Verfahren zur Herstellung von Cystinrest-haltigen Peptiden
Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Cystinrest-haltigen Peptiden.
In der Natur kommen verschiedene Cystinresthaltige Peptide vor, in welchen die Disulfidbrücke des Cystins in einem Ring liegt, z. B. Oxytocin, Vasopressine, Vasotocin, Isotocin, Mesotocin, Wachstumshormon, Thyrocalcitonin, Insulin. Anderseits kann die Disulfidbrücke des Cystins aber auch geradlinige Aminosäureketten miteinander verbinden, wie dies z. B.
bei den beiden Disulfidbrücken zwischen der A- und B-Kette des Insulins oder beim Glutathion der Fall ist.
Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Synthese solcher Disulfidbrücken enthaltender Peptide bekannt.
Ausser natürlichen Peptiden mit Disulfidbrücken wurden auch bereits eine grössere Zahl von aktiven Analogen, z. B. Desamino-oxytocin, Ser4-Oxytocin, Asn-Oxytocin, Val8-Oxytocin, Tyr"(O-Methyl)-Oxytocin, PheS-Arg8- Vasopressin, PheS-Lys8-Vasopressin, Phe2-Orn8-Vaso- pressin, Ile3-Arg8-Vasopressin, Asn4-Lys8-Vasopressin, synthetisiert.
Nach den bekannten Verfahren werden zur Herstellung der Disulfidbrücke zunächst aus einer die beiden zu verbindenden Cysteinreste enthaltenden Aminosäuresequenz, in welcher die Mercaptogruppen geschützt sind, beispielsweise durch Carbobenzoxy- oder Benzylgruppen oder durch die Tritylgruppe, die Mer capto-Schutzgruppen abgespalten, Benzyl beispielsweise mit Natrium in flüssigem Ammoniak, Trityl, z. B.
mittels Mercuriacetat, und Schwefelwasserstoff oder mit 10n Salzsäure, und dann wird das die freien Mercaptogruppen enthaltende Peptid zum Disulfid oxydiert, beispielsweise mit 1 ,2-Dijodäthan oder mit Sauerstoff.
Dieses Verfahren hat den Nachteil, dass die. genannten Abspaltungsmethoden Nebenreaktionen veranlassen, insbesondere bei empfindlichen Peptiden, und dass die Ausbeute dementsprechend beeinträchtigt wird. Beim Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung erhält man Cystinrest-haftige Peptide in einfacherer Weise und besserer Ausbeute. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende Cysteinreste enthaltende Peptide, in denen die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen geschützt sind, mit Jod behandelt.
Die Umsetzung findet bei Zimmertemperatur statt, kann aber auch, je nach der Art des Peptids, bei niedriger oder höherer Temperatur ausgeführt werden, z. B. bei Temperaturen von 0 bis 60 . Vorzugsweise führt man die Reaktion in einem Lösungsmittel, in welchem Jod und das Peptid wenigstens teilweise löslich sind, vorzugsweise in einem Alkohol wie einem niederen Alkanol, z.B. Äthanol oder insbesondere Methanol oder einem Gemisch eines Alkohols mit einem organischen Lösungsmittel, in welchem das Peptid löslich ist, wie Essigester, Dimethylformamid, Methylenchlorid, oder in Eisessig durch. Zweckmässig sorgt man für einen jeweiligen Überschuss an Jod, z. B.
durch Arbeiten in verdünnten Lösungen und Zugabe der Peptidlösung zur Jodlösung. Dabei wird ausschliesslich das gewünschte Monomere erhalten. Wird hingegen umgekehrt vorgegangen, z. B. die Jodlösung in eine Peptidlösung eingetropft, so werden beträchtliche Mengen Polymere gebildet. Aus der erhaltenen Lösung kann das überschüssige Jod beispielsweise mit Thiosulfat entfernt werden.
Bei der Reaktion werden als Ausgangsstoffe Peptide verwendet, in denen die freien Aminogruppen zweck mässig geschützt sind. Auch freie Hydroxyl- und Carboxylgruppen können, wenn erwünscht, in geschützter Form vorliegen. Als Amino-Schutzgruppen sind beispielsweise zu nennen Benzyl, Trifluormethyl, Phthaloyl, p-Toluolsulfonyl, oder vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls im aromatischen Rest durch Halogenatome, Niederalkyl- oder Niederalkoxy- oder Niedercarbalkoxygruppen substituierte Carbobenzoxygruppen, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzytoxycarbonyl, Tolyloxycarbonyl, 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-Tolyl-isopropyloxycarbonyl- und vor allem 2-p-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl (vgl. franz.
Patent Nr. 1 554 051), ferner aliphatische Oxycarbonylgruppen, wie z. B. Allyl oxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Amyloxy carbonyl, Adamantyloxycarbonyl und in erster Linie tert.-Butyloxycarbonyl.
Die Carboxylgruppen können, wenn erwünscht, z. B. durch Amidierung oder Veresterung geschützt sein. Als Ester sind z. B. diejenigen von Methanol, Methanol, Benzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, 2,4,5 Trichlorphenol, N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy phthalimid, oder vor allem von tert.-Butanol zu nennen.
Hydroxygruppen, z. B. von Serin- oder Tyrosinresten, können z. B. durch Verätherung, beispielsweise mit Benzylalkohol oder vorzugsweise mit tert.-Butanol geschützt sein. In Argininresten kann die Guanidinogruppe beispielsweise durch die Tosylgruppe geschützt sein.
Die bei dem vorliegenden Verfahren erhaltenen, Schutzgruppen aufweisenden Disulfid-Peptide können direkt für die Synthese von Peptiden mit längerer Aminosäurekette verwendet werden oder, wenn erwünscht, können die Schutzgruppen in bekannter Weise durch Hydrolyse oder Hydrogenolyse abgespalten werden.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Cysteinresthaltigen Peptide sind bekannt oder können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden. Unter Cysteinrest-haltigen Peptiden sind auch Peptide zu verstehen, in denen funktionelle Gruppen wie z. B. Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxygruppen mit den oben genannten oder anderen für die Peptidsynthese bekannten Schutzgruppen versehen sind, ferner Verbindungen, die statt eines oder beider zu verbindenden Cysteinreste Desaminocysteinreste enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben. In der Dünn schichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet: System 43A: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (100:40:10) System 43C: tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (51:21: 28) System 45: sek.-Butanol-3 %iges wässriges Ammo niak (70: 30) System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser (75 : 7,5 : 21) System 53: n-Butanol-Ameisens äure-Wasser (60 : 0,75 : 39) System 70: Äthylacetat-Pyridin-Wasser (40:20:40) System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (38 : 24: 8 : 30) System 1 02E: Essigester-Methyläthylketon-Eisessig
Wasser 50 : 30:10:10) System 121A:
Isopropanol-Ammoniak (26 %ig)-Was ser (85 : 5:10).
Folgende Abkürzungen werden verwendet:
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl; TRI = Trityl.
Beispiel 1 zeigt die Herstellung der geschützten N-terminalen Sequenz 1-9 des Thyrocalcitonins mit Disulfidrilìg; die Beispiele 2 und 8 zeigen die Disulfidverknüpfung des geschützten Fragments 20-21 der A-Kette mit dem geschützten Fragment 18-21 bzw.
19-21 der B-Kette des Insulins; die Beispiele 3, 7 und 9 zeigen die Herstellung von geschützten Peptid Dimeren mit Disulfidbrücke; die Beispiele 4-6 zeigen die Herstellung von Oxytocin, Lys8-Vasopressin und Phe-4, Lys8-Vasopressin nach dem neuen Verfahren.
Beispiel 1
EMI2.1
<tb> BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser-(tBu)-Thr(tBu)-Cys- <SEP>
<tb> <SEP> Val-Leu-OH
<tb>
Zu einer gerührten Lösung von 3,73 g (14,78 mMol) Jod in 500 ml Methanol werden bei Zimmertemperatur 2,50 g (1,478 mMol) BOC-Cys(TRl:)-Ser-(tBu)-Asn- Leu-Ser(tBu)-ThrftBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH in 500 ml Methanol innert 45 Minuten zugetropft. Nach beendetem Eintragen rührt man 1 Stunde weiter und entfärbt dann die Lösung bei 0 mit 1,0n wässriger Thiosulfatlösung (26,05 ml in Thiosulfat). Die klare Lösung wird am Wasserstrahlvakuum bei 300 auf etwa 100 ml eingeengt. Dann gibt man 1,5 Liter Wasser zu, filtriert das ausgefallene Produkt und wäscht es mit Wasser.
Nach dem Trocknen über Kaliumhydroxyd wiegt das Rohprodukt 2,32 g. Es wird zweimal mit Petroläther verrieben und zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetra chlorkohlenstoff (10 : 3 : 5 : 4) entworfen. [Puffer: 28,6 ml Eisessig; 19,25 g Ammoniumacetat, mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt.] Nach 135 Schritten befindet sich das Hauptprodukt in den Elementen 39-68 (rrn..ix 53; K =0,65). Der Inhalt dieser Elemente wird zusamrnen am Hochvakuum (400) zur Trockne eingedampft und das Ammoniumacetat absublimiert.
Das
EMI2.2
<tb> erhaltene <SEP> B <SEP> QC-Cys <SEP> - <SEP> Ser(tBu) <SEP> - <SEP> Asn <SEP> - <SEP> Leu <SEP> - <SEP> Ser(tBu) <SEP> - <SEP> Thr
<tb> (tBu)-Cys-Val-Leu-OH <SEP> (1,49 <SEP> g <SEP> = <SEP> 83 <SEP> S <SEP> der <SEP> Theorie)
<tb> erweist sich im Dünnschichtchromatogramm (Silicagel) als einheitlich. Ruf45 = 0,42; Rfl2lA = 0,70; Rf70 = 0,75; Ruf5? = 0,43; Rf.SA = 0,22. [Cr]2,3 = 160 (c = 2 in Chloroform). Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Nonapeptid kann wie folgt hergestellt werden: 1.
H-Thr(tBu)-OMe
12,92 g (40 mMol) Z-Thr(tBu)-OMe werden in 200 ml Eisessig und 3 g Pd-Kohle (10%) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme von Wasserstoff ist nach einer Stunde beendet. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Wasserstrahlvakuum bei 350 eingedampft. Nach dem Trocknen am Hochvakuum bei 350 resultieren 7,3 g eines Öls, das gemäss Dünnschichtchromatogramm einheitlich ist und direkt weiter verwendet wird.
2. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OMe
19,3 g (38,6 mMol) DPC-Ser(tBu)-OH, Cyclohexylaminsalz werden in 500 ml Chloroform aufgenommen und bei 0 dreimal mit 25 ml 1n Zitronensäure und fünfmal mit 40 ml halbgesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird eingedampft und der erhaltene Schaum in 250 ml Essigester aufgenommen. Man gibt 5,36 ml (38,6 mMol) Triäthylamin zu, kühlt die Lösung auf -10 ab und versetzt unter Rühren mit 5,13 ml (38,6 mMol) Isobutylchlorocarbonat. Es wird 10 Minuten bei -10 gerührt und dann die auf -120 gekühlte Lösung von 7,3 g (38,6 mMol) H-Thr(tBu)-OMe in 100 ml Essigester so zugetropft, dass die Reaktionstemperatur -10 nie übersteigt.
Nach beendetem Eintragen wird noch eine Stunde bei -100 gerührt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Die Lösung wird vom ausgeschiedenen Triäthylamin Hydrochlorid abfiltriert und bei 0 dreimal mit je 20 ml in Zitronensäure und fünfmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft.
