Verfahren zur Gewinnung von 6-1Vlethyl-C8,9-ergolen-8-carbonsäure Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von 6-Methyl-A8,9-ergolen-8-carbon- säure der Formel I.
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Erfindungsgemäss erhält man die Verbindung der Formel I durch Züchtung des in vitro der Konidienbil- dung fähigen Pilzstammes NRRL 3080 des Species Claviceps paspali Stevens et Hall in saprophytischer Kultur und anschliessende Isolierung der 6-Methyl- ,/,8@9-ergolen-8-carbonsäure aus dem Kulturfiltrat.
Es ist bekannt, dass verschiedene Stämme des Pil zes Claviceps paspali Stevens et Hall unter geeigneten Kulturbedingungen alkaloidartige Verbindungen zu bil den vermögen, doch handelt es sich hierbei immer um Derivate der Lysergsäure, einer bereits lang bekannten heterocyclischen Carbonsäure, die u. a. einen Bestand teil der natürlichen Mutterkorn-Alkaloide bildet.
Es war daher überraschend, dass es nun gelungen ist, durch Züchtung eines neuen Stammes der Species Claviceps paspali Stevens et Hall eine Carbonsäure mit einer Struktur zu erhalten, wie sie bisher weder in der Natur gefunden wurde noch auch synthetisch oder halbsynthetisch dargestellt wurde.
Dieser Stamm, der aus Sclerotien, die auf dem Grase Paspalum dilatatum in Portugal gewachsen waren, gewonnen werden konnte und von dem Proben beim United States Department of Agriculture (Nort- hern Utitisation Research and Development Division), Peoria/Ill., unter der Nummer NRRL 3080 deponiert wurden, ist im Gegensatz zu allen bisher bekannten Stäm men,
der Species Claviceps paspali Stevens et Hall fähig, die 6-Methyl-Q8,9-er,olen-8-carbonsäure in saprophytischer Kultur als Hauptprodukt zu bilden.
Dieser Stamm der Species Claviceps paspali Ste- vens et Hall ist ferner, dies ebenfalls im Gegensatz zu allen anderen bisher beschriebenen Stämmen dieser Pilzart (siehe z. B. Proc. Roy. Soc. Serials B., 155, 33), in vitro der Konidienbildung fähig. Die Fähigkeit eines Pilzes Konidien zu bilden, ist nämlich für die Ausführung von mikrobiologischen Verfahren in tech nischem Masstab von grosser Bedeutung.
So ist es mit Hilfe von Konidien möglich, Einspor- isolierungen durchzuführen und dadurch zu genetisch einheitlichem Material zu gelangen. Auch lassen sich aus Konidien durch Röntgen- und UV-Bestrahlung, sowie mit Chemikalien sehr viel leichter Mutanten er zeugen und isolieren als aus sterilem Mycel. Ferner können mit Konidien blühende Paspalumpflanzen infi ziert und auf diese Weise auf dem natürlichen Wirt Sclerotien erzeugt werden, welche sich zur Konservie rung des Stammes ausgezeichnet eignen.
Man kann beispielsweise aus diesem haltbaren Material jederzeit frischen Impfstoff gewinnen, wenn die in-vitro-Kultu- ren nach wiederholten Passagen degenerieren. Koni- dien können auch lyophilisiert bzw. nach Gefriertrock nung unbegrenzt gelagert werden, was ebenfalls die Konservierung eines Stammes ermöglicht. Schliesslich aber eignet sich für die Beimpfung einer Nährlösung eine Konidiensuspension am besten, weil die Impf menge am geeignetsten dosiert werden kann und weil sich damit am leichtesten steril arbeiten lässt.
(Ein ste riles Mycel hingegen muss am Anfang in einem Mixer homogenisiert werden).
Aus der erfindungsgemäss gewonnenen 6-Methyl- Q8=9-ergolen-8-carbonsäure kann auf halbsyntheti schem Wege eine Reihe neuer Derivate mit wertvollen pharmakologischen Eigenschaften gewonnen werden. Ausserdem kann man durch ein bestimmtes Ver fahren, das ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfin dung bildet, die 6=Methyl-A1,1-ergolen-8-carbonsäure auf sehr einfache Weise und mit guter Ausbeute in Lysergsäu.re überführen, die als Zwischenprodukt zur Herstellung wertvoller Heilmittel, so z.
B. der klinisch viel verwendeten Oxytocica Ergobasin und Methyler- gobasin und des bisher stärksten Serotoninantagoni- sten, des 1-Methyl-d lysergsäure-(+)-butanolamids-(2'), von grösster Bedeutung ist.
Die Isolierung und Vermehrung des neuen Stammes vom Claviceps paspali Stevens et Hall NRRL 3080 kann z. B. auf folgende Weise geschehen: Aus dem Innern eines Sclerotiums wird ein kleines Gewebestück steril entnommen und auf Bierwürzeagar übertragen.
