Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung
Es wurden bereits Peptide beschrieben, die sich durch eine verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden, dass sie am Aminoende als erste a-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen, vgl.
z. B. Schweizer Patent Nr. 499497.
Es wurde nun gefunden, dass ein Octadecapeptidamid, das an Stelle der Argininreste in 17,18-Stellung Lysinreste enthält, eine besonders gute adrenocorticotrope Wirkung aufweist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des D-Seryl-L-tyros y1-L-seryl-L-methionyl-Lglutamyl (oder L-glutamins)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L- arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-vaWl- giycyl-L-lysyl-L4ysyl-L-lysyl-L4ysinamids und ihrer Säureadditionssalze und Komplexe.
Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen.
Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptiden entstehen und vor allem diejenigen, die ihnen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganische Stoffe sind Verbindungen, die sich von Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle. Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z. B.
Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrin, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z. B. Protamin und insbesondere von Aminosäuren, die einen überwiegenden Anteil an sauren sz-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, aufweisen.
Die neuen Verbindungen besitzen, wie bereits erwähnt, eine wesentlich stärkere ACTH-Aktivität als die entsprechenden Verbindungen mit L-Konfiguration an der ersten Aminosäure. Sie sollen dementsprechend in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden, z. B. an Stelle des natürlichen Hormons.
Die neuen Peptide werden nach den für die Her stellung von Peptiden mit grosser Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt unter Verwendung einer D-Aminosäure als N-terniinaler Aminosäure. Dabei werden die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Hervorzuheben ist besonders auch die sogenannte Feststoffträgersynthese (vgl. Merrifield, J. Am.
Chem. Soc. 85, 2149 [1963]), bei der das Peptid vom Carboxylende, das ersterartig an ein Polymeres gebunden ist, aufgebaut wird, indem man die Aminosäuren der Reihe nach ankondensiert. Als Kondensationsmethoden sind z.B. die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode zu erwähnen. Beispielsweise kann man eines der Aminosäure- bzw. Peptidmoleküle in Form eines Esters mit einem weiteren Aminosäure- bzw. Peptidmolekül, das eine geschützte Aminogruppe enthält, in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie eines Carbodiimids oder eines Phosphorigsäureesterhalogenids, ver knüpfen, oder man kann mit dem Aminosäure bzw.
Peptidester mit freier Aminogruppe eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe), z.B. ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid (z. 13. aus N athyl-5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat, 5. Woodward et al., J.Am.Chem.Soc. 89, 1011 [1961]), oder einem aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylthiolester oder Nitrophenylester, umsetzen. Umgekehrt kann auch eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit freier Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe) mit einer Aminosäure bzw. einem Peptid mit aktivierter Aminogruppe (und geschützter Carboxylgruppe), z. B.
einem Phosphitamid, zur Reaktion gebracht werden.
An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, oder Amidbildung, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung der Tosyl-, Trityl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, Phthalyl- oder Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p(p'-Methoxy-phenylazo)-ben- zyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des tert. Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginins ist die Nitrogruppe geeignet;
die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden. Die Iminogruppe des Histidins kann durch den Benzyl- oder Tritylrest geschützt werden.
Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder Iminogruppe in eine freie Gruppe sowie die tJberfüh- rung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher dadurch gekennzeichnet, dass man die zum Aufbau der neuen Peptide nötigen Aminosäuren unter Bildung von CONH Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen schützt, die Carboxylgruppe des endständigen Lysinrestes zu Beginn oder zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt, indem man das Octadecapeptid durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.
Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, dass man das die ersten 3 Aminosäuren, D-Ser-Tyr-Ser-OH enthaltende Tripeptid (die abgekürzte Schreibweise bezieht sich auf L-Aminosäuren, wenn das D- nicht besonders bezeichnet ist), oder das ausserdem die 4. Aminosäure enthaltende Tetrapeptid mit dem Heptapeptid bzw.
Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 kondensiert, vorzugsweise nach der Azidmethode, und dann das Decapeptid mit dem Octapeptidester oder -amid der Aminosäuren 11-18 kondensiert.
Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode der aktivierten Ester, vor allem mittels des pNitro- phenylesters, verwendet. Im letzten Falle braucht der p-Nitrophenylester des Decapeptids nicht als solcher isoliert zu werden, sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst aus dem Decapeptid mit freier Carboxylgruppe, pNitrophenol und Dicyclohexylcarbodiimid gebildet werden. Das Decapeptid liegt also als a-Aminogeschütztes Peptid mit freier Carboxylgruppe oder mit einer pNitrophenylestergruppe vor. Die in den zu kondensierenden Peptidbruchstücken vorhandenen Seitenketten-Aminogruppen werden vorzugsweise durch die tert. - Butyloxycarbonylgruppe, die Carboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe geschützt.
Diese Schutzgruppen können in der letzten Stufe mit Trifluoressigsäure abgespalten werden.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.
B. solche nut anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwassertoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Amino- benzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Amino-salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Athansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure,
p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.
Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.
Man kann sie auch mit den in der ACTH-Therapie üblichen Zusätzen zur Verlängerung der Wirkung, wie z. B. Oxypolygelatine, Polyphloretinphosphat, Carboxymethylcellulose, oder den oben erwähnten schwerlöslichen Metallverbindungen, insbesondere Phosphaten, Pyrophosphaten oder Hydroxyden des Zinks, kombinieren.
In den folgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
Die dünnschichtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet: System 43A: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (100 :40:10) System 43C: tert.-Amylalkohol-Tsopropanol-Wasser (100 :40: 55) System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser (100:10: 30) System 52A: n-Butanol-Eisessig-Wasser (67: 10: 23) System 100: Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6:11) System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (30:20:6:24)
Folgende Abkürzungen werden verwendet:
Z = Carbobenzoxy
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl tBu = tert.-Butyl.