Rohprodukt (Ö1): 22,07 g. Zur Reinigung wird 1 g an einer Silicagelsäule (2,5 cm, 30 cm) chromatographiert. Mit Petroläther-Essigester (1:1) werden nach einem Vorlauf von 110 ml 787 mg reines Produkt eluiert.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton (7 : 3) ist Rf = 0,51.
3. Z-Val-Leu-OMe
Man löst 19,9 g (110 mMol) H-Leu-OMe, HC1 in 120 ml Dimethylformamid und gibt bei 0 14,6 ml (105 mMol) Triäthylamin zu. Das ausgeschiedene Tri äthylamin-Hydrochlorid wird abfiltriert, das Filtrat zu einer Lösung von 25,1 g (100 mMol) Z-Val-OH in 200 ml Dimethylformamid (00) gegeben und dann 22,6 g (110 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid trocken zugefügt. Nach einer Stunde Rühren bei 0 und Stehen über Nacht im Kühlschrank wird filtriert und die Lösung am Hochvakuum bei 400 eingedampft. Der ölige Rückstand wird in 30 ml Essigester aufgenommen, die Lösung auf 0 abgekühlt und vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff befreit. Nach Zugabe von n-Hexan kristallisiert das Produkt aus dem Filtrat über Nacht aus.
F. 102-10150; [a12n0 : 410 (c = 2,88 in Methanol).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (98 : 2) ist Rf = 0,55 und in Toluol-Aceton (7 : 3) ist Rf = 0,60.
4. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NH2.
4,253 g (7,4 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-OMe in 18 ml Methanol werden mit 5,55 ml (etwa 110 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und 10 Stunden bei Zimmertemperatur und 2 Stunden bei 400 stehengelassen. Die Reaktionslösung wird in 450 ml Essigester aufgenommen und viermal mit halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird auf etwa 15 ml eingeengt und mit etwa 5 ml Petroläther versetzt. Über Nacht kristallisieren 3,17 g des Hydrazids vom F. 132-1340 aus.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in
Toluol-Aceton (7 : 3) ist Rf = 0,40.
5. H-Val-Leu-OMe,HCl
5,66 g (15 mMol) Z-Val-Leu-OMe werden in
75 ml Methanol in Gegenwart von 15 mMol Salzsäure und 850 mg Pd-Kohle (10 %) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme von Wasserstoff ist nach
3 Stunden beendet. Es wird vom Katalysator abfiltriert und die Lösung auf etwa 15 ml eingeengt. Bei Zugabe von Äther kristallisiert das Produkt aus. F. 136-1390.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in
Chloroform-Methanol (9:1) ist Rf = 0,45; in Toluol Aceton (1:1) ist Rf = 0,43.
6. TRI-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe
7,13 g (10 mMol) TRI-Cys(TRI)-OH, Diäthylaminsalz werden in Chloroform bei 0 mit 1n Zitronensäure und halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen, die Lösung getrocknet, eingedampft und der erhaltene Schaum in 50 ml Essigester aufgenommen. Dazu gibt man eine mit 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin versetzte Lösung von 3,22 g (10 mMol) H-Val-Leu-OMe, Hydrochlorid in 40 ml Essigester von 00, aus der man das ausgefallene Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert hat.
Dann versetzt man bei 0 mit 2,26 g (11 mMol) trokkenem Dicyclohexylcarbodiimid, rührt 21/2 Stunden bei 0 und lässt über Nacht im Kühlschrank stehen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und die Lösung bei 0 mit 1n Zitronensäure, 1n Natriumbicarbonat und halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird auf etwa 20 ml eingeengt, auf 0 gekühlt und von weiterem Dicyclohexylharnstoff abfiltriert.
Eindampfen zur Trockne ergibt 8,53 g Ester. Zur Reinigung wird das Rohprodukt an einer Silicagelsäule (5 cm; 55 cm) chromatographiert. Nach einem Vorlauf von 400 ml wird das Hauptprodukt mit 300 ml Petroläther-Essigester (1:1) in reiner Form eluiert.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (99:1) ist Rf = 0,43.
7. H-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe
11,08 g (13,3 mMol) TRI-Cys(TRI)-Val-Leu-OMe werden in 75 ml Essigester gelöst und 12,3 ml Wasser tropfenweise zugegeben, so dass stets eine klare Lösung bleibt. Nach einer Stunde Rühren bei Zimmertemperatur gibt man zur klaren Lösung 64 ml Wasser, filtriert den Niederschlag ab und wäscht mit kalter 50 %iger Essigsäure. Das Filtrat wird am Hochvakuum bei 400 zu einem Öl eingedampft, dieses in 250 ml Essigester aufgenommen und bei 0 mit ln Natriumbicarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen.
Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft, wobei 7,07 g eines weissen Produktes erhalten werden. Das Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Chloroform-Methanol (98 : 2) zeigt beim Besprühen mit Reindel-Hoppe-Reagenz einen Fleck vom Rf-Wert 0,30.
8. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-GMe
Zu 13,6 g (23,8 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu) NH2 in 220 ml Dimethylformamid werden bei -120 32,26 ml Salzsäure in Essigester (1,84n; 59,25 mMol) und 3,26 ml (28,55 mMol) tert.-Butylnitrit gegeben.
Nach 15 Minuten bei -100 lässt man dann die auf -100 gekühlte Lösung von 14,03 g (23,8 mMol) H-Cys (TRI)-Val-Leu-OMe und 8,315 ml (59,25 mMol) Tri äthylamin in 100 ml Dimethylformamid derart zutropfen, dass die Reaktionstemperatur -90 nie überschreitet.
Es wird noch eine Stunde bei 100 gerührt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Es wird vom ausgeschiedenen Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert, das Filtrat am Hochvakuum bei 400 eingedampft, der ölige Rückstand in 500 ml Essigester aufgenommen, mit 1n Zitronensäure, 1n Natriumbicarbonat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet, auf etwa 40 ml eingeengt und mit etwa 10 ml Petroläther versetzt. Über Nacht kristallisiert der geschützte Pentapeptidester vom F. 177-1780 aus.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (98 : 2) ist Rf = 0,45; in Toluol Aceton (7 : 3) ist Rf = 0,57.
9. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Val-Leu-OH
2,830 g (2 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys (TRI)-Val-Leu-OMe werden in 60 ml 75 %igem Dioxan gelöst und mit 3 ml 2n Natronlauge (6 mMol) versetzt.
Nach 11/2 Stunden bei Zimmertemperatur wird das Dioxan am Wasserstrahlvakuum bei 400 abgedampft, Essigester und Wasser zugegeben und bei 0 mit 1n Zitronensäure auf pH 3 gestellt. Die Essigester-Phase wird mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Es resultiert ein Produkt, das gemäss Dünnschichtchromatogramm an Silicagel einheitlich ist.
Rf in Chloroform-Methanol (7: 3) = 0,40; Rf45 = 0,55.
10. H-Ser(tBu)-Thr(tBu) -Cys (TRI)-Val-Leu-OH
2,22 g (2 mMol) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)- Val-Leu-OH werden in 20 ml Methylenchlorid gelöst und 12 ml Chloressigsäure in Wasser (aus 75 g Chloressigsäure und 25 ml Wasser) zugegeben. Die klare Lösung wird 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, auf 0 gekühlt und dann werden 70 ml Wasser zugegeben. Mit konzentriertem Ammoniak wird auf pH 6,5 eingestellt, wobei das Produkt ausfällt. Die wässrige Lösung wird abdekantiert und der Rückstand noch dreimal mit Wasser verrieben und dann lyophilisiert. Dreimaliges Verreiben des Produktes mit Äther liefert ein weisses Pulver, welches laut Dünnschichtchromatogramm einheitlich ist. Es wird in dieser Form weiter verwendet.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rfl, = 0,48; Rfloz = 0,65; Ruf52 = 0,75.
11. Z-Asn-Leu-OMe
16,7 g H-Leu-OMe und 46,0 g ZAsn-ONP werden in 100 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst.
Die Lösung wird 19 Stunden bei 250 stehengelassen.
Hierauf gibt man 1,2 Liter Wasser zu und nutscht die kristalline Fällung ab. Das Dipeptidderivat wird bei 40D im Vakuum getrocknet und dann zweimal aus Methanol-Wasser umkristallisiert. F. 180-1810; [a] + 90 (c = 2,05 in Chloroform).
12. H-Asn-Leu-OMe
15,0 g Z-Asn-OMe werden in 400 ml t-Butanol Wasser (9:1) gelöst und in Gegenwart von 2 g Palladium-Kohle (10S Pd) hydriert. Nach Beendigung der Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht und bei 400 eingedampft. Der Rückstand wird direkt weiter verwendet.
13. Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe
8,90 g H-Asn-Leu-OMe und 11,0 g Z-Ser(tBu)-OH werden in 100 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0 gekühlt und mit 3,90 g N-Hydroxysuccininimid und dann mit 8,70 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 30 Minuten Stehen bei 0' und 18 Stunden bei 250 wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und das Filtrat in 800 ml Eiswasser gegossen. Der dabei ausfallende, kristalline Niederschlag wird im Vakuum bei 40 getrocknet und dann aus Methanol-Wasser umkristallisiert. Das dabei in analysenreiner Form erhaltene Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe schmilzt bei F. 202 bis 2050; [ce]2D = -180 (c = 1,05 in Eisessig).
14. H-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe
6,3 g Z-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe werden in 600 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 1,2 g Palladium-Kohle (10X Pd) hydriert. Nach 1,25 Stunden wird vom Katalysator abgenutscht und im Vakuum bei 300 Badtemperatur zur Trockne eingedampft. Das dabei erhaltene kristalline Tripeptidderivat zeigt bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten im System Chloroform-Methanol (90:10) Rf = 0,11.
15. BOC-Cys(TRI)-Ser-(tBu)-Asn-Leu-OMe
5,0 g H-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe und 6,7 g BOC Cys(TRI)-ONP werden in 30 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Die gelbe Lösung wird 42 Stunden bei 260 stehengelassen. Hierauf wird durch Zugabe von 500 ml Eiswasser gefällt und das ausgefallene Produkt abgenutscht. Es wird in Essigester gelöst und die Lösung mit 5 % Zitronensäurelösung, und dann mit Wasser gewaschen. Hierauf wird unter Eiskühlung zur Entfernung von p-Nitrophenol fünfmal mit einem Gemisch von je 1 Volumteil 5 %Liter Kaliumcarbonat- und 5 %Der Kaliumbicarbonatlösung und dann mit Wasser gewaschen. Die Essigesterlösung hinterlässt nach Trocknen und Eindampfen ein harzartiges Produkt. Dieses wird viermal aus Aceton und Petroläther umgefällt.
Das dabei als festes Pulver erhaltene Teteapeptidderivat zeigt F. 181-1820; [a]2D 110 (c = 2,09 in Methanol).
Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten ist Rfg3z = 0,57; Rf in Essigester = 0,10; Rf in Toluol-Aceton (7 : 3) = 0,05; Rf in Chloroform Methanol (9:1) = 0,45.
16. BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-NHNH2
7,0 g BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-OMe werden in 70 ml Methanol gelöst und die auf 0 gekühlte Lösung mit 7 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach 16 Stunden bei 20 wird eine eiskalte Lösung von 600 ml 2n Essigsäure zugegeben, die gallertige Fällung gut zerrieben, abgenutscht und mit viel Wasser neutral gewaschen. Das erhaltene Pulver wird bei 400 im Vakuum getrocknet und dann in 100 ml Acetonitril suspendiert. Nach Zerreiben wird abgenutscht und bei 400 im Vakuum getrocknet. Das erhaltene BOC Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Hydrazid zeigt F. 216 bis 2180.
Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten weist es die folgenden Rf-Werte auf: Rf = 0,55 in Dioxan-Wasser (98 : 2); Rf = 0,52 in Chloroform Methanol (8 : 2); Rflo2F = 0,70.
17. BOC-Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)
Thr(tBu)-Cys(TRI) -Val-Leu-OH
Bei -150 werden zu 1,075 g (1,26 mMol) BOC Cys(TRI)-Ser(tBu)-Asn-Leu-NH-NH2 in 15 Dimethylformamid 1,71 ml Salzsäure in Essigester (I,84n; 3,15 mMol) und 0,174 ml (1,51 mMol) tert.-Butylnitrit (1,74 ml aus einer Lösung von 1 ml tert.-Butylnitrit mit Dimethylformamid auf 10 ml aufgefüllt) gegeben. Die Lösung wird 15 Minuten bei -100 gerührt und dann die auf -120 gekühlte Lösung von 1,104 g (1,26 mMol) H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Val-Leu- OH und 0,61 ml (4,41 mMol) Triäthylamin in 15 ml Dimethylformamid zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei -100 und vier Stunden bei Zimmertemperatur gerührt.
Nach Eindampfen am Hochvakuum auf ein kleines Volumen und Zugabe von Wasser erhält man ein pulveriges Produkt, welches zweimal mit Wasser verrieben und dann am Hochvakuum über Kalilauge getrocknet wird. Dieses Rohprodukt wird durch Umlösen aus Methanol gereinigt.
Aus einer bei 500 gesättigten methanolischen Lösung scheidet sich über Nacht bei 0 ein weisses Pulver aus, welches sich im Dünnschichtchromatogramm als einheitlich erweist.
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf43c = 0,54; Rf1tÄ = 0,65; Rf45 = 0,50; Rf70 = 0,75; Rf in Chloroform-Methanol (8 : 2) = 0,40.
Beispiel 2
EMI4.1
Zu 172 mg (0,2 mMol) EOC-Val-Cys(TRI)-Gly- Glu(OtBu) und 128 mg BOC-Cys(TRI)-Asn-OtBu in 5 ml Essigester und 2 ml Methanol gibt man 254 mg (1 mMol) Jod in 5 ml Methanol und lässt die Lösung eine Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Bei 0 wird dann mit ln Thiosulfatlösung entfärbt, das Reaktionsgemisch in 200 ml Essigester aufgenommen und dreimal mit Wasser gewaschen. Bei Einengen der (mit Natriumsulfat getrockneten) Essigesterlösung fällt [BOC Cys-Asn-OtBu]2 kristallin aus (32 mg, F. 194-1960) und wird abfiltriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand zweimal mit Petroläther verrieben. Aus dem unlöslichen Rückstand erhält man durch Säulenchromatographie an Silicagel 90 mg (I).
Dieses zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf = 0,25, im System Chloroform-Methanol (95 : 5) und Rf = 0,30 im System Toluol-Aceton (1:1).
Als zweites Produkt erhält man bei der Säulenchromatographie 54 mg [BOC-Val-Cys-Gly-Glu(OtBu)l;; Rf (an Silicagel) im System Chloroform-Methanol (9:1) = 0,55. Das oben erwähnte kristalline Dimere vom F. 194-1960 zeigt folgende Rf-Werte (an Silicagel): in Chloroform-Methanol (9:1) Rf = 0,25; in Toluol Aceton (1:1) Rf = 0,18.
Die beiden Ausgangspeptide können wie folgt hergestellt werden: 1. Z-Asn-OtBu
Man löst 32 g (120 mMol) Z-Asn-OH in 600 ml Dioxan und leitet bei -300 300 ml Isobutylen in die Lösung. Nach Zugabe von 12 ml konzentrierter Schwefelsäure wird der Kolben verschlossen und unter gelegentlichem -Schütteln 20 Stunden bei 0 stehengelassen, wobei eine klare Lösung erhalten wird. Diese wird bei Zimmertemperatur weitgehend vom überschüssigen Isobutylen befreit. Zu der erhaltenen Lösung gibt man bei 0 eine wässrige Lösung von 44 g Kaliumbicarbonat, dampft dann auf ein kleines Volumen ein und nimmt in Essigester auf. Die organische Phase wird mit 1n Bicarbonat und dann mit Wasser neutral gewaschen.
Beim Einengen der mit Natriumsulfat getrockneten Essigesterlösung beginnt das Produkt auszukristallisieren. Man fügt noch n-Hexan zu und filtriert ab. F. 100 bis 1020. [a]2r3 :-160 (c = 2 in Methanol).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist der Rf-Wert in Toluol-Aceton (7 : 3) = 0,27; in Essigester = 0,43.
2. H-Asn-OtBu
23,6 g (73,2 mMol) Z-Asn-OtBu werden in 200 ml Essigester in Gegenwart von 2 g Pd-Kohle (10%) hydriert. Nach 1 Stunde wird kein Wasserstoff mehr aufgenommen. Man filtriert vom Katalysator ab. Beim Einengen des Filtrates kristallisiert das Produkt aus F. 96-980; [a]D: + 20 (c = 2,1 in Methanol).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf.,2 = 0,30; Rf < 5 = 0,50.
3. BOC-Cys(TRI)-Asn-OtBu
Man gibt zu 18,52 g (40 mMol) BOC-Cys(TRI)-OH und 5,6 ml (40 mMol) Triäthylamin in 200 ml Tetrahydrofuran bei -10 5,32 ml (40 mMol) Isobutylchlorocarbonat und rührt 10 Minuten bei dieser Temperatur. Eine auf -100 gekühlte Lösung von 7,52 g (40 mMol) H-Asn-OtBu in 150 ml Tetrahydrofuran wird zugetropft und das Gemisch 1 Stunde bei -100 und über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Dann filtriert man vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorid ab, dampft das Filtrat zur Trockne ein, nimmt den Rückstand in Essigester auf und wäscht mit 1n Zitronensäure, ln Natriumbicarbonat und Wasser. Bei Einengen der Essigesterlösung und Zugabe von Petroläther kristallisiert das Produkt aus. F. 155 bis 1570. [cc]2D3 . + 340 (c = 2,1 in CHC13).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton (1:1) ist Rf = 0,45; in Chloroform Methanol (95 : 5) = 0,33; Rf:3., = 0,65.
4. Z-Gly-Glu(OtBu)2
Man gibt zu einer Lösung von 23,2 g (0,11 Mol) Z-Gly-OH und 15,54 ml (0,11 Mol) Triäthylamin in 200 ml Tetrahydrofuran bei -100 14,97 ml (0,11 Mol) Isobutylchlorocarbonat und lässt 10 Minuten bei 100 stehen. Ein Gemisch von 28,52 g (96,5 mMol) H-Glu (OtBu)2, HC1 und 13,5 ml (96,5 mMol) Triäthylaminhydrochlorid in 300 ml Tetrahydrofuran wird vom Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert, das Filtrat auf -10 gekühlt und dann bei -100 in obige Lösung getropft. Man rührt noch 1 Stunde bei -100 und 2 Stunden bei Raumtemperatur, filtriert vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorid ab und dampft das Filtrat zur Trockne ein.
Das erhaltene Öl wird in Essigester aufgenommen und mit 1n Zitronensäure, ln Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach Abdampfen des Essigesters erhält man das Peptidderivat, das aus Essigester-n-Hexan kristallisiert. F. 74 bis 760; [iD3 : 170 (c = 2,2 in Methanol).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist der Rf-Wert in Toluol-Aceton (7: 3) = 0,50.
5. H-Gly-Glu(OtBu),
2,7 g (6 mMol) Z-Gly-Glu(OtBu) werden in 30 ml Essigester in Gegenwart von 250 mg Pd-Kohle (102) hydriert. Nach 4 Stunden ist die Wasserstoffaufnahme beendet. Man filtriert vom Katalysator ab und dampft die Lösung ein. Das Produkt wird als Ö1 erhalten, das dünnschichtchromatographisch einheitlich ist. Die Rf Werte (an Silicagel) sind:
In Toluol-Aceton (7: 3) = 0,27; in Chloroform Methanol (9:1) = 0,37; RftÄ v = 0,50.
6. TRI-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)2
Man gibt zu 26,6 g (44 mMol) TRI-Cys(TRI)-OH und 13,9 g (44 mMol) H-Gly-Glu(OtBu) in 350 ml Essigester bei 0 9,06 g (44 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt 2 Stunden bei 0 und lässt über Nacht im Kühlschrank stehen. Dann filtriert man vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab, wäscht das Filtrat mit ln Zitronensäure, In Natriumbicarbonat und Wasser, trocknet die Lösung, dampft ein. Das Produkt kristallisiert aus Essigester-n-Hexan. F. 107 bis 1100. [¯r]2,3 : + 80 (c = 2,0 in Methanol).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Toluol-Aceton (7 : 3) ist Rf = 0,70; in Chloroform-Methanol (98 : 2) ist Rf = 0,78.
7. H-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)
Zu 3,156 g (3,5 mMol) TRI-Cys(TRI)-Gly-Glu (OtBu) in 20 ml Eisessig werden bei Zimmertemperatur 5 ml Wasser derart gegeben, dass sich der gebildete Niederschlag stets wieder löst. Nach etwa 10 Minuten tritt Trübung und Bildung eines Niederschlags ein. Man rührt 1 Stunde, gibt dann 15 ml Wasser zu und filtriert ab. Das Filtrat wird im Hochvakuum bei 40 eingedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und bei 0 mit 0,5n Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Der nach dem Eindampfen erhaltene Schaum wird mit Petroläther verrieben.
Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (95 : 5) Rf = 0,40; in Toluol Aceton (1:1) Rf = 0,55; Rf42A = 0,60.
8. BOC-Val-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)2
Man gibt zu 7,17 g (33 mMol) BOC-Val-OIH und 4,62 ml (33 mMol) Triäthylamin in 80 ml Essigester bei -10 4,4 ml (33 mMol) Isobutylchlorocarbonat und rührt 10 Minuten bei -100. Eine auf -100 gekühlte Lösung von 21,92 g (33 mMol) H-Cys(TRI)-Gly Glu(OtBu) in 400 ml Essigester wird zugetropft und das Gemisch noch 1 Stunde bei 100 und 10 Stunden bei Zimmertemperatur gehalten. Dann wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand zweimal mit je 200 ml Wasser verrieben und über Phosphorpentoxid getrocknet. Den Rückstand löst man in 450 ml heissem Methanol. Das Produkt kristallisiert über Nacht bei 0 aus.
F. 213-215. [a]2D = + 190 (c = 2,2 in Chloroform).
Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Cyclohexan-Essigester (1:1) ist Rf = 0,18; im System Toluol-Aceton (1:1) ist Rf = 0,65.
Beispiel 3
Man versetzt 172 mg (0,2 mMol) BOC-Val-Cys (TRI)-Gly-Glu(OtBu). in 5 ml Essigester und 2 ml Methanol mit 127 mg (0,5 mMol) Jod in 2,5 ml Methanol und lässt das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Die Lösung wird dann bei 03 mit ln Thiosulfat entfärbt, in 200 ml Essigester aufgenommen und dreimal mit Wasser gewaschen.
Das nach dem Eindampfen der Essigesterlösung erhaltene Produkt wird zweimal mit Petroläther verrieben.
Das in Teiroläther unlösliche [BOC-Val-Cys-Gly-Glu (OtBu)-. ist dünnschichtchromatographisch einheitlich.
Ausbeute 123 mg (100%).