[Zusammensetzung: 250 ml ungehopfte helle Bier würze (Trockensubstanz 17 (l/o), 18 g Agar-Agar, dest. Wasser ad 1 L (pH 5,2)]. Es entwickelt sich eine kreis runde Kolonie, die nach 14 Tagen bei 24 C einen Durchmesser von 15 mm erreicht. Sie besteht aus einer dem Agar aufliegenden, ca. 1 mm dicken Haut von pseudosclerotialer Struktur und darüber einem Polster von weissem Luftmycel. Ein brauner Farbstoff diffun diert in den Agar hinein.
Es worden keine Konidien gebildet.
Diese Kolonie wird mit einem Spatel in Stücke zer teilt und in ein Reagenzglas mit 12 cm3 des folgenden Agarnährbodens übertragen:
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Bierwürze <SEP> 500 <SEP> ml
<tb> Cornsteep-Solids <SEP> 60 <SEP> g
<tb> Milchsäure <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> Salmiaklösung <SEP> bis <SEP> pH <SEP> 4,8
<tb> Agar-Agar <SEP> 20 <SEP> g
<tb> dest. <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 1 <SEP> L.
Um jedes Impfstück bildet sich eine kleine Kolonie von zunächst weissem, später rotbraunem Mycel. Nach 10 Tagen beginnen sich an den Hyphenspitzen Koni- dien abzuschnüren. Nach 20 Tagen sind genügend Konidien vorhanden, um damit eine wässerige Suspen sion herzustellen, mit welcher 20 Schrägagar-Röhrchen (gleicher Agar wie oben) beimpft werden können. Diese Kulturen werden bei 24 C bebrütet. Die Koni- dien keimen nach 24-36 Stunden.
Nach 6 Tagen ist die Agaroberfläche von einem feinen, weissen Mycel gleichmässig überzogen, nach 10 Tagen ist eine braun graue, feingefurchte Myceldecke gebildet, welche dem Agar eng aufliegt und nur kurze Lufthyphen hat. An diesen werden Konidien abgeschnürt. Nach 12 Tagen entstehen an mehreren Stellen im Mycel Zentren, an welchen kleine Tröpfchen einer rotbraunen Flüssigkeit ausgeschieden werden.
Die Tröpfchen erreichen einen Durchmesser von 1-3 mm und werden bald von sehr zahlreichen Konidien milchig trüb. Nach 16-18 Tagen ist die Konidienbildung praktisch abgeschlossen. Eine Schrägagarkultur in einem Reagenzglas von 2 cm Durchmesser mit 12m1 Agar-Nährboden enthält ca. <B>109</B> Konidien.
Für die Züchtung in Submerskultur wird zunächst eine Vorkultur wie folgt bereitet: Als Medium wird eine 4,5 prozentige wässerige Malzextraktlösung mit pH 5,4 verwendet. Ein Liter dieser Lösung wird in einem 2 L-Erlenmeyerkolben 20 Minuten bei 110 C sterilisiert,
hernach mit 6.10$ Konidien von einer 15 Tage alten Agarkultur beimpft und 3 Tage lang auf einer rotierenden Schüttelma schine bei 24 C inkubiert. Es entsteht eine dichte Kul tur aus feinen Mycelflocken. Die Flocken bestehen aus einem lockeren Knäuel von Hyphen und haben einen Durchmesser von 2-4 mm. Es sind keine Alkaloide nachweisbar.
Zur Herstellung grösserer Mengen Vorkultur wer den Glasfermenter, welche je 10 L desselben Mediums enthalten, mit je<B>6.101</B> Komdien beimpft und 3 Tage bei 23 C unter Belüftung mit 6 L Luft pro Minute und Rühren mit 300 U. p. M. bebrütet. Zur Schaumbe kämpfung wird eine Siliconemulsion verwendet. Die so erhaltenen Fermenterkulturen sind von gleicher Be schaffenheit wie die Schüttelkulturen.
Für die Haupt kultur erwies sich die folgende Nährlösung, die in 1 L destilliertem Wasser
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Sorbit <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Bernsteinsäure <SEP> 36 <SEP> g
<tb> KH,PO4 <SEP> 2 <SEP> g
<tb> M9S04 <SEP> 0,3 <SEP> g
<tb> FeS04 <SEP> . <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> ZnS04. <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 10 <SEP> mg enthält und mit NH40H auf pH 5,4 eingestellt worden ist, als besonders zweckmässig.
Diese Nährlösung wird mit 10 % einer 3 Tage alten Vorkultur beimpft und in Portionen von 100 ml in 500 ml Erlenmeyerkolben auf einer reziprok schütteln den Maschine bei 23 C inkubiert. Andere Kulturen werden in analoger Weise in einem 170 L Nährme dium enthaltenden Fermenter aus rostfreiem Stahl ge züchtet.
Dabei wird mit 170 L Luft pro Minute belüf tet und mit anfänglich 70, später 180 U. p. M. gerührt. Zur Schaumbekämpfung wird eine Siliconemulsion verwendet.
