Verfahren zur Isolierung der uteruswirksamen Substanz des 11-,vpophysen-Binterlappens. In "the Journal of tlie Ameriean Chemi- eal Soeiety", Band<B>150, S. 573 (1928)</B> ist ein Verfahren zur Trennung der wirksamen Substanzen des Hypophysen-Hinferlappens beschrieben.
Das Verfahren besteht, darin, dass man die Trockensubstanz mit verdünnter Essigsäure auszieht., die eingedampften Ex- traktlösungen mit Ammoniumsuliat versetzt und die hierbei entstandenen Fällungen mit E'isessig eluiert und die erhaltene Lösung mit organisehen Lösungsmitteln fraktioniert ver setzt.
Es wurde nun gefunden, dass man die Trennung der wirksamen Substanzen des Hypophysen-Hinterlappens in technisch viel einfacherer Weise bewerkstelligen kann, wenn man Lösungen, welche die wirksamen Substanzen des 111.interlappens enthalten, mit kieselsäurehaltigen Adsorptionsmitteln be handelt.
Das Verfahren gemäss der Erfin dung zur Isolierung der uteruswirksamen Substanz des Hypophysen-Hinterlappens ist dadurch --ekenn eichnet. dass man Lösungen, <I>2n</I> 2D welche die Blutdruck steigernde Substanz und die uteruswirksame Substanz des Hypo- pliysen-Hinte,rlappens enthalten, mit kiesel säurehaltigen Adsorptionsmitteln bei der ,dem Wirkungsoptimum :
des Adsorptionsmit- tels entsprechenden Wasserstoffionenk-onzen- tration -der Lösung behandelt und das Ad- sorbat. von derdie uteruswirksame Substanz enthaltenden Lösung trennt. Vor der Ein wirkung des Adsorptionsmittels kann man ,die Lösungen allfällig mit Hilfeder gewöhn- liehen Enteiweissungsmittel vom Eiweiss be freien.
Als besonders zweckmässig hat es sich jedoch erwiesen, die Rohlösungen mit Bento- nit zu behandeln, wobei das Eiweiss zusam men mit den wirksamen Substanzen adsor- biert wird. Aus dem Adsorbat lassen sieh die wirksamen Substanzen durch Elution mit verdünnter Säure praktisch frei von Eiweiss wieder in Lösung bringen.
Durch Behan-d- lung der Lösungen, die weitgehend frei von tinweiss sind, mit kieselsäurehaltigen Ad- sorptionsinitteln, kann dann gemäss dem Ver fahren der Erfindung die blutdruckstei gernde Substanz adsorbiert werden, während die uteruswirksame Substanz zum weitaus grössten Teil in Lösung bleibt.
Bei dieser spezifischen Adsorption (Waldschmidt-Leitz, Berichte der deutschen Chemischen Gesell schaft, Band<B>63,</B> Seite 1204,<B>1930)</B> entstehen unter Mitwirkung von bestimmten, elleiniscb. definierten Restvalenzender Adsorptionsmit- tel (vergl. 'Waldschmidt-Leitz a.
a.<B>0.)</B> wenig dissoziierende, schwer lösliche, chemische Verbindungen aus den Adsarptionsmitteln und der einen hochmolekularen organischen Stoff darstellenden blutdrucksteigernden Substanz, die da-durch, dass man sie von der Lösung trennt, eine Gewinnung -der in Lö sung bleibenden uteruswirksamen Substanz gestatten.
Dass es sieh bei dem vorliegenden Verfahren um eine spezifische Adsorption handelt, geht daraus hervor, dass bereits Dudley, Journal of Pharmacology, Bd. 21 <B>(1923), S.</B> 104 und Abel und Mitarbeiter, Journal of Pharmacology, Bd. 22 (1924),<B>S.</B> <B>296</B> Hypophysenhinterlappen-Auszüge mit Adsorptionsmitteln, wie Talk,
Kohle oder Quecksilbersulfid behandelt und dabei keine Trennung der uteruswirksamen vonder blut drucksteigernden Substanz erhalten haben. Mit diesen Adsorptionsmitteln wird vielmehr zusammen mitder blutdrueksteigernden Sub stanz auch der uteruswirksame, Stoff gleiell- mässig aus der fraglichen Lösung ausgreschie- den.
Der Grad :der Trennung der wirksamen Substanzen ist von der Wahl des Adsorp- tionsmittels und der verwendeten Menge ab hängig. Als kieselsäurehaltige Adsorptions- mittel kommen in Frage Kieselsäure und be stimmte Silikate, zum Beispiel bei einer %sserstoffionenkonzentration von pH =:
4 bis<B>7</B> der im Handel befindliche Bentonit. Da ein Überschuss, des Adsorptionsmittels natürlich auch die uteruswirksame Substanz zu adsorbieren vermag, so ermittelt man zweckmässig in ;einem Vorversu6b. diejenige Menge Adsorptionsmittel, welche die opti- malste Adsorption der blutdruck-wirksamen Substanz bewerkstelligt.
