Procédé de préparation de la cystine On connaît l'importance de la cystéine et du chlorhydrate de cystéine. On sait également que la cystéine, en raison notamment de sa grande solubilité, présente de sérieuses difficultés d'isolement et que, pour la préparer par une voie synthétique, il est recommandé d'effectuer d'abord la synthèse de la cystine puis de réduire ce composé disulfuré.
La synthèse de la cystine et celle de la cystéine ont fait l'objet de nombreux travaux. Wood et du Vigneaud (J. Biol. Chem. 1939, 131, 267-271) ont condensé le phtalimido malomate sodé avec le benzyl thio chloro-méthane suivant la réaction
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Par hydrolyse et décarboxylation de ce composé sul furé,
on obtient le dérivé S-benzylique <B>de</B> la cystéine que l'on réduit ensuite dans l'ammoniac liquide avec l'aide de sodium pour obtenir de la cystéine qui, oxydée, donne de la cystine.
On a proposé également (Crawhall et Elliolt, J. J. Chem. Soc. 1951, p. 2071 à 2077) de fixer un groupe hydroxy-méthylique sur le thio-benzamido malonate d'éthyle
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puis de déshydrater le composé méthylolé en thi- azoline
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que l'on transforme ensuite en cystéine.
Nadeau et Gaud'ry (Car. J. Research, 1949, 27, 421) ont appliqué au cas de la cystéine la méthode de synthèse des acides a-aminés décrite par Bücherer (J. Prakt. Chem. 1934, 140, 291 et 141, 5) ;
à partir de l'acétal diéthylique de la benzyl thio acétaldéhyde, ils ont préparé la benzyl thio méthyl hydantone dont l'hydrolyse fournit la S-benzyl cystéine.
Atkinson, Poppeldorf et Williams (J. Chem. Soc. 1953, p. 580) ont préparé la S-benzyl cystéine à partir de l'acétamido malonate d'éthyle par une méthode compliquée, comprenant la préparation de l'acétamido diméthyl-amino-méthyl malonate d'éthyle (par action de la formaldéhyde et de la diméthyl- amine),
la transformation de ce composé tertio aminé en iodo-méthylate, la réaction de l'iodo- méthylate avec du benzyl thiolate de sodium pour obtenir l'acétamida benzyl-thio-méthyl malonate d'éthyle qui, décarboxylé, fournit la S-benzyl cystéine.
Pour mémoire on citera les synthèses à partir de la série décrite par Erlenmeyer (Berichte Ber deutsch. Chem. Ges. 1903, 36, 2720 et Ann. 337, 236), par Fry (J. Org. Chem. 1950, 15, 438) et par Crawhall et Elliolt (J. Chem. Soc. 195l, p.
2071) et les synthèses à partir du chloracrylonitrile (Gun- dermann, Angew. Chem. 1952, 64, 594 et Ann. 1952, 578, 45) à partir du chloracrylate de méthyle (Behringer et P. Zillikens, Ann. 1951, 574, 140), à partir de l'acide a-acétamido-acrylique (Schürbel et Wagner, Naturwiss. 1947, 34, 189 et Farlow J.
Biol. Chem. 1948, 176, 71) à partir des oxazolones (C. R. Acad. Sci. 240, 1955, 208-210) et à partir de l'acide a-acétamido acrylique, avec passage par le N-benzyl thio-carbonylamino malonate d'éthyle (Arnstein et Crawhall, J. 1953, 55, 2, 180-185).
La plupart de ces synthèses conduisent à la S benzyl-cystéine et l'on est ainsi ramené au problème qu'ont résolu Wood et du Vigneaud. Or la réduction appliquée par ces auteurs, c'est-à-dire la réduction par le sodium et l'ammoniac liquide est un procédé de laboratoire qu'il n'est pas possible de transposer économiquement à l'échelle industrielle.
Or, la titulaire a trouvé qu'il était possible d'obte nir aisément et avec un bon rendement un mélange de dl-cystine et de mésocystine en préparant d'abord un Bisulfure de bis-(a-amino-a, a-di-carbalcoxy- éthyle) à groupements d'amine libres ou bloqués et en soumettant ce Bisulfure à une hydrolyse décar- boxylante suivant une des méthodes connues.
