Procédé de préparation de dérivation de dérivés N-acyles de la N-désulfo-héparine
On sait que l'on peut isoler à partir du poumon des mammifères l'héparine, remarquable notamment au point de vue physiologique par son activité anti- coagulante.
En même temps, l'héparine exerce également une activité antilipémique, à savoir que la lipémie alimentaire (turbidité du sang provoquée par ingestion d'un repas riche en lipides) est réduite quelques minutes après une injection intraveineuse d'hé- parine chez l'homme. Il semble être d'un intérêt thérapeutique de pouvoir dissocier ces deux activités de l'héparine et d'exalter ainsi l'activité antilipémique par rapport aux effets anticoagulants.
On a trouvé que l'on pouvait parvenir à ce résul- tat par une transformation convenable des groupements sulfamiques de la molécule de l'héparine. Par clivage de ces groupements, on accède à la N-désulfo- héparine qui sera désignée ci-après sous le nom d' héparamine et qui se montre exempte d'activité anticoagulante, mais possède une faible activité anti lipémique et dont les dérivés N-acylés présentent les propriétés recherchées, leur activité antilipémique étant dans certains cas même identique à celle de l'héparine sans présenter d'activité anticoagulante notable.
L'objet de la présente invention est un procédé pour la préparation de dérivés N-acylés de la N-désul- fo-héparine (héparamine), caractérisé en ce qu'on transforme les groupements sulfamiques de l'héparine en groupements amino pour obtenir la N-désulfo-hé- parine et on traite celle-ci par un agent acylant.
On peut ainsi préparer des dérivés N-acylés de l'héparamine dans lesquels le radical acyle provint des acides carboxyliques des séries aliphatiques, alicycliques, araliphatiques, hétérocycliques ou aromatiques, tout spécialement de l'acide benzoïque et des acides benzoïques substitués dont le phényle porte des hydroxyles éthérifiés ou estérifiés, des atomes d'halogènes, des groupes alcoyle ou des groupes nitro, comme par exemple les acides 3, 4, 5-triméthoxyben- zoique, p-acétoxybenzoïque, p-nitrobenzoique, 2, 4ou 3, 5-dinitrobenzoique et 3, 5-diméthylbenzoïque. On peut citer, en outre, 1'acide p-naphtoïque,
l'acide phé nylacétique, l'acide phényléthylacétique, l'acide 2., 4dichlorophénoxyacétique, les acides carboxyliques du furanne, tels que l'acide furanne-2-carboxylique, les acides gras inférieurs, par exemple l'acide acétique ou l'acide isocaproique. Comme acides non carboxyliques, citons encore les acides sulfoniques et en particulier l'acide tosylique.
La transformation des groupements sulfamiques de l'héparine en groupements amino est effectuée, selon un mode d'exécution du présent procédé, par action d'un alcool inférieur, tel que le méthanol, sur l'héparine et clivage de l'ester formé, par action d'une base alcaline. De préférence, on soumet l'héparine à 1'action de l'alcool inférieur à la température d'ébulli- tion du mélange réactionnel et, après clivage alcalin du produit d'alcoolyse, on isole l'héparamine par précipitation.
Suivant un autre mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on traite l'héparine par un excès de l'alcool inférieur, aux environs de la température ambiante, on effectue le clivage alcalin du produit d'alcoolyse à la température ambiante et on isole l'héparamine sous forme d'un sel facilement cristallisable, par exemple du sel potassique. Le second mode d'exécution présente l'avantage de fournir une héparamine plus pure, à l'état cristallisé.
Le clivage des groupements sulfamiques de l'héparine peut encore être effectué par d'autres moyens que l'alcoolyse et l'action des alcalis.
L'acylation est ensuite réalisée en traitant l'héparamine par les agents acylants classiques capables d'acyler un groupe amino, par exemple les halogénu- res d'acides et en particulier les chlorures ou les anhydrides simples et mixtes. De préférence, on effectue l'acylation en milieu aqueux, faiblement basique, de manière à empêcher l'estérification des fonctions alcools.
