CA2822536A1 - Nouvelles souches de levure de panification - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet de nouvelles souches de levure de panification large spectre, c'est-à-dire des souches de levure performantes à la fois sur des pâtes dites sans sucre et des pâtes dites sucrées. La présente invention a également pour objet des levures obtenues par culture desdites souches de levure et leur utilisation en panification. Un autre objet de l'invention concerne un procédé d'obtention de souches de levure large spectre.

Description

NOUVELLES SOUCHES DE LEVURE DE PANIFICATION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne de nouvelles souches de levure de panification large spectre, c'est-à-dire des souches de levure performantes à la fois sur des pâtes dites sans sucre et des pâtes dites sucrées.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE
Le document EP0511108 décrit des souches de levure large spectre obtenues par un programme de croisement de souches, couplé à des étapes de sélection. Les haploïdes et les souches hybrides issues de leur croisement sont sélectionnés sur la base d'une activité
maltoperméase et une activité maltase élevées en présence de glucose (et en l'absence de maltose), et sur la base d'une activité invertase basse.
Le document JP9-149785 décrit des souches de levure de panification large spectre obtenues par hybridation dont l'une des souches parentes haploïdes est déficiente en invertase. Les souches obtenues sont ensuite sélectionnées sur la base d'une activité
invertase de 10 à 50 unités et d'une activité maltase d'au moins 40 unités permettant l'obtention desdites souches de levure large spectre. Selon ce document, une unité d'activité invertase correspond à la formation en une minute d'un milligramme de sucres réducteurs par gramme de levure à 67%
d'humidité.
Par ailleurs, le document EP0511108 indique qu'il est possible d'abaisser l'activité invertase au moyen de la génétique moléculaire en disruptant un ou plusieurs gènes SUC, de préférence sur des haploïdes qui possèdent au maximum un ou deux gènes SUC.
Les différentes étapes de sélection, effectuées sur la base de plusieurs critères et portant à la fois sur les souches parentes, les haploïdes et les hybrides, permettent d'améliorer les chances d'obtenir une souche de levure large spectre. Toutefois, le procédé
d'obtention de souches de levure large spectre tel que décrit dans le document EP0511108 est relativement long et lourd à mettre en oeuvre.
Le document EP0994192 décrit une nouvelle cassette d'excision pour une utilisation chez la levure. Cette cassette d'excision permet de ne laisser aucun ADN exogène dans la levure.

2 A titre d'exemple, le document EP0994192 décrit la disruption de trois copies du gène SUC
en utilisant successivement trois cassettes d'excision comprenant chacune :
deux séquences recombinogéniques encadrant deux séquences répétées directes (séquence mosaïque), elles-mêmes encadrant un marqueur de sélection négatif (gène suicide RTA) et un marqueur de sélection positif (kanamycine). La séquence mosaïque est une séquence d'ADN
non hétérologue de Saccharomyces cerevisiae comportant 97 paires de base.
Le procédé d'excision décrit dans le document EP0994192 est utile pour disrupter un nombre limité de gènes. Toutefois, il n'est pas adapté à la disruption d'un nombre plus important de gènes : le procédé d'excision implique en effet de construire autant de cassettes d'excision et comprend autant d'étapes de disruption que le nombre de gènes à exciser. Le procédé décrit dans le document EP0994192 devient alors beaucoup trop long et lourd à mette en oeuvre. De plus, le procédé décrit dans le document EP0994192 ne permet pas la disruption de plus de 4 copies du gène SUC, étant données la longueur de la séquence recombinogénique utilisée et la taille du gène SUC.
Il est utile pour un industriel de disposer de souches de levure large spectre. En effet, il est alors possible de produire sur une même installation et à partir d'une unique souche de levure, des levures destinées à une application sur pâte sans sucre et des levures destinées à une application sur pâte sucrée. L'utilisation d'une souche de levure large spectre procure ainsi un gain de temps et de place au sein de l'usine, et donc une meilleure productivité.
La présente invention a pour objet de fournir un nouveau procédé rapide, efficace et simple à
mettre en oeuvre pour obtenir de nouvelles souches de levure de panification large spectre.
RESUME DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention est de fournir une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre, caractérisée en ce que :
- n copies d'un gène SUC sont inactivées, n étant un nombre entier tel que l'activité
invertase de ladite souche est inférieure ou égale à 20 unités, et - l'activité maltase de ladite souche avant l'inactivation des n copies du gène SUC est inférieure à 80 unités.
Un deuxième objet de l'invention concerne un procédé d'obtention d'une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre, comprenant les étapes de :
- sélection d'une souche de Saccharomyces cerevisiae présentant :
o une activité maltase inférieure à 80 unités, et

3 o une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans sucre, - inactivation de m copies d'un gène SUC de ladite souche sélectionnée, m étant un nombre entier tel que l'activité invertase de la souche sélectionnée et inactivée est inférieure ou égale à 20 unités.
Un troisième objet de l'invention concerne une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre susceptible d'être obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus.
Un quatrième objet de l'invention est une souche de levure dérivée d'une souche telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que ladite souche de levure dérivée est une souche large spectre présentant une activité invertase inférieure ou égale à 20 unités.
Un cinquième objet de l'invention est une levure obtenue par culture d'une souche de levure telle que définie ci-dessus ou d'une souche dérivée telle que définie ci-dessus.
Un sixième objet de l'invention concerne l'utilisation d'une levure telle que définie ci-dessus, pour la fabrication de produits de panification.
Un septième objet de l'invention concerne l'utilisation d'une diminution de l'activité
invertase pour obtenir une souche de levure large spectre à partir d'une souche de levure présentant une faible activité maltase et une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans sucre.
TEXTE LIBRE DU LISTAGE DE SEQUENCES
La séquence SEQ ID NO: 2 est une séquence artificielle comprenant la séquence loxP et des régions flanquantes ( loxP and flanking regions ).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention a donc pour objet de fournir un nouveau procédé rapide, efficace et simple à mettre en oeuvre pour obtenir de nouvelles souches de levure de panification large spectre.
De manière surprenante et inattendue, les Inventeurs ont mis en évidence qu'il est possible d'obtenir des souches de levure large spectre à partir de souches de levure présentant une activité maltase basse.
Une souche de levure large spectre est une souche de levure performante à la fois dans des pâtes sans sucre et des pâtes sucrées.
Une pâte sans sucre désigne ici une pâte dans laquelle il n'a pas été ajouté
de sucre.
Dans une pâte sans sucre, les sucres présents proviennent de la farine.

