CA2845790A1 - Determination du pouvoir thrombogene d'immunoglobulines humaines - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne l'utilisation d'un kit pour la détermination du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines, ou lié à la présence du facteur VII ; du facteur X1 ; du facteur IX ; du facteur X ; de la forme activée de l'un ou l'autre de de ces facteurs ; ou toute combinaison de ces facteurs et/ou de l'une ou l'autre de leurs formes activées, lesquels sont contenues dans un échantillon à tester, le kit comprenant au moins les éléments suivants : un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes, des phospholipides, et du CaCl2. La présente invention concerne également un procédé permettant de déterminer le pouvoir thrombogène d'un échantillon à
tester lié à la présence du facteur VII activé ; et/ou du facteur XI activé ; et/ou du facteur IX
activé ; et/ou du facteur XII activé ; et/ou du facteur X activé.
tester lié à la présence du facteur VII activé ; et/ou du facteur XI activé ; et/ou du facteur IX
activé ; et/ou du facteur XII activé ; et/ou du facteur X activé.
Description
DETERMINATION DU POUVOIR THROMBOGENE
D'IMMUNOGLOBULINES HUMAINES
La présente invention concerne la détermination du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester.
Les immunoglobulines humaines, contenant essentiellement des IgG, sont utilisées couramment dans la thérapie des pathologies telles que l'immunodéficience ou des maladies auto-immunes et particulièrement par voie intraveineuse (MG).
Néanmoins, selon l'observation clinique, l'utilisation des MG chez des patients entraîne parfois des effets secondaires graves, comme par exemple des accidents thrombo-embo ligues.
Une thrombose embolique consiste en la formation d'un thrombus obturant un vaisseau sanguin. Le thrombus peut se développer dans la circulation veineuse et donner lieu à une thrombose veineuse, ou dans la circulation artérielle et entraîner une occlusion artérielle avec ischémie voire infarctus. Un thrombus résulte de la coagulation sanguine, par l'agrégation plaquettaire et l'activation du système de coagulation, ceci étant une réaction en chaîne qui met en jeu les plaquettes et les facteurs de la coagulation. Un thrombus contient essentiellement de la fibrine, une protéine insoluble, formée à partir du fibrinogène.
Les facteurs XI et IX font partie des facteurs intervenant dans la coagulation sanguine par voie intrinsèque. Le facteur IX est activé par le facteur XI
activé, ce dernier étant lui-même activé par le facteur XII activé. Cette cascade d'activation aboutit finalement à la formation du fibrinogène (FI).
Les études de la Demanderesse présentées dans la présente demande ont permis de montrer que la présence des facteurs de coagulation, tels que le facteur VII, le facteur IX, le facteur XI, le facteur XII ou le facteur X et/ou leurs formes activées dans un produit d'immunoglobuline humaine, tel que les MG, pourrait être la cause d'accidents thrombo-emboliques après l'injection des MG chez des patients.
Par conséquent, il y a une grande nécessité à mettre à disposition un procédé
fiable et sensible permettant de déterminer la présence de facteur VII activé, de facteur XI
activé, de facteur IX activé, de facteur XII activé et/ou de facteur X activé
dans un produit biologiquement acceptable contenant des immunoglobulines.
D'IMMUNOGLOBULINES HUMAINES
La présente invention concerne la détermination du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester.
Les immunoglobulines humaines, contenant essentiellement des IgG, sont utilisées couramment dans la thérapie des pathologies telles que l'immunodéficience ou des maladies auto-immunes et particulièrement par voie intraveineuse (MG).
Néanmoins, selon l'observation clinique, l'utilisation des MG chez des patients entraîne parfois des effets secondaires graves, comme par exemple des accidents thrombo-embo ligues.
Une thrombose embolique consiste en la formation d'un thrombus obturant un vaisseau sanguin. Le thrombus peut se développer dans la circulation veineuse et donner lieu à une thrombose veineuse, ou dans la circulation artérielle et entraîner une occlusion artérielle avec ischémie voire infarctus. Un thrombus résulte de la coagulation sanguine, par l'agrégation plaquettaire et l'activation du système de coagulation, ceci étant une réaction en chaîne qui met en jeu les plaquettes et les facteurs de la coagulation. Un thrombus contient essentiellement de la fibrine, une protéine insoluble, formée à partir du fibrinogène.
Les facteurs XI et IX font partie des facteurs intervenant dans la coagulation sanguine par voie intrinsèque. Le facteur IX est activé par le facteur XI
activé, ce dernier étant lui-même activé par le facteur XII activé. Cette cascade d'activation aboutit finalement à la formation du fibrinogène (FI).
Les études de la Demanderesse présentées dans la présente demande ont permis de montrer que la présence des facteurs de coagulation, tels que le facteur VII, le facteur IX, le facteur XI, le facteur XII ou le facteur X et/ou leurs formes activées dans un produit d'immunoglobuline humaine, tel que les MG, pourrait être la cause d'accidents thrombo-emboliques après l'injection des MG chez des patients.
Par conséquent, il y a une grande nécessité à mettre à disposition un procédé
fiable et sensible permettant de déterminer la présence de facteur VII activé, de facteur XI
activé, de facteur IX activé, de facteur XII activé et/ou de facteur X activé
dans un produit biologiquement acceptable contenant des immunoglobulines.
2 Le test de génération de thrombine (TGT) est connu de l'homme du métier. Le principe de ce test concerne l'analyse de la cinétique de la formation de thrombine qu'un plasma donné produit en réponse à une stimulation standardisée.
Parmi les TGT développés à ce jour, la thromboélastographie consiste à mesurer les propriétés physiques d'un sang total en analysant de manière mécanique la formation du caillot en fonction du temps. Selon les paramètres extraits d'un graphique (appelé
thromboélastogramme) généré par le thromboélastographe, on peut évaluer l'aptitude à la coagulation d'un patient.
Par ailleurs, Hemker et al. proposent en 2002 le concept de thrombinographie permettant de mesurer la génération de thrombine par fluorométrie (Pathophysiol Haemost thromb 2002; 32: 249-53). La thrombinographie consiste à utiliser un calibrateur de thrombine et un substrat fluorescent spécifique en plasma pauvre en plaquettes ou en plasma riche en plaquettes, afin d'établir un thrombinogramme. Un signal induit par la thrombine générée par le facteur tissulaire est confronté
au signal généré par une quantité normalisée de thrombine exogène dans ce même plasma.
La Demanderesse de la présente demande a trouvé de manière surprenante qu'un test de génération de thrombine permet également de déterminer la présence de FVII, de FXI, de FIX, de FXII, de FX et/ou de leurs formes activées dans un échantillon.
La présente invention a pour l'objectif de fournir un kit pour la détermination du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un produit bio logiquement acceptable.
La présente invention a également pour l'objectif de fournir un procédé
permettant de déterminer le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé, XI activé, du facteur IX activé, du facteur XII activé et/ou du facteur X
activé dans un échantillon susceptible d'être administré chez des humains.
Le premier aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes, - des phospholipides, - du CaC12, et éventuellement - du facteur tissulaire humain,
Parmi les TGT développés à ce jour, la thromboélastographie consiste à mesurer les propriétés physiques d'un sang total en analysant de manière mécanique la formation du caillot en fonction du temps. Selon les paramètres extraits d'un graphique (appelé
thromboélastogramme) généré par le thromboélastographe, on peut évaluer l'aptitude à la coagulation d'un patient.
Par ailleurs, Hemker et al. proposent en 2002 le concept de thrombinographie permettant de mesurer la génération de thrombine par fluorométrie (Pathophysiol Haemost thromb 2002; 32: 249-53). La thrombinographie consiste à utiliser un calibrateur de thrombine et un substrat fluorescent spécifique en plasma pauvre en plaquettes ou en plasma riche en plaquettes, afin d'établir un thrombinogramme. Un signal induit par la thrombine générée par le facteur tissulaire est confronté
au signal généré par une quantité normalisée de thrombine exogène dans ce même plasma.
