Procédé de préparation de dérivés de l'insuline
La présente invention a pour objet un procédé de préparation de nouveaux dérivés de l'insuline; c'est-à-dire la kprolylinsuline, la di-L-prolylinsuline, la glycylinsuline, la diglycylinsuline et leurs dérivés prolyl- et glycyl- N-protégés.
On a trouvé que ces nouveaux dérivés ont une durée d'activité plus longue que celle de l'insuline. La cause de ce prolongement de la durée n'est pas tout à fait compris, bien qu'on ait postulé qu'il résulterait d'une plus grande résistance des groupes proline et glycine au clivage par les diverses enzymes, telles que l'aminopeptidase, présentes dans le corps, dont l'effet a pour résultat la digestion plus ou moins rapide des formes d'insuline actuellement disponibles. Cette digestion nécessite des injections assez fréquentes, afin de maintenir le taux d'insuline requis chez les patients diabétiques pour combattre l'hyperglycémie associée à cette maladie.
On met ainsi à disposition un composé qui limite la nécessité d'injections si fréquentes et ainsi simplifie beaucoup le traitement de la maladie. L'importance de la diminution du nombre des injections nécessaires est évidente et bien reconnue dans le métier. A part les aspects purement pratiques, le danger moindre d'infection dû aux injections fréquentes, administrées habituellement par le patient lui-même, diminue clairement les risques inhérents à un traitement de ce genre. Donc, I'obtention d'une forme d'insuline ayant l'activité prolongée décrite a été l'objet de nombreuses recherches depuis plus de trente ans.
Parmi les insulines appropriées d'origine animale qu'on peut utiliser comme matières de départ pour la préparation des produits par le procédé selon la présente invention, on peut citer les insulines obtenues à partir du pancréas du porc, du bétail, des baleines, des poissons, etc. On préfère particulièrement l'insuline provenant du pancréas des porcs, communément appelée insuline de porc.
On prépare ces insulines prolyl- et glycyl-substituées par l'acylation des insulines de ce genre avec des esters actifs de L-proline
N-protégée et de glycine N-protégée tels que le p-nitrophénylester de tert.-butyloxycarbonyl-L-proline, ou le p-nitrophénylester de tert.-butyloxycarbonyl-N-glycine. Si on le désire, on peut utiliser d'autres esters actifs de tert.-butyloxycarbonyl-L-proline ou Nglycine, tels que des N-hydroxysuccinylesters, des phénylesters et des phénylesters substitués, par exemple tels que des phénylesters substitués négativement, par exemple des thiophénylesters, des nitrophénylesters, des dinitrophénylesters, des nitrophényl-thio-esters, des cyanophénylesters, des phénylesters halogénés, etc., pour le stade d'acylation.
Le procédé d'acylation ci-dessus a pour résultat la formation de dérivés de prolyl- ou de glycyl-insuline protégés, les dérivés particuliers dépendent, comme on le verra d'après les exemples, des quantités relatives des réactifs utilisées.
On peut enlever le groupe protecteur, par exemple le groupe tert.-butyloxycarbonyle, pour obtenir le produit final qui est une insuline prolyl- ou glycyl-substituée. De préférence, on enlève le groupe protecteur par un traitement avec l'aide trifluoro-acétique, bien qu'on puisse utiliser tout procédé connu dans le métier, par exemple un traitement avec un hydracide (tel que l'acide bromhydrique ou chlorhydrique) dans l'acide acétique, ou d'autres traite- ments acides connus.
Au lieu d'administrer tels quels les produits du procédé selon la présente invention pour le traitement des diabétiques, on peut les utiliser pour la préparation de complexes afin de prolonger encore plus le temps d'action de ces dérivés de prolylinsuline. Ainsi, on peut faire réagir les insulines prolyl- ou glycyl-substituées obtenues par le procédé selon la présente invention avec un sel de zinc, par exemple le chlorure de zinc, de préférence en présence d'un agent tampon tel qu'un acide organique (par exemple l'acide acétique, succinique ou citrique) ou un hydroxyde de métal alcalin, obtenant ainsi une zinc-prolyl- ou glycylinsuline; ou avec un sel de zinc comme ci-dessus plus une protéine alcaline telle que la protamine, I'histone ou la globine, obtenant ainsi des histone- et globin-prolyl ou -glycyl-zinc-insulines.
La préparation de complexes et de compositions de ce genre est bien connue dans le métier.
Pour la préparation de compositions, comprenant la prolylou glycylinsuline, acceptables par voie parentérale, on peut utiliser toute méthode parmi celles qui sont bien connues pour la préparation de compositions contenant l'insuline. On peut par exemple dissoudre la prolyl- ou glycylinsuline dans de l'eau stérile à un pH d'environ 2 à environ 4 (de préférence d'environ 2,5 à environ 3,5. La concentration en prolyl- ou glycylinsuline doit être telle qu'on obtient une solution contenant d'environ 40 unités à envi- ron 500 unités de prolyl- ou de glycylinsuline par ml de solution finale. Avantageusement, on ajoute un agent de conservation, tel que le phénol- ou le m-crésol à la solution. de préférence à une concentration d'environ 0,059/o à environ 0.5 'o en poids.
On peut aussi inclure un agent qui rend la solution isotonique, tel que la glycérine, de préférence à une concentration d'environ 0.15% en poids.
Pour l'utilisation, habituellement on administre des compositions contenant lesdites insulines par voie sous-cutanée, à des diabétiques en une dose d'environ 0,25 ml à environ 2 ml (de préférence environ 1 ml), ce qui fournit une dose d'environ 20 unités à 1000 unités (de préférence d'environ 250 unités) de prolylinsuline.