Beispiel I 1. Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2
5 g ZLys(BOC > Lys(BOC)-OCH3 werden in 100 ml absolutem Methanol gelöst, bei Zimmertemperatur mit Ammoniakgas gesättigt und während 30 Stunden im verschlossenen Kolben stehengelassen. Die Lösung wird dann auf etwa 25 ml eingeengt und zur Kristallisation über Nacht in den Eisschrank gestellt. Man filtriert ab, wäscht mit ein wenig kaltem Methanol und trocknet die Kristalle im Vakuum. Man erhält 3,95 g Z-Lys(BOC) Lys(BOC)-NH2 vom F. = 1650.
Die Verbindung zeigt bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel folgende Rf-Werte:
Rf (Chloroform-Methanol = 95 : 5) = 0,11
Rf (Chloroform-Methanol = 8 : 2) = 0,75
Rf (43A) = 0,76
Das als Ausgangsmaterial verwendete Z-Lys(BOC) Lys(BOC)-OCH-3, F. 78-840 kann aus Z-Lys(BOC)-OH und H-Lys(BOC)-OCHn (vgl. belg. Patent Nr. 594 338) durch Kondensation mittels Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt werden.
2. H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH2
3 g Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-NH2 werden unter leichtem Erwärmen in 100 ml Methanol gelöst und mit 500 mg Palladiumkohle (10% Pd) in der Schüttelente unter Absorption des sich bildenden Kohlendioxyds-bei Raumtemperatur hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist nach etwa 1 Stunde beendet, und nach einer weiteren Stunde wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Das in quantitativer Ausbeute erhaltene Rohprodukt wird aus Essigester-Petroläther umkristallisiert und weist dann einen F. von 110-1120 auf.
Auf Silicagel ergeben sich folgende Rf-Werte:
Rf (Chloroform-Methanol = 8 : 2) = 0,32
Rf (43A) = 0,35
Rf (52) = 0,65 3. Z-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)- Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2
5,13 g Z-Lys (B OC)-Pro-Val-Gly-Lys (BOC)-Lys(BOC)-
NHNH2 (schweiz. Patent Nr. 485 6703 werden in 60 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und auf - 250 abgekühlt.
Bei dieser Temperatur gibt man tropfenweise unter Rühren 8,8 ml 2,1 15n Salzsäure hinzu und zuletzt noch 0,973 ml 5n Natriumnitritlösung. Die Reaktionslösung wird während 15 Minuten bei - 100 gerührt, worauf man eine auf -100 vorgekühlte Lösung von 2,0 g
H-Lys (B GC)-Lys(B O C) -NH2 in 10 ml Dimethylformamid zufügt und dann noch 2,6 ml Triäthylamin zutropft. Man rührt während 30 Minuten bei 0 und lässt dann während etwa 20 Stunden bei 0 stehen. Zur Isolierung des Rohproduktes engt man auf etwa 30 ml ein, fällt durch Zugabe von 150 ml Wasser und filtriert den flockig-gallertigen Niederschlag ab.
Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Methanol-Wasser (2: 1) wird das geschützte Octapeptid in feinkristallisierter und chromatographisch reiner Form vom F. = 220-2210 (Zersetzung) erhalten. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:
Rf (Chloroform-Methanol = 9 :1) = 0,47
Rf (43A) = 0,75 4. H-Lys(B OC)-Pro-Val-Gly-Lys (B OC)-Lys(BOC)- Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2
1,0 g der oben beschriebenen Carbobenzoxy-Verbindung wird in 250 ml Methanol gelöst und mit 200 mg Palladiumkohle (10% Pd) in der Schüttelente bei Zimmertemperatur und unter Kohlendioxyd-Absorption hydriert.
Nach 6 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockene eingeengt und der Rückstand noch zweimal aus Methanol-Wasser umgefällt. Man erhält 738 mg chromatographisch einheitliches Octapeptidderivat, das auf Silicagel die folgenden Rf-Werte aufweist:
Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,14
Rf (52) = 0,63
Rf (43A) = 0,28 5. B OC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg- Try-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-
Lys(BOC)-Lys(BOC) -Lys(B OC)-NH2
988 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His Phe-Arg-Try-Gly-OH und 736 mg H-Lys(BOC)-Pro-Val Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC3-NH2 werden in 20 ml Pyridin suspendiert und nach Zugabe von 0,3 ml Wasser und 0,835 ml 1n Salzsäure während 15 Minuten bei 500 gerührt.
Nach Zugabe von 378 mg Dicyclohexylcarbodiimid rührt man während 3 Stunden bei 500, gibt dann nochmals gleich viel Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt weitere 3 Stunden bei 500 und engt dann bis zur Blildung eines halbfesten Rückstandes ein. Durch Erwärmen mit 20 ml Dimethylformamid werden die Peptide gelöst und durch Filtration vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff abgetrennt.
Das Filtrat wird bis zur Bildung eines dickflüssigen Rückstandes eingeengt und daraus durch Zugabe von 50 ml Wasser ein schmieriges Rohprodukt ausgefällt, das von der Mutterlauge abgetrennt und getrocknet wird. Durch zweimaliges Umfällen aus Dimethylformamid-Methanol-Essigester erhält man 1,29 g Rohprodukt, das zur endgültigen Reinigung einer Craig-Verteilung im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloro form-Tetrachlorkohlenstoff (10 : 3 : 7 :
4) [Puffer = 28,5 ml Eisessig + 19,25 g Ammoniumacetat in 960 ml Wassers mit Phasenvolumina von je 10 ml unterworfen wird. (Zu Beginn wird die Substanz gleichmässig verteilt in die ersten 5 Elemente eingefüllt.) Nach 171 Stufen isoliert man aus den Elementen Nr. 50-74 (rmax = 62; K=0,57) durch Einengen zur Trockene und Absublimieren des Ammoniumacetates bei 400 im Hochvakuum das dünnschichtchromatographisch einheitliche ge schützte Octadecapeptid-amid als reines, amorphes Pulver vom F. = etwa 210-2250 (Zersetzung). Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:
Rf (Chloroform-Methanol = 75 : 25) = 0,51
Rf (43C) = 0,62
Rf (52) = 0,55
Rf (100) = 0,43
Das als Ausgangsstoff verwendete Decapeptidderivat ist im Hauptpatent beschrieben.
