Verfahren zur Herstellung eines neuen Präparates mit adrenotroper und corticotroper Wirkung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen, corticotrop und adrenotrop wirkenden Poly- pepiidpräparates, unter Verwendung eines Pepsinabbauproduktes aus Hypophysenex- trakten als Ausgangsmaterial.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist da durch gekennzeichnet, dass man die Lösung eines Pepsinabbauproduktes eines Hypo- physenextraktes mit einem Kationenaustau- scherharz, dessen Austauschvermögen vor wiegend auf Carboxylgruppen zurückzu führen ist, in Berührung bringt, wobei die ACTH-wirksamen Stoffe an das Harz adsor- biert werden, hierauf diese Stoffe mit einer wässerigen Mineralsäure selektiv eluiert und das Eluat eindampft.
Es sind schon zahlreiche Extrakte und Konzentrate aus Hirnanhangdrüsen herge stellt worden, welche eine adrenotrope und corticotrope Hormonwirksamkeit (im folgen den ACTH-Wirkung genannt) besitzen, doch waren diese bisherigen Produkte sehr unrein und bestanden zur Hauptsache aus Stoffen, denen eine ACTH-Wirkung kaum oder über haupt nicht eigen war.
Ausserdem sind die bisher hergestellten Hypophysenextrakte (de ren AC'TH-Wirkung anscheinend auf das darin vorhandene Corticotropin zurückzu führen ist, welches das in der Hypophyse vor kommende, natürliche ACTH-wirksanie Prin- zip darstellt), sogar nach einer hochgradigen Reinigung von verhältnismässig geringer Wirksamkeit. Selbst das reine Corticotropin weist keine so starke Wirkung auf, wie das erfindungsgemässe Polypeptidpräparat, welch letzteres etwa die dreihundertfache Wirksam keit des Armour Standardpräparates La-1-A besitzt.
Dieses Standardpräparat ist: ein von der Armour & Co. hergestelltes, standardi siertes Corticotropinprodukt. Es wird im folgenden als Vergleichsmass für die ACTH- Wirksamkeiten der verschiedenen, im Laufe des erfindungsgemässen Verfahrens erhalte nen Extrakte und Konzentrate benützt.
Das erfindungsgemäss erhaltene Polypep- tidpräparat, das meist als Additionssalz einer Säure zur Anwendung gelangt, ist ein fester, amorpher, weisser Stoff, der weniger als 1 Schwefel und eine zu vernachlässigende Menge Asche enthält. Als Hydrochlorid ist das Polypeptidpräparat in Wasser und Metha nol löslich, wenig löslich in trockenem Ätha- nol und unlöslich in trockenem Aceton, Äther, Chloroform und Benzol.
Das Absorptions spektrum dieses Hydrochlorides im Infra roten lässt nur auf Amidbindungen schliessen; im Gebiet zwischen 2300 und 4000 A erscheint ein einziges Maximum bei etwa 2750-2780A; E iö m etwa 18 bis 20. Das Präparat zeigt höchstens eine sehr geringe, nahezu negative liinhydrinreaktion, wenn 60 Mikrogramm Präparat in 10 Mikrolitern Wasser auf ein Filterpapier gebracht werden und das Papier dann mit einer 0,1 %igen Ninhydrinlösung in n-Butanol eingesprüht und 5 Minuten bei <B>80'</B> C getrocknet wird.
Beim Analysieren des in der Foren des Trichloressigsäure-Additionssalzes vorliegen den Polypeptidpräparates nach dem Craig- schen Gegenstromverfahren, wobei das Sy stem sec. Butanol-0,5%ige, wässerige Tri- chloressigsäure verwendet wird, zeigt. es sich, dass das Präparat aus mindestens drei Kom ponenten besteht.
Das Trichloressigsäure- Additionssalz einer dieser Komponenten (das Corticotropin-B genannt wurde und extrem hohe Wirksamkeit besitzt) hat im genannten Zweiphasensystem einen Verteilungskoeffi zienten von etwa 0,6.
Das neue erfindungsgemäss erhaltene Prä parat erleidet in Berührung mit Luft oder andern Oxydationsmitteln sehr leicht Aktivi- tätsverluste. Diese Inaktivierung, welche offenbar auf einer Oxydation der Polypeptid- moleküle zu weniger wirksamen Oxydations produkten beruht, kann durch die Einwir kung gelinder Reduktionsmittel, wie Schwe felwasserstoff, Cystein, Thioglykolsäure, N a- triumsulfit und ähnlicher Stoffe, wieder rück gängig gemacht werden.
Dagegen wird die ACTH-Wirkung des Präparates durch Hydro lyse irreversibel zerstört. So geht zum Beispiel die ACTH-Wirksamkeit praktisch vollstän dig und dauernd verloren, wenn das Polypep- tidpräparat in wässeriger, 0,3n Salzsäure eine Stunde auf 100 C erhitzt wird.
Wenn das erfindungsgemässe Polypeptidpräparat nach Stein und Moore hydrolysiert wird, wobei das Gewicht der verwendeten 6n Salzsäure 200mal so gross wie das Gewicht des hydrolysierten Produktes genommen und in Stickstoff atmosphäre gearbeitet wird, werden im Hydrolysat bei der Analyse nach Moore und Stein die folgenden Aminosäuren gefunden Glycin, Alanin, Valin, Prolin, Seren, Phenyl- alanin,
Tyrosin, Methionin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Histidin, Lysin und Arginin. Dagegen sind Cystin, Threonin, Leuein und Isoleucin im Hydrolysat nicht enthalten.
Die Analysenergebnisse sind aus der folgenden Tabelle zu ersehen:
EMI0002.0055
Stiekstoffgehalt:
<tb> Prozente <SEP> vom <SEP> Gesamt Aminosäure <SEP> stickstoff <SEP> im <SEP> Hy <SEP> droly <SEP> sat
<tb> (Mittel <SEP> zweier <SEP> verschie dener <SEP> Präparate)
<tb> Glycin <SEP> 6,9
<tb> Alanin
<tb> Valin <SEP> 6.1
<tb> Leucin <SEP> rieht <SEP> vorhanden
<tb> Isoleucin <SEP> nicht <SEP> vorhanden
<tb> Prolin <SEP> <B>6,6</B>
<tb> Seren <SEP> 3,1
<tb> Threonin <SEP> nicht <SEP> vorhanden
<tb> Phenylalanin <SEP> <B>1-1,5</B>
<tb> Tyr <SEP> osin <SEP> 4,7
<tb> Cystin <SEP> nicht <SEP> vorhanden
<tb> Methionin <SEP> 1,7
<tb> Asparaginsäure <SEP> 4,8
<tb> Glutaminsäure <SEP> 6,1
<tb> Histidin <SEP> <B>6,3</B>
<tb> Lysin <SEP> 16,4
<tb> Arginin <SEP> 228,7
<tb> Ammoniak <SEP> <U>3,</U>6
<tb> 100,
0 Zur Herstellung des Ausgangsmaterials kann von den Hypophysendrüsen selber, z. B. von Hypophysen der Schweine, Rinder oder Schafe, ausgegangen, oder es können die im Handel erhältlichen ACTH-wirksamen Hypophysenextrakte oder deren Konzen trate verwendet werden.
Wenn vom Drüsen niaterial selber ausgegangen wird. kann die ses nach dein Verfahren von Li und Mitarbei tern der Salzsäure-Aceton-Extraktion unter worfen werden, wodurch ein Corticotropin- konzentrat erhalten wird, das von Li Säure- Aceton-Pulver genannt wird. Ein derartiges im Handel befindliches Präparat ist das Acthar A der Armour Co.