Il est bien entendu que pour le traitement du diabète il n'y a pas de dose standard et que dans tout les cas la dose particulière doit être calculée individuellement suivant les besoins de la personne soignée.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
Exemple 1
La tert.-blttyloxyrarbonyl-L-prolylinsuline I t-Boc.-L-prolylinsllline)
On dissout 1,2 g (200 moles) d'insuline de porc, provenant de Novo Industrie AIS , dans 20 ml d'un mélange 1:1 de pyridine et d'eau, et on ajoute une solution de p-nitrophénylester de tert.butyloxycarbonyl-L-proline dans la pyridine (0,2 g, 600 moles/2 ml). On agite le mélange réactionnel à la température ordinaire à un pH constant (8,5) avec un réglage pH stat .
Le mélange réactionnel consomme 2,5 équivalents de base (NaOH 0.25 N) au cours de 2 heures. on arrête alors l'addition.
On amène le pH du mélange à pH = 5,5 avec 2 ml d'acide chlorhydrique 6 N et le concentre à sec sous vide à la température ordinaire. On dissout le résidu, qui est une huile, dans 20 ml d'eau, on ajuste le pH à 5,5 et de nouveau concentre à sec sous vide. On me le résidu en suspension dans 50 ml d'éthanol et décante le liquide surnageant colloïdal du solide. On met le solide en suspension dans 50 ml d'acétate d'éthyle puis le filtre et le lave avec de l'acétate d'éthyle et le sèche dans un dessiccateur. Le produit, c'est-àdire 1,0 g de solide, est soluble dans une solution diluée de bicarbonate. On hydrolyse un échantillon de cette matière dans de l'acide chlorhydrique 6 N exempt d'ammoniac et mesure quantitativement les amino-acides de l'hydrolysat. Le tableau ci-dessous indique les résultats.
La L-prolylinsltline
On met en suspension 500 mg de la préparation ci-dessus (t
Boc-L-prolylinsuline) dans 4 ml d'acide trifluoro-acétique et laisse reposer pendant 20 minutes à la température ordinaire; pendant ce temps la dissolution a lieu. On dilue la solution avec 50 ml d'éther anhydre et traite le précipité insoluble avec deux portions de 50 ml d'éther anhydre et la filtre. On dissout le solide dans 10 ml d'eau et le filtre pour enlever la matière insoluble éventuelle. On amène le pH du filtrat de pH = 2 à pH = 5,5 avec de la diéthylamine et laisse reposer à 5 C pendant une nuit.
On sépare le précipité par centrifugation et le lave successivement avec 10 ml d'eau et deux portions de 10 ml d'éthanol et finalement avec 50 ml d'acétate d'éthyle, puis le sépare par filtration et le sèche sous vide à la température ordinaire. On obtient 380 mg de produit qui est soluble dans l'acide chlorhydrique 0,01 N et dans une solution de bicarbonate. On analyse quantitativement les amino-acides dans un échantillon hydrolysé dans de l'acide chlorhydrique 6 N exempt d'ammoniac; le tableau ci-dessous indique les résultats.
Exemple 2
La di- ( Ferr.-butyloxyearbonyl-L-prolyl)insuline
On dissout 1,2 g (200 moles) d'insuline de porc provenant de Novo Industrie AIS dans 20 ml d'un mélange 1:1 de pyridine et d'eau, ajuste le pH à 8,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 0,25 N. puis ajoute une solution de p-nitrophénylester de tert.-butyloxycarbonyl-L-proline dans la pyridine (0,4 g, 1,1 moles). On agite le mélange à la température ordinaire et
maintient le pH à 8.5 par réglage pH stat . On laisse la réaction
se poursuivre pendant 5 heures. et pendant ce temps on reprend
six équivalents de base. On ajuste le pH du mélange réactionnel à
5,5 avec 2,5 ml d'acide chlorhydrique 6 N. puis le concentre sous
vide à la température ordinaire.
On lave le résidu avec 10 ml d'eau
et sépare par filtration la matière insoluble. On la met de nouveau
en suspension dans 10 ml d'eau et la filtre. On met le produit inso
luble en suspension dans 50 ml d'éthanol où la matière forme d'a
bord des masses compactes gommeuses qui se solidifient lentement sous un liquide surnageant colloïdal. On décante le liquide surnageant et met le résidu solide en suspension dans 50 ml d'acétate d'éthyle et le filtre et finalement le lave avec ce solvant. Aprés séchage dans un dessiccateur à vide. le produit pèse 828 mg. On obtient 75 mg additionnels à partir du liquide surnageant alcoolique. Le produit se dissout lentement dans de l'acide chlorhydrique 0.01 N et facilement dans du bicarbonate dilué.
Une analyse quantitative des amino-acides de l'hydrolysat d'un échantillon de ce produit donne les résultats indiqués dans le tableau ci-dessous.
La di-L-prolylinsldine
On met en suspension 500 mg de la di-prolylinsuline protégée ci-dessus dans 4 ml d'acide trifluoroacétique anhydre pendant
20 minutes; la dissolution a lieu pendant ce temps. On dilue la solution avec 50 ml d'éther anhydre et traite le précipité qui s'est formé deux fois avec 50 ml d'éther anhydre. On sépare le solide par filtration et le dissout dans 10 ml d'eau.
On filtre la solution pour séparer la matière non dissoute éventuelle. puis traite le filtrat avec de la triéthylamine pour élever le pH de la solution jus qu'à 55. Après l'avoir laissé reposer pendant une nuit à 52 C, on sépare le précipité par centrifugation et le lave successivement avec une portion de 10 ml d'eau. deux portions de 10 ml d'éthanol et finalement avec une portion de 50 ml d'acétate d'éthyle, puis le filtre et le sèche dans un dessiccateur à vide. On obtient 400 mg de produit qui est soluble dans l'acide chlorhydrique 0.01 N et dans une solution diluée de bicarbonate.
