DE2258080C3 - Process for the preparation of hexatriacontapeptides - Google Patents
Process for the preparation of hexatriacontapeptidesInfo
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Description
worinwherein
X = Pro, Y = Gin, Z = GIu, Z' = GIu, oder X = Pro, Y = VaI, Z = GIu, Z' = GIu, oder X = Ser, Y = Gin, Z = GIu, Z' = GIu, oder X = Pro, Y = VaI, Z = GIu, Z' = Asn, oder X = Pro. Y = VaI, Z = Asn, Z' = GIuX = Pro, Y = Gin, Z = GIu, Z '= GIu, or X = Pro, Y = VaI, Z = GIu, Z '= GIu, or X = Ser, Y = Gin, Z = GIu, Z '= GIu, or X = Pro, Y = VaI, Z = GIu, Z '= Asn, or X = Pro. Y = VaI, Z = Asn, Z '= GIu
bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man Rinder-, Schweine-, Schaf- oder Human-Pankreatamean, characterized in that one bovine, pig, sheep or human pancreata
a) in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel bis zn einem nahezu einulgierten Zustand mahlt,a) in a water-immiscible solvent up to an almost emulsified state grinds,
b) die gemahlenen Drüsen mit wäßrigem Alkohol, der auf etwa pH 2,8 angesäuert ist, behandelt,b) treating the ground glands with aqueous alcohol acidified to about pH 2.8,
c) die unlöslichen Gewebesubstanzen durch Filtration abtrennt,c) separating the insoluble tissue substances by filtration,
d) die Lösung durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf pH 8 bis 8,5 einstellt,d) the solution is adjusted to pH 8 to 8.5 by adding aqueous ammonia,
e) bei diesem pH-Wert Fette und Ammoniumphosphat durch Fällung abtrennt,e) separates fats and ammonium phosphate by precipitation at this pH value,
f) mit einer Säure auf einen pH-Wert von etwa 5,2f) with an acid to a pH of about 5.2
einstellt,adjusts
g) diese Lösung mit einer Mischung van Diäthyläther und Äthanol verdünnt, 12 oder mehr Stunden stehen läßt, und danachg) this solution diluted with a mixture of diethyl ether and ethanol, 12 or more Lets stand for hours, and after that
h) den abgeschiedenen Niederschlag gewinnt,h) recovers the precipitated precipitate,
i) das so erhaltene, getrocknete Polypeptid-Gemisch in Essigsäure aufnimmt, die Lösung an Sephadex® G-50 (fein) Chromatographien und mit dem sauren Medium eluiert,i) the dried polypeptide mixture thus obtained takes up in acetic acid, the solution Sephadex® G-50 (fine) chromatographies and eluted with the acidic medium,
j) die einschlägigen Fraktionen zu einer trockenen Substanz lyophilisiert und diese in einer Harnstoff enthaltenden, auf einen pH-Wert von etwa 9,0 eingestellten Pufferlösung aufnimmt, k) die so erhaltene Lösung an Diäthylaminoäthylj) the relevant fractions lyophilized to a dry substance and this in a Absorbs urea-containing buffer solution adjusted to a pH of about 9.0, k) the resulting solution of diethylaminoethyl cellulose Chromatographien und mit der gleicellulose chromatographs and with the same
chen Pufferlösung eluiert,eluted buffer solution,
1) das Eluat an Sephadex® G - 25 (grob) Chromatographien und mit wäßriger Essigsäure eluiert und1) the eluate is eluted on Sephadex® G-25 (coarse) chromatographies and with aqueous acetic acid and
m) das jeweilige Hexatriacontapeptid durch Lyophilisieren des Eluats isoliertm) the respective hexatriacontapeptide is isolated by lyophilizing the eluate
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Hexatriacontapeptiden der Formel H2N-AIa-X-LeU-GIu-PrO- Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-Pro-Z-GIn-Met-Ala-Gln-Tyr-AIa-Ala-Z'-lThe invention relates to a method for obtaining hexatriacontapeptides of the formula H 2 N-Ala-X-LeU-GIu-PrO-Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-Pro-Z-GIn-Met-Ala -Gln-Tyr-AIa-Ala-Z'-l
1212th 1818th
24 2524 25
'-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr — C — NH2, 30 36'-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr - C - NH 2 , 30 36
5555
χ _ pro, Y - Gin, Z - GIu, Z' - GIu, oder X - Pro, Y - VaI, Z = GIu, Z' - GIu, oder X - Ser, Y - Gin, Z - GIu, Z' - GIu, oder X - Pro, Y - VaI, Z - GIu, Z' - Asn, oder X - Pro, Y - VaI, Z = Asn, Z' - GIuχ _ pro, Y - Gin, Z - GIu, Z '- GIu, or X - Pro, Y - VaI, Z = GIu, Z '- GIu, or X - Ser, Y - Gin, Z - GIu, Z' - GIu, or X - Pro, Y - VaI, Z - GIu, Z '- Asn, or X - Pro, Y - VaI, Z = Asn, Z '- GIu
bedeuten.mean.
