Procédé de préparation de nouveaux dérivés de la tétracycline
La présente invention concerne la préparation de nouveaux dérivés de la tétracycline pouvant tre représentés par la formule générale :
EMI1.1
et de leurs sels d'addition avec des acides, formule dans laquelle Ri et Rg représentent H, Nô.,, NHa,
CN ou un halogène, l'un au moins des Ri et il étant un groupe NO, Rg représente H ou (SH3 et R4 représente H ou OH.
Ces nouveaux composés sont préparés en faisant agir sur un composé de la formule I ci-dessus, où
R et/ou R sont de l'hydrogène, un agent de nitration tel que le nitrate de potassium, de préférence en proportions molaires équivalentes, et un acide minéral fort, par exemple l'acide sulfurique, à une température qui peut aller de-15 C à +15 C.
On isole habituellement la nitrotétracycline résul- tante du mélange réactionnel sous forme du sulfate acide par précipitation par l'éther froid. On peut obtenir la base libre en ajustant une solution aqueuse du produit à un pH d'environ 4 à 6 par un alcali doux, à savoir par exemple le carbonate de sodium.
On peut préparer ainsi les nitro-6-désoxytétracycline, nitro-6-déméthyl-6-désoxytétracycline ou nitro-5 hydroxy-6-désoxytétracycline, selon la matière de départ.
Quand on emploie comme matière de départ la 6-déméthyl-6-désoxytétracycline, on a trouvé que le produit nitré résultant est un mélange que l'on peut séparer en deux composés distincts par cristallisation fractionnée. Par commodité, on désignera ces derniers par isomère A et par isomère B de la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétracycline.
On réalise l'isolement de la nitro-6-déméthyl-6- désoxytétracycline-B du produit de nitration brut par cristallisation fractionnée. On réalise une séparation grossière des composés organiques et minéraux sur le produit de nitration brut précipité à l'éther en utilisant l'éthanol comme solvant. On sépare ensuite le produit organique en deux composants en utilisant les différences de solubilité dans le méthanol des bases libres respectives. On isole la nitro-6- déméthyl-6-désoxytétracycline-B sous forme d'un sulfate cristallisé dans la solution méthanolique et on la purifie en formant la base libre, puis on recristallise la base libre de façon classique.
Les deux composés diffèrent l'un de l'autre par leurs spectres et par leur activité. La principale différence entre les spectres d'ultraviolet des isomères A et B de la nitro 6-déméthyl-6-désoxytétracycline réside principalement dans la région de longueurs d'onde longues.
Dans l'HCl 0,1 N, les maxima d'absorption de la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétracycline-B sont à 350 mu tandis que la nitro-6-déméthyl-6-désoxy- tétracycline-A absorbe à 360 m. Dans Na2B407 0,1 N,
la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétracycline-B a un maximum d'absorption bien défini à 370 mu tandis que la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétracycline-
A a un maximum d'absorption très large avec un léger sommet à 350 mll.
Le spectre d'absorption d'infrarouge de la nitro 6-déméthyl-6-désoxytétracycline-B présente des bandes d'absorption nitro à 6,54 et à 7,46, sensiblement les mmes que celles de la nitro-6-démé- thyl-6-désoxytétracycline-A. Cependant, la courbe complète d'infrarouge de la nitro-6-déméthyl-6- désoxytétracycline-B est par ailleurs différente de la courbe d'infrarouge de la nitro-6-déméthyl-6-désoxy- tétracycline-A.
On n'a pas encore démontre de façon irréfutable la structure de la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétra- cycline-A et de la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétra- cycline-B mais on croit que les deux composés sont des isomères de position dans lesquels le groupe nitro est fixé sur le noyau aromatique de la tétracycline en position ortho-par rapport au groupe hydroxyle dans un composé, et en position para-dans l'autre composé.
On peut également nitrer les aminotétracyclines dans les conditions spécifiées ci-dessus pour former la nitrotétracycline mono-substituée, en vue d'obtenir 1'amino-nitro-6-désoxytétracycline. On peut également bromer les nitrotétracyclines en utilisant la
N-bromo-succinimide par exemple, pour former une désoxytétracycline di-substituée.
Les nouveaux composés préparés selon l'inven- tion sont des composés amphotères, et par suite on peut facilement en préparer les sels d'addition d'acide, c'est-à-dire les mono-et les di-sels (quand on utilise une aminotétracycline).
En général, les acides préférés sont les acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique et analogues, bien qu'on puisse également utiliser des acides organiques tels que 1'acide trichloracétique. On peut préparer ces sels d'addition d'acide en traitant le composé amphotère avec environ 2 équivalents ou plus de l'acide choisi. De préférence, on met en suspension la tétracycline dans un solvant convenable pendant l'acidification.