On soumet l'hydrolysat d'un échantillon, traité avec de l'acide chlorhydrique 6 N exempt d'ammoniac pendant 16 heures à la température de reflux, à une analyse quantitative des amino-acides; le tableau ci-dessous indique les résultats obtenus.
Exemple 3
La tert ert.-butyloryearbonylglycylinslxline t-Boc-glycyl-insuline )
On dissout 1,2 g (200 moles) d'insuline de porc provenant de Novo Industrie AiS dans 20 ml d'un mélange de parties égales de pyridine et d'eau, et on ajoute à cette solution 180 mg (600 moles) de p-nitrophénylester de tert.-butyloxycarbonyl-N
glycine dans 2 ml de pyridine. On agite le mélange réactionnel à la température ordinaire à un pH constant de 8,5 jusqu'à ce qu'il ne soit plus nécessaire d'ajouter de base (NaOH 0,25 N) pour maintenir ce pH. On ajuste alors le pH du mélange réactionnel à 5,5 avec de l'acide chlorhydrique 6 N et le concentre à sec sous vide à la température ordinaire.
On dissout le résidu, qui est une huile, dans 20 ml d'eau, et ajuste le pH de la solution obtenue à 5,5 et de nouveau la concentre à sec sous vide à la température ordinaire.
On met le résidu en suspension dans 50 ml d'acétate d'éthanol puis abandonne le liquide surnageant colloïdal. Ensuite on met en suspension le liquide résiduel dans 50 ml d'acétate d'éthyle puis le filtre et le lave avec de l'acétate d'éthyle et le sèche dans un dessiccateur. Le produit est soluble dans une solution diluée de bicarbonate et il peut former des sels solubles avec d'autres cations, par addition avec précaution à un pH d'environ 7.
La glycylinsrdine
On met en suspension la préparation ci-dessus, c'est-à-dire la t-Boc-glycylinsuline dans de l'acide trifluoro-acètique anhydre à raison de 1 gui 10 mi jusqu'à ce que la dissolution ait lieu et laisse reposer pendant environ 20 minutes. On dilue la solution avec 100 ml
Tableau
Composition de dérivés d'insuline et d'amino-acide
t-Boc-L-Prolyl- L-Prolyl- di-t-Boc-L-Prolyl- di-L-Prolyl
Insuline insuline insuline insuline insuline
Amino-acide (porc) (Ex. 1) (Ex. 2) (Ex. 3) (Ex. 4) Acide aspartique . . . . . 3 3 3 3 3
Thréonine - . . . 2 2 2 2 2
Sérine . 3 3 3 3 3
Acide glutamique . . 7 7 7 7 7 Proline t . . . . . . . . 1 2 2 3 3
Glycine . . . . .
. 4 4 4 4 4
Alanine . . . . . . 2 2 2 2 2
Cystine . . . . . . 3 3 3 3 3
Valine . . . . . . 4 4 4 4 4
Isoleucine . . . . . . . . 2 2 2 2 2
Leucine . . . . . . . . 4 6 6 6 6
Tyrosine . . . . . . . . 4 4 4 4 4 Phénylalanine . . . . . . . 3 3 3 3 3
Histidine . . . . . . . . 2 2 2 2 2
Lysine . . . . . . . . . 1 1 1 1 1
Arginine .. . 1 1 1 1 1
Ammoniac . . . . . . . 6 6 6 6 6 t-Boc = tert.-butyloxycarbonyle.
d'éther anhydre et triture le précipité successivement avec deux portions de 100 ml d'éther anhydre, puis le filtre. On dissout le solide dans 25 ml d'eau et le centrifuge pour séparer la matière non dissoute éventuelle. On décante le liquide surnageant et ajuste le pH à 5,5 avec de la triéthylamine et laisse reposer pendant une nuit à 5" C. On centrifuge le solide qui se sépare et le lave successivement avec 10 ml d'eau et deux portions de 10 ml d'éthanol et finalement avec de l'acétate d'éthyle, le filtre et le sèche dans un dessiccateur à vide à la température ordinaire. Le produit est soluble dans l'acide chlorhydrique 0,01 N et une solution de bicarbonate.
Exemple 4
La di- (tert .-butyloxyearbonylglycyl) insuline
On dissout 1,2 g (200 moles) d'insuline de porc provenant de Novo Industrie A/S dans 20 ml d'un mélange 1:1 de pyridine et d'eau et ajuste le pH à 8,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 0,25 N. Pendant qu'on maintient ce pH, avec un réglage pH stat , en utilisant de l'hydroxyde de sodium 0,25 N, on ajoute une solution pyridinique de 1200 moles de p-nitrophényles- ter de tert.-butyloxycarbonylglycine (360 mg/2 ml) et maintient le pH du mélange à 8,5 jusqu'à ce qu'il ne soit plus nécessaire d'ajouter de la base. La réaction est terminée après 5 heures; pendant ce temps six équivalents de base sont consommés.
On ajuste le pH du mélange réactionnel à 5,5 avec de l'acide chlorhydrique 6 N et le concentre sous vide à la température ordinaire. On lave alors le résidu deux fois avec 10 ml d'eau et le filtre. On met en suspension le produit insoluble dans 50 ml d'éthanol et sépare par déc5nta- tion la matière solide qui se forme lentement, du liquide surnageant colloïdal. On met le solide en suspension dans 50 ml d'acétate d'éthyle, le filtre et finalement le lave avec ce solvant. On sèche le produit dans un dessiccateur à vide. Le produit se dissout volontiers dans le bicarbonate et se dissout lentement dans l'acide chlorhydrique 0,01 N.