6. H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-ArgTry-Gly- Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 (D-Ser1-Lys97Bt8-ss - 8-Corticotropin-Lys18-amid)
400 mg geschütztes Octadecapeptid-amid werden in 8 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und während 30 Minuten bei 250 stehengelassen. Man engt sodann auf ein Volumen von etwa 3 ml ein, gibt 20 ml Wasser zu, engt nochmals ein und lyophiliert. Das so erhaltene Trifluoracetat des Octadecapeptid-amides wird zur Umwandlung in das Acetat in wenig Wasser gelöst und langsam durch eine Säule (O = 11 mm; 1 = 16 cm) von schwach basischem Ionenaustauscher (z. B. Merck Nr. II) in der Acetatform filtriert. Das Eluat wird auf ein kleines Volumen konzentriert, lyophilisiert und bei 400 im Hochvakuum nachgetrocknet.
Man erhält 301 mg chromatographisch und elektrophoretisch einheitliches Acetat des D-Ser1-Lys17'18-ss1 - 18-Corticotropin-Lys18-amids als amorphes, weisses Pulver von unscharfem Zersetzungspunkt bei etwa 170-180 . Im Dünnschichtchromatogramm an Aluminiumoxyd werden folgende Rf-Werte erhalten:
Rf (52A) = 0,13
Rf (101) = 0,32
Bei der Papierelektrophorese (16 Volt/cm) bei pH 6,1 (Pyridinacetatpuffer) läuft die Verbindung in 2 Stunden 11,5 cm gegen die Kathode.
Beispiel 2
Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her:
Acetat des D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18
Corticotropin-Lys'8-amids 0,5 mg
ZnSO4 + 7 H2O 1,23 mg
Na3PO4 + 12 H2O 1,38 mg
Mannit 40,0 mg
Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 1 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt. Man erhält eine Suspension mit einem pH von 7,6.
Beispiel 3
Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her:
Acetat des D-serl-Lysl7ls-,g1- 18¯
Corticotropin-Lys'8-amids 0,5 mg ZnSO4+7H,O 1,23 mg
Mannit 40,0 g und eine Lösungsampulle mit folgender Zusammensetzung der Lösung: Na3PO4 + 12 H20 1,38 mg
Versene - Fe-3 0,1 mg dest. Wasser ad 1,0 ml
Vor Gebrauch werden der Inhalt der Trockenampulle und der Lösungsampulle vermischt. Die erhaltene Suspension hat ein pH von 7,6.
Beispiel 4
Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden Komponenten her:
Acetat des D-SerÚ-Lysl7,18-ss1-18-
Corticotropin-Lys18-amids 0,5 mg
Gelatine 280,0 mg
Phenol 5,0 mg dest. Wasser ad 1,0 ml
Beispiel 5
Eine steril filtrierte wässrige Lösung von D-Ser-Lyst7 - 18-Corticotropin-Lyst8-amid- acetat wird unter aseptischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphosphat und Natriumchlorid vermischt und in Vials abgefüllt und lyophilisiert, so dass ein Trockenvial erhalten wird, das folgende Komponenten enthält:
Acetat des D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18 Corticotropin-Lys's-amids 0,5 mg
N atrium-Polyphloretinphosphat (86,5%ig) 23,20 mg
NaCl 12,28 mg
Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 2 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt.
Beispiel 6
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her:
Acetat des D-Ser'-Lys17'8-ss1-'8-
Corticotropin-Lys'8-amids 1,0 mg ZnC12 10,5 mg
Na2HPO4 1,7 mg
Benzylalkohol 17,0 mg
NaCl 2,5 mg
NaOH ad pH 8,0
Aqua dest. ad 2 ml
Beispiel 7
2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 11 000 werden in etwa 5,7 ml 10% iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser'-Lyst7,t8-ss-' - 8-Corticotropin-Lys'8-amid- acetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert.
Sie enthält pro ml:
Acetat des D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18 Corticotropin-Lyst8-amids 0,5 mg Poly-Lglutaminsäure 200,0 mg
Natronlauge bis pH 7,4
Merthiolat 0,02 mg
Aqua dest. 1,0 ml
Beispiel 8
2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 10 % iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg Acetat des D-Ser'-Lys'7'18-ss' - 18-Corticotropin-Lys18-amids und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst. Zu dieser Lösung wird 1 ml einer salzsauren Zinkchloridlösung (pH 2,8) mit 5,2 mg Zinkchlorid pro ml gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml aufgefüllt.
Beispiel 9
2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 10 % iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lö- sung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden 5,0 mg Acetat des D-Sert-Lyst7,t8,Bt - 8-Corticotropin-Lys8-amids und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst. Zu dieser Lösung werden 1 ml einer salzsauren Lösung (pH 2,8) enthaltend 5,2 mg Zinkchlorid und 0,85 mg Dinatriumphosphat (wasserfrei) gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt. Man füllt mit Wasser auf ein Volumen von 10 ml auf.
Beispiel 10
Man löst 11,12 mg Eisessig, 1,21 mg Natriumacetat, 2,5 mg Natriumchlorid und 2,0 mg D-5er1-Lys17'18-fl1 - 18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf. Die Lösung wird bei 1200 20 Minuten autoklaviert. Das pH ist nach der Sterilisation 3,7.
