DE949684C

DE949684C - Process for obtaining polypeptide preparations with high ACTH activity

Info

Publication number: DE949684C
Application number: DEM17919A
Authority: DE
Inventors: Donald Emory Ayer; Norman George Brink; Sotch Plains; John William Richter
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1952-03-27
Filing date: 1953-03-27
Publication date: 1956-09-27

Description

Verfahren zur Gewinnung von Polypeptidpräparaten hoher ACTH-Aktivität Die Erfindung betrifft die Gewinnung von Polypeptidpräparaten, welche eine sehr hohe adrenocorticotrope hormonale Aktivität besitzen, aus der Hypophyse (glandula pvtuitaria) oder Extrakten derselben.Process for obtaining polypeptide preparations with high ACTH activity The invention relates to the production of polypeptide preparations, which is a very have high adrenocorticotropic hormonal activity, from the pituitary gland (glandula pvtuitaria) or extracts thereof.

Es sind bereits Extrakte und Konzentrate der Hypophyse hergestellt worden, welche eine adrenocorticotrope hormonale Aktivität (nachfolgend: ACTH-Aktivität) besitzen, wobei zur Reinigung der Extrakte unter anderem das Prinzip der Adsorption aus wäßrigen Lösungen und: der Elution mit Säure angewendet worden ist. Indessen waren alle diese bisher bekannten Produkte im allgemeinen sehr unrein, und sie bestanden größtenteils aus Substanzen, die nur eine geringe oder gar keine ACTH-Aktivität besitzen. Außerdem waren die bisher bekannten Hypophysenextrakte, welche offensichtlich ihre ACTH-Aktivität dem Corticotropin verdanken., dem natürlich vorkommenden ACTH-akti#ven Prinzip der Hypophyse selbst bei weitgehender Reinigung relativ inaktiv, weil Corticotropin selbst keine so hohe ACTH-Aktivität wie das nach vorliiegendem Verfahren hergestellte Polypeptidpräparat besitzt. Es wurde nun gefunden, daß ein Polypeptidpräparat von außerordentlich hoher ACTH-Aktivität hergestellt werden kann, indem man die Rohauszüge von Hypophysenextrakten in Lösung mit einem Kationenaustauschharz behandelt, dessen Kapazität auf Karboxylgruppen beruht. Hierbei werden die stark ACTH-aktiven Substanzen selektiv auf dem Harz adsorbiert, von welchem sie dann mittels wäßriger Mineralsäure selektiv eluiert werden. Das so erhaltene Polypeptidpräparat besitzt etwa die 3oofache ACTH-Aktivität von Armour Standard La-i-A. Das letztgenannte Material ist ein standardisiertes Corticotropin-Pzodukt, welches von Armour & Co. hergestellt wird und nachfolgend als Standard zur Bewertung der ACTH-Aktivität der verschiedenen Extrakte und Konzentrate ditent, die im Verlaufe der Herstellung des vorliegenden Polypeptidpräparates anfallen. Die Aktivität von Armour Standard La i-A in internationalen Einheiten ist i I. U./mg (vgl. rEndocrinology«, Bd.42, S.379, 1948, M. A. Sayers, G. Sayers und L. A. Woodbury).Pituitary extracts and concentrates have already been made which have an adrenocorticotropic hormonal activity (hereinafter: ACTH activity) own, whereby for cleaning the extracts, among other things, the principle of adsorption from aqueous solutions and: acid elution has been used. Meanwhile all of these heretofore known products were generally very impure and passed mostly composed of substances that have little or no ACTH activity own. Also, the previously known pituitary extracts were which were obvious owe their ACTH activity to corticotropin, the naturally occurring ACTH-active Principle of the pituitary gland relatively inactive, even with extensive cleaning, because corticotropin itself not as high an ACTH activity as that produced by the present method Polypeptide preparation owns. It has now been found that a polypeptide preparation of extraordinarily high ACTH activity can be produced by the Raw extracts of pituitary extracts in solution treated with a cation exchange resin, whose capacity is based on carboxyl groups. This is where the highly ACTH-active Substances are selectively adsorbed on the resin, from which they then use aqueous Mineral acid can be eluted selectively. The polypeptide preparation thus obtained has about 3o times the ACTH activity of Armor Standard La-i-A. The latter material is a standardized corticotropin product manufactured by Armor & Co. and below as the standard for assessing the ACTH activity of the various Extracts and concentrates ditent in the course of the manufacture of the present Polypeptide preparations are incurred. The activity of Armor Standard La i-A in international Units is i I. U./mg (see rEndocrinology «, Vol. 42, p. 379, 1948, M. A. Sayers, G. Sayers and L. A. Woodbury).

Das vorliegende Polypeptidpräparat, welches gewöhnlich in Form seiner Säureadditionsverbindung hergestellt wird, ist eine weiße amorphe feste Masse, die weniger als 1% Schwefel und zu vernachlässigende Mengen von Asche enthält. Dieses Polypeptidpräparat in Form des Sal@zsäureadditionssalzes ist in Wasser und Methanol löslich, in trocknem Äthylalkohol etwas löslich und in trocknem Aceton, Äther, Chloroform und Benzol unlöslich. Das Ultrarotspektrum des Chlorwasserstoffadditionssalzes dieses Polypeptidpräparates zeigt nur Amidbindungen; im Bereich von 2300 bis 4000 A zeigt das Absorptionsspektrum dieses Salzes in wäßriger Lösung ein einziges Maximum bei etwa 275o bis 2780 A., E 12. etwa 18 bis 2o. Dieses Polypeptidpräparat gibt meistens eine sehr schwache, fast negative Ninhydrinfarbe, wenn aus einer Lösung von 6o Mikrogramm dieses Polypeptidpräparates in io Mikroliter Wasser (i Mikroliter = o,ooi cms) ein kleiner Fleck auf einem zur Chromatographie geeigneten Filtrierpapier gebildet und dieser anschließend mit o,i °/o Ninhydrin in n-Butanol besprüht und das Papier 5 Minuten bei 8o° getrocknet wird.The present polypeptide preparation, which is usually made in the form of its acid addition compound, is a white amorphous solid containing less than 1% sulfur and negligible amounts of ash. This polypeptide preparation in the form of the hydrochloric acid addition salt is soluble in water and methanol, somewhat soluble in dry ethyl alcohol and insoluble in dry acetone, ether, chloroform and benzene. The ultra-red spectrum of the hydrogen chloride addition salt of this polypeptide preparation shows only amide bonds; in the range from 2300 to 4000 A, the absorption spectrum of this salt in aqueous solution shows a single maximum at about 275o to 2780 A., E 12 about 18 to 2o. This polypeptide preparation usually gives a very weak, almost negative ninhydrin color, if a solution of 60 micrograms of this polypeptide preparation in 10 microliters of water (1 microliters = o, ooi cms) forms a small spot on a filter paper suitable for chromatography and this is then marked with o, i ° / o ninhydrin is sprayed in n-butanol and the paper is dried for 5 minutes at 80 °.

Wenn dieses Polypeptidpräparat in Form seiner Additionsverbindung mit Trichloressigsäure nach dem Verfahren der Gegenstromverteilung nach C r ai g unter Verwendung des Systems s-Butylaikohol-o,5°/oige wäßrige Trichloressigsäure analysiert wird, zeigt sich, daß das Gemisch zumindest aus drei verschiedenen Bestandteilen besteht. Das Trichloressigsäure-Anlagerungssalz eines dieser Bestandteile (welches Corticotropin-B genannt worden ist_,und eine außerordentlich hohe ACTIJ-Aktivität besitzt) hat einen Verteilungskoeffizienten von etwa o,6 in dem zweiphasigen System s-Butyl-alkohol-o,5o/oige wäßrigeTrichloressigsäure.When this polypeptide preparation in the form of its addition compound with trichloroacetic acid according to the countercurrent distribution method according to C r ai g using the s-butyl alcohol-0.5% aqueous trichloroacetic acid system is analyzed, it is found that the mixture consists of at least three different components consists. The trichloroacetic acid addition salt of one of these ingredients (which Has been called corticotropin-B_, and an extraordinarily high ACTIJ activity possesses) has a distribution coefficient of about 0.6 in the two-phase system s-butyl alcohol-0.5% aqueous trichloroacetic acid.

