Procédé de préparation de nouveaux composés hépariniquesutilisables, notamment,
pour le traitement des troubles de la coagulabilité sanguine
La présente invention a pour objet un procédé de préparation de nouveaux composés, les N- (sulfo benzoyl)-N-désulfa-héparines et leurs sels de métaux alcalins, lesquels sont utilisables notamment pour le traitement des troubles de la coagulabilité sanguine.
Les N-sulfobenzoyl)-N-désulfo-héparines répondent à la formule générale :
EMI1.1
damslaqueiUc R représente de l'hydrogène ou un atome de métal alcalin, Rt, R > "R3 et R4 représen- tent simultanément ou distinctement un atome d'hy- drogène ou un groupe sulfonique libre ou salifie, étant exclu Rt = R2 = R3 = R4 = hydrogène, alors que n est environ 10.
On connaît déjà des dérivés N-acylés de la Ndésulfo-héparine, tels que la N-benzoyl-N-désulfo- héparine, la N-p-nitro-benzoyl-N-désulfo-héparine, la
N-3, 5Ziméthyl-benzoyl-N-désulio-héparine, etc., décrits dans le brevet suisse N"385812 possédant une activité anticoagulante minime.
D'autre part, on sait également que la transfo- mation de la N-désulfo-héparine en urée substituée conduit comme décrit dans le brevet français N 1344156 à des composés, tels que la n-butyl-hé- parylurée, la phényl-héparylurée ou la a-naphthyl-hé- parylurée, dotés d'une activité anticoagulante peu prononcée.
Il a été trouvé maintenant que les N- (sulfoben zoyl)-N-désulfo4iéparines et leurs sels alcalins, obte- nus selon le procédé objet de l'invention, possèdent une activité anticoagulante nette et plus particulièrement une action anticoagulante prolongée, pouvant se manifester pendant 6 à 10 heures après le moment d'administration.
Le procédé de préparation de ces composés est caractérisé en c* que l'on transforme la N-désulfo- héparine en un sel d'ammonium quaternaire à lon- gue chaîne de carbones, fait réagir sur ce sel d'am
Dans ses modes d'exécution, le procédé de pré paration des N-sulfobenzoyl)-N-désulfo-héplarines peut être caractérisé par les points suivants :
Les sels d'ammonium quaternaires convenant par
ticulièrement pour la préparation des sels d'am-
monium quatcrnaires de la N-désulfo-héparine
sont de préférence l'hyamine 2389 qui est le chlo
rure de trimÚthyl-(mÚthyl-dodÚcyl-benzyl)-ammo
nium, l'Aquad 2C ou chlorure de dilauryl-dimé
thylammonium et notamment l'hyamine 1622 ou
chlorure de benzyl-diméthyl-2- [2- (p-1, 1, 3, 3-tétra- méthyl-butyl-phénoxy)-éthoxy]-éthylammonium ;
-l'anhydride ou l'anhydride mixte d'un acide ben
zoïque mono-ou polysulfoné que l'on fait réagir
sur le sel d'ammonium quaternaire de la N-dé-
sulfo-héparine est de préférence l'anhydride o-sul
fobenzaique, l'anhydride d'acide 2, 4-disulfoben
zo¯que, l'anhydride mixte de l'acide 3, 5-disulfo-
benzoïque et de l'acide éthoxy carbonique, ou
l'anhydride mixte de l'acide m-sulfobenzoique et
de l'acide éthoxy carbonique ;
-l'acylate. inférieur d'un métal alcalin que l'on em
ploie pour l'obtention de sels alcalins de N- (sulfo-
benzoyl)-N¯désulfo-héparines est de préférence
l'acétate de sodium.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
Exemple 1
Préparai du sel de sodium de la N- (2-sulfoben zoyl)-N-désulfo-héparine :
On introduit 0, 07 g de N-désulfo-hépadne dans 50 cm3 d'eau, puis ajoute 250 om3 d'une solution aqueuse à ld n/o d'Hyamine 1622, homogénéise le précipité formé, laisse au repos pendant une heure environ, essore et lave à l'eau. On obtient 28, 5 g de sel d'Hyamine de N-désulfo-héparine que l'on emploie tel quel pour le stade suivant de la synthèse.