4 Une pâte sucrée désigne ici une pâte ayant une teneur en saccharose ajouté
supérieure ou égale à 14% en masse par rapport à la masse de la farine, de préférence supérieure ou égale à
20%.
Une pâte sucrée est par exemple une pâte ayant une teneur en sucre ajouté
égale à 25% ou 26% en masse par rapport à la masse de la farine.
La performance d'une souche de levure peut être évaluée en mesurant sa force fermentative.
La force fermentative d'une souche de levure correspond au volume de CO2 (en ml) produit par la levure en fermentation dans des pâtons de farine.
Dans le cadre de la présente invention, la force fermentative d'une souche est mesurée après culture de ladite souche sur plaque de mélasse.
La culture d'une souche de levure sur plaque de mélasse est décrite dans l'exemple 1.
La force fermentative est mesurée selon des techniques classiques connues de l'homme du métier, adaptées du protocole décrit par Burrows et Harrison dans Journal of the Institute of Brewing , Vol 65, 1959.
La force fermentative est notamment mesurée au moyen d'un fermentomètre ou d'un Risograph (par exemple National Manufacturing, Lincoln, Nebraska).
La force fermentative est mesurée ici sur des pâtons constitués de farine et d'une suspension de levures obtenues par culture de la souche sur plaque de mélasse, sur une durée de 2 heures (cf exemple 1).
La suspension de levures est constituée de 150 mg de matières sèches de levure pour une mesure de la force fermentative en pâte sans sucre ou de 300 mg de matière sèches de levure pour une mesure de la force fermentative en pâte sucrée, dans 15 ml d'une solution aqueuse à
27g/1 de NaC1 et 4 g/1 de SO4(NH4)2.
Pour constituer les pâtons, le mélange de farine et de suspension de levures est malaxé
pendant 40 secondes dans un pétrin, de manière à obtenir une pâte. La pâte est ensuite placée dans un récipient mis au bain-marie à 30 C. 13 minutes après le début du malaxage, le récipient contenant la pâte est fermé hermétiquement et le volume de gaz est mesuré à 2 heures.
En l'absence d'indication contraire, la force fermentative correspond au volume total de gaz produit en ml, sur une durée de 2 heures, à 30 C.
Dans le cadre de la présente invention, la force fermentative d'une souche de levure dans une pâte sans sucre est mesurée dans une pâte contenant 20 g de farine.

Dans le cadre de la présente invention, la force fermentative d'une souche de levure dans une pâte sucrée est mesurée dans une pâte contenant 6,5 g de saccharose et 25 g de farine.
Une souche de levure large spectre au sens de l'invention est une souche de levure qui a :

5 - une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans sucre, et - une force fermentative supérieure ou égale à 90 ml dans une pâte sucrée.
Une souche de levure large spectre préférée est une souche de levure qui a:
- une force fermentative supérieure ou égale à 120 ml, de préférence supérieure ou égale à 130 ml dans une pâte sans sucre, et - une force fermentative supérieure ou égale à 95 ml, de préférence supérieure ou égale à 100 ml dans une pâte sucrée.
De manière surprenante et inattendue, les Inventeurs ont ainsi mis en évidence qu'il est possible de conférer un caractère large spectre à une souche de levure uniquement en diminuant son activité invertase et malgré le fait que ladite souche de levure présente une activité maltase basse.
La présente invention a ainsi pour objet des souches de levure large spectre, caractérisée en ce qu'elles présentent une activité invertase basse et en ce qu'elles sont obtenues à partir d'une souche de levure présentant une activité maltase basse.
La présente invention concerne uniquement des souches de Saccharomyces cerevisiae.
Par la suite, on utilise donc indifféremment les termes souche de levure ou souche de Saccharomyces cerevisiae .
L'activité invertase est conférée par au moins une enzyme invertase.
L'invertase convertit une molécule de saccharose en une molécule de glucose et une molécule de fructose.
Une activité invertase basse désigne ici une activité invertase inférieure ou égale à 20 unités, l'activité invertase étant mesurée après culture de la souche de levure sur plaque de mélasse (cf exemple 1).
Une unité invertase correspond à 1 umole de sucre réducteur libérée en 5 minutes par mg de matière sèche de levure, à 30 C et à pH 4,7, sans plasmolyse de la levure.
L'activité invertase peut être mesurée par des tests bien connus de l'homme du métier.
Par exemple, l'activité invertase est mesurée de la manière suivante : une quantité connue, de l'ordre de quelques dizièmes de milligrammes, de matières sèches levure et du saccharose à

6 une concentration 0,1 molaire sont mis en présence en milieu tamponné (tampon acétate à 50 mM et à pH 4,7), le tout placé dans un bain-marie à 30 C. Après 5 minutes d'incubation, la réaction d'inversion du saccharose est bloquée par ajout du réactif à l'acide dinitrosalicylique qui sert à doser, avec un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 540 nm, les sucres réducteurs formés par réaction colorimétrique.
Dans un mode de réalisation préféré, une souche de levure large spectre selon l'invention possède une activité invertase inférieure ou égale à 17 unités, de préférence inférieure ou égale à 15 unités.
L'activité maltase est mesurée ici en condition de répression, c'est-à-dire après culture en présence de glucose et en l'absence de maltose.
Une activité maltase basse désigne ici une activité inférieure à 80 unités, l'activité maltase étant mesurée après culture de la souche de levure sur plaque de mélasse, puis mise en incubation dans un milieu contenant du glucose, en l'absence de maltose (cf exemple 1).
Une unité maltase correspond à 1 nanomole de p-nitrophénol libéré par minute et par mg de protéines.
L'activité maltase peut être mesurée par des tests bien connus de l'homme du métier.
Par exemple, l'activité maltase est mesurée par dosage de la libération d'un produit coloré, le p-nitrophénol, suite à l'action de la maltase sur un substrat chromogénique, le 4-nitrophényl-a-D-glucopyranoside, comme décrit dans Houghton-Larsen et Anders Brandt, Appl.
Environ.
Microbiol., 2006, p 7176-7182.
L'activité maltase est mesurée ici après culture de la souche de levure sur plaque de mélasse et mise en incubation, notamment pendant 4 heures, dans un milieu contenant du glucose (cf protocole décrit dans l'exemple 1).
Une caractéristique essentielle de l'invention réside en ce que la souche de levure large spectre présente une activité invertase basse.
La famille de gènes SUC de Saccharomyces comprend 6 gènes codant pour l'invertase (SUC1 à SUCS et SUC7) qui sont localisés sur différents chromosomes.
Par le terme gène SUC , on désigne ici indifféremment les gènes SUC1, SUC2, SUC3, SUC 4, SUCS ou SUC7.
Dans un mode de réalisation préféré, l'activité invertase basse est obtenue en inactivant au moins une copie d'un gène SUC.

7 Une souche de Saccharomyces cerevisiae peut avoir dans son génome zéro, une ou plusieurs copies de chacun des gènes SUC, SUC2, SUC3, SUC 4, SUCS ou SUC7.
La présente invention a ainsi pour objet une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre, caractérisée en ce que :
- n copies d'un gène SUC sont inactivées, n étant un nombre entier tel que l'activité
invertase de ladite souche est inférieure ou égale à 20 unités, - l'activité maltase de ladite souche avant inactivation des n copies du gène SUC est basse.
La présente invention a particulièrement pour objet une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre, caractérisée en ce que :
- n copies d'un gène SUC sont inactivées, n étant un nombre entier tel que l'activité
invertase de ladite souche est inférieure ou égale à 20 unités, et - l'activité maltase de ladite souche avant l'inactivation des n copies du gène SUC est inférieure à 80 unités.
Une copie d'un gène SUC est inactivée lorsqu'elle n'est pas du tout traduite en invertase ou lorsqu'elle n'est pas traduite en une invertase fonctionnelle.
Une invertase fonctionnelle est une invertase qui est capable de convertir le saccharose en glucose et fructose.
L'expression n copies d'un gène SUC inactivées signifie que la somme du nombre de copies inactivées du gène SUC1, du gène SUC2, du gène SUC3, du gène SUC4, du gène SUCS et du gène SUC7 est égale à n.
Le nombre n de copies d'un gène SUC inactivées est nécessairement inférieur ou égal au nombre de copies du gène SUC présent dans la souche.
Par nombre de copies du gène SUC présent dans la souche, on entend la somme du nombre de copies du gène SUC1, du gène SUC2, du gène SUC3, du gène SUC4, du gène SUCS et du gène SUC7.
Le nombre n de copies du gène SUC inactivées doit donc être suffisant pour obtenir une activité invertase inférieure ou égale à 20 unités.
La présente invention a particulièrement pour objet une souche telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que n est supérieur ou égal à 2, de préférence supérieur ou égal à 4, plus préférentiellement supérieur ou égal à 8.