On peut, en particulier, préparer initialement un Bisulfure de bis-(a-acylamido-a, a-di-carbalcoxy- éthyle), en particulier du Bisulfure de bis-(a-acét- amido-a, a-dicarbéthoxy-éthyle)
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en condensant, dans la proportion moléculaire 2 :
1, un dérivé sodique ou potassique d'un acylamido malonate d'alcoyle, en particulier celui de l'acétyl- amido malonate d'éthyle, avec un Bisulfure de bis- halogéno-méthyle, en particulier le Bisulfure de bis- chlorométhyle, en milieu organique anhydre, de pré férence en milieu benzénique ou toluénique.
Le Bisulfure obtenu se présente vraisemblable ment en mélange avec des produits d'hydrolyse par tielle, notamment le bisulfure de bis-(a-acétamido- a-carboxy-carbéthoxy-éthyle)
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et le composé aza-lactonisé
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lorsqu'on part d'acétylamido malonate d'éthyle.
On a trouvé que, pour préparer la cystine, il n'était pas nécessaire de chercher à séparer le Bisul- fure de bis-(a-acétamido-a, (x-di-carbéthoxy-éthyle) des produits de son hydrolyse partielle qui peuvent l'accompagner. On peut très bien utiliser, et il y a par conséquent avantage à utiliser, comme matière première, le produit brut de la réaction de conden sation définie ci-dessus, après l'avoir simplement sé paré du milieu organique dans lequel il a pris nais sance.
Il suffit, par exemple, de chasser la majeure partie du benzène par distillation sous la pression ordinaire et les dernières traces par distillation, sous vide, après quoi on peut effectuer l'hydrolyse décar- boxylante dans le récipient de distillation même.
Pour transformer le bisulfure ou le mélange de bisulfures défini ci-dessus en cystine, avec sépara tion d'alcool et d'anhydride carbonique et déblocage des groupements aminés, on peut le traiter par de l'acide chlorhydrique dilué à l'ébullition. Pour séparer la cystine formée, il suffit de neutraliser le produit brut de la réaction, après l'avoir filtré, puis isoler le précipité et le purifier.
On recueille ainsi de la cystine optiquement inac tive, accompagnée de son isomère la mésocystine. Si on le désire, on peut les séparer l'une de l'autre, par exemple par application de la méthode décrite par Loring et du Vigneaud (J. Biol. Chem. 1933, 102, 287).
Le procédé décrit ci-dessus offre l'avantage de permettre la préparation de la cystine d'une façon très simple et quantitative sans impliquer de traite ment qui soit prohibitif à l'échelle industrielle. Lors qu'on part d'acétamido malonate d'éthyle sodé et de bisulfure de bis-chlorométhyle, le rendement en cys- tine, rapporté à ce bisulfure est généralement de 70 à 75 %.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation de la cystine, caractérisé en ce qu'on soumet un Bisulfure de bis-(a-amino- ou a-acylamino- a, a-dicarbalcoxy-éthyle) à une hydrolyse décarboxy- lante.
Parmi les disulfures de bis-(a-acylamido-u, a- dicarbalcoxy-éthyle, les. disulfures de bis-(a-form- amido-a, a-dicarbalcoxy-éthyle), plus spécialement le disulfure de bis-(a-formamido-a, (x-dicarbéthoxy- éthyle) et le disulfure de bis-(a-acétamido-a, a-di- carbéthoxy-éthyle),
conviennent particulièrement bien comme matières premières pour la synthèse de la cystine, car leur hydrolyse décarboxylante s'accom- plit beaucoup plus rapidement, en l'espèce en quel ques heures, que celles de divers autres disulfures à groupes aminés amidifiés, pour lesquels elle demande plusieurs jours.
Pour faire la synthèse de la cystine, il y a avan tage à préparer un disulfure de bis-(a-acylamido-a, a-dicarbalcoxy-éthyle) ou un disulfure de bis-(a- amino-a, a-dicarbalcoxy-éthyle), de préférence le Bi- sulfure de bis-(a-formamido-a, a-dicarbéthoxy-éthyle) en milieu éthanolique absolu, à chasser ensuite l'étha nol par distillation,
et à effectuer en milieu acide selon les techniques connues l'hydrolyse décarboxy- lante du résidu de la distillation ; pour exécuter cette hydrolyse, on peut, d'une façon générale, utiliser un acide fort à l'état dilué (solution aqueuse ayant un titre compris entre 5 à 30 "/o), et faire bouillir le résidu de distillation avec cet acide ;
on utilise de préférence de l'acide chlorhydrique à un titre de l'ordre de 25 ')/o. On a remarqué qu'en ajoutant à un tel acide de l'acide acétique en moindre propor tion, de préférence de l'ordre de 5 à 50 %, par rap- port à la solution d'acide à 25 %, on accélérait con- sidérablement la vitesse de décarboxylation,
appa remment grâce à l'action solubilisante de l'acide acé tique à l'égard du Bisulfure soumis à l'hydrolyse ; si en revanche on ajoute plus de 70 % d'acide acétique la décarboxylation n'est plus favorisée et est plutôt freinée.