Aus der DE-AS 21 38 848 ist bereits ein Verfahren zur Abtrennung von Glucagon aus Pankreas-Extrakten, die außer Glucagon Insulin und insulinähnliche Polypeptide enthalten, bekannt. Nach diesem Verfahren überführt man den Extrakt in eine im wesentlichen wäßrige Lösung, stellt diese auf einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 8 ein, leitet die Lösung bei einer Temperatur unter etwa 5° C über die Alkali- oderFrom DE-AS 21 38 848 is already a method for the separation of glucagon from pancreatic extracts which contain insulin and insulin-like polypeptides in addition to glucagon. According to this procedure if the extract is transferred into an essentially aqueous solution, this is brought to a pH of im Range from 7 to 8, passes the solution over the alkali or at a temperature below about 5 ° C Erdalkalimetallform eines sulfonierten weitmaschigen Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren, wäscht das Harz mit dem daran adsorbierten Glucagon mit einer Pufferlösung bei pH 7 bis 8 und eluiert das Glucagon dann mit einer verdünnten wäßrigen Lösung einer Base.Alkaline earth metal form of a sulfonated wide mesh styrene-divinylbenzene copolymer, washes the resin with the glucagon adsorbed thereon with a buffer solution at pH 7 to 8 and the glucagon is eluted then with a dilute aqueous solution of a base.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Gewinnung von neuen Hexatriacontapeptiden aus Rinder-, Schweine-, Schaf- oder Human-Pankreata, die interessante biologische Wirkungen zeigen. So verstärken sie die Darmmobilität, verengen den Gallengang und entspannen die Gallenblase. Sie können daher als Veterinärabführmittel verwendet werden, die keine orale Verabreichung erfordern.The present invention now relates to a method for obtaining new hexatriacontapeptides from Bovine, porcine, sheep or human pancreata showing interesting biological effects. In this way, they increase intestinal mobility and narrow the bile duct and relax the gallbladder. They can therefore be used as veterinary laxatives that do not have any require oral administration.
Gegenstand der Erfindung ist daher das Verfahren gemäß Patentanspruch.The invention therefore relates to the method according to claim.
