Im französischen Patent Nr. 1 512 342 sind Peptide beschrieben, die sich durch eine verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden, dass sie am Aminoende als erste a-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen.
Es wurde nun gefunden, dass das D-Ser1-ah-Corticotro- pin und das D-Ser1, Asp25-a,-Corticotropin eine besonders gute adrenocorticotrope Wirkung bei ausgezeichneter Verträglichkeit aufweisen. (ah-Cortocotropin ist das menschliche Corticotropin. Unter ah-Corticotropin wird im folgenden die Sequenz H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu His -Phe-Arg-Trp -Gly-Lys -Pro -Val -Gly -Lys -Lys -Arg- Arg-Pro -Val-Lys-Val-Tyr-Pro -Asn -Gly-Ala-Glu -Asp- Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH verstanden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von D-Ser1-a-Corticotropin und D-Ser1, Asp25ah-Corticotropin, ihrer Säureadditionssalze und Komplexe.
Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch verwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und langkettigen Fettsäuren, zu nennen.
Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptiden entstehen und vor allem diejenigen, die ihnen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganische Stoffe sind Verbindungen, die sich von Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, ferner Alkalimetallpolyphosphate. Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z. B.
Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z. B. Protamin und insbesondere von Aminosäuren, die einen überwiegenden Anteil an sauren a-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, aufweisen.
Die neuen Verbindungen besitzen, wie bereits erwähnt, eine besonders gute ACTH-Aktivität bei ausgezeichneter Verträglichkeit. Sie sollen dementsprechend als Heilmittel verwendet werden, z. B. an Stelle des natürlichen Hormons.
Die neuen Peptide werden nach an sich bekannten Methoden hergestellt, insbesondere nach den für die Herstellung von anderen ACTH-Peptiden bekannten Verfahren.
Dabei werden die Aminosäuren in der gewünschten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Die Verknüpfung der Aminosäureund/oder Peptideinheiten erfolgt in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a -Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a -Aminogruppe und freier oder geschützter, z. B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe, umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.
Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylester, p-Nitrophenylester, 2,4,5 Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester, N-Hydroxypiperidinester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid oder einem unsubstituierten oder z. B. durch Halogen, Methyl oder Methoxy substituierten 1 Hydroxybenzotriazol) oder N,N'-Carbonyl-diimidazols, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphitamid aktiviert werden.
Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode, ferner die Merrifield-Methode und die Methode der N-Carboxyanhydride oder N-Thiocarboxyanhydride.
An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste.
Als Schutzgruppen verwendet man die für die Peptidsynthese bekannten Gruppen, insbesondere diejenigen, die für die Synthese von ACTH-Sequenzen bekannt sind, ferner gegebenenfalls neu vorgeschlagene Gruppen, z. B. die im französischen Patent 1 554 051 beschriebenen Gruppen. Als Amino-Schutzgruppen sind beispielsweise zu nennen gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppen wie Diphenylmethyloder Triphenylmethylgruppen, oder Acylgruppen wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthaloyl, p-Toluolsulfonyl, Benzylsulfonyl, Benzolsulfenyl, o-Nitrophenylsulfenyl, oder vor allem von der Kohlensäure oder Thiokohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls im aromatischen Rest durch Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxy- oder Niedercarbalkoxygruppen substituierte Carbobenzoxygruppen, z. B.
Carbobenzoxy, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy, p-Methoxycarbobenzoxy, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p' -Methoxyphenylazo) -benzyloxycarbonyl, Tolyloxycarbonyl, 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-Tolylisopropyloxycarbonyl und vor allem 2-(para-Biphenylyl)2-propyloxycarbonyl, ferner aliphatische Oxycarbonylgruppen wie z. B. Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert. Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, 2, 2,2-Trichlor äthyloxycarbonyl, 2-Jodäthoxycarbonyl und in erster Linie tert.-Butyloxycarbonyl, weiter z. B. Carbamoyl, Thiocarbamoyl, N-Phenylcarbamoyl und -thiocarbamoyl.
Die Carboxygruppen werden beispielsweise durch Amidoder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt. Zur Veresterung geeignet sind z. B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole wie Methanol, Äthanol, Cyanmethylalkohol oder insbesondere tert.-Butanol, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z. B. gegebenenfalls substituierte Benzylalkohole wie p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol, Phenole und Thiophenole wie p-Nitrothiophenol, 2,4,5-Trichlorphenol, p-Cyanphenol, oder p-Methansulfonylphenyl, weiter z. B. N-Hydroxysuccinimid und N Hydroxyphthalimid.
Die Hydroxygruppen der Seitenketten, z. B. der Serinund/oder Tyrosinreste können z. B. durch Verätherung, beispielsweise mit Benzylalkohol oder vorzugsweise mit tert. - Butanol geschützt werden, sie braucht aber nicht notwendig geschützt zu werden. Zum Schutze der Aminogruppen in der Guanidinogruppierung des Arginins kommen vor allem die Nitrogruppe und die Tosylgruppe zur Anwendung, doch braucht die Guanidinogruppe nicht geschützt zu werden.
Ebenso braucht die Iminogruppe des Histidins nicht unbedingt geschützt zu werden, jedoch kann es vorteilhaft sein, sie zu schützen, z. B. durch Benzyl, Trityl, Adamantyloxycarbonyl oder die in Ber. 100 (1967), 3838-3849 beschriebenen 2,2,2-Trifluor-1 -tert. -butyloxycarbonylaminoäthyl- oder -1 -benzyloxycarbonylaminoäthylgruppen. Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt in bekannter Weise durch Hydrogenolyse oder Hydrolyse, vor allem saure Hydrolyse, z. B. mittels starker organischer oder anorganischer Säuren, z. B. Halogenwasserstoffsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure, Trifluoressigsäure oder Ameisensäure, in einer einzigen oder gegebenenfalls in mehreren Stufen.