Statt das Ver fahren nach Li anzuwenden, bevorzugt man gewöhnlich ein Verfahren, bei dem durch Extraktion mit Aceton zuerst die Fettstoffe und das Wasser aus den Drüsen entfernt. wer den, worauf der Rückstand mit einer metha- nolischenEssigsäure extrahiert wird.
Beien Zu- satz von Äther zum Methanolextrakt scheidet sich ein ACTH-wirksames Konzentrat aus, (las im folgenden Methanol-Essigsäure-Ex- t i a.kt #> genannt wird.
Der Hypophysenextrakt (dessen Wirk samkeit gewöhnlich etwa 3-5 mal so gross ist wie diejenige des Armour Standards La-1-A) wird zweckmässig wie folgt weiter verarbeitet fr wird in Lösung mit Oxycellulose zusam- niengebracht, wobei die ACTH-wirksanien Substanzen selektiv adsorbiert werden.
Mit Hilfe einer wässerigen Mineralsäurelösung lassen sie sich wieder ehiieren. Die Adsorption wird durchgeführt, indem der Drüsenextrakt in einer schwach sauren, wässerigen Säure lösung, z. B. in verdünnter, etwa 0,1n Essig- säiire, gelöst und diese Lösung mit der Oxy- cellulose in Berührung gebracht wird.
Zu bevorzugen ist vorgewaschene Oxycellulose, die, erhalten werden kann, indem man han delsmässige Oxycellulose mit etwa 10-12% freiem Carboxyl zuerst in verdünnter, wässe riger Salzsäure und dann in verdünnter, wässeriger Essigsäure wäscht. Nachdem die Oxycellulose die ACTH-wirksamen Substan zen adsorbiert hat, wird sie mit verdünnter, wässeriger Mineralsäure, vorzugsweise 0. In Salzsäure, behandelt, wodurch die adsorbier- ten Stoffe eluiert werden.
Das Eluat wird auf einen p. von maxifinal 2,5-3 eingestellt, was mit Vorteil durch Behandeln des Ehiates mit einem stark basischen, in der Carbonatform vorliegenden Ionenaustauscherharz geschieht.
Dann wird das Harz abfiltriert und das Filtrat zu einem Konzentrat eingedampft, das ge- wöhnlieh etwa die 60-85fache ACTH-Wirk- samkeit des Armour Standards La-1-A auf weist.
Dieses Konzentrat wird dann unter verhältnismässig gelinden Bedingungen finit Pepsin abgebaut. Dieser Pepsinabbau wird gewöhnlich in saurer, wässeriger Lösung (pH etwa 2-3) und bei Temperaturen zwischen etwa 35 und 40' C während etwa eines Tages drirchgef'ührt. Die abgebaute Lösung wird hierauf zur Zerstörung des Pepsins erhitzt, dann gekühlt und Trichloressigsäure zuge setzt,
wodurch sich die Verbindungen mit höheren Molek ulargewiehten und geringer ACTH-Wirksainkeit ausscheiden. Die ge klärte, wässerige Lösung wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lö sungsmittel, etwa mit Äther, extrahiert, wodurch der Überschuss an Trichloressig- säure entfernt wird und die wässerige Schicht dann im gefrorenen Zustand im Vakuum ein gedampft, wobei ein pepsinabgebautes Pro dukt, zurückbleibt. Meist wird beim erfin dungsgemässen Verfahren ein auf diese Weise erhaltenes Produkt verwendet.
Es hat etwa die 80fache Wirkung des Armour Standards La-1-A und enthält die Polypeptidmischung zusammen mit Stoffen geringerer Basizität, welche geringere oder keine ACTH-Wirkung aufweisen.
_ Unter Umständen kann auch ein Produkt, das durch Pepsinabbau aus einem nicht vor her an Oxycellulose adsorbiertem Drüsen extrakt hergestellt wurde, als Ausgangs material für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden.
Kationenaustauscherharze mit polaren Carboxylgruppen wurden in der Literatur beschrieben. Gewöhnlich werden sie herge stellt, indem man ein Phenol und einen Alde hyd kondensiert, wobei die eine oder andere dieser Komponenten eine Carboxylgruppe enthält, besonders durch Kondensation von Resorcylsäure mit Formaldehyd. Eine andere Herstellungsmöglichkeit ist die Copolymeri- sierung einer polymerisierbaren Säure mit einer Divinylverbindung, also einer Verbin dung, welche zwei CH2=CH-Gruppen be sitzt, z.
B. von Acryl- oder Methacrylsäure mit Divinylbenzol. Die Kationenaustausch- fähigkeit aller dieser Harze ist auf die in ihrem Molekül vorhandenen Carboxylgrup- pen zurückzuführen. Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird als Harz ein Copolymer von Acryl- oder Metha- crylsäure mit Divinylbenzol bevorzugt, bei welchem die Divinylkomponente zwischen 2,5 und 5% des Harzes ausmacht.
(Ein der artiges Harz ist z. B. das im Handel erhält liche Amberlite IRC-50 [Markenprodukt] von Rohm & Haas Co.) Solche Harze be sitzen eine ausgesprochen selektive Adsorp- tionsfähigkeit für die im pepsinabgebauten Material enthaltenen ACTH-wirksamen Stof fe. Das Harz kann zwar in der Wasserstofform verwendet werden, es ist aber besser, es in der gepufferten Form anzuwenden.
Diese letztere wird erhalten, indem das Harz mit einer wässerigen Lösung eines Alkahhydroxydes, etwa mit Natron- oder Kalilauge, vorbehan delt und so teilweise in die Alkalisalzform ver wandelt wird. Das Verhältnis von Wasser stoff zu gebildetem Salz wird mit Vorteil so gewählt, dass die mit dem Harz behandelte Lösung des pepsinabgebauten Produktes einen bei etwa 5-7 liegenden pH aufweist.
Zur Adsorption wird das pepsinabgebaute Material vorzugsweise in Wasser gelöst, das mit Vorteil ein schwaches Reduktionsmittel, wie Schwefelwasserstoff, Natriumsulfit, Thio- glykolsäure, Cystein und dergleichen, enthält und die Lösung durch eine mit dem Aus tauschharz (vorzugsweise in gepufferter Form vorliegend) gefüllte Kolonne geschickt.
Die Durchflussgeschwindigkeit wird mit Vorteil so gewählt, dass eine praktisch vollständige Adsorption der ACTH-aktiven Substanzen möglich ist. Bei Verwendung eines richtig gepufferten Harzes liegt der p, der austre tenden Flüssigkeit bei etwa 5-7. Bei höheren pn-Werten ist eine vermehrte Inaktivierung der Polypeptidmischung zu befürchten, zu tiefe PH-Werte führen leicht zu unvollstän diger Adsorption, da ja stark saure Lösungen als Eluierungsmittel wirken.
Nach der Adsorption wird die Kolonne zweckmässig zuerst mit. Wasser, dann mit einer schwach basischen wässerigen Lösung und schliesslich mit einer wässerigen, schwach sauren Säurelösung ausgewaschen, wodurch die Stoffe mit geringerer Basizität als die der Polypeptidmischung, welche geringe ACTH- Wirkung besitzen, ausgewaschen werden.
Überraschenderweise wird durch das be schriebene Waschen nur Material mit gerin ger oder ganz fehlender ACTH-Wirkung aus gewaschen, währenddem die stark wirksamen Substanzen praktisch vollständig adsorbier t bleiben. Als schwach basische Waschflüssig keit wird gewöhnlich eine -wässerige Lösung eines tertiären heterocy clischen Amines, z. B.
eine wässerige Pyridin-, Picoli_n-. Lutidin- oder Collidinlösung, verwendet. ; bevorzugt wird eine wässerige Pyridinlösung. Hierauf wird meist noch mit der wässerigen Lösung einer niederen Fettsäure, wie Essigsäure, Propionsäure. Ameisensäure und dergleichen, gewaschen.
