Procédé de préparation de nouveaux dérivés de la tétracycline
La présente invention concerne la préparation de nouveaux dérivés de la tétracycline pouvant tre représentés par la formule générale :
EMI1.1
et de leurs sels d'addition avec des acides, formule dans laquelle Ri et Rg représentent H, Nô.,, NHa,
CN ou un halogène, l'un au moins des Ri et il étant un groupe NO, Rg représente H ou (SH3 et R4 représente H ou OH.
Ces nouveaux composés sont préparés en faisant agir sur un composé de la formule I ci-dessus, où
R et/ou R sont de l'hydrogène, un agent de nitration tel que le nitrate de potassium, de préférence en proportions molaires équivalentes, et un acide minéral fort, par exemple l'acide sulfurique, à une température qui peut aller de-15 C à +15 C.
On isole habituellement la nitrotétracycline résul- tante du mélange réactionnel sous forme du sulfate acide par précipitation par l'éther froid. On peut obtenir la base libre en ajustant une solution aqueuse du produit à un pH d'environ 4 à 6 par un alcali doux, à savoir par exemple le carbonate de sodium.
On peut préparer ainsi les nitro-6-désoxytétracycline, nitro-6-déméthyl-6-désoxytétracycline ou nitro-5 hydroxy-6-désoxytétracycline, selon la matière de départ.
Quand on emploie comme matière de départ la 6-déméthyl-6-désoxytétracycline, on a trouvé que le produit nitré résultant est un mélange que l'on peut séparer en deux composés distincts par cristallisation fractionnée. Par commodité, on désignera ces derniers par isomère A et par isomère B de la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétracycline.
On réalise l'isolement de la nitro-6-déméthyl-6- désoxytétracycline-B du produit de nitration brut par cristallisation fractionnée. On réalise une séparation grossière des composés organiques et minéraux sur le produit de nitration brut précipité à l'éther en utilisant l'éthanol comme solvant. On sépare ensuite le produit organique en deux composants en utilisant les différences de solubilité dans le méthanol des bases libres respectives. On isole la nitro-6- déméthyl-6-désoxytétracycline-B sous forme d'un sulfate cristallisé dans la solution méthanolique et on la purifie en formant la base libre, puis on recristallise la base libre de façon classique.
Les deux composés diffèrent l'un de l'autre par leurs spectres et par leur activité. La principale différence entre les spectres d'ultraviolet des isomères A et B de la nitro 6-déméthyl-6-désoxytétracycline réside principalement dans la région de longueurs d'onde longues.
Dans l'HCl 0,1 N, les maxima d'absorption de la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétracycline-B sont à 350 mu tandis que la nitro-6-déméthyl-6-désoxy- tétracycline-A absorbe à 360 m. Dans Na2B407 0,1 N,
la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétracycline-B a un maximum d'absorption bien défini à 370 mu tandis que la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétracycline-
A a un maximum d'absorption très large avec un léger sommet à 350 mll.
Le spectre d'absorption d'infrarouge de la nitro 6-déméthyl-6-désoxytétracycline-B présente des bandes d'absorption nitro à 6,54 et à 7,46, sensiblement les mmes que celles de la nitro-6-démé- thyl-6-désoxytétracycline-A. Cependant, la courbe complète d'infrarouge de la nitro-6-déméthyl-6- désoxytétracycline-B est par ailleurs différente de la courbe d'infrarouge de la nitro-6-déméthyl-6-désoxy- tétracycline-A.
On n'a pas encore démontre de façon irréfutable la structure de la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétra- cycline-A et de la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétra- cycline-B mais on croit que les deux composés sont des isomères de position dans lesquels le groupe nitro est fixé sur le noyau aromatique de la tétracycline en position ortho-par rapport au groupe hydroxyle dans un composé, et en position para-dans l'autre composé.
On peut également nitrer les aminotétracyclines dans les conditions spécifiées ci-dessus pour former la nitrotétracycline mono-substituée, en vue d'obtenir 1'amino-nitro-6-désoxytétracycline. On peut également bromer les nitrotétracyclines en utilisant la
N-bromo-succinimide par exemple, pour former une désoxytétracycline di-substituée.
Les nouveaux composés préparés selon l'inven- tion sont des composés amphotères, et par suite on peut facilement en préparer les sels d'addition d'acide, c'est-à-dire les mono-et les di-sels (quand on utilise une aminotétracycline).