Vorzugsweise verwendet man als Schutzgruppe für die Aminogruppen der Seitenketten die tert. -Butyloxycarbonylgruppe und als Schutzgruppe für die Carboxylgruppen der Seitenkette und die C-terminale Carboxylgruppe die tert. - Butylestergruppe. Diese Schutzgruppen werden zweckmässig mittels Trifluoressigsäure, Salzsäure oder Fluorwasserstoff abgespalten.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher dadurch ge kennzeichnet, dass man die zum Aufbau der neuen Peptide nötigen Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende reaktive funk tionelle Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher
Gruppen geeigneten Schutzgruppen intermediär schützt, und gegebenenfalls Säureadditionssalze herstellt, indem man das Nonatriacontapeptid durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.
B. solche mit anorga nischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispiels weise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure,
Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphor säure, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essig säure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztrauben säure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure,
Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, 2,2 Dimethyl-2 -(p-chlorphenyloxy) -essigsäure, Benzoesäure,
Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoe säure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure,
4-Aminosalicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxy benzoesäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxy äthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure,
Naphthalinsulfonsäure oder Sulfanilsäure.
Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem z. B. für die intravenöse, intramuskuläre, subcutane oder intranasale
Applikation geeigneten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.
Für therapeutische Zwecke wendet man 0,01 bis 3 mg des Peptids in Lösung oder Suspensionen, z. B. als Zink komplex-Suspension oder als Gelatine-Lösung oder als Poly phloretinphosphat-Lösung, an. Von den Lösungen oder Sus pensionen verabreicht man 0,1 bis 5 ml, beispielsweise intra venös, intramuskulär, subcutan oder intranasal. Die Anwen dung kann z. B. ein- oder dreimal täglich oder ein oder mehr mals pro Woche erfolgen. Das freie Peptid wird vorzugs weise intravenös oder intramuskulär, die Komplexe, z. B. Zink komplexe, vorzugsweise intramuskulär oder subcutan ange wandt.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen be schrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angege ben.
Folgende Abkürzungen werden verwendet:
Z = Carbobenzoxy
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
But = tert. -Butyl
Ac = Acetyl
Die Aminosäure-Abkürzungen beziehen sich auf L Aminosäuren, wenn die D-Konfiguration nicht besonders angegeben ist.
In der Dünnschichtchromatographie (DS) werden die folgenden Systeme verwendet: System 45: 2-Butanol-3-proz. wässe rigesNH3 70:30 System 52: 1-Butanol-Essigsäure
Wasser 71:7:22 System 89: Essigester-Aceton-Wasser 72:24:4 System 100: Essigester-Pyridin-Essig säure-Wasser 62:21:6: 11 System 101A: 1-Butanol-Pyridin-Essig säure-Wasser 42:24:4:30 System 108: Toluol-Aceton-Methanol
Essigsäure 70:5:20:5 System 111C: 1 -Butanol-Pyridin-konz.
NH3-Wasser 38:24:8:30 System 112E: 1-Butanol-Pyridin-Amei sensäure-Wasser 59 :26,8 :2,2:22 System 112B: 1 -Butanol-Pyridin-Amei sensäure-Wasser 40:24:6:30 System 101: 1-Butanol-Pyridin-Essig säure-Wasser 38 :24:8:30.
Beispiel 1 H-D -S er-Tyr -S er -Met -Glu -His -Phe -Arg-Trp -Gly-Lys -Pro - Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp- Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu Phe-OH (D-Ser1, Asp25-ah-Corticotropin).
Man friert 12 ml 90%ige Trifluoressigsäure bei -30" C ein, fügt 400 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC) -Pro-Val-Gly-Lys(B OC) Lys(BOC) -Arg -Arg-Pro -Val-Lys(BOC) -Val-Tyr-Pro Asp(OtBu) -Gly-Ala-Glu(OtBu) -Asp(OtBu) -Glu(OtBu) Ser-Ala-Glu(OtBu) -Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu) -Phe OtBu zu, verdrängt die Luft durch Stickstoff, lässt auf 25" C erwärmen und belässt 90 Minuten. Dann giesst man die Mischung in 300 ml eiskalten, peroxydfreien Äther, nutscht ab, wäscht mit Äther nach und trocknet.
Das Trifluoracetat des freien Nonatriacontapeptids löst man in 5% Essigsäure und filtriert zur Entfernung von Trifluoracetationen über eine Säule von Merck-Ionenaustauschern Nr. 2 (schwach basisch, Acetatform). Man lyophilisiert das Eluat und erhält das D-S er1, Asp2s-ah-Corticotropin als farbloses Pulver.
Dünnschichtchromatographie auf Cellulose (Avicel, mikrokristallin) Ruf101 = 0,37, Rf,l2B = 0,55. Bei Dünnschichtelektrophorese auf Celluloseplatte beträgt die Laufstrecke 2,8 cm gegen Kathode (pH = 1,9, 16 V/cm, 1 Stunde). Das als-Ausgangsmaterial verwendete,geschützteNonadecapep- tid kann wie folgt hergestellt werden:
Man setzt H-Ala-Glu(OtBu) -Ala-Phe-Pro-Leu-Glu- (OtBu)-Phe-OtBu-Acetat mit Carbobenzoxy-L-serin-pentachlorphenylester in Dimethylformamidlösung um, fällt das Produkt mit Äther aus, wäscht auf der Nutsche frei von Pentachlorphenol und trocknet im Vakuum (Dünnschichtchromatographie an Silicagel: Rf = 0,38 (Chloroform-Ace ton = 1 : 1); 0,45 (Chloroform-Methanol = 9: 1).