Das neue Polypeptidgemisch ist in Lösungen sehr empfindlich gegenüber Aktivitätsverlusten im Kontakt mit Luft oder anderen oxydierend wirkenden Mitteln. Diese Inaktivierung, die offensichtlich auf die Oxydation . der Polypeptidmoleküle zu Produkten geringerer ACTH-Aktivität beruht, kann im wesentlichen umgekehrt werden, wenn man die inaktivierten Stoffe mit einem milden Reduktionsmittel behandelt, wie Schwefelwasser-;toff, Cystein, Thioglykolsäure, Natriumsulfit u. dgl. Die ACTH-Aktivität dieses Polypeptidpräparates wird dagegen durch Hydrolyse irreversibel zerstört (im -Gegensatz zu der reversiblen Inaktivierung durch milde Oxydationsmittel). Zum Beispiel geht die ACTH-Aktivität im wesentlichen vollständig und dauernd verloren, wenn man das Polypeptidpräparat in 0,3 n-wäßrsger Salzsäure i Stunde auf ioo° erhitzt. Wenn das vorliegende Polypeptidpräparat nach der Methode von S t e i n und M o o r e erhitzt wird, wobei man 6 n-wäßrige Salzsäure in einer Menge verwendet, die dem 2oofachen Gewicht des Polypeptidpräparates entspricht, jedoch mit der Abänderung arbeitet, daß die Hydrolyse unter Stickstoff durchgeführt wird, und wenn man das Hydrolysat auf seinen Gehalt an Aminosäuren nach Moore und Stein analysiert, findet man folgende dreizehn Aminosäuren: Glycin, Ahnin, Valin, Prolin, Serin, Phenylalanin, Tyrosin, Methionin, Asparaginsäure, Glutaminsäure; Histi, din, Lysin und Arginin. Dagegen sind Cystin, Threonin, Leucin und Isoleuoin im Hydrolysat nicht enthalten. Die Ergebnisse der Hydrolyse des Polypeptidpräparates und der Trennung und Analyse der Hydrolyseprodukte nach dem vorstehenden Verfahren sind folgende: Stickstoffgehalt des Gesamtstickstoffs im Hydrolysat (Durchschnitt Aminosäure von Bestimmungen der Hy- droIysate von zwei verschie- denen Herstellungen des Polypeptidpräparats) Glycin . .. . . . . . . . . . . . . . 6,9 Alanin ............... 2,5 Valin ................ 6,1 Leucin ............... - Isoleucin ............. - Prolin ............... 6,6 Serin ................ 3,1 Threonin ............. - Phenylalanin . ........ . 2,5 Tyrosin ........... . . 4,7 Cystin ............... Methionin . . . . . ...... 17 Asparaginsäure ....... 4,8 Glutaminsäure . . . . . . . . 6,1 Histidin . . . . . . . . . . . . . . 6,3 Lysin ................ 16,4 Argänin .............. 28,7 Ammoniak . . . .. . . . . . . 3,6 Insgesamt I « ioo,o Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Poly peptidpräparat, wie oben ausgeführt, durch Harzadsorption und Elution gewonnen, wobei man als Ausgangsprodukt einen Rohauszug aus einem Hypophysenextrakt verwendet. Zur Herstellung dieses Ausgangsproduktes kann man Drüsenmaterial verwenden, z. B. vom Schwein, Rind, Schaf u. dgl., nach Wunsch kann man auch ACTH-aktive Extrakte von Drüsen und deren Konzentrate verwenden, die im Handel erhältlich sind. Wenn Drüsenmaterial verwendet wird, kann dieses nach dem Verfahren der Salzsäure-Aceton-Extraktion nach L i (vgl. Journal Biol. Chem. 149, S. 413 [1943]) und anderen behandelt werden, um ein COrticotropin-Konzentrat zu gewinnen, welches von Li als »Säure-Aceton-Pulver« bezeichnet worden ist. Anstatt nach L i und Mitarbeitern zu arbeiten, empfiehlt es sich im allgemeinen, das feinverteilte Hypophysenmaterial mit Aceton zu extrahieren, wodurch man die Fettsubstanzen und das Wasser entfernt, worauf man den Rückstand mit einer methyhlalkoholischen Lösung von Essigsäure auszieht. Durch Zusatz von Äther zum Metlianolextrakt fällt man ein ACTH-aktives Konzentrat aus, welches nachfolgend als »methylalkoholischer Essigsäure-Extrakt« bezeichnet wird.The new polypeptide mixture is very sensitive in solutions to loss of activity in contact with air or other oxidizing agents. This inactivation, obviously due to the oxidation. the polypeptide molecules is based on products of lower ACTH activity, can essentially be reversed if the inactivated substances are treated with a mild reducing agent, such as hydrogen sulfide, cysteine, thioglycolic acid, sodium sulfite and the like. The ACTH activity of this polypeptide preparation is on the other hand irreversibly destroyed by hydrolysis (in contrast to the reversible inactivation by mild oxidizing agents). For example, the ACTH activity is essentially completely and permanently lost if the polypeptide preparation is heated to 100 ° for 1 hour in 0.3 N aqueous hydrochloric acid. If the present polypeptide preparation is heated according to the method of Stein and M oo re, using 6 N aqueous hydrochloric acid in an amount which corresponds to twice the weight of the polypeptide preparation, but works with the modification that the hydrolysis is carried out under nitrogen If one analyzes the hydrolyzate for its amino acid content according to Moore and Stein, one finds the following thirteen amino acids: glycine, anine, valine, proline, serine, phenylalanine, tyrosine, methionine, aspartic acid, glutamic acid; Histi, din, lysine and arginine. In contrast, cystine, threonine, leucine and isoleuoin are not contained in the hydrolyzate. The results of the hydrolysis of the polypeptide preparation and the separation and analysis of the hydrolysis products by the above procedure are as follows: Nitrogen content of total nitrogen in Hydrolyzate (average Amino acid of determinations of the hy- droIysate of two different which manufactures the Polypeptide preparation) Glycine. ... . . . . . . . . . . . . 6.9 Alanine ............... 2.5 Valine ................ 6.1 Leucine ............... - Isoleucine ............. - Proline ............... 6.6 Serine ................ 3.1 Threonine ............. - Phenylalanine. ......... 2.5 Tyrosine ............ . 4.7 Cystine ............... Methionine . . . . . ...... 17 Aspartic acid ....... 4.8 Glutamic acid. . . . . . . . 6.1 Histidine. . . . . . . . . . . . . . 6.3 Lysine ................ 16.4 Arganin .............. 28.7 Ammonia. . . ... . . . . . 3.6 In total I «ioo, o According to the present invention, the polypeptide preparation is obtained, as stated above, by resin adsorption and elution, a raw extract from a pituitary extract being used as the starting product. To produce this starting product you can use glandular material, e.g. B. from pork, beef, sheep and the like. If desired, ACTH-active extracts from glands and their concentrates, which are commercially available, can also be used. If glandular material is used, this can be treated according to the method of hydrochloric acid-acetone extraction according to L i (cf. Journal Biol. Chem. 149, p. 413 [1943]) and others in order to obtain a Corticotropin concentrate which has been referred to by Li as "acid-acetone powder". Instead of working according to Li et al., It is generally advisable to extract the finely divided pituitary material with acetone, which removes the fatty substances and the water, whereupon the residue is extracted with a methyl alcoholic solution of acetic acid. By adding ether to the methylianol extract, an ACTH-active concentrate is precipitated, which is hereinafter referred to as "methyl alcoholic acetic acid extract".

Der Hypophysenextrakt (dessen ACTH-Aktivität gewöhnlich drei bis fünf Armour Standard La-I-A beträgt) wird in Lösung mit Oxycellulose behandelt, wodurch die ACTH-aktiven* Substanzen auf der Oxycellulose selektiv adsorbiert werden. Sie werden darauf mit wäßriger Mineralsäure von der Oxycellulose-eluiert. Die Adsorption wird ausgeführt, indem man den Drüsenextrakt in einer schwach sauren wäßrigen Lösung löst, z. B. wäßriger Essigsäure, wie einer o,1 n-wäßrigen Essigsäure, und die so gewonnene Lösung mit Oxycellulose in Berührung bringt. Gewöhnlich verwendet man hierzu eine vorgewaschene Oxycellulose, die durch Auswaschen handelsüblicher Oxycellulose, die etwa 1o bis 120/ö freies Carboxyl enthält, zuerst mit einer wäßrigen Lösung von Chlorwasserstoff und dann mit wäßriger Essigsäure gewonnen wird. Die Oxycellulose adsorbiert das ACTH-aktive Material selektiv aus der Lösung, und das so gewonnene Oxycellulose-Adsorbat wird nun mit verdünnter wäßriger Mineralsäure behandelt, vorteilhaft o,i n-Salzsäure. Dadurch werden die ACTH-aktiven Substanzen von der Oxycellulose eluiert. Das Eluat wird auf ein p$ von etwa 2,5 bis 3 eingestellt, was gewöhnlich durch Behandlung des Eluates. mit einem stark basischen Anionenaustauschharz in Karbonatform erfolgt. Das Harz wird abfiltriert und das Filtrat abgedampft. Es fällt ein ACTH-aktives Konzentrat an, dessen ACTH-Aktivität gewöhnlich etwa 6o bis 85 Armour Standard La-I-A beträgt.The pituitary extract (its ACTH activity usually three to five Armor Standard La-I-A is) is treated in solution with oxycellulose, whereby the ACTH-active * substances are selectively adsorbed on the oxycellulose. she are then eluted from the oxycellulose with aqueous mineral acid. The adsorption is carried out by placing the gland extract in a weakly acidic aqueous solution solves, e.g. B. aqueous acetic acid, such as an o, 1 N aqueous acetic acid, and the so brings the solution obtained into contact with oxycellulose. Usually one uses for this purpose a pre-washed oxycellulose, which is obtained by washing out commercially available oxycellulose, which contains about 10 to 120% free carboxyl, first with an aqueous solution is obtained from hydrogen chloride and then with aqueous acetic acid. The oxycellulose adsorbs the ACTH-active material selectively from the solution, and the so obtained Oxycellulose adsorbate is now treated with dilute aqueous mineral acid, which is advantageous o, i n-hydrochloric acid. This removes the ACTH-active substances from the oxycellulose eluted. The eluate is adjusted to a p $ of about 2.5 to 3, which is usually by treating the eluate. with a strongly basic anion exchange resin in Carbonate form takes place. The resin is filtered off and the filtrate is evaporated. It's falling an ACTH-active concentrate, the ACTH activity of which is usually about 6o to 85 Armor Standard La-I-A is.