En général, les acides préférés sont les acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique et analogues, bien qu'on puisse également utiliser des acides organiques tels que 1'acide trichloracétique. On peut préparer ces sels d'addition d'acide en traitant le composé amphotère avec environ 2 équivalents ou plus de l'acide choisi. De préférence, on met en suspension la tétracycline dans un solvant convenable pendant l'acidification.
Les nouvelles tétracyclines préparées selon l'in- vention sont biologiquement actives, et ont le large spectre d'activité antibactérienne des tétracyclines déjà connues. Le spectre antibactérien de certains de ces composés, représentant la quantité nécessaire pour inhiber la croissance de diverses bactéries typiques, a été déterminé de la façon classique par la technique de dilution sur agar communément utilisée pour l'essai des nouveaux antibiotiques. Les concentrations inhibitrices minimums, exprimées en gamma par cc, vis-à-vis de divers organismes d'essai sont reportés dans le tableau ci-dessous. A titre comparatif, on y a également inclu l'activité antibactérienne de la tétracycline contre les mmes organismes.
Organisme Tétracycline Nitro-6-demethyl-6-
desoxytdtracycline-B
Mycobacterium ranae 1 0,25
Mycobacterium smegma
tis ATCC 607 1 0, 5
Staphylococcus aureus
209P 2 0,5
Sarcina Lutea 1001 2 0,5
Bacillus subtilis
ATCC 6633 0,5 0,25
Streptococcus pyogenes
C203 0, 5 0,25
Streptococcus cp Ne 11. 250 31
Streptococcus p ? 80 250 31
Staphylococcus aureus
NY 104 4 0,5
Bacillus Cereus No 5 0,25 0,
125
Pseudomonas aeruginosa 8 4
Proteus vulgaris 8427 31 1
Escherichia coli
ATCC 9637 8 4
Salmonella gallinarum 8 4
Escherichia coli No 22 4 2
Les nouveaux composés de la tétracycline obtenus selon l'invention ont une stabilité considérablement plus élevée vis-à-vis des acides et des alcalis que la tétracycline parente. De plus, les aminotétracyclines sont beaucoup plus solubles que le composé parent.
L'invention sera décrite maintenant plus en détail en référence aux exemples particuliers suivants.
Exemple 1 PrcparaoM du produit de nitration brut de la 6 demetlayl-6-desoxytetracycline.
A une solution de 900 mg (2 m moles) de chlorhydrate de 6-déméthyl-6-désoxytétracycline (J. A. C.
S. 80-5324, 1958) préparé par mise en contact d'une solution dans un solvant polaire de 6-déméthyltétracycline (J. A. C. S. 79,4561,1957) avec de l'hydrogène en présence d'acide borique et d'un métal noble catalyseur jusqu'à ce qu'environ une mole d'hydrogène ait été absorbée par mole de 6-démé thyltétracycline dans 50cc d'H-, SOX concentré à 00, on ajoute 200 mg (2 m moles) de KNO. On agite la solution réactionnelle brun clair à 0"pendant 20 minutes.
On verse graduellement cette solution froide dans 1 litre d'éther diéthylique à 5o. L'addition est effectuée à une vitesse maintenant la température de l'éther entre 5 et 10o. Le solide jaune clair qui a précipité immédiatement, se dépose graduellement dans la solution éthérique. On décante la plus grande partie de la solution et on filtre le solide, on le lave à l'éther froid (quatre fois 10 cc) et on le sèche sous vide à température ambiante pendant 4 heures.
Poids de solide : 1,01 g.
On dissout 200 mg du produit de nitration ci-dessus dans 5 cc de HO en agitant. On ajuste la solu tion brun clair (pH 1,3) à pH 5,0 avec Na,, CH3 2N.
Il précipite un solide jaune brunâtre. On laisse ce mélange sous agitation dans un bain de glace pendant une heure. On filtre le solide (en tant que base libre), on le lave à H30 (trois fois 5 cc) et on le sèche sous vide à 600 pendant 4 heures. Poids : 80 mg point de fusion avec carbonisation 197 .
Analyse : calculée pour C ; ltHalNSO9. H30 (494,4) :
C 50,9 ; H 5,08 ; N 8,46 ; H30 7, 26. Trouvé :
C 50, 63 ; H 4, 84 ; N 8,79 ; HSO (perte au sé
chage) 5,29.