Beispiel 11
Man löst in 0,7 ml physiologischer Natriumchloridlösung 0,5 mg D-5er1-Lys17'18-ss1 18-ss1- 18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat und säuert die Lösung mit 0,in Salzsäure auf pH 3,2 an.
Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml aufgefüllt und wie in Beispiel 1 hitzesterilisiert.
Beispiel 12
In 0,8 ml destilliertem Wasser werden 7,05 ml Glycin und 6,08 mg Natriumchlorid gelöst und 0,055 ml 0,ln HC1 zugefügt. Anschliessend wird 1,0 mg
D-SerÚ-Lys17,18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat in der Lösung aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.
Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 1200 20 Minuten autoklaviert.
Das pH beträgt 3,6.
Beispiel 13
In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung von 10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml in Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0, in Salzsäure hergestellt. In dieser Lösung werden 4,0 mg
D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 0,1 ml aufgefüllt.
Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 1200 20 Minuten autoklaviert.
Das pH beträgt 3,6.
Beispiel 14
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser1-Lys'718,ss' - 18-Cortico tropin-Lyst8-amid-acetat 1,0 mg
ZnCl2 5,25 mg Na2HPO4 - 2 H20 1,05 mg
NaCl 2,0 mg
Benzylalkohol 10,0 mg
NaOH ad pH 8,3
Dest. Wasser ad 1,0 ml
Beispiel 15
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser-Lysl7il8,ss1- 18-Cortico- tropin-Lyst8-amid-acetat 1,0 mg ZnCl2 6,30 mg
Na2NPO4.2H2O 1,26 mg
NaCl 1,5 mg
Benzylalkohol 10,0 mg
NaOH ad pH 8,3
Dest.
Wasser ad 1,0 ml
Beispiel 16
Man stellt 0,5 ml einer salzsauren Lösung von 0,5 mg
D-SerÚ-Lys17,18-ss-1 - 18-Corticotropin-Lys'8-amid- acetat, 5,25 mg ZnCl2, 1,05 mg Na2HPO4 2 HoO und 2,0 mg NaCl vom pH 3,0 her und gibt die Lösung zu 0,5 ml einer wässrigen Lösung von 10 mg Benzylalkohol, die so viel Natronlauge enthält, dass eine Suspension vom pH 8,3 erhalten wird.
Beispiel 17
5 mg Poly-L-glutaminsäure vom mittleren Molekulargewicht 39 600 werden in 5 ml 0,1n Natronlauge gelöst. Man filtriert die Lösung, gibt eine Lösung von 2,5 mg D-Ser1-Lys17'18-ss' - 18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat hinzu, säuert dann mit Essigsäure oder Salzsäure auf pH 4 an und füllt mit Wasser auf 101 ml auf. Dabei fällt ein
Poly-L-glutaminsäure-D-SerÚ-Lys17,18-ss-1 - 18 Corticotropin-Lysl8-amid-Komplex fein verteilt aus. Die Suspension enthält pro ml 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure und 0,25 mg D-Ser1-Lys17'18-p-1 - 18-Corticotropin-Lys18-amld als Komplexverbindung.
Beispiel 18
2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 39 600 werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt. In dieser Lösung werden dann 4,0 mg D-Ser1-Lys17'15-fi1 18-ss1- 18-Corticotropin-Lys18-amid-acetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml: D-Ser1-Lys17'18-ss-' - 18-Cortico- tropin-Lysl8-amid-acetat 4,0 mg
Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg
Natronlauge bis pH 7,4
Merthiolat 0,02 mg
Dest.
Wasser ad 1,0 ml
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH Wirkung der Formel
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl (oder L-glutaminyl) -L-histidyl-L-phenylalanyl-L- arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysin-amid und von Säureadditionssalzen dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man zu ihrem Aufbau nötige Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende reaktive funktionelle Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen intermediär schützt, die Carboxylgruppe des endständigen Lysinrestes zu Beginn oder zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt,
indem man das Octadecapeptid durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Schutzgruppe für die Aminogruppen die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und als Schutzgruppe für die Carboxylgruppen die tert.-Butylgruppe verwendet.
2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man sämtliche Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäure abspaltet.
3. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteransprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-
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Process for the production of new peptides with ACTH effects
Peptides have already been described which are distinguished by an increased ACTH effect and which differ from the known peptides with ACTH effect in that they have a D-amino acid as the first a-amino acid at the amino end, cf.
z. B. Swiss Patent No. 499497.
It has now been found that an octadecapeptide amide which contains lysine residues instead of the arginine residues in the 17,18-position has a particularly good adrenocorticotropic effect.
The present invention relates to a process for the preparation of D-seryl-L-tyros y1-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl (or L-glutamine) -L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl -L-lysyl-L-prolyl-L-vaWl- giycyl-L-lysyl-L4ysyl-L-lysyl-L4ysinamids and their acid addition salts and complexes.
As acid addition salts, particular mention should be made of salts of therapeutically applicable acids, such as hydrochloric acid, acetic acid, but especially sparingly soluble salts, such as sulfates, phosphates or sulfonates.
Complexes are to be understood as meaning the complex-like compounds, whose structure has not yet been clarified, which arise when certain inorganic or organic substances are added to adrenocorticotropic peptides, and above all those which give them a prolonged effect. Such inorganic substances are compounds which are derived from metals such as calcium, magnesium, aluminum, cobalt and in particular from zinc, especially sparingly soluble salts such as phosphates and pyrophosphates and hydroxides of these metals. Organic substances that cause the effect to be prolonged are, for example, non-antigenic gelatin, e.g. B.