La proportion optimum d'acide acétique à ajouter peut être dans chaque cas déterminée par des essais ; ainsi les proportions les meilleures (par rap port à l'acide chlorhydrique à 25 0/0) sont d'environ 5 à 15 % pour le composé formiamidé,
20 à 30 0/0 pour le composé benzamidé et 30 à 50 % pour le composé phtalimidé. Au lieu d'acide acétique, on peut aussi utiliser du dioxane qui offre toutefois l'in convénient d'être plus coûteux.
L'intérêt de soumettre sans purification à l'hydro lyse le produit intermédiaire de la réaction dans l'éthanol découle à la fois de ce que les opérations se trouvent ainsi simplifiées et les pertes évitées et de ce que, dans les liqueurs mères de cristallisation des produits intermédiaires, on trouve souvent des sirops incristallisables qui néanmoins se révèlent capables de fournir de la cystine par hydrolyse décarboxylante.
Lorsqu'on travaille ainsi sans isolement du pro duit intermédiaire à l'état pur, on peut produire de la cystine avec un rendement de l'ordre de 80 à 85 0/0.
Dans les exemples suivants, tous les points de fusion sont mesurés au tube de Thiele. <I>Exemple 1</I> On utilise du disulfure de bis-chlorométhyle (CICH2-S-S-CH2Cl) pur, préparé et purifié, par exemple, selon. les indications de Davies et Hambly, Australian J. Chem. 1953, 6, 152-155 ; ce disulfure doit avoir été rectifié sous vide dans une colonne de grande hauteur (par exemple une colonne de Vigreux de 1,20 m), afin d'être très pur.
L'acétamido malonate d'éthyle sodé peut être pré paré par l'action - du sodium sur de l'acétamido malonate d'éthyle dans du xylène, ce qui est lent et peu pratique.
Le mode de préparation suivant s'est avéré pré férable: Dans un ballon muni d'un agitateur, on dissout 2,82 g de sodium dans 50 cm3 d'éthanol anhydre (dis tillé sur Mg suivant la technique de Vogel, A text book of practical organic chemistry n p. 165-l66) on ajoute alors, peu à peu, 26,65 g d'acétamido malo- nate d'éthyle anhydre dissous dans 300 cm8 de benzène anhydre.
Le ballon est ensuite muni, en plus de l'agitateur, d'un réfrigérant ascendant garni à son extrémité d'une garde de CaCl2. Après deux heures d'agitation à l'ébullition, il y a apparition d'un pré cipité blanc jaunâtre. On distille alors jusqu'à dispa rition de la présence d'alcool dans le distillat. Il faut pour cela distiller environ 200 cm' de solvant.
On complète ensuite le résidu de distillation pré cédent à 300 cors de benzène anhydre et on ajoute, en une fois, 10 g de Bisulfure de bis-chlorométhyle parfaitement rectifié et recueilli sur 10. Le mélange est porté à reflux pendant 10 heures (un essai effec tué à la température ordinaire a révélé qu'après 15 heures d'agitation, la réaction était pratiquement nulle). Après refroidissement, le benzène et les pro duits de réaction forment un gel blanc jaunâtre.
Le benzène est chassé par distillation à la pres sion ordinaire au bain à huile puis sous pression réduite (20 m/m) on obtient 36 g d'un produit blanc.
Dans un ballon de 250 cm3 muni d'un réfrigérant ascendant on place 10 g du produit ainsi obtenu, après expulsion du benzène, avec 100 cm3 d'acide chlorhydrique à 25 0/0. Le mélange est porté à l'ébul lition pendant 6 heures ou mieux pendant 8 à 10 heu res. Après 5 heures, il y a dissolution totale du pro duit. Après refroidissement, on filtre la solution pour éliminer une très faible quantité de matière insoluble. Le filtrat incolore est amené à neutralité (tournesol) avec de l'ammoniaque.