On introduit, sous agitation, 3 g de composé ci-dessus dans 60cm3 de stébrahydrofuran et agite jusqu'à dissolution. Puis, on ajoute successivement, et sous agitation, 3 cm3 de triéthylamine et 1, 5 g d'anhydride o-sulfobenzoïque. On continue l'agitation pendant quinze heures à température ambiante. On évapore ensuite à sec sous vide, reprend le résidu par 30 cm3 de n-butanol aqueux, extrait la solution n-butanolique à plusieurs reprises par une solution d'acétate de sodium à 20 /0, filtre les extraits réunis, verse le filtrat dans le méthanol, laisse au repos pendant une heure environ, essore le précipité formé, le lave au méthanol et sèche. On obtient 1, 047 g de sel de sodium de la N- (2-sulfobenzoyl)-N-désulfo-héparine.
Spectre U. V. : (acide chlorhydrique N/10) absorp- tion à 266 et 272 mt correspondant à 1, 3-1, 4. 10-3 moles d'acide o-sutfobenzoïque par gramme.
Ce produit est soluble dans l'eau, insoluble dans l'alcool, l'éther, l'acétone, le benzène, et le chloroforme. Les acides dilués aqueux l'hydrolysent. Les alcalis dilués aqueux le dégradent.
Analyse : (C76H77O77N4S11Na15)n = (2, 976, 12) n
Calculé : S 11, 85 0/o
Trouvé : S 11, 4 /o
Ce composé n'est pas décrit t dans la littérature.
Activité anticoagulante : 36, 5 ¯1, 5 UAT/mg.
Exemple 2
Préparation du sel de sodium de la N- (2, 4-disulfo-
benzoyl)-N-désulfo-héparine :
On dissout 17, 88 g. de sel de potassium de N-dé- sulfo-héparine dans 100 cm3 d'eau, puis ajoute 500cm3 dI'une solution aqueuse d'Hyarnine 1622 à monium quaternaire l'anhydride ou un anhydride mixte d'un acide benzoïque mono-ou polysulfoné et transforme finalement, le cas échéant, l'amide résul- tant en sel d'un métal alcalin par action d'un acylate infÚrieur de mÚtal alcalin. 40
Le schéma suivant résume les réactions suivantes :
EMI2.1
<tb> <SEP> /COOH <SEP> CHgOSOgR <SEP> \3 <SEP> COOH <SEP> CH., <SEP> OS03R
<tb> <SEP> sel <SEP> d'ammonium <SEP> quaternaire <SEP> à
<tb> <SEP> OH <SEP> OH <SEP> OH <SEP> longue <SEP> chdine
<tb> <SEP> sel <SEP> d'ammonium <SEP> quaternaire <SEP> de
<tb> <SEP> O <SEP> H <SEP> OH <SEP> NH2 <SEP> la <SEP> N-désulfo-héparine
<tb> w
<tb> <SEP> H, <SEP> SO3H
<tb> 2) <SEP> Sel <SEP> d'ammonium <SEP> qua-anhydride <SEP> d'acide <SEP> Amine <SEP> N- <SEP> (sulfo-benzoyl)-N-dé
<tb> <SEP> ternaire <SEP> de <SEP> la <SEP> N-+ <SEP> benzoïque <SEP> sulfone <SEP> sulfo-héparine
<tb> <SEP> désulfo-héparine <SEP> tertiaire
<tb> 3) <SEP> N- <SEP> (sulfobenzoyl)- <SEP> acylate <SEP> inférieur <SEP> N- <SEP> (sulfobenzoyl)
<tb> <SEP> N-désulfo-héparine <SEP> > <SEP> N-désulfo-hépaLAne
<tb> <SEP> alcalin <SEP> sel <SEP> de <SEP> métal <SEP> alcalin
<tb> 10 /o, homogénéise le mélange réactionnel, laisse au repos pendant une à deux heures environ, essore le précipité, le lave à l'eau et sèche sous vide. On ob- tient 56 g de sel d'Hyamine de N-désulfo-héparine (A).
D'autre part, on prépare le sel d'Hyamine d'anhy- dride d'acide 2, 4-disulfobenzöïque (B), de la manière suivante : on dissout 70 g de sel de sodium d'acide 2, 4-disulfobenzoique dans 700 cm3 d'eau et 70 cm3 d'acide formique. Puis on ajoute 1550cm3 d'une solution aqueuse d'Hyamine à 10 /o, extrait à plusieurs reprises par le chlorure de méthylène, réunit les extraits, les évapore, chasse l'eau par entraînement avec le benzène, reprend le résidu sec par 700cm3 de trichloréthylène, porte au reflux jusqu'à dissolution, laisse refroidir vers 50-600 C et introduit sous agi tation 105 cm3 de chlorure de thionyle.