Les nouvelles tétracyclines préparées selon l'in- vention sont biologiquement actives, et ont le large spectre d'activité antibactérienne des tétracyclines déjà connues. Le spectre antibactérien de certains de ces composés, représentant la quantité nécessaire pour inhiber la croissance de diverses bactéries typiques, a été déterminé de la façon classique par la technique de dilution sur agar communément utilisée pour l'essai des nouveaux antibiotiques. Les concentrations inhibitrices minimums, exprimées en gamma par cc, vis-à-vis de divers organismes d'essai sont reportés dans le tableau ci-dessous. A titre comparatif, on y a également inclu l'activité antibactérienne de la tétracycline contre les mmes organismes.
Organisme Tétracycline Nitro-6-demethyl-6-
desoxytdtracycline-B
Mycobacterium ranae 1 0,25
Mycobacterium smegma
tis ATCC 607 1 0, 5
Staphylococcus aureus
209P 2 0,5
Sarcina Lutea 1001 2 0,5
Bacillus subtilis
ATCC 6633 0,5 0,25
Streptococcus pyogenes
C203 0, 5 0,25
Streptococcus cp Ne 11. 250 31
Streptococcus p ? 80 250 31
Staphylococcus aureus
NY 104 4 0,5
Bacillus Cereus No 5 0,25 0,
125
Pseudomonas aeruginosa 8 4
Proteus vulgaris 8427 31 1
Escherichia coli
ATCC 9637 8 4
Salmonella gallinarum 8 4
Escherichia coli No 22 4 2
Les nouveaux composés de la tétracycline obtenus selon l'invention ont une stabilité considérablement plus élevée vis-à-vis des acides et des alcalis que la tétracycline parente. De plus, les aminotétracyclines sont beaucoup plus solubles que le composé parent.
L'invention sera décrite maintenant plus en détail en référence aux exemples particuliers suivants.
Exemple 1 PrcparaoM du produit de nitration brut de la 6 demetlayl-6-desoxytetracycline.
A une solution de 900 mg (2 m moles) de chlorhydrate de 6-déméthyl-6-désoxytétracycline (J. A. C.
S. 80-5324, 1958) préparé par mise en contact d'une solution dans un solvant polaire de 6-déméthyltétracycline (J. A. C. S. 79,4561,1957) avec de l'hydrogène en présence d'acide borique et d'un métal noble catalyseur jusqu'à ce qu'environ une mole d'hydrogène ait été absorbée par mole de 6-démé thyltétracycline dans 50cc d'H-, SOX concentré à 00, on ajoute 200 mg (2 m moles) de KNO. On agite la solution réactionnelle brun clair à 0"pendant 20 minutes.
On verse graduellement cette solution froide dans 1 litre d'éther diéthylique à 5o. L'addition est effectuée à une vitesse maintenant la température de l'éther entre 5 et 10o. Le solide jaune clair qui a précipité immédiatement, se dépose graduellement dans la solution éthérique. On décante la plus grande partie de la solution et on filtre le solide, on le lave à l'éther froid (quatre fois 10 cc) et on le sèche sous vide à température ambiante pendant 4 heures.
Poids de solide : 1,01 g.
On dissout 200 mg du produit de nitration ci-dessus dans 5 cc de HO en agitant. On ajuste la solu tion brun clair (pH 1,3) à pH 5,0 avec Na,, CH3 2N.
Il précipite un solide jaune brunâtre. On laisse ce mélange sous agitation dans un bain de glace pendant une heure. On filtre le solide (en tant que base libre), on le lave à H30 (trois fois 5 cc) et on le sèche sous vide à 600 pendant 4 heures. Poids : 80 mg point de fusion avec carbonisation 197 .
Analyse : calculée pour C ; ltHalNSO9. H30 (494,4) :
C 50,9 ; H 5,08 ; N 8,46 ; H30 7, 26. Trouvé :
C 50, 63 ; H 4, 84 ; N 8,79 ; HSO (perte au sé
chage) 5,29.
Le spectre d'ultraviolet de ce produit est de caractère différent de celui de la 6-déméthyl-6-désoxy- tétracycline de départ. Dans l'acide chlorhydrique 0,1 N il y a une diminution de 5 mu de la longueur d'onde courte d'absorption à 262 mst tandis que dans la longueur d'onde longue d'absorption il y a une augmentation de 10 mut à 355 m ! l. Le spectre d'infrarouge, qui est également différent de celui de la 6 déméthyl-6-désoxytétracycline, présente des bandes d'absorption de groupe nitro à 6,56 [c et 7,45 R.
Séparation du produit de nitration brut en isomères
A et B de la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétra-
cycline.
On chauffe à ébullition au bain-marie une suspension de 11,78 g du produit de nitration précipité à l'éther de la 6-déméthyl-6-désoxytétracycline dans 500 cc d'éthanol absolu. On filtre immédiatement la matière insoluble, on la lave à l'éthanol absola u chaud (deux fois 25 cc), puis à l'éther (trois fois 50 cc). On sèche le solide à l'air à température ambiante. Poids 3,70g. On réunit le filtrat éthanolique trouble et les lavages à l'éthanol et on les évapore sous vide à sec, à 30 . Poids 8,1 g.