La diglycylinsuline
Pour la préparation de la diglycylinsuline, on dissout la di-(t
Boc-glycyl)insuline décrite dans l'exemple 7 ci-dessus dans l'acide trifluoro-acétique anhydre, à raison de 1 g/10 ml, et laisse reposer pendant environ 20 minutes en solution à la température ordinaire. On dilue alors la solution avec 100 ml d'éther anhydre et triture le précipité deux fois avec 100 ml d'éther anhydre. On sépare le solide par filtration et le dissout dans 20 ml d'eau. On sépare par filtration ou centrifugation la matière non dissoute éventuelle et ajuste le pH de la solution limpide à 5,5 avec de la triéthylamine.
Après avoir laissé reposer pendant une nuit à 5 C, on sépare par centrifugation le solide qui se sépare, et le lave successivement avec 10 ml d'eau, deux fois 10 ml d'éthanol et finalement 50 ml d'acétate d'éthyle, puis le filtre et le sèche dans un dessiccateur à vide. Le produit est soluble dans l'acide chlorhydrique 0,01 N et dans une solution diluée de bicarbonate.
Exemple 5
A. La zinc-L-prolylinsuline de porc cristalline
On met en suspension 250 mg de L-prolylinsuline, préparée par le procédé de l'exemple 1, dans 12,5 ml d'eau et la dissout en ajustant le pH à 2,3 par l'addition d'acide chlorhydrique 1 N. On ajoute 1 g de chlorure de sodium et un agent favorisant la filtration ( Hyflo , marque déposée) à la solution. On filtre le précipité qui se forme et le lave avec une solution de chlorure de sodium à 8%. On dissout le précipité dans 25 ml d'eau distillée et ajuste le pH à 7,0 avec de l'hydroxyde de sodium 1 N. On ajoute de l'acétone jusqu'à une concentration finale de 250i0. On filtre la solution pour enlever une petite quantité d'impuretés, en utilisant Hyflo pour faciliter la filtration.
On ajoute 1,2 ml de tampon au citrate ayant un pH = 5,4 (préparé à partir de 5 g d'acide citrique dans 10 ml d'eau et 2,5 g d'hydroxyde de sodium dans 5 ml d'eau, dilué jusqu'à 30 ml avec de l'eau. Finalement on ajoute à la solution filtrée 0,25 ml de solution de chlorure de zinc à 20% et ajuste le à 6. On racle les parois du ballon et garde le mélange à la température ordinaire jusqu'à ce qu'une partie importante de l'insuline modifiée apparaisse sous forme cristalline. Après quelques jours à 5 C dans un réfrigérateur, la cristallisation est complète. On filtre alors les cristaux de zinc-L-prolylinsuline et les lave avec de l'acétone diluée, finalement avec de l'acétone et les sèche à l'air.
B. La zinc-elyeylinsl(line
On procède comme cidessus, mais en substituant une quantité équivalente de glycylinsuline, préparée par le procédé de l'exemple 3, à la L-prolylinsuline, et l'on obtient la zinc-glycylinsuline cristalline.
Exemple 6
La proremzine-:inc-L-prolylinsllline
Pour la préparation de 500 litres de solution de protamine zinc-l-prolylinsuIine, on procède selon l'une des méthodes suivantes:
On introduit 450 kg d'eau pour injections dans une cuve. On ajoute 8000 g de glycérine. 500 ml de phénol redistillé (100%) et 500 ml de solution d'acide chlorhydrique I N. On ajoute alors 850 ml de solution de chlorure de zinc (200 mg de zinc par ml) et mélange bien la solution. On ajoute 3400 g de zinc-prolylinsuline et 1000 g de sulfate de protamine et agite le mélange obtenu. On ajoute suffisamment d'acide chlorhydrique 1 N pour obtenir un pH de 2,9-3,0 et dissoudre les solides.
On ajoute alors suffisamment d'eau pour injections pour que le volume final de la solution soit de 500 litres et stérilise la solution par filtration sous pression et récolte la protamine-zinc-L-prolylinsuline dans des flacons de 20 litres pour l'opération de remplissage.
b) On introduit 200 litres d'eau pour injections dans une cuve; on ajoute 4000 g de glycérine, 375 g de méta-crésol fraichement distillé, 162,5 ml de phénol redistillé (100%) et 250 ml d'acide chlorhydrique I N et mélange la solution obtenue. On ajoute 30 ml de solution de chlorure de zinc (200 mg de zinc par ml) et mélange à fond le mélange obtenu. On ajoute 1700 g de zinc-Lprolylinsuline et 168 g de sulfate de protamine et agite le mélange
obtenu. On ajoute suffisamment d'acide chlorhydrique 1 N pour
amener le pH à 2,7-3,0 et pour dissoudre tous les solides. On ajoute alors suffisamment d'eau pour injections pour que la solution pèse 245 kg et ajuste le pH à 2,7-3,0 avec de l'acide chlorhydrique 1 N.
On ajoute alors suffisamment d'eau pour injections
pour que le volume de la solution finale soit de 250 litres et mé
lange la solution à fond. On stérilise la solution par filtration sous pression.
REVENDICATION I
Procédé de préparation d'un polypeptide choisi parmi la L
prolylinsuline, la di-L-prolylinsuline, la glycylinsuline. la diglycylinsuline et leurs dérivés prolyl- et glycyl- N-protégés, caractérisé en ce qu'on acyle l'insuline avec un ester actif de L-proline N-pro tégée ou de glycine N-protégée.