On continue l'agitation pendant deux heures environ à une tempé- rature située entre 75 à 800 C, distille au commencement sous pression normale, puis sous vide jusqu'à ce qu'il n'y reste que des traces de chlorure de thionyle. On reprend ensuite le résidu par 700 cm3 de tétrahydrofuran, traite la solution au noir animal, fil tre et obtient la solution tétrahydrofuranique du sel d'Hyamine de l'anhydride d'acide 2, 4-disulfobenzoi- que (B), que l'on emploie tel quel pour le stade suivant de la synthèse.
On introduit sous agitation 49 g de sel d'Hyamine 1622 de N-désullò-héparine (A) dans 1000 cm de tétrahydrofuran puis ajoute, après dissolution à tem pérature ambiante la solution B préparée comme décrit précédemment et soumet le mélange réactionnel à l'agitation pendant dix-sept heures environ à tem pérature ambiante. On évapore ensuite à sec sous vide, sans dépasser r 5Oo C, reprend le résidu par 50û cmz de n-butanol aqueux, extrait à plusieurs reprises par une solution aqueuse d'acétate de sodium à 20 /0, réunit les extraits, les filtre,
ajoute 750 cm3 de méthanol et laisse au repos une heure à deux heures environ, puis filtre le précipité formé, le lave successivement au méthanol et à l'éther, sèche et ob- tient le sel de sodium de la N- (2, 4-disulfobenzoyl)-N désulfo-héparine brute. On purifie ce produit par passage d'une solution aqueuse de celui-ci sur une résine échangeuse d'anions fortement basique telle que celle possédant une structure fonctionnelle d'ammo- nium quaternaire.
On passe, sur la résine, la totalité de la solution aqueuse préparée ci-dessus mais ne recueille que la fraction donnant un test positif de précipitation à l'Hyamine, rince la colonne à l'eau distillée, réunit les 6luts, les traite au noir animal, filtre, neutralise le filtrat par addition d'acide acétique, puis ajuste le pH à 7, 8 par la lessive de soude, précipite par addition de méthanol, sépare le précipité, l'essore, le lave successivement au méthanol et à l'éther, le sèche et obtient 16, 7 g de sel de sodium de la N- (2, 4-di sulfobenzoyl)-N-désulfo-héparine.
Teneur en soufre : 12, 65 zozo (théorie : 14, 18 /o).
Spectre U. V. : (en solution dans ClH N/10)
X max. 221 mt E1% 1cm = 107
Amax. 263mF Eie/ = 11, 2
? max. 270 mÁ E1% 1cm = 12, 4
? max 277 mÁ E1% 1cm = 11,1
Activité anticoagulante : 66, 2 UAT/mg.
Le produit est soluble dans l'eau, insoluble dans l'alcool, l'éther, l'acétone, le benzène et le chloroforme.
Ce composé n'est pas décrit dans la littérature.
Exemple 3
Préparation de la N- (3, 5-disulfobenzoyl)-N-désulfo-
héparine (sel de sodium) : a) Préparation de l'anhydride mixte de l'acide 3, 5- disulfobenzoique :
Dans une fiole conique de 500 cm3, on dissout 3, 75 g de 3, 5-disulfobenzoate de potassium dans 50cm3 d'eau distillÚe. Le pH de la solution est ajusté à 10 par addition de potasse. On ajoute alors 160 cm3 d'une solution à 10 0/o d'Hyamine 1622. Le sel d'Hy- amine de l'acide 3, 5-disulfobenzoique précipite. On le recueille par fiLtration, puis l'épuise à 2 reprises par 100 cm3 de chlorure de méthylène.
La solution organique. est lavée à l'eau puis séchée sur sulfate de sodium et évaporée à sec. L'extrait sec est redissous dans 30 cm3 de tétrahydrofuran. La solution est transvasée dans un ballon à trois tubulures et refroi- die entre 0'et + 5 C sous agitation et sous atmo- sphère d'azote. On ajuste le pH à 10 par addition de 0 ;, 1 cm3 de triéthylamine puis ajoute 0, 75 cm3 de chlorofonmiate d'éthyle. On maintient l'agitation en atmosphère d'azote.