La Demanderesse de la présente demande a trouvé de manière surprenante qu'un test de génération de thrombine permet également de déterminer la présence de FVII, de FXI, de FIX, de FXII, de FX et/ou de leurs formes activées dans un échantillon.
La présente invention a pour l'objectif de fournir un kit pour la détermination du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un produit bio logiquement acceptable.
La présente invention a également pour l'objectif de fournir un procédé
permettant de déterminer le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé, XI activé, du facteur IX activé, du facteur XII activé et/ou du facteur X
activé dans un échantillon susceptible d'être administré chez des humains.
Le premier aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes, - des phospholipides, - du CaC12, et éventuellement - du facteur tissulaire humain,
3 pour déterminer le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester lorsqu'ils sont mélangés formant un milieu réactionnel.
Le deuxième aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain déficient en facteur XI, - des phospholipides, - du CaC12, et éventuellement - du facteur tissulaire humain, pour déterminer le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester lorsqu'ils sont mélangés formant un milieu réactionnel.
On entend par plasma sanguin humain déficient en facteur XI , un plasma sanguin humain contenant moins de 1% (essais fonctionnels et antigéniques) de la quantité normale de facteur XI et de facteur XI activé.
Un plasma sanguin déficient en facteur XI est préparé par immuno-adsorption tel que le plasma déficient en facteur XI commercialisé par la société
Cryopep.
On entend par Immunoglobulines humaines ou IgG humaines dans le cadre de l'invention, des immunoglobulines polyvalentes qui sont essentiellement des IgG, incluant éventuellement des IgM. Il peut s'agir d'immunoglobulines entières, ou de fragments tels que F(ab')2 ou F(ab) et toute fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des immunoglobulines polyvalentes.
Dans le cadre de l'invention, on entend par pouvoir thrombogène , la capacité d'immunoglobulines humaines à déclencher une coagulation et former un thrombus chez des patients. Par conséquent, une préparation d'immunoglobulines thrombogène est une préparation d'immunoglobulines ayant la capacité
d'induire une coagulation et former un thrombus chez des patients.
Etant donné que les facteurs de coagulation sont naturellement présents dans les plasmas humains, le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines est un index relatif par rapport à la coagulation sanguine pouvant être déclenchée naturellement chez des patients.
Le deuxième aspect de l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain déficient en facteur XI, - des phospholipides, - du CaC12, et éventuellement - du facteur tissulaire humain, pour déterminer le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester lorsqu'ils sont mélangés formant un milieu réactionnel.
On entend par plasma sanguin humain déficient en facteur XI , un plasma sanguin humain contenant moins de 1% (essais fonctionnels et antigéniques) de la quantité normale de facteur XI et de facteur XI activé.
Un plasma sanguin déficient en facteur XI est préparé par immuno-adsorption tel que le plasma déficient en facteur XI commercialisé par la société
Cryopep.
On entend par Immunoglobulines humaines ou IgG humaines dans le cadre de l'invention, des immunoglobulines polyvalentes qui sont essentiellement des IgG, incluant éventuellement des IgM. Il peut s'agir d'immunoglobulines entières, ou de fragments tels que F(ab')2 ou F(ab) et toute fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des immunoglobulines polyvalentes.
Dans le cadre de l'invention, on entend par pouvoir thrombogène , la capacité d'immunoglobulines humaines à déclencher une coagulation et former un thrombus chez des patients. Par conséquent, une préparation d'immunoglobulines thrombogène est une préparation d'immunoglobulines ayant la capacité
d'induire une coagulation et former un thrombus chez des patients.
Etant donné que les facteurs de coagulation sont naturellement présents dans les plasmas humains, le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines est un index relatif par rapport à la coagulation sanguine pouvant être déclenchée naturellement chez des patients.
4 On entend un échantillon biologiquement acceptable , un échantillon susceptible d'être administré chez les humains par voix intraveineuse, parentérale, ou intramusculaire. Il peut s'agir notamment de préparations d'immunoglobulines humaines à visée thérapeutique.
Par préparations d'immunoglobulines humaines à visée thérapeutique on entend tout médicament comprenant des immunoglobulines humaines sous une forme pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir notamment d'IvIG.
L'utilisation du kit selon la présente invention permet d'établir un thrombinogramme pour l'échantillon à tester. Un thrombinogramme est représenté
par une courbe de génération de thrombine caractérisée par plusieurs paramètres :
- Le Temps de latence ou Lagtime (en minutes) qui est corrélé au temps de coagulation - L'aire sous le pic ou ETP (Endogenous Thrombin Potential, en nM x min), directement corrélée à la quantité totale de thrombine générée - La hauteur de pic ou Peak (en nM), représentant la quantité maximale de thrombine présente dans l'échantillon au cours de la lecture - Le Temps au pic ou Time to peak : ttPeak (en minutes), qui est le temps permettant d'atteindre le sommet du pic - La Vélocité : Peak/(ttPeak-Lagtime) (en nM/min), représentative de la vitesse de formation de la thrombine.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI, - des phospholipides, - du CaC12, et éventuellement - du facteur tissulaire humain, pour déterminer le pouvoir thrombogène, lié à la présence notamment du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leurs formes activées, d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester formant un milieu réactionnel.
Encore plus avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes,
Par préparations d'immunoglobulines humaines à visée thérapeutique on entend tout médicament comprenant des immunoglobulines humaines sous une forme pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir notamment d'IvIG.
L'utilisation du kit selon la présente invention permet d'établir un thrombinogramme pour l'échantillon à tester. Un thrombinogramme est représenté
par une courbe de génération de thrombine caractérisée par plusieurs paramètres :
- Le Temps de latence ou Lagtime (en minutes) qui est corrélé au temps de coagulation - L'aire sous le pic ou ETP (Endogenous Thrombin Potential, en nM x min), directement corrélée à la quantité totale de thrombine générée - La hauteur de pic ou Peak (en nM), représentant la quantité maximale de thrombine présente dans l'échantillon au cours de la lecture - Le Temps au pic ou Time to peak : ttPeak (en minutes), qui est le temps permettant d'atteindre le sommet du pic - La Vélocité : Peak/(ttPeak-Lagtime) (en nM/min), représentative de la vitesse de formation de la thrombine.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI, - des phospholipides, - du CaC12, et éventuellement - du facteur tissulaire humain, pour déterminer le pouvoir thrombogène, lié à la présence notamment du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leurs formes activées, d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester formant un milieu réactionnel.
Encore plus avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes,
5 - des phospholipides, - du CaC12, et éventuellement - du facteur tissulaire humain, pour déterminer le pouvoir thrombogène, lié à la présence notamment du facteur XII
et/ou de sa forme activée, d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à
tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à
tester formant un milieu réactionnel.
Par plasma sanguin humain déficient en facteur XI et pauvre en plaquettes , on entend un plasma sanguin humain contenant moins de 1% (essais fonctionnels et antigéniques) de la quantité normale de facteur XI et moins de 10x 109 plaquettes/L de plasma.
Un plasma sanguin pauvre en plaquettes est préparé selon une méthode connue de l'homme du métier telle que la centrifugation.
Par facteur VII activé ou FVIIa , on entend une protéine de FVII capable d'activer le facteur IX ou le facteur X.
Par facteur XII activé ou FXIIa , on entend une protéine de FXII capable d'activer le facteur XI.
Par facteur XI activé ou FXIa , on entend une protéine constituée de deux sous-unités de 80 kDa, liées entre elle par un pont disulfure à la position Cys-321 et capable de reconnaître son substrat naturel : FIX.
Par facteur IX activé ou FIXa , on entend une protéine de FIX capable de reconnaître son substrat naturel : FX.