SOUS-REVENDICATIONS
1. Procédé selon la revendication 1. caractérisé en ce qu'on acyle l'insuline avec un ester actif de tert.-butyloxycarbonyl-Lproline pour obtenir la ten.-butyloxycarbonyl-N-prolylinsuline ou la di (tert .-butyloxycarbonyl-L-prolylinsuline.
2. Procédé selon la revendication 1. caractérisé en ce qu'on acyle l'insuline avec un ester actif de ten.-butyloxycarbonylglycine pour obtenir la tert.-butyloxycarbonylglycylinsuline ou la di(tert.butyloxycarbonylglycyl)insuline.
3. Procédé selon la sous-revendication 1. caractérisé en ce qu'on traite la tert.-butyloxycarbonyl-L-prolylinsuline avec un acide pour obtenir la L-prolylinsuline.
4. Procédé selon la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite la di(tert.-butyloxycarbonyl-L-prolyl)insuline avec un acide pour obtenir la di-L-prolylinsuline.
5. Procédé selon la sous-revendication 2. caractérisé en ce qu'on traite la tert.-butyloxycarbonylglycylinsuline avec un acide pour obtenir la glycylinsuline.
6. Procédé selon la sous-revendication 2. caractérisé en ce qu'on traite la di(tert.-butyloxycarbonyl)glycylinsuline avec un acide pour obtenir la diglycylinsuline.
7. Procédé selon la revendication 1. caractérisé en ce que l'on traite l'insuline prolyl- ou glycyl-substituée avec un sel de zinc pour obtenir la zinc-L-prolyl- ou zinc-glycylinsuline.
REVENDICATION II
Utilisation des polypeptides obtenus conformément au procédé selon la revendication I ou selon la revendication I et la sous-revendication 7. pour la préparation de complexes de ces polype tides avec une protéine alcaline.
SOUS-REVENDICATIONS
8. Utilisation selon la revendication II. caractérisée en ce qu'on traite l'insuline prolyl- ou glycyl-substituée avec une protéine alcaline.
9. Utilisation selon la revendication II, caractérisée en ce qu'on traite la zinc-L-prolyl- ou la zinc-glycyl-insuline avec une protéine alcaline.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
Process for the preparation of insulin derivatives
The present invention relates to a process for the preparation of new insulin derivatives; that is, kprolylinsulin, di-L-prolylinsulin, glycylinsulin, diglycylinsulin and their prolyl- and glycyl-N-protected derivatives.
These new derivatives have been found to have a longer duration of activity than that of insulin. The cause of this prolongation of life is not fully understood, although it has been postulated that it would result from greater resistance of the proline and glycine groups to cleavage by various enzymes, such as aminopeptidase. , present in the body, the effect of which results in the more or less rapid digestion of the forms of insulin currently available. This digestion requires fairly frequent injections in order to maintain the insulin level required in diabetic patients to combat the hyperglycemia associated with this disease.
A compound is thus provided which limits the need for such frequent injections and thus greatly simplifies the treatment of the disease. The importance of reducing the number of injections required is obvious and well recognized in the art. Apart from the purely practical aspects, the lesser danger of infection due to frequent injections, usually administered by the patient himself, clearly reduces the risks inherent in such treatment. Therefore, obtaining a form of insulin with the prolonged activity described has been the subject of much research for over thirty years.
Among the suitable insulins of animal origin which can be used as starting materials for the preparation of the products by the process according to the present invention, mention may be made of the insulins obtained from the pancreas of pigs, cattle, whales, whales, fish, etc. Particularly preferred is insulin from the pancreas of pigs, commonly referred to as pork insulin.
These prolyl- and glycyl-substituted insulins are prepared by acylating such insulins with active esters of L-proline.
N-protected and N-protected glycine such as tert.-butyloxycarbonyl-L-proline p-nitrophenyl ester, or tert.-butyloxycarbonyl-N-glycine p-nitrophenyl ester. If desired, other active esters of tert.-butyloxycarbonyl-L-proline or Nglycine can be used, such as N-hydroxysuccinylesters, phenylesters and substituted phenylesters, for example such as negatively substituted phenylesters, for example. thiophenylesters, nitrophenylesters, dinitrophenylesters, nitrophenyl-thio-esters, cyanophenylesters, halogenated phenylesters, etc., for the acylation step.
The above acylation process results in the formation of protected prolyl- or glycyl-insulin derivatives, the particular derivatives will depend, as will be seen from the examples, on the relative amounts of the reagents used.
The protecting group, for example the tert.-butyloxycarbonyl group, can be removed to obtain the end product which is a prolyl- or glycyl-substituted insulin. Preferably, the protecting group is removed by treatment with trifluoroacetic aid, although any method known in the art can be used, for example treatment with a hydracid (such as hydrobromic or hydrochloric acid) in acetic acid, or other known acid treatments.
Instead of administering the products of the process according to the present invention as such for the treatment of diabetics, they can be used for the preparation of complexes in order to further prolong the action time of these prolylinsulin derivatives. Thus, the prolyl- or glycyl-substituted insulins obtained by the process according to the present invention can be reacted with a zinc salt, for example zinc chloride, preferably in the presence of a buffering agent such as an organic acid. (for example acetic, succinic or citric acid) or an alkali metal hydroxide, thus obtaining a zinc-prolyl- or glycylinsulin; or with a zinc salt as above plus an alkaline protein such as protamine, histone or globin, thereby obtaining histone- and globin-prolyl or -glycyl-zinc-insulins.
The preparation of complexes and compositions of this kind is well known in the art.
