Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung
Es wurden bereits Peptide beschrieben, die sich durch eine verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden, dass sie am Aminoende als erste a-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen, vgl. z.B. Schweizer Patent Nummer 499 497.
Als Peptid mit sehr guter ACTH-Wirkung ist darin das H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH (D-Ser1-ss'-24-Corticotropin) beschrieben.
Es wurde nun gefunden, dass das entsprechende Peptid, das an Stelle der Argininreste in 17,18-Stellung Lysinreste enthält, eine bessere adrenocroticotrope Wirkung aufweist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung des D-S eryl-L-tyrosyl-L-seryl-L- methionyl-L-glutamyl-(oder L-glutaminyl)-L-histidyl-Lphenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-propyl L-valyl-glycyl -L-lysyl -L-lysyl-L-lysyl-L -lysyl-L-prolyl-L-valyl- L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolins und seines C-terminalen Amids und ihrer Säureadditionssalze und Komplexe.
Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen.
Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu adrenocorticotrop wirksamen Peptiden entstehen und vor allem diejenigen, die ihnen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche anorganische Stoffe sind Verbindungen, die sich von Metallen, wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze, wie Phosphate und Pyrophosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle. Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z.B.
Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrin, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z.B. Protamin und insbesondere von Aminosäuren, die einen überwiegenden Anteil an sauren a-Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, aufweisen.
Die neuen Verbindungen besitzen, wie bereits erwähnt, eine wesentlich stärkere ACTH-Aktivität als die entsprechenden Verbindungen mit L-Konfiguration an der ersten Aminosäure. Sie sollen dementsprechend in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden, z.B. an Stelle des natürlichen Hormons.
Die neuen Peptide werden nach den für die Herstellung von Peptiden mit grosser Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt unter Verwendung einer D-Aminosäure als Nterminaler Aminosäure. Dabei werden die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft. Hervorzuheben ist besonders auch die sogenannte Feststoffträgersynthese (vgl.
Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85, 2149 [1963]), bei der das Peptid vom Carboxylende, das esterartig an ein Polymeres gebunden ist, aufgebaut wird, indem man die Aminosäuren der Reihe nach ankondensiert. Als Kondensationsmethoden sind z.B. die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode zu erwähnen. Beispielsweise kann man eines der Aminosäure- bzw. Peptidmoleküle in Form eines Esters mit einem weiteren Aminosäure- bzw. Peptidmolekül, das eine geschützte Aminogruppe enthält, in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie eines Carbodiimids oder eines Phosphorigsäureesterhalogenids, verknüpfen, oder man kann mit dem Aminosäure- bzw. Peptidester mit freier Aminogruppe eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe), z.B. ein Säurehalogenid, -azid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid (z.
B. aus N-Äthyl5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonat, s. Woodward et al., J.Am.
Chem.Soc. 89, 1011 [1961]), oder einem aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Carboxymethylthiolester oder Nitrophenylester, umsetzen. Umgekehrt kann auch eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit freier Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe) mit einer Aminosäure bzw. einem Peptid mit aktivierter Aminogruppe (und geschützter Carb oxylgruppe), z.B. einem Phosphitamid, zur Reaktion gebracht werden.
An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung, z.B. mit Methanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, oder Amidbildung, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung der Tosyl-, Trityl-, Formyl-, Trifluoracetyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, Phthalyl- oder Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo-benzyloxycarbonylgruppe und der p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginins ist die Nitrogruppe geeignet; die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden.
Die Iminogruppe des Histidins kann durch den Benzyl- oder Tritylrest geschützt werden.
Die Umwandlung einer geschützten Amino- oder Iminogruppe in eine freie Gruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher dadurch gekennzeichnet, dass man die zum Aufbau der neuen Peptide nötigen Aminosäuren bzw. deren aktivierte Derivate unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei die L-terminale Aminosäure gegebenenfalls in Form des Amids eingesetzt wird und wobei man nicht an der Reaktion teilnehmende reaktive funktionelle Gruppen durch Einführung von zum Schutz solcher Gruppen geeigneten Schutzgruppen intermediär schützt und gegebenenfalls die Säureadditionssalze herstellt, indem man das erhaltene Peptid durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Säuren in die entsprechenden Salze überführt.
Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, dass man das die ersten 3 Aminosäuren, z.B. H-D-Ser-Tyr-Ser-OH enthaltende Tripeptid (die abgekürzte Schreibweise bezieht sich auf L-Aminosäuren, wenn das D- nicht besonders bezeichnet ist), oder das ausserdem die 4. Aminosäure enthaltende Tetrapeptid mit dem Heptapeptid bzw. Hexapeptid der folgenden Aminosäuren bis zur Aminosäure 10 kondensiert, vorzugsweise nach der Azidmethode, und dann das Decapeptid mit dem Tetradecapeptid der Aminosäuren 11-24 kondensiert. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode der aktivierten Ester, vor allem mittels des p-Nitrophenylesters, verwendet.
Im letzten Fall braucht der p-Nitrophenylester des Decapeptids nicht als solcher isoliert zu werden, sondern kann auch in der Kondensationsstufe selbst aus dem Decapeptid mit freier Carboxylgruppe, p-Nitrophenol und Dicyclohexylcarbodiimid gebildet werden. Das Decapeptid liegt also als a-Amino-geschütztes Peptid mit freier Carboxylgruppe oder mit einer p-Nitrophenylestergruppe vor. Das Tetradecapeptid wird in Form eines Esters, vorzugsweise des tert. Butylesters, oder des a > -Amids verwendet. Die in den zu kondensierenden Peptidbruchstücken vorhandenen Seitenketten Aminogruppen werden vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die Seitenkettencarboxylgruppen durch die tert.-Butylestergruppe geschützt. Diese Schutzgruppen können in der letzten Stufe mit Trifluoressigsäure abgespalten werden.
Nach einem weiteren bevorzugten Verfahren wird das die ersten 4 Aminosäuren enthaltende Tetrapeptid H-D-Ser Tyr-Ser-Met-OH mit dem Eicosapeptid der Aminosäuren 5-24 kondensiert. Bei dieser Kondensation wird als Kupplungsmethode vorzugsweise die Azidmethode verwendet. Die a-Aminogruppe des Tetrapeptidhydrazids bzw. -azids wird vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonlygruppe geschützt. Das Eicosapeptid kann als freies Peptid oder als Ester, insbesondere tert.-Butylester, oder als Pro24-Amid vorliegen. Auch im Eicosapeptid werden die Seitenketten Aminogruppen vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die Seitenkettencarboxylgruppe durch die tert. - Butylestergruppe geschützt.
Nachdem man durch Kondensation der Peptidbruchstücke das Tetracosapeptid erhalten hat, dessen a-Aminogruppe und Seitenketten-Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und dessen Endcarboxylgruppe und Seitenkettencarboxylgruppe durch die tert. -Butylestergruppe geschützt sind, können alle diese Schutzgruppen gleichzeitig durch saure Hydrolyse, beispielsweise mit Trifluoressigsäure, abgespalten werden. Liegt die Endcarboxylgruppe nicht als tert.-Butylestergruppe, sondern als Amidgruppe vor, so werden Peptidamide erhalten. Peptidhydrazide erhält man beispielsweise, wenn man ein Peptid mit endständiger Niederalkylestergruppe mit Hydrazinhydrat behandelt.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.