Das durch Adsorption an Oxycellulose u.id Eluation gewonnene ACTH-aktive Konzentrat wird nun mit Pepsin unter verhältnismäßig milden Bedingungen dispergiert. Diese Pepsinbehandlung wird gewöhnlich etwa 1 Tag in wäßriger saurer Lösung (p$ etwa 2 bis 3) bei etwa 35 bis 40° durchgeführt. Die digerierte Lösung wird erhitzt, um das Pepsin zu zerstören. Die so erhaltene Lösung wird abgekühlt und mit Trichloressigsäure behandelt, wodurch man die hochmolekularen Substanzen von niedriger ACTH-Aktivität ausfällt. Die geklärte wäßrige Lösung wird nun mit ednem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Äther, extrahiert, wodurch man überschüssige Trichloressigsäure entfernt. Die wäßrige Lösung wird nun der Gefriertrocknung im Vakuum unterworfen, wodurch man ein peps.inverdautes Produkt erhält. Dieses »pepsinverdaute Material«, welches gewöhnlich als Ausgangsprodukt für das Verfahren der Harzadsorption und -eluation nach der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat eine Aktivität von 8o Armour Standard La-1-A. Es enthält das vorliegende Polypeptidpräparat in Mischung mit Polypeptiden niedrigerer ACTH-Aktivität und Stoffen von niedrigerer Basizität, die eine geringe Oder gar keine ACTH-Aktivität besitzen.The ACTH-active obtained by adsorption on oxycellulose and id elution Concentrate is now dispersed with pepsin under relatively mild conditions. This pepsin treatment is usually given for about 1 day in an aqueous acidic solution (p $ about 2 to 3) carried out at about 35 to 40 °. The digested solution is heated, to destroy the pepsin. The solution thus obtained is cooled and washed with trichloroacetic acid treated, whereby one the high molecular weight substances of low ACTH activity fails. The clarified aqueous solution is now immiscible with ednem with water organic solvents, such as ether, extracted, whereby excess trichloroacetic acid removed. The aqueous solution is now subjected to freeze-drying in vacuo, whereby a peps.in digested product is obtained. This "pepsin-digested material" which is usually used as a starting product for the process of resin adsorption and -eluation is used according to the present invention has an activity of 8o Armor Standard La-1-A. It contains the present polypeptide preparation in a mixture with polypeptides of lower ACTH activity and substances of lower basicity, who have little or no ACTH activity.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das entweder in der obenbeschriebenen Weise hergestellte oder auch durch-Pepsinbehandlung eines rohen, nicht mit Oxycellulose behandelten Hypophysenextraktes.gewonnene »pepsinverdaute Material« mit einem Kationenaustauschharz behandelt, dessen Austauschkapazität im wesentlichen auf der Anwesenheit von Carboxylgruppen beruht. Dadurch werden die in der Pepsinbrühe anwesenden ACTH-aktiven Substanzen, insbesondere das erfindungsgemäße Polypeptidgemisch, selektiv an dem Harz adsorbiert und von diesem anschließend mittels wäßriger Mineralsäure selektiv eluiert: Kationenaustauschharze mit polaren Carboxylgruppen sind bekannt. Im allgemeinen werden diese .entweder durch Kondensation eines Phenols und eines Aldehyds gewonnen, wobei eine dieser beiden Komponenten eine Carboxylgruppe enthält, zinsbesondere Resorcylsäure und Formaldehyd, oder die Herstellung erfolgt durch Mischpolymerisation einer polymerisierbaren Säure mit einer Divinylverbindung, d. h. eine Verbindung, welche zwei C H2 = C H-Gruppen enthält, z. B. Acryl- und/oder Methacrylsäure und Divinylbenzol. Harze dieser Art zeichnen sich durch die Eigenschaft aus, daß ihre Kationenaustauschkapazität auf der Anwesenheit von Carboxylgruppen im Harzmolekül beruht. Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung empfiehlt es sich, ein Mischpolymerisat aus Acryl- oder Methacrylsäure und Divinylbenzol zu verwenden, in welchem die Divinylbenzol-Komponente zu 2,5 bis 5 % enthalten ist (z. B. Amberlite IRC-5o, vgl. USA.-Patentschriften 2319359, 2333754, 2340110, 234O 111), da derartige Harze ein bemerkenswertes selektives Adsorptionsvermögen für die ACTH-aktiven Substanzen- in »pepsinverdautem Material.« besitzen. Obgleich das Harz in Wasserstofform verwendet werden kann, empfiehlt es sich gewöhnlich, es in gepulverter Form anzuwenden. Diese Form wird hergestellt, indem man das Harz vor der Adsorption mit einem wäßrigen Alkalihydroxyd vorbehandelt, z. B. Natronlauge, Kalilauge und dergleichen, wobei man das Harz teilweise in Alkaliresinat umwandelt. Das Verhältnis von Wasser- Stoff zu gebildetem Salz wird vorzugsweise so gehalten, daß die verbrauchte Beschickungslösung ein pH von etwa 5 bis 7 hat. ' Die Adsorption wird ausgeführt, indem man das ypepsinverdaute Material« in Wasser löst, welches vorteilhaft ein mildes Reduktionsmittel, wie Schwefelwasserstoff, Natriumsulfit,Thioglycolsäure, Cystein und dergleichen, enthält, und die so erhaltene Lösung durch eine Säule des Carboxylgruppen enthaltenden Kationenaustauschharzes (welches vorteilhaft in gepufferter Farm vorliegt) ausreichend langsam leitet, wobei das Harz die ACTH-aktiven, in der Lösung enthaltenen Stoffe adsorbiert. Wenn die Säule richtig gepuffert ist, hat das abströmende Gut ein p$ von etwa 5 bis 7. Bei hohen pw-Werten ist das Polypeptidpräparat empfindlicher gegen Inaktivierung; bei niedrigeren pH-Werten kann die Adsorption unvollständig bleiben, weil Lösungen von niedrigerer pff tatsächlich in der Lage sind, das Polypeptidgemisch vom Harz zu eluieren.To carry out the process according to the invention, the "pepsin-digested material" obtained either in the manner described above or by pepsin treatment of a crude pituitary extract not treated with oxycellulose is treated with a cation exchange resin, the exchange capacity of which is essentially based on the presence of carboxyl groups. As a result, the ACTH-active substances present in the pepsin broth, in particular the polypeptide mixture according to the invention, are selectively adsorbed on the resin and then selectively eluted from it using aqueous mineral acid: Cation exchange resins with polar carboxyl groups are known. In general, these are obtained either by condensation of a phenol and an aldehyde, one of these two components containing a carboxyl group, in particular resorcylic acid and formaldehyde, or they are produced by copolymerizing a polymerizable acid with a divinyl compound, ie a compound which contains two C H2 = C contains H groups, e.g. B. acrylic and / or methacrylic acid and divinylbenzene. Resins of this type are characterized by the fact that their cation exchange capacity is based on the presence of carboxyl groups in the resin molecule. To carry out the present invention, it is advisable to use a copolymer of acrylic or methacrylic acid and divinylbenzene in which the divinylbenzene component is 2.5 to 5% (e.g. Amberlite IRC-50, cf. USA. -Patentschriften 2319359, 2333754, 2340110, 234O 111), since such resins have a remarkable selective adsorption capacity for the ACTH-active substances in "pepsin-digested material." Although the resin can be used in the hydrogen form, it is usually best to use it in powdered form. This shape is made by pretreating the resin with an aqueous alkali metal hydroxide prior to adsorption, e.g. B. sodium hydroxide solution, potassium hydroxide solution and the like, the resin being partially converted into alkali metal resin. The ratio of hydrogen to formed salt is preferably maintained so that the spent feed solution has a pH of about 5-7. The adsorption is carried out by dissolving the ypepsin-digested material in water, which advantageously contains a mild reducing agent such as hydrogen sulfide, sodium sulfite, thioglycolic acid, cysteine and the like, and the solution thus obtained through a column of the carboxyl group-containing cation exchange resin (which advantageously in a buffered farm) conducts slowly enough, the resin adsorbing the ACTH-active substances contained in the solution. If the column is properly buffered, the effluent has a p $ of about 5 to 7. At high pw values, the polypeptide preparation is more sensitive to inactivation; at lower pH values the adsorption can remain incomplete because solutions of lower pff are actually able to elute the polypeptide mixture from the resin.