Auch die Wahl der Wasserstoffionenkonzentration der die wirk samen Substanzen enthalten-den Lösung ist von dem<B>'</B> verwendeten Adsorptionsmittel ab hängig und kann in einem Vorversuch leicht ermittelt werden. Die inden folgenden Bei spielen angegebenen Wasserstoffionenken- zentrationen entsprechen dem Wirkungsopti mum.
Man kann bei der Ausführung des Verfahrens entweder so vorgehen, dass man .die Trennung mit einer einmaligen Zugabe ,des Adsorptionsmittels bewerkstelligt, es kann aber auch bezüglich einer vollständige- ren Trennung der wirksainen Substanzen und Erzielung besserer Ausbeuten von Vor teil sein, dass man der Lösung das Adsorp- tionsmittel portionenweise zugibt.
Der Vor teil bei der ersten Ausführungsforin ist der, dass man in einem Arbeitsgang fast eine quantitative Trennung der wirksamen Sub stanzen bewerkstelligen kann, wobei aller- ,dings kleine Verluste an uteruswirksamer Substanz unvermeidlich sind. Das zweite Verfahren besitzt bei etwas grösserer Um ständlichkeit den Vorzug, dass -die Verluste an uteruswirksamer Substanz nur unbedeu tend sind.
<I>Beispiele:</I> <B>1.</B> Eine Lösung, welche im Kubikzenti meter<B>je 60 E</B> der beiden wirksamen Sub stanzen des Hypophysenhinterlappens ent hält, wird auf pH =: 6,4 eingestellt. Je <B>10</B> cm' dieser Lösun-, werden geschüttelt mit.
a) 0,125 gr Bentonit <B>b) 0,1</B> e) 0,05 ,d) 0,025 Die Adsorbate werden jeweils abzentrifu- giert; :das Zentrifugat enthält vorwiegend die uteruswirksame Substanz, und zwar:
EMI0002.0102
<I>Uteruswirksame <SEP> Blittdr-it.ekivirksaiiee</I>
<tb> <I>Substanz: <SEP> Substanz:</I>
<tb> a) <SEP> 40 <SEP> <B>E</B> <SEP> 2 <SEP> <B>E</B>
<tb> <B>b)</B> <SEP> 40 <SEP> <B>E <SEP> 5 <SEP> E</B>
<tb> <B>e) <SEP> -60 <SEP> E <SEP> 5 <SEP> E</B>
<tb> <B><I>d) <SEP> 6</I> <SEP> 0</B> <SEP> F, <SEP> <B>5 <SEP> E</B> Aus dieser Versuchsreihe geht hervor, dass bei a und<B>b</B> Verluste, bei<B>c</B> und<B>d</B> keine Verluste an uteruswirksamer Substanz zu verzeichnen sind, während die Trennung der beiden Substanzen bei a am weitgehendsten durcho-eführt ist.
Eine weito-ehendere Tren- #n ZD nun- kann dann bei c und<B>d</B> durch noch- malicre Behandlung der Lösung mit einer kleinen Menge Bentonit erzielt werden.
2. Eine eiweissfreie Lösung :der wirk samen Substanzen des Hypophysen-Hinter- lappens wird, wie in Beispiel<B>1</B> beschrieben, mit verschiedenen Mengen eines gereinigten Tenpräparafes, zum Beispiel des unter -dem Namen "Dazol" im Handel befindliehen Prä parates, bei pH <B>= 6,2</B> behandelt, und nach dem Ausfall der Vorprüfung die geeignete Menge des Adsorptionsmittels für den Hauptversuch verwendet. Die weitere Verar beitung gestaltet sieh wie im Beispiel<B>1.</B>
<B>3.</B> Eine eiweissfreie Lösungder wirksamen Substanzen des Hypophysen-Hinterlappens wird bei pH =z <B>3,5</B> mit verschiedenen Nen- ,gen eines Kieselsäurepräparates, zum Bei spiel "Osmosil", behandelt und so die oeeig- iiete Menge des Adsorptionsmittels gefunden, mit der dann der Hauptversuch ebenso wie im Beispiel<B>1</B> dureltgeführt wird.
Nit andern als den erfindungsgemäss ver wandten kieselsäurehaltigen Adsorptionsmit- teln lässt sieh eine wirksame spezifische Ad- sorption nicht durchführen.
Process for the isolation of the uterine active substance of the 11-, vpophysen-binterlappen. In "the Journal of the American Chemical Society", Volume 150, p. 573 (1928), a method for separating the active substances of the hypophyseal lobe is described.
The process consists in extracting the dry substance with dilute acetic acid, adding ammonium sulate to the evaporated extract solutions and eluting the precipitates produced with acetic acid and adding organic solvents to the resulting solution in a fractionated manner.
It has now been found that the separation of the active substances of the posterior lobe of the pituitary gland can be accomplished in a technically much simpler manner if solutions which contain the active substances of the lobe are treated with silica-containing adsorbents.