For the preparation of compositions, comprising prolyl or glycylinsulin, acceptable by the parenteral route, one can use any method among those which are well known for the preparation of compositions containing insulin. For example, the prolyl- or glycylinsulin can be dissolved in sterile water at a pH of about 2 to about 4 (preferably about 2.5 to about 3.5. The concentration of prolyl- or glycylinsulin should be such that a solution is obtained containing from about 40 units to about 500 units of prolyl- or glycylinsulin per ml of final solution. Advantageously, a preservative is added, such as phenol- or m-cresol. in solution, preferably at a concentration of about 0.059% to about 0.5% by weight.
It is also possible to include an agent which renders the solution isotonic, such as glycerin, preferably at a concentration of about 0.15% by weight.
For use, compositions containing said insulins are usually administered subcutaneously to diabetics in a dose of from about 0.25 ml to about 2 ml (preferably about 1 ml), which provides a dose of. about 20 units to 1000 units (preferably about 250 units) of prolylinsulin.
It is understood that for the treatment of diabetes there is no standard dose and that in any case the particular dose must be calculated individually according to the needs of the person being treated.
The following examples illustrate the invention.
Example 1
Tert.-blttyloxyrarbonyl-L-prolylinsulin I t-Boc.-L-prolylinsllline)
1.2 g (200 moles) of pork insulin, obtained from Novo Industrie AIS, is dissolved in 20 ml of a 1: 1 mixture of pyridine and water, and a solution of p-nitrophenyl ester of tert. .butyloxycarbonyl-L-proline in pyridine (0.2 g, 600 moles / 2 ml). The reaction mixture is stirred at room temperature at constant pH (8.5) with stat pH adjustment.
The reaction mixture consumes 2.5 equivalents of base (0.25 N NaOH) over the course of 2 hours. the addition is then stopped.
The pH of the mixture is brought to pH = 5.5 with 2 ml of 6N hydrochloric acid and concentrated to dryness under vacuum at room temperature. The residue, which is an oil, is dissolved in 20 ml of water, the pH is adjusted to 5.5 and again concentrated to dryness in vacuo. The residue is suspended in 50 ml of ethanol and the colloidal supernatant liquid is decanted from the solid. The solid is suspended in 50 ml of ethyl acetate and then filtered and washed with ethyl acetate and dried in a desiccator. The product, i.e. 1.0 g of solid, is soluble in dilute bicarbonate solution. A sample of this material is hydrolyzed in 6 N hydrochloric acid free of ammonia and quantitatively measured for amino acids in the hydrolyzate. The table below shows the results.
L-prolylinsltline
500 mg of the above preparation are suspended (t
Boc-L-prolylinsulin) in 4 ml of trifluoroacetic acid and left to stand for 20 minutes at room temperature; during this time the dissolution takes place. The solution is diluted with 50 ml of anhydrous ether and the insoluble precipitate is treated with two 50 ml portions of anhydrous ether and filtered. The solid is dissolved in 10 ml of water and filtered to remove any insoluble material. The pH of the filtrate from pH = 2 is brought to pH = 5.5 with diethylamine and left to stand at 5 ° C. overnight.
The precipitate is separated by centrifugation and washed successively with 10 ml of water and two 10 ml portions of ethanol and finally with 50 ml of ethyl acetate, then separated by filtration and dried in vacuo at temperature. ordinary. 380 mg of product are obtained which is soluble in 0.01 N hydrochloric acid and in a bicarbonate solution. Amino acids are quantitatively analyzed in a sample hydrolyzed in 6N hydrochloric acid free of ammonia; the table below shows the results.
Example 2
Di- (Ferr.-Butyloxyearbonyl-L-prolyl) insulin
1.2 g (200 moles) of pork insulin from Novo Industrie AIS is dissolved in 20 ml of a 1: 1 mixture of pyridine and water, the pH is adjusted to 8.5 with a hydroxide solution sodium 0.25N then add a solution of p-nitrophenyl ester of tert.-butyloxycarbonyl-L-proline in pyridine (0.4 g, 1.1 moles). The mixture is stirred at room temperature and
maintains the pH at 8.5 by adjusting the pH stat. We leave the reaction
continue for 5 hours. and during this time we resume
six basic equivalents. The pH of the reaction mixture is adjusted to
5.5 with 2.5 ml of 6 N hydrochloric acid then concentrate it under
vacuum at room temperature.
The residue is washed with 10 ml of water
and separates insoluble material by filtration. We put it on again
suspended in 10 ml of water and filter it. We put the product inso
luble suspended in 50 ml of ethanol where the material forms a
edge of the gummy compact masses that slowly solidify under a colloidal supernatant liquid. The supernatant liquid is decanted and the solid residue is suspended in 50 ml of ethyl acetate and filtered and finally washed with this solvent. After drying in a vacuum desiccator. the product weighs 828 mg. An additional 75 mg are obtained from the alcoholic supernatant liquid. The product dissolves slowly in 0.01 N hydrochloric acid and easily in dilute bicarbonate.
A quantitative analysis of the hydrolyzate amino acids of a sample of this product gave the results shown in the table below.
Di-L-prolylinsldine
500 mg of the protected di-prolylinsulin above are suspended in 4 ml of anhydrous trifluoroacetic acid for
20 minutes; dissolution takes place during this time. The solution is diluted with 50 ml of anhydrous ether and the precipitate which formed twice is treated with 50 ml of anhydrous ether. The solid is separated by filtration and dissolved in 10 ml of water.
The solution is filtered to separate any undissolved material. then the filtrate is treated with triethylamine to raise the pH of the solution to 55. After allowing it to stand overnight at 52 ° C., the precipitate is separated by centrifugation and washed successively with a 10 ml portion. of water. two 10 ml portions of ethanol and finally with one 50 ml portion of ethyl acetate, then filter and dry in a vacuum desiccator. 400 mg of product are obtained which is soluble in 0.01 N hydrochloric acid and in a dilute bicarbonate solution.