Um die Wirksamkeitsverluste beim Waschprozess möglichst tief zu halten, wird den Waschflüssigkeiten gewöhnlich ein schwaehes Reduktionsmittel zugesetzt, das zweckmässig so gewählt wird, dass es imstande ist, organische Disulfide zu den entspreehen- den Sulfhydrylverbindungen zu reduzieren.
In Frage kommen beispielsweise Schwefel wasserstoff, Natriumsulfit, Natriiimthiosttl- fat, Thioglykolsäure, Cystein und derglei chen.
Das gewaschene Harzadsorbat wird zweck mässig zuerst mit einer wässerigen Mineral säurelösung, etwa einer Lösung von Chlor wasserstoff, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen, eluiert. Vorzugsweise wer den verdünnte Säuren mit einem über etwa <B>1,8</B> liegenden h, verwendet, was einer Nor malität von etwa 0,015 entspricht.
Durch diese Säurelösungen werden solche Stoffe eluiert, welche eine geringere Basizitä;t und niedrigere ACTH-Wirksamkeit besitzen als die erfindungsgemässe Polypeptidmischung. Hierauf wird zweckmässig mit einer wässeri gen Mineralsäurelösung, etwa einer Lösung von Schwefelsäure, Phosphorsäure oder einer Halogenwasserstoffsäure. eluiert, deren etwa zwischen 1,0 und 1,8 liegt.
(0,1n bis 0,015n), wodurch die hoch-vc-irksainen Poly- peptide herausgelöst werden. Eine wässerige Minerallösung mit einem pl, zwischen 1.5 und 1,6 (0,03_ n und 0,025n) wird bevorzugt.
Das Eluat kann dann im gefrorenen Zustand eingedampft werden, wodurch ein Polypep- tidpräparat erhalten wird, dessen ACTH- Wirksamkeit etwa 300mal grösser ist als die des Arinour Standards La-1-A und das die bereits angegebene Zusammensetzung auf weist.
Das Polypeptidpräparat wird gewöhnlich in der Form eines Säureadditionssalzes ver- wendet, da es in dieser Form haltbarer ist als in Foi in der freien Base. Immerhin kann auch die freie Base hergestellt werden, indem man das Additionssalz, z. B. das Hydrochlorid, in 3fetlianol löst und eine organische Base, etwa Triä thylamin, zusetzt, wodurch die freie Base ausgefällt wird.
Durch Reaktion mit, einer Saure. doppeltem Umsatz oder Ionenaus- tausch können aus der freien Base oder den Additionssalzen die verschiedensten Addi- l ionssalze auf bekannte Weise hergestellt werden.
<I>Beispiel 1</I> 40 g Corticotropinkonzentrat (Säure-Ace- tonpulver), das durch Salzsäure-Aceton- Extraktion aus Schweinehypophysen erhal ten worden war und das die vierfache ACTH- Wirksamkeit des Armour Standards 'La-1-A zeigte, wurde in 1200 cm3 0,1n wässerige Essigsäure gebracht.
Die Mischung wurde mehrere Stunden gerührt und dann zur Ent fernung einer kleinen Menge unlöslichen Materials filtriert. Dem Filtrat wurden 40 g gewaschene Oxycellulose zugesetzt (herge stellt durch Auswaschen einer handels üblichen Oxycellulose init etwa 10-20% freiem Carboxyl;
als erste Waschflüssigkeit diente n-Salzsäure, als zweite Waschflüssig keit 0,1n wässerige Essigsäure) und die Mi schung bei annähernd Zimmertemperatur etwa 24 Stunden gerührt, wobei das ACTH- wirksa-me Material an die Oxycellulose ad sorbiert wurde. Die Oxycellulose mit dein Adsorbat wurde abfiltriert und mehrmals mit je 200 cin3 0,1n wässeriger Essigsäure gewaschen.
Nun wurden 200 cm3 wässerige 0,1n Salz säure beigefügt und die Mischung etwa eine halbe Stunde gerührt. Dann wurde filtriert, die Oxycellulose zu neuen 200 cm3 0, In Salz säure gegeben, die Mischung wieder etwa eine halbe Stunde gerührt und schliesslich filtriert. Die Filtrate wurden zusammengegossen und der PH durch Zusatz eines stark basischen Anionaustauschharzes in Carbonatform auf etwa 2,5-3 eingestellt.
Das Harz wurde ab filti iert und das Filtrat iin gefrorenen Zu- stand eingedampft, wodurch 1,5 g eines wei- ssen, amorphen Pulvers erhalten wurden, das etwa 75mal wirksamer war als der Armour Standard La-1-A.
6,4 g dieses Pulvers wurden in 320 em@ Wasser gelöst und der Lösung 23,7 mg Pepsin zugesetzt. Der PH der Lösung wurde durch Zusatz einiger Tropfen verdünnter wässeriger Salzsäure auf etwa 2,5 gebracht, dann wurde die saure Lösung etwa 24 Stunden bei einer Temperatur von ungefähr 3 7 C stehenge lassen. Hierauf wurde zur Zerstörung des Pepsins etwa 15 Minuten auf<B>90'</B> C erhitzt, nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur 36 em@ einer wässerigen 50%igen Trichlor- essigsäurelösung zugesetzt und die Mischung etwa eine Stunde stehengelassen.
Das aus geschiedene Material (hochmolekulare Sub stanzen mit geringer ACTH-Wirksamkeit) wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Die klare Lösung (Volumen etwa 350 crn3) wurde dann sechsmal mit je 350 cm3 Äther extra hiert und so der Überschuss von Trichlor- essigsäure entfernt. Die wässerige Lösung wurde anschliessend zur Entfernung des Ätherrückstandes im Vakuum erwärmt, hier auf gefi oren und im Vakuum eingedampft, wobei etwa 5,6 g eines weissen, amorphen Pulvers erhalten wurden.
Dieses pepsin- abgebaute Produkt erwies sich als 80mal ACTH-wirksamer als der Armour Standard La-1-A.
300 mg dieses Pulvers wurden in 10 cm' einer praktisch gesättigten, wässerigen Schwe- felwasserstofflösung aufgelöst und die Lösung durch eine wie folgt vorbereitete Kolonne ge schickt: 25 g gekörntes<I>Harz</I> ( Amberlite IRC-50 , ein Kationenaustauscher von Rohm & Haas, dessen Austauschvermögen vorwiegend auf Carboxylgruppen beruht) in der Wasserstoff- form wurde mit 200 cx & Wasser verrührt und der Mischung langsam 0,5 g gelöstes Natrium hydroxyd zugesetzt.
Nach erfolgter Adsorp- tion der Natriumionen wurde das Harz mit Wasser gewaschen und so ein Harzmaterial erhalten, das zu etwa 151)/" in der Natrium salzform vorlag. Es wurde in eine 50-em3- Bürette gefüllt und die Harzkolonne mit einer praktisch gesättigten, wässerigen Schwe- felwasserstofflösung aufgefüllt.
Die Durchtrittsgeschwindigkeit der Lö sung durch die Harzkolonne wurde so ge wählt, dass die behandelte Lösung nach etwa anderthalb Stunden durchgeflossen war. Diese Zeit ist für die vollständige Adsorption der ACTH-aktiven Stoffe an das Harz aus reichend.
Nun wurden 50 cm3 gesättigte wässerige Schwefelwasserstofflösung mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 cin3 pro Minute durch die Kolonne geschickt, dann im Laufe von etwa 3 Stunden zuerst mit 250 cm3 einer 10%igen, wässerigen Pyridinlösung, welche etwa 125 mg Natriumsulfit enthielt und dann mit 500 cm3 10 % iger, wässeriger, finit. Schwe felwasserstoff praktisch gesättigter Essig säure gewaschen,
wodurch die Stoffe mit ge ringerer Basizität als Corticotropin-B und geringer oder fehlender ACTH-Wirkung ent fernt wurden.