8 Des souches préférées selon l'invention présentent au moins 10 copies du gène SUC
inactivées ou encore au moins 12 copies du gène SUC inactivées.
Lorsqu'une souche de levure présente une activité invertase nulle ou quasi nulle, son utilisation peut entraîner des problèmes de coloration du pain au cours de la cuisson.
Aussi, la présente invention a de préférence pour objet une souche de levure large spectre telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que l'activité invertase de ladite souche est supérieure ou égale à 2 unités.
Les n copies du gène SUC peuvent être inactivées par tout moyen.
Chacune des n copies inactivées du gène SUC peut être inactivée par un ou plusieurs moyens différents.
Les n copies du gène SUC peuvent par exemple être inactivées par l'inactivation de la transcription d'au moins une copie d'un gène SUC, la délétion d'au moins une copie d'un gène SUC, l'insertion d'au moins une séquence dans au moins une copie d'un gène SUC, la disruption d'au moins une copie d'un gène SUC et/ou une mutation dans au moins une copie d'un gène SUC.
L'inactivation de la transcription d'une copie d'un gène SUC est par exemple obtenue en supprimant la séquence promotrice dudit gène SUC.
La délétion d'une copie d'un gène SUC signifie la délétion totale ou partielle de la partie codante d'une copie du gène SUC, éventuellement accompagnée de la délétion totale ou partielle de la séquence promotrice et/ou de la séquence terminatrice.
L'expression partie codante d'un gène est synonyme de phase ouverte de lecture ou ORF (Opening Reading Frame).
La phase ouverte de lecture commence par un codon d'initiation et se termine par un codon stop.
L'insertion d'au moins une séquence dans une copie d'un gène SUC signifie qu'au moins une séquence d'ADN est insérée dans la partie codante de la copie du gène SUC.
La séquence d'ADN insérée comprend au moins 1 paire de base.
Dans un mode de réalisation préféré, l'insertion d'au moins une séquence d'ADN
dans une copie d'un gène SUC introduit un décalage du cadre de lecture. Le décalage du cadre de lecture empêche ainsi une traduction correcte de la copie du gène SUC.
Plusieurs séquences d'ADN peuvent être insérées dans la partie codante d'une copie du gène SUC.

9 La disruption d'une copie d'un gène SUC signifie la délétion partielle ou totale de la partie codante du gène SUC, accompagnée d'une insertion d'au moins une séquence d'ADN
dans la partie codante d'une copie du gène SUC.
Lors de la disruption d'une copie d'un gène SUC, la séquence d'ADN insérée comprend au moins 1 paire de base, de préférence au moins 30 paires de base.
La disruption d'une copie d'un gène SUC conduit par exemple à l'insertion d'une séquence d'ADN de 103 paires de base.
De préférence, la copie du gène SUC inactivée par disruption présente une délétion d'au moins 1% de la phase ouverte de lecture du gène SUC, de préférence au moins

10%, plus préférentiellement au moins 20%, plus préférentiellement encore au moins 50%.
La copie du gène SUC inactivée par disruption peut également présenter une délétion d'au moins 60% de la phase ouverte de lecture du gène SUC ou au moins 70% de la phase ouverte de lecture du gène SUC.
Une souche de levure large spectre selon l'invention peut comprendre des copies du gène SUC inactivées par disruption présentant des pourcentages de délétion de la phase ouverte de lecture du gène SUC différents.
La mutation dans une copie d'un gène SUC est de préférence une mutation qui introduit un codon stop dans la région codante ou une mutation qui modifie au moins un acide aminé du site actif de l'invertase.
Dans un mode de réalisation avantageux, lorsque l'inactivation du gène SUC est obtenue par disruption ou insertion, cette inactivation ne conduit pas à l'expression d'un peptide, d'un polypeptide ou d'une protéine chimère.
Par peptide, polypeptide ou protéine chimère , on entend un peptide, polypeptide ou protéine qui n'existe pas dans la souche de Saccharomyces cerevisiae sauvage et qui est obtenu par transcription puis traduction d'une partie de séquence provenant de la souche et d'une partie ou de la totalité de la séquence d'ADN insérée.
La présente invention a particulièrement pour objet une souche telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'au moins une copie d'un gène SUC est inactivée par disruption.
Une souche préférée selon l'invention est caractérisée en ce qu'au moins 8 copies du gène SUC sont inactivées par disruption, de préférence au moins 10 copies.
Des souches préférées selon l'invention présentent 10, 11 ou 12 copies du gène SUC
inactivées par disruption.

Les souches larges spectre selon l'invention sont généralement obtenues par inactivation d'un nombre élevé de copies du gène SUC.
Comme indiqué par la suite, les Inventeurs ont mis au point un procédé
original permettant d'effectuer rapidement, efficacement et facilement une disruption multicopies du gène SUC.
5 Lorsqu'une souche large spectre est obtenue par le procédé selon l'invention en utilisant la technique cre-lox, il reste au moins une séquence d'ADN exogène dans la souche.
La présente invention a ainsi pour objet une souche telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence d'ADN exogène.
10 Une séquence d'ADN exogène correspond à une séquence d'ADN qui n'est pas présente dans le génome d'une souche de Saccharomyces non génétiquement modifiée.
La séquence d'ADN exogène provient de préférence de l'inactivation d'une copie du gène SUC par disruption ou insertion.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la séquence d'ADN
exogène ne comprend pas de gène de résistance à un antibiotique.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, la séquence d'ADN
exogène n'est pas une séquence codante.
De plus, la séquence d'ADN exogène n'est de préférence pas traduite, en totalité ou partie, en un peptide, polypeptide ou une protéine chimère.
Dans un mode de réalisation préféré, la séquence d'ADN exogène comprend une séquence lox.
Une séquence lox préférée selon l'invention est la séquence loxP de 34 paires de base suivante :
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT (SEQ ID N0:1).
Une séquence d'ADN exogène préférée est la séquence de 103 paires de base suivante :
TGAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAAC TTC GTATAATGTA
TGCTATACGAAGTTATTAGGTGATATCAGATCCACTAGTGGCCTATGCG
(SEQ ID NO: 2).
La séquence SEQ ID NO: 2 comprend la séquence loxP de séquence SEQ ID NO:1 (représentée en caractères gras) et des régions flanquantes.

11 Une souche de levure large spectre selon l'invention comprend de préférence le même nombre de séquences exogènes que le nombre de copies du gène SUC inactivées par disruption.
Une souche de levure large spectre selon l'invention comprend en particulier le même nombre de séquences exogènes SEQ ID NO: 2 que le nombre de copies du gène SUC
inactivées par disruption.
La présente invention a plus particulièrement pour objet une souche telle que définie ci-dessus, choisie parmi la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro 1-4339, la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro 1-4340 et la souche déposée auprès de la CNCM
sous le numéro 1-4338.
Les souches 1-4339, 1-4340 et 1-4338 ont été déposées en vertu du traité de Budapest le 8 juillet 2010 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, France.
La souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le numéro 1-4339 est caractérisée en ce que :
- 10 copies d'un gène SUC sont inactivées par disruption, son activité
invertase étant inférieure ou égale à 15 unités, et - l'activité maltase de ladite souche avant l'inactivation des n copies du gène SUC est inférieure à 70 unités.
La souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le numéro 1-4339 comprend 10 séquences SEQ ID NO: 2, au niveau des dix copies du gène SUC
inactivées par disruption.
La souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le numéro 1-4340 est caractérisée en ce que :
- 11 copies d'un gène SUC sont inactivées par disruption, son activité
invertase étant inférieure ou égale à 15 unités, et - l'activité maltase de ladite souche avant l'inactivation des n copies du gène SUC est inférieure à 70 unités.
La souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le numéro 1-4340 comprend 11 séquences SEQ ID NO: 2, au niveau des onze copies du gène SUC
inactivées par disruption.