Beispiel 4
EMI6.1
<tb> BOC-Cys-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 <SEP>
<tb>
Zu einer Lösung von 620 mg Jod in 150 ml Methanol werden bei 250 unter starkem Rühren 500 mg BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-Cys(TRI)- Pro-Leu-Gly-NH, gelöst in 100 ml Methanol, innert 45 Minuten eingetropft. Man rührt eine Stunde weiter, kühlt dann die Lösung auf 50 ab und entfärbt sie durch Zugabe von 1,0n wässriger Natriumthiosulfatlösung. Hierauf wird die Lösung im Wasserstrahlvakuum auf ein Volumen von etwa 5 ml eingeengt und das Produkt durch Zugabe von viel Wasser ausgefällt. Es wird abgenutscht und im Vakuum über Natriumhydroxyd getrocknet. Zwecks Überführung in das freie Oxytocin wird das Produkt in 5 ml eiskalter, konzentrierter Salzsäure suspendiert und unter Rühren gelöst.
Nach 10 Minuten bei 0 verdünnt man die Lösung mit 20 ml Eiswasser, gibt 5 ml Eisessig zu, filtriert über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II, schwach basisch, Acetatform, und wäscht mit 20iger Essigsäure nach. Dann wird im Vakuum bei 30 eingedampft, der Rückstand in Wasser gelöst und die Lösung lyophilisiert. Das so erhaltene rohe Oxytocin kann, falls erwünscht, nach dem Verfahren von Yamashiro (Nature 201, 76 (1964) weiter gereinigt werden.
Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Nonapeptidderivat BOC - Cys(TRI) - Tyr(tBu) - Ile - Gln- Asn-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-NH2 kann wie folgt hergestellt werden: 1. TRI-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-NH2
30 g H-Pro-Leu-Gly-NH2 werden in 500 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst, und die auf 50 gekühlte Lösung wird mit 70 g TRI-Cys(TRI)-OH, 20 g N-Hydroxysuccinimid und 30 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 30 Minuten bei 0 erwärmt man auf Raumtemperatur und lässt 18 Stunden stehen.
Sodann wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht, das Filtrat im Hochvakuum bei 400 eingedampft und der Rückstand mit 1 Liter Petroläther versetzt. Nach gründlichem Zerreiben des ungelösten Produktes dekantiert man die Petrolätherlösung ab.
Den in Petroläther unlöslichen Rückstand nimmt man in Essigester auf, wäscht die Lösung bei 0 mit verdünnter Zitronensäure, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und Wasser, trocknet sie mit Natriumsulfat und dampft zur Trockene ein. Das dabei erhaltene, rohe Tetrapeptidderivat TRI - Cys(TRI) - Pro - Leu - Gly wird zur Reinigung in Methanol gelöst und über eine Säule von Sephadex LH-20 filtriert. Die erhaltenen Fraktionen werden eingedampft und ihre Reinheit mittels Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten im System Chloroform-Methanol (99:1) geprüft. Die reinen Fraktionen werden vereinigt, eingedampft und getrocknet.
2. H-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-NH.i
Zur Abspaltung der N -TRI-Gruppe löst man 5 g TRI-Cys(TRI)-Prn-Leu-Gly-NH2 in 100 ml 80 %der Essigsäure und lässt die Lösung 1 Stunde bei 350 stehen. Dann gibt man 100 ml Wasser zu und lässt 5 Stunden bei 0 stehen. Hierauf werden die Kristalle des ausgeschiedenen Triphenylcarbinols abgenutscht, das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum bei 300 getrocknet. Zur Überführung in die freie Base wird das als essigsaures Salz erhaltene H-Cys(TRI)-Pro-Leu-Gly-NHs in Chloroform gelöst, die Lösung mit verdünnter Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
3. Z-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH
4,05 g H-Ile-Gln-Asn-OH werden in 70 ml Wasser und 1,5 ml Triäthylamin gelöst und dann 200 ml Dimethylformamid zugegeben. Hierauf wird mit 8 g Z-Tyr(tBu)-p-nitrophenylester (dargestellt aus Z-Tyr (tBu)-OH und p-Nitrophenol mittels Dicyclohexylcarbodiimid, F. 88-890 aus Methanol-Wasser) versetzt und 72 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann engt man im Vakuum bei 400 auf ungefähr 20 ml ein, gibt 100 ml 0,5n Natriumbicarbonatlösung und 200 ml Äther zu, trennt die Atherlösung ab und kühlt die wässrige Phase in Eis. Nach Ansäuern mit 2n Salzsäure wird das ausgeschiedene Z-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH abgenutscht und mit Eiswasser gewaschen. Zur Reinigung wird es nochmals aus Dimethylformamidlösung mit Äther gefällt.
4. H-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH
1,2 g des unter 3 erhaltenen Tetrapeptidderivates werden in 50 ml 90 einer Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle (10 % Pd) hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht, das Filtrat im Vakuum zur Trockne verdampft und der Rückstand im Hochvakuum bei 400 getrocknet.
5. BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH
Das unter 4 erhaltene Produkt wird in 35 ml Dimethylformamid und 0,5 ml Triäthylamin suspendiert und durch Zugabe von Wasser in Lösung gebracht.
Dann wird 1,0 g BOC-Cys(TRI)-p-nitrophenylester zugegeben und das Reaktionsgemisch 48 Stunden bei 280 stehengelassen. Hierauf wird im Hochvakuum bei 350 eingeengt, der Rückstand mit 100 ml eiskalter, 1n Salzsäure versetzt und das rohe Pentapeptidderivat abgenutscht. Nach Waschen mit Eiswasser und Trocknen wird mehrmals aus Dimethylformamid-Äther umgefällt.
Zur weiteren Reinigung wird in Methanol gelöst und über eine Säule von Sephadex LH-20 chromatographiert.
6. BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-Cys(TRI)- Pro-Leu-Gly-NH2
2,1 g des unter 2 erhaltenen Tetrapeptidderivates und 3,3 g BOC-Cys(TRI)-Tyr(tBu)-Ile-Gln-Asn-OH werden in 50 ml Dimethylformamid unter Zusatz von 1 g N-Hydroxysuccinimid gelöst. Die auf -200 gekühlte Lösung wird mit 0,9 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 2 Stunden bei 200 und sodann 48 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei nach 6, 12 und 18 Stunden jeweils noch weitere 200 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben werden. Hierauf wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylcarbodiimid abfiltriert, das Filtrat im Hochvakuum bei 400 Badtemperatur auf ein kleines Volumen eingeengt und das Nonapeptidderivat durch Zugabe von Ather gefällt.
Das Pulver wird abgenutscht, getrocknet, mit Wasser zerrieben, wieder abgenutscht und getrocknet. Das so erhaltene rohe BOC - Cys(TRI) - Tyr(tBu) - Ile-Gln-Asn-Cys(TRI) Pro-Leu-Gly-NH wird zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im gleichen System wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen.
Beispiel 5
EMI7.1
<tb> BOC-Cys-Tyr(tBu)-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro <SEP>
<tb> <SEP> Lys <SEP> (B <SEP> OC) <SEP> -Gly-NH2 <SEP>
<tb>
Zu einer Lösung von 1120 mg Jod in 500 ml Methanol wird bei Raumtemperatur unter starkem Rühren eine Lösung von 800 mg BOC-Cys(TRI)-Tyr (tBu) - Phe - Gln-Asn-cys(TRI)-pro-Lys(Boc)-Gly-NHst in 500 ml Methanol innert 45 Minuten tropfenweise zugegeben. Dann wird die Lösung auf 20 gekühlt und durch Zutropfen von wässriger 1n Natriumthiosulfatlösung entfärbt. Hierauf wird im Wasserstrahlvakuum bei 300 Badtemperatur auf ein kleines Volumen eingeengt und das Produkt durch Zugabe von viel Wasser ausgefällt. Es wird abgenutscht und im Vakuumexsikkator getrocknet.
Zwecks Überführung in Lysin8 Vasopressin wird das
EMI7.2
<tb> BOC-Cys-Tyr(tBu) <SEP> -Phe-Gln-Asn- <SEP>
<tb> Cys-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH unter Rühren in 10 ml eiskalter, konzentrierter Salzsäure gelöst. Nach 10 Mi nuten bei 0 verdünnt man mit 50 ml Eiswasser und gibt 5 ml Eisessig zu. Hierauf wird über eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II, schwach basisch,
Acetatform, filtriert und das Eluat zur Trockne eingedampft.
Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Nonapeptidderivat BOC - Cys(TRI) - Tyr(tBu) - Phe-Oln- Asn-Cys(TRI)-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2 kann in analoger Weise wie für das geschützte Nonapeptidamid in Beispiel 4 gezeigt durch Kondensation von BOC-Cys (TRI)-Tyr(tBu)-Phe-Gln-Asn-OH mit H-Cys(TRI)-Pro Lys(BOC)-Gly-NH2 in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid hergestellt werden. Die Herstellung der Zwischenprodukte kann ebenfalls analog erfolgen.
Beispiel 6
EMI7.3
<tb> B0 & ys-Phe-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro- <SEP>
<tb> <SEP> Lys(BOC)-Gly-NH. <SEP>
<tb>
Diese Verbindung kann nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren aus BOC-Cys(TRI)-Phe-Phe Gln - Asn - Cys(TRI)-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2 hergestellt und in Phe2, Lys8-Vasopressin übergeführt werden.
Beispiel 7
1,524 g BOC-Cys(TRI)-Gly-Glu(OtBu)3 und 508 mg Jod werden in 25 ml Methanol während einer Stunde bei Zimmertemperatur reagieren gelassen. Durch tropfenweise Zugabe von wässriger 1n Natriumthiosulfatlösung wird die Reaktionslösung bei 0 entfärbt und das Produkt mit 50 ml Wasser ausgefällt. Das getrocknete Rohprodukt wird dreimal mit je 10 ml Petroläther verrieben. Kristallisation des Rückstandes aus Essigester-Petroläther liefert 945 mg (91 %) [BOC Cys-Gly-Glu(OtBu)2]3 vom F. 150-1520. Rf = 0,60 (Chloroform-Methanol 9:1).
Beispiel 8
Die Reaktion von 762 mg (1,0 mMol) BOC-Cys (TRI)-Gly-Glu(OtBu)r und 634 mg (1,0 mMol) BOC Cys(TRI)-Asn-OtBu mit 508 mg (2,0 mMol) Jod und die Aufarbeitung werden wie in Beispiel 7 ausgeführt.
Das Rohprodukt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Chloroform-Methanol (9:1) drei Flecken: Rf = 0,60 ([BOC-Cys-GW-Glu(0tBu)2j2 = I), 0,25 ([BOC-Cys-Asn-OtBu]3 = II) und 0,45
EMI7.4
Die Trennung gelingt durch Gegenstromverteilung im System Methanol -0,1- Ammoniumacetat - Chloroform- Tetrachlorkohlenstoff (4 : 2:1: 3). Nach 100 Schritten befindet sich II in den Elementen 56-76 (r,,, = 65; K = 1,85). Diese werden geleert, frische untere Phase eingefüllt und weitere 100 Schritte ausgeführt. III befindet sich nun in den Rohren 8-25 (r,nax = 16; K = 0,09), I in den Elementen 0-5.
Eindampfen dieser Fraktionen und Absublimieren von Ammoniumacetat liefert die drei Verbindungen in dünnschichtchromatographisch reiner Form:
I schmilzt nach Umkristallisation aus Essigester
Petroläther bei 150-1520; Ausbeute 225 mg (sta tistisch: 260 mg);
II schmilzt nach Umkristallisation aus Methanol Äther bei 194-1960; Ausbeute 162 mg (sta tistisch 195 mg).