nenen Hexatriacontapeptide entsprechen der folgenden FormelNenen hexatriacontapeptides correspond to the following formula
HjN-Ala-X-Leu-Glu-Pro-Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-Pro-Z-Gln-Met-AIa-Gln-Tyr-Ala-Ala-Z'-Leu-Arg 1 12 13 18 24 25HjN-Ala-X-Leu-Glu-Pro-Y-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asp-Ala-Thr-Pro-Z-Gln-Met-AIa-Gln-Tyr-Ala-Ala-Z'-Leu -Arg 1 12 13 18 24 25
LArg-Tyr-IIe-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr —C —NH2, 30 36 L Arg-Tyr-IIe-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-C -NH 2 , 3036
worin in Abhängigkeit von dem für die Gewinnung eingesetzten Ausgangsmaterial X, Y, Z und Z' die folgenden Bedeutungen besitzen:wherein depending on the starting material used for the recovery X, Y, Z and Z 'the have the following meanings:
1515th
2020th
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Hexatriacontapeptide sind in handelsüblichem kristallinem Insulin in niedrigeD Konzentrationen enthalten. In höheren Konzentrationen liegen sie in dem rohen Pankreasextrakt vor, der bei der Abtrennung von Insulin erzeugt wird und in der Fachwelt als »Salzkuchen« bekannt ist Das Produkt ist in der so Mutterlauge des alkalischen Insulin-Kristallisationsverfahrens enthalten und ist daraus extrahiert worden. Es kann ferner aus Pankreas selbst und aus rohen flüssigen Pankreasextrakten extrahiert werden.The hexatriacontapeptides obtained by the process according to the invention are contained in commercially available crystalline insulin in low concentrations. In higher concentrations, they lie in the crude pancreatic extract before, which is generated in the separation of insulin and in the art as "salt cake" is known to the product in the so mother liquor of alkaline insulin crystallization process included and has been extracted therefrom. It can also be extracted from the pancreas itself and from crude liquid pancreatic extracts.
Erfindungsgemäß geht man vorzugsweise von ganzem Pankreas aus, der sauber aus dem Körper eines frisch getöteten Tieres herausgelöst wurde, beispielsweise bei der Fleischgewinnung. Die Drüse wird abgewaschen und sofort eingefroren. Wenn sie länger als für kurze Zeit aufbewahrt werden soll, wird sie in gefrorenem Zustand gehalten. Die verwendete Drüsenmenge ist nicht wesentlich, für eine zweckmäßige Ausbeute von 30 bis 50 mg Produkt werden jedoch etwa 10 kg benötigt Alle folgenden Arbeitsgänge, die anschließend beschrieben werden, werden sauber, hygienisch, nach Bedarf aseptisch und bei 4 ± 0,5° C durchgeführt Lösungsmittel und ähnliche Stoffe werden bei der angegebenen Temperatur eingeführt.According to the invention, the starting point is preferably the whole pancreas, which has been cleanly removed from the body of a freshly killed animal was removed, for example in meat production. The gland will washed off and frozen immediately. If it is to be kept for longer than a short time, it will be in kept frozen. The amount of glands used is not essential for an expedient Yield of 30 to 50 mg of product, however, about 10 kg are required All the following operations that subsequently described will be clean, hygienic, aseptic as necessary and at 4 ± 0.5 ° C carried out Solvents and similar substances are introduced at the specified temperature.
Die Drüse wird bis zu einem fast emulgierten Zustand fein gemahlen und dann mit wäßrigem Alkohol versetzt, der auf etwa pH 2,8 angesäuert ist Die erhaltene Aufschlämmung wird gerührt und dann werden unlösliche Gewebesubstanzen durch Filtration entfernt. Die betreffende Fraktion befindet sich in der Lösung. Zur Einstellung des benötigten pH-Werts können Phosphorsäure, Salzsäure, Schwefelsäure und andere Säuren verwendet werden.The gland is finely ground to an almost emulsified state, and then aqueous alcohol is added, which is acidified to about pH 2.8. The resulting slurry is stirred and then stirred insoluble tissue substances removed by filtration. The faction concerned is in the solution. Phosphoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid and others can be used to set the required pH Acids are used.
Die gewebefreie saure Lösung wird durch vorsichtige Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf pH 8 bis 8,5 eingestellt. Bei diesem pH-Wert scheiden sich aus dem erhaltenen konzentrierten Präparat etwas Fett und Ammoniumphosphat ab. Die Lösung wird abgetrennt, beispielsweise durch Dekantieren, Filtrieren oder beide Maßnahmen.The tissue-free acidic solution is adjusted to pH 8 to 8.5 by careful addition of aqueous ammonia set. At this pH value, some fat and separate from the concentrated preparation obtained Ammonium phosphate. The solution is separated, for example by decanting, filtering, or both Measures.