L'héparine de départ peut être préparée à partir d'un héparinate alcalin qu'on soumet à l'action d'une résine échangeuse de cations suivie d'une concentration de l'héparine acide à basse température.
Dans les exemples de mise en oeuvre de l'inven- tion qui suivent, les températures ont été exprimées en degrés centigrades.
Exemple 1 a) Préparation de l'heparamine
On introduit 10 g d'héparinate de sodium (S = 13, 2%, solvatation= 11, 6%, activité anticoa- gulante= 150 unités/mg, activité antilipémique
= 140 unités/mg) dans 60 cm3 d'eau, agite, refroidit à 00, puis ajoute 120 cm3 de Dowex 50 p, forme acide, (résine échangeuse de cations à base de polystyrène).
L'addition de la résine est effectuée très lentement de manière à ne pas dépasser 00. On agite ensuite pendant un quart d'heure, filtre la résine et lave avec quelques cm3 d'eau froide. Le filtrat additionné des eaux de lavage est ajusté de manière à contenir 10% de la quantité du sodium théorique (par une nouvelle addition de 4 volumes de Dowex 50 p au cas où le sodium est en excès, ou par addition de quelques cm3 de soude dans le cas contraire) puis concentré sous vide dans une atmosphère d'azote à 12-15% du volume primitif. On ajoute 250 cm3 de méthanol, ajuste le titre en eau de la solution méthanolique à 10% et porte au reflux.
Dès le début de l'ébullition il y a précipitation. Au bout d'un quart d'heure de chauffage, on refroidit à la température ambiante, lave au méthanol et sèche sous vide pour recueillir 7 g de poudre blanche constituée par rhéparamine sous forme de sel quaternaire du sulfate acide de méthyle. Le produit est dissous dans 35 cm3 d'eau, on refroidit la solution aqueuse à 0 et introduit goutte à goutte 5 cm3 environ de soude 5 N jusqu'à pH 12. Après une agitation d'un quart d'heure, on verse dans 500 cm3 de méthanol glacé ; l'héparamine précipite. On essore, lave plusieurs fois par empâtage au méthanol et sèche sur chlorure de calcium.
Rendement : 7 g (soit 85%) d'héparamine (sel de sodium), [a] 2D = + 670 + 2 (c= 1%, eau).
pH de la solution aqueuse à 10% = 9, 8
Solvatation= 10%
Activité anticoagulante < 1 unité/mg
Activité antilipémique = 5 à 7 unités/mg
Ce solide blanc est soluble dans 1'eau, insoluble dans les solvants organiques usuels, tels que l'alcool, l'éther, etc.
Analyse : N 2, 7 % S 9, 7 %.
L'héparamine n'est pas décrite dans la littérature.
L'héparamine peut encore être identifiée par son passage à l'héparine, de la manière décrite ci-après :
On chauffe à 70o et agite le mélange de 0, 45 cm3 de chlorhydrine sulfurique dans 4 cm3 de pyridine anhydre, puis introduit 0, 25 g d'héparamine. Après 5 heures, on ajoute 10 cm d'eau puis sépare l'héparine de la liqueur suivant les moyens usuels. On obtient ainsi 0, 24 g de sel de sodium d'héparine.
L'action anticoagulante est restaurée.
Une vérification du poids moléculaire de cette héparine par iodométrie prouve qu'il n'y a pas eu de dépolymérisation au cours de la préparation de l'hé paramine. b) Acylation de l'héparamine
On dissout 0, 5 g d'héparamine, obtenue selon a), dans 10 cm3 d'une solution saturée de bicarbonate de sodium, ajoute en 30 minutes 1, 1 cm de chlorure de benzoyle et abandonne le mélange réactionnel pendant trois heures sous agitation à la température ambiante. On verse ensuite dans 100 cm d'éthanol, un abondant précipité blanc se forme.
Par addition d'acide chlorhydrique concentré, on acidifie à pH 2, essore et lave à l'éthanol à 10% d'eau jusqu'à disparition des chlorures dans les eaux de lavage. Après séchage, on recueille 0, 520 à 0, 590 g (86, 5 à 98%) de N-benzoyl-héparamine qui est un solide blanc amorphe, solvaté de 10 à 15%. Soluble dans 1'eau, il est insoluble dans les solvants organiques usuels tels que l'alcool, l'éther, l'acétone, etc.