12 La souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le numéro 1-4338 est caractérisée en ce que :
- 12 copies d'un gène SUC sont inactivées par disruption, son activité
invertase étant inférieure ou égale à 15 unités, et - l'activité maltase de ladite souche avant l'inactivation des n copies du gène SUC est inférieure à 70 unités.
La souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposée à la CNCM sous le numéro 1-4338 comprend 12 séquences SEQ ID NO: 2, au niveau des douze copies du gène SUC
inactivées par disruption.
Les souches de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposées à la CNCM sous les numéros 1-4339, 1-4340 et 1-4338 ne comportent pas de séquence exogène autre que les séquences SEQ ID NO: 2.
En particulier, les souches de Saccharomyces cerevisiae large spectre déposées à la CNCM
sous les numéros 1-4339, 1-4340 et 1-4338 ne comportent pas de gène de résistance à un antibiotique.
Les souches de levure large spectre selon l'invention, et en particulier les souches déposées à
la CNCM sous les numéros 1-4339, 1-4340 et 1-4338 ont été obtenues par un procédé original qui est à la fois rapide, efficace et simple à mettre en oeuvre.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé d'obtention d'une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre, comprenant les étapes de :
- sélection d'une souche de Saccharomyces cerevisiae présentant :
o une activité maltase inférieure à 80 unités, et o une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans sucre, - inactivation de m copies d'un gène SUC de ladite souche sélectionnée, m étant un nombre entier tel que l'activité invertase de la souche sélectionnée et inactivée est inférieure ou égale à 20 unités.
L'activité maltase, l'activité invertase et la force fermentative sont telles que définies ci-dessus.
L'étape de sélection comprend de préférence la sélection d'une souche de Saccharomyces cerevisiae présentant une force fermentative supérieure ou égale à 120 ml dans une pâte sans sucre, plus préférentiellement supérieure ou égale à 130 ml dans une pâte sans sucre.

13 L'expression m copies d'un gène SUC inactivées signifie que la somme du nombre de copies inactivées du gène SUC1, du gène SUC2, du gène SUC3, du gène SUC4, du gène SUCS et du gène SUC7 est égale à m.
Le nombre m de copies d'un gène SUC inactivées est nécessairement inférieur ou égal au nombre de copies du gène SUC présent dans la souche.
Par nombre de copies du gène SUC présent dans la souche, on entend la somme du nombre de copies du gène SUC, du gène SUC2, du gène SUC3, du gène SUC4, du gène SUCS et du gène SUC7.
Le nombre m de copies du gène SUC inactivées doit donc être suffisant pour obtenir une activité invertase inférieure ou égale à 20 unités.
Le procédé selon l'invention permet ainsi d'obtenir des souches de levure large spectre telles que définies ci-dessus, c'est-à-dire des souches de levure qui ont :
- une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans sucre, et - une force fermentative supérieure ou égale à 90 ml dans une pâte sucrée.
La présente invention a particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que l'étape d'inactivation de m copies d'un gène SUC
comprend l'inactivation de la transcription d'au moins une copie d'un gène SUC, la délétion d'au moins une copie d'un gène SUC, l'insertion d'au moins une séquence dans au moins une copie d'un gène SUC, la disruption d'au moins une copie d'un gène SUC et/ou une mutation dans au moins une copie d'un gène SUC.
Les différents moyens d'inactivation d'une copie du gène SUC sont tels que définis ci-dessus.
Les souches de levure large spectre selon l'invention sont de préférence des souches de levure industrielles.
Les souches de levure industrielles sont généralement polyploïdes, voire aneuploïdes.
S'agissant du gène SUC, une souche industrielle peut comprendre par exemple au moins 12 copies du gène SUC.
L'inactivation d'un nombre relativement élevé de copies du gène SUC peut donc être nécessaire pour obtenir une activité invertase inférieure à 20 unités.
La présente invention a particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que m est supérieur ou égal à 2, de préférence supérieur ou égal à 4, plus préférentiellement supérieur ou égal à 8.

14 La présente invention a par exemple pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé
en ce que m est supérieur ou égal à 10. Par exemple, m est égal à 10, 11 ou 12.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, au moins 4 copies du gène SUC sont inactivées par disruption, de préférence au moins 8 copies du gène SUC, plus préférentiellement au moins 10 copies du gène SUC. Par exemple, 10, 11 ou 12 copies du gène SUC sont inactivées par disruption.
L'invention a pour objet de fournir un procédé rapide, efficace et simple de mise en oeuvre pour obtenir des souches de levure large spectre, quel que soit le nombre de copies du gène SUC à inactiver par disruption.
Cependant, il est connu qu'une variabilité génétique existe entre les différents membres de la famille de gènes SUC, au niveau des séquences adjacentes de la partie codante du gène (Carlson et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2894-2902).
Aussi, si on souhaite utiliser les séquences en amont et en aval des gènes SUC
pour inactiver plusieurs copies du gène SUC, il est nécessaire de construire des cassettes de disruption spécifiques pour chacun des 6 membres de la famille de gènes SUC et utiliser au moins 6 jeux de séquences de recombinaison homologue.
Afin d'éviter un procédé nécessitant de construire de nombreuses cassettes de disruption, les Inventeurs ont alors décidé de choisir les séquences d'ADN homologues dans la partie codante du gène SUC.
Toutefois, les Inventeurs ont mis en évidence, de manière inattendue, une variabilité
génétique dans la séquence codante des membres de la famille de gènes SUC
entre différentes souches de Saccharomyces cerevisiae.
Par exemple, la séquence SEQ ID NO: 3 correspondant à la partie codante du gène SUC de référence YIL162W possède 92% d'identité avec la séquence de la partie codante d'un gène SUC de la souche déposée le 24 février 2005 à la CNCM sous le numéro 1-3399.
Or, de manière surprenante et inattendue, le procédé selon l'invention permet d'utiliser un même jeu de séquences de recombinaison homologue pour inactiver par disruption différentes copies du gène SUC, indépendamment de la souche de saccharomyces cerevisiae utilisée.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que l'étape d'inactivation comprend :
- une étape a) de transformation de ladite souche sélectionnée avec une cassette de disruption comprenant un marqueur de sélection, - une étape b) de sélection des souches transformées ayant intégré la cassette de disruption, - une éventuelle étape c) d'élimination du marqueur de sélection.
La cassette de disruption comprend un marqueur de sélection, ainsi que des séquences 5 promotrices et terminatrices permettant son expression.
L'homme du métier sait quels marqueurs de sélection sont appropriés pour une utilisation chez la levure.
Le marqueur de sélection est de préférence un gène de résistance à un antibiotique.
Le marqueur de sélection est par exemple choisi parmi le gène de résistance à
la kanamycine, 10 blasticidine, phléomycine, hygromycine et nourséothricine.
La cassette de disruption comprend deux séquences de recombinaison homologues qui encadrent le marqueur de sélection.
Une séquence de recombinaison homologue est ici une séquence homologue d'une séquence de la partie codante de la copie du gène SUC ou d'une séquence adjacente à la partie codante