Die gewonnene Lösung wird dann auf einen pH-Wert von etwa 5,2 eingestellt, beispielsweise mit Essigsäure. Diese Lösung wird dann mit einer Mischung von 4 Vol.-Teilen Diäthyläther und 2 Vol.-Teilen Äthanol verdünnt Die Mischung wird über Nacht oder für eine äquivalente oder längere Zeitdauer stehengelassen. In dieser Zeit scheiden sich fast alle Proteine, darunter das gewünschte Hexatriacontapeptid ab. Die erhaltene Suspension wird zentrifugiert und der Niederschlag wird gewonnen. Der Niederschlag wird im Vakuum vom Wasser befreit zur Entfernung restlicher Fette, falls vorhanden, mit Äther gewaschen und dann im Vakuum von restlichem Äther befreit Das getrocknete Produkt wird dann in molarer Essigsäure aufgenommen. In dem sauren Medium lösen sich verschiedene Proteine. Die Lösung wird hierauf an einer Kolonne mit Sephadex® G-50 (fein) Chromatographien, wodurch eine Trennung ungefähr nach dem Molekulargewicht erfolgtThe solution obtained is then adjusted to a pH of about 5.2, for example with acetic acid. This solution is then treated with a mixture of 4 parts by volume of diethyl ether and 2 parts by volume of ethanol diluted The mixture is allowed to stand overnight or for an equivalent or longer period of time. In During this time, almost all proteins, including the desired hexatriacontapeptide, are separated out. The received The suspension is centrifuged and the precipitate is collected. The precipitate is in the vacuum from Water freed to remove residual fats, if any, washed with ether and then in vacuo freed from residual ether. The dried product is then taken up in molar acetic acid. By doing acidic medium dissolves various proteins. The solution is then on a column with Sephadex® G-50 (fine) chromatographies, whereby a separation occurs approximately according to the molecular weight
Glucagon hat ein Molekulargewicht von etwa 3500. Die erfindungsgemäß gewonnenen Hexatriacontapeptide besitzen ein Molekulargewicht von etwa 4200, bei einer Bestimmung der Rinderform genau 4231, während Insulin ein Molekulargewicht von etwa 5800 aufweistGlucagon has a molecular weight of about 3500. The hexatriacontapeptides obtained according to the invention have a molecular weight of about 4200, with a determination of the cattle shape exactly 4231, while Insulin has a molecular weight of about 5800
Ferner enthält Glucagon einen Tryptophanrest, durch den das Molekül in gewissem Ausmaß die Fähigkeit zur Sorption auf Sephadex· erhält Aus diesem Grund ist die Trennung von Glucagon und des neuen Proteins mit Sephadex® etwas besser als auf Grund des Molekulargewichts allein zu erwarten wäre. Erfindungsgemäß wird daher die Trennung mit Sephadex® bevorzugtGlucagon also contains a tryptophan residue, which gives the molecule some degree of its ability to Sorption on Sephadex · receives for this reason the separation of glucagon and the new protein with Sephadex® is slightly better than would be expected based on molecular weight alone. According to the invention therefore separation with Sephadex® is preferred
Nach diesem Verfahren werden die Hexatriacontapeptide und einige andere von Stoffen geschieden, die in diesem Zusammenhang nicht von Interesse sind. Das Eluat kann mittels Ultraviolettabsorption überwacht werden. Dabei wird jede Proteineluatbande durch eine starke Absorption bei 276 bis 280 ηιμπι angezeigt Wenn die Abnahme eines solchen Extinktionsmaximums festgestellt wird, wird das Auffanggefäß gewechselt und gegebenenfalls nochmals gewechselt, wenn das Auftreten eines weiteren Extinktionsmaximums beobachtet wird. Bei einer anderen Arbeitsweise werden die Auffanggefäße nach einem Zeitplan gewechselt und durch visuelle Beobachtung oder mittels eines Meßblattes mit Zeitkoordinate festgestellt, welche getrennt aufgefangenen Proben von Interesse sind. Die Fraktion, die das gewünschte Hexatriacontapeptid enthält, enthält gewöhnlich auch Insulin und Glucagon.According to this procedure, the hexatriacontapeptides and some others are divorced from substances contained in are of no interest in this context. The eluate can be monitored by means of ultraviolet absorption will. Each protein eluate band is indicated by a strong absorption at 276 to 280 ηιμπι Wenn the decrease in such an extinction maximum is determined, the collecting vessel is changed and if necessary changed again if the occurrence of a further extinction maximum is observed will. In another way of working, the collecting vessels are changed according to a schedule and determined by visual observation or by means of a measuring sheet with time coordinate, which separately collected samples are of interest. The fraction containing the desired hexatriacontapeptide, usually also contains insulin and glucagon.