The hydrolyzate of a sample, treated with 6N hydrochloric acid free of ammonia for 16 hours at reflux temperature, is subjected to quantitative analysis for amino acids; the table below indicates the results obtained.
Example 3
Tert.-Butyloryearbonylglycylinslxline t-Boc-glycyl-insulin)
1.2 g (200 moles) of pork insulin from Novo Industrie AiS is dissolved in 20 ml of a mixture of equal parts of pyridine and water, and to this solution 180 mg (600 moles) of tert.-Butyloxycarbonyl-N p-nitrophenyl ester
glycine in 2 ml of pyridine. The reaction mixture is stirred at room temperature at a constant pH of 8.5 until it is no longer necessary to add base (0.25 N NaOH) to maintain this pH. The pH of the reaction mixture is then adjusted to 5.5 with 6N hydrochloric acid and concentrated to dryness in vacuo at room temperature.
The residue, which is an oil, is dissolved in 20 ml of water, and the pH of the resulting solution is adjusted to 5.5 and again concentrated to dryness in vacuo at room temperature.
The residue is suspended in 50 ml of ethanol acetate and then the colloidal supernatant liquid is abandoned. Then the residual liquid is suspended in 50 ml of ethyl acetate and then filtered and washed with ethyl acetate and dried in a desiccator. The product is soluble in dilute bicarbonate solution and can form soluble salts with other cations, on careful addition at a pH of about 7.
Glycylinsrdine
The above preparation, i.e. t-Boc-glycylinsulin, is suspended in anhydrous trifluoroacetic acid at a rate of 1 ml 10 ml until dissolution takes place and allows rest for about 20 minutes. The solution is diluted with 100 ml
Board
Composition of insulin and amino acid derivatives
t-Boc-L-Prolyl- L-Prolyl- di-t-Boc-L-Prolyl- di-L-Prolyl
Insulin insulin insulin insulin insulin
Amino acid (pork) (Ex. 1) (Ex. 2) (Ex. 3) (Ex. 4) Aspartic acid. . . . . 3 3 3 3 3
Threonine -. . . 2 2 2 2 2
Serine. 3 3 3 3 3
Glutamic acid. . 7 7 7 7 7 Proline t. . . . . . . . 1 2 2 3 3
Wisteria. . . . .
. 4 4 4 4 4
Alanine. . . . . . 2 2 2 2 2
Cystine. . . . . . 3 3 3 3 3
Valine. . . . . . 4 4 4 4 4
Isoleucine. . . . . . . . 2 2 2 2 2
Leucine. . . . . . . . 4 6 6 6 6
Tyrosine. . . . . . . . 4 4 4 4 4 Phenylalanine. . . . . . . 3 3 3 3 3
Histidine. . . . . . . . 2 2 2 2 2
Lysine. . . . . . . . . 1 1 1 1 1
Arginine ... 1 1 1 1 1
Ammonia. . . . . . . 6 6 6 6 6 t-Boc = tert.-butyloxycarbonyl.
of anhydrous ether and triturates the precipitate successively with two 100 ml portions of anhydrous ether, then the filter. The solid is dissolved in 25 ml of water and centrifuged to separate any undissolved material. The supernatant liquid is decanted and the pH is adjusted to 5.5 with triethylamine and left to stand overnight at 5 ° C. The solid which separates is centrifuged and washed successively with 10 ml of water and two portions of 10. ml of ethanol and finally with ethyl acetate, filter and dry in a vacuum desiccator at room temperature The product is soluble in 0.01 N hydrochloric acid and bicarbonate solution.
Example 4
Di- (tert-butyloxyearbonylglycyl) insulin
1.2 g (200 moles) of pork insulin from Novo Industrie A / S is dissolved in 20 ml of a 1: 1 mixture of pyridine and water and the pH is adjusted to 8.5 with a solution of 0.25 N sodium hydroxide. While maintaining this pH, with a static pH adjustment, using 0.25 N sodium hydroxide, a pyridine solution of 1200 moles of p-nitrophenyls is added. of tert.-Butyloxycarbonylglycine (360 mg / 2 ml) and maintain the pH of the mixture at 8.5 until no more base is required. The reaction is complete after 5 hours; during this time six base equivalents are consumed.
The pH of the reaction mixture is adjusted to 5.5 with 6N hydrochloric acid and concentrated in vacuo at room temperature. The residue is then washed twice with 10 ml of water and the filter. The insoluble material is suspended in 50 ml of ethanol and the slowly forming solid is decoupled from the colloidal supernatant liquid. The solid is suspended in 50 ml of ethyl acetate, filtered and finally washed with this solvent. The product is dried in a vacuum desiccator. The product readily dissolves in bicarbonate and dissolves slowly in 0.01 N hydrochloric acid.
Diglycylinsulin
For the preparation of diglycylinsulin, the di- (t
Boc-glycyl) insulin described in Example 7 above in anhydrous trifluoroacetic acid, at a rate of 1 g / 10 ml, and left to stand for about 20 minutes in solution at room temperature. The solution is then diluted with 100 ml of anhydrous ether and the precipitate is triturated twice with 100 ml of anhydrous ether. The solid is separated by filtration and dissolved in 20 ml of water. Any undissolved material is separated by filtration or centrifugation and the pH of the clear solution is adjusted to 5.5 with triethylamine.