The method according to the invention for isolating the uterine-active substance of the posterior lobe of the pituitary gland is thus identified. that solutions, <I> 2n </I> 2D, which contain the blood pressure-increasing substance and the uterus-effective substance of the posterior pituitary lobe, with silica-acidic adsorbents, have the optimum effect:
of the adsorbent corresponding hydrogen ion concentration -the solution is treated and the adsorbate. from the solution containing the uterine active substance. Before the adsorbent takes effect, the solutions can be freed from protein with the help of the usual deproteinizers.
However, it has proven to be particularly useful to treat the raw solutions with bentonite, the protein being adsorbed together with the active substances. From the adsorbate, the active substances can be brought back into solution practically free of protein by elution with dilute acid.
By treating the solutions, which are largely free of tin-white, with silica-containing adsorbents, the blood pressure-increasing substance can then be adsorbed according to the method of the invention, while the uterus-active substance remains for the most part in solution.
With this specific adsorption (Waldschmidt-Leitz, reports of the German chemical society, volume <B> 63, </B> page 1204, <B> 1930) </B> arise with the participation of certain, elleiniscb. defined residual valence adsorbents (see 'Waldschmidt-Leitz a.
a. <B> 0.) </B> Little dissociating, poorly soluble, chemical compounds from the adsorbents and the blood pressure-increasing substance, which is a high molecular weight organic substance, which, by separating them from the solution, is a recovery -the Allow uterine active substance remaining in solution.
The fact that the present method involves a specific adsorption is evident from the fact that Dudley, Journal of Pharmacology, Vol. 21 (1923), pp. 104 and Abel and coworkers, Journal of Pharmacology , Vol. 22 (1924), <B> S. </B> <B> 296 </B> Posterior pituitary lobe extracts with adsorbents such as talc,
Treated with charcoal or mercury sulphide and not separated the uterine substance from the blood pressure-increasing substance. Rather, with these adsorbents, together with the blood pressure-increasing substance, the uterus-effective substance is equally eliminated from the solution in question.
The degree: the separation of the active substances depends on the choice of adsorbent and the amount used. Silica and certain silicates can be used as adsorbents containing silica, for example with a% hydrogen ion concentration of pH =:
4 to <B> 7 </B> the commercially available bentonite. Since an excess of the adsorbent can of course also adsorb the substance active in the uterus, it is expedient to determine in a preliminary test. that amount of adsorbent which brings about the most optimal adsorption of the blood pressure-effective substance.
The choice of the hydrogen ion concentration of the solution containing the active substances is also dependent on the adsorbent used and can easily be determined in a preliminary test. The hydrogen ion concentrations given in the following examples correspond to the optimum effect.
When carrying out the process, one can either proceed in such a way that one accomplishes the separation with a single addition of the adsorbent, but it can also be of advantage with regard to a more complete separation of the active substances and better yields that one of the Solution adds the adsorbent in portions.
The advantage of the first embodiment is that you can achieve almost a quantitative separation of the active substances in one operation, although small losses of uterine substance are inevitable. The second method has the advantage that the loss of uterine substance is only insignificant if it is somewhat more complicated.
<I> Examples: </I> <B> 1. </B> A solution that contains <B> 60 U </B> of the two active substances of the posterior lobe of the pituitary gland in cubic centimeters is set to pH =: 6.4 set. Each <B> 10 </B> cm 'of this solution is shaken with.
a) 0.125 gr bentonite b) 0.1 e) 0.05, d) 0.025 The adsorbates are each centrifuged off; : The centrifugate contains mainly the uterine active substance, namely:
EMI0002.0102
<I> Uterus effective <SEP> Blittdr-it.ekivirksaiiee </I>
<tb> <I> Substance: <SEP> Substance: </I>
<tb> a) <SEP> 40 <SEP> <B> E </B> <SEP> 2 <SEP> <B> E </B>
<tb> <B> b) </B> <SEP> 40 <SEP> <B> E <SEP> 5 <SEP> E </B>
<tb> <B> e) <SEP> -60 <SEP> E <SEP> 5 <SEP> E </B>
<tb> <B> <I> d) <SEP> 6 </I> <SEP> 0 </B> <SEP> F, <SEP> <B> 5 <SEP> E </B> From this test series It can be seen that with a and <B> b </B> losses, with <B> c </B> and <B> d </B> no losses of uterine active substance are recorded, while the two substances are separated is most extensively carried out at a.
A far greater separation can then be achieved with c and <B> d </B> by treating the solution again with a small amount of bentonite.
2. A protein-free solution: the active substances of the posterior lobe of the pituitary gland are, as described in example 1, with various amounts of a purified preparation, for example the one under the name "Dazol" The preparation in question is treated at pH 6.2 and, if the preliminary test fails, the appropriate amount of adsorbent is used for the main test. Further processing is as in the example <B> 1. </B>
<B> 3. </B> A protein-free solution of the active substances of the posterior lobe of the pituitary gland is treated at pH = e.g. 3.5 </B> with various denominations of a silicic acid preparation, for example "Osmosil" and so found the right amount of adsorbent with which the main experiment is carried out as in example <B> 1 </B>.
An effective specific adsorption cannot be carried out with anything other than the silica-containing adsorbents used according to the invention.