B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4 Amino-salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxyben- zoesäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxy äthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Suffanilsäure.
Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geegineten pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermaterial.
Man kann sie auch mit den in der ACTH-Therapie üblichen Zusätzen zur Verlängerung der Wirkung, wie z.B.
Oxypolygelatine, Polyphloretinphosphat, Carboxymethylcellulose, oder den oben erwähnten schwerlöslichen Metallverbindungen, insbesondere Phosphaten, Pyrophosphaten oder Hydroxyden des Zinks, kombinieren.
In den folgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
Die dünnschichtchromatographischen Systeme werden wie folgt bezeichnet: System 43 A: tert. -Amylalkohol-Isopropanol-Wasser (100:40:10) System 45: sec.-Butanol-3% wässriges Ammoniak (100:44) System 100: Äthylacetat-Pyridin-Eisessig-Wasser (62:21:6:11) System 101: n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (30:20:6:24)
Folgende Abkürzungen werden verwendet: Z = Carbobenzoxy BOC = tert.-Butyloxycarbonyl tBu = tert.-Butyl.
Beispiel 1 1. Z.Lys(BOC)-Lys(BOC) NHNH2
10 g Z .Lys(BOC)-Lys(BOC) OCH3 (hergestellt aus Z Lys(BOC)-OH + Lys(BOC)-OCH3 mittels Dicyclohexylcarbodiimid) werden in 160 ml Methanol gelöst und mit 7,8 ml Hydrazinhydrat versetzt. Man lässt die klare Lösung während 24 Stunden bei 25 stehen und engt dann auf etwa 1/3 des ursprünglichen Volumens ein. Beim Versetzen mit 200 ml Wasser fällt ein öliger Niederschlag aus, der sich beim Abkühlen und Zerreiben verfestigt und pulverisiert werden kann. Man nutscht ab, wäscht mit Wasser und trocknet das Rohprodukt. Es wird durch einmaliges Umkristallisieren aus Methanol-Essigester-Petroläther gereinigt und weist dann einen F. von 118-119,5" auf.
Auf Silicagel-Dünnschichtplatten werden folgende Rf-Werte erhalten: Rf (43 A) = 0,40
Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,75
2. Z Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-OH
1,87 g Z Lys(BOC)-Lys(BOC) NHNH2 werden in 15 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst und auf 250 abgekühlt. Dazu tropft man langsam 2,07 ml 4,35n Salzsäure und anschliessend 0,66 ml 5n Natriumnitritlösung. Man rührt während 10 Minuten bei -10" und gibt dann eine Lö sung von 692 mg L-Prolin in 4,2 ml Dimethylformamid
Wasser (2:1) zu. Schliesslich werden noch bei 100 1,82 ml Triäthylamin zugetropft und dann die Reaktionslösung über
Nacht bei 0 und während weiterer 2 Stunden bei Raumtem peratur stehengelassen.
Man engt sodann im Hochvakuum auf ein Volumen von etwa 4 ml ein und versetzt den klebri gen Rückstand mit 25 ml Wasser. Durch Abkühlen auf 0 und Zerreiben kann er pulverisiert werden. Man nutscht ab, wäscht mit wenig Wasser und trocknet im Hochvakuum bei 40". Zur Reinigung des nicht kristallisierbaren Rohproduktes wird eine multiplikative Verteilung nach Craig im Lösungs mittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlen- stoff (35:13:15:15) [Puffer=28,5 ml Eisessig+ 19,25 g
Ammoniumacetat in 960 ml Wasser] mit Phasenvolumina von je 10 ml durckgeführt.
Nach 220 Stufen isoliert man aus den
Verteilungselementen Nr. 49-73 (uox =61; K =0,39) durch Einengen zur Trockne und Wegsublimieren des Am moniumacetates chromatographisch reines, jedoch amorphes
Tripeptidderivat vom F. etwa 70-80". Im Dünnschichtchro matogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten:
Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,19
Rf (43 A) = 0,29
Rf(45) = 0,52
3. Z Lys(B OC)-Lys(B OC) -Pro-Val-Lys(B OC)-Val-Tyr
ProOtBu
2,4 C; g Z Lys(B Z.Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro.OH zu OH und 3,12 g n Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 30 ml abso lutem Chloroform gelöst.
Man gibt bei 0 0,845 g Dicyclo hexylcarbodiimid zu, rührt während 1 Stunde bei 0 und lässt dann während 30 Stunden bei 25 stehen. Der ausge schiedene kristalline Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und mit ein wenig Essigester gewaschen. Zum Filtrat gibt man
150 ml Essigester und extrahiert die organische Phase bei 0^ dreimal mit je 30 ml 3 %iger Weinsäurelösung zur Entfernung des überschüssigen Pentapeptids. Man wäscht noch mehrmals mit Wasser bis zur neutralen Reaktion und dampft dann zur
Trockne ein. Zur Abtrennung von lipophilen Verunreinigun gen löst man den Rückstand in 10 ml Methanol und 20 ml
Essigester und fällt das Octapeptid durch Zugabe von 120 ml
Petroläther als schmierige Masse aus, die im Vakuum bei 40 getrocknet wird.
Das so erhaltene Rohprodukt (3,1 g) wird zur endgültigen Reinigung einer Craig-Verteilung im
System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (30:10:3:30) [Puffer wie unter 2. angegeben] über 225 Stufen mit Phasenvolumina von je 10 ml unterworfen. Das chromatographisch einheitliche Octapeptidderivat wird beim Einengen des Inhaltes der Elemente Nr. 65-96 (umax=78; K=0.53) zur Trockne und Wegsublimieren des Ammoniumacetates im Hochvakuum als weisses amorphes Pulver vom F. etwa 130-140 erhalten. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf (43 A) = 0,74 Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,54 Rf (Benzol-Aceton = 1:1) = 0,33 4.
H Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val Tyr-Pro-OtBu
1,46 g Z Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC) Val-Tyr-Pro-OtBu werden in 40 ml Methanol nach Zugabe von 300 mg 10%iger Palladiumkohle in einer Schüttelente mit Kohlendioxyd-Absorption hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist nach 20 Min. bereits beendet. Nach 1 Stunde wird der Katalysator abfiltriert, mit Methanol nachgespült und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Man erhält in quantitativer Ausbeute das chromatographisch einheitliche decarbobenzoxylierte Octapeptidderivat als weisses amorphes Pulver vom F. etwa 110-120 . Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf (43 A) = 0,53
Rf (Chloroform-Methanol = 9: 1) = 0,34 5.Z.
Lys (BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC) Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr Pro-OtBu
1,98 g Z Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)- Lys(BOC) NHNH2 (Schweizer Patent Nr. 485 670) werden in 22 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf -25" tropfenweise unter Rühren mit 3,4 ml 2,115n Salzsäure und dann mit 0,378 ml 5n Natriumnitritlösung versetzt. Die klare Lösung wird während 15 Minuten bei -10" weitergerührt und dann mit einer auf -5" vorgekühlten Lösung von 1,313 g des oben beschriebenen Octapeptidderivates in 4 ml Dimethylformamid versetzt. Man spült noch mit 1 ml Dimethylformamid nach und tropft dann langsam bei -5" 1,05 ml Triäthylamin zu.