Recherche de NUL : négative.
Spectre U. V. : max. = 228 mF, Et'ém = 162 (soit 16, 8% de benzoyle par g, théorie 17, 0).
Activité anticoagulante : 3 unités/mg.
Activité antilipémique : 29 unités/mg.
Dosage de l'azote : 2, 4%.
Ce composé n'est pas décrit dans la littérature.
Exemple 2
On dissout 0, 5 g d'héparamine, obtenue selon 1'exemple la, dans 10 cm3 d'une solution saturée de bicarbonate de sodium (pH = 8, 5) et ajoute très lentement 1, 125 g de chlorure de 3, 5-dinitro-benzoyle.
On agite pendant 3 heures à la température ambiante, essore le dinitrobenzoate de sodium précipité et concentre la solution à un tiers de volume par un léger chauffage sous vide dans une atmosphère d'azote.
L'addition de 50 cm3 d'éthanol fait précipiter la N3, 5-dinitrobenzoyl-héparamine. On essore, lave à l'al- cool additionné de quelques gouttes d'acide chlorhydrique, puis à l'alcool pur et sèche sous vide durant une nuit. Rendement : 0, 550 g (soit 80-84%) de produit blanc, amorphe, [a] 20 = + 940 (c = 1%, eau).
Il est soluble dans l'eau, insoluble dans les solvants organiques usuels.
Dosage de NO2 = 12, 3% (théorie = 13, 0%).
Recherche de NH2 : traces.
Spectre U. V. : max. = 237 m., Ei m = 239 dans 1'eau.
Activité anticoagulante= 1 à 4 unités/mg.
Activité antilipémique= 100 à 150 unités/mg.
Analyse : N 5, 8% S 6, 6%.
Ce composé n'est pas décrit dans la littérature.
Exemple 3
On introduit avec agitation sous atmosphère d'azote 10 g d'héparamine obtenue selon l'exemple la dans 200 cm3 d'une solution à 0, 5% de carbonate de sodium et chauffe à 800 pendant deux heures et demie. Le volume est ensuite réduit sous vide à 25 cm3 environ, on ajoute à la solution jaune pale épaisse obtenue 65 cm3 d'alcool et amène le pH, par addition d'acide chlorhydrique, à 3. Il y a dégagement de gaz carbonique, on rajoute 150 cm3 d'alcool, gratte, essore, lave à l'alcool à 90 % et sèche sous vide.
Le produit obtenu est dissous dans 200 cm3 d'une solution saturée de bicarbonate de sodium, on ajoute 100 cm3 de benzène, porte à 500 et, en agitant, introduit lentement, par portions de 12 cm3, une solution de 30-34 g de chlorure de 3, 5-dixnéthyl-benzoyle [préparé selon H. R. Snyder et R. R. Adams, Am. Soc., 63, 3280 (1941)] dans 85 cm3 de benzène. L'intervalle entre une introduction et la suivante étant d'une heure, l'addition de la solution totale d'agent acylant dure environ dix heures. Le pH du mélange réactionnel est maintenu pendant ce temps à 8-8, 5 par les additions de bicarbonate de sodium. On abandonne pendant une nuit à la température ambiante, chasse ensuite le benzène sous vide, filtre, lave l'insoluble à 1'eau et concentre la phase aqueuse à 200 cm3.
On ajoute 100 cm3 d'alcool, il se forme un précipité abondant, on acidifie par l'acide chlorhydrique à pH 2, 5 ; le produit se prend en masse. Après addition de 1400 cm3 d'alcool, on essore, lave à 1'alcool à 90% et sèche sous vide pour recueillir 8, 68 g (soit 66, 5%) de N-3, 5-diméthylbenzoyl-héparamine, solvaté à 13, 8%, [Ct] D = + 70, 50 (c = 1%, eau). Le pH de sa solution aqueuse est de 4, 5 environ. Le nouveau composé est un solide amorphe de couleur blanc crème, très soluble dans l'eau, soluble dans le chlorure de méthylène et le propylène-glycol, insoluble dans l'alcool, l'éther, l'acétone, le benzène et le chloroforme.