On délaye le résidu solide de l'évaporation d'étha- nol dans 300 cc de méthanol (pH dans 1'eau 2,5) puis on ajoute de la triéthylamine jusqu'à ce qu'on atteigne un pH de 5,0 (dans Haro) ; on filtre un solide cristallisé insoluble jaune foncé, on le lave au méthanol (2 fois 5 cc) et on le sèche sous vide à 600 pendant une heure pour obtenir 2,78 g de nitro 6-déméthyl-6-désoxytétracycline-A. On réunit le filtrat méthanolique et les lavages et on ajoute le pH à 1,8 avec H3SOA 6N. Après refroidissement de la solution dans un bain de glace, un solide cristallisé jaune clair (bouquets semblables à des aiguilles) commence à précipiter.
On agite le mélange dans un bain de glace pendant 2 heures, puis le solide est filtré, lavé à l'éther (5 fois 10 cc) et séché sous vide à 60 pendant une heure pour donner 1,8 g de nitro 6-déméthyl-6-désoxytétracycline-B.
Préparation de la base libre nitro-6-demethyl-6- desoxytetracycline-B.
On agite 500 mg du sulfate de la nitro-6-démé- thyl-6-désoxytétracycline dans 20 cc d'eau. On filtre une petite quantité de solides insolubles à travers un adjuvant de filtration sur un entonnoir en verre fritte. On ajuste le filtrat jaune limpide (pH 1,7) à pH 5,2 avec NaCOg 2N. Il précipite un solide jaune partiellement cristallisé. On chauffe le mélange à environ 800 sur un cône de vapeur, puis on le refroidit au bain de glace. Le solide apparaît encore très fin et reste suspendu en solution. On congèle alors la suspension dans un bain glace sèche-méthyl cellosolve. Après maintien de la congélation pendant une heure encore, on laisse le mélange se réchauffer à température ambiante.
On lave le solide filtré à 1'eau (deux fois 5 cc). On place le solide sous vide à température ambiante jusqu'au lendemain puis on le sèche à 600 pendant une heure. Poids 284 mg.
Recristallisation de la base libre nitro-6-demethyl- 6-désoxytétracycline-B.
On chauffe au bain-marie un mélange de 70 mg de la base libre (produit de 1'exemple 3). On sépare par filtration à chaud une petite quantité d'un solide amorphe insoluble. Le filtrat, qui est devenu trouble pendant la filtration, est rechauffé en une solution limpide ; par refroidissement lent à la température ambiante il précipite un solide cristallisé jaune (en bouquets analogues à des aiguilles). On filtre le solide, on le lave avec 1 cc d'eau et on le sèche sous vide à 600 pendant une heure. Poids : 37,2 mg.
On chauffe une portion de cette base libre dans du toluène dans un appareillage d'extraction Soxhlet.
Le bouilleur contient de l'hydrure de calcium et on soumet au reflux pendant 4 heures la solution toluénique jaune. On suit ce processus en vue d'éli- miner toute 1'eau de cristallisation du composé.
On obtient un solide jaune que l'on chauffe à 140 pendant 2 heures sous vide puis que l'on analyse immédiatement.
Analyse : calculée pour CHN-jOs-0, 2 mole to
luène : C 56,2 ; H 4,70 ; N 8,84 ; O 30,3. Trouvé :
C 55,94 ; H 5,47 ; N 8,68 ; O (direct) 29,73.
Dans HCI 0,1 N l'absorption maximum d'ultraviolet est à 350mut. Dans NaO 0, 1 M l'absorp- tion maximum d'ultraviolet est à 370 mu. Le spectre d'infrarouge présente des bandes d'absorption de groupe nitro à 6,54 zut et 7,46 > .
Pt-gparation du chlorhydrate de nitro-6-demethyl-6- d ésoxytétracycline-B.
A une suspension de 250 mg de la base libre préparée à 1'exemple 4 dans 25 cc de n-butanol on ajoute 7 gouttes de HC1 concentré. On filtre une petite quantité de solide insoluble et au filtrat jaune limpide on ajoute 7 autres gouttes d'HCl concentré.
La solution que l'on refroidit dans un bain de glace se trouble légèrement mais il ne précipite aucun solide. Au chauffage à 300, en grattant la paroi, il commence de précipiter un solide cristallisé jaune clair (en bouquets semblables à des aiguilles). Une fois que le mélange est reste au froid (4o) toute la nuit, on filtre le solide, on le lave avec quelques gouttes de n-butanol et on le sèche sous vide à 100o pendant 3 heures. Poids : 223 mg.
Exemple 2
Préparation de la nitro-6-desoxytetracycline.