Le spectre d'ultraviolet de ce produit est de caractère différent de celui de la 6-déméthyl-6-désoxy- tétracycline de départ. Dans l'acide chlorhydrique 0,1 N il y a une diminution de 5 mu de la longueur d'onde courte d'absorption à 262 mst tandis que dans la longueur d'onde longue d'absorption il y a une augmentation de 10 mut à 355 m ! l. Le spectre d'infrarouge, qui est également différent de celui de la 6 déméthyl-6-désoxytétracycline, présente des bandes d'absorption de groupe nitro à 6,56 [c et 7,45 R.
Séparation du produit de nitration brut en isomères
A et B de la nitro-6-déméthyl-6-désoxytétra-
cycline.
On chauffe à ébullition au bain-marie une suspension de 11,78 g du produit de nitration précipité à l'éther de la 6-déméthyl-6-désoxytétracycline dans 500 cc d'éthanol absolu. On filtre immédiatement la matière insoluble, on la lave à l'éthanol absola u chaud (deux fois 25 cc), puis à l'éther (trois fois 50 cc). On sèche le solide à l'air à température ambiante. Poids 3,70g. On réunit le filtrat éthanolique trouble et les lavages à l'éthanol et on les évapore sous vide à sec, à 30 . Poids 8,1 g.
On délaye le résidu solide de l'évaporation d'étha- nol dans 300 cc de méthanol (pH dans 1'eau 2,5) puis on ajoute de la triéthylamine jusqu'à ce qu'on atteigne un pH de 5,0 (dans Haro) ; on filtre un solide cristallisé insoluble jaune foncé, on le lave au méthanol (2 fois 5 cc) et on le sèche sous vide à 600 pendant une heure pour obtenir 2,78 g de nitro 6-déméthyl-6-désoxytétracycline-A. On réunit le filtrat méthanolique et les lavages et on ajoute le pH à 1,8 avec H3SOA 6N. Après refroidissement de la solution dans un bain de glace, un solide cristallisé jaune clair (bouquets semblables à des aiguilles) commence à précipiter.
On agite le mélange dans un bain de glace pendant 2 heures, puis le solide est filtré, lavé à l'éther (5 fois 10 cc) et séché sous vide à 60 pendant une heure pour donner 1,8 g de nitro 6-déméthyl-6-désoxytétracycline-B.
Préparation de la base libre nitro-6-demethyl-6- desoxytetracycline-B.
On agite 500 mg du sulfate de la nitro-6-démé- thyl-6-désoxytétracycline dans 20 cc d'eau. On filtre une petite quantité de solides insolubles à travers un adjuvant de filtration sur un entonnoir en verre fritte. On ajuste le filtrat jaune limpide (pH 1,7) à pH 5,2 avec NaCOg 2N. Il précipite un solide jaune partiellement cristallisé. On chauffe le mélange à environ 800 sur un cône de vapeur, puis on le refroidit au bain de glace. Le solide apparaît encore très fin et reste suspendu en solution. On congèle alors la suspension dans un bain glace sèche-méthyl cellosolve. Après maintien de la congélation pendant une heure encore, on laisse le mélange se réchauffer à température ambiante.
On lave le solide filtré à 1'eau (deux fois 5 cc). On place le solide sous vide à température ambiante jusqu'au lendemain puis on le sèche à 600 pendant une heure. Poids 284 mg.
Recristallisation de la base libre nitro-6-demethyl- 6-désoxytétracycline-B.
On chauffe au bain-marie un mélange de 70 mg de la base libre (produit de 1'exemple 3). On sépare par filtration à chaud une petite quantité d'un solide amorphe insoluble. Le filtrat, qui est devenu trouble pendant la filtration, est rechauffé en une solution limpide ; par refroidissement lent à la température ambiante il précipite un solide cristallisé jaune (en bouquets analogues à des aiguilles). On filtre le solide, on le lave avec 1 cc d'eau et on le sèche sous vide à 600 pendant une heure. Poids : 37,2 mg.
On chauffe une portion de cette base libre dans du toluène dans un appareillage d'extraction Soxhlet.
Le bouilleur contient de l'hydrure de calcium et on soumet au reflux pendant 4 heures la solution toluénique jaune. On suit ce processus en vue d'éli- miner toute 1'eau de cristallisation du composé.