Par facteur X activé ou FXa , on entend une protéine de FX capable de reconnaitre son substrat naturel la prothrombine.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l'utilisation d'un kit selon l'invention comprenant en outre un tampon de dilution tel qu'un tampon physiologique Tris NaC1 ou un tampon identique à celui de l'échantillon à
et/ou de sa forme activée, d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à
tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à
tester formant un milieu réactionnel.
Par plasma sanguin humain déficient en facteur XI et pauvre en plaquettes , on entend un plasma sanguin humain contenant moins de 1% (essais fonctionnels et antigéniques) de la quantité normale de facteur XI et moins de 10x 109 plaquettes/L de plasma.
Un plasma sanguin pauvre en plaquettes est préparé selon une méthode connue de l'homme du métier telle que la centrifugation.
Par facteur VII activé ou FVIIa , on entend une protéine de FVII capable d'activer le facteur IX ou le facteur X.
Par facteur XII activé ou FXIIa , on entend une protéine de FXII capable d'activer le facteur XI.
Par facteur XI activé ou FXIa , on entend une protéine constituée de deux sous-unités de 80 kDa, liées entre elle par un pont disulfure à la position Cys-321 et capable de reconnaître son substrat naturel : FIX.
Par facteur IX activé ou FIXa , on entend une protéine de FIX capable de reconnaître son substrat naturel : FX.
Par facteur X activé ou FXa , on entend une protéine de FX capable de reconnaitre son substrat naturel la prothrombine.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne l'utilisation d'un kit selon l'invention comprenant en outre un tampon de dilution tel qu'un tampon physiologique Tris NaC1 ou un tampon identique à celui de l'échantillon à
6 tester. Il s'agit alors d'un tampon de formulation acceptable pour une préparation d'immunoglobulines à visée thérapeutique.
L'échantillon de plasma sanguin humain contenu dans le kit et le tampon de dilution forment un témoin négatif.
Dans un mode de réalisation particulier, le kit selon l'invention comprend en outre un substrat fluorogénique ou flurorescent.
Le plasma sanguin humain est prélevé chez des donneurs volontaires sains ne présentant pas de maladies graves, et contient tous les facteurs de la coagulation, en taux normal, intervenant dans la coagulation sanguine par voie intrinsèque.
Dans un mode de réalisation avantageux, le plasma sanguin humain est un pool de plasmas sanguins humains frais ou congelé ou un plasma sanguin commercial calibré.
Le plasma sanguin utilisé dans l'invention peut contenir ou être dépourvu de facteur tissulaire.
Dans un mode de réalisation avantageux, le plasma sanguin humain est dépourvu de facteur tissulaire.
Dans un mode de réalisation avantageux, le facteur tissulaire humain du kit est d'origine plasmatique, d'origine recombinante, ou d'origine transgénique.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant :
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en FXI, dont le volume représente de 80% à 40%, notamment de 75% à 50%, particulièrement 53% du volume du milieu réactionnel.
- des phospholipides humains, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 1 ILLM à 10 ILLM, particulièrement 4 ILLM, - du facteur tissulaire humain, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM, - du CaC12.
Ledit kit peut comprendre en outre un tampon de dilution, notamment du tampon Tris NaCl.
Dans un mode de réalisation avantageux, le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon à tester est de 8:1 à 2:1, particulièrement 4:1.
L'échantillon de plasma sanguin humain contenu dans le kit et le tampon de dilution forment un témoin négatif.
Dans un mode de réalisation particulier, le kit selon l'invention comprend en outre un substrat fluorogénique ou flurorescent.
Le plasma sanguin humain est prélevé chez des donneurs volontaires sains ne présentant pas de maladies graves, et contient tous les facteurs de la coagulation, en taux normal, intervenant dans la coagulation sanguine par voie intrinsèque.
Dans un mode de réalisation avantageux, le plasma sanguin humain est un pool de plasmas sanguins humains frais ou congelé ou un plasma sanguin commercial calibré.
Le plasma sanguin utilisé dans l'invention peut contenir ou être dépourvu de facteur tissulaire.
Dans un mode de réalisation avantageux, le plasma sanguin humain est dépourvu de facteur tissulaire.
Dans un mode de réalisation avantageux, le facteur tissulaire humain du kit est d'origine plasmatique, d'origine recombinante, ou d'origine transgénique.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne l'utilisation d'un kit comprenant :
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en FXI, dont le volume représente de 80% à 40%, notamment de 75% à 50%, particulièrement 53% du volume du milieu réactionnel.
- des phospholipides humains, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 1 ILLM à 10 ILLM, particulièrement 4 ILLM, - du facteur tissulaire humain, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM, - du CaC12.
Ledit kit peut comprendre en outre un tampon de dilution, notamment du tampon Tris NaCl.
Dans un mode de réalisation avantageux, le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon à tester est de 8:1 à 2:1, particulièrement 4:1.
7 Le ratio de 8:1 à 2:1 correspond aux conditions d'injection de l'immunoglobuline au patient. Le ratio de 4:1 est physiologiquement significatif pour une concentration en Ig de 5%.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de mesure du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester notamment bio logiquement acceptable.
Ledit procédé comprend les étapes suivantes :
a) le mélange du tampon de dilution, notamment du tampon Tris NaC1, avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un témoin négatif intermédiaire ;
b) le mélange d'un échantillon à tester avec le plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un milieu réactionnel intermédiaire ;
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant des phospholipides, du CaC12, et éventuellement du facteur tissulaire humain, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif ;
d) l'obtention d'un premier thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel obtenu à l'étape c) et d'un second thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le témoin négatif obtenu à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenus de l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à
partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé
et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé et/ou du facteur X
activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans l'échantillon à tester.
Dans un mode de réalisation particulier, le plasma sanguin humain pauvre en plaquettes est déficient en facteur XI.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de mesure du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester notamment bio logiquement acceptable.
Ledit procédé comprend les étapes suivantes :
a) le mélange du tampon de dilution, notamment du tampon Tris NaC1, avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un témoin négatif intermédiaire ;
b) le mélange d'un échantillon à tester avec le plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un milieu réactionnel intermédiaire ;
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant des phospholipides, du CaC12, et éventuellement du facteur tissulaire humain, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif ;
d) l'obtention d'un premier thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel obtenu à l'étape c) et d'un second thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le témoin négatif obtenu à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenus de l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à
partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé
et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé et/ou du facteur X
activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans l'échantillon à tester.
Dans un mode de réalisation particulier, le plasma sanguin humain pauvre en plaquettes est déficient en facteur XI.
8 Dans un mode réalisation particulier, le thrombinogramme standard est obtenu en effectuant un test de génération de thrombine sur un milieu réactionnel comprenant i) un calibrateur dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII
activé et/ou du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé
et/ou du facteur X activé est connu, ii) un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et éventuellement déficient en facteur XI , iii) un mélange réactionnel comprenant des phopho lipides, du CaC12 et éventuellement le facteur tissulaire humain. Le calibrateur est utilisé par le logiciel pour effectuer des corrections des signaux bruts et permet de palier à certains inconvénients de la fluorescence et de transformer le signal initialement en Unités de fluorescence par minute directement en nanomolaires de thrombine.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la concentration finale du facteur tissulaire humain dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM. Le facteur tissulaire et le FVIIa forment un complexe pour activer des facteurs IX et X au niveau de la voie exogène de la coagulation.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la concentration finale des phospholipides humains dans le milieu réactionnel est de 1 ILLM à 10 ILLM, particulièrement 4 ILLM.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le volume du plasma sanguin représente de 80% à 40%, notamment de 75% à 50%, particulièrement 53% du volume du milieu réactionnel.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon est de 8:1 à 2:1, particulièrement 4:1.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le thrombinogramme est obtenu par la méthode de la thromboélastographie ou la méthode de thrombinographie.
La thromboélastographie peut être mise en oeuvre selon la méthode connue de l'homme du métier, telle que décrite par Savry et al. (Ann Fr Anesth Reanim 2005;
24 :607-16).