On suit le processus de l'exemple 1, sauf que 932 mg (2 m moles) de chlorhydrate de 6-désoxytétracycline (J. A. C. S. 80, 5324,1958), préparé par mise en contact d'une solution de tétracycline dans un solvant polaire avec de l'hydrogène en présence d'acide borique et d'un métal noble catalyseur jusqu'à ce qu'environ 1 mole d'hydrogène ait été absorbée par mole de tétracycline, sont dissous avec agitation dans 50 cc d'acide sulfurique concentré à 0 . A la solution réactionnelle brun foncé on ajoute peu à peu, en agitant, 200 mg (2 m moles) de nitrate de potassium. Après cette addition la couleur de la solution s'est éclaircie en jaune foncé.
On poursuit l'agitation de la solution réactionnelle à Oo pendant environ 5 minutes, puis on la verse peu à peu dans un litre d'éther à 00 en agitant, à une vitesse maintenant la température entre 0 et 10 . Il précipite un solide jaune clair que l'on filtre, lave à l'éther (4 fois 100 cc) et sèche sous vide pendant 2 heures à température ambiante. Poids : 850 mg.
On dissout 500 mg du produit de nitration ci-dessus dans 10 cc d'eau. A la solution brun foncé on ajoute suffisamment d'une solution concentrée de carbonate de sodium pour atteindre un pH de 5,0.
Il précipite un solide jaune biréfringent, que l'on filtre, lave à 1'eau (3 fois 2 cc) et sèche sous vide à 600 pendant 2 heures. Poids 260 mg. Point de fusion, avec carbonisation, 198 .
Analyse : calculée pour C22H23N309. 2H2O (509,4) :
C 51, 9 ; H 5, 34 ; N 8, 25 ; H. 7, 06. Trouvé :
C 52, 18 ; H 5, 15 ; N8, 29 ; li., (perte au sé
chage) 4,41.
Le spectre d'ultraviolet de ce composé, comparé à celui de la 6-désoxytétracycline dans HC1 0,1 N présente un déplacement dans les longueurs d'ondes courtes de 269 mli à 262 myt et dans les longueurs d'ondes longues, de 345myt à 360mlt. Le spectre d'infrarouge présente des bandes d'absorption de groupes nitro à 6,55 li et 7,43 y.
Exemple 3
Prgparation du sulfate de nitro-6-desoxytetracycline.
On prépare une solution de 6-désoxytétracycline en ajoutant lentement 1,00 g (0,0021 mole) de chlorhydrate de 6-désoxytétracycline dans 40 cc d'acide sulfurique concentré, froid. On agite cette solution et on ajoute 216 mg (0,0021 mole) de nitrate de potassium sur une période de 5 min, le ballon étant maintenu dans un bain de glace. On agite la solution pendant 10min et on ajoute 216 mg supplémentaires de nitrate de potassium comme ci-dessus. Après agitation pendant 25 autres minutes, on verse lentement la solution sur 400 g de glace en agitant. On extrait la solution aqueuse résultante par le n-butanol. On lave l'extrait organique à 1'eau et on l'évapore sous vide jusqu'à formation d'un précapité. On recueille ce sulfate (0,75 g). R/= 0,56 (n-butanol : pH 2 ; tampon au phosphate).
Exemple 4
Préparation dit bisulfate d'amino-nitro-6-désoxy-
tétracycline.
A une solution froide de 100 mg de bisulfate d'amino-6-désoxytétracycline dans 4 ce d'acide sulfurique concentré, on ajoute 16 mg de nitrate de potassium, en agitant. On maintient le ballon dans un bain de glace et on agite la solution pendant 5 minutes. Au bout de ce temps on l'ajoute lentement, en agitant, à 100 ce d'éther anhydre froid. On recueille le solide, on le lave à l'éther et on le dissout dans du méthanol anhydre. On filtre cette solution, on l'évapore à petit volume et on ajoute un excès d'éther pour précipiter le bisulfate d'amino-nitro-6-désoxy- tétracycline. On recueille celui-ci et on le lave à l'éther. Poids 65 mg. Rf = 0, 45 (n-butanol : pH 2, tampon au phosphate).
Exemple 5 a) Préparation du sulfate de bromo-nitro-6-démé- thyl-6-désoxytétracycline (somère A).
On dissout 920 mg (2 m moles) de nitro-6-démé- thyl-6-désoxytetracycline (isomère A) dans 20 cc d'H SOI eoneentré à 00. A la solution agitée froide, on ajoute 256 mg (2 m moles) de N-bromosuccinimide. On agite le mélange réactionnel à 0 pendant 30 min. On verse le mélange réactionnel brun foncé froid dans 1,1 litre d'éther agité (à 0 ) à une vitesse maintenant la température au-dessous de 5". Il pré- cipite un fin solide jaune clair que l'on filtre par succion et qu'on lave à l'éther (trois fois 50 cc). On sèche le solide sous vide à température ambiante pendant 2 heures.
Poids 1,27 g. b) Préparation du sulfate de bromo-nitro-6-démé- thyl-6-désoxytétracycline (isomère B).