On obtient un solide jaune que l'on chauffe à 140 pendant 2 heures sous vide puis que l'on analyse immédiatement.
Analyse : calculée pour CHN-jOs-0, 2 mole to
luène : C 56,2 ; H 4,70 ; N 8,84 ; O 30,3. Trouvé :
C 55,94 ; H 5,47 ; N 8,68 ; O (direct) 29,73.
Dans HCI 0,1 N l'absorption maximum d'ultraviolet est à 350mut. Dans NaO 0, 1 M l'absorp- tion maximum d'ultraviolet est à 370 mu. Le spectre d'infrarouge présente des bandes d'absorption de groupe nitro à 6,54 zut et 7,46 > .
Pt-gparation du chlorhydrate de nitro-6-demethyl-6- d ésoxytétracycline-B.
A une suspension de 250 mg de la base libre préparée à 1'exemple 4 dans 25 cc de n-butanol on ajoute 7 gouttes de HC1 concentré. On filtre une petite quantité de solide insoluble et au filtrat jaune limpide on ajoute 7 autres gouttes d'HCl concentré.
La solution que l'on refroidit dans un bain de glace se trouble légèrement mais il ne précipite aucun solide. Au chauffage à 300, en grattant la paroi, il commence de précipiter un solide cristallisé jaune clair (en bouquets semblables à des aiguilles). Une fois que le mélange est reste au froid (4o) toute la nuit, on filtre le solide, on le lave avec quelques gouttes de n-butanol et on le sèche sous vide à 100o pendant 3 heures. Poids : 223 mg.
Exemple 2
Préparation de la nitro-6-desoxytetracycline.
On suit le processus de l'exemple 1, sauf que 932 mg (2 m moles) de chlorhydrate de 6-désoxytétracycline (J. A. C. S. 80, 5324,1958), préparé par mise en contact d'une solution de tétracycline dans un solvant polaire avec de l'hydrogène en présence d'acide borique et d'un métal noble catalyseur jusqu'à ce qu'environ 1 mole d'hydrogène ait été absorbée par mole de tétracycline, sont dissous avec agitation dans 50 cc d'acide sulfurique concentré à 0 . A la solution réactionnelle brun foncé on ajoute peu à peu, en agitant, 200 mg (2 m moles) de nitrate de potassium. Après cette addition la couleur de la solution s'est éclaircie en jaune foncé.
On poursuit l'agitation de la solution réactionnelle à Oo pendant environ 5 minutes, puis on la verse peu à peu dans un litre d'éther à 00 en agitant, à une vitesse maintenant la température entre 0 et 10 . Il précipite un solide jaune clair que l'on filtre, lave à l'éther (4 fois 100 cc) et sèche sous vide pendant 2 heures à température ambiante. Poids : 850 mg.
On dissout 500 mg du produit de nitration ci-dessus dans 10 cc d'eau. A la solution brun foncé on ajoute suffisamment d'une solution concentrée de carbonate de sodium pour atteindre un pH de 5,0.
Il précipite un solide jaune biréfringent, que l'on filtre, lave à 1'eau (3 fois 2 cc) et sèche sous vide à 600 pendant 2 heures. Poids 260 mg. Point de fusion, avec carbonisation, 198 .
Analyse : calculée pour C22H23N309. 2H2O (509,4) :
C 51, 9 ; H 5, 34 ; N 8, 25 ; H. 7, 06. Trouvé :
C 52, 18 ; H 5, 15 ; N8, 29 ; li., (perte au sé
chage) 4,41.
Le spectre d'ultraviolet de ce composé, comparé à celui de la 6-désoxytétracycline dans HC1 0,1 N présente un déplacement dans les longueurs d'ondes courtes de 269 mli à 262 myt et dans les longueurs d'ondes longues, de 345myt à 360mlt. Le spectre d'infrarouge présente des bandes d'absorption de groupes nitro à 6,55 li et 7,43 y.
Exemple 3
Prgparation du sulfate de nitro-6-desoxytetracycline.