Oxypolygelatine, polyvinylpyrrolidone and carboxymethyl cellulose, also sulfonic acid or phosphoric acid esters of alginic acid, dextrin, polyphenols and polyalcohols, especially polyphloretin phosphate and phytic acid, as well as polymers and copolymers of amino acids, e.g. B. protamine and in particular of amino acids that have a predominant proportion of acidic sz-amino acids, such as glutamic acid or aspartic acid.
As already mentioned, the new compounds have a significantly stronger ACTH activity than the corresponding compounds with an L configuration at the first amino acid. Accordingly, they should be used in human and veterinary medicine, e.g. B. instead of the natural hormone.
The new peptides are prepared according to the methods known for the manufacture of peptides with a large chain length using a D-amino acid as the N-terminal amino acid. The amino acids are linked individually in the order mentioned or after prior formation of smaller peptide units. Particularly noteworthy is the so-called solid support synthesis (cf. Merrifield, J. Am.
Chem. Soc. 85, 2149 [1963]), in which the peptide from the carboxyl end, which is firstly bound to a polymer, is built up by condensing the amino acids on in sequence. As condensation methods, e.g. mentioning the carbodiimide method, the azide method, the activated ester method and the anhydride method. For example, one of the amino acid or peptide molecules in the form of an ester with another amino acid or peptide molecule containing a protected amino group, in the presence of a condensing agent such as a carbodiimide or a phosphorous acid ester halide, link, or you can with the amino acid or.
Peptide ester with free amino group an amino acid or a peptide with activated carboxyl group (and protected amino group), e.g. an acid halide, azide, anhydride, imidazolide, isoxazolide (e.g. 13. from N athyl-5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonate, 5. Woodward et al., J. Am. Chem. Soc. 89 , 1011 [1961]), or an activated ester such as cyanomethyl ester, carboxymethyl thiol ester or nitrophenyl ester. Conversely, an amino acid or a peptide with a free carboxyl group (and a protected amino group) with an amino acid or a peptide with an activated amino group (and a protected carboxyl group), e.g. B.
a phosphite amide to react.
Free functional groups not involved in the reaction are expediently protected, in particular by means of radicals which can be easily split off by hydrolysis or reduction, the carboxyl group preferably by esterification, e.g. B. with methanol, tert-butanol, benzyl alcohol, p-nitrobenzyl alcohol, or amide formation, the amino group, for example, by introducing the tosyl, trityl, formyl, trifluoroacetyl, o-nitrophenylsulfenyl, phthalyl or carbobenzoxy group or colored protective groups, such as the p-phenylazo-benzyloxycarbonyl group and the p (p'-methoxy-phenylazo) -ben- zyloxycarbonyl group, or especially of the tert. Butyloxycarbonyl radical. The nitro group is suitable for protecting the amino group in the guanido grouping of arginine;
However, the said amino group of arginine does not necessarily have to be protected during the reaction. The imino group of the histidine can be protected by the benzyl or trityl radical.
The conversion of a protected amino or imino group into a free group and the conversion of a functionally modified carboxyl group into a free carboxyl group in the course of the process takes place according to methods known per se by treatment with hydrolyzing or reducing agents.
The method according to the invention is therefore characterized in that the amino acids required to build up the new peptides are condensed with one another to form CONH bonds in any chronological order, groups not participating in the reaction being protected by introducing protective groups suitable for protecting such groups, which Carboxyl group of the terminal lysine residue is converted into the amide group at the beginning or at any point in time of the synthesis and, if necessary, the acid addition salts are prepared by converting the octadecapeptide into the corresponding salts by reaction with inorganic or organic acids.
A preferred method is that the tripeptide containing the first 3 amino acids, D-Ser-Tyr-Ser-OH (the abbreviated notation refers to L-amino acids if the D- is not specifically designated), or also the 4. Amino acid containing tetrapeptide with the heptapeptide or
Hexapeptide of the following amino acids condensed up to amino acid 10, preferably by the azide method, and then the decapeptide is condensed with the octapeptide ester or amide of amino acids 11-18.
In this condensation, the coupling method used is preferably the carbodiimide method or the activated ester method, especially by means of the pnitrophenyl ester. In the latter case, the p-nitrophenyl ester of the decapeptide need not be isolated as such, but can also be formed in the condensation stage itself from the decapeptide with a free carboxyl group, p-nitrophenol and dicyclohexylcarbodiimide. The decapeptide is thus present as an α-amino-protected peptide with a free carboxyl group or with a pnitrophenyl ester group. The side chain amino groups present in the peptide fragments to be condensed are preferably replaced by the tert. - Butyloxycarbonyl group, the carboxyl groups are protected by the tert-butyl ester group.
These protective groups can be split off in the last stage with trifluoroacetic acid.
Depending on the procedure, the new compounds are obtained in the form of bases or their salts. The bases can be obtained from the salts in a manner known per se. From the latter, in turn, salts can be obtained by reaction with acids which are suitable for the formation of therapeutically useful salts, e.g.
B. those only inorganic acids such as hydrohalic acids, for example hydrochloric acid or hydrobromic acid, perchloric acid, nitric acid or thiocyanic acid, sulfuric or phosphoric acids, or organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid , Fumaric acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, hydroxymaleic acid, dihydroxymaleic acid, benzoic acid, phenylacetic acid, 4-amino-benzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, anthranilic acid, cinnamic acid, mandelic acid, salicylic acid, 4-amino-salicylic acid, 2-oxy-benzoic acid, , Methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid,
p-toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid or sulfanilic acid.
The peptides obtained according to the method can be used in the form of pharmaceutical preparations. These contain the peptides in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral or parenteral administration.
They can also be used with the additives customary in ACTH therapy to prolong the effect, such as. B. Oxypolygelatine, Polyphloretinphosphat, Carboxymethylcellulose, or the sparingly soluble metal compounds mentioned above, in particular phosphates, pyrophosphates or hydroxides of zinc combine.