On dissout 130 mg (0,3 m mole) de nitro-6 déméthyl-6-désoxytétracycline (isomère B) dans 3 cc d'HJSOo concentré à 0O. A la solution on ajoute 59,3 g (0,3 m mole) de N-bromosuccinimide. On laisse la solution au froid (00) sous agitation pendant 45 minutes. On verse la solution réactionnelle brun foncé froide dans 150cc d'éther agité à 00 à une vitesse maintenant la température au-dessous de 5O.
On filtre le solide jaune clair qui précipite on le lave à l'éther froid (3 fois 5 cc) et on le sèche sous vide à 600 pendant une heure. Poids : 170mg.
Exemple 6 Prepctration dit sulfate de bromo-nitro-6-desoxy-
tétracycline.
Une solution de 60, 5 mg (0,1 m mole) de sulfate de bromo-6-désoxytétracycline (préparée par bromuration de la 6-désoxytétracycline dans l'acide sulfurique concentré au moyen d'un équivalent de N-bromosuccinimide) et 10,1 mg (0,1 m mole) nitrate de potassium dans 2,0 ce d'acide sulfurique concentré est agitée à la température du bain de glace pendant 10 minutes. On verse lentement la solution dans 50,0 cc d'éther froid et il se dépose 45 mg de solide.
Ru = 0, 81 (n-butanol : pH 2, tampon au phosphate).
Exemple 7
Préparation du sulfate de bromo-nitro-6-desoxy- 6-déméthyltétracycline.
Une solution de 59,1 mg (0,1 m mole) de sulfate de bromo-6-désoxy-6-déméthyltétracycline (préparée par bromuration de la 6-désoxy-6-déméthyltétracy- cline dans l'acide sulfurique concentré par un équivalent de N-bromosuccinimide) et 10,1 mg (0,1 m mole) de nitrate de potassium dans 2,0cc d'acide sulfurique concentré est conservée au bain de glace pendant 10 minutes. On ajoute lentement le mélange réactionnel à 100 ce d'éther froid. Le solide qui se sépare pèse 54 mg.
Process for the preparation of novel tetracycline derivatives
The present invention relates to the preparation of novel tetracycline derivatives which may be represented by the general formula:
EMI1.1
and their addition salts with acids, formula in which R 1 and R 8 represent H, N6. ,, NHa,
CN or halogen, at least one of Ri and it being an NO group, Rg represents H or (SH3 and R4 represents H or OH.
These new compounds are prepared by acting on a compound of formula I above, where
R and / or R are hydrogen, a nitration agent such as potassium nitrate, preferably in equivalent molar proportions, and a strong mineral acid, for example sulfuric acid, at a temperature which may range from- 15 C to +15 C.
The resulting nitrotetracycline is usually isolated from the reaction mixture as the acid sulfate by precipitation with cold ether. The free base can be obtained by adjusting an aqueous solution of the product to a pH of about 4 to 6 with a mild alkali, eg sodium carbonate.
Nitro-6-deoxytetracycline, nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline or nitro-5-hydroxy-6-deoxytetracycline can thus be prepared, depending on the starting material.
When using 6-demethyl-6-deoxytetracycline as the starting material, it has been found that the resulting nitro product is a mixture which can be separated into two separate compounds by fractional crystallization. For convenience, the latter will be designated by isomer A and by isomer B of nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline.
The isolation of nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline-B from the crude nitration product is accomplished by fractional crystallization. A coarse separation of organic and inorganic compounds is carried out on the crude nitration product precipitated with ether using ethanol as a solvent. The organic product is then separated into two components using the differences in the solubility in methanol of the respective free bases. Nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline-B is isolated in the form of a sulphate crystallized from the methanolic solution and it is purified to form the free base, then the free base is recrystallized in a conventional manner.
The two compounds differ from each other in their spectra and in their activity. The main difference between the ultraviolet spectra of the A and B isomers of nitro 6-demethyl-6-deoxytetracycline is mainly in the long wavelength region.
In 0.1 N HCl, the absorption maxima of nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline-B are at 350 mu while nitro-6-demethyl-6-deoxy-tetracycline-A absorbs at 360 mr. In 0.1 N Na2B407,
nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline-B has a well-defined absorption maximum at 370 mu while nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline-
A has a very broad absorption maximum with a slight top at 350 mll.
The infrared absorption spectrum of nitro 6-demethyl-6-deoxytetracycline-B exhibits nitro absorption bands at 6.54 and 7.46, substantially the same as those of nitro-6-dem-. thyl-6-deoxytetracycline-A. However, the full infrared curve of nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline-B is otherwise different from the infrared curve of nitro-6-demethyl-6-deoxy-tetracycline-A.
The structure of nitro-6-demethyl-6-deoxytetra-cyclin-A and nitro-6-demethyl-6-deoxytetra-cyclin-B has not yet been conclusively demonstrated, but it is believed that both compounds are positional isomers in which the nitro group is attached to the aromatic ring of the tetracycline in the position ortho-to the hydroxyl group in one compound, and in the para-position in the other compound.