15 du gène SUC.
De préférence, la séquence de recombinaison homologue est homologue d'une séquence de la partie codante de la copie du gène SUC.
Une séquence de recombinaison homologue comprend par exemple entre 40 et 60 paires de base, de préférence entre 45 et 55 paires de base.
Une séquence de recombinaison homologue est par exemple choisie parmi :
- la séquence située de la base 1 à 51 de la séquence SEQ ID NO: 3, - la séquence située de la base 1549 à 1599 de la séquence SEQ ID NO: 3, - la séquence située de la base 54 à 104 de la séquence SEQ ID NO: 3, - la séquence située de la base 1497 à 1547 de la séquence SEQ ID NO: 3, - la séquence située de la base 110 à 159 de la séquence SEQ ID NO: 3, et - la séquence située de la base 1442 à 1491 de la séquence SEQ ID NO: 3.
L'étape b) de sélection des souches transformées ayant intégré la cassette de disruption est effectuée en sélectionnant les souches sur la base du marqueur de sélection.
Lorsque le marqueur de sélection est un gène de résistance à un antibiotique, l'étape b) est effectuée en sélectionnant les souches capables de se multiplier sur un milieu contenant l'antibiotique. Seules les souches transformées ayant intégré la cassette de disruption contenant le gène de résistance à cet antibiotique sont capables de se multiplier sur le milieu contenant l'antibiotique.

16 Le procédé selon l'invention comprend de préférence une étape c) d'élimination du marqueur de sélection.
L'étape c) d'élimination du marqueur de sélection peut se produire par excision spontanée chez la levure.
Afin de favoriser l'excision spontanée, le marqueur de sélection est de préférence placé entre deux séquences répétées directes (SRD).
L'étape c) d'élimination du marqueur de sélection est de préférence effectuée de manière dirigée par des techniques bien connues de l'homme du métier.
Par exemple, l'étape d'élimination est effectuée avec la technique cre-lox.
Dans ce cas, la cassette de disruption comprend deux séquences lox encadrant le marqueur de sélection. Le marqueur de sélection est alors éliminé en utilisant la recombinase Cre.
La présente invention a ainsi particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la cassette de disruption comprend un marqueur de sélection encadré par deux séquences lox, lesdites séquences lox étant encadrées par deux séquences de recombinaison homologue.
La séquence lox est par exemple la séquence loxP de séquence SEQ ID NO: 1.
Lorsque plus d'une copie du gène SUC doivent être inactivées par disruption, il est avantageux d'utiliser des cassettes de disruption différentes, afin de diminuer la durée de l'étape d'inactivation.
Les cassettes de disruption peuvent différer entre elles par la nature du marqueur de sélection et/ou la ou les séquences de recombinaison homologue.
Par exemple, l'utilisation de cassettes de disruption avec une ou deux séquences de recombinaison homologue différentes entre elles permet d'éviter que la disruption se reproduise au niveau d'une copie déjà inactivée par disruption.
Par ailleurs, l'utilisation de cassettes de disruption avec des marqueurs de sélection différents permet d'effectuer les étapes de transformation et de sélection de manière séquentielle avec les différentes cassettes, puis d'éliminer les différents marqueurs en une seule étape.
Ainsi, le procédé selon l'invention permet de diminuer la durée de l'étape d'inactivation.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une fois la série d'étapes suivante :

17 - au moins deux répétitions de l'étape a) de transformation suivie de l'étape b) de sélection, et - une étape c) d'élimination des marqueurs de sélection.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, la présente invention a pour objet un procédé
tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que chaque étape a) de transformation est effectuée avec une cassette de disruption comprenant un marqueur de sélection différent et bu au moins une séquence de recombinaison homologue différente.
La présente invention a particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend trois fois ladite série d'étapes et en ce qu'au moins deux séries comprennent quatre répétitions de l'étape a) de transformation suivie de l'étape b) de sélection Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention a pour objet un procédé
d'obtention d'une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre, comprenant les étapes suivantes :
- sélection d'une souche de Saccharomyces cerevisiae présentant :
o une activité maltase inférieure à 80 unités et o une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans sucre, - inactivation de m copies d'un gène SUC de ladite souche sélectionnée, m étant un nombre entier tel que l'activité invertase de la souche sélectionnée et inactivée est inférieure ou égale à 20 unités, l'étape d'inactivation comprenant au moins deux fois la série d'étapes suivante :
o quatre répétitions de l'étape a) de transformation de ladite souche sélectionnée avec au moins une cassette de disruption comprenant un marqueur de sélection, suivie de l'étape b) de sélection des souches transformées ayant intégré
ladite cassette de disruption, et o une étape c) d'élimination des marqueurs de sélection, et comprenant une fois la série d'étapes suivante :
o au moins deux répétitions de l'étape a) de transformation avec au moins une cassette de disruption comprenant un marqueur de sélection, suivie de l'étape b) de sélection des souches transformées ayant intégré ladite cassette de disruption, et o une étape c) d'élimination des marqueurs de sélection.
Les cassettes de disruption de chaque série comportent de préférence les mêmes séquences de recombinaison homologue et des marqueurs de sélection différents.

18 Les cassettes de disruption entre les différentes séries comportent de préférence une ou les deux séquences de recombinaison homologue différentes.
Le procédé selon l'invention nécessite par exemple la construction de 4 plasmides comportant chacun un marqueur de sélection différent.
Douze cassettes de disruption peuvent alors être obtenues simplement, en utilisant uniquement trois jeux d'amorces différentes qui comprennent les séquences de recombinaison homologue.
La présente invention a également pour objet une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre susceptible d'être obtenue ou obtenue par le procédé tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet toutes les souches dérivées des souches de levure large spectre selon l'invention et qui partagent les mêmes propriétés.
Par l'expression souche dérivée , on désigne une souche dérivée par toute transformation quelle qu'elle soit, comme par exemple un ou plusieurs croisements et/ou une ou plusieurs mutations et/ou une ou plusieurs transformations génétiques.
Une souche dérivée par croisement peut être obtenue par croisement d'une souche selon l'invention avec la même souche, ou une autre souche selon l'invention, ou une autre souche quelconque.
Une souche dérivée par mutation peut être une souche qui a subi au moins une mutation spontanée dans son génome ou au moins une mutation induite, par exemple par mutagenèse.
La ou les mutations de la souche dérivée sont silencieuses ou non.
Par l'expression mutagenèse , on désigne à la fois la mutagenèse classique obtenue par rayonnements ou par des agents chimiques mutagènes, et la mutagenèse insertionnelle par transposition ou par intégration d'un fragment d'ADN exogène.
La mutagenèse par rayonnements comprend l'utilisation de rayonnements UV, X, ou gamma.
Les agents chimiques mutagènes sont par exemple l'EMS (éthyl-méthyl sulfonate), l'EES
(éthyl-éthyl sulfonate), la nitrosoguanidine, l'acide nitreux, 1' aflatoxine Bi, l'hydroxylamine, la 5-bromo uracile, la 2-amino purine, la proflavine et/ou l'acridine orange.
Une souche dérivée par transformation génétique est une souche dans laquelle a été introduit un ADN exogène.
Ledit ADN exogène peut être apporté par un plasmide.
Ledit ADN exogène est de préférence intégré dans le génome de la levure.