In the following examples the temperatures are given in degrees Celsius.
The thin-layer chromatographic systems are designated as follows: System 43A: tert-amyl alcohol-isopropanol-water (100: 40: 10) System 43C: tert-amyl alcohol-isopropanol-water (100: 40: 55) System 52: n-butanol - glacial acetic acid-water (100: 10: 30) system 52A: n-butanol-glacial acetic acid-water (67: 10: 23) system 100: ethyl acetate-pyridine-glacial acetic acid-water (62: 21: 6: 11) system 101: n-butanol-pyridine-glacial acetic acid-water (30: 20: 6: 24)
The following abbreviations are used:
Z = carbobenzoxy
BOC = tert-butyloxycarbonyl tBu = tert-butyl.
Example I 1. Z-Lys (Boc) -Lys (Boc) -NH2
5 g of ZLys (BOC> Lys (BOC) -OCH3 are dissolved in 100 ml of absolute methanol, saturated with ammonia gas at room temperature and left to stand for 30 hours in a sealed flask. The solution is then concentrated to about 25 ml and in the It is filtered off, washed with a little cold methanol and the crystals are dried in vacuo, giving 3.95 g of Z-Lys (BOC) Lys (BOC) -NH2 with a melting point of 1650.
The compound shows the following Rf values in thin-layer chromatography on silica gel:
Rf (chloroform-methanol = 95: 5) = 0.11
Rf (chloroform-methanol = 8: 2) = 0.75
Rf (43A) = 0.76
The Z-Lys (BOC) Lys (BOC) -OCH-3, F. 78-840 used as starting material can be made from Z-Lys (BOC) -OH and H-Lys (BOC) -OCHn (see Belgian Patent No. . 594 338) by condensation using dicyclohexylcarbodiimide.
2. H-Lys (BOC) -Lys (BOC) -NH2
3 g of Z-Lys (BOC) -Lys (BOC) -NH2 are dissolved in 100 ml of methanol with gentle warming and hydrogenated with 500 mg of palladium carbon (10% Pd) in a shaking duck with absorption of the carbon dioxide that forms at room temperature. The uptake of hydrogen ceases after about 1 hour, and after a further hour the catalyst is filtered off and the filtrate is concentrated to dryness. The crude product obtained in quantitative yield is recrystallized from ethyl acetate-petroleum ether and then has an F. of 110-1120.
The following Rf values are obtained on silica gel:
Rf (chloroform-methanol = 8: 2) = 0.32
Rf (43A) = 0.35
Rf (52) = 0.65 3. Z-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -NH2
5.13 g Z-Lys (B OC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) -
NHNH2 (Swiss Patent No. 485 6703 are dissolved in 60 ml of absolute dimethylformamide and cooled to - 250).
At this temperature, 8.8 ml of 2.1 15N hydrochloric acid are added dropwise with stirring, and finally 0.973 ml of 5N sodium nitrite solution. The reaction solution is stirred for 15 minutes at -100, whereupon a solution of 2.0 g which has been pre-cooled to -100
H-Lys (B GC) -Lys (B O C) -NH2 in 10 ml of dimethylformamide is added and then another 2.6 ml of triethylamine are added dropwise. The mixture is stirred at 0 for 30 minutes and then left to stand at 0 for about 20 hours. To isolate the crude product, it is concentrated to about 30 ml, precipitated by adding 150 ml of water and the flaky, gelatinous precipitate is filtered off.
After two recrystallizations from methanol-water (2: 1), the protected octapeptide is obtained in finely crystallized and chromatographically pure form with a melting point of 220-2210 (decomposition). It has the following Rf values on silica gel:
Rf (chloroform-methanol = 9: 1) = 0.47
Rf (43A) = 0.75 4. H-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) -Lys (Boc) -Lys (Boc) -NH2
1.0 g of the carbobenzoxy compound described above is dissolved in 250 ml of methanol and hydrogenated with 200 mg of palladium carbon (10% Pd) in a shaking duck at room temperature and with absorption of carbon dioxide.
After 6 hours, the catalyst is filtered off, the filtrate is concentrated to dryness and the residue is reprecipitated twice more from methanol-water. 738 mg of chromatographically uniform octapeptide derivative are obtained which has the following Rf values on silica gel:
Rf (chloroform-methanol = 9: 1) = 0.14
Rf (52) = 0.63
Rf (43A) = 0.28 5. BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (OtBu) -His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -
Lys (BOC) -Lys (BOC) -Lys (B OC) -NH2
988 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (OtBu) -His Phe-Arg-Try-Gly-OH and 736 mg H-Lys (BOC) -Pro-Val Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) -Lys (BOC) -Lys (BOC3-NH2 are suspended in 20 ml of pyridine and, after adding 0.3 ml of water and 0.835 ml of 1N hydrochloric acid, stirred at 500 for 15 minutes.
After adding 378 mg of dicyclohexylcarbodiimide, the mixture is stirred for 3 hours at 500, then the same amount of dicyclohexylcarbodiimide is added again, the mixture is stirred for a further 3 hours at 500 and then concentrated until a semi-solid residue is formed. The peptides are dissolved by heating with 20 ml of dimethylformamide and separated from the insoluble dicyclohexylurea by filtration.