Nun wurden 200 cm3 wässerige, mit Schwefelwasserstoff gesättigte Salzsäure mit einem PH von 2 mit der Geschwindigkeit von 100 cm3 pro Stunde durch die Harzkolonne geschickt, hierauf mit der gleichen Geschwin digkeit 200 cin3 einer ebenfalls mit Schwefel wasserstoff gesättigten, wässerigen Salzsäure mit dem p. <B><I>1,
58.</I></B> Die beiden Eluate wurden jedes für sich durch Zusatz des stark basi schen Anionaustauschharzes Amberlite IRA- 400 r> in der Carbonatform auf den PH 21-5-3 gebracht, filtriert und einzeln im gefrorenen Zustand im Vakuum eingedampft.
Aus der ersten Fraktion wurden so 60 mg, aus der zweiten 40 mg eines Polypeptidpräparates erhalten, beide als amorphe, weisse Pulver und in der Form des Hydrochlorides. Beide Pro dukte wurden nach der Methode von Sayers und Mitarbeitern geprüft und zeigten etwa 300mal so grosse ACTH-Wirksainkeit wie der Armour Standard La-1-A. Beispiel <I>2</I> 500 g frische, ganze, gefrorene Schweine hypophysen wurden mit 1000 cm3 Aceton vermischt und die Mischung in einem Misch werk homogenisiert.
Die erhaltene Mischung wurde mit 2 Litern Aceton versetzt und etwa 3 Stunden gerührt, worauf die oben schwim mende Flüssigkeit dekantiert und weggewor fen wurde. Die bleibende Flüssigkeit wurde zweimal mit je 2000 cni3 Aceton und einmal mit 2000 ein' Methanol gewaschen, wodurch praktisch die gesamten im Ausgangsmaterial vorhandenen Fettsubstanzen und auch das Wasser entfernt wurden. Auch diese Wasch flüssigkeiten wurden nicht weiter verwendet. Das übrigbleibende Drüsenmaterial wurde abfil.triert, mit Äther gewaschen und an der Luft getrocknet.
Es blieben etwa 100 g festes Material, das bei der Prüfung nach Sayers etwa die halbe Wirksamkeit des Armour Standards La-1-A zeigte.
Dieses wurde nun mit 900 cm3 Methanol vermischt und in einem mit Rührer, Rück flusskühler und Trockenröhrchen versehenen Gefäss gerührt, bis eine gute Dispersion er reicht war. Dann wurden 600 cin3 Eisessig zugesetzt. und die Mischung etwa, :? Stunden unter Rühren am Rückfluss auf etwa<B>75'</B> (% erhitzt.
Das beim darauffolgenden Abkühlen auf Zimmertemperatur sich absetzende Mate rial wurde durch Filtration gewonnen und finit 300 cin3 einer 40%igen Essigsäurelösung in Aceton gewaschen. Die Waschflüssigkeit wurde dem Filtrat zugefügt und die Lösung (Gesamtvolumen etwa 1500 cin3) finit etwa 1500 cni3 Äther versetzt. Die Mischung blieb etwa 15 Stunden bei einer zwischen 0 und 5 C liegenden Temperatur stehen, worauf der gebildete Bodensatz durch Filtration gewonnen und mit Äther bis zur vollständi gen Entfernung der Essigsäure gewaschen wurde.
Beim Trocknen im Vakuum über Kaliumhydroxyd _ wurden 13 g trockener Methanol-Essigsäure-Ext.rakt erhalten, des sen ACTH-Wirksamkeit diejenige des Ar- mour Standards La-1-A um das Dreifache übertraf.
Dieser Extrakt, wurde dann auf gleiche Weise weiterbehandelt, wie das für das Säure-Aceton-Pulver im Beispiel 1 beschrie ben wird. Er wurde in 0,1n wässeriger Essig säure gelöst und die ACTH-wirksamen Stoffe aus der Lösung an Oxycellulose adsorbiert. dann durch wässerige Salzsäure wieder elu- iert, die Eluat.e i111 Vakuum gefriergetrocknet und das erhaltene amor=phe, weisse Pulver mit Pepsin bei 3 1 C abgebaut;
die erhaltene Lösung wurde zum Zerstören des Pepsins auf <B>90'</B> C'. erhitzt und Verunreinigungen durch Zusatz von Trichloressigsäure ausgefällt. Die voin Niederschlag und der überschüssigen Trichloressigsäure befreite Lösung wurde im gefroi,eneri Zustand im Vakuum eingedampft, wobei ein amorphes Pulver erhalten wurde, das etwa 100mal wirksamer war als der Armour Standard La-1-A.
1.6g des pepsinabgebairteii Materials wurden in 25 cin3 mit Schwefelwasserstoff gesättigtem Wasser gelöst. Die Lösung wurde finit einer Geschwindigkeit von 8 ein 3 pro Stunde durch eine<B>80</B> cm hohe, 2 cm weite, unter Verwendung von Ainberlite IRC-50 wie im, vorhergehenden Beispiel vor bereitete Kolonne geschickt, wobei praktisch alle A(TH-wirksamen Stoffe adsorbiei t wur den. Die Kolonne wurde dann zuerst mit.
<B>151</B> cin3 Schwefelwasserstoffwasser nüt einer Durchflussgeschwindigkeit von etwa 30 cin3 pro Stunde, hierauf tnit 1000 cml wässeriger, 10%iger, etwa 0.5 g Natriunisulfit enthalten der Pyridinlösung und schliesslich mit 2500 c1113 praktisch finit Schwefelwasserstoff ge s i 'ittigter,
wässeriger, t> 10"/,)iger Essigsätire C ge- waschen. Dadurch wurden die Stoffe mit niedrigerer Basizität als Corticotropin-Bund geringer oder fehlender AGTH-Wifksamkeit beseitigt.
Hierauf wurden 400 cin3 mit Schwefel wasserstoff gesättigte Salzsäure finit dein PH 21mit einer Geschwindigkeit von etwa :300 c1113 pro Stunde durch die Kolonne ge schickt, gefolgt von 1000 cm3 ebenfalls mit Schwefelwasserstoff gesättigter, wässeriger Salzsäure mit dein pH <B>1,58,</B> Die beiden Eluate wurden jedes für sich durch.
Zusatz eines stark basischen Anionenaustausch- harzes in Carbonatform auf einen p. zwi schen ?,5 und 3 gebracht, filtriert und im Vakuum gefriergetrocknet. Das beim p" 1,58 erhaltene Eluat ergab etwa 300 mg Polypep- tidpi@iharat als Hydrochlorid in Form eines weissen, amorphen Pulvers, das etwa 000mal so stark ACTH-wirksain war, wie der Ar mout Standard La-1-A.
<I>Beispiel 3</I> Ein Extrakt aus Rinderhypophysen wurde nach dein in den beiden ersten Abschnitten des Beispiels 2 beschriebenen Verfahren her gestellt. Deso erhaltene Methanol-Essig- säui,-e-Extrakt wurde nüt Pepsin abgebaut und mit Ti-icliloressigsäuee behandelt, wie im dritten Abschnitt des Beispiels 1 angege ben.
200 mg des erhaltenen pepsinabgebauten ACTH-wirksamen Extraktes (ACTH-Wir- kung etwa zweimal so gross wie beim Armour Standard La-1-A) wurden in 80 cm3 Wasser gelöst und die Lösung finit einer Geschwindig keit von 0,8 cm' pro Minute durch eine 50 c111 lange, 1,5 cm weite Harzkolonne geschickt (Kolonne unter Verwendung von zu etwa <B>150/,</B> in der Natriumsalzform vorliegendem Amberlite IRC-50 wie in Beispiel 1 her gestellt),
wobei praktisch alles ACTH-aktiv e Material adsorbiert wurde. Das Harzadsorbat wurde finit 25 cm3 Wasser und dann zur Be seitigung der weniger basischen Stoffe als Corticotropin-B mit 200 cin3 10 % iger, wässe riger Essigsäure mit einer Durchsatzge- schwindigkeit von 4 cm3 pro Minute ge waschen.