19 La présente invention a ainsi pour objet une souche de levure dérivée d'une souche telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que ladite souche dérivée est une souche large spectre présentant une activité invertase inférieure ou égale à 20 unités.
L'invention a également pour objet un procédé de transformation d'une souche de levure large spectre selon l'invention, pour obtenir une souche dérivée telle que définie ci-dessus, ledit procédé de transformation comprenant une étape de transformation de ladite souche par au moins un croisement et/ou au moins une mutation et/ou au moins une transformation génétique.
La présente invention concerne également des souches de levure susceptibles d'être obtenues par le procédé de transformation tel que défini ci-dessus.
La présente invention a particulièrement pour objet une levure obtenue par culture d'une souche de levure telle que définie ci-dessus ou par culture d'une souche de levure dérivée telle que définie ci-dessus.
Les levures sont produites à partir de souches de levure large spectre selon l'invention, notamment comme décrit dans le livre de référence Yeast Technology , 2ème édition, 1991, G. Reed et T.W. Nagodawithana, publié par Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-31892-8.
La multiplication des levures, à l'échelle industrielle, comprend en général au moins les deux premières étapes de l'ensemble des étapes suivantes :
- multiplication d'une souche de levure en plusieurs stades, d'abord en semi-anaérobiose, puis en aérobiose, - séparation par centrifugation de la levure ainsi produite de son milieu de culture, pour obtenir une crème de levure liquide contenant environ entre 12 et 25% de matière sèche, voire une quantité plus élevée de matière sèche si la crème de levure est mélangée avec des produits osmolytes, - filtration de la crème de levure liquide ainsi obtenue, en général sur un filtre rotatif sous vide, pour obtenir une levure fraîche déshydratée contenant de 26% à 35%
de matière sèche, - malaxage de ladite levure fraîche déshydratée, pour obtenir une masse homogène, - extrusion de la levure ainsi obtenue, pour obtenir :
o une levure pressée sous forme de pains de levure fraîche ou de levure fraîche émiettée, contenant environ 30% de matière sèche, ou o une levure sous forme de particules, en général de granules, si la levure est destinée à être séchée, - éventuellement, séchage de manière ménagée, dans un courant d'air chaud, par exemple par fluidisation, des particules de levures obtenues par extrusion pour 5 obtenir de la levure sèche.
L'étape de séchage est de préférence un séchage rapide ménageant en présence d'un émulsifiant.
Parmi les émulsifiants pouvant être utilisés lors de l'étape de séchage, on peut choisir le monostéarate de sorbitan, utilisé par exemple à une concentration d'environ 1,0% (en poids 10 sur le poids de levure sèche).
Les levures selon l'invention peuvent être utilisées sous toute forme possible.
Par exemple, la présente invention a pour objet une levure telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de crème de levure, de levure pressée, de levure sèche ou de levure surgelée.
15 Les levures fraîches sont caractérisées par une teneur élevée en eau en comparaison aux levures sèches. Les levures fraîches englobent les crèmes de levure et les levures pressées.
Les crèmes de levure, appelées également levures liquides , sont des suspensions aqueuses de cellules de levure présentant une viscosité de type crème.
Par crème de levure, on comprend une suspension liquide, typiquement une suspension

20 aqueuse, de cellules vivantes de levure, ladite suspension ayant une teneur en matière sèche d'au moins 12% en masse, généralement comprise d'environ 12 à environ 50% en masse (définition étendue de crème de levure).
De préférence, la crème de levure répond à la définition au sens strict, c'est-à-dire qu'elle présente une teneur en matière sèche comprise d'environ 12 à environ 25% en masse, de préférence d'environ 14 à environ 22% en masse.
Parmi les levures pressées, on distingue les levures pressées en bloc compact, appelées également pains de levure qui sont caractérisées par une teneur en matière sèche comprise d'environ 26% à environ 35%, et les levures pressées en granules qui sont caractérisées par une teneur en eau comprise d'environ 21% à environ 35%.
Les levures sèches sont caractérisées par une teneur en matière sèche supérieure à environ 92%.
Les levures surgelées sont caractérisées par une teneur en matière sèche comprise d'environ 74% à environ 80%.

21 Les levures selon l'invention issues de la culture de souches de levure large spectre sont performantes sur des pâtes sans sucre et des pâtes sucrées, en particulier des pâtes sucrées contenant un pourcentage élevé de saccharose.
Les levures selon l'invention sont ainsi utiles en tant qu'agent de fermentation pour la fabrication de produits de panification obtenus à partir de pâtes sans sucre ou de pâtes sucrées.
La performance d'une levure peut être évaluée en panification par une mesure du temps d'apprêt (également appelé proof time).
Le temps d'apprêt est défini comme le temps nécessaire pour que la pâte boulangère atteigne une certaine hauteur dans le moule correspondant au développement de la pâte souhaitée pour qu'elle soit mise au four.
Les levures produites à partir des différentes souches de levure large spectre selon l'invention permettent d'obtenir un temps d'apprêt comparable à une souche de référence en pâte normale et à une souche de référence en pâte sucrée (cf exemple 2).
Les levures issues des souches de levure large spectre selon l'invention donnent par exemple des valeurs de temps d'apprêt comprises entre les valeurs de temps d'apprêt obtenues avec deux souches adaptées à une pâte sucrée de référence sur pâte sucrée (cf exemple 2), en panification selon un schéma direct avec 25 % de saccharose.
La présente invention a ainsi également pour objet l'utilisation d'une levure telle que définie ci-dessus, pour la fabrication de produits de panification.
Les levures obtenues par culture des souches large spectre selon l'invention peuvent être utilisées dans des procédés de panification de type schéma direct (NO-TIME
DOUGH) et de type schéma indirect ( SPONGE and DOUGH ), dans des pâtes sans sucre ou sucrées, avec ou sans inhibiteur de moisissures. Leur utilisation n'est cependant pas limitée aux applications spécifiques décrites ci-dessus et ci-après.
Un schéma direct ne comporte pratiquement pas de première fermentation entre un pétrissage intensif et la division de la pâte, les pâtons obtenus étant fermentés en moule entre 35 C et 40 C, puis cuits.
Un schéma SPONGE and DOUGH est un procédé de panification comprenant deux étapes de fermentation :
- une première étape, appelée SPONGE , qui correspond à la fermentation d'une pâte comprenant 50 à 70% de la farine totale mise en oeuvre, une partie de l'eau et la totalité de la levure, pendant plusieurs heures, en général environ quatre heures,

22 - une seconde étape, appelée DOUGH , dans laquelle le SPONGE obtenu après la fermentation ci-dessus est combiné avec le reste de la farine, le reste de l'eau et les autres ingrédients de la pâte, le mélange ainsi constitué est pétri, divisé, mis en moule et fermenté, puis cuit, cette seconde fermentation en moule correspondant à
l'apprêt et sa durée étant le temps d'apprêt.
Les pourcentages sont exprimés en pourcentages dits du boulanger, le pourcentage dit du boulanger étant une méthode de calcul appliquée aux rapports des ingrédients dans laquelle la masse totale de la farine représente toujours 100% et la masse des autres ingrédients de la pâte est calculée par rapport à cette masse de farine.
L'invention vise encore une pâte boulangère contenant une levure selon l'invention.
La pâte boulangère peut être une pâte sans sucre, une pâte légèrement sucrée ou une pâte sucrée, le sucre étant de préférence ajouté sous forme de saccharose.
L'expression pâte légèrement sucrée désigne des pâtes ayant une teneur en sucre ajouté
inférieure à 14% en masse par rapport à la masse de la farine, de préférence inférieure ou égale à 12% en masse par rapport à la masse de la farine.
L'invention vise encore un procédé de préparation d'une pâte boulangère comprenant une étape de fermentation par une levure selon l'invention.
L'invention vise encore un procédé de préparation d'un produit cuit de panification comprenant une étape de cuisson d'une pâte boulangère telle que définie ci-dessus.
L'invention vise enfin un produit de panification susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini ci-dessus.
Ainsi, en jouant uniquement sur le paramètre activité invertase, les Inventeurs ont obtenu des souches de levure large spectre.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une diminution de l'activité
invertase pour obtenir une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre à
partir d'une souche de Saccharomyces cerevisiae présentant une faible activité maltase et une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans sucre.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans la limiter.
Les exemples décrivent en particulier l'obtention des souches de levure large spectre selon l'invention, et l'évaluation en panification des levures obtenues à partir de ces souches.