III ist amorph; Ausbeute 463 mg.
Wird die Reaktion mit 1 mMol BOC-Cys(TRI)
Gly-Glu(OtBu)2, 2 mMol BOC-Cys(TRI)-Asn OtBu und 3 mMol Jod ausgeführt, so werden
580 mg III isoliert (statistisch 606 mg).
Beispiel 9
Zu 254 mg (1 mMol) Jod in 5 ml Eisessig wird die Lösung von 380 mg (0,5 mMol) BOC-Cys(TRI) Gly-Glu(OtBu)2 und 45 mg (0,55 mMol) Natriumacetat (wasserfrei) in 5 ml Eis essig gegeben und eine Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Durch Zugabe von In Natriumthiosulfat (1,7 ml) wird die braune Lösung entfärbt; man gibt weitere 5 ml Eisessig zu und lyophilisiert. Das resultierende Pulver wird in Wasser aufgenommen, filtriert und der Rückstand gut mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Phosphorpentoxyd werden durch Umkristallisieren aus Essigester Petroläther 205 mg (80S) [BOC-Cys-Gly-Glu(OtBu)2]o vom F. 151-1520 erhalten.
Process for the production of peptides containing cystine residues
The invention relates to a new process for the preparation of peptides containing cystine residues.
Various peptides containing cystine residues occur in nature in which the disulfide bridge of the cystine is in a ring, e.g. B. oxytocin, vasopressins, vasotocin, isotocin, mesotocin, growth hormone, thyrocalcitonin, insulin. On the other hand, the disulfide bridge of cystine can also connect straight amino acid chains with one another, as z. B.
is the case with the two disulfide bridges between the A and B chains of insulin or with glutathione.
Various methods for synthesizing such peptides containing disulfide bridges are already known.
In addition to natural peptides with disulfide bridges, a large number of active analogs, e.g. B. Desamino-oxytocin, Ser4-oxytocin, Asn-oxytocin, Val8-oxytocin, Tyr "(O-methyl) -oxytocin, PheS-Arg8-vasopressin, PheS-Lys8-vasopressin, Phe2-Orn8-vasopressin, Ile3- Arg8-vasopressin, Asn4-Lys8-vasopressin, synthesized.
According to the known method, to produce the disulfide bridge, the mercapto protective groups are first split off from an amino acid sequence containing the two cysteine residues to be connected in which the mercapto groups are protected, for example by carbobenzoxy or benzyl groups or by the trityl group, benzyl for example with sodium in liquid ammonia, trityl, e.g. B.
by means of mercuric acetate, and hydrogen sulfide or with 10N hydrochloric acid, and then the peptide containing the free mercapto groups is oxidized to the disulfide, for example with 1,2-diiodoethane or with oxygen.
This method has the disadvantage that the. The elimination methods mentioned cause side reactions, especially in the case of sensitive peptides, and that the yield is impaired accordingly. In the process according to the present invention, peptides containing cystine residues are obtained in a simpler manner and with a better yield. The method is characterized in that corresponding peptides containing cysteine residues, in which the mercapto groups are protected by trityl groups, are treated with iodine.
The reaction takes place at room temperature, but can also, depending on the type of peptide, be carried out at a lower or higher temperature, e.g. B. at temperatures from 0 to 60. Preferably, the reaction is carried out in a solvent in which iodine and the peptide are at least partially soluble, preferably in an alcohol such as a lower alkanol, e.g. Ethanol or in particular methanol or a mixture of an alcohol with an organic solvent in which the peptide is soluble, such as ethyl acetate, dimethylformamide, methylene chloride, or in glacial acetic acid. It is expedient to ensure a respective excess of iodine, e.g. B.
by working in dilute solutions and adding the peptide solution to the iodine solution. Only the desired monomer is obtained here. If, however, the procedure is reversed, z. B. the iodine solution is dripped into a peptide solution, so considerable amounts of polymers are formed. The excess iodine can be removed from the solution obtained, for example with thiosulfate.
The starting materials used in the reaction are peptides in which the free amino groups are appropriately protected. Free hydroxyl and carboxyl groups can also be present in protected form, if desired. Examples of amino protective groups are benzyl, trifluoromethyl, phthaloyl, p-toluenesulfonyl, or, above all, groups derived from carbonic acid, such as carbobenzoxy groups substituted in the aromatic radical by halogen atoms, lower alkyl or lower alkoxy or lower carbalkoxy groups, colored benzyloxycarbonyl groups such as p- Phenylazo-benzyloxycarbonyl and p- (p'-methoxyphenylazo) -benzytoxycarbonyl, tolyloxycarbonyl, 2-phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-tolyl-isopropyloxycarbonyl and especially 2-p-diphenyl-isopropyloxycarbonyl (cf. French.
Patent No. 1,554,051), also aliphatic oxycarbonyl groups, such as. B. allyl oxycarbonyl, cyclopentyloxycarbonyl, tert-amyloxy carbonyl, adamantyloxycarbonyl and primarily tert-butyloxycarbonyl.
The carboxyl groups can, if desired, e.g. B. be protected by amidation or esterification. As esters, for. B. those of methanol, methanol, benzyl alcohol, p-methoxybenzyl alcohol, 2,4,5 trichlorophenol, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxy phthalimide, or especially of tert-butanol.
Hydroxyl groups, e.g. B. of serine or tyrosine residues, z. B. protected by etherification, for example with benzyl alcohol or preferably with tert-butanol. In arginine residues, the guanidino group can be protected, for example, by the tosyl group.
The disulfide peptides containing protective groups obtained in the present process can be used directly for the synthesis of peptides with a longer amino acid chain or, if desired, the protective groups can be split off in a known manner by hydrolysis or hydrogenolysis.
The peptides containing cysteine residues used as starting materials are known or can be produced by methods known per se. Peptides containing cysteine residues are also to be understood as meaning peptides in which functional groups such. B. amino groups, carboxyl groups, hydroxyl groups are provided with the abovementioned or other protective groups known for peptide synthesis, and also compounds which contain desaminocysteine residues instead of one or both of the cysteine residues to be linked.
In the following examples, the temperatures are given in degrees Celsius. The following systems are used in thin-layer chromatography: System 43A: tert-amyl alcohol-isopropanol-water (100: 40: 10) System 43C: tert-amyl alcohol-isopropanol-water (51:21:28) System 45: sec .-Butanol-3% aqueous ammonia (70:30) System 52: n-butanol-glacial acetic acid-water (75: 7.5: 21) System 53: n-butanol-formic acid-water (60: 0, 75:39) System 70: ethyl acetate-pyridine-water (40:20:40) System 101: n-butanol-pyridine-glacial acetic acid-water (38: 24: 8:30) System 1 02E: ethyl acetate-methyl ethyl ketone-glacial acetic acid
Water 50: 30:10:10) System 121A:
Isopropanol-ammonia (26%) -water (85: 5:10).
The following abbreviations are used:
BOC = tert-butyloxycarbonyl; TRI = trityl.
Example 1 shows the preparation of the protected N-terminal sequence 1-9 of thyrocalcitonin with disulfidrilìg; Examples 2 and 8 show the disulfide linkage of the protected fragment 20-21 of the A chain with the protected fragment 18-21 and
19-21 of the insulin B chain; Examples 3, 7 and 9 show the preparation of protected peptide dimers with disulfide bridges; Examples 4-6 show the production of oxytocin, Lys8-vasopressin and Phe-4, Lys8-vasopressin by the new process.
example 1
EMI2.1
<tb> BOC-Cys-Ser (tBu) -Asn-Leu-Ser- (tBu) -Thr (tBu) -Cys- <SEP>
<tb> <SEP> Val-Leu-OH
<tb>
2.50 g (1.478 mmol) of BOC-Cys (TRl:) - Ser- (tBu) -Asn-Leu-Ser are added to a stirred solution of 3.73 g (14.78 mmol) of iodine in 500 ml of methanol at room temperature (tBu) -ThrftBu) -Cys (TRI) -Val-Leu-OH in 500 ml of methanol was added dropwise within 45 minutes. After the end of the introduction, stirring is continued for 1 hour and the solution is then decolorized at 0 with 1.0N aqueous thiosulfate solution (26.05 ml in thiosulfate). The clear solution is concentrated in a water jet vacuum at 300 to about 100 ml. Then 1.5 liters of water are added, the precipitated product is filtered and washed with water.
After drying over potassium hydroxide, the crude product weighs 2.32 g. It is triturated twice with petroleum ether and designed to purify a countercurrent distribution in the methanol-buffer-chloroform-carbon tetrachloride system (10: 3: 5: 4). [Buffer: 28.6 ml of glacial acetic acid; 19.25 g ammonium acetate, made up to 1 liter with water.] After 135 steps, the main product is in the elements 39-68 (rrn..ix 53; K = 0.65). The contents of these elements are evaporated to dryness in a high vacuum (400) and the ammonium acetate is sublimed off.
The
EMI2.2
<tb> received <SEP> B <SEP> QC-Cys <SEP> - <SEP> Ser (tBu) <SEP> - <SEP> Asn <SEP> - <SEP> Leu <SEP> - <SEP> Ser ( tBu) <SEP> - <SEP> Thr
<tb> (tBu) -Cys-Val-Leu-OH <SEP> (1.49 <SEP> g <SEP> = <SEP> 83 <SEP> S <SEP> of the <SEP> theory)
<tb> turns out to be uniform in the thin-layer chromatogram (silica gel). Ruf45 = 0.42; Rfl2lA = 0.70; Rf70 = 0.75; Ruf5? = 0.43; Rf.SA = 0.22. [Cr] 2.3 = 160 (c = 2 in chloroform). The protected nonapeptide used as starting material can be prepared as follows: 1.
H-Thr (tBu) -OMe
12.92 g (40 mmol) of Z-Thr (tBu) -OMe are hydrogenated in 200 ml of glacial acetic acid and 3 g of Pd-charcoal (10%) at room temperature. The uptake of hydrogen ceases after one hour. The solution is filtered off from the catalyst and evaporated at 350 in a water jet vacuum. After drying in a high vacuum at 350, 7.3 g of an oil result which, according to thin-layer chromatogram, is uniform and is used further directly.
2. DPC-Ser (tBu) -Thr (tBu) -OMe
19.3 g (38.6 mmol) of DPC-Ser (tBu) -OH, cyclohexylamine salt are taken up in 500 ml of chloroform and extracted three times with 25 ml of 1N citric acid and five times with 40 ml of semi-saturated sodium chloride solution at 0. After the solution has been dried over sodium sulfate, it is evaporated and the foam obtained is taken up in 250 ml of ethyl acetate. 5.36 ml (38.6 mmol) of triethylamine are added, the solution is cooled to -10 and, while stirring, 5.13 ml (38.6 mmol) of isobutyl chlorocarbonate are added. The mixture is stirred for 10 minutes at -10 and then the solution, cooled to -120, of 7.3 g (38.6 mmol) of H-Thr (tBu) -OMe in 100 ml of ethyl acetate is added dropwise so that the reaction temperature never exceeds -10.
After the end of the entry, the mixture is stirred for another hour at -100 and then left to stand overnight at room temperature.
The solution is filtered off from the precipitated triethylamine hydrochloride and washed at 0 three times with 20 ml each time in citric acid and five times with saturated sodium chloride solution, dried and evaporated.
Crude product (oil 1): 22.07 g. For purification, 1 g is chromatographed on a silica gel column (2.5 cm, 30 cm). With petroleum ether / ethyl acetate (1: 1), after a forerun of 110 ml, 787 mg of pure product are eluted.
In the thin-layer chromatogram on silica gel in toluene-acetone (7: 3), Rf = 0.51.