Nun wurde mit einer 0,15n wässerigen Salzsäure (p" etwa 0,8) "bei einer Durchsatz geschwindigkeit von 1,2 cm3 pro Minute eluiert. Das Elua;t wurde im gefrorenen Zu stand im Vakuum eingedampft, der Rück stand in Methanol gelöst, Äther zugefügt, die Ausfällung durch Zentrifugieren gewonnen und bei Zimmertemperatur im Vakuum ge trocknet, wobei 50 fing eines Produktes er halten wurden, das die fünffache ACTH- Wirksamkeit des Armour Standards La-1-A aufwies.
<I>Beispiel 4</I> Ein Corticotropinkonzentrat (Säure-Ace- ton-Pulver) aus Schweinehypophysen wurde direkt dem Pepsinabbau unterworfen und darauf die Verunreinigungen mit Trichlor- essigsäirre gefällt, wie in Beispiel 1 beschrie- ben. Das so erhaltene pepsinabgebaute Mate rial war etwa dreimal wirksamer als der Armour Standard La-1-A.
5,5 g dieses Materials wurden in 700 em3 Wasser gelöst und die Lösung mit einer Ge schwindigkeit von etwa 5 cm' pro Minute durch 2 hintereinander geschaltete, je etwa 150 cm lange und 1,8 cm weite Kolonnen ge schickt. Das Harz der ersten Kolonne wurde bereitet, indem 150 g Amberlite IRC-50 mit einer wässerigen Lösung von etwa 3 g Natriumhydroxyd behandelt und dadurch das Harz teilweise in die Natriumsalzform umgewandelt wurde;
die zweite Kolonne enthielt 150 g vollständig in der Wasserstoff form befindliches Amberlite IRC-50 . Beim Durchgang der Lösung durch diese Kolonnen wurde praktisch alles ACTH-wirksame Mate rial adsorbiert. Nun wurden die Kolonnen zum Entfernen der weniger basischen Stoffe als Corticotropin-B mit 400 cm3 -Wasser und dann finit 1000 cm3 10%iger,
wässeriger Essigsäure bei einem Durchsatz von 10 cm3 pro Minute ausgewaschen.
Hierauf wurde mit 14 Portionen wässeri ger Salzsäure eluieT-t. Die vier ersten Portio nen bestanden aus 0,015n HCl (p, 1,8); die Fraktionen 5 bis 9 wurden mit 0,08n HCl (pA 1,55) erhalten; für die 10. bis 14. Frak tion wurde O, 1n HCl (p, 1) verwendet. Das verwendete Flüssigkeitsvolumen war jedes mal 200 cm3, nur bei der letzten Fraktion wurden 400 em3 angewendet.
Die einzelnen Eluate wurden getrennt. aufgefangen, ge friergetrocknet und der erhaltene feste Rück stand jeweils in ]YTethanol gelöst und durch Zusatz von Äther ausgefällt. Die verschiede nen Fraktionen wurden dann auf ihre ACTH- Wirksamkeit untersucht.
Fraktion 5, Ge wicht<B>236</B> mg, war nicht ganz sechsanal so wirksam wie der Arinour Standard La-1-A. Jede der Fraktionen 7, 8 und 9 im Gewicht von 185 mg, 180 mg und 139,8 mg zeigte die 18- bis 25fache Wirksamkeit von La-1-A. Die Fraktionen 10, 13 und 14 mit den Ge wichten 81,5 mg, 119,8 mg und<B>110</B> mg waren 7- bis 10fach wirksamer als La-1-A. 730 mg pepsinabgebautes und wie oben beschrieben adsotbiertes und eluiei tes Mate rial, wozu aber nur die Fraktionen ausge wählt wurden,
die etwa die 20fache Wirksam keit des Armour Standards La-1-A aufwiesen, wurden in 125 ein3 Wasser gelöst und die Lösung mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,8 cin3 pro Minute durch eine 180 ein lange und ? cm weite Harzkolonne geschickt, die mit dein nach Beispiel 1 bereiteten Arrberlite IRC-50 beschickt war.
Es wurde praktisch alles ACTH-wirksaine Material adsorbiert. Die Kolonne wurde mit ?00 cm3 Wasser bei einer Durchsatzgeschwindigkeit von 3 cm3 pro Minute,
dann mit 1000 ein3 10 % iger. wässeriger Pyridinlösung bei einer Geschwin digkeit von 10 ein3 pro Minute und schliess lich mit 2000 cin3 10%iger wässei iger Essig säure bei einer Geschwindigkeit von 10 cm3 pro Minute gewaschen, wodui ch alle weniger basischen Verunreinigungen als Corticotro- pin-B entfernt wurden.
Hierauf wurden 500 cin3 0,015n wässerige Salzsäure (p, etwa, 1,8) finit einer Geschwin digkeit von 12 cm.3 pro Minute durch die Kolonne geschickt, anschliessend 1500 ein3 0,028n HCl bei 3 ein3 Durchsatz in der Minute. Die Eluate wurden getrennt aufgefangen, gefroren und rin Vakuum getrocknet, die Rückstände wurden in Methanol gelöst und durch Ätherzusatz wieder gefällt.
Die ab- filtrierten Fällungen wurden bei Zimmer- temperatur im Vakuum getrocknet:. Das mit der 0,015n Salzsäure erhaltene Eluat enthielt Stoffe finit geringer '%#@'irksainkeit. Aus dein Eluat mit 0,028n Salzsäure wurden 81 mg eines Produktes gewonnen, das etwa 80rna1 so wirksam war wie der Armour Standard La-1-A.
Method for producing a new preparation with adrenotropic and corticotropic action The present invention relates to a method for producing a new, corticotropic and adrenotropic polypepiid preparation, using a pepsin degradation product from pituitary extracts as starting material.
The method according to the invention is characterized in that the solution of a pepsin degradation product of a hypophyseal extract is brought into contact with a cation exchange resin, the exchange capacity of which is mainly due to carboxyl groups, the ACTH-active substances being adsorbed on the resin then these substances are selectively eluted with an aqueous mineral acid and the eluate is evaporated.
Numerous extracts and concentrates from pituitary glands have already been produced, which have an adrenotropic and corticotropic hormone effect (hereinafter referred to as ACTH effect), but these previous products were very impure and mainly consisted of substances that hardly have an ACTH effect or was not own at all.
In addition, the pituitary extracts produced so far (whose AC'TH effect is apparently due to the corticotropin present in them, which represents the natural ACTH-effective principle occurring in the pituitary), are relatively lower even after a high degree of purification Effectiveness. Even the pure corticotropin does not have as strong an effect as the polypeptide preparation according to the invention, which latter has about three hundred times the effectiveness of the Armor standard preparation La-1-A.
This standard preparation is: a standardized corticotropin product manufactured by Armor & Co. It is used below as a comparative measure for the ACTH efficacies of the various extracts and concentrates obtained in the course of the process according to the invention.
The polypeptide preparation obtained according to the invention, which is mostly used as an addition salt of an acid, is a solid, amorphous, white substance which contains less than 1 sulfur and a negligible amount of ash. As a hydrochloride, the polypeptide preparation is soluble in water and methanol, slightly soluble in dry ethanol and insoluble in dry acetone, ether, chloroform and benzene.