La thrombinographie peut être mise en oeuvre selon la méthode connue de l'homme du métier, telle que décrite par Hemker et al. (Pathophysiol Haemost thromb 2002 ; 32 : 249-53).
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes :
activé et/ou du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé
et/ou du facteur X activé est connu, ii) un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et éventuellement déficient en facteur XI , iii) un mélange réactionnel comprenant des phopho lipides, du CaC12 et éventuellement le facteur tissulaire humain. Le calibrateur est utilisé par le logiciel pour effectuer des corrections des signaux bruts et permet de palier à certains inconvénients de la fluorescence et de transformer le signal initialement en Unités de fluorescence par minute directement en nanomolaires de thrombine.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la concentration finale du facteur tissulaire humain dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM. Le facteur tissulaire et le FVIIa forment un complexe pour activer des facteurs IX et X au niveau de la voie exogène de la coagulation.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la concentration finale des phospholipides humains dans le milieu réactionnel est de 1 ILLM à 10 ILLM, particulièrement 4 ILLM.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le volume du plasma sanguin représente de 80% à 40%, notamment de 75% à 50%, particulièrement 53% du volume du milieu réactionnel.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon est de 8:1 à 2:1, particulièrement 4:1.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le thrombinogramme est obtenu par la méthode de la thromboélastographie ou la méthode de thrombinographie.
La thromboélastographie peut être mise en oeuvre selon la méthode connue de l'homme du métier, telle que décrite par Savry et al. (Ann Fr Anesth Reanim 2005;
24 :607-16).
La thrombinographie peut être mise en oeuvre selon la méthode connue de l'homme du métier, telle que décrite par Hemker et al. (Pathophysiol Haemost thromb 2002 ; 32 : 249-53).
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes :
9 a) le mélange du tampon de dilution d'un échantillon à tester avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI pour former un témoin négatif intermédiaire;
b) le mélange d'un échantillon avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI représentant 53% du volume du milieu réactionnel, dans lequel le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon est de 8:1 à 2:1, particulièrement 4:1 pour former un milieu réactionnel intermédiaire ;
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant 4 M
des phopho lipides, et 3pM de facteur tissulaire humain et du CaC12, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif;
d) l'obtention de deux thrombinogrammes par la mise en oeuvre de thrombinographie, en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel et sur le témoin négatif obtenus à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenu à l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé
et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur X activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leur forme activée dans l'échantillon.
La présente invention est illustrée davantage par les figures et les exemples ci-dessous. Ces figures et exemples représentant les modes de réalisation particuliers de l'invention, ne visent en aucun cas à limiter la portée de l'invention.
Figures Figure 1: la figure 1 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, ou un pool de plasma normal dilué (1/9), du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, ou un pool de plasma normal dilué (1/9) respectivement, selon le premier protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 20 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 1 .
Figure 2 : la figure 2 représente la détermination respective du pouvoir 5 thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, ou du FXIa dans un pool de plasma normal dilué (1/9), et du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, ou du tampon de dilution dans un pool de plasma normal dilué (1/9), selon le deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1,
b) le mélange d'un échantillon avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI représentant 53% du volume du milieu réactionnel, dans lequel le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon est de 8:1 à 2:1, particulièrement 4:1 pour former un milieu réactionnel intermédiaire ;
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant 4 M
des phopho lipides, et 3pM de facteur tissulaire humain et du CaC12, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif;
d) l'obtention de deux thrombinogrammes par la mise en oeuvre de thrombinographie, en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel et sur le témoin négatif obtenus à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenu à l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé
et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur X activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leur forme activée dans l'échantillon.
La présente invention est illustrée davantage par les figures et les exemples ci-dessous. Ces figures et exemples représentant les modes de réalisation particuliers de l'invention, ne visent en aucun cas à limiter la portée de l'invention.
Figures Figure 1: la figure 1 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, ou un pool de plasma normal dilué (1/9), du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, ou un pool de plasma normal dilué (1/9) respectivement, selon le premier protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 20 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 1 .
Figure 2 : la figure 2 représente la détermination respective du pouvoir 5 thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, ou du FXIa dans un pool de plasma normal dilué (1/9), et du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, ou du tampon de dilution dans un pool de plasma normal dilué (1/9), selon le deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1,
10 sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 3 : la figure 3 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, du FXI dans un pool de plasma normal dilué (1/9), du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, ou du tampon de dilution dans un pool de plasma normal dilué (1/9), selon le deuxième protocole. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 4 : la figure 4 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur XI activé de concentrations différentes dans un pool de plasma normal contenant IgG, du XIa activé dans un pool de plasma normal, d'un pool de plasma normal contenant IgG, et du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, selon le deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 5 : la figure 5 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur IX activé de concentrations différentes dans un pool de plasma normal contenant IgG, du IXa activé dans un pool de plasma normal, d'un pool de plasma normal contenant IgG, et du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, selon le deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu
Figure 3 : la figure 3 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur XI activé dans un pool de plasma normal, du FXI dans un pool de plasma normal dilué (1/9), du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, ou du tampon de dilution dans un pool de plasma normal dilué (1/9), selon le deuxième protocole. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 4 : la figure 4 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur XI activé de concentrations différentes dans un pool de plasma normal contenant IgG, du XIa activé dans un pool de plasma normal, d'un pool de plasma normal contenant IgG, et du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, selon le deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 5 : la figure 5 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du facteur IX activé de concentrations différentes dans un pool de plasma normal contenant IgG, du IXa activé dans un pool de plasma normal, d'un pool de plasma normal contenant IgG, et du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, selon le deuxième protocole. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu
11 réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 6 : la figure 6 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, du facteur XI
activé
dans un pool de plasma normal contenant IgG, du facteur IX activé dans un pool plasma normal contenant IgG, du facteur XI activé et du facteur IX activé dans un pool de plasma normal contenant IgG, des immunoglobulines de type Tégéline0 (LFB) dans un pool de plasma normal contenant, des immunoglobulines de type Clairyg0 (LFB) dans un pool de plasma normal, de des immunoglobulines de type IgNG (LFB) dans un pool de plasma normal, des immunoglobulines de type IVHEBEXO (LFB) dans un pool de plasma normal. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 7 : la figure 7 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma calibré commercialisé par la société Stago sous le nom Unicalibrator0 , du plasma Unicalibrator0 contenant le tampon de dilution, du plasma Unicalibrator0 contenant le facteur IX activé, du plasma Unicalibrator0 contenant le facteur XI activé, du plasma Unicalibrator0 contenant le facteur IX
activé et le facteur XI activé, du plasma Unicalibrator0 contenant des immunoglobulines de type ClairygO. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 8 : la figure 8 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma Unicalibrator0 contenant le tampon de dilution, du plasma Unicalibrator0 contenant le facteur IX activé, du plasma Unicalibrator0 contenant le facteur XI activé, du plasma Unicalibrator0 contenant des immunoglobulines de type IgNG. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 6 : la figure 6 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du tampon de dilution dans un pool de plasma normal, du facteur XI
activé
dans un pool de plasma normal contenant IgG, du facteur IX activé dans un pool plasma normal contenant IgG, du facteur XI activé et du facteur IX activé dans un pool de plasma normal contenant IgG, des immunoglobulines de type Tégéline0 (LFB) dans un pool de plasma normal contenant, des immunoglobulines de type Clairyg0 (LFB) dans un pool de plasma normal, de des immunoglobulines de type IgNG (LFB) dans un pool de plasma normal, des immunoglobulines de type IVHEBEXO (LFB) dans un pool de plasma normal. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 7 : la figure 7 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma calibré commercialisé par la société Stago sous le nom Unicalibrator0 , du plasma Unicalibrator0 contenant le tampon de dilution, du plasma Unicalibrator0 contenant le facteur IX activé, du plasma Unicalibrator0 contenant le facteur XI activé, du plasma Unicalibrator0 contenant le facteur IX
activé et le facteur XI activé, du plasma Unicalibrator0 contenant des immunoglobulines de type ClairygO. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 8 : la figure 8 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma Unicalibrator0 contenant le tampon de dilution, du plasma Unicalibrator0 contenant le facteur IX activé, du plasma Unicalibrator0 contenant le facteur XI activé, du plasma Unicalibrator0 contenant des immunoglobulines de type IgNG. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
12 Figure 9 : la figure 9 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma déficient en FXI, du FIXa dans un plasma déficient en FXI, du FXIa dans un plasma déficient en FXI, du FIXa et du FXIa dans un plasma déficient en FXI, de des immunoglobulines de type Clairyg0 dans un plasma déficient en FXI.
