Verfahren zur Gewinnung von Lysergsäure-Derivaten Das Hauptpatent Nr. 468 465 beschreibt ein Ver fahren zur Gewinnung von 6-Methyl-Aa,
9-ergalen- 8-carbonsäure durch saprophytische Züchtung eines neuen konidienbildenden Pilzstammes der Species Cla- viceps paspali Stevens et Hall in Submerskultur resp. Fermenterkultur und anschliessende Extraktion der 6-Methyl-Qe@9-ergolen-8-carbonsäure aus dem Kultur filtrat auf an sich bekannte Weise.
Dieser Pilz wurde beim United States Department of Agriculture (Nort- liern Utilisation Research and Development Division), Peoria, Ill. hinterlegt und erhielt dort die Bezeichnung NRRL 3080.
Es wurde nun gefunden, dass man aus diesem Pilz- stamm durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht und anschliessende Behandlung mit Äthylenimin auf an sich bekannte Weise Mutanten gewinnen kann, die mehr 6-Methyl-Q8,9-ergolen-8-carbonsäure zu bilden ver mögen als der Ausgangsstamm.
Eine dieser Mutanten wurde beim United States Department of Agriculture (Northern Utilisation Research and Development Divi sion), Peoria, lll. unter der Bezeichnung NRRL 3167 deponiert.
Erfindungsgemäss kann man hierbei vorteilhafter weise wie folgt verfahren: Man suspendiert Konidien des Pilzstammes NRRL 3080 in Wasser und verteilt diese Suspension auf die Agaroberfläche einer mit Malzagar ausgegosse nen Petrischale. Danach werden pro Petrischale ca. 1000 Sporen ausgesät.
Die Agaroberfläche wird dann mit ultraviolettem Licht bestrahlt, bis pro Platte nur noch 5-10 Konidien auskeimen; dieses entspricht einer Abtötungsrate von. 99-99,5 9/a (Abstand von der Licht quelle, z. B. Hanaulampe und Belichtungsdauer werden in Vorversuchen empirisch ermittelt).
Aus den überle benden Sporen entstehen im Verlauf von 10-14 Tagen bei 22 makroskopisch sichtbare Kolonien. Diese wer den weiter überimpft, um auf die im Hauptpatent be schriebene Weise Kulturen mit Konidien zu gewinnen. Aus den so gewonnenen Mutanten werden mit Hilfe von Züchtungsversuchen (z. B. in einer der im Hauptpatent beschriebenen Kulturen) diejenigen Stämme ausgewählt, die sich durch ein besonders hohes Alkaloidbildungsvermögen auszeichnen und einer weiteren mutagenen Behandlung mit Hilfe von Äthylenimin unterworfen.
Hierfür werden die Konidien bei 24 während 2 Stunden in einer 1 %oigen Äthylen- iminlösung suspendiert, die Sporen mittels eines Membranfilters von der Lösung getrennt, auf dem Fil ter mit sterilem Wasser gewaschen und dann auf Agar- platten ausgeimpft. Bei dieser Behandlung beträgt die Abtötungsrate ca. 99 9/0.
Von den überlebenden Stämmen werden wiederum, wie oben beschrieben, die Mutanten mit dem höchsten Alkaloidbildungsvermögen ausgewählt und gegebenen falls noch 5-10 Male einer mutagenen Behandlung mit Athylenimin unterworfen.
So erhält man beispielsweise bei 6-facher Wiederholung dieser Behandlung einen besonders stark alkaloidbildenden Stamm, der beim United States Department of Agriculture (Northern Utilisation Research and Development Division), Peo- ria, <B>111.</B> unter der Bezeichnung NRRL 3167 deponiert wurde.
Bei der Züchtung der Mutante NRRL 3167 in der im Hauptpatentgesuch beschriebenen Schüttelkultur wird nach Aufarbeitung des Kulturfiltrates eine Aus beute von 3330 mg/1 an Gesamtalkaloiden ermittelt; davon sind 89 9/o 6-Methyl-A8,9-ergolen-8-carbonsäure und 119/o Clavinalkaloide. In der im Hauptpatentge- such beschriebenen Fermenterkultur produziert diese Mutante 2480 mg/1 an Gesamtalkaloiden; davon 93 9/0 6-Methyl-/\8,11-ergolen-8-carbonsäure.
Process for the production of lysergic acid derivatives The main patent No. 468 465 describes a process for the production of 6-methyl-Aa,
9-ergalen- 8-carboxylic acid by saprophytic breeding of a new conidia-forming fungal strain of the species Cla- viceps paspali Stevens et Hall in submerged culture, respectively. Fermenter culture and subsequent extraction of the 6-methyl-Qe @ 9-ergolen-8-carboxylic acid from the culture filtrate in a manner known per se.
This fungus has been deposited with the United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, Ill., Where it was given the designation NRRL 3080.
It has now been found that, by irradiation with ultraviolet light and subsequent treatment with ethylene imine, mutants capable of forming more 6-methyl-Q8,9-ergolen-8-carboxylic acid can be obtained from this fungal strain than the starting stem.
One of these mutants was at the United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, III. deposited under the designation NRRL 3167.
According to the invention, one can advantageously proceed as follows: Conidia of the fungal strain NRRL 3080 are suspended in water and this suspension is distributed on the agar surface of a Petri dish filled with malt agar. Then about 1000 spores are sown per Petri dish.
The agar surface is then irradiated with ultraviolet light until only 5-10 conidia germinate per plate; this corresponds to a kill rate of. 99-99.5 9 / a (distance from the light source, e.g. Hanau lamp and exposure time are empirically determined in preliminary tests).
The surviving spores gave rise to macroscopically visible colonies in 22 within 10-14 days. These who the further inoculated in order to win cultures with conidia in the manner described in the main patent. From the mutants obtained in this way, breeding experiments (e.g. in one of the cultures described in the main patent) are used to select those strains which are characterized by a particularly high alkaloid-forming capacity and are subjected to further mutagenic treatment with the aid of ethyleneimine.
For this purpose, the conidia are suspended in a 1% ethylene imine solution for 2 hours at 24, the spores are separated from the solution using a membrane filter, washed on the filter with sterile water and then inoculated onto agar plates. With this treatment, the kill rate is approx. 99 9/0.
From the surviving strains, as described above, the mutants with the highest alkaloid-forming capacity are again selected and, if necessary, subjected to a mutagenic treatment with ethyleneimine 5-10 times.
For example, if this treatment is repeated 6 times, a particularly strong alkaloid-forming strain is obtained, which is available from the United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peria, <B> 111. </B> under the name NRRL 3167 was deposited.
When cultivating the mutant NRRL 3167 in the shaking culture described in the main patent application, a yield of 3330 mg / 1 total alkaloids is determined after processing the culture filtrate; 89% of these are 6-methyl-8,9-ergolen-8-carboxylic acid and 119% are clavine alkaloids. In the fermenter culture described in the main patent application, this mutant produces 2480 mg / l of total alkaloids; of which 93 9/0 6-methyl- / \ 8,11-ergolen-8-carboxylic acid.