The absorption spectrum of this hydrochloride in the infrared indicates only amide bonds; in the area between 2300 and 4000 A, a single maximum appears at around 2750-2780A; E iö m about 18 to 20. The preparation shows at most a very small, almost negative linhydrin reaction when 60 micrograms of preparation in 10 microliters of water are applied to filter paper and the paper is then sprayed with a 0.1% ninhydrin solution in n-butanol and dried for 5 minutes at 80 ° C.
When analyzing the polypeptide preparation present in the forums of the trichloroacetic acid addition salt by the Craig countercurrent method, the system using 0.5% butanol-0.5% aqueous trichloroacetic acid. it is essential that the preparation consists of at least three components.
The trichloroacetic acid addition salt of one of these components (which was called corticotropin-B and is extremely effective) has a distribution coefficient of about 0.6 in the two-phase system mentioned.
The new preparation obtained according to the invention very easily suffers from losses of activity in contact with air or other oxidizing agents. This inactivation, which is apparently based on the oxidation of the polypeptide molecules to less effective oxidation products, can be reversed by the action of mild reducing agents such as hydrogen sulphide, cysteine, thioglycolic acid, sodium sulphite and similar substances.
In contrast, the ACTH effect of the preparation is irreversibly destroyed by hydrolysis. For example, the ACTH efficacy is practically completely and permanently lost if the polypeptide preparation is heated to 100 C for one hour in aqueous 0.3N hydrochloric acid.
If the polypeptide preparation according to the invention is hydrolyzed according to Stein and Moore, the weight of the 6N hydrochloric acid used being 200 times as great as the weight of the hydrolyzed product and working in a nitrogen atmosphere, the following amino acids are found in the hydrolyzate in the analysis according to Moore and Stein: glycine , Alanine, valine, proline, serums, phenylalanine,
Tyrosine, methionine, aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine and arginine. On the other hand, cystine, threonine, leuein and isoleucine are not contained in the hydrolyzate.
The analysis results can be seen from the following table:
EMI0002.0055
Carbon content:
<tb> Percentage <SEP> of the <SEP> total amino acid <SEP> nitrogen <SEP> in the <SEP> Hy <SEP> droly <SEP> sat
<tb> (mean <SEP> of two <SEP> different <SEP> preparations)
<tb> Glycine <SEP> 6.9
<tb> alanine
<tb> Valine <SEP> 6.1
<tb> Leucine <SEP> does not contain <SEP>
<tb> Isoleucine <SEP> not <SEP> available
<tb> Proline <SEP> <B> 6.6 </B>
<tb> Sera <SEP> 3.1
<tb> Threonine <SEP> not <SEP> available
<tb> Phenylalanine <SEP> <B> 1-1.5 </B>
<tb> Tyr <SEP> osin <SEP> 4.7
<tb> Cystine <SEP> not <SEP> available
<tb> methionine <SEP> 1.7
<tb> Aspartic Acid <SEP> 4.8
<tb> glutamic acid <SEP> 6.1
<tb> Histidine <SEP> <B> 6.3 </B>
<tb> Lysine <SEP> 16.4
<tb> Arginine <SEP> 228.7
<tb> ammonia <SEP> <U> 3, </U> 6
<tb> 100,
0 To produce the starting material, the pituitary glands themselves, e.g. B. from the pituitary glands of pigs, cattle or sheep, or the commercially available ACTH-active pituitary extracts or their concentrates can be used.
If the gland itself is not used. this can be subjected to hydrochloric acid-acetone extraction according to the method of Li et al., whereby a corticotropin concentrate is obtained, which Li calls acid-acetone powder. One such commercially available preparation is Acthar A from Armor Co.
Instead of using the Li method, a method is usually preferred in which the fatty substances and water are first removed from the glands by extraction with acetone. who, whereupon the residue is extracted with a methanolic acetic acid.
When ether is added to the methanol extract, an ACTH-effective concentrate is precipitated (read in the following called methanol-acetic acid extract.
The pituitary extract (which is usually about 3-5 times as effective as that of Armor Standard La-1-A) is expediently further processed as follows: it is brought into solution with oxycellulose, whereby the ACTH-active substances are selectively adsorbed will.
With the help of an aqueous mineral acid solution, they can be reassembled. The adsorption is carried out by the gland extract in a weakly acidic, aqueous acid solution, e.g. B. in dilute, about 0.1N acetic acid, and this solution is brought into contact with the oxycellulose.
Prewashed oxycellulose, which can be obtained by washing commercial oxycellulose with about 10-12% free carboxyl, first in dilute, aqueous hydrochloric acid and then in dilute, aqueous acetic acid, is preferred. After the oxycellulose has adsorbed the ACTH-active substances, it is treated with dilute, aqueous mineral acid, preferably 0. In hydrochloric acid, whereby the adsorbed substances are eluted.
The eluate is reduced to ap. set of maxifinal 2.5-3, which is done with advantage by treating the Ehiates with a strongly basic ion exchange resin in the carbonate form.
The resin is then filtered off and the filtrate is evaporated to a concentrate which is usually about 60-85 times the ACTH activity of Armor Standard La-1-A.
This concentrate is then finitely broken down by pepsin under relatively mild conditions. This breakdown of pepsin is usually carried out in an acidic, aqueous solution (pH about 2-3) and at temperatures between about 35 and 40 ° C. for about one day. The degraded solution is then heated to destroy the pepsin, then cooled and trichloroacetic acid is added,
whereby the compounds with higher molecular weight and lower ACTH effectiveness are eliminated. The clarified, aqueous solution is extracted with a water-immiscible, organic solvent, such as ether, whereby the excess of trichloroacetic acid is removed and the aqueous layer is then evaporated in the frozen state in vacuo, with a pepsin-degraded pro dukt, stay behind. Usually a product obtained in this way is used in the process according to the invention.
It has about 80 times the effect of Armor Standard La-1-A and contains the polypeptide mixture together with substances of lower basicity that have little or no ACTH effect.
Under certain circumstances, a product which was produced by pepsin breakdown from a gland extract that was not previously adsorbed on oxycellulose can also be used as the starting material for the process according to the invention.
Cation exchange resins with polar carboxyl groups have been described in the literature. Usually they are Herge provides by condensing a phenol and an aldehyde, one or the other of these components containing a carboxyl group, especially by condensation of resorcylic acid with formaldehyde. Another production option is the copolymerization of a polymerizable acid with a divinyl compound, that is to say a compound which has two CH2 = CH groups, e.g.
B. of acrylic or methacrylic acid with divinylbenzene. The ability of all these resins to exchange cations is due to the carboxyl groups present in their molecules. When carrying out the process according to the invention, the preferred resin is a copolymer of acrylic or methacrylic acid with divinylbenzene, in which the divinyl component makes up between 2.5 and 5% of the resin.
(One such resin is, for example, the commercially available Amberlite IRC-50 [branded product] from Rohm & Haas Co.) Such resins have an extremely selective adsorption capacity for the ACTH-active substances contained in the pepsin-degraded material . While the resin can be used in the hydrogen form, it is better to use it in the buffered form.
The latter is obtained by pre-treating the resin with an aqueous solution of an alkali hydroxide, for example with sodium or potassium hydroxide, and thus partially converting it into the alkali salt form. The ratio of hydrogen to salt formed is advantageously chosen so that the solution of the pepsin-degraded product treated with the resin has a pH of about 5-7.
For adsorption, the pepsin-degraded material is preferably dissolved in water, which advantageously contains a weak reducing agent such as hydrogen sulfide, sodium sulfite, thioglycolic acid, cysteine and the like, and the solution is passed through a column filled with the exchange resin (preferably in buffered form) cleverly.
The flow rate is advantageously chosen so that practically complete adsorption of the ACTH-active substances is possible. If a properly buffered resin is used, the p of the exiting liquid is around 5-7. At higher pn values, increased inactivation of the polypeptide mixture is to be feared, while pH values that are too low easily lead to incomplete adsorption, since strongly acidic solutions act as eluents.