The aminotetracyclines can also be nitrated under the conditions specified above to form the mono-substituted nitrotetracycline, in order to obtain the amino-nitro-6-deoxytetracycline. Nitrotetracyclines can also be brominated using the
N-bromo-succinimide for example, to form a di-substituted deoxytetracycline.
The new compounds prepared according to the invention are amphoteric compounds, and therefore the acid addition salts, that is to say the mono and the di-salts (when one can easily prepare them). uses an aminotetracycline).
In general, the preferred acids are mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like, although organic acids such as trichloroacetic acid can also be used. These acid addition salts can be prepared by treating the amphoteric compound with about 2 or more equivalents of the selected acid. Preferably, the tetracycline is suspended in a suitable solvent during the acidification.
The novel tetracyclines prepared according to the invention are biologically active, and have the broad spectrum of antibacterial activity of the already known tetracyclines. The antibacterial spectrum of some of these compounds, representing the amount necessary to inhibit the growth of various typical bacteria, was determined in the conventional manner by the agar dilution technique commonly used for testing new antibiotics. The minimum inhibitory concentrations, expressed as gamma per cc, against various test organisms are reported in the table below. By way of comparison, the antibacterial activity of tetracycline against the same organisms has also been included.
Organism Tetracycline Nitro-6-demethyl-6-
deoxytdtracycline-B
Mycobacterium ranae 1 0.25
Mycobacterium smegma
tis ATCC 607 1 0, 5
Staphylococcus aureus
209P 2 0.5
Sarcina Lutea 1001 2 0.5
Bacillus subtilis
ATCC 6633 0.5 0.25
Streptococcus pyogenes
C203 0.5 0.25
Streptococcus cp Ne 11.250 31
Streptococcus p? 80 250 31
Staphylococcus aureus
NY 104 4 0.5
Bacillus Cereus No 5 0.25 0,
125
Pseudomonas aeruginosa 8 4
Proteus vulgaris 8427 31 1
Escherichia coli
ATCC 9637 8 4
Salmonella gallinarum 8 4
Escherichia coli No 22 4 2
The new tetracycline compounds obtained according to the invention have a considerably higher stability towards acids and alkalis than the parent tetracycline. In addition, aminotetracyclines are much more soluble than the parent compound.
The invention will now be described in more detail with reference to the following specific examples.
Example 1 Preparation of the crude nitration product of 6 demetlayl-6-deoxytetracycline.
To a solution of 900 mg (2 moles) of 6-demethyl-6-deoxytetracycline hydrochloride (J. A. C.
S. 80-5324, 1958) prepared by contacting a solution in a polar solvent of 6-demethyltetracycline (JACS 79,4561,1957) with hydrogen in the presence of boric acid and a noble metal catalyst until about one mole of hydrogen has been absorbed per mole of 6-demethyltetracycline in 50cc of H-, SOX concentrated to 00, 200 mg (2 moles) of KNO are added. The light brown reaction solution was stirred at 0 ° for 20 minutes.
This cold solution is gradually poured into 1 liter of 5o diethyl ether. The addition is carried out at a rate maintaining the temperature of the ether between 5 and 10o. The light yellow solid which precipitated immediately settles gradually in the etheric solution. Most of the solution is decanted and the solid is filtered, washed with cold ether (four times 10 cc) and dried in vacuo at room temperature for 4 hours.
Solid weight: 1.01 g.
200 mg of the above nitration product are dissolved in 5 cc of HO with stirring. The light brown solution (pH 1.3) is adjusted to pH 5.0 with 2N Na 2 CH 3.
It precipitates a brownish yellow solid. This mixture is left under stirring in an ice bath for one hour. The solid is filtered (as free base), washed at H30 (three times 5 cc) and dried under vacuum at 600 for 4 hours. Weight: 80 mg melting point with carbonization 197.
Analysis: calculated for C; ltHalNSO9. H30 (494.4):
C 50.9; H 5.08; N 8.46; H30 7, 26. Found:
C 50, 63; H 4.84; N 8.79; HSO (loss in se
chage) 5.29.
The ultraviolet spectrum of this product is different in character from that of the starting 6-demethyl-6-deoxy-tetracycline. In 0.1 N hydrochloric acid there is a decrease of 5 mu in the short wavelength of absorption to 262 mst while in the long wavelength of absorption there is an increase of 10 mut at 355 m! l. The infrared spectrum, which is also different from that of 6-demethyl-6-deoxytetracycline, shows nitro group absorption bands at 6.56 [c and 7.45 R.
Separation of the crude nitration product into isomers
A and B 6-nitro-demethyl-6-deoxytetra-
cycline.
A suspension of 11.78 g of the nitration product precipitated with the ether of 6-demethyl-6-deoxytetracycline in 500 cc of absolute ethanol is heated to boiling in a water bath. The insoluble material is immediately filtered off, washed with hot absola u ethanol (twice 25 cc), then with ether (three times 50 cc). The solid is dried in air at room temperature. Weight 3.70g. The cloudy ethanolic filtrate and the ethanol washes are combined and evaporated under vacuum to dryness at 30. Weight 8,1 g.