Das Reaktionsgemisch wird noch während 30 Minuten gerührt und dann während 15 Stunden bei 0 stehengelassen. Schliesslich wird bis zur Bildung eines viskosen Öles konzentriert und daraus durch Zugabe von 20 ml Wasser eine schmierige Masse ausgefällt. Diese wird unter Erwärmen in 20 ml Methanol wieder gelöst und das Peptid durch Zugabe von 30 ml Wasser aber mals ausgefällt. Beim Kühlen auf 0 und Zerreiben erhält man eine pulverige Aufschlämmung, die filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet wird. Dieses Rohprodukt wird zur Reinigung einer Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (60:20:3 :60) [Puffer wie unter 2. angegeben] mit Phasenvolumina von je 20 ml unterworfen.
Nach 218 Stufen isoliert man aus den Elemen ten Nr. 105-134 (umax= 121; K= 1,25) durch Einengen zur Trockne und Absublimieren des Ammoniumacetates im Hochvakuum chromatographisch einheitliches geschütztes
Tetradecapeptid als weisses, amorphes Pulver vom F. etwa 180-190 . Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf:
Rf (43 A) = 0,80
Rf (Chloroform-Methanol = 9:1) = 0,49
6. H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC) Lys(BOC)-Lys(B OC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr-
Pro-OtBu
1,66 g Z Lys(B Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(B OC)-Lys(BOC) Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(B OC)-Val-Tyr-Pro OtBu werden in 40 ml Methanol mit 300 mg Palladiumkohle (10% Pd) wie üblich hydriert.
Beim Einengen der filtrierten Hydrierlösung zur Trockne erhält man direkt das chromatographisch einheitliche Produkt (1,49 g) als amorphes Pulver, das unscharf bei etwa 175-190 schmilzt. Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf (43 A) = 0,41 Rf (Chloroform-Methanol = 9 :1) = 0,24 7.
BOC.D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-Arg-Try Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC) Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr Pro-OtBu
378 mg B OC-D-Ser-Tvr-Ser-Met-Glu(OtBu)-His-Phe- Arg-Try-Gly-OH (Case 5503, G.Nr. 10 583/64) und 451 mg H-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(B OC) Lys(BOC)-Lys(BOC)-Pro-Val-Lys(BOC)-Val-Tyr Pro OtBu werden in 4 ml absolutem Pyridin suspendiert und nach Zugabe von 0,15 ml Wasser und 0,32 ml 1n Salzsäure während 10 Minuten bei 50 gerührt. Zur trüben Suspension gibt man dann 145 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und nach 3 Stunden nochmals eine gleich grosse Menge. Man rührt noch während weiterer 3 Stunden bei 50 und lässt dann über Nacht bei 0 stehen.
Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und 3mal mit je 0,8 ml 90 %igem Pyridin nachgewaschen. Das Filtrat wird mit 45 ml Benzol versetzt, wobei ein pulveriges Rohprodukt ausfällt, das abfiltriert und bei 45" getrocknet wird. Durch Umfällen aus Methanol-Benzol-Petroläther wird.der grösste Teil der lipophilen Verunreinigungen abgetrennt, worauf die endgültige Reinigung mittels einer Craig-Verteilung erfolgt im Lösungsmittelsystem Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10 :3,17 :5:
4) [Puffer wie unter 2. angegeben] über 300 Stufen, mit Phasenvolumina von je 10 mi. Aus den Verteilungselementen Nr. 5185 (UmaX=67; K=0,29) isoliert man durch Einengen zur Trockne und Wegsublimieren des Ammoniumacetates bei 40 im Hochvakuum 445 mg chromatographisch reines geschütztes Tetracosapeptidacetat als amorphes Pulver vom F. etwa 205-210 (Zersetzung). Es weist auf Silicagel folgende Rf-Werte auf: Rf (43 A) = 0,63 Rf (100) = 0,60 Rf (Chloroform-Methanol = 75:25) = 0,42 8.
H D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Bro- OH (D-Ser-Lysz7Xl8-sst-24-Corticotropin)
370 mg geschütztes Tetracosapeptidderivat werden in 7,4 ml 90 %iger Trifluoressigsäure gelöst und während 45 Minuten bei 25 stehengelassen. Die Lösung wird dann auf etwa 2 ml eingeengt, mit 20 ml Wasser verdünnt, nochmals eingeengt und zuletzt liophilisiert. Man erhält das Trifluoracetat des freien Tetracosapeptids, das zur Umwandlung in das Acetat in wenig Wasser gelöst und durch eine Säule = = 12,5 mm; 1=15 cm) von schwach basischem Ionen- austauscher (z.B. Merck Nr. II) in der Acetatform filtriert wird. Das Eluat wird auf etwa 3 ml konzentriert, lyophilisiert und im Hochvakuum bei 40 nachgetrocknet.
Man erhält 316 mg chromatographisch und elektrophoretisch einheitliches Acetat des D-Ser'-Lys'718-ss'-24-Corticotropins als weisses, amorphes Pulver.
Im Dünnschichtchromatogramm an Aluminiumoxyd im System 101 weist die Verbindung einen Rf-Wert von 0,40 auf (sst-24-Corticotropin unter gleichen Bedingungen 0,51).
Sie wandert bei der Elektrophorese (16 Vol/cm) bei pH 6,1 (Pyridinacetatpuffer) in 2 Stunden 8,4 cm gegen die Kathode.
Beispiel 2
Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her: D-Ser'-Lys'7, 18-ss -Corilcotropin-Hexaacetut 0,5 mg ZnSO4+7H2O 1,23 mg Na3PO4+12H2O 1,38 mg Mannit 40,0 mg
Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 1 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt. Man erhält eine Suspension mit einem pH von 7,6.
Beispiel 3
Man stellt eine Trockenampulle aus folgenden Komponenten her: D-Ser'-Lys17,18-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg ZnS04+7 H2O 1,23 mg Mannit 40,0 mg und eine Lösungsampulle mit folgender Zusammensetzung der Lösung: NasPO4+12H2O 1,38 mg Versene - Fe-3 0,1 mg dest. Wasser ad 1,0 ml
Vor Gebrauch werden der Inhalt der Trockenampulle und der Lösungsampulle vermischt. Die erhaltene Suspension hat ein pH von 7,6.
Beispiel 4
Man stellt eine Lösungsampulle aus folgenden Komponenten her: D -S er1-Lys17,18-ss 4-Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg Gelatine 280,0 mg Phenol 5,0 mg dest. Wasser . ad 1,0 ml
Beispiel 5
Eine steril filtrierte wässrige Lösung von D-Serl-Lyst7Xl3- sst-24-Corticotropin-Hexaacetat wird unter aseptischen Bedingungen mit Natrium-Polyphloretinphosphat und Natriumchlorid vermischt und in Vials abgefüllt und lyophilisiert, so dass ein Trockenvial erhalten wird, das folgende Komponenten enthält: D-Ser1-Lysl7,18-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg Natrium-Polyphloretinphosphat (86,5%ig) 23,20 mg NaCI 12,28 mg
Vor Gebrauch wird der Inhalt des Trockenvials mit 2 ml destilliertem Wasser, enthalten in einer Lösungsampulle, vermischt.