After leaving to stand overnight at 5 ° C., the solid which separates is separated by centrifugation and washed successively with 10 ml of water, twice 10 ml of ethanol and finally 50 ml of ethyl acetate, then filter and dry it in a vacuum desiccator. The product is soluble in 0.01 N hydrochloric acid and in dilute bicarbonate solution.
Example 5
A. Zinc-L-prolylinsulin crystalline pork
250 mg of L-prolylinsulin, prepared by the method of Example 1, are suspended in 12.5 ml of water and dissolved, adjusting the pH to 2.3 by the addition of 1 N hydrochloric acid. 1 g of sodium chloride and a filtration promoting agent (Hyflo, registered trademark) are added to the solution. The precipitate which forms is filtered off and washed with 8% sodium chloride solution. The precipitate is dissolved in 25 ml of distilled water and the pH is adjusted to 7.0 with 1N sodium hydroxide. Acetone is added to a final concentration of 25010. The solution is filtered to remove a small amount of impurities, using Hyflo to aid filtration.
1.2 ml of citrate buffer having a pH = 5.4 (prepared from 5 g of citric acid in 10 ml of water and 2.5 g of sodium hydroxide in 5 ml of water are added. , diluted to 30 ml with water.Finally, 0.25 ml of 20% zinc chloride solution is added to the filtered solution and adjusted to 6. The walls of the flask are scraped and the mixture kept at at room temperature until a significant portion of the modified insulin appears in crystalline form. After a few days at 5 ° C in a refrigerator, crystallization is complete. Zinc-L-prolylinsulin crystals are then filtered and washed with dilute acetone, finally with acetone and air dried.
B. Zinc-elyeylinsl (line
The procedure is as above, but substituting an equivalent amount of glycylinsulin, prepared by the process of Example 3, for L-prolylinsulin, and crystalline zinc-glycylinsulin is obtained.
Example 6
Proremzine-: inc-L-prolylinsllline
To prepare 500 liters of protamine zinc-1-prolylinsulin solution, one of the following methods is used:
450 kg of water for injections are introduced into a tank. 8000 g of glycerin are added. 500 ml of redistilled phenol (100%) and 500 ml of I N hydrochloric acid solution. 850 ml of zinc chloride solution (200 mg of zinc per ml) are then added and the solution is mixed well. 3400 g of zinc-prolylinsulin and 1000 g of protamine sulfate are added and the resulting mixture is stirred. Sufficient 1N hydrochloric acid is added to obtain a pH of 2.9-3.0 and dissolve the solids.
Sufficient water for injections is then added so that the final volume of the solution is 500 liters and the solution is sterilized by filtration under pressure and the protamine-zinc-L-prolylinsulin is collected in vials of 20 liters for the operation of filling.
b) 200 liters of water for injections are introduced into a tank; 4000 g of glycerin, 375 g of freshly distilled meta-cresol, 162.5 ml of redistilled phenol (100%) and 250 ml of I N hydrochloric acid are added and the solution obtained is mixed. 30 ml of zinc chloride solution (200 mg of zinc per ml) are added and the resulting mixture is thoroughly mixed. 1700 g of zinc-Lprolylinsulin and 168 g of protamine sulfate are added and the mixture is stirred
got. Sufficient 1N hydrochloric acid is added to
bring the pH to 2.7-3.0 and to dissolve any solids. Sufficient water for injections is then added so that the solution weighs 245 kg and the pH is adjusted to 2.7-3.0 with 1 N hydrochloric acid.
Sufficient water is then added for injections
so that the volume of the final solution is 250 liters and
Mix the solution thoroughly. The solution is sterilized by filtration under pressure.
CLAIM I
Process for preparing a polypeptide selected from L
prolylinsulin, di-L-prolylinsulin, glycylinsulin. diglycylinsulin and their prolyl- and glycyl- N-protected derivatives, characterized in that the insulin is acylated with an active ester of N-protected L-proline or of N-protected glycine.
SUB-CLAIMS
1. Method according to claim 1. characterized in that the insulin is acylated with an active ester of tert.-butyloxycarbonyl-Lproline to obtain ten.-butyloxycarbonyl-N-prolylinsulin or di (tert.-Butyloxycarbonyl-L -prolylinsulin.
2. Method according to claim 1. characterized in that the insulin is acylated with an active ester of ten.-butyloxycarbonylglycine to obtain tert.-butyloxycarbonylglycylinsulin or di (tert.butyloxycarbonylglycyl) insulin.
3. Method according to sub-claim 1. characterized in that the tert.-butyloxycarbonyl-L-prolylinsulin is treated with an acid to obtain L-prolylinsulin.
4. Method according to sub-claim 1, characterized in that the di (tert.-butyloxycarbonyl-L-prolyl) insulin is treated with an acid to obtain di-L-prolylinsulin.
5. Method according to sub-claim 2, characterized in that the tert.-butyloxycarbonylglycylinsulin is treated with an acid to obtain glycylinsulin.
6. Method according to sub-claim 2. characterized in that the di (tert.-butyloxycarbonyl) glycylinsulin is treated with an acid to obtain diglycylinsulin.
7. Method according to claim 1, characterized in that the prolyl- or glycyl-substituted insulin is treated with a zinc salt to obtain zinc-L-prolyl- or zinc-glycylinsulin.
CLAIM II
Use of the polypeptides obtained according to the process according to claim I or according to claim I and sub-claim 7. for the preparation of complexes of these polype tides with an alkaline protein.
SUB-CLAIMS
8. Use according to claim II. characterized in that the prolyl- or glycyl-substituted insulin is treated with an alkaline protein.
9. Use according to claim II, characterized in that the zinc-L-prolyl- or zinc-glycyl-insulin is treated with an alkaline protein.
** ATTENTION ** end of DESC field can contain start of CLMS **.