After the adsorption, the column is expediently first with. Water, then with a weakly basic aqueous solution and finally with an aqueous, weakly acidic acid solution, whereby the substances with a lower basicity than those of the polypeptide mixture, which have a low ACTH effect, are washed out.
Surprisingly, only material with little or no ACTH effect is washed out by the washing described, while the highly active substances remain practically completely adsorbed. As a weakly basic washing liquid is usually a -aqueous solution of a tertiary heterocyclic amines, z. B.
an aqueous pyridine, picoli_n-. Lutidine or collidine solution. ; an aqueous pyridine solution is preferred. This is usually followed by an aqueous solution of a lower fatty acid such as acetic acid or propionic acid. Formic acid and the like.
In order to keep the loss of effectiveness during the washing process as low as possible, a weak reducing agent is usually added to the washing liquids, which is expediently chosen so that it is capable of reducing organic disulfides to the corresponding sulfhydryl compounds.
For example, hydrogen sulfide, sodium sulfite, sodium thiophosphate, thioglycolic acid, cysteine and the like are suitable.
The washed resin adsorbate is expediently first eluted with an aqueous mineral acid solution, such as a solution of hydrogen chloride, sulfuric acid, phosphoric acid and the like. It is preferred to use the dilute acids with an h greater than about 1.8, which corresponds to a normality of about 0.015.
These acid solutions elute those substances which have a lower basicity and lower ACTH activity than the polypeptide mixture according to the invention. It is then expedient to use an aqueous mineral acid solution, such as a solution of sulfuric acid, phosphoric acid or a hydrohalic acid. eluted, which is approximately between 1.0 and 1.8.
(0.1n to 0.015n), whereby the high-vc-irksainen polypeptides are extracted. An aqueous mineral solution with a pl between 1.5 and 1.6 (0.03_n and 0.025n) is preferred.
The eluate can then be evaporated in the frozen state, whereby a polypeptide preparation is obtained whose ACTH activity is about 300 times greater than that of the Arinour standard La-1-A and which has the composition already specified.
The polypeptide preparation is usually used in the form of an acid addition salt, since it is more durable in this form than in Foi in the free base. After all, the free base can also be prepared by adding the addition salt, e.g. B. the hydrochloride, dissolves in 3fetlianol and an organic base, such as Triä thylamine, is added, whereby the free base is precipitated.
By reaction with, an acid. With double conversion or ion exchange, a wide variety of addition salts can be prepared in a known manner from the free base or the addition salts.
<I> Example 1 </I> 40 g of corticotropin concentrate (acid-acetone powder), which had been obtained by hydrochloric acid-acetone extraction from porcine pituitary glands and which showed four times the ACTH activity of Armor Standard 'La-1-A , was placed in 1200 cm3 of 0.1N aqueous acetic acid.
The mixture was stirred for several hours and then filtered to remove a small amount of insoluble material. 40 g of washed oxycellulose were added to the filtrate (produced by washing out a commercially available oxycellulose with about 10-20% free carboxyl;
n-hydrochloric acid was used as the first washing liquid, 0.1N aqueous acetic acid was used as the second washing liquid and the mixture was stirred at approximately room temperature for about 24 hours, the ACTH-active material being adsorbed onto the oxycellulose. The oxycellulose with the adsorbate was filtered off and washed several times with 200 cin3 0.1N aqueous acetic acid each time.
Now 200 cm3 of aqueous 0.1N hydrochloric acid were added and the mixture was stirred for about half an hour. It was then filtered, the oxycellulose was added to a new 200 cm3 of O. In hydrochloric acid, the mixture was again stirred for about half an hour and finally filtered. The filtrates were poured together and the pH was adjusted to about 2.5-3 by adding a strongly basic anion exchange resin in carbonate form.
The resin was filtered off and the filtrate evaporated in the frozen state, yielding 1.5 g of a white, amorphous powder which was about 75 times more effective than the Armor Standard La-1-A.
6.4 g of this powder were dissolved in 320 em @ water and 23.7 mg of pepsin were added to the solution. The pH of the solution was brought to about 2.5 by adding a few drops of dilute aqueous hydrochloric acid, then the acidic solution was allowed to stand for about 24 hours at a temperature of about 37 ° C. This was followed by heating to 90 ° C for about 15 minutes to destroy the pepsin, after cooling to room temperature 36 cm @ of an aqueous 50% trichloroacetic acid solution was added and the mixture was left to stand for about an hour.
The separated material (high molecular weight substances with low ACTH activity) was separated by centrifugation. The clear solution (volume approx. 350 cm3) was then extracted six times with 350 cm3 of ether each time, thus removing the excess of trichloroacetic acid. The aqueous solution was then heated in vacuo to remove the ether residue, frozen here and evaporated in vacuo, about 5.6 g of a white, amorphous powder being obtained.
This pepsin-degraded product was found to be 80 times more ACTH-effective than the Armor Standard La-1-A.
300 mg of this powder were dissolved in 10 cm 'of a practically saturated, aqueous hydrogen sulfide solution and the solution was sent through a column prepared as follows: 25 g of granular resin (Amberlite IRC-50, a cation exchanger from Rohm & Haas, whose exchange capacity is mainly based on carboxyl groups) in the hydrogen form was stirred with 200 cx water and 0.5 g of dissolved sodium hydroxide was slowly added to the mixture.
After the sodium ions had been adsorbed, the resin was washed with water and a resin material was obtained which was about 151) / "in the sodium salt form. It was filled into a 50-em3 burette and the resin column was filled with a practically saturated, aqueous hydrogen sulphide solution.
The rate of passage of the solution through the resin column was chosen so that the treated solution had flowed through after about one and a half hours. This time is sufficient for the ACTH-active substances to be fully adsorbed onto the resin.
Now 50 cm3 of saturated aqueous hydrogen sulfite solution were sent through the column at a rate of about 1 cin3 per minute, then over the course of about 3 hours first with 250 cm3 of a 10% aqueous pyridine solution containing about 125 mg of sodium sulfite and then with 500 cm3 10%, aqueous, finite. Washed hydrogen sulphide with practically saturated acetic acid,
whereby the substances with lower basicity than corticotropin-B and little or no ACTH effect were removed.
Now 200 cm3 of aqueous hydrochloric acid saturated with hydrogen sulfide with a pH of 2 were sent through the resin column at the rate of 100 cm3 per hour, then at the same speed 200 cm3 of an aqueous hydrochloric acid likewise saturated with hydrogen sulfide with the p. <B> <I> 1,
58. </I> </B> The two eluates were each brought to the PH 21-5-3 by adding the strongly basic anion exchange resin Amberlite IRA-400 r> in the carbonate form, filtered and individually frozen in Evaporated in vacuo.
From the first fraction 60 mg and from the second 40 mg of a polypeptide preparation were obtained, both as amorphous, white powder and in the form of the hydrochloride. Both products were tested using the method of Sayers et al. And showed about 300 times more ACTH effectiveness than the Armor Standard La-1-A. Example <I> 2 </I> 500 g of fresh, whole, frozen pigs pituitary were mixed with 1000 cm3 of acetone and the mixture was homogenized in a mixer.
The resulting mixture was mixed with 2 liters of acetone and stirred for about 3 hours, after which the above floating liquid was decanted and discarded. The remaining liquid was washed twice with 2,000 cubic centimeters of acetone and once with 2,000 cubic centimeters of methanol, whereby practically all of the fatty substances present in the starting material and also the water were removed. These washing liquids were also no longer used. The remaining glandular material was filtered off, washed with ether and dried in the air.
About 100 g of solid material remained which, when tested by Sayers, showed about half the effectiveness of Armor Standard La-1-A.