Dann entfernt man die Carbobenzoxygruppe durch katalytische Hydrie ruilg in 80 %iger Essigsäure in Gegenwart von Palladiumkohle.
Nach Entfernen des Katalysators und Eindampfen der Lösung ist das Produkt einheitlich. DS : 0,20 (Silicagel, Chloroform-Methanol = 9:1). Dann setzt man mit Carbobenzoxy-L glutaminsäure-y-tert.-butyl-a-p-nitrophenylester um in Dimethylformamidlösung. Man fällt das Produkt mit Äther aus, nutscht ab, wäscht mit viel Äther nach und trocknet. Man reinigt das Produkt durch Chromatographie an Silicagel, wobei es durch einen linearen Gradienten aus Chloroform und Chloroform-Methanol (9:1)-Gemisch eluiert wird. Man kontrolliert die Reinheit der Fraktionen durch DS-Chromatographie auf Silicagel, System Chloroform-Methanol (9: 1), Rf = 0,50.
Dann hydriert man zur Entfernung der Carbobenzoxygruppe wie oben; das Produkt zeigt Rf = 0,30 an Silicagel in Chloroform-Methanol (9:1). Dann setzt man mit Carbobenz oxy-L-asparaginsäure-ss-tert. -butylestere -p-nitrophenylester in Dimethylformamidlösung um und fällt das Produkt durch Zugabe von viel Äther aus, wäscht gründlich mit Äther nach und trocknet. Man reinigt das Produkt durch Chromatographie an Silicagel, wobei es durch ein Chloroform-Methanol (9: 1)-Gemisch eluiert wird. Die nach Dünnschichtchromatographie einheitlichen Fraktionen werden vereinigt; Rf an Silicagel = 0,06 in Chloroform-Aceton (7:3), Rf = 0,37 in Chloroform-Aceton (1:1), Rf = 0,42 in Chloroform-Methanol (9:1).
Dann hydriert man wie oben angegeben und setzt das Produkt [DS-Chromatographie: Rf = 0,29 an Silicagel, System Chloroform-Methanol (9:1)] mit Carbobenzoxy-L-glut aminsäure-y -tert.-butylester-a -p-nitrophenylester um. Das Produkt zeigt Rf = 0,07 an Silicagel, System Chloroform Methanol (9:1). Man hydriert es wie oben, setzt es mit Carbobenzoxy-L-alanin-p-nitrophenylester um [Rf = 0,31 Silicagel, System Chloroform-Methanol (9:1)], hydriert, setzt mit Carbobenzoxy-Glycin-p-nitrophenylester um und reinigt das erhaltene Z-Gly-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu) Ser-Ala-Glu(OtBu) -Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu) -Phe- OtBu durch Chromatographie an Silicagel, wobei das Produkt mit einem Chloroform-Methanol-Gemisch (4: 1) eluiert wird.
DS-Chromatographie an Silicagel : Rf = 0,33 im System Chloroform-Methanol (9:1); Rf = 0,75 in Chloroform-Methanol (4:1).
Dann hydriert man wie oben und setzt mit Carbobenz oxy-L-asparapinsäure-ss -tert. -butyl -p-nitrophenylester um [DS-Chromatographie Rf = 0,41 in Chloroform-Methanol (9:1)], hydriert wie oben und kondensiert mit Z-Arg-Arg Pro-Val-Lys(BOC) -Val-Tyr-Pro-OH-dihydrochlorid mittels der gemischten Anhydridmethode wie bei Schwyzer und Sieber, Helv. Chim. Acta 49 (1966), 134 beschrieben.
Das Produkt reinigt man durch Gegenstromverteilung im System Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff-Methanol-0,5 m wässrige Ammoniumacetatlösung (5 :5:8 :2) über 1200 Stufen (K 1,8). Man kontrolliert den Reinheitsgrad der erhaltenen Fraktionen mittels DS-Chromatographie an Silicagel im System Essigester-Pyridin-Essigsäure-Wasser (60 :20: 6: 11; Volumteile): Rf = 0,39.
Dann hydriert man zur Entfernung der Carbobenzoxygruppe in 80 %iger Essigsäure in Gegenwart von Palladiumkohle und setzt das erhaltene Produkt wie bei Schwyzer und Sieber, loc. cit. beschrieben mit dem aus Z-Lys(BOC)-Pro Val-Gly-Lys(BOC) -Lys(BOC) -hydrazid bereiteten Azid um, wobei man im Gegensatz zu diesen Autoren auf die Zerstörung des überschüssigen Azids verzichtet. Die Reinigung des geschützten Nonacosapeptids erfolgt durch Gegenstromverteilung nach Schwyzer & Sieber loc. cit.: K 0,6. Dann hy driert man in 80 HOiger Essigsäure, fällt das Produkt durch Zugabe von Natriumsulfatlösung als schwefelsaures Salz aus und setzt es schliesslich mit dem Dekapeptid BOC-D-Ser-Tyr Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH (Hydrat, vgl. B. Riniker & W. Rittel, Helv. Chim.
Acta 53, 513 (1970) mittels Dicyclohexylcarbodiimid unter Zugabe von N Hydroxysuccinimid um. Man reinigt das Rohprodukt durch Gegenstromverteilung wie bei Schwyzer & Sieber loc. cit angegeben (K - 0,9); DS-Chromatographie an Silicagel: Rf = 0,51 im System-Essigester-Pyridin-Essigsäure-Wasser (60:20: 6:11; Volumteile).
Beispiel 2 H-D -Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu- Phe-OH(D -Ser1 -ah-Corticotropin) .