The filtrate is concentrated until a viscous residue is formed and a greasy crude product is precipitated therefrom by adding 50 ml of water, which is separated from the mother liquor and dried. By reprecipitating twice from dimethylformamide-methanol-ethyl acetate, 1.29 g of crude product are obtained, which for the final purification of a Craig partition in the methanol-buffer-chloroform-carbon tetrachloride (10: 3: 7:
4) [buffer = 28.5 ml of glacial acetic acid + 19.25 g of ammonium acetate in 960 ml of water with phase volumes of 10 ml each. (At the beginning the substance is poured evenly into the first 5 elements.) After 171 steps, one isolates from the elements no.50-74 (rmax = 62; K = 0.57) by concentrating to dryness and subliming off the ammonium acetate at 400 in a high vacuum the uniform ge protected octadecapeptide amide as a pure, amorphous powder of F. = about 210-2250 (decomposition). It has the following Rf values on silica gel:
Rf (chloroform-methanol = 75:25) = 0.51
Rf (43C) = 0.62
Rf (52) = 0.55
Rf (100) = 0.43
The decapeptide derivative used as the starting material is described in the main patent.
6. HD-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-ArgTry-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 (D-Ser1-Lys97Bt8-ss - 8- Corticotropin-lys18-amide)
400 mg of protected octadecapeptide amide are dissolved in 8 ml of 90% strength trifluoroacetic acid and left to stand at 250 for 30 minutes. It is then concentrated to a volume of about 3 ml, 20 ml of water are added, the mixture is concentrated again and lyophilized. The trifluoroacetate of the octadecapeptide amide obtained in this way is dissolved in a little water to convert it into the acetate and slowly passed through a column (O = 11 mm; 1 = 16 cm) of weakly basic ion exchanger (e.g. Merck No. II) in the Acetate form filtered. The eluate is concentrated to a small volume, lyophilized and dried at 400 in a high vacuum.
301 mg of chromatographically and electrophoretically uniform acetate of D-Ser1-Lys17'18-ss1-18-corticotropin-Lys18-amide are obtained as an amorphous, white powder with an unsharp decomposition point of about 170-180. The following Rf values are obtained in the thin-layer chromatogram on aluminum oxide:
Rf (52A) = 0.13
Rf (101) = 0.32
With paper electrophoresis (16 volts / cm) at pH 6.1 (pyridine acetate buffer), the compound runs 11.5 cm against the cathode in 2 hours.
Example 2
A dry ampoule is made from the following components:
Acetate of D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18
Corticotropin-Lys'8-amides 0.5 mg
ZnSO4 + 7 H2O 1.23 mg
Na3PO4 + 12 H2O 1.38 mg
Mannitol 40.0 mg
Before use, the contents of the dry vial are mixed with 1 ml of distilled water contained in a solution ampoule. A suspension with a pH of 7.6 is obtained.
Example 3
A dry ampoule is made from the following components:
Acetate of D-serl-Lysl7ls, g1-18¯
Corticotropin-Lys'8-amides 0.5 mg ZnSO4 + 7H, O 1.23 mg
Mannitol 40.0 g and a solution ampoule with the following composition of the solution: Na3PO4 + 12 H20 1.38 mg
Versene - Fe-3 0.1 mg dist. Water to 1.0 ml
The contents of the drying ampoule and the solution ampoule are mixed before use. The suspension obtained has a pH of 7.6.
Example 4
A solution ampoule is made from the following components:
Acetate of D-SerÚ-Lysl7,18-ss1-18-
Corticotropin-Lys18-amides 0.5 mg
Gelatin 280.0 mg
Phenol 5.0 mg dist. Water to 1.0 ml
Example 5
A sterile filtered aqueous solution of D-Ser-Lyst7-18-corticotropin-Lyst8-amide acetate is mixed under aseptic conditions with sodium polyphloretin phosphate and sodium chloride and filled into vials and lyophilized so that a dry vial is obtained which contains the following components :
D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18 acetate corticotropin-Lys's-amide 0.5 mg
N atrium polyphloretin phosphate (86.5%) 23.20 mg
NaCl 12.28 mg
Before use, the contents of the dry vial are mixed with 2 ml of distilled water contained in a solution ampoule.
Example 6
A suspension is made from the following components:
D-Ser'-Lys17'8-ss1-'8- acetate
Corticotropin-Lys'8-amides 1.0 mg ZnC12 10.5 mg
Na2HPO4 1.7 mg
Benzyl alcohol 17.0 mg
NaCl 2.5 mg
NaOH ad pH 8.0
Aqua dest. ad 2 ml
Example 7
2.0 g of poly-L-glutamic acid with an average molecular weight of about 11,000 are dissolved in about 5.7 ml of 10% sodium hydroxide solution so that the pH of the solution is 7.4. 5.0 mg of D-Ser'-Lyst7, t8-ss- '- 8-corticotropin-Lys'8-amide acetate and 0.2 mg of merthiolate are dissolved in this solution and made up to 10 ml with distilled water. The solution is filtered sterile.
It contains per ml:
D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18 acetate corticotropin-lyst8-amide 0.5 mg poly-Lglutamic acid 200.0 mg
Sodium hydroxide solution up to pH 7.4
Merthiolate 0.02 mg
Aqua dest. 1.0 ml
Example 8
2.0 g of poly-L-glutamic acid are dissolved in about 5.7 ml of 10% sodium hydroxide solution so that the pH of the solution is 7.4. 5.0 mg of acetate of D-Ser'-Lys'7'18-ss'-18-corticotropin-Lys18-amide and 0.2 mg of merthiolate are dissolved in this solution. 1 ml of a hydrochloric acid zinc chloride solution (pH 2.8) containing 5.2 mg of zinc chloride per ml is added to this solution. The pH is adjusted to 7.8 with sodium hydroxide solution and made up to a final volume of 10 ml with distilled water.
Example 9
2.0 g of poly-L-glutamic acid are dissolved in about 5.7 ml of 10% sodium hydroxide solution so that the pH of the solution is 7.4. 5.0 mg acetate of D-Sert-Lyst7, t8, Bt-8-corticotropin-Lys8-amide and 0.2 mg merthiolate are dissolved in this solution. 1 ml of a hydrochloric acid solution (pH 2.8) containing 5.2 mg of zinc chloride and 0.85 mg of disodium phosphate (anhydrous) are added to this solution. The pH is adjusted to 7.8 with sodium hydroxide solution. The volume is made up to 10 ml with water.