Auf diese Weise entstehen Kulturen aus zahlrei chen, gleichartigen Mycelpartikeln. Diese haben einen Durchmesser von ca. 5 mm und besitzen einen kuge ligen, kompakten Kern von ca. 1 mm Durchmesser aus pseudeparenchymatischem Gewebe. Dieser Kern trägt sternartig angeordnete, ca. 2 mm lange Fortsätze aus parallel gelagerten Hyphen. Am Ende der ca. 10-tägi- gen Kulturdauer ist das Mycel dunkelbraun, und das Filtrat intensiv rotbraun gefärbt. Der pH-Wert verän dert sich nur unwesentlich.
Das auf diese Weise erhaltene Kulturfiltrat hat einen kolorimetrisch bestimmten Gesamtalkaloidgehalt von 620 mg/L, bezogen auf ein Molekulargewicht von 300.
Die papierchromatographisch ermittelte Zusam mensetzung des Alkaloidgemisch@es ist folgendermas sen:
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6-Methyl-A8,9-ergolen-8-carbonsäure
<tb> und <SEP> geringe <SEP> Mengen <SEP> Lysergsäure <SEP> und <SEP> <B>86,511/0</B>
<tb> Isolysergsäure
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Lysergsäureamid <SEP> <B>3,90/0</B>
<tb> Isolysergsäureamid <SEP> <B>3,90/0</B>
<tb> Ergobasin <SEP> <B>1,00/0</B>
<tb> Ergobasinin <SEP> <B>0,50/0</B>
<tb> Clavin-Alkaloide <SEP> 4,
2% Die Isolierung der 6-Methyl-Q8#9-ergolen-8-car- bonsäure .aus dem Kulturfiltrat kann nach verschie- nen Methoden erfolgen. Vorzugsweise wird sie dem Kulturfiltrat durch einen stark sauren Kationenaustau- scher auf der Basis von Sulfonsäureharzen, (z. B.
Dowex 50 oder Amberlite IR 120) entzogen, von die sem durch Behandlung mit verdünntem Ammoniak abgelöst und durch Einengen des Eluates und Einstel len des pH-Wertes der Lösung auf ihren isoelektri- schen Punkt zur Kristallisation gebracht.
Die so gewonnene 6-Methyl-Q8,9-ergolen-8-car- bonsäure kann durch Behandlung mit basischen Rea genzien in Lysergsäure übergeführt werden. Vorteilhaf- terweise kann z. B. eine Lösung der 6-Methyl-Qa,s- ergolen-8-carbonsäure in verdünnter wässeriger Natronlauge einige Zeit auf 100 erhitzt werden, wor auf man die Lösung abkühlt und ihren pH-Wert auf den isoelektrischen Punkt der Lysergsäure einstellt.
Das Kulturfiltrat kann auch direkt auf Lysergsäure aufgearbeitet werden, indem man z. B. nach dem Ein dampfen der Lösung die 6 Methyl-A8,9-ergolen-8-car- bonsäure dem Rückstand durch Extraktion mit einer alkoholischen Ammoniaklösung entzieht, anschliessend durch Erhitzen des Extrakts die 6-Methyl-Q8,9-ergo- len-8-carbonsäure zur Lysergsäure isomerisiert und diese, wie oben beschrieben, aus der Lösung isoliert.
Man kann aber auch nach der Aufarbeitung des Kulturfiltrats durch Ionenaustauscher die ammoniaka- lische Lösung der, 6-Methyl-Q8,9-ergolen-8-carbon- säure direkt oder nach Zugabe von Lauge erhitzen, wobei Isomerisierung zu Lysergsäure eintritt.
In den nachfolgenden Beispielen, welche die Durchführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sol len, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden; die Schmelzpunkte sind korrigiert.
<I>Beispiel 1</I> 6-Methyl-Q8>9-ergolen-8-carbonsäure 5 L Kulturfiltrat des neuen Stammes von Claviceps paspali Stevens et Hall mit einem kolorimetrisch be stimmten Gesamtgehalt an Ergolin-Derivaten von ca. 500 mg/L (bezogen auf ein Mol.-Gew. von 300) und einem pH-Wert von 5,6 werden durch eine mit Wasser eingeschlämmte Säule von 500 g Amberlite IR 120 (H -Form; Durchmesser der Säule 2,8 cm; Höhe 115 cm) filtriert.
Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 500 ml/.Std. Nach dem Waschen der Säule mit 1 L Wasser wird die 6-Methyl-A",9=ergolen-8-carbonsäure mit 5-proz. Ammoniak eluiert. Der in Fraktionen von je 500 ml gesammelte Durchlauf wird durch Fluores zenz im UV. und Farbreaktion nach Keller (FeClg-Eis- essig, H,S04 konz.) auf den Gehalt an Ergolin-Deri- vaten geprüft.