The solid residue from the evaporation of ethanol is diluted in 300 cc of methanol (pH in water 2.5) and then triethylamine is added until a pH of 5.0 is reached ( in Haro); a dark yellow insoluble crystalline solid was filtered off, washed with methanol (2 times 5 cc) and dried under vacuum at 600 for one hour to obtain 2.78 g of nitro 6-demethyl-6-deoxytetracycline-A. The methanolic filtrate and the washings are combined and the pH is added to 1.8 with 6N H3SOA. After cooling the solution in an ice bath, a light yellow crystalline solid (needle-like clumps) begins to precipitate.
The mixture is stirred in an ice bath for 2 hours, then the solid is filtered, washed with ether (5 times 10 cc) and dried under vacuum at 60 for one hour to give 1.8 g of 6-demethyl nitro. -6-deoxytetracycline-B.
Preparation of the free base nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline-B.
500 mg of the 6-nitro-demethyl-6-deoxytetracycline sulfate are stirred in 20 cc of water. A small amount of insoluble solids is filtered through a filter aid on a sintered glass funnel. The clear yellow filtrate (pH 1.7) is adjusted to pH 5.2 with 2N NaCOg. It precipitates a partially crystallized yellow solid. The mixture is heated to about 800 over a steam cone, then cooled in an ice bath. The solid still appears very fine and remains suspended in solution. The suspension is then frozen in a dry ice-methyl cellosolve bath. After freezing for an additional hour, the mixture is allowed to warm to room temperature.
The filtered solid is washed with water (twice 5 cc). The solid is placed under vacuum at room temperature overnight and then dried at 600 for one hour. Weight 284 mg.
Recrystallization of the free base nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline-B.
A mixture of 70 mg of the free base (product of Example 3) is heated in a water bath. A small amount of an insoluble amorphous solid is separated by hot filtration. The filtrate, which became cloudy during filtration, is reheated to a clear solution; on slow cooling to room temperature it precipitates a yellow crystalline solid (in needle-like clumps). The solid is filtered, washed with 1 cc of water and dried under vacuum at 600 for one hour. Weight: 37.2 mg.
A portion of this free base is heated in toluene in a Soxhlet extraction apparatus.
The boiler contains calcium hydride and the yellow toluene solution is refluxed for 4 hours. This procedure is followed in order to remove all water of crystallization from the compound.
A yellow solid is obtained which is heated at 140 for 2 hours under vacuum and then analyzed immediately.
Analysis: calculated for CHN-jOs-0.2 mole to
luene: C 56.2; H 4.70; N 8.84; O 30.3. Find :
C 55.94; H 5.47; N 8.68; O (direct) 29.73.
In 0.1 N HCl the maximum ultraviolet absorption is 350mut. The maximum ultraviolet absorption in 0.1 M NaO is 370 mu. The infrared spectrum shows nitro group absorption bands at 6.54% and 7.46%.
Pt-gparation of 6-nitro-demethyl-6-deoxytetracycline-B hydrochloride.
To a suspension of 250 mg of the free base prepared in Example 4 in 25 cc of n-butanol, 7 drops of concentrated HCl are added. A small amount of insoluble solid is filtered off and to the clear yellow filtrate 7 more drops of concentrated HCl are added.
The solution which is cooled in an ice bath becomes cloudy slightly but it does not precipitate any solid. On heating to 300, scratching the wall, it begins to precipitate a light yellow crystalline solid (in needle-like clumps). Once the mixture has remained cold (4o) overnight, the solid is filtered, washed with a few drops of n-butanol and dried under vacuum at 100o for 3 hours. Weight: 223 mg.
Example 2
Preparation of nitro-6-deoxytetracycline.
The procedure of Example 1 is followed, except that 932 mg (2 moles) of 6-deoxytetracycline hydrochloride (JACS 80, 5324,1958), prepared by contacting a solution of tetracycline in a polar solvent with hydrogen in the presence of boric acid and a noble metal catalyst until about 1 mole of hydrogen has been absorbed per mole of tetracycline, are dissolved with stirring in 50 cc of concentrated sulfuric acid at 0. To the dark brown reaction solution is gradually added, with stirring, 200 mg (2 moles) of potassium nitrate. After this addition the color of the solution lightened to dark yellow.
Stirring of the reaction solution at Oo is continued for about 5 minutes, then it is gradually poured into a liter of 00 ether with stirring, at a speed maintaining the temperature between 0 and 10. It precipitates a light yellow solid which is filtered, washed with ether (4 times 100 cc) and dried under vacuum for 2 hours at room temperature. Weight: 850 mg.
500 mg of the above nitration product are dissolved in 10 cc of water. To the dark brown solution, sufficient concentrated sodium carbonate solution is added to reach a pH of 5.0.