Analyse : C 37, 2-37, 4%, H 4,2% N 2, 0%,
S 8, 4%.
Le spectre U. V. comparé à celui de la 3, 5-dimé thylbenzoyl-cyclohexylamine montre que le produit obtenu est constitué par 90% de composé acylé.
Activité anticoagulante : 12, 5 unités/mg.
Activité antilipémique : 147 unités/mg.
Le produit n'est pas décrit dans la littérature.
Exemple 4
On dissout par agitation à 250, 2, 5 g d'hépara- mine obtenue selon l'exemple la, dans 70 cm3 d'une solution aqueuse saturée de bicarbonate de soude et 10 cm3 de benzène. On introduit, en l'espace de cinq heures, 4, 9 g de chlorure de p-naphtoyle en solution dans 60 cm3 de benzène et agite le mélange réactionnel une nuit à 250. Après filtration, on ajuste le pH du filtrat à 3-3, 5 par addition d'acide formique 12 N, puis élimine par extraction à l'éther 1'acide 13-naphtoi- que formé au cours de la réaction.
Par addition de soude 2N, on ramène ensuite le pH à 8, 3 et verse dans 5 volumes d'éthanol. Le dérivé naphtoylé préci- pite, on l'essore, lave à l'éthanol et sèche sous vide à température ambiante. Rendement : 2, 3 g (soit 70% de la théorie) de N-p-naphtoyl-héparamine (sel de sodium), produit blanc, solide, solvaté à 10-16% d'eau. Le nouveau dérivé, [a] 2D sur produit sec = + 114 (c = 0, 2%, eau), est très soluble dans l'eau, insoluble dans l'alcool et l'éther.
Son spectre U. V., comparé à celui de la 0-naph- toyl-cyclohexylamine, montre que ce produit est constitué par 78, 5% de composé acylé.
Activité anticoagulante : 9, 4 unités/mg.
Activité antilipémique : 122 unités/mg.
Le produit n'est pas décrit dans la littérature.
D'autres dérivés N-acylÚs de l'héparamine peuvent être préparés de la manière décrite dans les exemples 1 à 4. Le tableau ci-dessous donne des constantes des produits obtenus ainsi que les rendements de ces préparations.
Les caractéristiques communes de ces composés sont : état amorphe, couleur blanche, solvatation 1015%, solubilité dans Peau et les acides et alcalis dilués aqueux, ils sont insolubles dans les solvants organiques usuels. (Voir tableau à la page 4) a) Alcoolyse
On dissout 20 g d'héparinate de sodium (S =13, 2%, solvatation= 11, 6%) dans 200 cm3 d'eau et fait passer en 20 minutes cette solution par percolation sur une colonne contenant 80 cm3 de Dowex 50 , forme acide, (résine échangeuse de cations à base de polystyrène).
Après rinçage de la résine par 50 cm8 d'eau distillée, on réunit l'effluent et l'eau de lavage et ajoute successivement 10 cm8 de soude N, puis 9 volumes de méthanol. Le mélange réactionnel est ensuite agité pendant 48 heures sous atmosphère d'azote à la température de 200, puis additionné de 60 cm3 d'une solution aqueuse à 20% d'acétate de soude. L'ester méthylique partiel préci- pite sous forme de sel de sodium ; on le sépare par filtration ou centrifugation et lave plusieurs fois au méthanol.
Après séchage à 400 sous vide, on recueille 15, 5 g (soit 95% environ) de cet ester méthylique de l'héparamine solvaté à 10%, [a] 2D0 = + 640 (c
=1%, eau).