Die ersten vier Fraktionen (insgesamt 2 L) dampft man bei 13 mm Torr und 30 Badtempera- tur auf 500 ml ein, stellt die Lösung mit Eisessig auf einen pH-Wert von 5,5, filtriert vom .ausgefallenen Harz (Keller-Farbreaktion negativ) ab, .engt das Filtrat im Vakuum auf ca. 25 ml ein, fügt 20 ml Methanol zu, kocht die Lösung kurz auf und lässt bei 5 einige Std. stehen.
Die auskristallisierte Säure wird nach dem Ab filtrieren mit Wasser und Methanol gewaschen und bei 80 2 Std. im Vakuum getrocknet. Die folgenden sie ben Fraktionen des Ammoniak-Durchlaufs liefern nach der gleichen Aufarbeitung eine weitere Menge kristalli sierter 6-Methyl-Q8,9-ergolen-8-carbonsäure.
Zur Reinigung der rohen Säure werden die kristal lisierten Produkte vereinigt, in 5-proz. alkoholischem Ammoniak gelöst, die Lösung nach Filtration mit 2-n-Essigsäure auf pH 5,5 gestellt, kurz auf dem Was serbad erwärmt, die kristallisierte Säure nach einigen Std. erbfiltriert, mit Wasser und Methanol gewaschen und im Vakuum bei 80 getrocknet. Smp. 243-245 (Zers.); [a]D = -180 (0,1-n . NaOH).
Farbreaktion nach Keller, van Urk und Ehrlich wie bei Lysergsäure; Dünnschichtchromatogramrn auf Kie selgel mit Alkohol/25-proz. Ammoniak (9:1) als Fliess- mittel: Rf-Wert = 0,4 bis 0,45. Der Fleck gibt beim Besprühen mit Ehrlich-Reagens eine blaue Färbung.
UV.-Spektrum: A, 0,1-n NaOH 1 log s = 217,5/4,56; M--X. mss 282/3,79; 292/3,74, Minimum bei<I>252</I> mu. IR.-Spektrum: charakteristische Banden bei 3340, 2275 (breit), 1674 und 1580 cm 71 (in Nujol). <I>Hydrochlorid:
</I> Das aus der oben beschriebenen 6-Methyl-Q8,9-ergolen-8-carbonsäure mit verd. Salz säure hergestellte Hydrochlorid. wurde aus Wasser und verd. Salzsäure umkristallisiert: Smp. 257-259 (Zerr.);
[a]D = -176 (in 0,1-n. HCl). UV.-Spektrum wie bei der 6-Methyl-Qa,9-ergolen-8-carbonsäure. IR.-Spektrum: charakteristische Banden bei 3380, 2600, 1708, 1660 (schwach ) und 1606 (schwach) cm-1 (in. Nujol.) 6-Methyl-,LS,9-ergolen-8-carbonsäure <I>aus dem</I> <I>Hydrochlorid:</I> Die Suspension von 100 mg Hydrochlo rid in 5 ml Wasser wird unter Rühren tropfenweise mit 2-n Natriumhydrogencarbonatlösung versetzt, bis alle Substanz in Lösung gegangen ist.
Hierauf stellt man mit Eiessig den pH-Wert auf 5,5, kocht kurz auf, fil- triert nach einigen Std. die kristallisierte Säure ab, wäscht sie mit Wasser und Methanol und trocknet im Vakuum. bei 80 . Smp. 245-247 (Zers.); [a]D = -208 (0,1-n NaOH), im Dünnschichtchromatogramm auf Kieselgel mit Alkohol/25-proz. Ammoniak (9:1) einheitlich; Rf-Wert = 0,45. Der Fleck zeigt im UV.
praktisch keine Fluoreszenz und gibt beim Besprühen mit Ehrlich-Reagens blaue Färbung. Beispiel <I>2</I> 6-Methyl-Q8>9-ergolen-8-carbonsäure Zur Gewinnung der 6-Methyl-A8,9-ergolen-8-car- bonsäure aus dem Kulturfiltrat des neuen Claviceps paspalum-Stammes verfährt man nach Beispiel 1, ver wendet aber anstelle von Amberlite IR 120 den Katio- nenaustauscher Dowex 50.
Man erhält die kristalli sierte, rohe 6-Methyl-Q11,9-ergolen-8-carbonsäure mit den im Beispiel 1 angegebenen Eigenschaften.
<I>Beispiel 3</I> Lysergsäure 500 mg der nach Beispiel 1 aus dem Kulturfiltrat des neuen Claviceps paspalum-Stammes isolierten rohen, kristallisierten 6-Methyl-Q8,9-ergolen-8-carbon- säure werden in 10 ml 2-n Natronlauge 2 Sbd. auf dem Wasserbad erwärmt, die heisse Lösung mit Aktivkohle behandelt und das Filtrat mit verd. Salzsäure und Eis essig auf einen pH-Wert von 5,5 gestellt.