Au bout de quinze minutes, on ajoute 1, 5 cm3 d'une solution de formiate de. triéthyl- amine à 10 0/o dans le tétrahydrofuran qui décompose l'excès de chlorofonrmiate d'éthyle. On obtient ainsi une solution d'anhydride mixte de l'acide 3, 5-disulfo- benzoïque. b) Préparation de la N- (3, 5-disulfobenzoyl)-N
désulfo-héparine :
On ajoute à la solution d'anhydride mixte préparée selon a) la solution suivante :
Nldésulfo-héparin, ate d'Hyamine 1622 2 g
Tétrahydrofuran 30 cm3
Tnéthylamine 0, 5 CMB
On agite, ensuite sous barbotage d'azote.
La solution est ensuite évaporée à soc sous vide. On obtient la N- (3, 5-disulfobenzoyl)-N-désulfo-héparine sous forme d'un résidu amorphe. c) Préparation du sel de sodium de la N- (3, 5
disulfobenzoyl)-N-désulfo-héparine :
Le résidu obtenu selon b) est dissous dans 30 cm3 de butanol saturé d'eau. On épuise cette solution à trois reprises avec 5 cm3 d'une solution aqueuse à 20"/o d'acétate de sodium. La solution aqueuse est filtrée puis versée dans 100 eus de méthanol. Le sel de sodium de la N-(3, 5disul1fobenzoyl)-N-désulfo- héparine précipite.
On le recueille par filtration, l'essore, le lave par du méthanol à 20"/od'ean et le sèche. On obtient ainsi 0, 5 à 0, 55 g de sel de sodium, soit un rendement de 55 à 60/o. ! Le produit a été obtenu avec un taux d'amidification variant entre 82 et 95 /o.
Spectre U. V. : (acide chlorhydrique N/10) inflexions à 270 à 230 mssl environ.
Activité anticoagulante : 31 3 UAT/mg.
Le spectre U. V. indique la présence de 0, 97 à 1, 13. 10-3 mol. d'acide 3, 5-dulfabnzoique par gramme de produit (théorie : 1, 18. 10-3/g).
Ce composé n'est pas décrit dans la littérature.
Exemple 4
Préparation de la N-3-sulfobenzoyl)-N-désulfo-
héparine (sel de sodium) : a) Préparation du m-sulfobenzoate d'Hyaminel622 :
Dans un Erlenmeyer de 300cm3, on introduit successivement 5, 2 g de m-sulfobenzoate de sodium, 125 cm3 d'eau distillée et 2, 5 cm3 de lessive de soude.
Le m-sulfobenzoate de sodium se dissout rapidement.
On obtient une solution alcaline de pH voisin de 10.
On ajoute alors 220 cm3 d'une solution aqueuse à 10"/o d'Hyamine 1622. Le m-sulfobenzoate d'Hyamine 1622 précipite. Le précipité amorphe séparé par filtration est épuisé à deux reprises par 100 cm3 de chlorure de méthylène. La solution organique est lavée à l'eau, séchée sur sulfate de sodium et éva- porée à sec à la pression atmosphérique.
Le résidu sec de sel d'Hyamine 1622 est redissous dans 50 cm3 environ de tétrahydrofuran. Après complète dissolution, on amène au volume exact de 100 cm3 avec du tétrahydrofuran. b) Préparation de l'anhydride mixte :
Dans un ballon à trois tubulures, on introduit 50 cm3 de la solution tétrahydrofuranique de m-sulfo- benzoate d'Hy. amine 1622 préparée selon a). On refroidit à 5o C 1 sous agitation et sous atmosphère d'azote.
On ajuste le pH de la solution à 10 avec de la triéthylamine puis on introduit 1 cm3 de chlo roformiate d'éthyle redistillé. La température du milieu monte légèrement puis revient Ó 5¯ C.On maintient alors trente minutes à cette température. On ajoute ensuite 3 cm3 d'une solution de formiate de triéthylamine à 10 /o dans, le °étrahydrofuran.