Beispiel 6
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser1-Lys17,18-ss1-24-corticotropin-Hexaacetat 1,0 mg ZnCl2 10,5 mg Na2HPO4 1,7 mg Benzylalkohol 17,0 mg NaC1 2,5 mg NaOH ad pH 8,0 Aqua dest ad 2 ml
Beispiel 7
2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 11 000 werden in etwa 5,7 ml 10 %iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.
In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser'-Lys'7,18-ss124- Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml: D-Ser1-Lyst72s8-sst-24-Corticotropin-Hexaacetat 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg Natronlauge bis pH 7,4 Merthiolat 0,02 mg Aqua dest. 1,0 ml
Beispiel 8
2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 105tsiger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.
In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser1-Lyst7Xt8-sst-24- Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst.
Zu dieser Lösung wird 1 ml einer salzsauren Zinkchloridlösung (pH 2,8) mit 5,2 mg Zinkchlorid pro ml gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt und mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml aufgefüllt.
Beispiel 9
2,0 g Poly-L-glutaminsäure werden in etwa 5,7 ml 10%iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.
In dieser Lösung werden 5,0 mg D-Ser1-Lys11,18-,l1-24 Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst.
Zu dieser Lösung werden 1 ml einer salzsauren Lösung (pH 2,8) enthaltend 5,2 mg Zinkchlorid und 0,85 mg Dinatriumphosphat (wasserfrei) gegeben. Das pH wird mit Natronlauge auf 7,8 eingestellt. Man füllt mit Wasser auf ein Volumen von 10 ml auf.
Beispiel 10
Man löst 11,12 mg Eisessig, 1,21 mg Natriumacetat, 2,5 mg Natriumchlorid und 2,0 mg D-Ser1-Lys17,18-ss124- Corticotropin-Hexaacetat in 0,7 ml destilliertem Wasser und füllt mit destilliertem Wasser auf 1 ml auf. Die Lösung wird bei 1200 20 Minuten autoklaviert. Das pH ist nach der Sterilisation 3,7.
Beispiel 11
Man löst in 0,7 ml physiologischer Natriumchloridlösung 0,5 mg D-Ser9-Lys17so8-sst-24-Corticotropin-Hexaacetat und säuert die Lösung mit 0,ln Salzsäure auf pH 3,2 an. Mit destilliertem Wasser wird auf 1 ml aufgefüllt und wie in Beispiel 1 hitzesterilisiert.
Beispiel 12
In 0,8 ml destilliertem Wasser werden 7,05 ml Glycin und 6,08 mg Natriumchlorid gelöst und 0,055 ml 0,1n HCI zugefügt. Anschliessend wird 1,0 mg D-Ser1-Lys17,18-ss124- Corticotropin-Hexaacetat- in der Lösung aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.
Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 1200 20 Minuten autoklaviert. Das pH beträgt 3,6.
Beispiel 13
In 0,8 ml destilliertem Wasser wird eine Lösung von
10,16 mg Zitronensäure (mit 1 Mol Kristallwasser), 0,097 ml In Natronlauge, 3,54 mg Natriumchlorid und 0,51 ml 0,1n Salzsäure hergestellt. In dieser Lösung werden 4,0 mg D-Ser1-Lys'7,18-ss 9-24-Corticotropin-Hexaacetat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 1,0 ml aufgefüllt.
Die Lösung wird auf übliche Weise filtriert, in Ampullen abgefüllt und bei 1200 20 Minuten autoklaviert. Das pH beträgt 3,6.
Beispiel 14
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-Ser9-Lyst7 t8-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 1,0 mg ZnCl2 5,25 mg Na2HPO4 2H2O 1,05 mg NaCl 2,0 mg Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3 Dest. Wasser ad 1,0 ml
Beispiel 15
Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: D-ser1-Lys1718-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 1,0 mg ZnCl2 6,30 mg Na2NPO4 2H2O 1,26 mg NaCl 1,5 mg Benzylalkohol 10,0 mg NaOH ad pH 8,3 Dest.
Wasser ad 1,00 ml
Beispiel 16
Man stellt 0,5 ml einer salzsauren Lösung von 0,5 mg D-Ser1-Lysl7sl8-ss 9¯24-Corticotropin-Hexaacetat, 5,25 mg ZnCl2, 1,05 mg Na2HPO4 2H2O und 2,0 mg NaCl vom pH 3,0 her und gibt die Lösung zu 0,5 ml einer wässrigen Lösung von 10 mg Benzylalkohol, die so viel Natronlauge enthält, dass eine Suspension vom pH 8,3 erhalten wird,
Beispiel 17
5 mg Poly-L-glutaminsäure vom mittleren Molekulargewicht 39 600 werden in 5 ml 0,1n Natronlauge gelöst. Man filtriert die Lösung, gibt eine Lösung von 2,5 mg D-Ser1- Lys17,18-ss124-Corücotropin-Hexaacetat hinzu, säuert dann mit Essigsäure oder Salzsäure auf pH 4 an und füllt mit Wasser auf 10 ml auf.
Dabei fällt ein Poly-L-glutaminsäure D-Sert-Lys17-18-ssl¯24-Corticotropin-Komplex fein verteilt aus. Die Suspension enthält pro ml 0,5 mg Poly-L-glutaminsäure und 0,25 mg D-Ser1-Lysl7sl8-ssl-24-Corticotropin als Komplexverbindung.
Beispiel 18
2,0 g Poly-L-glutaminsäure mit einem mittleren Molekulargewicht yon etwa 39 600 werden in etwa 5,7 ml 10 %iger Natronlauge gelöst, so dass das pH der Lösung 7,4 beträgt.
In dieser Lösung werden dann 4,0 mg D-Ser1-Lys17,18- ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat und 0,2 mg Merthiolat aufgelöst und mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Die Lösung wird steril filtriert. Sie enthält pro ml: D-Ser1-Lys17,18-ss1-24-Corficotropin-Hexaacetat 4,0 mg Poly-L-glutaminsäure 200,0 mg Natronlauge bis pH 7,4 Merthiolat 0,02 mg Aqua dest ad 1,0 ml
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH Wirkung der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl(oder L glutaminyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-trypto- phyl-glycyl-L4ysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L4ysyl-L-lysyl- L-lySyl-L-lySyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- prolin und ihrer C-terminalen Amide und von Säureadditionssalzen dieser Verbindungen,
dadurch gekennzeichnet, dass man die zu ihrem Aufbau nötigen Aminosäuren bzw.
deren aktivierte Derivate unter Bildung von CONH-Bindun
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
Process for the production of new peptides with ACTH effects
Peptides have already been described which are distinguished by an increased ACTH effect and which differ from the known peptides with ACTH effect in that they have a D-amino acid as the first a-amino acid at the amino end, cf. e.g. Swiss patent number 499 497.
As a peptide with a very good ACTH effect, it contains the HD-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro- Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH (D-Ser1-ss'-24-Corticotropin).