Nach einigen Std. wird die auskristallisierte Lysergsäure abfiltriert, mit Wasser und Methanol gewaschen und bei 80 im Vakuum getrocknet: Smp. 245-247 (Zers.).
Die so erhaltene Lysergsäure hat alle in der Litera tur für diese Verbindung beschriebenen chemischen und physikalischen Eigenschaften.
<I>Beispiel 4</I> Lysergsäure 101 des wie oben beschrieben erhaltenen Kulturfil trates werden am Wasserbad eingedampft und der Rückstand unter Erwärmen auf ungefähr 50 mit 3 X 500 ml 5 9/o alkoholischer Ammoniaklösurng extra hiert. Der Extrakt wird im Rotationsverdampfer auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt, die rückbleibende konzentrierte Lösung mit Eisessig auf pH 5,5 gestellt, mit Aktivkohle behandelt und das Fil trat im Vakuum auf ca. 20 ml eingeengt, wobei Kristal- lisation einsetzt.
Man lässt bei 5 einige Stunden ste hen, der Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser und Methanol gewaschen, bei 80 getrocknet und durch Umkristallisieren oder Umfällen gereinigt. Die so er haltene Lysergsäure schmilzt bei 245-247 und hat alle in der Literatur für diese Verbindung beschriebe nen chemischen und physikalischen Eigenschaften.
<I>Beispiel 5</I> Lysergsäure 101 des wie oben beschrieben erhaltenen Kulturfil trates werden unter Rühren während ca. 12 Stunden mit 500 g Amberlite IR 120 (H+-Form) behandelt, man filtriert den Ionenaustauscher ab und verfährt mit dem Filtrat nochmals wie oben beschrieben unter Ver wendung von 250 g desselben Kationenaustauschers. Die Farbreaktion nach Keller einer zur Trockne einge- dampften Probe (5 ml) der nach zweimaliger Behand lung mit dem Austauschcrharz resultierenden Kulturlö sung fällt negativ aus.
Die beiden Portionen des Ionen- austauschers werden jeweils zweimal während 4 Stun den mit der gleichen Gewichtsmenge Wasser verrührt. Man behandelt nun jede Portion des Ionenaustauschers dreimal mit der gleichen Gewichtsmenge einer 5 9/0 wässrigen Ammoniaklösung unter Ausschluss von Kohlendioxyd während 12 Stunden bei 5-10 .
Die ein zelnen Extrakte werden am Wasserbad bei ca. 100 im Rotationsverdampfer auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt, die Konzentrate mit Eisessig auf pH 5,5 gestellt, eventuell geringe Mengen ausgefallenes Harz abfiltriert und im Vakuum auf 15-20 ml ein geengt und weiter wie in Beispiel 3 beschrieben die Lysergsäure isoliert und gereingt. Statt des hier be nützten Ionenaustauschers können auch andere starke saure Ionenaustauscher wie z. B. Dowex 50 verwendet werden.
Process for the production of 6-1Vlethyl-C8,9-ergolen-8-carboxylic acid The present invention relates to a process for the production of 6-methyl-A8,9-ergolen-8-carboxylic acid of the formula I.
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According to the invention, the compound of the formula I is obtained by culturing the fungal strain NRRL 3080 of the species Claviceps paspali Stevens et Hall, which is capable of conidia formation in vitro, in saprophytic culture and then isolating the 6-methyl-, /, 8 @ 9-ergolen-8- carboxylic acid from the culture filtrate.
It is known that different strains of the mushroom Claviceps paspali Stevens et Hall under suitable culture conditions alkaloid-like compounds to bil, but these are always derivatives of lysergic acid, a long-known heterocyclic carboxylic acid, which u. a. forms part of the natural ergot alkaloids.
It was therefore surprising that we have now succeeded in breeding a new strain of the species Claviceps paspali Stevens et Hall to obtain a carboxylic acid with a structure that has not yet been found in nature, nor has it been synthesized or synthesized.
This strain, which could be obtained from sclerotia which had grown on the grass Paspalum dilatatum in Portugal and from which samples were obtained from the United States Department of Agriculture (Northern Utitization Research and Development Division), Peoria / Ill., Under the number NRRL 3080 were deposited, in contrast to all previously known strains,
of the species Claviceps paspali Stevens et Hall are able to form 6-methyl-Q8,9-er, olen-8-carboxylic acid in saprophytic culture as the main product.
This strain of the species Claviceps paspali Stevens et Hall is also, in contrast to all other previously described strains of this species of fungus (see, for example, Proc. Roy. Soc. Serials B., 155, 33), in vitro the Capable of conidia formation. The ability of a fungus to form conidia is of great importance for the execution of microbiological processes on a technical scale.
With the help of conidia it is possible to isolate single spores and thereby to arrive at genetically uniform material. It is also much easier to generate and isolate mutants from conidia by means of X-ray and UV irradiation and with chemicals than from sterile mycelium. Furthermore, paspalum plants blooming with conidia can be infected and in this way sclerotia produced on the natural host, which are excellently suited for the conservation of the trunk.