La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 10 : la figure 10 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma déficient en FXI, du FIXa dans un plasma déficient en FXI, du FXIa dans un plasma déficient en FXI, des immunoglobulines de type IgNG dans un plasma déficient en FXI. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 11: la figure 11 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, des immunoglobulines de type IgNG dans un plasma déficient en FIX. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 12 : la figure 12 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, des immunoglobulines de type IgNG dans un plasma déficient en FIX. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 13 : la figure 13 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du tampon de dilution dans le plasma Unicalibrator0 , du FXIa dans le plasma Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type Tégéline dans le plasma Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type Clairyg dans le plasma
La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 10 : la figure 10 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma déficient en FXI, du FIXa dans un plasma déficient en FXI, du FXIa dans un plasma déficient en FXI, des immunoglobulines de type IgNG dans un plasma déficient en FXI. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 11: la figure 11 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, des immunoglobulines de type IgNG dans un plasma déficient en FIX. La concentration finale du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel est 0,3 pM. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 12 : la figure 12 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, du FIXa dans un plasma déficient en FIX, des immunoglobulines de type IgNG dans un plasma déficient en FIX. Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire. Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 13 : la figure 13 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène du tampon de dilution dans le plasma Unicalibrator0 , du FXIa dans le plasma Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type Tégéline dans le plasma Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type Clairyg dans le plasma
13 Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type IVhebex dans le plasma Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type IgNG 10% dans le plasma Unicalibrator0 , des immunoglobulines de type IgNG 5% dans le plasma Unicalibrator0 . Le milieu réactionnel ne contient pas de facteur tissulaire.
La concentration finale des phospholipides dans le milieu réactionnel est 8 M.
Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 14A : la figure 14 A représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant 0,3 pM de facteur tissulaire, 4 ,M de phospholipides, 10itL d'immunoglobuline intraveineuse thrombogène, 80 ,L de plasma normal et éventuellement 10itL d' anti-FXI.
Figure 14B : la figure 14 B représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant 0,3 pM de facteur tissulaire, 4 ,M de phospholipides, 10itL d'immunoglobuline intraveineuse thrombogène, 80 ,L de plasma déficient en FXI et éventuellement 10itL d'anti-FXI.
Figure 15 : la figure 15 représente l'étude de la vélocité en fonction de la concentration en inhibiteur du FXI.
Figure 16 : la figure 16 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 1 à 16ng/m1 de FXIa dilués dans un lot d'IgNG 5% ou dans le tampon de dilution dudit lot d'IgNG 5%.
Figure 17A : la figure 17A représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,5U1/ml à 200UI/m1 de FVIIa dans un plasma déficient en FXI ou le tampon Clairyg0 (tampon de formulation du produit Clairyg0 commercialisé par le Laboratoire LFB BIOMEDICAMENTS) dans un plasma déficient en FXI.
Figure 17B : la figure 17B représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,5U1/ml à 200UI/m1 de FVIIa dans un plasma normal ou le tampon Clairyg0 dans un plasma normal.
La concentration finale des phospholipides dans le milieu réactionnel est 8 M.
Les autres conditions de réactions sont décrites dans le tableau 1, sous la colonne désignée Protocole 2 .
Figure 14A : la figure 14 A représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant 0,3 pM de facteur tissulaire, 4 ,M de phospholipides, 10itL d'immunoglobuline intraveineuse thrombogène, 80 ,L de plasma normal et éventuellement 10itL d' anti-FXI.
Figure 14B : la figure 14 B représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant 0,3 pM de facteur tissulaire, 4 ,M de phospholipides, 10itL d'immunoglobuline intraveineuse thrombogène, 80 ,L de plasma déficient en FXI et éventuellement 10itL d'anti-FXI.
Figure 15 : la figure 15 représente l'étude de la vélocité en fonction de la concentration en inhibiteur du FXI.
Figure 16 : la figure 16 représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 1 à 16ng/m1 de FXIa dilués dans un lot d'IgNG 5% ou dans le tampon de dilution dudit lot d'IgNG 5%.
Figure 17A : la figure 17A représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,5U1/ml à 200UI/m1 de FVIIa dans un plasma déficient en FXI ou le tampon Clairyg0 (tampon de formulation du produit Clairyg0 commercialisé par le Laboratoire LFB BIOMEDICAMENTS) dans un plasma déficient en FXI.
Figure 17B : la figure 17B représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,5U1/ml à 200UI/m1 de FVIIa dans un plasma normal ou le tampon Clairyg0 dans un plasma normal.
14 Figure 18A : la figure 18A représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,68 UI/ml à 5,5 UI/ml de FIXa dans un plasma déficient en FXI ou le tampon Clairyg0 dans un plasma déficient en FXI.
Figure 18B : la figure 18B représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,68 UI/ml à 5,5 UI/ml de FIXa dans un plasma normal ou le tampon Clairyg0 dans un plasma normal.
Exemples Exemple 1: détermination du pouvoir thrombogène d'un échantillon Protocole 1 pour déterminer le pouvoir thrombogène d'un échantillon à
tester Equipement: système CAT (Stago) Réactifs: Stago D Plasma Normal : pool de Plasma congelé (interne) Préparation des échantillons: 1 volume de produit pour 8 volumes de PN ou de PN au 1/5ème en Tampon de dilution (R1).
D Conditions expérimentales:
- 80 lut Préparation. +20 lut PPP-reagent High (4 ILLM phospholipides et 20 pM
FT final) - 20 lut FluCa-reagent ajoutés par l'appareil D Fluorescence: X excitation = 390 nm, X émission = 460 nm Protocole 2 pour déterminer le pouvoir thrombogène d'un échantillon à
tester Equipement : Fuoroscan / système CAT (Stago) Réactifs: Stago D Plasma Normal (PN): Pool de Plasma congelé (interne) ou Unicalibrator (Stago) D Préparation des échantillons: 1 vol de produit pour 4 ou 8 vol de PN
D mélange réactionnel : 500 lut MP-reagent repris avec 0,5mL d'eau + 300 I
PRP-reagent + 200 lut de tampon de dilution D Conditions expérimentales:
- 80 ILLL Préparation - 20 ILLL mélange réactionnel (4 ILLM phospholipides et 0,3 pM FT final) - 20 ILLL FluCa-reagent ajoutés par l'appareil Fluorescence: X excitation = 390 nm, X émission = 460 nm Les conditions de réactions selon le protocole 1 ou le protocole 2 sont résumés dans le tableau ci-dessous.
Protocole 1 Protocole 2 Equipement Fluoroscan système CAT (Hemker) Normal 1/5 Normal pur ou Plasma Normal pur = R1 déficient FXI
Stago Facteur Tissulaire Stago Stago PRP-reagent PPP-reagent PPP-reagent Phospholipides High High Stago MP-reagent FluCa kit FluCa kit FluCa kit Substrat Stago Stago Stago fluorogénique CaC12 CaC12 CaC12 FT finale 20 pM 20pM 0,3 pM
PL finale 4 i_tM 4 i_tM 4 i_tM
Plasma final 59% 12% 53%
Plasma / Ech 8:1 8:5 4:1 Exemple 2 : Concentration finale du facteur tissulaire 10 Le pouvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma normal ou dans un pool de plasma dilué est déterminé selon le protocole 1 (Figure 1) ou le protocole 2 (Figure 2), respectivement décrits ci-dessus.