Diese Mischung wird dann bei der bevorzugten Arbeitsweise zu einer trockenen Substanz lyophilisiert. Diese trocken« Substanz wird dann in einer Pufferlösung aufgenommen, die 0,01 molar in bezug auf Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 0,001 molar in bezug auf Tetranatriumätnylendiamintetraacetat und 7 molar in bezug auf Harnstoff ist, und der pH-Wert der entstandenen Lösung (ursprünglich etwa 11) wird mit HCI auf etwa 9,0 eingestellt.This mixture is then lyophilized to a dry substance in the preferred procedure. This dry substance is then taken up in a buffer solution which is 0.01 molar in relation to tris (hydroxymethyl) aminomethane, 0.001 molar in relation to tetrasodium ethylenediaminetetraacetate and 7 molar in relation to urea, and the pH of the resulting solution (originally about 11) is adjusted to about 9.0 with HCI.
Wenn die trockene Substanz in einer ausreichenden Mindestmenge des Puffers völlig gelöst ist, wird die entstandene Lösung durch eine Kolonne mit Diäthylaminoäthylcellulose unter Verwendung weiterer Anteile der gleichen Pufferlösung als Eluiermittel chromato-When the dry substance is completely dissolved in a minimum sufficient amount of the buffer, the resulting solution through a column with diethylaminoethyl cellulose using further proportions the same buffer solution as the eluent chromato-
graphiert.graphed.
Bei dieser Elution werden Spuren von unerwünschten Stoffen, die hier nicht von Interesse sind, zuerst eluiert, gefolgt von Glucagon. Nach dem Glucagon wird das erfindungsgemäß angestrebte Hexatriacontapeptid sauber eluiert Bei der hier beschriebenen bevorzugten Arbeitsweise bleibt Insulin in der Chromatographiekolonne gebunden. Es kann, wenn dies gewünscht wird, mittels stärkerer Salzlösungen eluiert werden, diese Maßnahme bildet jedoch keinen Teil der Erfindung.During this elution, traces of undesirable substances, which are not of interest here, are first eluted. followed by glucagon. After the glucagon, the hexatriacontapeptide aimed at according to the invention becomes clean eluted In the preferred procedure described here, insulin remains in the chromatography column bound. If so desired, stronger salt solutions can be used to elute them However, measure does not form part of the invention.
Das Eluat in Pufferlösung wird dann an einer Kolonne mit Sephadex® G-25 (grob) mit 2%iger wäßriger Essigsäure als Eluiermittel chromatographiert. In dieser Stufe werden nichtvväßrige Pufferkomponenten fast vollständig entfernt Die erhaltene Lösung wird erneut lyophilisiert und das getrocknete Produkt, das nach dem Lyophilisieren verbleibt, ist das erfindungsgemäße Hexatriacontapeptid.The eluate in buffer solution is then passed on to a column Chromatographed with Sephadex® G-25 (coarse) with 2% aqueous acetic acid as the eluent. In this In the 2nd stage, non-aqueous buffer components are almost completely removed. The solution obtained is again lyophilized and the dried product that remains after lyophilizing is that of the invention Hexatriacontapeptide.