EMI4.1
<tb>
<SEP> Activité <SEP> Activité
<tb> <SEP> Composés <SEP> Spectre <SEP> U. <SEP> V. <SEP> anticoagulante <SEP> antilipémique
<tb> <SEP> unites/mg <SEP> unités/mg
<tb> <SEP> R-NH-C <SEP> ,-N02 <SEP> m, <SEP> 271 <SEP> m,, <SEP> Ei m <SEP> = <SEP> 245 <SEP> 11 <SEP> 103
<tb> <SEP> O
<tb> <SEP> R-NH-C-O¯OCO-CH3 <SEP> J <SEP> max. <SEP> 242m <SEP> Et/Gm <SEP> 145 <SEP> 15 <SEP> 130
<tb> <SEP> 0
<tb> <SEP> OMe
<tb> <SEP> oye
<tb> <SEP> R-NFi-C-, <SEP> ¯ <SEP> pMe <SEP> max. <SEP> 290 <SEP> m,, <SEP> Ei m <SEP> = <SEP> 77 <SEP> 6, <SEP> 3 <SEP> 39, <SEP> 3
<tb> <SEP> zone
<tb> <SEP> CH2-CH3
<tb> <SEP> R-NH-C-CH-, <SEP> presence <SEP> de <SEP> phenyles <SEP> 3 <SEP> 28
<tb> <SEP> cri
<tb> <SEP> 0
<tb> <SEP> Cl
<tb> R-NH-C-CHz-O-/-Cl <SEP> max.
<SEP> 282, <SEP> 5 <SEP> mE== <SEP> 19, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 3 <SEP> 41
<tb> <SEP> O
<tb> <SEP> R-NH-SOs-/-CHs <SEP> I <SEP> max. <SEP> 230 <SEP> m,, <SEP> Ei m <SEP> = <SEP> 143 <SEP> 11, <SEP> 5 <SEP> 130
<tb> (*) R-NH-correspond ici à l'enchaînement acide glucuronique-glucosaminé
Analyse sur produit sec : NH2 (Van Slyke) 2, 68% (calculé en N) S 11, 1-11, 2%.
L'estérification partielle des carboxyles est mise en évidence par la réaction colorée de l'hydroxamate ferrique. b) Clivage alcalin
On dissout 10g d'héparamine obtenue selon a) dans 100 cm3 d'eau puis ajoute sous agitation modérée 100 cm3 de soude 2 N. Apr¯s un abandon de 15 minutes sous azote, le mélange réactionnel est additionné de 1000 cm3 de méthanol : l'héparamine e précipite. On filtre, lave plusieurs fois au méthanol et sèche sous vide à 400 pour obtenir 10 g d'héparamine (sel de sodium). Le rendement à ce stade est pratiquement quantitatif.
Réaction colorée des esters à l'hydroxamate ferrique : négative. c) Cristallisation
On dissout 20 g d'héparamine (sel de sodium) obtenue selon b) dans 200 cm3 d'eau et porte à 500 au bain-marie. La solution sous agitation est additionnée successivement de 200 cm3 d'une solution aqueuse à 50% d'acétate de potassium et de 20 cm3 de méthanol. On refroidit, l'héparamine commence à cristalliser vers 350. On abandonne pendant une nuit, filtre et lave le précipité par une solution aqueuse à 25% d'acétate de potassium et 20% de méthanol, puis par du méthanol pur.
Rendement : 10, 6 g (soit 50%) d'héparamine (sel de potassium), [e] 2D = + 570 (c = 1%, eau).
Analyse : (C48H65OGtN4STK1) n
Calculé : C24, 75%, H2, 8%, N2, 3%, S 9, 6%
K 18, 5 %.
Trouvé : C25, 2 %, H 3, 1%, N2, 3%, S 9, 5%
K 18, 8 %.
Dosage de razote aminé = 2, 2 (potentiométrie).
2, 1 (Van Slyke)
2, 4 (théorie)
Une analyse effectuée sur un produit quatre fois recristallisé dans les mêmes conditions donne les résultats suivants :
C24, 75%, H3, 0%, N2, 4%, S9, 9% le rendement étant de 90%.
En faisant passer une solution aqueuse du sel de potassium de l'héparamine sur une colonne contenant la résine ¸Dowex 50 ¯, forme acide, on obtient l'héparamine à l'état libre.
L'héparamine ainsi obtenue est transformée en un dérivé acylé de la manière décrite dans les exemples 1 à4.