For example, fresh vaccine can be obtained from this durable material at any time if the in vitro cultures degenerate after repeated passages. Conidia can also be lyophilized or stored indefinitely after freeze-drying, which also enables a strain to be preserved. Ultimately, however, a conidia suspension is best suited for inoculating a nutrient solution, because the inoculation amount can be dosed in the most suitable way and because it is the easiest way to work sterile.
(A sterile mycelium, on the other hand, must be homogenized in a mixer at the beginning).
From the 6-methyl-Q8 = 9-ergolen-8-carboxylic acid obtained according to the invention, a number of new derivatives with valuable pharmacological properties can be obtained in a semi-synthetic way. In addition, you can drive by a certain process, which also forms part of the present invention, the 6 = methyl-A1,1-ergolen-8-carboxylic acid in a very simple manner and with good yield in Lysergsäu.re convert, as an intermediate for the production of valuable remedies, e.g.
B. the clinically widely used Oxytocica Ergobasin and Methylergobasin and the strongest serotonin antagonist to date, 1-methyl-d lysergic acid - (+) - butanolamide- (2 '), is of great importance.
The isolation and propagation of the new strain from Claviceps paspali Stevens et Hall NRRL 3080 can, for. B. can be done in the following way: A small piece of tissue is removed sterile from the inside of a sclerotium and transferred to wort agar.
[Composition: 250 ml unhopped light beer wort (dry substance 17 (l / o), 18 g agar-agar, distilled water ad 1 L (pH 5.2)]. A circular colony develops, which after 14 days reaches a diameter of 15 mm at 24 ° C. It consists of an approximately 1 mm thick skin with a pseudosclerotial structure and a cushion of white aerial mycelium on top of the agar, and a brown dye diffuses into the agar.
No conidia were formed.
This colony is divided into pieces with a spatula and transferred to a test tube with a size of 12 cm3 of the following agar culture medium:
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Beer wort <SEP> 500 <SEP> ml
<tb> Cornsteep-Solids <SEP> 60 <SEP> g
<tb> Lactic acid <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> Ammonia solution <SEP> to <SEP> pH <SEP> 4.8
<tb> agar-agar <SEP> 20 <SEP> g
<tb> dest. <SEP> water <SEP> ad <SEP> 1 <SEP> L.
A small colony of initially white, later red-brown mycelium forms around each inoculation piece. After 10 days, conidia begin to constrict at the hyphae tips. After 20 days there are enough conidia to produce an aqueous suspension with which 20 agar slant tubes (same agar as above) can be inoculated. These cultures are incubated at 24 C. The conidia germinate after 24-36 hours.
After 6 days the agar surface is evenly covered by a fine, white mycelium, after 10 days a brown-gray, finely furrowed mycelium cover is formed, which lies closely on the agar and has only short aerial hyphae. Conidia are pinched off at these. After 12 days, centers develop in several places in the mycelium, where small droplets of a red-brown liquid are excreted.
The droplets reach a diameter of 1-3 mm and soon become milky opaque with numerous conidia. Conidia formation is practically complete after 16-18 days. A slant agar culture in a test tube with a diameter of 2 cm with 12 ml agar medium contains approx. 109 conidia.
For the cultivation in submerged culture, a preculture is first prepared as follows: A 4.5 percent aqueous malt extract solution with a pH of 5.4 is used as the medium. One liter of this solution is sterilized in a 2 L Erlenmeyer flask at 110 C for 20 minutes,
then inoculated with 6.10 $ conidia from a 15 day old agar culture and incubated for 3 days on a rotating shaker at 24 ° C. A dense culture of fine mycelium flakes is created. The flakes consist of a loose ball of hyphae and are 2-4 mm in diameter. No alkaloids are detectable.
To produce larger quantities of preculture, the glass fermenters, each containing 10 L of the same medium, are inoculated with 6.101 each and then for 3 days at 23 C with aeration with 6 L of air per minute and stirring at 300 rpm . M. incubated. A silicone emulsion is used to combat foam. The fermenter cultures obtained in this way are of the same quality as the shaking cultures.
For the main culture the following nutrient solution turned out to be in 1 L of distilled water
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Sorbitol <SEP> 50 <SEP> g
<tb> succinic acid <SEP> 36 <SEP> g
<tb> KH, PO4 <SEP> 2 <SEP> g
<tb> M9S04 <SEP> 0.3 <SEP> g
<tb> FeS04 <SEP>. <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> ZnS04. <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 10 <SEP> mg and has been adjusted to pH 5.4 with NH40H is particularly useful.
This nutrient solution is inoculated with 10% of a 3-day-old preculture and incubated in portions of 100 ml in 500 ml Erlenmeyer flasks on a reciprocally shaking machine at 23 C. Other cultures are grown in an analogous manner in a stainless steel fermenter containing 170 L nutrient medium.