It has now been found that the corresponding peptide, which contains lysine residues instead of the arginine residues in the 17,18-position, has a better adrenocroticotropic effect.
The present invention therefore relates to a process for the preparation of DS eryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl- (or L-glutaminyl) -L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl -glycyl-L-lysyl-L-propyl L-valyl-glycyl -L-lysyl -L-lysyl-L-lysyl-L -lysyl-L-prolyl-L-valyl- L-lysyl-L-valyl-L- tyrosyl-L-proline and its C-terminal amide and their acid addition salts and complexes.
As acid addition salts, particular mention should be made of salts of therapeutically applicable acids, such as hydrochloric acid, acetic acid, but especially sparingly soluble salts, such as sulfates, phosphates or sulfonates.
Complexes are to be understood as meaning the complex-like compounds, whose structure has not yet been clarified, which arise when certain inorganic or organic substances are added to adrenocorticotropic peptides, and above all those which give them a prolonged effect. Such inorganic substances are compounds which are derived from metals such as calcium, magnesium, aluminum, cobalt and in particular from zinc, especially sparingly soluble salts such as phosphates and pyrophosphates and hydroxides of these metals. Organic substances which cause the effect to be prolonged are, for example, non-antigenic gelatin, e.g.
Oxypolygelatine, polyvinylpyrrolidone and carboxymethyl cellulose, also sulfonic acid or phosphoric acid esters of alginic acid, dextrin, polyphenols and polyalcohols, especially polyphloretin phosphate and phytic acid, as well as polymers and copolymers of amino acids, e.g. Protamine and in particular of amino acids which have a predominant proportion of acidic α-amino acids, such as glutamic acid or aspartic acid.
As already mentioned, the new compounds have a significantly stronger ACTH activity than the corresponding compounds with an L configuration at the first amino acid. Accordingly, they are intended to be used in human and veterinary medicine, e.g. instead of the natural hormone.
The new peptides are produced according to the methods known for the production of peptides with a large chain length, using a D-amino acid as the N-terminal amino acid. The amino acids are linked individually in the order mentioned or after prior formation of smaller peptide units. Particularly noteworthy is the so-called solid support synthesis (cf.
Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 [1963]), in which the peptide is built up from the carboxyl end, which is bonded to a polymer like an ester, by condensing the amino acids on in sequence. As condensation methods, e.g. mentioning the carbodiimide method, the azide method, the activated ester method and the anhydride method. For example, one of the amino acid or peptide molecules in the form of an ester can be linked to another amino acid or peptide molecule that contains a protected amino group in the presence of a condensing agent such as a carbodiimide or a phosphorous acid ester halide, or the amino acid ester can be or peptide ester with a free amino group an amino acid or a peptide with an activated carboxyl group (and protected amino group), eg an acid halide, azide, anhydride, imidazolide, isoxazolide (e.g.
B. from N-ethyl5-phenyl-isoxazolium-3'-sulfonate, s. Woodward et al., J. Am.
Chem. Soc. 89, 1011 [1961]), or an activated ester such as cyanomethyl ester, carboxymethyl thiol ester or nitrophenyl ester. Conversely, an amino acid or a peptide with a free carboxyl group (and a protected amino group) can also be combined with an amino acid or a peptide with an activated amino group (and a protected carboxyl group), e.g. a phosphite amide to react.
Free functional groups that are not involved in the reaction are expediently protected, in particular by means of radicals that can be easily split off by hydrolysis or reduction, the carboxyl group preferably by esterification, e.g. with methanol, tert-butanol, benzyl alcohol, p-nitrobenzyl alcohol, or amide formation, the amino group, for example, by introducing the tosyl, trityl, formyl, trifluoroacetyl, o-nitrophenylsulfenyl, phthalyl or carbobenzoxy group or colored protective groups, such as the p-phenylazo-benzyloxycarbonyl group and the p- (p'-methoxyphenylazo) -benzyloxycarbonyl group, or in particular the tert-butyloxycarbonyl radical. The nitro group is suitable for protecting the amino group in the guanido grouping of arginine; However, the said amino group of arginine does not necessarily have to be protected during the reaction.
The imino group of the histidine can be protected by the benzyl or trityl radical.
The conversion of a protected amino or imino group into a free group and the conversion of a functionally modified carboxyl group into a free carboxyl group in the course of the process is carried out according to methods known per se by treatment with hydrolyzing or reducing agents.
The method according to the invention is therefore characterized in that the amino acids or their activated derivatives required to build up the new peptides are condensed with one another to form CONH bonds in any chronological order, the L-terminal amino acid optionally being used in the form of the amide and wherein reactive functional groups not participating in the reaction are intermediately protected by introducing protective groups suitable for protecting such groups and, if appropriate, the acid addition salts are prepared by converting the peptide obtained into the corresponding salts by reaction with inorganic or organic acids.
A preferred method is that the first 3 amino acids, e.g. HD-Ser-Tyr-Ser-OH containing tripeptide (the abbreviated notation refers to L-amino acids, if the D- is not specifically designated), or the tetrapeptide also containing the 4th amino acid with the heptapeptide or hexapeptide of the following amino acids condensed up to amino acid 10, preferably by the azide method, and then condensed the decapeptide with the tetradecapeptide of amino acids 11-24. In this condensation, the coupling method used is preferably the carbodiimide method or the activated ester method, especially by means of the p-nitrophenyl ester.
In the latter case, the p-nitrophenyl ester of the decapeptide need not be isolated as such, but can also be formed in the condensation stage itself from the decapeptide with a free carboxyl group, p-nitrophenol and dicyclohexylcarbodiimide. The decapeptide is therefore present as an α-amino-protected peptide with a free carboxyl group or with a p-nitrophenyl ester group. The tetradecapeptide is in the form of an ester, preferably the tert. Butyl ester, or the a> -amide used. The side chains of amino groups present in the peptide fragments to be condensed are preferably protected by the tert-butyloxycarbonyl group, the side chain carboxyl groups by the tert-butyl ester group. These protective groups can be split off in the last stage with trifluoroacetic acid.
According to a further preferred method, the tetrapeptide H-D-Ser Tyr-Ser-Met-OH containing the first 4 amino acids is condensed with the eicosapeptide of amino acids 5-24. The azide method is preferably used as the coupling method in this condensation. The α-amino group of the tetrapeptide hydrazide or azide is preferably protected by the tert-butyloxycarbonyl group. The eicosapeptide can be present as a free peptide or as an ester, in particular tert-butyl ester, or as a Pro24-amide. In the eicosapeptide, too, the side chains of amino groups are preferably through the tert-butyloxycarbonyl group, the side chain carboxyl group through the tert. - Butyl ester group protected.
After the tetracosapeptide has been obtained by condensation of the peptide fragments, its a-amino group and side-chain amino groups through the tert-butyloxycarbonyl group and its end carboxyl group and side-chain carboxyl group through the tert. -Butylestergruppe are protected, all these protective groups can be split off simultaneously by acid hydrolysis, for example with trifluoroacetic acid. If the terminal carboxyl group is not present as a tert-butyl ester group but as an amide group, peptide amides are obtained. Peptide hydrazides are obtained, for example, if a peptide with a terminal lower alkyl ester group is treated with hydrazine hydrate.