23 EXEMPLE 1: OBTENTION DE SOUCHES DE LEVURE LARGE SPECTRE SELON
L'INVENTION
Matériel et Méthodes (i) Culture sur plaque de mélasse Une pré-culture de la souche de levure est réalisée en ensemençant 0,3 mg de la souche de levure sur une boîte de Pétri de diamètre 90 mm contenant 20 ml de milieu YEG
(à 2% de glucose). Le milieu YEG contient 20 g/1 de glucose, 5 g/1 d'extrait de levure et 30 g/1 d'agar.
Après 16 heures d'incubation à 30 C, les cellules de levure contenues sur la boîte de Pétri sont récoltées.
Les cellules de levure récoltées à l'issue de la pré-culture sont ensemencées sur des boîtes de Pétri de 140 mm de diamètre contenant de la mélasse, à raison de 2 mg de matière sèche de levure par boîte. Le milieu mélasse contient 5 g/1 de mélasse, 0,5 g de (NH4)2HPO4, 12,7 g/1 de K2504, 5,8 g/1 de Na2504, 30 g/1 d'agar, à pH5-5,5. Après 20h d'incubation à 30 C, les cellules de levure contenues sur les boîtes de Pétri sont récoltées et lavées. Les cellules de levure sont remises en suspension dans 20 ml d'eau déminéralisée.
(ii) Disruption multicopies du gène SUC
Souche de départ La disruption de plusieurs copies du gène SUC est effectuée sur une souche de Saccharomyces cerevisiae sélectionnée sur les critères suivants :
- une activité maltase inférieure à 80 unités, et - une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans sucre.
La souche qui est sélectionnée est appelée par la suite souche de départ .
La souche de départ est la souche déposée à la CNCM le 24 février 2005 sous le numéro I-3399.
La souche de départ sélectionnée a une force fermentative supérieure à 130 ml dans une pâte sans sucre et une activité maltase inférieure à 70 unités (cf tableau 2).
Le nombre de copies du gène SUC présent dans cette souche de départ est évalué
à au moins 12 copies par PCR quantitative.
Construction des cassettes de disruption Etant donné le nombre élevé de copies du gène SUC présent dans la souche de départ, 3 séries de cassettes de disruption sont construites, chaque série ayant des séquences de recombinaison homologue identiques.

24 Par ailleurs, chaque série comporte 4 cassettes de disruption qui diffèrent par la nature du marqueur de sélection utilisé (kanamycine, blastycidine, phléomycine et hygromycine).
Les séquences de recombinaison homologue utilisées sont les suivantes :
- pour la lere série de disruption :
o la séquence située de la base 1 à 51 de la séquence SEQ ID NO: 3 et o la séquence située de la base 1549 à 1599 de la séquence SEQ ID NO: 3, - pour la 2' série de disruption :
o la séquence située de la base 54 à 104 de la séquence SEQ ID NO: 3 et o la séquence située de la base 1497 à 1547 de la séquence SEQ ID NO: 3, - pour la 3' série de disruption :
o la séquence située de la base 110 à 159 de la séquence SEQ ID NO: 3 et o la séquence située de la base 1442 à 1491 de la séquence SEQ ID NO: 3.
Les amorces utilisées pour construire les cassettes de disruption de chaque série comprennent ainsi :
- une des séquences de recombinaison homologue ci-dessus, et - une séquence d'une vingtaine de bases permettant une hybridation de part et d'autre d'une région comprenant les séquences loxP encadrant le gène de résistance (kanamycine, phléomycine, hygromycine ou blastycidine) des plasmides suivants pUG6, pUG66, pUG-hygro, pUG-blast.
Le plasmide pUG6 comporte en effet le gène de résistance à la kanamycine, le plasmide pUG66 le gène de résistance à la phléomycine, le plasmide pUG-hygro le gène de résistance à
l'hygromycine et le plasmide pUG-blast le gène de résistance à la blastycidine.
La cassette de disruption est construite en effectuant une amplification PCR
avec le couple d'amorce de chaque série sur chacun des plasmides pUG6, pUG66, pUG-hygro, pUG-blast.
L'amplification PCR pour construire l'ensemble des cassettes de disruption a été réalisée grâce à l'enzyme DyNAzyme0 (Finnzyme), selon les recommandations du fournisseur et en utilisant les cycles de température suivants : 94 C pendant 5 min, 94 C
pendant 30 s, 55 C
pendant 30 s, 72 C pendant 1 min 30 (ces trois dernières étapes sont répétées de manière à
effectuer 25 cycles) et enfin un cycle final d'élongation à 72 C pendant 10 min.
Les cassettes amplifiées sont purifiées individuellement sur colonne (Kit nucleo spin extract H) et sont dosées après élution sur un appareil Nanodrop.

Disruption Les levures sont transformées avec la cassette de disruption choisie par la méthode de l'acétate de lithium (Schiestl et Gietz, 1989).
5 La sélection des transformants est effectuée sur boîte de milieu YEG (20 g/L glucose, 5 g/L
d'extrait de levure, 30 g/1 agar) contenant une concentration appropriée d'antibiotique en fonction du gène de résistance utilisé comme marqueur de sélection.
Elimination des marqueurs de sélection 10 Des transformants sont transformés avec un plasmide comprenant le gène de résistance à la nourseothricine et le gène de la recombinase Cre, par la méthode de l'acétate de lithium (Schiestl et Gietz, 1989).
Des clones transformants devenus résistants à la nourséothricine sont sélectionnés et cultivés sur une nuit en présence d'un milieu YE contenant 20 g/1 de galactose, afin d'induire 15 l'expression de la recombinase Cre présente sur le plasmide.
10 1 de cette culture sont ensemencés dans un milieu YEG frais. Après 24h de culture en condition non sélective en vue de favoriser la perte du plasmide, un étalement sur boite gélosée YEG est réalisé. Une centaine de clones est analysée pour vérifier la perte effective de la résistance aux 4 marqueurs antibiotiques des cassettes de disruption (kanamycine, 20 phléomycine, hygromycine ou blastycidine) et de la résistance à la nourseothricine apportée par le plasmide comprenant la recombinase.
Les clones qui ont perdu toute résistance à ces antibiotiques sont analysés afin de vérifier que cette étape particulière n'a pas affecté la croissance et le rendement de production de levures à
partir des clones sélectionnés.
Schéma de disruption Trois séries de disruption sont effectuées.
Lors de chaque série de disruption, les 4 cassettes de disruption sont utilisées de manière séquentielle : transformation avec la première cassette et sélection des transformants sur la base du marqueur de sélection correspondant, transformation avec la deuxième cassette et sélection des transformants sur la base du marqueur de sélection correspondant, transformation avec la troisième cassette et sélection des transformants sur la base du marqueur de sélection correspondant, puis transformation avec la quatrième cassette et sélection des transformants sur la base du marqueur de sélection correspondant.