It is ventilated with 170 L of air per minute and initially 70, later 180 r.p.m. M. stirred. A silicone emulsion is used to combat foam.
In this way, cultures are created from numerous, similar mycelium particles. These have a diameter of approx. 5 mm and have a spherical, compact core of approx. 1 mm in diameter made of pseudeparenchymatic tissue. This nucleus has star-like, approximately 2 mm long appendages made of parallel hyphae. At the end of the approx. 10-day culture period, the mycelium is dark brown and the filtrate is intensely red-brown in color. The pH value changes only insignificantly.
The culture filtrate obtained in this way has a colorimetrically determined total alkaloid content of 620 mg / L, based on a molecular weight of 300.
The composition of the alkaloid mixture determined by paper chromatography is as follows:
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6-methyl-A8,9-ergolen-8-carboxylic acid
<tb> and <SEP> small <SEP> amounts of <SEP> lysergic acid <SEP> and <SEP> <B> 86,511 / 0 </B>
<tb> isolysergic acid
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Lysergic acid amide <SEP> <B> 3.90 / 0 </B>
<tb> Isolysergic acid amide <SEP> <B> 3.90 / 0 </B>
<tb> Ergobasin <SEP> <B> 1.00 / 0 </B>
<tb> Ergobasinin <SEP> <B> 0.50 / 0 </B>
<tb> clavine alkaloids <SEP> 4,
2% The 6-methyl-Q8 # 9-ergolen-8-carboxylic acid can be isolated from the culture filtrate by various methods. It is preferably added to the culture filtrate by a strongly acidic cation exchanger based on sulfonic acid resins (e.g.
Dowex 50 or Amberlite IR 120) removed, detached from it by treatment with dilute ammonia and crystallized by concentrating the eluate and adjusting the pH of the solution to its isoelectric point.
The 6-methyl-Q8,9-ergolen-8-carboxylic acid obtained in this way can be converted into lysergic acid by treatment with basic reagents. Advantageously, z. B. a solution of 6-methyl-Qa, s-ergolen-8-carboxylic acid in dilute aqueous sodium hydroxide solution can be heated to 100 for some time, whereupon the solution is cooled and its pH is adjusted to the isoelectric point of lysergic acid.
The culture filtrate can also be worked up directly on lysergic acid by z. B. After the solution has evaporated, the 6-methyl-8,9-ergolen-8-carboxylic acid is removed from the residue by extraction with an alcoholic ammonia solution, then the 6-methyl-8,9-ergo- len by heating the extract -8-carboxylic acid isomerized to lysergic acid and this, as described above, isolated from the solution.
However, after the culture filtrate has been worked up by ion exchangers, the ammoniacal solution of 6-methyl-8,9-ergolen-8-carboxylic acid can be heated directly or after adding lye, with isomerization to lysergic acid taking place.
In the following examples, which explain how the process is carried out but in no way limit the scope of the invention, all temperatures are given in degrees Celsius; the melting points are corrected.
<I> Example 1 </I> 6-Methyl-Q8> 9-ergolen-8-carboxylic acid 5 L culture filtrate of the new strain of Claviceps paspali Stevens et Hall with a colorimetrically determined total content of ergoline derivatives of approx. 500 mg / L (based on a mol. Weight of 300) and a pH value of 5.6 are passed through a column of 500 g Amberlite IR 120 (H -form; diameter of the column 2.8 cm; height 115 cm) filtered.
The throughput speed is 500 ml / hour. After washing the column with 1 L of water, the 6-methyl-A ", 9 = ergolen-8-carboxylic acid is eluted with 5% ammonia. The flow, collected in fractions of 500 ml each, is illuminated by fluorescence in the UV. And Color reaction according to Keller (FeClg-glacial acetic acid, H, S04 conc.) Tested for the content of ergoline derivatives.
The first four fractions (2 L in total) are evaporated to 500 ml at 13 mm Torr and a bath temperature of 30 °, the solution is adjusted to a pH value of 5.5 with glacial acetic acid, and the resin which has precipitated is filtered off (cellar color reaction negative ). The filtrate is concentrated in vacuo to approx. 25 ml, 20 ml of methanol are added, the solution is briefly boiled and left to stand at 5 for a few hours.
The acid which has crystallized out is filtered off, washed with water and methanol and dried at 80 for 2 hours in vacuo. The following seven fractions of the ammonia run-through yield, after the same work-up, a further amount of crystallized 6-methyl-Q8,9-ergolen-8-carboxylic acid.
To purify the crude acid, the crystallized products are combined in 5 percent. Dissolved alcoholic ammonia, the solution was adjusted to pH 5.5 after filtration with 2N acetic acid, briefly heated on the water bath, the crystallized acid was filtered off after a few hours, washed with water and methanol and dried in vacuo at 80. M.p. 243-245 (dec.); [a] D = -180 (0.1-n. NaOH).