Die saubere Durchführung der vorher im einzelnen beschriebenen Stufen führt mit Zuverlässigkeit zu dem Produkt Das Produkt läßt sich jedoch gewünschtenfalls leicht folgendermaßen weiter charakterisieren. Eine bevorzugte erste Charakterisierungsmethode ist die Analyse auf die N-terminale Aminosäure. Dazu wird ein Teil des Produkts in bekannter Weise mit 1-DimethylaminonaphthaIin-5-sulfonylchlorid umgesetzt, das ein N-terminales Addukt bildet Das Addukt wird hydrolysiert, wodurch die terniinale Aminosäure als solches Addukt entfernt wird. Dieses wird dann einer Dünnschichtchromatographie unterworfen und im Ultraviolettlicht auf einen einzigen fluoreszierenden Fleck des 1 -Dimethylaminonaphthalin-S-sulfonylchlorid-Addukts von Alanin geprüftCarrying out the steps described in detail above reliably leads to this Product However, if desired, the product can easily be further characterized as follows. One the preferred first method of characterization is analysis for the N-terminal amino acid. To do this, a Part of the product in a known manner with 1-dimethylaminonaphthalene-5-sulfonyl chloride reacted, which forms an N-terminal adduct The adduct is hydrolyzed, whereby the terminal amino acid as such an adduct is removed. This then becomes one Subjected to thin layer chromatography and ultraviolet light on a single fluorescent spot of the 1-dimethylaminonaphthalene-S-sulfonyl chloride adduct checked by alanine
Wenn die Ergebnisse dieses Tests befriedigend ausfallen, wird das Produkt durch Polyacrylamidscheibengel-EIektrophorese in einem Trisborat-Puffer in einer Produktionskonzentration von 0,1% geprüft. Nach 2 Stunden bei einem konstanten elektrophoretischen Strom von 2 mAmpere wird das Gel mit Coomassie-Brilliantblau in einer Konzentration von etwa 0,025% in 10%iger wäßriger Trichloressigsäure angefärbt. Dieser Test soll eine einzelne blaue Zone mit beträchtlicher Dichte ergeben, die dem erfindungsgemäß angestrebten Hexatriacontapeptid entspricht.If the results of this test are satisfactory, the product is electrophoresed by polyacrylamide disc gel electrophoresis tested in a trisborate buffer at a production concentration of 0.1%. After 2 hours at a constant electrophoretic Current of 2 mAmpere is the gel with Coomassie brilliant blue in a concentration of about 0.025% stained in 10% aqueous trichloroacetic acid. This test is designed to feature a single blue zone result in considerable density, which corresponds to the hexatriacontapeptide aimed at according to the invention.
Wenn dieser Test befriedigende Ergebnisse liefert, 4-, kann mit der Probe gewünschtenfalls eine partielle oder vollständige Aminosäurensequenzanalyse durchgeführt werden.If this test gives satisfactory results, 4-, a partial or partial test can be carried out with the sample, if desired complete amino acid sequence analysis can be performed.
Das trockene isolierte Produkt ist eine weiße kristalline Substanz, die sich beim Erwärmen zersetzt, bevor eine definierte Schmelztemperatur festgestellt wird. Die Analyse durch eine Folge von subtraktiven Edman-Schritten führt zu der vorher angegebenen Struktur.The dry isolated product is a white crystalline substance that decomposes when heated, before a defined melting temperature is determined. Analysis through a sequence of subtractive Edman steps lead to the structure given above.
Die erfindungsgemäß gewonnenen Hexatriaconta- π peptide sind als Veterinärabführmittel vorteilhaft, das keine orale Verabreichung erfordert. Für solche Zwecke werden sie in bekannter Art und Weise so verabreicht, daß das Polypeptid undenaturiert in den Blutstrom gelangt. Die Verabreichung des Mittels führt zu einer (,ο unwillkürlichen Defalcation des Dickdarminhalts. Wenn eine rasche Wirkung gewünscht wird, wird es intravenös verabreicht. Wenn eine länger anhaltende Wirkung, die langsamer einsetzt, gewünscht wird, wird es als Depot verabreicht, aus dem es langsam in den Blutstrom br> abgegeben wird, z. B. subkutan in einem Gebiet mit guter peripherer Kreislaufversorgung.The Hexatriaconta- according to the invention obtained π peptides are useful as veterinary laxative, which does not require oral administration. For such purposes, they are administered in a known manner so that the polypeptide enters the bloodstream undenatured. The administration of the agent leads to an (, ο involuntary defalcation of the intestinal contents. If a rapid effect is desired, it is administered intravenously. If a longer-lasting effect, which onset more slowly, is desired, it is administered as a depot, from which it is administered slowly is released into the bloodstream b r > , e.g. subcutaneously in an area with good peripheral circulation.