Nach der Adsorptionsstufe wird das Harzadsorbat mit Wasser, einer milden alkalischen wäßrigen Lösung und einer schwach sauren wäßrigen Lösung gewaschen. Dadurch entfernt man diejenigen Stoffe, die eine geringere Basizität als .das gewünschte Polypeptidpräparat und eine geringere oder gar keine ACTH-Aktivität besitzen. Überraschenderweise eluieren die sauren und die schwach basischen Waschflüssigkeiten Stoffe, die im wesentlichen keine ACTH-Aktivität besitzen, während sie praktisch keine der auf dem Harz -adserbierten ACTH-aktiven Substanzen entfernen. Als schwach basische Lösung verwendet man gewöhnlich eine wäßrige Lösung, die ein heterocyclisches tertiäres Amin enthält, wie Pyridin, Picolin, die Lutidine, Collidine und dergleichen; vorzugsweise wird wäßriges Pyridin verwendet. Außer der alkalischen Wäsche wäscht man das Harzadsorbat gewöhnlich mit einer wäßrigen Lösung einer niedrigen Alkansäure, wie Essigsäure, Propionsäure, Ameisensäure und dergleichen, wobei man vorteilhaft wäßrige Essigsäure verwendet. Um die Inaktivierungsverluste von ACTH-Stoffen minimal zu halten, setzt man gewöhnlich jeder der zum Waschen des Harzadsorbates dienenden Lösung ein mildes Reduktionsmittel zu, welches in der Lage ist, organische Disulfide zu den entsprechenden Sulfhydrylverbindungen zu reduzieren, z. B. Schwefelwasserstoff, Natrium sulfit, Thiosulfat, Thioglycolsäure, Cystein und dergleichen.After the adsorption stage, the resin adsorbate with water, a mild alkaline aqueous solution and a weakly acidic aqueous solution. This removes those substances that have a lower basicity than the desired one Polypeptide preparation and little or no ACTH activity. Surprisingly the acidic and weakly basic washing liquids elute substances that are present in the have essentially no ACTH activity, while practically none of the above Remove ACTH-active substances from the resin. As a weakly basic solution one usually uses an aqueous solution, which is a heterocyclic tertiary Contains amine, such as pyridine, picoline, the lutidines, collidines and the like; preferably aqueous pyridine is used. In addition to the alkaline wash, the resin adsorbate is also washed usually with an aqueous solution of a lower alkanoic acid such as acetic acid, Propionic acid, formic acid and the like, advantageously aqueous acetic acid used. In order to keep the inactivation losses of ACTH substances to a minimum, sets one of the solutions used to wash the resin adsorbate is usually a mild one Reducing agent, which is able to convert organic disulfides to the corresponding To reduce sulfhydryl compounds, e.g. B. hydrogen sulfide, sodium sulfite, Thiosulfate, thioglycolic acid, cysteine and the like.

Das Harzadsorbat wird zuerst mit einer wäßrigen Mineralsäure eluiert, z. B. Salz-, Schwefel-, Phosphorsäure und dergleichen, die ein p$ über etwa 1,8 haben (entsprechend einer Normalität von etwa o,oi5 n), wodurch die Substanzen, die eine niedrigere Basizität und ACTH-Aktivität als das gewünschte Polypeptidpräparat besitzen, eluiert werden. Das Harzadsorbat wird dann mit wäßriger Mineralsäure eluiert, z. B. Halogenwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosplorsäure, wobei vorteilhaft eine wäßrige Lösung von Salzsäure von einem pg von etwa i bis 1,8 (o,i bis 0,015 n) verwendet wird. Dadurch wird das gewünschte ACTH-aktive Polypeptidpräparat von dem Harzadsorbat eluiert. Gewöhnlich empfiehlt sich die Verwendung einer wäßrigen Mineralsäure von einem pa zwischen 1,5 und 1,6 (0,032 bis 0,025 n) als Eluierungsmittel, um das Polypeptidgemisch vom Harzadsorbat zu eluieren. Dieses 'letztgenannte Eluat wird nun durch Gefriertrocknung im Vakuum konzentriert und ergibt das gesuchte Polypeptidgemisch, welches eine ACTH-Aktivität von 3ooArmour Standard La-i-A besitzt und sich ferner so kennzeichnet, wie es weiter oben beschrieben wurde.The resin adsorbate is first eluted with an aqueous mineral acid, z. B. hydrochloric, sulfuric, phosphoric acid, and the like, which have ap $ over about 1.8 have (corresponding to a normality of about o, oi5 n), whereby the substances, which have a lower basicity and ACTH activity than the desired polypeptide preparation own to be eluted. The resin adsorbate is then eluted with aqueous mineral acid, z. B. hydrohalic acid, sulfuric acid or phosphoric acid, being advantageous an aqueous solution of hydrochloric acid of one pg from about i to 1.8 (o, i to 0.015 n) is used. This will produce the desired ACTH-active polypeptide preparation from the resin adsorbate eluted. It is usually best to use an aqueous one Mineral acid of one pa between 1.5 and 1.6 (0.032 to 0.025 n) as an eluent, to elute the polypeptide mixture from the resin adsorbate. This last-named eluate is now concentrated by freeze-drying in vacuo and results in the polypeptide mixture we are looking for, which has an ACTH activity of 300Armour Standard La-i-A and further as described above.

Das Polypeptidpräparat wird gewöhnlich in Form von Säure-Additions-Verbindungen hergestellt, da die freie Base weniger beständig ist. Die freie Base läßt sich indessen herstellen, indem man ein Säureadditionssalz, wie das Chlorwasserstoffsalz, in Methanol löst und eine organische Base, wie Triäthylamin, zusetzt, worauf das Polypeptidpräparat als freie Base ausfällt. Verschiedene Säureadditionssalze können auseinander und aus der freien Base nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden, z. B. durch Reaktion mit Säuren, Metathese und Ionenaustausch. Beispiel i 4o g Corticotropinkonzentrat (»Säure-Aceton-Pulver«), welches aus Schweinedrüsen durch Salzsäure-Aceton-Extraktion gewonnen ist und die ACTH-Aktivität 4 Armour-Standard La-i-A besitzt, wurden zu i2oo ccm o,i n-wäßriger Essigsäure zugesetzt. Das Gemisch wurde mehrere Stunden gerührt und dann filtriert, um geringe Mengen von Unlöslichem zu entfernen. Zu dem Filtrat wurde nun 4o g gewaschene Oxycellulose (hergestellt aus handelsüblicher Oxycellulose, die etwa io bis 1211/o freies Carboxyl enthält, indem man diese zuerst mit i n-Salzsäure und dann mit o, i n-Essigsäure auswäscht) zugesetzt, worauf man das Gemisch etwa 24 Stunden bei Raumtemperatur rührte. Hierbei wurden die ACTH-aktiven Stoffe auf der Oxycellulose adsorbiert. Das Adsorbat wurde durch Filtration gewonnen und mehrere Male mit je Zoo ccm o,i n-wäßriger Essigsäure gewaschen.The polypeptide preparation is usually in the form of acid addition compounds produced because the free base is less stable. The free base can meanwhile Prepared by adding an acid addition salt, such as the hydrogen chloride salt, in methanol dissolves and an organic base, such as triethylamine, adds, whereupon the polypeptide preparation precipitates as the free base. Different acid addition salts can separate and be prepared from the free base by methods known per se, e.g. B. by Reaction with acids, metathesis and ion exchange. Example i 40 g of corticotropin concentrate (»Acid-Acetone-Powder«), which is obtained from pig glands by hydrochloric acid-acetone extraction is obtained and the ACTH activity has 4 Armor standard La-i-A, were to i2oo ccm o, i n-aqueous acetic acid was added. The mixture was several hours stirred and then filtered to remove small amounts of insolubles. In addition The filtrate was now 40 g of washed oxycellulose (made from commercially available Oxycellulose, which contains about 10 to 1211 / o free carboxyl, by first adding this with i n-hydrochloric acid and then with o, i n -acetic acid washes) added, whereupon one the mixture was stirred at room temperature for about 24 hours. Here the ACTH-active Substances adsorbed on the oxycellulose. The adsorbate was collected by filtration and washed several times with zoo ccm of 0.15 aqueous acetic acid each time.