La solution est abandonnée une nuit à la glacière, le précipité est essoré et lavé à l'eau. On le dissout dans: l'ammoniaque à 20'%. La solution obtenue est filtrée puis la cystine est précipitée par addition d'acide acétique jusqu'à neutralité (tour nesol).
La cystine est lavée à l'eau glacée puis à l'al- cool et l'éther. Le rendement est de 80 % à partir du produit intermédiaire. Cette cystine fond vers 2600 avec décomposition. Ce composé est absolument iden tique à la cystine optiquement inactive.
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Analyse
<tb> Calculé: <SEP> Trouvé
<tb> C <SEP> Q/o <SEP> = <SEP> 29,99 <SEP> C'o/o <SEP> = <SEP> 29,88 <SEP> - <SEP> 29,84
<tb> H'o/o <SEP> = <SEP> 5,03 <SEP> H'o/o <SEP> = <SEP> 4,90 <SEP> - <SEP> 5,03
<tb> N <SEP> % <SEP> = <SEP> 11,66 <SEP> N <SEP> o/o <SEP> = <SEP> 11,74 <SEP> - <SEP> 11,48
<tb> S <SEP> 'o/o <SEP> = <SEP> 26,69 <SEP> S <SEP> 'o/o <SEP> = <SEP> 26,83 <SEP> - <SEP> 27,10 Ce produit donne la réaction de Sullivan comme la dl-cystine et, à la chromatographie sur papier, il se comporte comme la dl-cystine et la mésocystine préparées par d'autres voies.
On a réussi à séparer aisément la dl-cystine d'avec la mésocystine en appliquant la méthode indi quée par Loring et du Vigneaud d'ans J. Biol. Chem. 1933, 102, 287.
On peut modifier certaines conditions opératoi res ; ainsi, en particulier, on peut effectuer l'hydro lyse décarboxylante avec de l'acide chlorhydrique plus dilué (notamment de l'acide à 20 0/0), remplacer le benzène par du toluène (la réaction est alors un peu plus rapide) pour préparer le Bisulfure de bis- (a-acétylamido-a, a-dicarbéthoxy-éthyle) et utiliser un Bisulfure de bis-(a-amino-a, a-dicarbalcoxy-éthyle)
dont les groupements d'amine sont ou bien libres ou bien acylés par un groupe autre que le groupe acéty- lique, en particulier par le groupe formylique ou phtalylique. De même l'alcool qui estérifie les grou pes carboxyliques peut être autre que l'alcool éthyli que.
<I>Exemple 2</I> a) Dans un ballon de 500 cm3 muni d'un dis positif d'agitation mécanique, d'un réfrigérant à re flux, d'une ampoule à brome et d'un thermomètre, on place 200 cm3 d'éthanol absolu avec 4,6 g de sodium. Lorsque la solution alcoolique est à une température de 400 on ajoute 40,6 g de formamido- malonate d'éthyle dissous dans 100 cm3 d'éthanol.
On agite le mélange pendant une demi-heure. Après ce temps, lorsque la température est à 30 , on introduit lentement 16,3 g de Bisulfure de bis-chloro- méthyle et on chauffe le mélange à reflux pendant une heure.
Après refroidissement, on filtre le mélange afin d'éliminer le chlorure de sodium formé.
On chasse l'alcool par distillation sous vide et, au résidu gommeux, on ajoute 400 cm3 d'acide chlorhydrique à 25 fl/o avec 20 cm3 d'acide acétique concentré.
Le mélange est porté à reflux durant 4 à 6 heures (jusqu'à absence de dégagement de CO.). Durant l'hydrolyse on prend soin de faire barboter de l'azote dans le milieu.
Après absence de dégagement de CO.. on amène la solution à siccité afin d'éliminer la majeure partie de l'acide chlorhydrique, puis on reprend le résidu par de l'eau distillée et enfin on traite suivant les indications de l'exemple 1. Après la première précipitation par l'ammonia que, on obtient la cystine brute avec un rendement variant de 60 à 85 % suivant que l'on opère à l'abri de l'humidité ou pas.
Ce rendement peut être obtenu chaque fois que l'on opère avec des solvants et des produits rigoureusement anhydres. L'emploi de l'acide sulfurique pour l'hydrolyse décarboxylante n'est pas avantageux vu la difficulté d'éliminer cet acide.
L'ordre des vitesses de décarboxylation semble être, jusqu'ici, inversement proportionnel au poids moléculaire des composés utilisés.