Die Dosierungsmengen werden entsprechend der Tierart, der Stärke der gewünschten Wirkung und anderen Faktoren eingestellt, die üblicherweise bei der Festlegung von Dosierungsmengen berücksichtigt werden. Bei Hunden wurden mit dem erfindungsgemäßen Produkt bei intravenösen Injektionen von 5 bis 50 μg pro kg Körpergewicht gute Ergebnisse erzielt, was als allgemeine Richtlinie dienen kann. Dosierungen von nur 0,5 μg pro kg sind ebenfalls wirksam.The dosage amounts are determined according to the species, the strength of the desired effect and other factors usually taken into account when determining dosage levels. In dogs with the product according to the invention in intravenous injections of 5 to 50 μg gives good results per kg of body weight, which can serve as a general guide. Dosages of only 0.5 μg per kg are also effective.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.The following examples are provided for further explanation the invention.
Aus menschlichem Pankreas gewonnenes Hexatriacontapeptid (HPP)Hexatriacontapeptide (HPP) obtained from human pancreas
Man gewinnt bei Autopsien etwa 10 kg Humanpankreas und lagert ihn bei -20° C. Nach dem Vermählen bereitet man unter Anwendung der Verfahrensweise von Keller et al (J. Biol. Chem. 223 (1956) 457—467) aus jedem Pankreasansatz (1 bis 2 kg pro Ansatz) eine Aufschlämmung in Aceton, Wv/oei diese Behandlung unmittelbar nach der Lieferung des Pankreata in das Laboratorium erfolgt Die mit Aceton gebildeten Pulver mit einem Gesamtgewicht von 3 kg werden einzeln nach der Methode von Jackson et al (Diabetes 18 (1969) 2Of. -211) extrahiert, mit dem Unterschied, daß man pro Gramm des pulverförmigen Materials 65%iges angesäuertes Äthanol (mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 2,8 angesäuert) verwendet, um das während des Entfettungsvorgangs beseitigte Wasser zu kompensieren. Normalerweise extrahiert man jedes Gramm des feuchten Gewebes mit 2,5 ml angesäuertem 82%igem Äthanol (auf einen pH-Wert von 2,8 mit Phosphorsäure angesäuert).About 10 kg of human pancreas are obtained from autopsies and are stored at -20 ° C. After grinding prepared using the procedure of Keller et al (J. Biol. Chem. 223 (1956) 457-467) a suspension in acetone for each pancreatic batch (1 to 2 kg per batch), Wv / o for this treatment Immediately after delivery of the pancreata to the laboratory takes place The powder formed with acetone with a total weight of 3 kg are individually according to the method of Jackson et al (Diabetes 18 (1969) 2Of. -211), with the difference that one per Grams of the powdered material 65% acidified ethanol (with phosphoric acid on a pH 2.8 acidified) is used to add the water removed during the degreasing process compensate. Typically, every gram of wet tissue is extracted with 2.5 ml of acidified 82% ethanol (acidified to pH 2.8 with phosphoric acid).