Das Oxycelluloseadsorbat wurde zu 200 ccm einer o,i n-wäßrigen Salzsäure zugesetzt, und diese Mischung wurde etwa 1/z Stunde gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und die Oxyzcellulose nochmals mit Zoo ccm o, i n-Salzsäure etwa 1/z Stunde g-°rührt und die Oxycellulose erneut abfiltriert. Die filtrierten Lösungen (Eluate) wurden vereinigt und auf p$ 2,5 bis 3 eingestellt, indem man ein stark basisches Anionenaustauschharz in Carbonatform zusetzte. Das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum durch Gefriertrocknung konzentriert. Hierdurch erhält man 1,5 g eines amorphen weißen Pulvers, welches eine Aktivität von etwa 75 Armour Standard La-i-A besitzt.The oxycellulose adsorbate became 200 cc of o, i n aqueous hydrochloric acid was added and this mixture was stirred for about 1/2 hour. The mixture was filtered and the oxyzcellulose is again stirred with zoo ccm of 0.15 hydrochloric acid for about 1 / 10th of an hour and the oxycellulose is filtered off again. The filtered solutions (eluates) were combined and adjusted to p $ 2.5 to 3 by using a strongly basic anion exchange resin added in carbonate form. The resin was filtered off and the filtrate was passed through in vacuo Freeze drying concentrated. This gives 1.5 g of an amorphous white Powder which has an activity of about 75 Armor Standard La-i-A.

6,4 g dieses weißen amorphen Pulvers wurden in 32o ccm Wasser gelöst. Zu dieser Lösung setzte man 23,7 mg Pepsin. Der pH-Wert der Lösung wurde auf etwa 2,5 eingestellt, indem man mehrere Tropfen verdünnte wäßrige Salzsäure zusetzte. Die saure Lösung wurde etwa a4 Stunden bei etwa 370 gehalten. Nunmehr wurde sie auf etwa 9o° erhitzt und etwa 15 Minuten auf dieser Temperatur gehalten, um das Pepsin zu zerstören. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt, darauf wurden 36 ccm einer So'/eigen wäßrigen Lösung von Trichloressigsäure zugesetzt, worauf man das Gemisch schließlich etwa i Stunde stehenließ. Das Ausgefallene (hochmolekulare Substanzen von geringer ACTH-Aktivität) wurde durch Schleudern entfernt und verworfen. Die geklärte Lösung (etwa 350 ccm) wurde nun nacheinander sechsmal mit je 350 ccm Äther extrahiert, wodurch die überschüssige Trichloressigsäure aus der wäßrigen Lösung ausgezogen wurde. Die wäßrige Lösung wurde nach dieser Extraktion unter vermindertem Druck erwärmt. Dabei dampfte der verbliebene Äther ab. Die Lösung wurde nun durch Gefriertrocknung im Vakuum konzentriert und ergab 5,6 g eines amorphen weißen Pulvers. Dieses pepsinverdaute Material besaß eine ACTH-Aktivität von etwa 8o Armour Standard La-i-A.6.4 g of this white amorphous powder were dissolved in 32o cc of water. 23.7 mg of pepsin were added to this solution. The pH of the solution was adjusted to about 2.5 by adding several drops of dilute aqueous hydrochloric acid. The acidic solution was held at about 370 for about a4 hours. It was then heated to about 90 ° and held at this temperature for about 15 minutes in order to destroy the pepsin. The solution was then cooled to room temperature, 36 cc of a So '/ own aqueous solution of trichloroacetic acid were then added, whereupon the mixture was finally left to stand for about 1 hour. The precipitated (high molecular weight substances of low ACTH activity) was removed by spinning and discarded. The clarified solution (about 350 ccm) was then extracted six times in succession with 350 ccm of ether each time, as a result of which the excess trichloroacetic acid was extracted from the aqueous solution. The aqueous solution after this extraction was heated under reduced pressure. The remaining ether evaporated. The solution was then concentrated by freeze drying in vacuo and gave 5.6 g of an amorphous white powder. This pepsin-digested material had an ACTH activity of about 80 Armor Standard La-iA.

30o mg dieses pepsinverdauten Materials (von einer ACTH-Aktivität von etwa 8o Armour Standard La-i-A) wurden in io ccm Wasser gelöst, welches mit Schwefelwasserstoff gesättigt war. Diese Lösung wurde abwärts strömend durch eine Säule von Harz geleitet, welches wie folgt hergestellt war 25 g körniges Amberlite IRC-5o (Korngröße 8 bis 24 Maschen) .wurden in Wasserstofform mit Zoo ccm Wasser verrührt. Zu diesem Gemisch wurde langsam eine wäßrige Lösung zugesetzt, die o,5 g Natriumhydroxyd enthielt. Wenn das Harz mit den Natriumionen beladen ist, wurde es mit Wasser gewaschen. Hierdurch erhielt man ein Harz, welches zu etwa 150/9 in Natriumform, zum restlichen Teil in Wasserstofform vorlag. Dieses Harz wurde in eine 5o-ccm-Bürette eingebracht und diese Säule mit Wasser gefüllt, welches mit Schwefelwasserstoff gesättigt war.30o mg of this pepsin-digested material (from an ACTH activity of about 8o Armor Standard La-i-A) were dissolved in 10 cc of water, which was mixed with Hydrogen sulfide was saturated. This solution was flowing down through a Passed a column of resin made as follows: 25 g of granular amberlite IRC-50 (grain size 8 to 24 meshes) .were in hydrogen form with zoo cc water stirred. An aqueous solution containing 0.5% was slowly added to this mixture g sodium hydroxide. When the resin is loaded with the sodium ions, it was washed it with water. This gave a resin that was about 150/9 in Sodium form, the remaining part in hydrogen form. This resin was made in introduced a 5o ccm burette and filled this column with water, which with Hydrogen sulfide was saturated.

Die Geschwindigkeit, mit welcher die Lösung (io ccm) abwärts durch die Harzsäule fließt, wird so eingestellt, daß sie- in etwa i1/2 Stunden durchgeflossen ist. In dieser Zeit adsorbiert das Harz die ACTH-aktiven, ursprünglich in der Lösung anwesenden Stoffe. Die Harzsäule wurde nun mit 50 ccm Wasser gewaschen, welches mit Schwefelwasserstoff gesättigt war und mit einer Geschwindigkeit von etwa i ccm/Min. abwärts durch die Säule floß. Im Verlaufe von etwa 3 Stunden wurde die Harzsäule gewaschen, und zwar zuerst mit a50 ccm einer io%igen wäßrigen Pyridinlösung, die etwa 125 mg Natriumsulfit enthielt, und dann mit 500 ccm einer io%igen wäßrigen Essigsäure, die mit Schwefelwasserstoff gesättigt war. Dadurch wurden die Stoffe entfernt, die eine geringere Basizität als Corticotropin-B und eine geringe oder gar keine ACTH-Aktivität besitzen.The rate at which the solution (10 cc) flows downward through the resin column is adjusted so that it has flowed through in about 11/2 hours. During this time, the resin adsorbs the ACTH-active substances originally present in the solution. The resin column was then washed with 50 cc of water, which was saturated with hydrogen sulfide and at a rate of about 1 cc / min. flowed downward through the pillar. The resin column was washed in the course of about 3 hours, first with 50 cc of a 10% strength aqueous pyridine solution containing about 125 mg of sodium sulfite, and then with 500 cc of 10% strength aqueous acetic acid which was saturated with hydrogen sulfide. This removed the substances that have a lower basicity than corticotropin-B and little or no ACTH activity.