Le protocole 2, effectué en faible concentration finale du facteur tissulaire, permet d'obtenir un résultat plus sensible que celui obtenu par le protocole 1, utilisant
Figure 18B : la figure 18B représente la détermination respective du pouvoir thrombogène des échantillons contenant respectivement de 0,68 UI/ml à 5,5 UI/ml de FIXa dans un plasma normal ou le tampon Clairyg0 dans un plasma normal.
Exemples Exemple 1: détermination du pouvoir thrombogène d'un échantillon Protocole 1 pour déterminer le pouvoir thrombogène d'un échantillon à
tester Equipement: système CAT (Stago) Réactifs: Stago D Plasma Normal : pool de Plasma congelé (interne) Préparation des échantillons: 1 volume de produit pour 8 volumes de PN ou de PN au 1/5ème en Tampon de dilution (R1).
D Conditions expérimentales:
- 80 lut Préparation. +20 lut PPP-reagent High (4 ILLM phospholipides et 20 pM
FT final) - 20 lut FluCa-reagent ajoutés par l'appareil D Fluorescence: X excitation = 390 nm, X émission = 460 nm Protocole 2 pour déterminer le pouvoir thrombogène d'un échantillon à
tester Equipement : Fuoroscan / système CAT (Stago) Réactifs: Stago D Plasma Normal (PN): Pool de Plasma congelé (interne) ou Unicalibrator (Stago) D Préparation des échantillons: 1 vol de produit pour 4 ou 8 vol de PN
D mélange réactionnel : 500 lut MP-reagent repris avec 0,5mL d'eau + 300 I
PRP-reagent + 200 lut de tampon de dilution D Conditions expérimentales:
- 80 ILLL Préparation - 20 ILLL mélange réactionnel (4 ILLM phospholipides et 0,3 pM FT final) - 20 ILLL FluCa-reagent ajoutés par l'appareil Fluorescence: X excitation = 390 nm, X émission = 460 nm Les conditions de réactions selon le protocole 1 ou le protocole 2 sont résumés dans le tableau ci-dessous.
Protocole 1 Protocole 2 Equipement Fluoroscan système CAT (Hemker) Normal 1/5 Normal pur ou Plasma Normal pur = R1 déficient FXI
Stago Facteur Tissulaire Stago Stago PRP-reagent PPP-reagent PPP-reagent Phospholipides High High Stago MP-reagent FluCa kit FluCa kit FluCa kit Substrat Stago Stago Stago fluorogénique CaC12 CaC12 CaC12 FT finale 20 pM 20pM 0,3 pM
PL finale 4 i_tM 4 i_tM 4 i_tM
Plasma final 59% 12% 53%
Plasma / Ech 8:1 8:5 4:1 Exemple 2 : Concentration finale du facteur tissulaire 10 Le pouvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma normal ou dans un pool de plasma dilué est déterminé selon le protocole 1 (Figure 1) ou le protocole 2 (Figure 2), respectivement décrits ci-dessus.
Le protocole 2, effectué en faible concentration finale du facteur tissulaire, permet d'obtenir un résultat plus sensible que celui obtenu par le protocole 1, utilisant
15 une forte concentration finale du facteur tissulaire.
Exemple 3 : Présence du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel Le pourvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma normal ou dans un pool de plasma dilué est déterminé, selon le protocole 2, dans un milieu réactionnel contenant 0,3 pM du facteur tissulaire (Figure 2) ou sans facteur tissulaire (Figure 3).
Exemple 3 : Présence du facteur tissulaire dans le milieu réactionnel Le pourvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma normal ou dans un pool de plasma dilué est déterminé, selon le protocole 2, dans un milieu réactionnel contenant 0,3 pM du facteur tissulaire (Figure 2) ou sans facteur tissulaire (Figure 3).
16 La variabilité des réponses obtenues dans le milieu réactionnel sans FT est plus importante que celle dans le milieu réactionnel avec FT. En l'absence de FT, La spécificité de cette réponse qui intervient à des temps tardifs ( >20min) n'est pas assurée.
Exemple 4: Concentration finale des phospholipides Le pouvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma commercial calibré
(Unicalibrator0, Stago) est déterminé, selon le protocole 2, dans un milieu réactionnel contenant 4 ,M (Figure 8) ou 8 ,M (Figure 13) des phospholipides et sans FT.
Il ressort que l'augmentation de la concentration en phospholipides de 4 1.M à
1.M en absence de facteur tissulaire n'a pas permis de stabiliser les réponses.
Exemple 5: Détermination du pouvoir thrombogène des immunoglobulines de type IgNG
Le protocole 2 décrit ci-dessus est mis en oeuvre pour déterminer le pouvoir thrombogène lié à la présence du FXIa (Figure 4) ou du FIXa (Figure 5) des immunoglobulines de type IgNG (LFB).
Le signal de l'apparition de la thrombine dans l'échantillon contenant seulement des immunglobulines de type IgNG est apparu quasiment en même temps que celui de l'apparition de la thrombine dans l'échantillon contenant le tampon de dilution. Il ressort que les immunoglobulines de type IgNG ne contient quasiment pas du FXIa ou FIXa.
Exemple 6: Origine du pool de plasma sanguin Le pouvoir thrombogène du FXIa ou du FIXa est déterminé, selon le protocole 2, dans un milieu réactionnel contenant respectivement un pool de plasma normal commercial calibré (Unicalibrator0) (Figures 7 et 8), un pool de plasma déficient en FXI
(Figures 9 et 10), ou un pool de plasma déficient en FIX (Figures 11 et 12).
La capacité discriminant du signal vis-à-vis d'un échantillon contenant FXIa dans un milieu réactionnel contenant un pool de plasma commercial n'est pas significativement différente de celle dans un pool de plasma déficient en FXI
(Figures 12, 13, 14 et 15).
Il ressort que les modifications observées entre les résultats obtenus dans les milieux réactionnels contenant de différentes origines de pool de plasma sont très faibles.
Exemple 4: Concentration finale des phospholipides Le pouvoir thrombogène du FXIa dans un pool de plasma commercial calibré
(Unicalibrator0, Stago) est déterminé, selon le protocole 2, dans un milieu réactionnel contenant 4 ,M (Figure 8) ou 8 ,M (Figure 13) des phospholipides et sans FT.
Il ressort que l'augmentation de la concentration en phospholipides de 4 1.M à
1.M en absence de facteur tissulaire n'a pas permis de stabiliser les réponses.
Exemple 5: Détermination du pouvoir thrombogène des immunoglobulines de type IgNG
Le protocole 2 décrit ci-dessus est mis en oeuvre pour déterminer le pouvoir thrombogène lié à la présence du FXIa (Figure 4) ou du FIXa (Figure 5) des immunoglobulines de type IgNG (LFB).
Le signal de l'apparition de la thrombine dans l'échantillon contenant seulement des immunglobulines de type IgNG est apparu quasiment en même temps que celui de l'apparition de la thrombine dans l'échantillon contenant le tampon de dilution. Il ressort que les immunoglobulines de type IgNG ne contient quasiment pas du FXIa ou FIXa.
Exemple 6: Origine du pool de plasma sanguin Le pouvoir thrombogène du FXIa ou du FIXa est déterminé, selon le protocole 2, dans un milieu réactionnel contenant respectivement un pool de plasma normal commercial calibré (Unicalibrator0) (Figures 7 et 8), un pool de plasma déficient en FXI
(Figures 9 et 10), ou un pool de plasma déficient en FIX (Figures 11 et 12).
La capacité discriminant du signal vis-à-vis d'un échantillon contenant FXIa dans un milieu réactionnel contenant un pool de plasma commercial n'est pas significativement différente de celle dans un pool de plasma déficient en FXI
(Figures 12, 13, 14 et 15).