Depending on the procedure, the new compounds are obtained in the form of bases or their salts. The bases can be obtained from the salts in a manner known per se. From the latter, in turn, salts can be obtained by reaction with acids which are suitable for the formation of therapeutically useful salts, e.g.
B. those with inorganic acids such as hydrohalic acids, for example hydrochloric acid or hydrobromic acid, perchloric acid, nitric acid or thiocyanic acid, sulfuric or phosphoric acids, or organic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, glycolic acid, lactic acid, pyruvic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid Acid, fumaric acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, ascorbic acid, hydroxymaleic acid, dihydroxymaleic acid, benzoic acid, phenylic acid, 4-aminobenzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, anthranilic acid, cinnamic acid, mandelic acid, salicylic acid, 4-amino-salicylic acid, 2-phenylbenzoic acid, 2-phenoxy acid Methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalene sulfonic acid or suffanilic acid.
The peptides obtained according to the method can be used in the form of pharmaceutical preparations. These contain the peptides mixed with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral or parenteral administration.
It can also be used with the usual additives in ACTH therapy to prolong the effect, e.g.
Oxypolygelatine, polyphloretin phosphate, carboxymethyl cellulose, or the above-mentioned sparingly soluble metal compounds, in particular phosphates, pyrophosphates or hydroxides of zinc.
In the following examples the temperatures are given in degrees Celsius.
The thin-layer chromatographic systems are designated as follows: System 43 A: tert. Amyl alcohol-isopropanol-water (100: 40: 10) system 45: sec-butanol-3% aqueous ammonia (100: 44) system 100: ethyl acetate-pyridine-glacial acetic acid-water (62: 21: 6: 11) system 101: n-butanol-pyridine-glacial acetic acid-water (30: 20: 6: 24)
The following abbreviations are used: Z = carbobenzoxy BOC = tert-butyloxycarbonyl tBu = tert-butyl.
Example 1 1. Z.Lys (BOC) -Lys (BOC) NHNH2
10 g of Z .Lys (BOC) -Lys (BOC) OCH3 (produced from Z Lys (BOC) -OH + Lys (BOC) -OCH3 by means of dicyclohexylcarbodiimide) are dissolved in 160 ml of methanol and treated with 7.8 ml of hydrazine hydrate. The clear solution is left to stand at 25 for 24 hours and then concentrated to about 1/3 of the original volume. When 200 ml of water are added, an oily precipitate separates out, which solidifies and can be pulverized on cooling and grinding. One sucks off, washed with water and dried the crude product. It is purified by recrystallizing once from methanol-ethyl acetate-petroleum ether and then has an F. of 118-119.5 ".
The following Rf values are obtained on silica gel thin-layer plates: Rf (43 Å) = 0.40
Rf (chloroform-methanol = 9: 1) = 0.75
2. Z Lys (BOC) -Lys (BOC) -Pro-OH
1.87 g of Z Lys (BOC) -Lys (BOC) NHNH2 are dissolved in 15 ml of freshly distilled dimethylformamide and cooled to 250. 2.07 ml of 4.35N hydrochloric acid and then 0.66 ml of 5N sodium nitrite solution are slowly added dropwise. The mixture is stirred for 10 minutes at -10 "and then a solution of 692 mg of L-proline in 4.2 ml of dimethylformamide is added
Water (2: 1) too. Finally, 1.82 ml of triethylamine are added dropwise at 100 and the reaction solution is then poured over
Night at 0 and for a further 2 hours at room temperature.
It is then concentrated in a high vacuum to a volume of about 4 ml and the sticky residue is mixed with 25 ml of water. It can be pulverized by cooling to 0 and grinding. It is filtered off with suction, washed with a little water and dried in a high vacuum at 40 ". To purify the crude product which cannot be crystallized, a multiplicative distribution according to Craig in the solvent system methanol-buffer-chloroform-carbon tetrachloride (35: 13: 15: 15) [ Buffer = 28.5 ml glacial acetic acid + 19.25 g
Ammonium acetate in 960 ml of water] with phase volumes of 10 ml each.
After 220 steps one isolated from the
Distribution elements No. 49-73 (uox = 61; K = 0.39) by concentration to dryness and sublimation of the ammonium acetate, chromatographically pure, but amorphous
Tripeptide derivative from F. about 70-80 ". The following Rf values are obtained in the thin-layer chromatogram on silica gel:
Rf (chloroform-methanol = 9: 1) = 0.19
Rf (43 A) = 0.29
Rf (45) = 0.52
3. Z Lys (B OC) -Lys (B OC) -Pro-Val-Lys (B OC) -Val-Tyr
ProOtBu
2.4 C; g Z Lys (B Z.Lys (BOC) -Lys (BOC) -Pro.OH to OH and 3.12 g n Val-Lys (BOC) -Val-Tyr-Pro-OtBu) are dissolved in 30 ml of absolute chloroform.
0.845 g of dicyclohexylcarbodiimide are added at 0, the mixture is stirred at 0 for 1 hour and then left to stand at 25 for 30 hours. The separated crystalline dicyclohexylurea is filtered off and washed with a little ethyl acetate. Add to the filtrate
150 ml of ethyl acetate and extracted the organic phase at 0 ^ three times with 30 ml of 3% tartaric acid solution each time to remove the excess pentapeptide. It is washed several times with water until a neutral reaction and then evaporated
Dry up. To remove lipophilic impurities, the residue is dissolved in 10 ml of methanol and 20 ml
Ethyl acetate and the octapeptide falls by adding 120 ml
Petroleum ether as a greasy mass, which is dried in a vacuum at 40.
The crude product thus obtained (3.1 g) is used for the final purification of a Craig distribution in
System methanol-buffer-chloroform-carbon tetrachloride (30: 10: 3: 30) [buffer as indicated under 2.] subjected to 225 stages with phase volumes of 10 ml each. The chromatographically uniform octapeptide derivative is obtained when the contents of the elements No. 65-96 (umax = 78; K = 0.53) are concentrated to dryness and the ammonium acetate is sublimed away in a high vacuum as a white amorphous powder of about 130-140. It has the following Rf values on silica gel: Rf (43 A) = 0.74 Rf (chloroform-methanol = 9: 1) = 0.54 Rf (benzene-acetone = 1: 1) = 0.33 4.
H Lys (BOC) -Lys (BOC) -Pro-Val-Lys (BOC) -Val Tyr-Pro-OtBu
1.46 g of Z Lys (BOC) -Lys (BOC) -Pro-Val-Lys (BOC) Val-Tyr-Pro-OtBu are mixed with carbon dioxide in 40 ml of methanol after adding 300 mg of 10% palladium carbon in a shaking duck. Hydrated absorption. The uptake of hydrogen is already over after 20 minutes. After 1 hour, the catalyst is filtered off, rinsed with methanol and the filtrate is evaporated to dryness. The chromatographically uniform decarbobenzoxylated octapeptide derivative is obtained in quantitative yield as a white amorphous powder with a temperature of about 110-120. It has the following Rf values in the thin layer chromatogram on silica gel: Rf (43 A) = 0.53
Rf (chloroform-methanol = 9: 1) = 0.34 5th Z.
Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) Lys (BOC) -Lys (BOC) -Pro-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr Pro-OtBu
1.98 g of Z Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) NHNH2 (Swiss patent no. 485 670) are dissolved in 22 ml of absolute dimethylformamide and, after cooling to -25 ", are added dropwise Stirring with 3.4 ml of 2.115N hydrochloric acid and then with 0.378 ml of 5N sodium nitrite solution. The clear solution is stirred for 15 minutes at -10 "and then with a pre-cooled to -5" solution of 1.313 g of the octapeptide derivative described above in 4 ml Dimethylformamide is added. 1 ml of dimethylformamide is rinsed and 1.05 ml of triethylamine are slowly added dropwise at -5 ".
The reaction mixture is stirred for a further 30 minutes and then left to stand at 0 for 15 hours. Finally, it is concentrated until a viscous oil is formed and a greasy mass is precipitated from it by adding 20 ml of water. This is redissolved in 20 ml of methanol while warming and the peptide is precipitated again by adding 30 ml of water. Cooling to 0 and trituration gives a powdery slurry which is filtered, washed with water and dried. For purification, this crude product is subjected to a Craig distribution in the system methanol-buffer chloroform-carbon tetrachloride (60: 20: 3: 60) [buffer as indicated under 2.] with phase volumes of 20 ml each.
After 218 steps, the elements No. 105-134 (umax = 121; K = 1.25) are isolated by concentration to dryness and subliming off the ammonium acetate under high vacuum, which is chromatographically uniform
Tetradecapeptide as a white, amorphous powder from about 180-190. It has the following Rf values on silica gel:
Rf (43 A) = 0.80
Rf (chloroform-methanol = 9: 1) = 0.49
6. H-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) Lys (BOC) -Lys (B OC) -Pro-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr-
Pro-OtBu
1.66 g Z Lys (B Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (B OC) -Lys (BOC) Lys (BOC) -Lys (BOC) -Pro-Val-Lys (B OC) -Val -Tyr-Pro OtBu are hydrogenated as usual in 40 ml of methanol with 300 mg of palladium carbon (10% Pd).
When the filtered hydrogenation solution is concentrated to dryness, the chromatographically uniform product (1.49 g) is obtained directly as an amorphous powder, which melts indistinctly at about 175-190. It has the following Rf values on silica gel: Rf (43 A) = 0.41 Rf (chloroform-methanol = 9: 1) = 0.24 7.
BOC.D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu (OtBu) -His-Phe-Arg-Try Gly-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (BOC) Lys (BOC) -Lys (BOC) -Pro-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr Pro-OtBu
378 mg B OC-D-Ser-Tvr-Ser-Met-Glu (OtBu) -His-Phe-Arg-Try-Gly-OH (Case 5503, G. No. 10 583/64) and 451 mg H-Lys (BOC) -Pro-Val-Gly-Lys (BOC) -Lys (B OC) Lys (BOC) -Lys (BOC) -Pro-Val-Lys (BOC) -Val-Tyr Pro OtBu are in 4 ml of absolute pyridine suspended and, after addition of 0.15 ml of water and 0.32 ml of 1N hydrochloric acid, stirred at 50 for 10 minutes. 145 mg of dicyclohexylcarbodiimide are then added to the cloudy suspension and, after 3 hours, another equal amount. The mixture is stirred for a further 3 hours at 50 and then left to stand at 0 overnight.
The precipitated dicyclohexylurea is filtered off and washed 3 times with 0.8 ml of 90% pyridine each time. The filtrate is mixed with 45 ml of benzene, whereby a powdery crude product precipitates, which is filtered off and dried at 45 ". Most of the lipophilic impurities are separated off by reprecipitation from methanol-benzene-petroleum ether, whereupon the final purification by means of a Craig- Distribution takes place in the solvent system methanol-buffer-chloroform-carbon tetrachloride (10: 3.17: 5:
4) [buffer as indicated under 2.] over 300 steps, with phase volumes of 10 ml each. From the distribution elements No. 5185 (UmaX = 67; K = 0.29), 445 mg of chromatographically pure protected tetracosapeptide acetate are isolated as an amorphous powder of approx. 205-210 (decomposition) by concentrating to dryness and subliming away the ammonium acetate at 40 in a high vacuum . It has the following Rf values on silica gel: Rf (43 A) = 0.63 Rf (100) = 0.60 Rf (chloroform-methanol = 75:25) = 0.42 8.
H D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Bro- OH (D-Ser-Lysz7Xl8-sst-24-corticotropin)
370 mg of protected tetracosapeptide derivative are dissolved in 7.4 ml of 90% strength trifluoroacetic acid and left to stand at 25 for 45 minutes. The solution is then concentrated to about 2 ml, diluted with 20 ml of water, concentrated again and finally lyophilized. The trifluoroacetate of the free tetracosapeptide is obtained, which is dissolved in a little water for conversion into the acetate and passed through a column = = 12.5 mm; 1 = 15 cm) of weakly basic ion exchanger (e.g. Merck No. II) in the acetate form is filtered. The eluate is concentrated to about 3 ml, lyophilized and post-dried at 40 in a high vacuum.
316 mg chromatographically and electrophoretically uniform acetate of D-Ser'-Lys'718-ss'-24-corticotropin is obtained as a white, amorphous powder.
In the thin-layer chromatogram on aluminum oxide in system 101, the compound has an Rf value of 0.40 (sst-24-corticotropin under the same conditions 0.51).
During electrophoresis (16 vol / cm) at pH 6.1 (pyridine acetate buffer), it migrates 8.4 cm against the cathode in 2 hours.
Example 2
A dry ampoule is made from the following components: D-Ser'-Lys'7, 18-ss -Corilcotropin-Hexaacetut 0.5 mg ZnSO4 + 7H2O 1.23 mg Na3PO4 + 12H2O 1.38 mg mannitol 40.0 mg
Before use, the contents of the dry vial are mixed with 1 ml of distilled water contained in a solution ampoule. A suspension with a pH of 7.6 is obtained.
Example 3
A dry ampoule is made from the following components: D-Ser'-Lys17,18-ss1-24-corticotropin hexaacetate 0.5 mg ZnS04 + 7 H2O 1.23 mg mannitol 40.0 mg and a solution ampoule with the following composition of the solution : NasPO4 + 12H2O 1.38 mg Versene - Fe-3 0.1 mg dist. Water to 1.0 ml
The contents of the drying ampoule and the solution ampoule are mixed before use. The suspension obtained has a pH of 7.6.
Example 4
A solution ampoule is made from the following components: D -S er1-Lys17,18-ss 4-corticotropin hexaacetate 0.5 mg gelatin 280.0 mg phenol 5.0 mg dist. Water . ad 1.0 ml
Example 5
A sterile filtered aqueous solution of D-Serl-Lyst7Xl3- sst-24-corticotropin hexaacetate is mixed under aseptic conditions with sodium polyphloretin phosphate and sodium chloride and filled into vials and lyophilized so that a dry vial is obtained which contains the following components: D -Ser1-Lysl7,18-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 0.5 mg Sodium polyphloretin phosphate (86.5%) 23.20 mg NaCl 12.28 mg
Before use, the contents of the dry vial are mixed with 2 ml of distilled water contained in a solution ampoule.