200 ccm wäßrige, mit Schwefelwasserstoff gesättigte Salzsäure, die ein pH von 2 hat, wurde abwärts strömend durch die Harzsäule mit einer Geschwindigkeit von etwa ioo ccm/Stunde geleitet, worauf man mit gleicher Geschwindigkeit Zoo ccm einer wäßrigen Salzsäure leitete, deren pH r,58. betrug und die mit Schwefelwasserstoff gesättigt ist. Zwei entsprechende Eluatfraktionen wurden gesammelt und jede -getrennt auf PH 2,5 bis 3 eingestellt, indem man das stark basische Anionenaustauschharz Amberlite IRA-4oo . in Carbonatform zusetzte; dies ist ein polymeres quaternäres Amin, dessen Austauschfähigkeit auf quaternäre Amingruppen zurückgeht (vgl. USA.-Patentschriften 2 597 494, 2 597 440, 2 57o 822, 2 567 836). Dann wurde jedes der beiden Eluate gesondert filtriert und durch Gefriertrocknung im Vakuum konzentriert. Die erste Fraktion ergab 6o mg des gewünschten Polypeptidpräparates und die zweite 40 mg desselben. Beide Produkte sind Salzsäureadditionsverbindungen und fallen in Form eines amorphen weißen Pulvers an. Beide Produkte wurden der Prüfung nach S a y e r s und Mitarbeitern, Endocrinology, Bd. 42, S. 379 (i948), unterworfen und zeigten dabei eine Aktivität von etwa 30o Armour Standard La-i-A. Beispiel 2 50o g frische gefrorene Schweinedrüsen wurden mit iooo ccm Aceton homogenisiert. Das so erhaltene Gemisch wurde nun mit 2 1 Aceton etwa 3 Stunden gerührt, worauf man die überstehende Flüssigkeit dekantierte und verwarf. Das restliche Gut wurde zweimal mit je 2000 ccm Aceton und einmal mit 200o ccm Methanol gewaschen. Damit wurden im wesentlichen alle im Ausgangsprodukt enthaltenen Fette und löslichen Salze entfernt. Die Aceton- und Methanol-Waschflüssigkeiten wurden ebenfalls verworfen. Das verbleibende Drüsenmaterial wurde nun abfiltriert, mit Äther genvaschen und an Luft getrocknet. Man erhielt ioo g eines festen Produktes, welches bei der Prüfung nach S ay e r s und Mitarbeitern eine Aktivität von etwa 1/2 Armour Standard La-i-A besaß.200 cc aqueous hydrochloric acid saturated with hydrogen sulfide, the having a pH of 2 was flowing down through the resin column at a rate of about 100 cc / hour, whereupon one zoo cc an aqueous hydrochloric acid, whose pH r, 58. and those with hydrogen sulfide is saturated. Two corresponding eluate fractions were collected and each was separated adjusted to pH 2.5 to 3 by using the strongly basic anion exchange resin Amberlite IRA-4oo. added in carbonate form; this is a polymeric quaternary Amine, the exchangeability of which is based on quaternary amine groups (cf. USA patents 2 597 494, 2 597 440, 2 57o 822, 2 567 836). Then each of the two eluates filtered separately and concentrated by freeze-drying in vacuo. The first Fraction gave 60 mg of the desired polypeptide preparation and the second 40 mg of the same. Both products are hydrochloric acid addition compounds and fall in the form of an amorphous white powder. Both products have been tested by S a y e r s and employees, Endocrinology, Vol. 42, p. 379 (1948), showing activity from about 30o Armor Standard La-i-A. Example 2 50o grams of fresh frozen pork glands were homogenized with 100 cc of acetone. The mixture thus obtained was now with 2 liters of acetone were stirred for about 3 hours, after which the supernatant liquid was decanted and rejected. The rest of the goods were twice with 2000 ccm acetone and once with Washed 200o cc of methanol. This meant that essentially all of them were in the starting product contained fats and soluble salts are removed. The acetone and methanol washes were also discarded. The remaining gland material was now filtered off, gene-washed with ether and air-dried. 100 g of a solid product were obtained, which in the test according to S ay e r s and employees an activity of about 1/2 Armor Standard La-i-A.

Dieses Produkt wurde nun mit 90o ccm Methanol in einem mit Rührer, Rückflußkühler und Trockenrohr ausgestatteten Gefäß gemischt und das Gemisch gerührt, bis es gut verteilt war. Nun wurden 60o ccm Eisessig zugesetzt, das Gemisch gerührt und etwa 2 Stunden auf Rückflußtemperatur erhitzt (etwa 75°). Man ließ das Gemisch sich absetzen, während es auf Raumtemperatur abkühlte, und filtrierte dann das Ausgefallene ab und wusch mit 300 ccm einer 4o%igen Lösung von Essigsäure in Methanol. Die methylalkoholische Waschflüssigkeit wurde zu dem Filtrat zugesetzt, worauf man zu der so erhaltenen Lösung (Volumen etwa i5oo ccm) etwa 1500 ccm Äther zusetzte. Man ließ diese Lösung etwa 15 Stunden bei einer Temperatur von o bis 5° stehen. Die Ausfällung wurde nun abfiltriert, mit Äther essigsäurefrei gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur über Kaliumhydroxyd getrocknet. Hierdurch erhielt man 13 g eines Methanol-Essigsäure-Extraktes, welcher eine ACTH-Aktivität von etwa 3 :Armour Standard La-i-A besaß.This product was then mixed with 90 ° cc of methanol in a vessel equipped with a stirrer, reflux condenser and drying tube, and the mixture was stirred until it was well distributed. 60o cc of glacial acetic acid were then added, the mixture was stirred and heated to reflux temperature (about 75 °) for about 2 hours. The mixture was allowed to settle while cooling to room temperature, and then the precipitate was filtered off and washed with 300 cc of a 40% solution of acetic acid in methanol. The methyl alcoholic washing liquid was added to the filtrate, whereupon about 1500 ccm of ether was added to the solution thus obtained (volume about 1500 ccm). This solution was allowed to stand for about 15 hours at a temperature of 0 to 5 °. The precipitate was then filtered off, washed free of acetic acid with ether and dried over potassium hydroxide in vacuo at room temperature. This gave 13 g of a methanol-acetic acid extract which had an ACTH activity of about 3: Armor Standard La-iA.

Der Methanol-Essigsäure-Extrakt wurde nun nach dem gleichen Verfahren aufbereitet, wie es zur Behandlung des »Säure-Aceton-Pulvers« angewendet wird und in den ersten drei Absätzen von Beispiel i beschrieben ist. Hierzu wird der Methanol-Essigsäure-Extrakt in o,i n-wäßriger Essigsäure gelöst und diese Lösung mit Oxycellulose behandelt; dadurch wurden die ACTH-aktiven Substanzen an Oxycellulose adsorbiert. Die ACTF.-aktiven Substanzen wurden dann von dem Adsorbat mittels wäßriger Salzsäure eluiert und die Eluate der Gefriertrocknung im Vakuum unterworfen. Das so erhaltene amorphe weiße Pulver wurde mit Pepsin in wäßriger Lösung bei 37` digeriert; die erhaltene Lösung wurde auf 9o° erhitzt, um das Pepsin zu zerstören, worauf man Trichloressigsäure zusetzte und dadurch die Verunreinigungen ausfällte. Nach der Entfernung der Ausfällung und Extraktion der überschüssigen Trichloressigsäure mit Äther wurde die erhaltene wäßrige Lösung der Gefriertrocknung im Vakuum unterworfen. Hierdurch erhielt man ein amorphes Pulver, welches eine ACTH-Aktivität von etwa ioo Armour Standard La-i-A besaß.The methanol-acetic acid extract was now made using the same procedure prepared as it is used to treat the "acid-acetone powder" and is described in the first three paragraphs of example i. The methanol-acetic acid extract is used for this purpose dissolved in o, i n-aqueous acetic acid and treated this solution with oxycellulose; thereby the ACTH-active substances were adsorbed on oxycellulose. The ACTF.-active Substances were then eluted from the adsorbate using aqueous hydrochloric acid and the Subjected eluates to freeze-drying in vacuo. The amorphous white thus obtained Powder was digested with pepsin in aqueous solution at 37 '; the solution obtained was heated to 90 ° to destroy the pepsin, whereupon trichloroacetic acid was added clogged and thereby precipitated the impurities. After removing the precipitate and extraction of the excess trichloroacetic acid with ether was obtained aqueous solution subjected to freeze-drying in vacuo. This gave one an amorphous powder which has an ACTH activity of about 100 Armor Standard La-i-A owned.

1,6 g dieses pepsinverdauten Materials wurden in 25 ccm mit Schwefelwasserstoff gesättigtem Wasser gelöst. Diese Lösung wurde mit einer Geschwindigkeit von 8 ccm/Stunde durch eine 8o cm hohe Harzsäule von 2 cm Durchmesser abwärts strömend (das Harz war unter--Verwendung von Amberlite IRC-So nachdem im Beispiel i beschriebenen Verfahren hergestellt) geleitet, wodurch das Harz die ACTH- aktiven, in der Lösung vorhandenen Stoffe adsorbierte. Die Säule wurde dann gewaschen, und zwar zuerst mit 150 ccm Wasser, welches mit Schwefelwasserstoff gesättigt war, mit einer Geschwindigkeit von etwa 30 ccm/Stunde, dann mit iooo ccm einer ioo/oigen wäßrigen Lösung von Pyridin, die etwa 0,5 g Natriumsulfit enthielt, und schließlich mit 250o ccm einer ioo/oigen wäßrigen Essigsäure, die mit Schwefelwasserstoff gesättigt war. Hierdurch wurden alle Stoffe, die eine niedrigere Basizität als Corticotropin-B und ein geringere oder gar keine ACTH-Aktivität besitzen, entfernt.1.6 g of this pepsin-digested material was dissolved in 25 cc of water saturated with hydrogen sulfide. This solution was passed downward at a rate of 8 cc / hour through a 8o cm high resin column 2 cm in diameter (the resin was prepared using Amberlite IRC-So according to the method described in Example i), whereby the resin the ACTH-active substances present in the solution adsorbed. The column was then washed, first with 150 cc of water saturated with hydrogen sulfide at a rate of about 30 cc / hour, then with 100 cc of a 100 per cent aqueous solution of pyridine containing about 0.5 g of sodium sulfite and finally with 250o cc of 100% aqueous acetic acid which was saturated with hydrogen sulphide. This removed all substances that had a lower basicity than corticotropin-B and a lower or no ACTH activity.