On obtient ainsi une solution d'anhydride mixte de d'acide m-sulfobenzoïque. c) Préparation de la N-(3-sulfobenzoyl)-N-désulfo-
héparine (sel de sodium) :
On ajoute à la solution d'anhydride mixte de l'acide m-sulfobenzoique 30 cm3 d'une solution tétra- hydrofuranique à 10 /0 de Ndésulfo-héparinate d'Hyamine 1622. On rince le récipient ayant contenu le N-désulfo-héparinate d'Hyamine 1622 par 10cm3 de tétrahydrofuran. On agite le mélange pendant une heure à + 5"C sous atmosphère d'azote. Le mélange réactionnel est ensuite
évaporé à sec sous vide. Le résidu amorphe est redissous dans 50 cm3 de butanol saturé d'eau. La solution de N- (m-sulfobenzoyl)-N- désulfo-héparine est alors épuisée par 10 cm3, 10 cm3 et enfin 5 cm3 d'une solution aqueuse à 20"/o d'acé- ta, te de sodium. La phase aqueuse décantée est filtrée et versée dans 100 cm3 de méthanol. Le précipité de sel de sodium est enfin séparé par filtration, essoré, lave et séché.
On obtient ainsi 1, 05 g de N- (3-sulfo- benzoyl)-N-désulfo-héparine (sel de sodium), soit un rendement de 75 /o.
Teneur en NH2 < 4"/o (exprimé en N-désuifo" héparine) ; S 11, 5"/o (théorie : 11, 88).
Spectre U. V. (acide chlorhydrique N/10) :
inflexions vers 230mÁ E1% 1cm = 79, 5
inflexions vers 270mÁ E1% 1cm = 6, 6
Cette absorption correspond à 1, 06. 10-3 mol/g d'acide m-sulfobenzoique (théorie : 1, 35. 10-3). Le taux d'amidification est donc de l'ordre de 80 /o.
Activité anticoagulante : 29 UAT/mg.
Ce composé n'est pas décrit dans la littérature.
Ainsi qu'il a été indiqué plus haut, les N- (sulfo- benzoyl)-N-désulfohhépaxines peuvent être utilisées pour le traitement des thromboses, des thrombophlé- bites, des embolies, des menaces d'infarctus pulmo- naire ou cardiaque, des artérites, de l'angine de poitrine, des troubles trophiques post-phlébitiques.
Elles possèdent notamment l'avantage sur l'hépa- rine d'exercer une action prolongée qui évite les injections intraveineuses répétées ou les perfusions veineuses continues représentant des doses d'héparine très élevées. Elles possèdent, en outre, l'avantage sur les anticoagulants dérivés de la dicoumarine d'agir avec rapidité et pendant un délai bien déterminé alors que les dérivés de la dicoumarine qui inhibent t la synthèse de la thrombine dans le foie (antagonistes de la vitamine K) sont d'une action tardive mais dont la durée ne peut être prévue avec certitude.
Enfin, pour autant qu'on le sache, l'action des
N- (sulfobenzoyl) N-désuNo-héparines se manifeste sur tous les stades de la coagulation, ce qui rend leur action plus sûre et moins dangereuse pour r l'organisme.
Les N- (sulfobenzoyl)-N-désulfo-héparines sont ad ministrées par voie intraveineuse. Elles n'agissent pas par voie buccale.
La posologie utile s'échelonne entre 400 mg et 2 g par jour chez l'adulte en fonction de la voie d'admi- nistration.
Action retard par voie intraveineuse
Cette action a été étudiée chez le lapin. Elle a été mesurée en déterminant le temps de coagulation à intervalles réguliers (2, 4, 6, 8 et 10 heures après l'injection intraveineuse du composé étudié). Les composés ont été administrés aux doses de 10 mg/kg et de 20 mg/kg. Les résultats suivants ont été obtenus :
Activité anticoagulante
10 mg/kg 20 mg/kg ComposÚ administrÚ
Nombre DurÚe Nombre DurÚe
d'UI/kg d'action d'UI/kg d'action
Héparine 1350 4 h 2700 6-7 h N- (2-sulfobenzoyl)-désulfo-
héparine. 340 6 h 680 9 h N- 4ésulfo-
héparine. 250 3 h N- (3, 5-distulfobenzoyl)-désulfo-
héparine.. 300 2 h 600 3 h N-(2, 4Zisulfobenzoyl) désulfo-
héparine.
220 6-7 h 440 9-10 h
Ainsi qu'il ressort de ce tableau, les N- (sulfo- benzoyl)-N-désulfo-heparines possèdent une action anticoagulante prolongée à des doses anticoagulantes (exprimées en Unités Internationales) infiniment plus faibles que colles d'héparine nécessaires pour obtenir un effet du même ordre.