150 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe Arg-Trp-Gly-Lys(BOC) -Pro-Val-Gly-Lys(B OC)-Lys (B OC) -Arg-Arg-Pro-Val-Lys(BOC) -Val-Tyr-Pro-Asn Gly-Ala-Glu(OtBu) -Asp(OtBu) -Glu(OtBu) -Ser-Ala Glu(OtBu) -Ala-Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu) -Phe-OtBu werden unter Überleitungen von N2 bei -5 " C mit 5 ml 90 %iger Tri fluoressigsäure versetzt. Nach dem Lösen wird auf Raumtemperatur erwärmt und 90 Minuten belassen. Das Peptid-Trifluoracetat wird durch Fällen mit Äther gewonnen. Nach Lösen in 2 ml Wasser wird durch eine kleine Säule aus 2 ml Amberlite IR 45-Acetat-Form filtriert, nachgewaschen mit 0,05n Essigsäure bei Pauly-negativ und das Filtrat lyophilisiert. Man erhält das Peptid in Form des Acetats.
Es zeigt bei Dünnschichtchromatographie auf Cellulose: Ruf101 = 0,39; Rf11213 = 0,55; bei Dünnschichtelektrophorese auf Cellulose: Laufstrecke = 3 cm gegen Kathode in 1 Stunde bei pH 1,9 und 16 V/cm.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
Man setzt das im Beispiel 1 erhaltene H-Gly-Ala-Glu (OtBu)-Asp(OtBu) -Glu(OtBu) -Ser-Ala-Glu(OtBu)-Ala Phe-Pro-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu in Dimethylformamidlösung mit Carbobenzoxy-L-asparagin-p-nitro-phenylester um, fällt das Produkt mit Äther aus und fällt es zweimal aus Dimethylformamid-Aceton um; DS -Chromatographie: Rf = 0,34 an Silicagel im System Chloroform-Methanol (9: 1). Dann hydriert man wie angegeben und baut die Sequenz weiter auf wie in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 3
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser1-ah-Corticotropin 1,0 mg ZnCl2 5,25 mg
Na2HPO4 2H2O 1,05 mg
NaCl 2,0 mg
Benzylalkohol 10,0 mg
0,6n NaOH ad pH 8,0
Dest. Wasser ad 1,0 ml
Beispiel 4
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser1-ah-Corticotropin 1,0 mg ZnCl2 4,20 mg Na2HPO4.2H2G 1,26 mg
NaCl 1,5 mg
Benzylalkohol 10,0 mg
NaOH ad pH 8,0
Dest. Wasser ad 1,0 mg
Beispiel 5
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser1-ah-Corticotropin 1,0 mg
Natriumpolyphosphat Calgon 322
Kondensationsgrad 15-30) 2,0 mg
NaCl 9 mg dest.
Wasser ad 1 ml
Beispiel 6
Man stellt eine Injektionslösung aus folgenden Komponenten her: D-Ser1-ah-Corticotropin 0,50 mg
Eisessig 1,22 mg
CH3COONa 3 H2O 0,607 mg
NaCl 8,1 mg dest. Wasser ad 1 ml
Beispiel 7
Man stellt eine Lösung aus folgenden Komponenten her: D-Sert-ah-Corticotropin 0,4 mg
20 %ige wässrige Lösung von Oxypolygelatine mit 0,5% Phenol ad 1 ml
Beispiel 8
Man stellt ein Trockenvial folgender Zusammensetzung her: D -S et-crh-Corticotropin 1,0 mg Natriumpolypbloretinphosphat (86,5%mg) 23,2 mg
NaCl 12,28 mg
Als Lösungsampulle wird bidestilliertes Wasser (2 ml) verwendet.
Beispiel 9
Man stellt einen Nasenspray, enthaltend ca. 100 Einzeldosen à 1 mg, wie folgt her:
100 mg feingemahlenes D-Ser1-ah-Corticotropin werden in einer Mischung von 75 mg Benzylalkohol und 1,395 g Miglyol 812 (Triglyzerid von Fettsäuren mit 8-12 Kohlenstoffatomen), suspendiert. Diese Suspension wird in 10-ml-Aluminium-Monoblocdosen eingefüllt und mit einem Dosierventil verschlossen. Dann werden 6,0 g Freon 12/114 (40:60) unter Stickstoffdruck eingefüllt.
Beispiel 10
Man stellt ein Trockenvial folgender Zusammensetzung her: D-Ser1-ah-Corticotropin 1,0 mg
Mannit 40,0 mg
Als Lösungsampulle wird physiologische Kochsalzlösung (2 ml) verwendet.
Beispiel 11
In den Beispielen 1-10 wird D-Ser1, Asp25-ah-Corticotropin statt des D-Ser1-ah-Corticotropins eingesetzt.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung von D-Ser1-ah-Corticotropin der Formel H-D -Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp- Gly-Lys -Pro-Val-Gly -Lys-Lys -Arg-Arg-Pro-Val-Lys -Val- Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe- Pro-Leu-Glu-Phe-OG oder seinem Asp25-Analogen und von Säureadditionssalzen dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass man die zu ihrem Aufbau nötigen Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende reaktive funktionelle Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen intermediär schützt und gegebenenfalls Säureadditionssalze herstellt,
indem man das Nonatriacontapeptid durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man als Schutzgruppe für die Aminogruppen die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und als Schutzgruppe für die Carboxylgruppen die tert.-Butylgruppe verwendet.
2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man sämtliche Schutzgruppen mittels Tri fluoressigsäure abspaltet.
PATENTANSPRUCH II
Verwendung der nach dem Verfahren von Patentanspruch I erhaltenen Peptide zur Herstellung von entsprechenden Peptid-Komplexen mit verlängerter Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man Komplexe mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat und/oder Zinkhydroxyd herstellt, indem man eine wässrige Lösung, welche das Peptid und ein wasserlösliches Zinksalz enthält, mit einem Alkalimetallhydroxyd, -phosphat oder -pyrophosphat umsetzt.