qoo ccm einer wäßrigen, mit Schwefelwasserstoff gesättigten Salzsäure von pH 2 wurden abwärts strömend durch die Harzsäule mit einer Geschwindigkeit von etwa Zoo ccm/Stunde geleitet, worauf man mit gleicher Geschwindigkeit iooo ccm wäßrige, mit Schwefelwasserstoff gesättigte Salzsäure von pH 1,58 hindurchleitete. Zwei entsprechende Eluatfraktionen wurden gesammelt, jede getrennt auf PH 2,5 bis 3 eingestellt, indem man ein stark basisches Anionenaustauschharz in Carbonatform zusetzte, worauf jedes Eluat gesondert filtriert und durch Gefriertrocknung im Vakuum konzentriert wurde. Die Verdampfung des dem ersten Eluierungsmittel von PH 2 entsprechenden Eluates ergab etwa Zoo mg Polypeptid, welches eine ACTH-Aktivität von etwa i5o Armour Standard La-i-A besaß. Die Verdampfung des dem zweiten Eluierungsmittels von pH 1,58 entsprechenden Eluates ergab . etwa 300 mg Polypeptid. Dieses Produkt wurde in Form eines amorphen weißen Pulvers als Chlorwasserstoffsalz gewonnen. Dieses Polypeptidpräparat besaß eine ACTH-Aktivität von etwa 3oo Armour Standard La-i-A. Beispiel 3 Es wurde ein ACTH-Konzentrat aus Rinderdrüsen hergestellt, indem man im wesentlichen das gleiche Verfahren anwendete, wie es in den ersten beiden Absätzen von Beispie12 für die Aufarbeitung von Schweinedrüsen beschrieben ist. Der so erhaltene »Methanol-Essigsäure-Extrakt« von Rinderdrüsen wurde nun mit Pepsin digeriert und anschließend mit Trichloressigsäure gefällt, wobei man im wesentlichen das gleich Verfahren verwendete, wie es im dritten Absat-r von Beispiel i beschrieben ist. Zu Zoo mg dieses pepsinverdauten ACTH-aktiven Konzentrates (ACTH-Aktivität etwa 2 Armour Standard La-i-A) wurden in 8o ccm Wasser gelöst. Diese Lösung wurde mit einer Geschwindigkeit von o,8 ccm/Min. durch eine So cm lange Harzsäule von einem Durchmesser von i,5 cm (das Harz war aus Amberlite IRC-So nach dem im Beispiel i beschriebenen Verfahren hergestellt; etwa i 5 % desselben lagen in Form des Natriumsalzes, der restliche Teil in Wasserstofform vor) geleitet, wodurch die in der Lösung vorhandenen ACTH-aktiven Stoffe von dem Harz adsorbiert wurden. Das Harzadsorbat wurde nun mit 23 ccm Wasser gewaschen, anschließend mit 20o ccm einer ioo/oigen wäßrigen Essigsäure mit einer Geschwindigkeit von .4 ccm/Min., wodurch man aus der Harzsäule die Verunreinigungen entfernte, die weniger basisch als Corticotropin-B waren.100 cc of aqueous hydrochloric acid of pH 2, saturated with hydrogen sulphide, was passed downwardly through the resin column at a rate of about zoo cc / hour, whereupon 100 cc of aqueous hydrochloric acid of pH 1.58, saturated with hydrogen sulphide, was passed at the same rate. Two corresponding eluate fractions were collected, each adjusted separately to pH 2.5 to 3 by adding a strongly basic anion exchange resin in carbonate form, whereupon each eluate was filtered separately and concentrated by freeze-drying in vacuo. Evaporation of the eluate corresponding to the first eluent of PH 2 gave about zoo mg of polypeptide, which had an ACTH activity of about 150 Armor Standard La-iA. Evaporation of the eluate corresponding to the second eluent of pH 1.58 gave. about 300 mg of polypeptide. This product was obtained as an amorphous white powder as a hydrogen chloride salt. This polypeptide preparation had an ACTH activity of about 300 Armor Standard La-iA. Example 3 A bovine gland ACTH concentrate was prepared using essentially the same procedure as described in the first two paragraphs of Example 12 for porcine gland reprocessing. The resulting "methanol-acetic acid extract" from bovine glands was then digested with pepsin and then precipitated with trichloroacetic acid, using essentially the same procedure as described in the third paragraph of Example i. To Zoo mg of this pepsin-digested ACTH-active concentrate (ACTH activity about 2 Armor Standard La-iA) were dissolved in 80 cc of water. This solution was at a rate of 0.8 ccm / min. through a resin column about 1.5 cm in length and 1.5 cm in diameter (the resin was made from Amberlite IRC-So according to the method described in Example i; about 1.5% of the same was in the form of the sodium salt, the remainder in the form of hydrogen) passed, whereby the ACTH-active substances present in the solution were adsorbed by the resin. The resin adsorbate was then washed with 23 cc of water, then with 20o cc of 100% aqueous acetic acid at a rate of .4 cc / min., Whereby the impurities which were less basic than corticotropin-B were removed from the resin column.

iooccm o,i5n-wäßrigerSalzsäure mit einem pü Wert von etwa o,8 wurden dann mit einer Geschwindigkeit von i,2 ccm/Min. durch die Säule geleitet. Dadurch wurde das ACTH-aktiv e Material vom Harzadsorbat eluiert. Dieses Salzsäureeluat wurde nun durch Gefriertrocknung im Vakuum konzentriert, der Rückstand in Methanol gelöst, Äther zugesetzt und der Niederschlag durch Schleudern und Vakuumtrocknung bei Raumtemperatur gewonnen. Man erhielt So mg eines ACTH-Konzentrates von einer ACTH-Aktivität von etwa 5 Armour Standard La-i-A. Beispiel q. Ein Corticotropin-Konzentrat (»Säure-Aceton-Pu'ver«), das aus Schweinedrüsen durch Salzsäure-Aceton-Extraktion gewonnen war, wurde direkt mit Pepsin digeriert. Anschließend wurden durch Fällung mit Trichloressigsäure die Verunreinigungen nach dem Verfahren entfernt, :wie es im Absatz 3 des Beispiels i beschrieben ist. Das so gewonnene pepsinverdauteMaterial hatte eineACTH-Aktivität von etwa 3 Armour Standard La-i-A.iooccm o, i5N aqueous hydrochloric acid with a pu value of about 0.8 then at a rate of 1.2 cc / min. passed through the column. Through this the ACTH-active material was eluted from the resin adsorbate. This hydrochloric acid eluate was then concentrated by freeze-drying in vacuo, the residue in methanol dissolved, ether added and the precipitate by centrifugation and vacuum drying obtained at room temperature. So mg of an ACTH concentrate were obtained from one ACTH activity of about 5 Armor Standard La-i-A. Example q. A corticotropin concentrate (»Acid-Aceton-Pu'ver«), obtained from pig glands by hydrochloric acid-acetone extraction was obtained, was digested directly with pepsin. Then were by precipitation with trichloroacetic acid removes the impurities after the process: as it is described in paragraph 3 of example i. The pepsin-digested material thus obtained had an ACTH activity of about 3 Armor Standard La-i-A.

5,5 g dieses pepsinverdauten Materials wurden in 700 ccm Wasser gelöst. Diese Lösung wurde mit einer Geschwindigkeit von 5 ccm/Min. durch zwei in Reihe geschaltete Harzsäulen geleitet. Jede dieser Säulen hatte eine Länge von 1,5 m und einen Durchmesser von i,8 cm. Das Harz in der ersten Säule war durch Vorbehandlung von i50 g Amberlite IRC-5o mit i2oo ccm einer wäßrigen Natronlauge hergestellt, welche insgesamt 39 NaOH enthielt, so daß das Harz zum Teil in das Natriumsalz übergeführt war. Die zweite Säule enthielt i50 g Amb.erlite IRC-5o, welches vollständig in Wasserstofform vorlag. Beim Strömen, der Lösung des pepsinverdauten Materials durch die Säulen wurden die ACTH-aktiven, in der Lösung enthaltenen Stoffe an dem Harz adsorbiert. Das Harz in den Säulen wurde anschließend mit 400 ccm Wasser und danach mit iooo ccm ioo/oiger wäßriger Essigsäure mit der Geschwindigkeit von io ccm/ Min. gewaschen. Hierdurch wurden die Verunreinigungen, die weniger basisch als Corticotropin-B waren, aus den Harzsäulen entfernt.5.5 g of this pepsin-digested material were dissolved in 700 cc of water. This solution was at a rate of 5 cc / min. passed through two resin columns connected in series. Each of these columns was 1.5 m long and 1.8 cm in diameter. The resin in the first column was prepared by pretreating 150 g of Amberlite IRC-50 with 100 cc of an aqueous sodium hydroxide solution which contained 39 NaOH in total, so that the resin was partially converted into the sodium salt. The second column contained 150 g of Amb.erlite IRC-50, which was completely in hydrogen form. As the solution of the pepsin-digested material flowed through the columns, the ACTH-active substances contained in the solution were adsorbed on the resin. The resin in the columns was then washed with 400 cc of water and then with 100 cc of 100% aqueous acetic acid at a rate of 10 cc / min. This removed the impurities that were less basic than corticotropin-B from the resin columns.