On prépare une solution de 6-désoxytétracycline en ajoutant lentement 1,00 g (0,0021 mole) de chlorhydrate de 6-désoxytétracycline dans 40 cc d'acide sulfurique concentré, froid. On agite cette solution et on ajoute 216 mg (0,0021 mole) de nitrate de potassium sur une période de 5 min, le ballon étant maintenu dans un bain de glace. On agite la solution pendant 10min et on ajoute 216 mg supplémentaires de nitrate de potassium comme ci-dessus. Après agitation pendant 25 autres minutes, on verse lentement la solution sur 400 g de glace en agitant. On extrait la solution aqueuse résultante par le n-butanol. On lave l'extrait organique à 1'eau et on l'évapore sous vide jusqu'à formation d'un précapité. On recueille ce sulfate (0,75 g). R/= 0,56 (n-butanol : pH 2 ; tampon au phosphate).
Exemple 4
Préparation dit bisulfate d'amino-nitro-6-désoxy-
tétracycline.
A une solution froide de 100 mg de bisulfate d'amino-6-désoxytétracycline dans 4 ce d'acide sulfurique concentré, on ajoute 16 mg de nitrate de potassium, en agitant. On maintient le ballon dans un bain de glace et on agite la solution pendant 5 minutes. Au bout de ce temps on l'ajoute lentement, en agitant, à 100 ce d'éther anhydre froid. On recueille le solide, on le lave à l'éther et on le dissout dans du méthanol anhydre. On filtre cette solution, on l'évapore à petit volume et on ajoute un excès d'éther pour précipiter le bisulfate d'amino-nitro-6-désoxy- tétracycline. On recueille celui-ci et on le lave à l'éther. Poids 65 mg. Rf = 0, 45 (n-butanol : pH 2, tampon au phosphate).
Exemple 5 a) Préparation du sulfate de bromo-nitro-6-démé- thyl-6-désoxytétracycline (somère A).
On dissout 920 mg (2 m moles) de nitro-6-démé- thyl-6-désoxytetracycline (isomère A) dans 20 cc d'H SOI eoneentré à 00. A la solution agitée froide, on ajoute 256 mg (2 m moles) de N-bromosuccinimide. On agite le mélange réactionnel à 0 pendant 30 min. On verse le mélange réactionnel brun foncé froid dans 1,1 litre d'éther agité (à 0 ) à une vitesse maintenant la température au-dessous de 5". Il pré- cipite un fin solide jaune clair que l'on filtre par succion et qu'on lave à l'éther (trois fois 50 cc). On sèche le solide sous vide à température ambiante pendant 2 heures.
Poids 1,27 g. b) Préparation du sulfate de bromo-nitro-6-démé- thyl-6-désoxytétracycline (isomère B).
On dissout 130 mg (0,3 m mole) de nitro-6 déméthyl-6-désoxytétracycline (isomère B) dans 3 cc d'HJSOo concentré à 0O. A la solution on ajoute 59,3 g (0,3 m mole) de N-bromosuccinimide. On laisse la solution au froid (00) sous agitation pendant 45 minutes. On verse la solution réactionnelle brun foncé froide dans 150cc d'éther agité à 00 à une vitesse maintenant la température au-dessous de 5O.
On filtre le solide jaune clair qui précipite on le lave à l'éther froid (3 fois 5 cc) et on le sèche sous vide à 600 pendant une heure. Poids : 170mg.
Exemple 6 Prepctration dit sulfate de bromo-nitro-6-desoxy-
tétracycline.
Une solution de 60, 5 mg (0,1 m mole) de sulfate de bromo-6-désoxytétracycline (préparée par bromuration de la 6-désoxytétracycline dans l'acide sulfurique concentré au moyen d'un équivalent de N-bromosuccinimide) et 10,1 mg (0,1 m mole) nitrate de potassium dans 2,0 ce d'acide sulfurique concentré est agitée à la température du bain de glace pendant 10 minutes. On verse lentement la solution dans 50,0 cc d'éther froid et il se dépose 45 mg de solide.
Ru = 0, 81 (n-butanol : pH 2, tampon au phosphate).
Exemple 7
Préparation du sulfate de bromo-nitro-6-desoxy- 6-déméthyltétracycline.
Une solution de 59,1 mg (0,1 m mole) de sulfate de bromo-6-désoxy-6-déméthyltétracycline (préparée par bromuration de la 6-désoxy-6-déméthyltétracy- cline dans l'acide sulfurique concentré par un équivalent de N-bromosuccinimide) et 10,1 mg (0,1 m mole) de nitrate de potassium dans 2,0cc d'acide sulfurique concentré est conservée au bain de glace pendant 10 minutes. On ajoute lentement le mélange réactionnel à 100 ce d'éther froid. Le solide qui se sépare pèse 54 mg.