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French Patent No. 1 512 342 describes peptides which are characterized by an increased ACTH effect and which differ from the known peptides with ACTH effect in that they have a D-amino acid as the first α-amino acid at the amino end.
It has now been found that D-Ser1-ah-corticotropin and D-Ser1, Asp25-a, -corticotropin have a particularly good adrenocorticotropic effect with excellent tolerability. (ah-cortocotropin is the human corticotropin. In the following, ah-corticotropin is the sequence H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu His -Phe-Arg-Trp -Gly-Lys -Pro -Val -Gly -Lys -Lys -Arg- Arg-Pro -Val-Lys-Val-Tyr-Pro -Asn -Gly-Ala-Glu -Asp- Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OH understood.
The present invention relates to a process for the preparation of D-Ser1-α-corticotropin and D-Ser1, Asp25ah-corticotropin, their acid addition salts and complexes.
As acid addition salts, particular mention should be made of salts of therapeutically usable acids, such as hydrochloric acid, acetic acid, sulfuric acid, phosphoric acid and long-chain fatty acids.
Complexes are to be understood as meaning the complex-like compounds, whose structure has not yet been clarified, which arise when certain inorganic or organic substances are added to adrenocorticotropic peptides, and above all those which give them a prolonged effect. Such inorganic substances are compounds which are derived from metals such as calcium, magnesium, aluminum, cobalt and, in particular, zinc, especially sparingly soluble salts such as phosphates, pyrophosphates and polyphosphates and hydroxides of these metals, and also alkali metal polyphosphates. Organic substances that cause the effect to be prolonged are, for example, non-antigenic gelatin, e.g. B.
Oxypolygelatine, polyvinylpyrrolidone and carboxymethyl cellulose, also sulfonic acid or phosphoric acid esters of alginic acid, dextran, polyphenols and polyalcohols, especially polyphloretin phosphate and phytic acid, as well as polymers and copolymers of amino acids, e.g. B. protamine and in particular of amino acids which have a predominant proportion of acidic α-amino acids, such as glutamic acid or aspartic acid.
As already mentioned, the new compounds have particularly good ACTH activity with excellent tolerability. Accordingly, they are intended to be used as remedies, e.g. B. instead of the natural hormone.
The new peptides are produced by methods known per se, in particular by the processes known for the production of other ACTH peptides.
The amino acids are linked individually in the desired sequence or after forming smaller peptide units beforehand. The amino acid and / or peptide units are linked in such a way that an amino acid or a peptide with a protected α-amino group and activated terminal carboxyl group with an amino acid or a peptide with a free α -amino group and free or protected, e.g. B. esterified or amidated terminal carboxyl group, or that one reacts an amino acid or a peptide with activated α-amino group and protected terminal carboxyl group with an amino acid or a peptide with free terminal carboxyl group and protected α-amino group.
The carboxyl group can, for example, be converted into an acid azide, anhydride, imidazolide, isoxazolide or an activated ester such as cyanomethyl ester, carboxymethyl ester, p-nitrophenyl ester, 2,4,5 trichlorophenyl ester, pentachlorophenyl ester, N-hydroxysuccinimide ester, N-hydroxyphthalimide ester -Hydroxyquinoline ester, N-hydroxypiperidine ester or by reaction by means of a carbodiimide (optionally with the addition of N-hydroxysuccinimide or an unsubstituted or, for example, by halogen, methyl or methoxy substituted 1 hydroxybenzotriazole) or N, N'-carbonyl-diimidazole, the amino group for example, activated by reaction with a phosphite amide.
The most common methods are the carbodiimide method, the azide method, the activated ester method and the anhydride method, also the Merrifield method and the N-carboxyanhydride or N-thiocarboxyanhydride method.
Free functional groups which are not involved in the reaction are expediently protected, in particular by means of radicals which can be easily split off by hydrolysis or reduction.
The groups known for peptide synthesis are used as protective groups, in particular those known for the synthesis of ACTH sequences, and any newly proposed groups, e.g. B. the groups described in French patent 1,554,051. Examples of amino protective groups that may be mentioned are optionally substituted aralkyl groups such as diphenylmethyl or triphenylmethyl groups, or acyl groups such as formyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, p-toluenesulfonyl, benzylsulfonyl, benzenesulfenyl, o-nitrophenylsulfenyl, or, above all, groups which may be derived from carbonic acid or thiocarbonic acid, such as aromatic radical by halogen atoms, nitro groups, lower alkyl or lower alkoxy or lower carbalkoxy groups substituted carbobenzoxy groups, e.g. B.
Carbobenzoxy, p-bromo- or p-chlorocarbobenzoxy, p-nitrocarbobenzoxy, p-methoxycarbobenzoxy, colored benzyloxycarbonyl groups such as p-phenylazo-benzyloxycarbonyl and p- (p'-methoxyphenylazo) -benzyloxycarbonyl, tolyloxycarbonyl-isopropyl, 2-phenyloxycarbonyl, 2-phenyloxycarbonyl and especially 2- (para-biphenylyl) 2-propyloxycarbonyl, and also aliphatic oxycarbonyl groups such as. B. allyloxycarbonyl, cyclopentyloxycarbonyl, tert. Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, 2, 2,2-Trichlor äthyloxycarbonyl, 2-Jodäthoxycarbonyl and primarily tert-Butyloxycarbonyl, further z. Carbamoyl, thiocarbamoyl, N-phenylcarbamoyl and -thiocarbamoyl.