3. Z-Val-Leu-OMe
19.9 g (110 mmol) of H-Leu-OMe, HC1 are dissolved in 120 ml of dimethylformamide and 14.6 ml (105 mmol) of triethylamine are added at 0. The precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off, the filtrate is added to a solution of 25.1 g (100 mmol) of Z-Val-OH in 200 ml of dimethylformamide (00) and then 22.6 g (110 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide are added dry. After stirring for one hour at 0 and standing overnight in the refrigerator, the mixture is filtered and the solution is evaporated at 400 in a high vacuum. The oily residue is taken up in 30 ml of ethyl acetate, the solution is cooled to 0 and freed from the dicyclohexylurea which has separated out. After adding n-hexane, the product crystallizes out of the filtrate overnight.
M.p. 102-10150; [α12n0: 410 (c = 2.88 in methanol).
In the thin-layer chromatogram on silica gel in chloroform-methanol (98: 2), Rf = 0.55 and in toluene-acetone (7: 3), Rf = 0.60.
4. DPC-Ser (tBu) -Thr (tBu) -NH-NH2.
4.253 g (7.4 mmol) of DPC-Ser (tBu) -Thr (tBu) -OMe in 18 ml of methanol are mixed with 5.55 ml (about 110 mmol) of hydrazine hydrate and left to stand for 10 hours at room temperature and 2 hours at 400. The reaction solution is taken up in 450 ml of ethyl acetate and washed four times with half-saturated sodium chloride solution. After drying the solution over sodium sulfate, it is concentrated to about 15 ml and mixed with about 5 ml of petroleum ether. 3.17 g of the hydrazide with a melting point of 132-1340 crystallize out overnight.
In the thin layer chromatogram on silica gel in
Toluene-acetone (7: 3) is Rf = 0.40.
5. H-Val-Leu-OMe, HCl
5.66 g (15 mmol) of Z-Val-Leu-OMe are in
75 ml of methanol in the presence of 15 mmol of hydrochloric acid and 850 mg of Pd-charcoal (10%) hydrogenated at room temperature. The uptake of hydrogen is after
Finished 3 hours. The catalyst is filtered off and the solution is concentrated to about 15 ml. When ether is added, the product crystallizes out. F. 136-1390.
In the thin layer chromatogram on silica gel in
Chloroform-methanol (9: 1) is Rf = 0.45; in toluene acetone (1: 1) is Rf = 0.43.
6. TRI-Cys (TRI) -Val-Leu-OMe
7.13 g (10 mmol) of TRI-Cys (TRI) -OH, diethylamine salt are washed in chloroform at 0 with 1N citric acid and semi-saturated sodium chloride solution, the solution is dried, evaporated and the foam obtained is taken up in 50 ml of ethyl acetate. A solution of 3.22 g (10 mmol) of H-Val-Leu-OMe, hydrochloride in 40 ml of ethyl acetate of 00, from which the precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off, is added to a solution of 1.4 ml (10 mmol) of triethylamine Has.
Then 2.26 g (11 mmol) of dry dicyclohexylcarbodiimide are added at 0, the mixture is stirred at 0 for 21/2 hours and left to stand in the refrigerator overnight. The precipitated dicyclohexylurea is filtered off and the solution is washed at 0 with 1N citric acid, 1N sodium bicarbonate and semi-saturated sodium chloride solution and dried over sodium sulfate. The solution is concentrated to about 20 ml, cooled to 0 and further dicyclohexylurea is filtered off.
Evaporation to dryness gives 8.53 g of ester. For purification, the crude product is chromatographed on a silica gel column (5 cm; 55 cm). After a first run of 400 ml, the main product is eluted in pure form with 300 ml of petroleum ether / ethyl acetate (1: 1).
In the thin-layer chromatogram on silica gel in chloroform-methanol (99: 1), Rf = 0.43.
7. H-Cys (TRI) -Val-Leu-OMe
11.08 g (13.3 mmol) of TRI-Cys (TRI) -Val-Leu-OMe are dissolved in 75 ml of ethyl acetate and 12.3 ml of water are added dropwise so that a clear solution always remains. After stirring for one hour at room temperature, 64 ml of water are added to the clear solution, the precipitate is filtered off and washed with cold 50% acetic acid. The filtrate is evaporated to an oil in a high vacuum at 400, this is taken up in 250 ml of ethyl acetate and washed at 0 with 1N sodium bicarbonate and saturated sodium chloride solution.
After drying over sodium sulfate, it is evaporated to give 7.07 g of a white product. The thin-layer chromatogram on silica gel in the chloroform-methanol system (98: 2) shows a spot with an Rf value of 0.30 when sprayed with Reindel-Hoppe reagent.
8. DPC-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys (TRI) -Val-Leu-GMe
To 13.6 g (23.8 mmol) of DPC-Ser (tBu) -Thr (tBu) NH2 in 220 ml of dimethylformamide are added 32.26 ml of hydrochloric acid in ethyl acetate (1.84n; 59.25 mmol) and 3 , 26 ml (28.55 mmol) of tert-butyl nitrite are added.
After 15 minutes at -100, the solution, cooled to -100, of 14.03 g (23.8 mmol) of H-Cys (TRI) -Val-Leu-OMe and 8.315 ml (59.25 mmol) of triethylamine is left in Add 100 ml of dimethylformamide dropwise so that the reaction temperature never exceeds -90.
It is stirred for a further hour at 100 and then left to stand overnight at room temperature. The precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off, the filtrate is evaporated in a high vacuum at 400, the oily residue is taken up in 500 ml of ethyl acetate, washed with 1N citric acid, 1N sodium bicarbonate and saturated sodium chloride solution, dried, concentrated to about 40 ml and mixed with about 10 ml petroleum ether offset. The protected pentapeptide ester from F. 177-1780 crystallizes out overnight.
In the thin-layer chromatogram on silica gel in chloroform-methanol (98: 2), Rf = 0.45; in toluene acetone (7: 3) is Rf = 0.57.
9. DPC-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys (TRI) -Val-Leu-OH
2.830 g (2 mmol) of DPC-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys (TRI) -Val-Leu-OMe are dissolved in 60 ml of 75% dioxane and mixed with 3 ml of 2N sodium hydroxide solution (6 mmol).
After 11/2 hours at room temperature, the dioxane is evaporated off in a water jet vacuum at 400, ethyl acetate and water are added and the pH is adjusted to 3 at 0 using 1N citric acid. The ethyl acetate phase is washed with sodium chloride solution, dried and evaporated. The result is a product which, according to a thin-layer chromatogram on silica gel, is uniform.
Rf in chloroform-methanol (7: 3) = 0.40; Rf45 = 0.55.
10. H-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys (TRI) -Val-Leu-OH
2.22 g (2 mmol) of DPC-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys (TRI) - Val-Leu-OH are dissolved in 20 ml of methylene chloride and 12 ml of chloroacetic acid in water (from 75 g of chloroacetic acid and 25 ml Water) added. The clear solution is stirred for 15 minutes at room temperature, cooled to 0 and then 70 ml of water are added. The pH is adjusted to 6.5 with concentrated ammonia, whereupon the product precipitates. The aqueous solution is decanted off and the residue is triturated three times with water and then lyophilized. Rubbing the product three times with ether yields a white powder which, according to the thin-layer chromatogram, is uniform. It is still used in this form.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rfl, = 0.48; Rfloz = 0.65; Ruf52 = 0.75.
11. Z-Asn-Leu-OMe
16.7 g of H-Leu-OMe and 46.0 g of ZAsn-ONP are dissolved in 100 ml of freshly distilled dimethylformamide.
The solution is left at 250 for 19 hours.
1.2 liters of water are then added and the crystalline precipitate is filtered off with suction. The dipeptide derivative is dried in vacuo at 40D and then recrystallized twice from methanol-water. F. 180-1810; [a] + 90 (c = 2.05 in chloroform).
12. H-Asn-Leu-OMe
15.0 g of Z-Asn-OMe are dissolved in 400 ml of t-butanol water (9: 1) and hydrogenated in the presence of 2 g of palladium-carbon (10S Pd). After the hydrogenation has ended, the catalyst is suction filtered and evaporated at 400. The residue is used further directly.
13. Z-Ser (tBu) -Asn-Leu-OMe
8.90 g of H-Asn-Leu-OMe and 11.0 g of Z-Ser (tBu) -OH are dissolved in 100 ml of freshly distilled dimethylformamide. The solution is cooled to 0, and 3.90 g of N-hydroxysuccinimide and then 8.70 g of dicyclohexylcarbodiimide are added. After standing for 30 minutes at 0 'and 18 hours at 250, the precipitated dicyclohexylurea is suctioned off and the filtrate is poured into 800 ml of ice water. The resulting crystalline precipitate is dried in vacuo at 40 and then recrystallized from methanol-water. The Z-Ser (tBu) -Asn-Leu-OMe obtained in analytically pure form melts at a temperature of 202 to 2050; [ce] 2D = -180 (c = 1.05 in glacial acetic acid).
14. H-Ser (tBu) -Asn-Leu-OMe
6.3 g of Z-Ser (tBu) -Asn-Leu-OMe are dissolved in 600 ml of methanol and hydrogenated in the presence of 1.2 g of palladium-carbon (10X Pd). After 1.25 hours, the catalyst is filtered off with suction and evaporated to dryness in vacuo at a bath temperature of 300. The crystalline tripeptide derivative obtained in this way shows in thin-layer chromatography on silica gel plates in the chloroform-methanol (90:10) system Rf = 0.11.
15. BOC-Cys (TRI) -Ser- (tBu) -Asn-Leu-OMe
5.0 g of H-Ser (tBu) -Asn-Leu-OMe and 6.7 g of BOC Cys (TRI) -ONP are dissolved in 30 ml of freshly distilled dimethylformamide. The yellow solution is left to stand at 260 for 42 hours. It is then precipitated by adding 500 ml of ice water and the precipitated product is suction filtered. It is dissolved in ethyl acetate and the solution is washed with 5% citric acid solution and then with water. This is followed by washing five times with a mixture of 1 part by volume of 5% liter of potassium carbonate and 5% of the potassium bicarbonate solution and then with water, while cooling with ice to remove p-nitrophenol. The ethyl acetate solution leaves a resinous product after drying and evaporation. This is reprecipitated four times from acetone and petroleum ether.
The teteapeptide derivative obtained as a solid powder shows F. 181-1820; [a] 2D 110 (c = 2.09 in methanol).
For thin layer chromatography on silica gel plates, Rfg3z = 0.57; Rf in ethyl acetate = 0.10; Rf in toluene-acetone (7: 3) = 0.05; Rf in chloroform methanol (9: 1) = 0.45.
16. BOC-Cys (TRI) -Ser (tBu) -Asn-Leu-NHNH2
7.0 g of BOC-Cys (TRI) -Ser (tBu) -Asn-Leu-OMe are dissolved in 70 ml of methanol and 7 ml of hydrazine hydrate are added to the solution, which has been cooled to 0. After 16 hours at 20, an ice-cold solution of 600 ml of 2N acetic acid is added, the gelatinous precipitate is triturated well, suction filtered and washed neutral with plenty of water. The powder obtained is dried in vacuo at 400 and then suspended in 100 ml of acetonitrile. After trituration, it is suction filtered and dried at 400 in a vacuum. The BOC Cys (TRI) -Ser (tBu) -Asn-Leu hydrazide obtained shows F. 216 to 2180.
When subjected to thin layer chromatography on silica gel plates, it has the following Rf values: Rf = 0.55 in dioxane-water (98: 2); Rf = 0.52 in chloroform methanol (8: 2); Rflo2F = 0.70.