Zur Herstellung des HPP verwendet man die herkömmliche Methode zur Bereitung von Insulin in Laboratoriumsmaßstab. Die vereinigten Äthanol/ Äther-Niederschläge machen insgesamt 160 g aus. Dieses pulverförmige Material wird an Sephadex® G —50F chromatographiert, um die insulinhaltige Fraktion zu gewinnen. In dieser Weise bildet man aus 17 Ansätzen 1700 mg dieses Materials. Diese rohe, lyophilisierte Insulinfraktion wird in 245 ml 0,005 η Chlorwasserstoffsäure bei 25° C gelöst Dann gibt man langsam unter Rühren ein gleich großes Volumen 30%iger Natriumchloridlösung, die mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 3,0 angesäuert worden ist, zu zentrifugiert den gebildeten Niederschlag nach 15 Minuten ab, entsalzt ihn durch eine Chromatographie an Sephadex® G —25C und lyophilisiert. Die erhaltene Probe mit einem Gewicht von 550 mg wird an Diäthylaminoäthylcellulose bei einem pH-Wert von 8 chromatographiert, wobei man 65 mg rohes HPP und 2'jO mg hochreines Insulin erhält. Man gewinnt hochreines HPP aus dem rohen HPP-Präparat durch Chromatograpiiie an Sephadex® G —50F gefolgt von einer Chromatographie an Diäthylaminoäthylcellulose bei einem pH-Wert von 9.The traditional method of preparing insulin on a laboratory scale is used to prepare the HPP. The combined ethanol / ether precipitates make a total of 160 g. This powdery material is chromatographed on Sephadex® G -50F to recover the insulin-containing fraction. 1700 mg of this material are formed in this way from 17 batches. This crude, lyophilized insulin fraction is dissolved in 245 ml of 0.005 η hydrochloric acid at 25 ° C. Then, while stirring, an equal volume of 30% sodium chloride solution which has been acidified to pH 3.0 with hydrochloric acid is slowly centrifuged the precipitate formed is removed after 15 minutes, it is desalted by chromatography on Sephadex® G-25C and lyophilized. The sample obtained, weighing 550 mg, is chromatographed on diethylaminoethyl cellulose at a pH value of 8, 65 mg of crude HPP and 20 mg of high-purity insulin being obtained. Highly pure HPP is obtained from the crude HPP preparation by chromatography on Sephadex® G -50F followed by chromatography on diethylaminoethyl cellulose at a pH of 9.
Beispiele 2bis4Examples 2-4
Nach der Verfahrensweise von Beispie! 1 bereitet man Rinder-Hexatriacontapeptid (BPP), Schweine-I Iexatriacontapeptid (PPP) und Schaf-Hexatriacontapeptid (OPP), indem man von Rinder-, Schweine- bzw. Schafpankreas ausgeht. Die Aminosäurezusammensetzung der erhaltenen Hexatriacontapeptide sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt.According to the procedure of Example! 1 is used to prepare bovine hexatriacontapeptide (BPP), porcine Iexatriacontapeptide (PPP) and sheep hexatriacontapeptide (OPP). Sheep pancreas goes out. The amino acid composition of the hexatriacontapeptides obtained are shown in FIG compiled in the table below.
7 87 8
Aminosäurezusammensetzung der aus Pankreas gewonnenen llexatriacontapeptideAmino acid composition of the ilexatriacontapeptides obtained from the pancreas
Claims (1)
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE19722258080 DE2258080C3 (en) | 1972-11-27 | 1972-11-27 | Process for the preparation of hexatriacontapeptides |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19722258080 DE2258080C3 (en) | 1972-11-27 | 1972-11-27 | Process for the preparation of hexatriacontapeptides |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2258080A1 DE2258080A1 (en) | 1974-05-30 |
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| DE2258080C3 true DE2258080C3 (en) | 1981-12-17 |
Family
ID=5862842
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19722258080 Expired DE2258080C3 (en) | 1972-11-27 | 1972-11-27 | Process for the preparation of hexatriacontapeptides |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE2258080C3 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4033941A (en) * | 1975-12-17 | 1977-07-05 | Eli Lilly And Company | Process for purifying glucagon |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3715345A (en) * | 1970-08-03 | 1973-02-06 | Lilly Co Eli | Glucagon separation process |
-
1972
- 1972-11-27 DE DE19722258080 patent/DE2258080C3/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2258080A1 (en) | 1974-05-30 |
| DE2258080B2 (en) | 1981-04-23 |
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