Example 10
11.12 mg of glacial acetic acid, 1.21 mg of sodium acetate, 2.5 mg of sodium chloride and 2.0 mg of D-5er1-Lys17'18-fl1-18-corticotropin-Lys18-amide acetate are dissolved in 0.7 ml of distilled water and make up to 1 ml with distilled water. The solution is autoclaved at 1200 for 20 minutes. The pH after sterilization is 3.7.
Example 11
Dissolve 0.5 mg of D-5er1-Lys17'18-ss1 18-ss1-18-corticotropin-Lys18-amide acetate in 0.7 ml of physiological sodium chloride solution and acidify the solution with 0 in hydrochloric acid to pH 3.2 .
It is made up to 1 ml with distilled water and heat-sterilized as in Example 1.
Example 12
7.05 ml glycine and 6.08 mg sodium chloride are dissolved in 0.8 ml distilled water and 0.055 ml 0.1N HC1 are added. Then 1.0 mg
D-SerÚ-Lys17,18-Corticotropin-Lys18-amide-acetate dissolved in the solution and made up to 1.0 ml with distilled water.
The solution is filtered in the usual way, filled into ampoules and autoclaved at 1200 for 20 minutes.
The pH is 3.6.
Example 13
A solution of 10.16 mg citric acid (with 1 mol of water of crystallization), 0.097 ml in sodium hydroxide solution, 3.54 mg sodium chloride and 0.51 ml 0 in hydrochloric acid is prepared in 0.8 ml of distilled water. In this solution 4.0 mg
D-SerÚ-Lys17,18-ss1-18-Corticotropin-Lys18-amide-acetate dissolved and made up to 0.1 ml with distilled water.
The solution is filtered in the usual way, filled into ampoules and autoclaved at 1200 for 20 minutes.
The pH is 3.6.
Example 14
A suspension is prepared from the following components: D-Ser1-Lys'718, ss'-18-Cortico tropin-Lyst8-amide acetate 1.0 mg
ZnCl2 5.25 mg Na2HPO4 - 2 H20 1.05 mg
NaCl 2.0 mg
Benzyl alcohol 10.0 mg
NaOH ad pH 8.3
Dist. Water to 1.0 ml
Example 15
A suspension is prepared from the following components: D-Ser-Lysl7il8, ss1-18-corticotropine-lyst8-amide acetate 1.0 mg ZnCl2 6.30 mg
Na2NPO4.2H2O 1.26 mg
NaCl 1.5 mg
Benzyl alcohol 10.0 mg
NaOH ad pH 8.3
Dest.
Water to 1.0 ml
Example 16
Place 0.5 ml of a hydrochloric acid solution of 0.5 mg
D-SerÚ-Lys17,18-ss-1 - 18-corticotropin-Lys'8-amide acetate, 5.25 mg ZnCl2, 1.05 mg Na2HPO4 2 HoO and 2.0 mg NaCl with a pH of 3.0 and add the solution to 0.5 ml of an aqueous solution of 10 mg of benzyl alcohol, which contains enough sodium hydroxide solution that a suspension with a pH of 8.3 is obtained.
Example 17
5 mg of poly-L-glutamic acid with an average molecular weight of 39,600 are dissolved in 5 ml of 0.1N sodium hydroxide solution. The solution is filtered, a solution of 2.5 mg of D-Ser1-Lys17'18-ss'-18-corticotropin-Lys18-amide acetate is added, then acidified to pH 4 with acetic acid or hydrochloric acid and made up with water 101 ml. It comes to mind
Poly-L-glutamic acid-D-SerÚ-Lys17,18-ss-1 - 18 corticotropin-Lysl8-amide complex finely divided. The suspension contains 0.5 mg of poly-L-glutamic acid and 0.25 mg of D-Ser1-Lys17'18-p-1-18-corticotropin-Lys18-amld as complex compound per ml.
Example 18
2.0 g of poly-L-glutamic acid with an average molecular weight of about 39,600 are dissolved in about 5.7 ml of 10% sodium hydroxide solution so that the pH of the solution is 7.4. 4.0 mg of D-Ser1-Lys17'15-fi1 18-ss1-18-corticotropin-Lys18-amide acetate and 0.2 mg of merthiolate are then dissolved in this solution and made up to 10 ml with distilled water. The solution is filtered sterile. It contains per ml: D-Ser1-Lys17'18-ss- '- 18-corticotropine-Lysl8-amide acetate 4.0 mg
Poly-L-glutamic acid 200.0 mg
Sodium hydroxide solution up to pH 7.4
Merthiolate 0.02 mg
Dest.
Water to 1.0 ml
PATENT CLAIM 1
Process for the preparation of new peptides with ACTH effect of the formula
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl (or L-glutaminyl) -L-histidyl-L-phenylalanyl-L- arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L- prolyl-L-valyl glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysine amide and acid addition salts of these compounds, characterized in that amino acids necessary for their construction are formed with the formation of CONH bonds in any chronological order condensed with one another, reactive functional groups not taking part in the reaction being intermediately protected by introducing protective groups suitable for protecting such groups, the carboxyl group of the terminal lysine residue being converted into the amide group at the beginning or at any point in time of the synthesis and, if appropriate, the acid addition salts being prepared,
by converting the octadecapeptide into the corresponding salts by reaction with inorganic or organic acids.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that the tert-butyloxycarbonyl group is used as the protective group for the amino groups and the tert-butyl group is used as the protective group for the carboxyl groups.
2. The method according to dependent claim 1, characterized in that all protective groups are split off by means of trifluoroacetic acid.
3. The method according to claim I or dependent claims 1 or 2, characterized in that one
D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-
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