Color reaction according to Keller, van Urk and Ehrlich as with lysergic acid; Thin-layer chromatograms on silica gel with alcohol / 25 percent. Ammonia (9: 1) as a flow agent: Rf value = 0.4 to 0.45. The stain turns blue when sprayed with Ehrlich reagent.
UV spectrum: A, 0.1-n NaOH 1 log s = 217.5 / 4.56; M - X. mss 282 / 3.79; 292 / 3.74, minimum at <I> 252 </I> mu. IR spectrum: characteristic bands at 3340, 2275 (broad), 1674 and 1580 cm 71 (in Nujol). <I> hydrochloride:
</I> The hydrochloride produced from the 6-methyl-Q8,9-ergolen-8-carboxylic acid described above with dilute hydrochloric acid. was recrystallized from water and dilute hydrochloric acid: mp 257-259 (Zerr.);
[a] D = -176 (in 0.1 n. HCl). UV spectrum as for 6-methyl-Qa, 9-ergolen-8-carboxylic acid. IR spectrum: characteristic bands at 3380, 2600, 1708, 1660 (weak) and 1606 (weak) cm-1 (in. Nujol.) 6-methyl-, LS, 9-ergolen-8-carboxylic acid <I> dem </I> <I> hydrochloride: </I> The suspension of 100 mg hydrochloride in 5 ml water is added dropwise with stirring with 2N sodium hydrogen carbonate solution until all substance has gone into solution.
The pH is then adjusted to 5.5 with egg-white acid, briefly boiled, after a few hours the crystallized acid is filtered off, washed with water and methanol and dried in vacuo. at 80. M.p. 245-247 (dec.); [a] D = -208 (0.1 n NaOH), in the thin-layer chromatogram on silica gel with alcohol / 25 percent. Ammonia (9: 1) uniform; Rf value = 0.45. The stain shows in the UV.
practically no fluorescence and turns blue when sprayed with Ehrlich reagent. Example <I> 2 </I> 6-Methyl-Q8> 9-ergolen-8-carboxylic acid The procedure for obtaining 6-methyl-A8,9-ergolen-8-carboxylic acid from the culture filtrate of the new Claviceps paspalum strain Example 1 is used, but instead of Amberlite IR 120, the cation exchanger Dowex 50 is used.
The crystallized, crude 6-methyl-Q11,9-ergolen-8-carboxylic acid having the properties given in Example 1 is obtained.
<I> Example 3 </I> Lysergic acid 500 mg of the crude, crystallized 6-methyl-Q8,9-ergolen-8-carboxylic acid isolated from the culture filtrate of the new Claviceps paspalum strain according to Example 1 are dissolved in 10 ml 2- n sodium hydroxide solution 2 Sbd. warmed on the water bath, the hot solution treated with activated charcoal and the filtrate with dil. hydrochloric acid and glacial acetic acid to a pH of 5.5.
After a few hours, the lysergic acid which has crystallized out is filtered off, washed with water and methanol and dried at 80 in a vacuum: mp 245-247 (decomp.).
The lysergic acid obtained in this way has all the chemical and physical properties described in the literature for this compound.
<I> Example 4 </I> Lysergic acid 101 of the culture filtrate obtained as described above is evaporated on a water bath and the residue is extracted with 3 × 500 ml of 5% alcoholic ammonia solution while heating to about 50. The extract is concentrated to half its original volume in a rotary evaporator, the concentrated solution that remains is adjusted to pH 5.5 with glacial acetic acid, treated with activated charcoal and the filtrate is concentrated to approx. 20 ml in vacuo, with crystallization starting.
It is left at 5 for a few hours, the precipitate is filtered off, washed with water and methanol, dried at 80 and purified by recrystallization or reprecipitation. The lysergic acid obtained in this way melts at 245-247 and has all the chemical and physical properties described in the literature for this compound.
<I> Example 5 </I> Lysergic acid 101 of the culture filtrate obtained as described above are treated with 500 g of Amberlite IR 120 (H + form) while stirring for about 12 hours, the ion exchanger is filtered off and the filtrate is treated again as described above using 250 g of the same cation exchanger. According to Keller, the color reaction of a sample (5 ml) evaporated to dryness of the culture solution resulting after two treatments with the exchange resin is negative.
The two portions of the ion exchanger are each stirred twice for 4 hours with the same amount of water by weight. Each portion of the ion exchanger is now treated three times with the same amount by weight of a 5% aqueous ammonia solution with exclusion of carbon dioxide for 12 hours at 5-10.
The individual extracts are concentrated on a water bath at about 100 in a rotary evaporator to half the original volume, the concentrates are adjusted to pH 5.5 with glacial acetic acid, any small amounts of precipitated resin are filtered off and concentrated in vacuo to 15-20 ml and further as described in Example 3, the lysergic acid is isolated and purified. Instead of the ion exchanger being used here, other strong acidic ion exchangers such as. B. Dowex 50 can be used.