Il ressort que les modifications observées entre les résultats obtenus dans les milieux réactionnels contenant de différentes origines de pool de plasma sont très faibles.
17 Exemple 7: Pouvoir thrombogène de différentes immunoglobulines Le pouvoir thrombogène respectif des immunoglobulines de type Tégéline0 (LFB), des immunoglobulines de type Clairyg0 (LFB), des immunoglobulines de type IvHEBEXO (LFB), et des immunoglobulines de type IgNG (LFB), lié à la présence du FXIa et/ou du FIXa, est déterminé, selon le protocole 2.
Les résultats sont illustrés par la figure 6.
Exemple 8 : Inhibition du potentiel FXIa de préparation d'Ig thrombogène Une gamme d'anticorps monoclonal anti-FXIa humain, de 20 à 400 lag/m1 a été
réalisée et testée en présence de préparation d'Ig thrombogène (IgT), en plasma normal (figure 14A) et déficient en FXI (figure 14B).
Il a été observé une inhibition du potentiel thrombogène de l'Ig testée pure en fonction des doses croissantes en anticorps anti-FXI. L'inhibition n'est pas totale à la concentration la plus élevée en anti FXIa de 400 ltg/ml.
Afin de limiter la consommation de l'anticorps, le même essai a été refait sur le même lot d'immunoglobuline diluée au 1/10 et au 1/30. Les mêmes doses d'anticorps ont été testées de 20 à 4001.1g/uni.
Dans ces conditions, on observe une inhibition totale du FXIa exogène (immunoglobuline) et du FXIa issu du zymogène FXI dans le cas du plasma normal : un phénomène de plateau est observé.
La figure 15 présente le paramètre de vélocité en fonction des doses d'anticorps anti FXIa, en plasma normal et en plasma déficient en FXIa.
En plasma normal, l'inhibition est maximale pour la dose de 100 lag/m1 d'anticorps aux 2 dilutions d'Ig testées. Dans ce cas, le thrombinogramme obtenu présente une vélocité inférieure à celle du tampon de dilution testé seul en plasma normal, le FXI activé issu du plasma étant également inhibé.
En plasma déficient en FXI et FXI a, l'inhibition est complète pour une dose plus faible de 50 1.1g/uni d'anticorps. Dans ce cas, on retrouve une vélocité
comparable à
celle du tampon de dilution seul en plasma déficient en FXI et FXIa. Ce résultat montre que le FXIa exogène est pour ce lot le seul responsable de l'augmentation du potentiel thrombique.
Ces résultats démontrent que :
Les résultats sont illustrés par la figure 6.
Exemple 8 : Inhibition du potentiel FXIa de préparation d'Ig thrombogène Une gamme d'anticorps monoclonal anti-FXIa humain, de 20 à 400 lag/m1 a été
réalisée et testée en présence de préparation d'Ig thrombogène (IgT), en plasma normal (figure 14A) et déficient en FXI (figure 14B).
Il a été observé une inhibition du potentiel thrombogène de l'Ig testée pure en fonction des doses croissantes en anticorps anti-FXI. L'inhibition n'est pas totale à la concentration la plus élevée en anti FXIa de 400 ltg/ml.
Afin de limiter la consommation de l'anticorps, le même essai a été refait sur le même lot d'immunoglobuline diluée au 1/10 et au 1/30. Les mêmes doses d'anticorps ont été testées de 20 à 4001.1g/uni.
Dans ces conditions, on observe une inhibition totale du FXIa exogène (immunoglobuline) et du FXIa issu du zymogène FXI dans le cas du plasma normal : un phénomène de plateau est observé.
La figure 15 présente le paramètre de vélocité en fonction des doses d'anticorps anti FXIa, en plasma normal et en plasma déficient en FXIa.
En plasma normal, l'inhibition est maximale pour la dose de 100 lag/m1 d'anticorps aux 2 dilutions d'Ig testées. Dans ce cas, le thrombinogramme obtenu présente une vélocité inférieure à celle du tampon de dilution testé seul en plasma normal, le FXI activé issu du plasma étant également inhibé.
En plasma déficient en FXI et FXI a, l'inhibition est complète pour une dose plus faible de 50 1.1g/uni d'anticorps. Dans ce cas, on retrouve une vélocité
comparable à
celle du tampon de dilution seul en plasma déficient en FXI et FXIa. Ce résultat montre que le FXIa exogène est pour ce lot le seul responsable de l'augmentation du potentiel thrombique.
Ces résultats démontrent que :
18 = Le pic de génération de thrombine observé pour la préparation d'Ig thrombogène testé est bien lié à la présence de FXIa.
= L'utilisation d'un test sensible au FXIa pour l'étude du potentiel thrombique de lots d'immunoglobulines est pertinente.
Exemple 9 : Recherche d'un éventuel effet inhibiteur sur la génération de thrombine : environnement protéique Les lots d'immunoglobulines étant fortement concentrés (50 g/1), il a été
vérifié
que cet environnement n'avait pas un impact (effet inhibiteur) sur la génération de thrombine. Un tel phénomène conduirait en effet à conclure à un résultat faussement négatif.
Une gamme de FXIa de 1 à 15 ng/ml a été réalisée (figure 16) ; les dilutions ont été faites en parallèle dans un lot d'IgNG 5% (courbes FXIa + IgNG) et dans le tampon de formulation d'IgNG 5% (courbes FXIa + Tp).
La figure 16 montre que les profils de génération de thrombine ne diffèrent pas significativement en présence ou en absence d'immunoglobuline. L'absence d'effet inhibiteur lié aux immunoglobulines est démontrée, même pour des concentrations très faibles de FXIa, de l'ordre du ng/ml.
Exemple 10 : Détermination du pouvoir thrombogène du facteur Vila La figure 17A et la figure 17B montrent que l'utilisation du kit de la présente invention contenant un plasma sanguin humain déficient en FXIa permet de donner une meilleure sensibilité à la présence éventuelle du facteur Vila dans un échantillon à tester par rapport à celle obtenue avec un plasma normal.
Exemple 11: Détermination du pouvoir thrombogène du facteur IXa La figure 18A et la figure 18B montrent que l'utilisation du kit de la présente invention contenant un plasma sanguin humain déficient en FXI permet de donner une meilleure sensibilité à la présence éventuelle du facteur IXa dans un échantillon à tester par rapport à celle obtenue avec un plasma normal.
= L'utilisation d'un test sensible au FXIa pour l'étude du potentiel thrombique de lots d'immunoglobulines est pertinente.
Exemple 9 : Recherche d'un éventuel effet inhibiteur sur la génération de thrombine : environnement protéique Les lots d'immunoglobulines étant fortement concentrés (50 g/1), il a été
vérifié
que cet environnement n'avait pas un impact (effet inhibiteur) sur la génération de thrombine. Un tel phénomène conduirait en effet à conclure à un résultat faussement négatif.
Une gamme de FXIa de 1 à 15 ng/ml a été réalisée (figure 16) ; les dilutions ont été faites en parallèle dans un lot d'IgNG 5% (courbes FXIa + IgNG) et dans le tampon de formulation d'IgNG 5% (courbes FXIa + Tp).
La figure 16 montre que les profils de génération de thrombine ne diffèrent pas significativement en présence ou en absence d'immunoglobuline. L'absence d'effet inhibiteur lié aux immunoglobulines est démontrée, même pour des concentrations très faibles de FXIa, de l'ordre du ng/ml.
Exemple 10 : Détermination du pouvoir thrombogène du facteur Vila La figure 17A et la figure 17B montrent que l'utilisation du kit de la présente invention contenant un plasma sanguin humain déficient en FXIa permet de donner une meilleure sensibilité à la présence éventuelle du facteur Vila dans un échantillon à tester par rapport à celle obtenue avec un plasma normal.