It precipitates a birefringent yellow solid, which is filtered, washed with water (3 times 2 cc) and dried under vacuum at 600 for 2 hours. Weight 260 mg. Melting point, with carbonization, 198.
Analysis: calculated for C22H23N3O9. 2H2O (509.4):
C 51.9; H 5.34; N 8, 25; H. 7, 06. Found:
C 52,18; H 5.15; N8, 29; li., (loss in se
chage) 4.41.
The ultraviolet spectrum of this compound, compared to that of 6-deoxytetracycline in 0.1 N HCl shows a shift in short wavelengths from 269 mli to 262 myt and in long wavelengths from 345 myt at 360mlt. The infrared spectrum shows absorption bands of nitro groups at 6.55 µl and 7.43 µm.
Example 3
Preparation of nitro-6-deoxytetracycline sulfate.
A 6-deoxytetracycline solution is prepared by slowly adding 1.00 g (0.0021 mol) of 6-deoxytetracycline hydrochloride in 40 cc of cold concentrated sulfuric acid. This solution was stirred and 216 mg (0.0021 mol) of potassium nitrate was added over a period of 5 min, the flask being kept in an ice bath. The solution is stirred for 10 min and an additional 216 mg of potassium nitrate is added as above. After stirring for another 25 minutes, the solution is slowly poured onto 400 g of ice with stirring. The resulting aqueous solution is extracted with n-butanol. The organic extract is washed with water and evaporated in vacuo until a precapitate is formed. This sulfate (0.75 g) is collected. R / = 0.56 (n-butanol: pH 2; phosphate buffer).
Example 4
Preparation known as amino-nitro-6-deoxy- bisulfate
tetracycline.
To a cold solution of 100 mg of 6-amino-deoxytetracycline bisulfate in 4 cc of concentrated sulfuric acid is added 16 mg of potassium nitrate, with stirring. The flask is kept in an ice bath and the solution is stirred for 5 minutes. At the end of this time it is added slowly, with stirring, to 100 cc of cold anhydrous ether. The solid is collected, washed with ether and dissolved in anhydrous methanol. This solution is filtered, evaporated to a small volume and an excess of ether is added to precipitate the amino-nitro-6-deoxy-tetracycline bisulfate. This is collected and washed with ether. Weight 65 mg. Rf = 0.45 (n-butanol: pH 2, phosphate buffer).
Example 5 a) Preparation of bromo-nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline sulfate (somer A).
920 mg (2 m moles) of nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline (isomer A) are dissolved in 20 cc of H SOI entered at 00. To the cold stirred solution, 256 mg (2 m moles are added. ) of N-bromosuccinimide. The reaction mixture is stirred at 0 for 30 min. The cold dark brown reaction mixture is poured into 1.1 liter of stirred (0) ether at a rate maintaining the temperature below 5 ". It precipitates a fine light yellow solid which is filtered off with suction. and washed with ether (three times 50 cc) The solid is dried under vacuum at room temperature for 2 hours.
Weight 1.27 g. b) Preparation of bromo-nitro-6-demethyl-6-deoxytetracycline sulfate (isomer B).
130 mg (0.3 mole) of 6-nitro-demethyl-6-deoxytetracycline (isomer B) are dissolved in 3 cc of HJSOo concentrated to 0O. To the solution is added 59.3 g (0.3 mole) of N-bromosuccinimide. The solution is left in the cold (00) with stirring for 45 minutes. The cold dark brown reaction solution is poured into 150 cc of ether stirred at 00 at a rate maintaining the temperature below 50.
The light yellow solid which precipitates is filtered off, washed with cold ether (3 times 5 cc) and dried under vacuum at 600 for one hour. Weight: 170mg.
Example 6 Prepctration known as bromo-nitro-6-deoxy- sulfate
tetracycline.
A solution of 60.5 mg (0.1 mole) of bromo-6-deoxytetracycline sulfate (prepared by bromination of 6-deoxytetracycline in concentrated sulfuric acid using one equivalent of N-bromosuccinimide) and 10 , 1 mg (0.1 mole) potassium nitrate in 2.0 cc of concentrated sulfuric acid is stirred at the temperature of the ice bath for 10 minutes. The solution is slowly poured into 50.0 cc of cold ether and 45 mg of solid are deposited.
Ru = 0.81 (n-butanol: pH 2, phosphate buffer).
Example 7
Preparation of bromo-nitro-6-deoxy-6-demethyltetracycline sulfate.
A solution of 59.1 mg (0.1 mole) of bromo-6-deoxy-6-demethyltetracycline sulfate (prepared by bromination of 6-deoxy-6-demethyltetracycline in concentrated sulfuric acid with one equivalent of N-bromosuccinimide) and 10.1 mg (0.1 m mole) of potassium nitrate in 2.0 cc of concentrated sulfuric acid is kept in an ice bath for 10 minutes. The reaction mixture is slowly added to 100 cc of cold ether. The solid which separates weighs 54 mg.