The carboxy groups are protected, for example, by amide or hydrazide formation or by esterification. Suitable for esterification are, for. B. lower optionally substituted alkanols such as methanol, ethanol, cyanomethyl alcohol or especially tert-butanol, also aralkanols such as aryl lower alkanols, e.g. B. optionally substituted benzyl alcohols such as p-nitrobenzyl alcohol or p-methoxybenzyl alcohol, phenols and thiophenols such as p-nitrothiophenol, 2,4,5-trichlorophenol, p-cyanophenol, or p-methanesulfonylphenyl, further z. B. N-hydroxysuccinimide and N hydroxyphthalimide.
The hydroxyl groups of the side chains, e.g. B. the serine and / or tyrosine residues can e.g. B. by etherification, for example with benzyl alcohol or preferably with tert. - Butanol can be protected, but it does not need to be protected. In order to protect the amino groups in the guanidino group of arginine, the nitro group and the tosyl group are mainly used, but the guanidino group does not need to be protected.
Likewise, the imino group of histidine does not necessarily need to be protected, but it can be advantageous to protect it, e.g. B. by benzyl, trityl, adamantyloxycarbonyl or those in Ber. 100, 3838-3849 (1967), 2,2,2-trifluoro-1-tert. -butyloxycarbonylaminoethyl or -1 -benzyloxycarbonylaminoethyl groups. The protective groups are split off in a known manner by hydrogenolysis or hydrolysis, especially acid hydrolysis, e.g. B. by means of strong organic or inorganic acids, e.g. B. hydrohalic acids, such as hydrochloric acid, hydrofluoric acid, trifluoroacetic acid or formic acid, in a single or optionally in several stages.
Preferably used as a protecting group for the amino groups of the side chains, the tert. -Butyloxycarbonylgruppe and as a protective group for the carboxyl groups of the side chain and the C-terminal carboxyl group the tert. - butyl ester group. These protective groups are expediently split off using trifluoroacetic acid, hydrochloric acid or hydrogen fluoride.
The method according to the invention is therefore characterized in that the amino acids required to build up the new peptides are condensed with one another to form CONH bonds in any chronological order, with reactive functional groups not participating in the reaction being introduced to protect them
Protective groups suitable as intermediates for groups, and if necessary acid addition salts are prepared by converting the nonatriacontapeptide into the corresponding salts by reaction with inorganic or organic acids.
Depending on the procedure, the new compounds are obtained in the form of bases or their salts. The bases can be obtained from the salts in a manner known per se. From the latter, in turn, salts can be obtained by reaction with acids which are suitable for the formation of therapeutically useful salts, e.g.
B. those with inorganic acids such as hydrohalic acids, for example hydrochloric acid or hydrobromic acid, perchloric acid,
Nitric acid or thiocyanic acid, sulfuric or phosphoric acid, or organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid,
Fumaric acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, hydroxymaleic acid, dihydroxymaleic acid, 2,2 dimethyl-2 - (p-chlorophenyloxy) -acetic acid, benzoic acid,
Phenylacetic acid, 4-aminobenzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, anthranilic acid, cinnamic acid, mandelic acid, salicylic acid,
4-aminosalicylic acid, 2-phenoxybenzoic acid, 2-acetoxybenzoic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid,
Naphthalenesulfonic acid or sulfanilic acid.
The peptides obtained according to the method can be used in the form of pharmaceutical preparations. These contain the peptides in a mixture with a z. B. for intravenous, intramuscular, subcutaneous or intranasal
Application of suitable pharmaceutical, organic or inorganic carrier material.
For therapeutic purposes, 0.01 to 3 mg of the peptide in solution or suspensions, e.g. B. as a zinc complex suspension or as a gelatin solution or as a poly phloretinphosphate solution. 0.1 to 5 ml of the solutions or suspensions are administered, for example intravenously, intramuscularly, subcutaneously or intranasally. The application can, for. B. one or three times a day or one or more times a week. The free peptide is preferred as intravenous or intramuscular, the complexes, for. B. zinc complex, preferably intramuscularly or subcutaneously applied.
The invention is described in the following examples. The temperatures are given in degrees Celsius.
The following abbreviations are used:
Z = carbobenzoxy
BOC = tert-butyloxycarbonyl
But = tert. -Butyl
Ac = acetyl
The amino acid abbreviations refer to L amino acids unless the D configuration is specifically indicated.
The following systems are used in thin layer chromatography (DS): System 45: 2-butanol-3 percent. aq. NH3 70:30 system 52: 1-butanol-acetic acid
Water 71: 7: 22 system 89: ethyl acetate-acetone-water 72: 24: 4 system 100: ethyl acetate-pyridine-acetic acid-water 62: 21: 6: 11 system 101A: 1-butanol-pyridine-acetic acid-water 42: 24: 4:30 system 108: toluene-acetone-methanol
Acetic acid 70: 5: 20: 5 system III C: 1 -butanol-pyridine-conc.
NH3-water 38: 24: 8: 30 system 112E: 1-butanol-pyridine-formic acid-water 59: 26.8: 2.2: 22 system 112B: 1-butanol-pyridine-formic acid-water 40:24 : 6:30 System 101: 1-butanol-pyridine-acetic acid-water 38: 24: 8: 30.
Example 1 HD -S er-Tyr -S er -Met -Glu -His -Phe -Arg-Trp -Gly-Lys -Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val- Tyr-Pro-Asp-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu Phe-OH (D-Ser1, Asp25-ah-corticotropin).
12 ml of 90% strength trifluoroacetic acid are frozen at -30 ° C., 400 mg of BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (OtBu) -His Phe-Arg-Trp-Gly-Lys (BOC) -Pro are added -Val-Gly-Lys (B OC) Lys (BOC) -Arg -Arg-Pro -Val-Lys (BOC) -Val-Tyr-Pro Asp (OtBu) -Gly-Ala-Glu (OtBu) -Asp (OtBu ) -Glu (OtBu) Ser-Ala-Glu (OtBu) -Ala-Phe-Pro-Leu-Glu (OtBu) -Phe OtBu, displaces the air with nitrogen, allows it to warm to 25 ° C. and leaves it for 90 minutes. The mixture is then poured into 300 ml of ice-cold, peroxide-free ether, filtered off with suction, washed with ether and dried.