Exemple 11: Détermination du pouvoir thrombogène du facteur IXa La figure 18A et la figure 18B montrent que l'utilisation du kit de la présente invention contenant un plasma sanguin humain déficient en FXI permet de donner une meilleure sensibilité à la présence éventuelle du facteur IXa dans un échantillon à tester par rapport à celle obtenue avec un plasma normal.
Claims (17)
1. Utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes, - des phospholipides, - du CaCl2, et éventuellement - du facteur tissulaire humain, et éventuellement - un tampon de dilution, notamment du tampon Tris-NaCl pour déterminer le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester lorsqu'ils sont mélangés formant un milieu réactionnel.
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes, - des phospholipides, - du CaCl2, et éventuellement - du facteur tissulaire humain, et éventuellement - un tampon de dilution, notamment du tampon Tris-NaCl pour déterminer le pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester lorsqu'ils sont mélangés formant un milieu réactionnel.
2. Utilisation d'un kit comprenant les éléments suivants:
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI, - des phospholipides, - du CaCl2, et éventuellement - du facteur tissulaire humain, et éventuellement - un tampon de dilution, notamment du tampon Tris-NaCl pour déterminer le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leurs formes activés dans un échantillon à tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester formant un milieu réactionnel.
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI, - des phospholipides, - du CaCl2, et éventuellement - du facteur tissulaire humain, et éventuellement - un tampon de dilution, notamment du tampon Tris-NaCl pour déterminer le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leurs formes activés dans un échantillon à tester, notamment biologiquement acceptable, lesdits éléments du kit et l'échantillon à tester formant un milieu réactionnel.
3. Utilisation d'un kit selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le tampon de dilution dudit kit est identique à celui de l'échantillon à tester.
4. Utilisation d'un kit selon l'une des revendications 1 à 3, ledit kit comprenant en outre un substrat fluorogénique.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, d'un kit comprenant :
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et éventuellement déficient en FXI dont le volume représente de 80% à 40%, notamment de 75% à 50%, particulièrement 53% du volume du milieu réactionnel.
- des phospholipides humains, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 1 µM à 10 µM, particulièrement 4 µM, - du facteur tissulaire humain, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM, - du CaCl2.
- un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et éventuellement déficient en FXI dont le volume représente de 80% à 40%, notamment de 75% à 50%, particulièrement 53% du volume du milieu réactionnel.
- des phospholipides humains, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 1 µM à 10 µM, particulièrement 4 µM, - du facteur tissulaire humain, dont la concentration finale dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM, - du CaCl2.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon à tester est de 8:1 à 2:1, particulièrement 4:1.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle le facteur tissulaire humain du kit est d'origine plasmatique, d'origine recombinante, ou d'origine transgénique.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le plasma sanguin humain est un pool de plasmas sanguins humains frais ou congelé ou un plasma sanguin commercial calibré.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle le plasma sanguin humain est dépourvu de facteur tissulaire.
10. Procédé de mesure du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester notamment biologiquement acceptable, comprenant les étapes suivantes :
a) le mélange du tampon de dilution, notamment du tampon Tris NaCl, avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un témoin négatif intermédiaire, b) le mélange d'un échantillon à tester avec le plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un milieu réactionnel intermédiaire, c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant des phopholipides, du CaCl2, et éventuellement le facteur tissulaire humain, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif ;
d) l'obtention d'un premier thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel obtenu à l'étape c) et d'un second thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le témoin négatif obtenu à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenu de l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé
et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé et/ou du facteur X
activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans l'échantillon à tester.
a) le mélange du tampon de dilution, notamment du tampon Tris NaCl, avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un témoin négatif intermédiaire, b) le mélange d'un échantillon à tester avec le plasma sanguin humain pauvre en plaquettes pour former un milieu réactionnel intermédiaire, c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant des phopholipides, du CaCl2, et éventuellement le facteur tissulaire humain, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif ;
d) l'obtention d'un premier thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel obtenu à l'étape c) et d'un second thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine sur le témoin négatif obtenu à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenu de l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé
et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé et/ou du facteur X
activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans l'échantillon à tester.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le thrombinogramme standard est obtenu en effectuant un test de génération de thrombine sur un milieu réactionnel comprenant i) un calibrateur dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII
activé, et/ou du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé
et/ou du facteur X activé est connu, ii) un plasma sanguin humain, iii) un mélange réactionnel comprenant des phopholipides et éventuellement le facteur tissulaire humain.
activé, et/ou du facteur XI activé et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur XII activé
et/ou du facteur X activé est connu, ii) un plasma sanguin humain, iii) un mélange réactionnel comprenant des phopholipides et éventuellement le facteur tissulaire humain.
12. Procédé selon la revendication 10 ou 11, dans lequel la concentration finale du facteur tissulaire humain dans le milieu réactionnel est de 0,05 pM à 10 pM, particulièrement 0,3 pM.
13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, dans lequel la concentration finale des phospholipides humains dans le milieu réactionnel est de 1 µM à 10 µM, particulièrement 4 µM.
14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, dans lequel le volume du plasma sanguin représente de 80% à 40%, notamment de 75% à 50%, particulièrement 53%
du volume du milieu réactionnel.
du volume du milieu réactionnel.
15. Procédé selon l'une des revendications 10 à 14, dans lequel le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon est de 8:1 à 2:1, particulièrement 4:1.
16. Procédé selon l'une des revendications 10 à 15, dans lequel le thrombinogramme est obtenu par la méthode de la thromboélastographie ou la méthode de thrombinographie.
17. Procédé de mesure du pouvoir thrombogène d'immunoglobulines humaines contenues dans un échantillon à tester notamment biologiquement acceptable, comprenant les étapes suivantes :
a) le mélange du tampon de dilution d'un échantillon à tester avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI pour former un témoin négatif intermédiaire;
b) le mélange d'un échantillon avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI représentant 53% du volume du milieu réactionnel, dans lequel le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon est de 8:1 à 2:1, particulièrement 4:1 pour former un milieu réactionnel intermédiaire ;
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant 4 µM
des phopholipides, et 3pM de facteur tissulaire humain et du CaCl2, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif;
d) l'obtention de deux thrombinogrammes par la mise en oeuvre de thrombinographie, en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel et sur le témoin négatif obtenus à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenu à l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé
et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur X activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leur forme activée dans l'échantillon.
a) le mélange du tampon de dilution d'un échantillon à tester avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI pour former un témoin négatif intermédiaire;
b) le mélange d'un échantillon avec un plasma sanguin humain pauvre en plaquettes et déficient en facteur XI représentant 53% du volume du milieu réactionnel, dans lequel le ratio entre le volume du plasma sanguin et celui de l'échantillon est de 8:1 à 2:1, particulièrement 4:1 pour former un milieu réactionnel intermédiaire ;
c) l'ajout dans le milieu réactionnel intermédiaire obtenu à l'étape précédente et dans le témoin négatif intermédiaire obtenu à l'étape a) d'un mélange comprenant 4 µM
des phopholipides, et 3pM de facteur tissulaire humain et du CaCl2, pour former un milieu réactionnel et un témoin négatif;
d) l'obtention de deux thrombinogrammes par la mise en oeuvre de thrombinographie, en effectuant un test de génération de thrombine sur le milieu réactionnel et sur le témoin négatif obtenus à l'étape c) ;
e) la comparaison d'au moins l'un des paramètres de chacun des thrombinogrammes obtenu à l'étape d) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'une série de calibrateurs dont le pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII activé et/ou du facteur XI activé
et/ou du facteur IX activé et/ou du facteur X activé est connu et varie entre chaque calibrateur ;
f) la déduction de l'étape e) du pouvoir thrombogène lié à la présence du facteur VII, du facteur XI, du facteur IX, du facteur X et/ou de leur forme activée dans l'échantillon.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request |
Effective date: 20160714 |
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| MKLA | Lapsed |
Effective date: 20210831 |
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| MKLA | Lapsed |
Effective date: 20191118 |