Das gewaschene Harzadsorbat in den Säulen wurde nun mit vierzehn gesonderten Anteilen von wäßriger Salzsäure eluiert; die ersten vier Eluierungen wurden mit einer 0,o15 n-HCl (PH 1,8), die fünfte bis neunte Fraktion mit je 0,o28 n-HCl (PH 1,55) und die zehnte bis vierzehnte Fraktion mit je o,io n (pH i) durchgeführt. Das Volumen jeder Eluatfraktion betrug 200 ccm, ausgenommen Fraktion 4, bei welcher 400 ccm verwendet wurden. Die einzelnen Eluate wurden gesondert gesammelt und einzeln lyophilisiert. Das so erhaltene feste Produkt wurde in jedem Falle in Methanol gelöst und aus dieser Lösung durch Zusatz von Äther ausgefällt. Darauf wurde die ACTH-Aktivität jeder Fraktion bestimmt. Die Fraktion 5, die 236 mg ausmachte, hatte eineACTH-Aktivität von weniger als 6 Armour Standard La-i-A. Die Fraktionen 7, 8 und 9, welche 185, 18o bzw. 139,8 mg wogen, hatten ACTH-Aktivitäten zwischen 18 und 23 Armour Standard La-i-A. Die Fraktionen io, 13 und 14 wogen 81,5, 119,8 bzw. i io mg und hatten ACTH-Aktivitäten zwischen 7 und io Armour Standard La-i-A.The washed resin adsorbate in the columns was now separated with fourteen Portions of aqueous hydrochloric acid eluted; the first four elutions were with one 0.015 n-HCl (PH 1.8), the fifth to ninth fraction each with 0.028 n-HCl (PH 1.55) and the tenth to fourteenth fractions with o, io n (pH i) each. The volume of each eluate fraction was 200 cc, except for fraction 4, in which 400 cc were used. The individual eluates were collected separately and individually lyophilized. The solid product thus obtained was dissolved in methanol in each case and precipitated from this solution by adding ether. This was followed by ACTH activity determined by each faction. Fraction 5, which was 236 mg, had ACTH activity less than 6 Armor Standard La-i-A. Fractions 7, 8 and 9, which 185, Weighed 18o and 139.8 mg, respectively, had ACTH activities between 18 and 23 Armor Standard La-i-A. Fractions 10, 13 and 14 weighed 81.5, 119.8 and 10 mg, respectively, and had ACTH activities between 7 and io Armor Standard La-i-A.

73o mg pepsinverdautes Material, welches in der oben beschriebenen Weise der Harzadsorption und der Eluation unterworfen und aus Fraktionen ausgewählt war, deren ACTH-Aktivität etwa 2o0 Armour Standard La-i-A betrug, wurden in 125 ccm Wasser gelöst. Diese Lösung wurde mit einer Geschwindigkeit von o,8 ccm/Min. durch eine Harzsäule geleitet, deren Länge i,8 m und deren Durchmesser 2 CM betrüg (das Harz in der Säule war nach dem im Beispiel i beschriebenen Verfahren hergestellt; etwa 1511/9 desselben lagen in Form des Natriumsalzes, der restliche Teil in Wasserstofform vor). Dadurch wurden die in der Lösung vorhandenen ACTH-aktiven Stoffe an dem Harz adsorbiert. Das Harzadsorbat wurde nun nacheinander mit Zoo ccm Wasser mit einer Geschwindigkeit von 3 ccm/Min., mit iooo ccm einer ioo/o-igen wäßrigen Lösung von Pyridin mit einer Geschwindigkeit von io ccm/Min. und mit 2ooo ccm ioo/oiger wäßriger Essigsäure mit einer Geschwin= digkeit von io ccm/Min. ausgewaschen, wodurch man die Verunreinigungen aus dem Harz entfernte, welche weniger basisch als Corticotropin-B waren.730 mg of pepsin-digested material, which had been subjected to resin adsorption and elution in the manner described above and was selected from fractions whose ACTH activity was about 2o0 Armor Standard La-iA, were dissolved in 125 cc of water. This solution was at a rate of 0.8 ccm / min. passed through a resin column, the length of i, m 8 and its diameter 2 cm betrüg (the resin in the column was prepared by the in Example i-described method; about 1511/9 thereof were in the form of the sodium salt, the remaining part in hydrogen form ). As a result, the ACTH-active substances present in the solution were adsorbed on the resin. The resin adsorbate was then successively with zoo cc of water at a rate of 3 cc / min., With 100 cc of a 100 / o strength aqueous solution of pyridine at a rate of 10 cc / min. and with 2,000 cc of 100% aqueous acetic acid at a rate of 10 cc / min. washed out, thereby removing the impurities from the resin which were less basic than corticotropin-B.

Dann wurden 50o ccm einer o,oi5 n-wäßrigen Salzsäure (pH etwa 1,8) nun mit einer Geschwindigkeit von 12 ecm/M:n. und schließlich wurden 1,51 o,o28n-wäßrige Salzsäure mit einerGeschwindigkeit von 3 ccm/Min. durch die Säule geleitet. Zwei entsprechende Eluatfraktionen wurden gesammelt, jedes Eluat gesondert getrocknet und im Vakuum durch Gefriertrocknung konzentriert. Die Rückstände wurden gesondert in Methanol gelöst und durch Zusatz von Äther ausgefällt. Die Ausfällungen wurden getrennt abfiltriert und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Die Ausfällung, die dem 0,015 n-Salzsäure-Eluat entsprach, enthielt Material von geringer ACTH-Aktivität. Aus dem 0,o28 n-Salzsäure-Eluat wurden 81 mg eines ACTH-aktiven Materials gewonnen, dessen ACTH-Aktivität etwa 8o Armour Standard La- i-A betrug.Then 50 ccm of an o, oi5 N aqueous hydrochloric acid (pH about 1.8) now at a speed of 12 ecm / M: n. and finally 1.51 were o, o28n-aqueous Hydrochloric acid at a rate of 3 cc / min. passed through the column. Two Corresponding eluate fractions were collected, and each eluate was dried separately and concentrated in vacuo by freeze drying. The residues were separated dissolved in methanol and precipitated by adding ether. The precipitates were filtered off separately and dried in vacuo at room temperature. The precipitate, which corresponded to the 0.015 N hydrochloric acid eluate contained material of low ACTH activity. 81 mg of an ACTH-active material were obtained from the 0.028 N hydrochloric acid eluate, whose ACTH activity was about 80 Armor Standard La-i-A.

Claims

CLAIMS: i. Process for obtaining polypeptide preparations high ACTH activity, characterized in that an optionally prepurified Solution of an ACTH-active, pepsin-digested pituitary extract in contact with a Resin brings its exchange capacity mainly due to its content of carboxyl groups based on what you treated the resin adsorbate with aqueous mineral acid to the ACTH-active substances selectively elute from the resin, and finally the eluate evaporates.

2. The method according to claim i, characterized in that one is used as the eluent a hydrohalic acid or sulfuric acid or phosphoric acid is used.

3. Process according to Claim i, characterized in that, firstly, an aqueous Solution of an ACTH-active pepsin-digested material, which is produced by adsorption of the ACTH-active substances from pituitary extract on oxycellulose, elution of this adsorbate with aqueous mineral acid and about a day's treatment of the ACTH-active obtained in this way En concentrate obtained in aqueous acidic solution at about 35 to 40 ° with pepsin and secondly, a buffered cation exchange resin, its exchange capacity is mainly based on carboxyl groups and about i54 / 0 is in sodium form, brings into contact with each other, then impurities from the resin adsorbate with a weakly alkaline solution, then with weakly acidic aqueous solutions of one p $ washes out for about 2, then the washed out resin adsorbate with aqueous mineral acid eluted from pH i to 1.8 and evaporated the eluate containing the ACTH-active material.

4. The method according to claim i to 3, characterized in that for the elution of the oxycellulose adsorbate aqueous hydrochloric acid that to wash out the impurities from the resin adsorbate successively aqueous pyridine solution, aqueous acetic acid and aqueous hydrochloric acid from PA about 2 and to elute the active ingredient from the washed out Resin adsorbate aqueous hydrochloric acid from p $ 1.5 to 1.6 is used. Documents considered: German Patent No. 550935; Swiss patent specification No. 164 041.