17. BOC-Cys (TRI) -Ser (tBu) -Asn-Leu-Ser (tBu)
Thr (tBu) -Cys (TRI) -Val-Leu-OH
At -150 to 1.075 g (1.26 mmol) of BOC Cys (TRI) -Ser (tBu) -Asn-Leu-NH-NH2 in 15 dimethylformamide 1.71 ml of hydrochloric acid in ethyl acetate (I, 84n; 3.15 mmol ) and 0.174 ml (1.51 mmol) of tert-butyl nitrite (1.74 ml from a solution of 1 ml of tert-butyl nitrite made up to 10 ml with dimethylformamide). The solution is stirred for 15 minutes at -100 and then the solution, cooled to -120, of 1.104 g (1.26 mmol) of H-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys (TRl) -Val-Leu-OH and 0 , 61 ml (4.41 mmol) of triethylamine in 15 ml of dimethylformamide were added dropwise. The reaction mixture is stirred for one hour at -100 and four hours at room temperature.
After evaporating to a small volume in a high vacuum and adding water, a powdery product is obtained which is triturated twice with water and then dried over potassium hydroxide solution in a high vacuum. This crude product is purified by dissolving it from methanol.
From a methanolic solution saturated at 500, a white powder separates out overnight at 0, which turns out to be uniform in the thin-layer chromatogram.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf43c = 0.54; Rf1tÄ = 0.65; Rf45 = 0.50; Rf70 = 0.75; Rf in chloroform-methanol (8: 2) = 0.40.
Example 2
EMI4.1
To 172 mg (0.2 mmol) EOC-Val-Cys (TRI) -Gly-Glu (OtBu) and 128 mg BOC-Cys (TRI) -Asn-OtBu in 5 ml ethyl acetate and 2 ml methanol are added 254 mg ( 1 mmol) iodine in 5 ml of methanol and the solution is left to stand for one hour at room temperature. At 0, it is decolorized with 1N thiosulfate solution, the reaction mixture is taken up in 200 ml of ethyl acetate and washed three times with water. When the ethyl acetate solution (dried with sodium sulfate) is concentrated, [BOC Cys-Asn-OtBu] 2 precipitates in crystalline form (32 mg, mp 194-1960) and is filtered off. The filtrate is evaporated to dryness and the residue is triturated twice with petroleum ether. 90 mg (I) are obtained from the insoluble residue by column chromatography on silica gel.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, this shows Rf = 0.25 in the chloroform-methanol system (95: 5) and Rf = 0.30 in the toluene-acetone system (1: 1).
The second product obtained in column chromatography is 54 mg [BOC-Val-Cys-Gly-Glu (OtBu) l ;; Rf (on silica gel) in the system chloroform-methanol (9: 1) = 0.55. The above-mentioned crystalline dimer from F. 194-1960 shows the following Rf values (on silica gel): in chloroform-methanol (9: 1) Rf = 0.25; in toluene acetone (1: 1) Rf = 0.18.
The two starting peptides can be produced as follows: 1. Z-Asn-OtBu
32 g (120 mmol) of Z-Asn-OH are dissolved in 600 ml of dioxane and 300 ml of isobutylene is passed into the solution at -300. After adding 12 ml of concentrated sulfuric acid, the flask is closed and left to stand at 0 for 20 hours with occasional shaking, a clear solution being obtained. This is largely freed from excess isobutylene at room temperature. An aqueous solution of 44 g of potassium bicarbonate is added to the resulting solution at 0, then evaporated to a small volume and taken up in ethyl acetate. The organic phase is washed neutral with 1N bicarbonate and then with water.
When the ethyl acetate solution dried with sodium sulfate is concentrated, the product begins to crystallize out. N-Hexane is added and the product is filtered off. 100-1020. [A] 2r3: -160 (c = 2 in methanol).
In the thin-layer chromatogram on silica gel, the Rf value in toluene-acetone (7: 3) = 0.27; in ethyl acetate = 0.43.
2. H-Asn-OtBu
23.6 g (73.2 mmol) of Z-Asn-OtBu are hydrogenated in 200 ml of ethyl acetate in the presence of 2 g of Pd-charcoal (10%). After 1 hour, no more hydrogen is taken up. The catalyst is filtered off. When the filtrate is concentrated, the product crystallizes from F. 96-980; [a] D: + 20 (c = 2.1 in methanol).
In the thin-layer chromatogram on silica gel, Rf., 2 = 0.30; Rf <5 = 0.50.
3. BOC-Cys (TRI) -Asn-OtBu
To 18.52 g (40 mmol) of BOC-Cys (TRI) -OH and 5.6 ml (40 mmol) of triethylamine in 200 ml of tetrahydrofuran at -10 5.32 ml (40 mmol) of isobutyl chlorocarbonate and stir for 10 minutes this temperature. A solution, cooled to -100, of 7.52 g (40 mmol) of H-Asn-OtBu in 150 ml of tetrahydrofuran is added dropwise and the mixture is left to stand for 1 hour at -100 and overnight at room temperature.
The precipitated triethylamine hydrochloride is then filtered off, the filtrate is evaporated to dryness, the residue is taken up in ethyl acetate and washed with 1N citric acid, 1N sodium bicarbonate and water. When the ethyl acetate solution is concentrated and petroleum ether is added, the product crystallizes out. F. 155 to 1570. [cc] 2D3. + 340 (c = 2.1 in CHCl3).
In the thin-layer chromatogram on silica gel in toluene-acetone (1: 1), Rf = 0.45; in chloroform, methanol (95: 5) = 0.33; Rf: 3rd, = 0.65.
4. Z-Gly-Glu (OtBu) 2
To a solution of 23.2 g (0.11 mol) of Z-Gly-OH and 15.54 ml (0.11 mol) of triethylamine in 200 ml of tetrahydrofuran at -100 14.97 ml (0.11 mol) Isobutyl chlorocarbonate and let stand at 100 for 10 minutes. A mixture of 28.52 g (96.5 mmol) of H-Glu (OtBu) 2, HC1 and 13.5 ml (96.5 mmol) of triethylamine hydrochloride in 300 ml of tetrahydrofuran is filtered off from the triethylamine hydrochloride, the filtrate is cooled to -10 and then dropped into the above solution at -100. The mixture is stirred for a further 1 hour at -100 and 2 hours at room temperature, the precipitated triethylamine hydrochloride is filtered off and the filtrate is evaporated to dryness.
The oil obtained is taken up in ethyl acetate and washed with 1N citric acid, 1N sodium bicarbonate and water. After evaporation of the ethyl acetate, the peptide derivative is obtained, which crystallizes from ethyl acetate-n-hexane. F. 74 to 760; [iD3: 170 (c = 2.2 in methanol).
In the thin-layer chromatogram on silica gel, the Rf value in toluene-acetone (7: 3) = 0.50.
5. H-Gly-Glu (OtBu),
2.7 g (6 mmol) of Z-Gly-Glu (OtBu) are hydrogenated in 30 ml of ethyl acetate in the presence of 250 mg of Pd-charcoal (102). The uptake of hydrogen has ended after 4 hours. The catalyst is filtered off and the solution is evaporated. The product is obtained as an oil which is uniform according to thin-layer chromatography. The Rf values (on silica gel) are:
In toluene-acetone (7: 3) = 0.27; in chloroform, methanol (9: 1) = 0.37; RftÄ v = 0.50.
6. TRI-Cys (TRI) -Gly-Glu (OtBu) 2
To 26.6 g (44 mmol) of TRI-Cys (TRI) -OH and 13.9 g (44 mmol) of H-Gly-Glu (OtBu) in 350 ml of ethyl acetate at 0 9.06 g (44 mmol) Add dicyclohexylcarbodiimide, stir for 2 hours at 0 and leave to stand in the refrigerator overnight. The dicyclohexylurea which has separated out is then filtered off, the filtrate is washed with 1N citric acid, 1N sodium bicarbonate and water, the solution is dried and evaporated. The product crystallizes from ethyl acetate-n-hexane. 107 to 1100. [¯r] 2.3: + 80 (c = 2.0 in methanol).
In the thin-layer chromatogram on silica gel in the toluene-acetone system (7: 3), Rf = 0.70; in chloroform-methanol (98: 2), Rf = 0.78.
7. H-Cys (TRI) -Gly-Glu (OtBu)
5 ml of water are added at room temperature to 3.156 g (3.5 mmol) of TRI-Cys (TRI) -Gly-Glu (OtBu) in 20 ml of glacial acetic acid in such a way that the precipitate that has formed always dissolves again. After about 10 minutes, turbidity and the formation of a precipitate appear. The mixture is stirred for 1 hour, then 15 ml of water are added and the mixture is filtered off. The filtrate is evaporated in a high vacuum at 40, the residue is taken up in ethyl acetate and washed at 0 with 0.5N sodium bicarbonate and water. The foam obtained after evaporation is triturated with petroleum ether.
The product shows in the thin-layer chromatogram on silica gel in chloroform-methanol (95: 5) Rf = 0.40; in toluene acetone (1: 1) Rf = 0.55; Rf42A = 0.60.
8. BOC-Val-Cys (TRI) -Gly-Glu (OtBu) 2
To 7.17 g (33 mmol) of BOC-Val-OIH and 4.62 ml (33 mmol) of triethylamine in 80 ml of ethyl acetate at -10 4.4 ml (33 mmol) of isobutyl chlorocarbonate and stir for 10 minutes at -100. A solution, cooled to -100, of 21.92 g (33 mmol) of H-Cys (TRI) -Gly Glu (OtBu) in 400 ml of ethyl acetate is added dropwise and the mixture is kept for a further 1 hour at 100 and 10 hours at room temperature. It is then evaporated to dryness, the residue is triturated twice with 200 ml of water each time and dried over phosphorus pentoxide. The residue is dissolved in 450 ml of hot methanol. The product crystallizes out at 0 overnight.
F. 213-215. [a] 2D = +190 (c = 2.2 in chloroform).
In the thin-layer chromatogram on silica gel in the system cyclohexane-ethyl acetate (1: 1), Rf = 0.18; in the toluene-acetone (1: 1) system, Rf = 0.65.
Example 3
172 mg (0.2 mmol) of BOC-Val-Cys (TRI) -Gly-Glu (OtBu) are added. in 5 ml of ethyl acetate and 2 ml of methanol with 127 mg (0.5 mmol) of iodine in 2.5 ml of methanol and the reaction mixture is left to stand for 1 hour at room temperature. The solution is then decolorized at 03 with 1N thiosulphate, taken up in 200 ml of ethyl acetate and washed three times with water.
The product obtained after evaporation of the ethyl acetate solution is triturated twice with petroleum ether.
The insoluble in teirol ether [BOC-Val-Cys-Gly-Glu (OtBu) -. is uniform according to thin layer chromatography.
Yield 123 mg (100%).
Example 4
EMI6.1
<tb> BOC-Cys-Tyr (tBu) -Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 <SEP>
<tb>
To a solution of 620 mg of iodine in 150 ml of methanol, 500 mg of BOC-Cys (TRI) -Tyr (tBu) -Ile-Gln-Asn-Cys (TRI) -Pro-Leu-Gly-NH, dissolved in 100 ml of methanol, added dropwise within 45 minutes. The mixture is stirred for a further hour, then the solution is cooled to 50 and decolorized by adding 1.0N aqueous sodium thiosulphate solution. The solution is then concentrated to a volume of about 5 ml in a water jet vacuum and the product is precipitated by adding a large amount of water. It is suction filtered and dried over sodium hydroxide in vacuo. To convert it into the free oxytocin, the product is suspended in 5 ml of ice-cold, concentrated hydrochloric acid and dissolved with stirring.