The trifluoroacetate of the free nonatriacontapeptide is dissolved in 5% acetic acid and filtered through a column of Merck ion exchangers No. 2 (weakly basic, acetate form) to remove trifluoroacetate ions. The eluate is lyophilized and the D-S er1, Asp2s-ah-corticotropin is obtained as a colorless powder.
Thin layer chromatography on cellulose (Avicel, microcrystalline) Ruf101 = 0.37, Rf, 12B = 0.55. With thin-layer electrophoresis on a cellulose plate, the distance to the cathode is 2.8 cm (pH = 1.9, 16 V / cm, 1 hour). The protected nonadecapeptide used as the starting material can be prepared as follows:
H-Ala-Glu (OtBu) -Ala-Phe-Pro-Leu-Glu (OtBu) -Phe-OtBu acetate is reacted with carbobenzoxy-L-serine pentachlorophenyl ester in dimethylformamide solution, the product is precipitated with ether and washed pentachlorophenol on the suction filter and dried in vacuo (thin layer chromatography on silica gel: Rf = 0.38 (chloroform-acetone = 1: 1); 0.45 (chloroform-methanol = 9: 1).
The carbobenzoxy group is then removed by catalytic hydrogenation in 80% acetic acid in the presence of palladium carbon.
After removing the catalyst and evaporating the solution, the product is uniform. DS: 0.20 (silica gel, chloroform-methanol = 9: 1). Then it is reacted with carbobenzoxy-L-glutamic acid-y-tert-butyl-a-p-nitrophenyl ester in dimethylformamide solution. The product is precipitated with ether, filtered off with suction, washed with a lot of ether and dried. The product is purified by chromatography on silica gel, eluting with a linear gradient of chloroform and chloroform-methanol (9: 1) mixture. The purity of the fractions is checked by DS chromatography on silica gel, chloroform-methanol system (9: 1), Rf = 0.50.
It is then hydrogenated to remove the carbobenzoxy group as above; the product shows Rf = 0.30 on silica gel in chloroform-methanol (9: 1). Then one sets with carbobenz oxy-L-aspartic acid-ss-tert. -butylestere -p-nitrophenylester in dimethylformamide solution and the product is precipitated by adding a lot of ether, washed thoroughly with ether and dried. The product is purified by chromatography on silica gel, eluting with a chloroform-methanol (9: 1) mixture. The fractions which are uniform according to thin-layer chromatography are combined; Rf on silica gel = 0.06 in chloroform-acetone (7: 3), Rf = 0.37 in chloroform-acetone (1: 1), Rf = 0.42 in chloroform-methanol (9: 1).
Then it is hydrogenated as indicated above and sets the product [DS chromatography: Rf = 0.29 on silica gel, system chloroform-methanol (9: 1)] with carbobenzoxy-L-glutamine acid-y-tert-butyl ester-a - p-nitrophenyl ester. The product shows Rf = 0.07 on silica gel, system chloroform methanol (9: 1). It is hydrogenated as above, it is reacted with carbobenzoxy-L-alanine-p-nitrophenyl ester [Rf = 0.31 silica gel, system chloroform-methanol (9: 1)], hydrogenated, and reacted with carbobenzoxy-glycine-p-nitrophenyl ester and purifies the obtained Z-Gly-Ala-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) Ser-Ala-Glu (OtBu) -Ala-Phe-Pro-Leu-Glu (OtBu) -Phe-OtBu by chromatography on silica gel, wherein the product is eluted with a chloroform-methanol mixture (4: 1).
DS chromatography on silica gel: Rf = 0.33 in the chloroform-methanol system (9: 1); Rf = 0.75 in chloroform-methanol (4: 1).
Then hydrogenate as above and set with carbobenz oxy-L-asparapic acid-ss -tert. -butyl-p-nitrophenyl ester um [DS chromatography Rf = 0.41 in chloroform-methanol (9: 1)], hydrogenated as above and condensed with Z-Arg-Arg Pro-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr -Pro-OH-dihydrochloride using the mixed anhydride method as in Schwyzer and Sieber, Helv. Chim. Acta 49, 134 (1966).
The product is purified by countercurrent distribution in the system chloroform-carbon tetrachloride-methanol-0.5 M aqueous ammonium acetate solution (5: 5: 8: 2) over 1200 stages (K 1.8). The degree of purity of the fractions obtained is checked by means of DS chromatography on silica gel in the system ethyl acetate-pyridine-acetic acid-water (60: 20: 6: 11; parts by volume): Rf = 0.39.
Then, to remove the carbobenzoxy group, it is hydrogenated in 80% acetic acid in the presence of palladium carbon and the product obtained is set as in Schwyzer and Sieber, loc. cit. described with the azide prepared from Z-Lys (BOC) -Pro Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) -hydrazide, whereby, in contrast to these authors, the destruction of the excess azide is dispensed with. The protected nonacosapeptide is purified by countercurrent distribution according to Schwyzer & Sieber loc. cit .: K 0.6. The product is then hydrogenated in 80% acetic acid, the product is precipitated as a sulfuric acid salt by adding sodium sulfate solution and it is finally treated with the decapeptide BOC-D-Ser-Tyr Ser-Met-Glu (OtBu) -His-Phe-Arg-Trp -Gly-OH (hydrate, cf. B. Riniker & W. Rittel, Helv. Chim.