This was then mixed with 900 cm3 of methanol and stirred in a vessel equipped with a stirrer, reflux condenser and drying tube until a good dispersion was achieved. Then 600 cc glacial acetic acid was added. and the mix about:? Hours while stirring at reflux to about <B> 75 '</B> (%.
The material which settled on subsequent cooling to room temperature was collected by filtration and washed finitely 300 in 3 of a 40% acetic acid solution in acetone. The washing liquid was added to the filtrate and the solution (total volume about 1500 cn3) was added finitely about 1500 cn3 of ether. The mixture remained at a temperature between 0 and 5 C for about 15 hours, whereupon the sediment formed was collected by filtration and washed with ether until the acetic acid was completely removed.
On drying in vacuo over potassium hydroxide, 13 g of dry methanol-acetic acid extract were obtained, the ACTH activity of which was three times that of the Armor Standard La-1-A.
This extract was then treated further in the same way as that described for the acid-acetone powder in Example 1. It was dissolved in 0.1N aqueous acetic acid and the ACTH-active substances were adsorbed from the solution on oxycellulose. then eluted again with aqueous hydrochloric acid, the eluate is freeze-dried in vacuo and the amorphous, white powder obtained is broken down with pepsin at 3 ° C .;
the solution obtained was used to destroy the pepsin to <B> 90 '</B> C'. heated and impurities precipitated by the addition of trichloroacetic acid. The solution, freed from the precipitate and the excess trichloroacetic acid, was evaporated in the frozen state in vacuo to give an amorphous powder which was about 100 times more effective than the Armor Standard La-1-A.
1.6 g of the pepsin-exposed material were dissolved in 25 cc water saturated with hydrogen sulphide. The solution was passed finitely at a rate of 8 a 3 per hour through a column prepared using Ainberlite IRC-50 as in the previous example, 80 cm high, 2 cm wide, with practically all A (TH-active substances were adsorbed. The column was then first with.
<B> 151 </B> cin3 hydrogen sulfide water at a flow rate of about 30 cin3 per hour, the pyridine solution then contains 1000 cml of aqueous, 10% strength, about 0.5 g sodium sulfite and finally with 2500 c1113 practically finite hydrogen sulfide saturated,
Wash aqueous, t> 10 ″ /,) iger acetic acid C. In this way, the substances with a lower basicity than corticotropin bundles with little or no AGTH effectiveness were eliminated.
Then 400 cc hydrochloric acid saturated with hydrogen sulphide was sent through the column at a rate of about: 300 c1113 per hour, followed by 1000 cc aqueous hydrochloric acid likewise saturated with hydrogen sulphide with a pH of 1.58, < / B> The two eluates were each by itself.
Addition of a strongly basic anion exchange resin in carbonate form to a p. between?, 5 and 3, filtered and freeze-dried in vacuo. The eluate obtained at p "1.58 yielded about 300 mg of polypeptide piharate as hydrochloride in the form of a white, amorphous powder which was about 000 times more ACTH-effective than the Armout standard La-1-A.
<I> Example 3 </I> An extract from bovine pituitary gland was prepared according to the method described in the first two sections of Example 2. The methanol-acetic acid, -e extract obtained in this way was broken down using pepsin and treated with titanium-icliloracetic acid, as indicated in the third section of Example 1.
200 mg of the resulting pepsin-degraded ACTH-effective extract (ACTH effect about twice as great as in the Armor Standard La-1-A) were dissolved in 80 cm3 of water and the solution finite at a speed of 0.8 cm per minute sent through a 50 c111 long, 1.5 cm wide resin column (column using about <B> 150 /, </B> in the sodium salt form present Amberlite IRC-50 as in Example 1),
practically all ACTH-active material was adsorbed. The resin adsorbate was finely washed with 25 cm3 of water and then, to remove the less basic substances than corticotropin-B, with 200 cc of 10% aqueous acetic acid at a throughput rate of 4 cm3 per minute.
It was then eluted with a 0.15N aqueous hydrochloric acid (p "about 0.8)" at a throughput rate of 1.2 cm3 per minute. The eluent was evaporated in the frozen state in vacuo, the residue was dissolved in methanol, ether was added, the precipitate was recovered by centrifugation and dried in vacuo at room temperature, with 50 catches of a product being obtained which contained five times the ACTH- Effectiveness of Armor Standard La-1-A.
<I> Example 4 </I> A corticotropin concentrate (acid-acetone powder) from porcine pituitary gland was directly subjected to the breakdown of pepsin and then the impurities were precipitated with trichloroacetic acid, as described in Example 1. The pepsin-degraded material so obtained was about three times more effective than Armor Standard La-1-A.
5.5 g of this material were dissolved in 700 cubic meters of water and the solution was sent at a speed of about 5 cm per minute through 2 columns connected in series, each about 150 cm long and 1.8 cm wide. The resin of the first column was prepared by treating 150 g of Amberlite IRC-50 with an aqueous solution of about 3 g of sodium hydroxide, thereby partially converting the resin to the sodium salt form;
the second column contained 150 grams of Amberlite IRC-50 entirely in the hydrogen form. When the solution passed through these columns, practically all ACTH-effective material was adsorbed. Now the columns were used to remove the less basic substances than corticotropin-B with 400 cm3 water and then finitely 1000 cm3 10%
aqueous acetic acid at a rate of 10 cm3 per minute.
It was then eluted with 14 portions of aqueous hydrochloric acid. The first four portions consisted of 0.015N HCl (p, 1.8); fractions 5 to 9 were obtained with 0.08N HCl (pA 1.55); O, 1N HCl (p, 1) was used for the 10th to 14th fraction. The volume of liquid used was 200 cm3 each time, only 400 cm3 were used for the last fraction.
The individual eluates were separated. collected, freeze-dried and the solid residue obtained was in each case dissolved in] Y-ethanol and precipitated by adding ether. The various fractions were then examined for their ACTH effectiveness.
Fraction 5, weight <B> 236 </B> mg, was not quite six-anally as effective as the Arinour standard La-1-A. Each of fractions 7, 8 and 9 weighing 185 mg, 180 mg and 139.8 mg showed 18 to 25 times the potency of La-1-A. The fractions 10, 13 and 14 with the weights 81.5 mg, 119.8 mg and <B> 110 </B> mg were 7 to 10 times more effective than La-1-A. 730 mg of pepsin-degraded material, adsorbed and eluted as described above, for which only the fractions were selected,
which had about 20 times the effectiveness of the Armor Standard La-1-A, were dissolved in 125 a 3 water and the solution at a rate of about 0.8 in 3 per minute through a 180 a long and? cm wide resin column, which was charged with the Arrberlite IRC-50 prepared according to Example 1.
Virtually all of the ACTH-effective material was adsorbed. The column was filled with? 00 cm3 of water at a throughput rate of 3 cm3 per minute,
then with 1000 ein3 10% iger. aqueous pyridine solution at a rate of 10 cm3 per minute and finally with 2,000 cm3 of 10% aqueous acetic acid at a rate of 10 cm3 per minute, whereby all less basic impurities than corticotropin-B were removed.
500 in 3 0.015 N aqueous hydrochloric acid (p, approx. 1.8) were then sent through the column finite at a speed of 12 cm 3 per minute, then 1500 in 3 0.028 N HCl at 3 in 3 throughput per minute. The eluates were collected separately, frozen and dried in vacuo, the residues were dissolved in methanol and reprecipitated by adding ether.
The precipitates filtered off were dried in vacuo at room temperature. The eluate obtained with the 0.015N hydrochloric acid contained substances finitely less '% # @' irksainkeit. From the eluate with 0.028N hydrochloric acid, 81 mg of a product were obtained which was about 80% as effective as the Armor Standard La-1-A.