After 10 minutes at 0, the solution is diluted with 20 ml of ice water, 5 ml of glacial acetic acid is added, it is filtered through a column of Merck ion exchanger No. II, weakly basic, acetate form, and it is washed with 20% acetic acid. It is then evaporated in vacuo at 30, the residue is dissolved in water and the solution is lyophilized. The crude oxytocin thus obtained can, if desired, be further purified by the method of Yamashiro (Nature 201, 76 (1964)).
The protected nonapeptide derivative BOC - Cys (TRI) - Tyr (tBu) - Ile - Gln- Asn-Cys (TRI) -Pro-Leu-Gly-NH2 used as starting material can be produced as follows: 1. TRI-Cys (TRI) -Pro-Leu-Gly-NH2
30 g of H-Pro-Leu-Gly-NH2 are dissolved in 500 ml of freshly distilled dimethylformamide, and the solution, cooled to 50, is mixed with 70 g of TRI-Cys (TRI) -OH, 20 g of N-hydroxysuccinimide and 30 g of dicyclohexylcarbodiimide. After 30 minutes at 0, the mixture is warmed to room temperature and left to stand for 18 hours.
The precipitated dicyclohexylurea is then suction filtered, the filtrate is evaporated in a high vacuum at 400 and the residue is treated with 1 liter of petroleum ether. After thorough trituration of the undissolved product, the petroleum ether solution is decanted off.
The residue, which is insoluble in petroleum ether, is taken up in ethyl acetate, the solution is washed at 0 with dilute citric acid, water, sodium bicarbonate solution and water, dried with sodium sulfate and evaporated to dryness. The crude tetrapeptide derivative TRI - Cys (TRI) - Pro - Leu - Gly obtained in this way is dissolved in methanol for purification and filtered through a column of Sephadex LH-20. The fractions obtained are evaporated and their purity is checked by means of thin-layer chromatography on silica gel plates in the chloroform-methanol (99: 1) system. The pure fractions are combined, evaporated and dried.
2. H-Cys (TRI) -Pro-Leu-Gly-NH.i
To split off the N -TRI group, 5 g of TRI-Cys (TRI) -Prn-Leu-Gly-NH2 are dissolved in 100 ml of 80% acetic acid and the solution is left to stand at 350 for 1 hour. Then 100 ml of water are added and the mixture is left to stand at 0 for 5 hours. The crystals of the precipitated triphenylcarbinol are then filtered off with suction, the filtrate is evaporated to dryness and the residue is dried at 300 in a high vacuum. To convert it into the free base, the H-Cys (TRI) -Pro-Leu-Gly-NHs obtained as the acetic acid salt is dissolved in chloroform, the solution is washed with dilute sodium bicarbonate solution, dried over sodium sulfate and evaporated.
3. Z-Tyr (tBu) -Ile-Gln-Asn-OH
4.05 g of H-Ile-Gln-Asn-OH are dissolved in 70 ml of water and 1.5 ml of triethylamine and then 200 ml of dimethylformamide are added. 8 g of Z-Tyr (tBu) -p-nitrophenyl ester (prepared from Z-Tyr (tBu) -OH and p-nitrophenol by means of dicyclohexylcarbodiimide, F. 88-890 from methanol-water) are then added and the mixture is left to stand for 72 hours at room temperature . Then the mixture is concentrated in vacuo at 400 to about 20 ml, 100 ml of 0.5N sodium bicarbonate solution and 200 ml of ether are added, the ether solution is separated off and the aqueous phase is cooled in ice. After acidification with 2N hydrochloric acid, the precipitated Z-Tyr (tBu) -Ile-Gln-Asn-OH is suction filtered and washed with ice water. For purification, it is precipitated again from dimethylformamide solution with ether.
4. H-Tyr (tBu) -Ile-Gln-Asn-OH
1.2 g of the tetrapeptide derivative obtained under 3 are dissolved in 50 ml of 90% acetic acid and hydrogenated in the presence of 0.5 g of palladium carbon (10% Pd). After the hydrogenation has ended, the catalyst is suction filtered, the filtrate is evaporated to dryness in vacuo and the residue is dried at 400 in a high vacuum.
5. BOC-Cys (TRI) -Tyr (tBu) -Ile-Gln-Asn-OH
The product obtained under 4 is suspended in 35 ml of dimethylformamide and 0.5 ml of triethylamine and brought into solution by adding water.
Then 1.0 g of BOC-Cys (TRI) -p-nitrophenyl ester is added and the reaction mixture is left to stand at 280 for 48 hours. It is then concentrated in a high vacuum at 350, 100 ml of ice-cold 1N hydrochloric acid are added to the residue and the crude pentapeptide derivative is suction filtered. After washing with ice water and drying, it is reprecipitated several times from dimethylformamide ether.
For further purification, it is dissolved in methanol and chromatographed over a column of Sephadex LH-20.
6. BOC-Cys (TRI) -Tyr (tBu) -Ile-Gln-Asn-Cys (TRI) -Pro-Leu-Gly-NH2
2.1 g of the tetrapeptide derivative obtained under 2 and 3.3 g of BOC-Cys (TRI) -Tyr (tBu) -Ile-Gln-Asn-OH are dissolved in 50 ml of dimethylformamide with the addition of 1 g of N-hydroxysuccinimide. The solution, cooled to -200, is admixed with 0.9 g of dicyclohexylcarbodiimide and left to stand for 2 hours at 200 and then for 48 hours at room temperature, a further 200 mg of dicyclohexylcarbodiimide being added after 6, 12 and 18 hours. The dicyclohexylcarbodiimide which has separated out is then filtered off, the filtrate is concentrated to a small volume in a high vacuum at a bath temperature of 400 and the nonapeptide derivative is precipitated by adding ether.
The powder is sucked off, dried, ground with water, sucked off again and dried. The crude BOC - Cys (TRI) - Tyr (tBu) - Ile-Gln-Asn-Cys (TRI) Pro-Leu-Gly-NH obtained in this way is subjected to countercurrent distribution in the same system as described in Example 1 for purification.
Example 5
EMI7.1
<tb> BOC-Cys-Tyr (tBu) -Phe-Gln-Asn-Cys-Pro <SEP>
<tb> <SEP> Lys <SEP> (B <SEP> OC) <SEP> -Gly-NH2 <SEP>
<tb>
A solution of 800 mg BOC-Cys (TRI) -Tyr (tBu) -Phe-Gln-Asn-cys (TRI) -pro-Lys (Boc.) Is added to a solution of 1120 mg iodine in 500 ml methanol at room temperature with vigorous stirring ) -Gly-NHst in 500 ml of methanol was added dropwise within 45 minutes. The solution is then cooled to 20 and decolorized by the dropwise addition of 1N aqueous sodium thiosulfate solution. It is then concentrated to a small volume in a water jet vacuum at a bath temperature of 300 and the product is precipitated by adding a large amount of water. It is suction filtered and dried in a vacuum desiccator.
For the purpose of conversion into lysine8 vasopressin, the
EMI7.2
<tb> BOC-Cys-Tyr (tBu) <SEP> -Phe-Gln-Asn- <SEP>
<tb> Cys-Pro-Lys (BOC) -Gly-NH dissolved in 10 ml ice-cold, concentrated hydrochloric acid while stirring. After 10 minutes at 0, the mixture is diluted with 50 ml of ice water and 5 ml of glacial acetic acid are added. This is followed by a column of Merck ion exchanger No. II, weakly basic,
Acetate form, filtered and the eluate evaporated to dryness.
The protected nonapeptide derivative BOC - Cys (TRI) - Tyr (tBu) - Phe-Oln-Asn-Cys (TRI) -Pro-Lys (BOC) -Gly-NH2 can be used in a manner analogous to that for the protected nonapeptide amide in Example 4 shown by condensation of BOC-Cys (TRI) -Tyr (tBu) -Phe-Gln-Asn-OH with H-Cys (TRI) -Pro Lys (BOC) -Gly-NH2 in the presence of dicyclohexylcarbodiimide and N-hydroxysuccinimide will. The intermediate products can also be prepared analogously.
Example 6
EMI7.3
<tb> B0 & ys-Phe-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro- <SEP>
<tb> <SEP> Lys (BOC) -Gly-NH. <SEP>
<tb>
This compound can be prepared from BOC-Cys (TRI) -Phe-PheGln-Asn-Cys (TRI) -Pro-Lys (BOC) -Gly-NH2 by the method described in Example 5 and converted into Phe2, Lys8-vasopressin .
Example 7
1.524 g of BOC-Cys (TRI) -Gly-Glu (OtBu) 3 and 508 mg of iodine are allowed to react in 25 ml of methanol for one hour at room temperature. By adding dropwise aqueous 1N sodium thiosulfate solution, the reaction solution is decolorized at 0 and the product is precipitated with 50 ml of water. The dried crude product is triturated three times with 10 ml of petroleum ether each time. Crystallization of the residue from ethyl acetate-petroleum ether gives 945 mg (91%) [BOC Cys-Gly-Glu (OtBu) 2] 3 with a temperature of 150-1520. Rf = 0.60 (chloroform-methanol 9: 1).
Example 8
The reaction of 762 mg (1.0 mmol) BOC-Cys (TRI) -Gly-Glu (OtBu) r and 634 mg (1.0 mmol) BOC Cys (TRI) -Asn-OtBu with 508 mg (2.0 mmol) iodine and the work-up are carried out as in Example 7.
The crude product shows three spots in the thin-layer chromatogram on silica gel in the chloroform-methanol (9: 1) system: Rf = 0.60 ([BOC-Cys-GW-Glu (0tBu) 2j2 = I), 0.25 ([BOC-Cys -Asn-OtBu] 3 = II) and 0.45
EMI7.4
The separation is achieved by countercurrent distribution in the system methanol-0.1-ammonium acetate-chloroform-carbon tetrachloride (4: 2: 1: 3). After 100 steps, II is in elements 56-76 (r ,,, = 65; K = 1.85). These are emptied, fresh lower phase poured in and a further 100 steps are carried out. III is now in pipes 8-25 (r, nax = 16; K = 0.09), I in elements 0-5.
Evaporation of these fractions and sublimation of ammonium acetate yields the three compounds in thin-layer chromatography pure form:
I melts after recrystallization from ethyl acetate
Petroleum ether at 150-1520; Yield 225 mg (statistical: 260 mg);
II melts ether after recrystallization from methanol at 194-1960; Yield 162 mg (statistically 195 mg).
III is amorphous; Yield 463 mg.
If the reaction is carried out with 1 mmol BOC-Cys (TRI)
Gly-Glu (OtBu) 2, 2 mmoles of BOC-Cys (TRI) -Asn OtBu and 3 mmoles of iodine are carried out so
580 mg III isolated (statistically 606 mg).
Example 9
To 254 mg (1 mmol) iodine in 5 ml glacial acetic acid the solution of 380 mg (0.5 mmol) BOC-Cys (TRI) Gly-Glu (OtBu) 2 and 45 mg (0.55 mmol) sodium acetate (anhydrous) placed in 5 ml of glacial vinegar and stirred for one hour at room temperature. Add 1 n sodium thiosulfate (1.7 ml) to decolorize the brown solution; a further 5 ml of glacial acetic acid are added and lyophilized. The resulting powder is taken up in water, filtered and the residue is washed well with water. After drying over phosphorus pentoxide, 205 mg (80S) of [BOC-Cys-Gly-Glu (OtBu) 2] o, F. 151-1520, are obtained by recrystallization from ethyl acetate petroleum ether.