Example 6
A suspension is made from the following components: D-Ser1-Lys17,18-ss1-24-corticotropin-hexaacetate 1.0 mg ZnCl2 10.5 mg Na2HPO4 1.7 mg benzyl alcohol 17.0 mg NaCl 2.5 mg NaOH ad pH 8.0 distilled water to 2 ml
Example 7
2.0 g of poly-L-glutamic acid with an average molecular weight of about 11,000 are dissolved in about 5.7 ml of 10% sodium hydroxide solution so that the pH of the solution is 7.4.
5.0 mg of D-Ser'-Lys'7,18-ss124-corticotropin-hexaacetate and 0.2 mg of merthiolate are dissolved in this solution and made up to 10 ml with distilled water. The solution is filtered sterile. It contains per ml: D-Ser1-Lyst72s8-sst-24-Corticotropin-Hexaacetat 0.5 mg Poly-L-glutamic acid 200.0 mg Sodium hydroxide up to pH 7.4 Merthiolate 0.02 mg Aqua dest. 1.0 ml
Example 8
2.0 g of poly-L-glutamic acid are dissolved in about 5.7 ml of 105% sodium hydroxide solution so that the pH of the solution is 7.4.
5.0 mg of D-Ser1-Lyst7Xt8-sst-24-corticotropin hexaacetate and 0.2 mg of merthiolate are dissolved in this solution.
1 ml of a hydrochloric acid zinc chloride solution (pH 2.8) containing 5.2 mg of zinc chloride per ml is added to this solution. The pH is adjusted to 7.8 with sodium hydroxide solution and made up to a final volume of 10 ml with distilled water.
Example 9
2.0 g of poly-L-glutamic acid are dissolved in about 5.7 ml of 10% sodium hydroxide solution so that the pH of the solution is 7.4.
5.0 mg of D-Ser1-Lys11,18-, l1-24 corticotropin hexaacetate and 0.2 mg merthiolate are dissolved in this solution.
1 ml of a hydrochloric acid solution (pH 2.8) containing 5.2 mg of zinc chloride and 0.85 mg of disodium phosphate (anhydrous) are added to this solution. The pH is adjusted to 7.8 with sodium hydroxide solution. The volume is made up to 10 ml with water.
Example 10
11.12 mg of glacial acetic acid, 1.21 mg of sodium acetate, 2.5 mg of sodium chloride and 2.0 mg of D-Ser1-Lys17,18-ss124-corticotropin hexaacetate are dissolved in 0.7 ml of distilled water and made up with distilled water 1 ml. The solution is autoclaved at 1200 for 20 minutes. The pH after sterilization is 3.7.
Example 11
0.5 mg of D-Ser9-Lys17so8-sst-24-corticotropin hexaacetate is dissolved in 0.7 ml of physiological sodium chloride solution and the solution is acidified to pH 3.2 with 0.1N hydrochloric acid. It is made up to 1 ml with distilled water and heat-sterilized as in Example 1.
Example 12
7.05 ml of glycine and 6.08 mg of sodium chloride are dissolved in 0.8 ml of distilled water, and 0.055 ml of 0.1N HCl are added. Then 1.0 mg of D-Ser1-Lys17,18-ss124-corticotropin-hexaacetate- is dissolved in the solution and made up to 1.0 ml with distilled water.
The solution is filtered in the usual way, filled into ampoules and autoclaved at 1200 for 20 minutes. The pH is 3.6.
Example 13
In 0.8 ml of distilled water, a solution of
10.16 mg citric acid (with 1 mol of water of crystallization), 0.097 ml in sodium hydroxide solution, 3.54 mg sodium chloride and 0.51 ml 0.1N hydrochloric acid. 4.0 mg of D-Ser1-Lys'7,18-ss 9-24-Corticotropin-Hexaacetat are dissolved in this solution and made up to 1.0 ml with distilled water.
The solution is filtered in the usual way, filled into ampoules and autoclaved at 1200 for 20 minutes. The pH is 3.6.
Example 14
A suspension is prepared from the following components: D-Ser9-Lyst7 t8-ss1-24-Corticotropin-Hexaacetat 1.0 mg ZnCl2 5.25 mg Na2HPO4 2H2O 1.05 mg NaCl 2.0 mg benzyl alcohol 10.0 mg NaOH ad pH 8.3 distilled water to 1.0 ml
Example 15
A suspension is prepared from the following components: D-ser1-Lys1718-ss1-24-corticotropin hexaacetate 1.0 mg ZnCl2 6.30 mg Na2NPO4 2H2O 1.26 mg NaCl 1.5 mg benzyl alcohol 10.0 mg NaOH ad pH 8.3 dist.
Water ad 1.00 ml
Example 16
0.5 ml of a hydrochloric acid solution of 0.5 mg D-Ser1-Lysl7sl8-ss 9¯24-corticotropin hexaacetate, 5.25 mg ZnCl2, 1.05 mg Na2HPO4 2H2O and 2.0 mg NaCl with a pH of 3 is made , 0 and add the solution to 0.5 ml of an aqueous solution of 10 mg benzyl alcohol, which contains enough sodium hydroxide solution that a suspension with a pH of 8.3 is obtained,
Example 17
5 mg of poly-L-glutamic acid with an average molecular weight of 39,600 are dissolved in 5 ml of 0.1N sodium hydroxide solution. The solution is filtered, a solution of 2.5 mg of D-Ser1-Lys17,18-ss124-corucotropin hexaacetate is added, then acidified to pH 4 with acetic acid or hydrochloric acid and made up to 10 ml with water.
A poly-L-glutamic acid D-Sert-Lys17-18-ssl¯24-corticotropin complex is finely divided. The suspension contains 0.5 mg of poly-L-glutamic acid and 0.25 mg of D-Ser1-Lysl7sl8-ssl-24-corticotropin as complex compounds per ml.
Example 18
2.0 g of poly-L-glutamic acid with an average molecular weight of about 39,600 are dissolved in about 5.7 ml of 10% sodium hydroxide solution so that the pH of the solution is 7.4.
4.0 mg of D-Ser1-Lys17,18-ss1-24-corticotropin hexaacetate and 0.2 mg of merthiolate are then dissolved in this solution and made up to 10 ml with distilled water. The solution is filtered sterile. It contains per ml: D-Ser1-Lys17,18-ss1-24-corficotropin hexaacetate 4.0 mg poly-L-glutamic acid 200.0 mg sodium hydroxide solution up to pH 7.4 merthiolate 0.02 mg distilled water ad 1.0 ml
PATENT CLAIM 1
Process for the production of new peptides with ACTH effect of the formula D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl (or L-glutaminyl) -L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-trypto - phyl-glycyl-L4ysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L4ysyl-L-lysyl- L-lySyl-L-lySyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl -L- proline and its C-terminal amides and of acid addition salts of these compounds,
characterized in that the amino acids or
their activated derivatives with the formation of CONH bonds
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