Acta 53, 513 (1970) by means of dicyclohexylcarbodiimide with addition of N hydroxysuccinimide. The crude product is purified by countercurrent distribution as in Schwyzer & Sieber loc. cit indicated (K - 0.9); DS chromatography on silica gel: Rf = 0.51 in the system-ethyl acetate-pyridine-acetic acid-water (60:20: 6:11; parts by volume).
Example 2 HD -Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro -Asn Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu- Phe-OH (D -Ser1 -ah-corticotropin).
150 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (OtBu) -His-Phe Arg-Trp-Gly-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (B OC) -Lys (B OC) -Arg-Arg-Pro-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr-Pro-Asn Gly-Ala-Glu (OtBu) -Asp (OtBu) -Glu (OtBu) -Ser-Ala Glu (OtBu) -Ala- Phe-Pro-Leu-Glu (OtBu) -Phe-OtBu are mixed with 5 ml of 90% trifluoroacetic acid while passing N2 at -5 ° C. After dissolving, the mixture is warmed to room temperature and left for 90 minutes. The peptide trifluoroacetate is obtained by precipitation with ether. After dissolving in 2 ml of water, it is filtered through a small column of 2 ml Amberlite IR 45 acetate form, washed with 0.05N acetic acid if Pauly-negative and the filtrate is lyophilized Form of the acetate.
In thin-layer chromatography on cellulose, it shows: Ruf101 = 0.39; Rf11213 = 0.55; with thin-layer electrophoresis on cellulose: distance = 3 cm against cathode in 1 hour at pH 1.9 and 16 V / cm.
The starting material can be made as follows:
The H-Gly-Ala-Glu (OtBu) -Asp (OtBu) -Glu (OtBu) -Ser-Ala-Glu (OtBu) -Ala Phe-Pro-Leu-Glu (OtBu) -Phe obtained in Example 1 is used -OtBu in dimethylformamide solution with carbobenzoxy-L-asparagine-p-nitro-phenyl ester, the product is precipitated with ether and it is reprecipitated twice from dimethylformamide-acetone; DS chromatography: Rf = 0.34 on silica gel in the chloroform-methanol system (9: 1). It is then hydrogenated as indicated and the sequence is further built up as described in Example 1.
Example 3
A suspension is prepared from the following components: D-Ser1-ah-corticotropin 1.0 mg ZnCl2 5.25 mg
Na2HPO4 2H2O 1.05 mg
NaCl 2.0 mg
Benzyl alcohol 10.0 mg
0.6N NaOH ad pH 8.0
Dist. Water to 1.0 ml
Example 4
A suspension is prepared from the following components: D-Ser1-ah-corticotropin 1.0 mg ZnCl2 4.20 mg Na2HPO4.2H2G 1.26 mg
NaCl 1.5 mg
Benzyl alcohol 10.0 mg
NaOH ad pH 8.0
Dist. Water ad 1.0 mg
Example 5
A suspension is prepared from the following components: D-Ser1-ah-corticotropin 1.0 mg
Sodium Polyphosphate Calgon 322
Degree of condensation 15-30) 2.0 mg
NaCl 9 mg dist.
Water ad 1 ml
Example 6
An injection solution is prepared from the following components: D-Ser1-ah-corticotropin 0.50 mg
Glacial acetic acid 1.22 mg
CH3COONa 3 H2O 0.607 mg
NaCl 8.1 mg dist. Water ad 1 ml
Example 7
A solution is prepared from the following components: D-Sert-ah-Corticotropin 0.4 mg
20% aqueous solution of oxypolygelatine with 0.5% phenol ad 1 ml
Example 8
A dry vial is prepared with the following composition: D -S et-crh-corticotropin 1.0 mg sodium polypbloretin phosphate (86.5% mg) 23.2 mg
NaCl 12.28 mg
Double-distilled water (2 ml) is used as the solution ampoule.
Example 9
A nasal spray containing approx. 100 single doses of 1 mg is prepared as follows:
100 mg of finely ground D-Ser1-ah-corticotropin are suspended in a mixture of 75 mg of benzyl alcohol and 1.395 g of Miglyol 812 (triglyceride of fatty acids with 8-12 carbon atoms). This suspension is filled into 10 ml aluminum monobloc cans and sealed with a metering valve. Then 6.0 g of Freon 12/114 (40:60) are introduced under nitrogen pressure.
Example 10
A dry vial is produced with the following composition: D-Ser1-ah-corticotropin 1.0 mg
Mannitol 40.0 mg
Physiological saline solution (2 ml) is used as the solution ampoule.
Example 11
In Examples 1-10, D-Ser1, Asp25-ah-corticotropin is used instead of D-Ser1-ah-corticotropin.
PATENT CLAIM 1
Process for the preparation of D-Ser1-ah-corticotropin of the formula HD -Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys -Pro-Val-Gly -Lys-Lys -Arg-Arg -Pro-Val-Lys -Val- Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-OG or its Asp25 analog and of acid addition salts of these compounds, characterized in that the amino acids necessary for their structure are condensed with one another to form CONH bonds in any chronological order, with reactive functional groups not participating in the reaction being intermediately protected by introducing protective groups suitable for protecting such groups and, if necessary, produces acid addition salts,
by converting the nonatriacontapeptide into the corresponding salts by reaction with inorganic or organic acids.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that the tert-butyloxycarbonyl group is used as the protective group for the amino groups and the tert-butyl group is used as the protective group for the carboxyl groups.
2. The method according to dependent claim 1, characterized in that all protective groups are split off by means of trifluoroacetic acid.
PATENT CLAIM II
Use of the peptides obtained by the process of claim I for the production of corresponding peptide complexes with prolonged action, characterized in that complexes with zinc phosphate, zinc pyrophosphate and / or zinc hydroxide are produced by adding an aqueous solution containing the peptide and a water-soluble zinc salt contains, reacts with an alkali metal hydroxide, phosphate or pyrophosphate.
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