Les 4 marqueurs de sélection sont ensuite éliminés en une seule étape, par action d'une recombinase.
A l'issue de chaque série de disruption, les transformants obtenus sont analysés par PCR pour vérifier l'intégration de la cassette de disruption à un locus SUC.
(iii) Dosage de l'activité invertase La souche de levure est cultivée sur plaque de mélasse comme indiqué ci-dessus au (i).
L'activité invertase est mesurée comme décrit dans Sumner et Howell (J. Biol.
Chem., 1935, 108, 51-54).
Une quantité connue, de l'ordre de quelques dizièmes de milligrammes, de matières sèches levure et du saccharose à une concentration 0,1 molaire sont mis en présence en milieu tamponné (tampon acétate à 50 mM et pH 4,7), le tout placé dans un bain-marie à 30 C.
Après 5 minutes d'incubation, la réaction d'inversion du saccharose est bloquée par ajout du réactif à l'acide dinitrosalicylique qui sert à doser, avec un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 540 nm, les sucres réducteurs formés par réaction colorimétrique.
L'activité invertase est exprimée en unité invertase, une unité invertase correspondant à 1 iumole de sucre réducteur libéré, correspondant en l'occurrence à une demi-micromole de saccharose inverti, en 5 minutes par mg de matière sèche de levure, à 30 C et à pH 4,7, sans plasmolyse de la levure.
(iv) Dosage de l'activité maltase L'activité maltase est mesurée par dosage de la libération de p-nitrophénol suite à l'action de la maltase sur un substrat chromogénique, le 4-nitro-phényl-a-D-glucopyrannoside, comme décrit dans Houghton-Larsen et Anders Brandt, Appl. Environ. Microbiol., 2006, p 7176-7182.
La souche de levure est cultivée sur plaque de mélasse comme indiqué ci-dessus au (i).
La suspension de levure est centrifugée et les cellules sont ensemencées à
raison de 1 mg de matière sèche par ml dans un milieu YPG contenant 2 % de glucose. Après 4 heures d'incubation, sous agitation, à 30 C, les cellules sont récoltées et une suspension cellulaire à
20 mg de matière sèche de levure par ml est préparée. 1 ml de ladite suspension cellulaire est prélevé pour broyer les cellules. Après le broyage des cellules, le surnageant est alors récupéré pour le dosage de l'activité maltase.
Le surnageant obtenu est dilué entre 5 et 400 fois pour le dosage. 1,4 ml de substrat à une concentration de 4 mM dans un tampon phosphate à pH 6,8 est ajouté à 100 iul d'une dilution de surnageant. Après 10 minutes d'incubation à 30 C, la réaction est stoppée par ajout de 1 ml d'une solution de Na2CO3 à 10%. La solution est centrifugée pendant 5 minutes à 4000 tours/minute et l'absorbance du surnageant est mesurée à 400 nm.
La concentration en p-nitrophénol dans le surnageant est déduite des valeurs d'absorbance obtenues avec une gamme de p-nitrophénol entre 100 à 800 nmol/ml.
Les résultats sont ensuite exprimés en unité maltase, une unité maltase correspondant à 1 nmol de p-nitrophénol libéré par minute et par mg de protéines.
(v) Mesure des forces fermentatives La force fermentative des souches de levure est mesurée dans une pâte sans sucre et une pâte sucrée.
Les souches de levure sont cultivées sur plaque de mélasse comme indiqué ci-dessus au (i).
Les levures ainsi obtenues sont mises en suspension, à raison de 150 mg de matières sèches de levure pour une mesure en pâte sans sucre ou de 300 mg de matière sèches de levure pour une mesure en pâte sucrée, dans 15 ml d'une solution aqueuse à 27g/1 de NaC1 et 4 g/1 de SO4(NH4)2.
La pâte sans sucre contient 20 g de farine et la pâte sucrée contient 6,5 g de saccharose et 25 g de farine.
Pour constituer les pâtons, le mélange de farine (avec ou sans saccharose) et ladite suspension de levures sont malaxés pendant 40 secondes dans un pétrin, de manière à
obtenir une pâte qui est ensuite placée dans un récipient mis au bain-marie à 30 C. 13 minutes après le début du malaxage, le récipient contenant la pâte est fermé hermétiquement.
Le volume de dégagement gazeux est mesuré au cours de la 1 ere heure et au cours de la 2' heure, au moyen d'un Risograph (National Manufacturing, Lincoln, Nebraska). On indique ensuite le volume total en ml sur 2 heures à 30 C.
Résultats (i) Disruption multicopies du gène SUC
Les deux séquences de recombinaison homologue de la première série comprennent le codon d'initiation ATG et le codon stop de SUC2. Après un évènement de double recombinaison homologue avec insertion de la cassette de disruption au locus ciblé, 1497 pb du gène SUC
ciblé sont délétées.
Les cassettes de disruption de la deuxième série permettent, selon le même principe, la délétion de 1392 pb du gène SUC au niveau du locus ciblé.

Les deux séquences de recombinaison homologue de la deuxième série étant situées dans la région du gène SUC délétée par utilisation des cassettes disruption de la première série, l'évènement de double recombinaison homologue ne peut se produire qu'au niveau d'un locus SUC n'ayant pas subi de disruption.
De la même façon, les cassettes de disruption de la troisième série permettent la délétion de 1173 pb du gène SUC au niveau du locus ciblé. Les deux séquences de recombinaison homologue de la troisième série étant situées dans la région du gène SUC
délétée par utilisation des cassettes disruption de la deuxième série, l'évènement de double recombinaison homologue ne peut se produire qu'au niveau d'un locus SUC
n'ayant pas subi de disruption.
La première série permet de disrupter 94% de l'ORF d'un gène SUC, la seconde série 87% et la troisième série 73%.
Des souches présentant jusqu'à 12 copies du gène SUC inactivées par disruption sont ainsi obtenues. Les souches sont désignées par le caractère A , suivi d'un chiffre indiquant le nombre de copies du gène SUC inactivées par disruption.
Les souches testées par la suite sont les suivantes : A4, A8, A9, A10, Ail, Al2.
(ii) Dosage de l'activité invertase des souches obtenues L'activité invertase des différentes souches obtenues, ainsi que celle de la souche de départ est mesurée comme indiqué dans la partie Matériel et Méthodes.
L'activité invertase de 3 souches témoin présentant une activité large spectre (Ti, T2 et T3) est également mesurée.
A partir de 8 copies du gène SUC inactivées par disruption, l'activité
invertase est diminuée de plus d'un facteur 20 (cf tableau la).
Les souches qui ont au moins 8 copies du gène SUC inactivées par disruption ont une activité
invertase inférieure à 20 unités.
Tableau la Souche de levure Activité invertase (en unités) Souche de départ 314 A4 + marqueur 72 A8 + marqueur 13 A9 + marqueur 14 Tableau lb Souche de levure Activité invertase (en unités) Souche de départ 343 A10 + marqueur 11 Ml + marqueur 8 Ml 12 Al2 + marqueur 9 Al2 10 Tl 27 A partir de 10 copies du gène SUC inactivées par disruption, la disruption d'une ou deux copies supplémentaires ne permet pas de diminuer davantage l'activité
invertase (cf tableau lb).
L'activité invertase mesurée sur les souches avant l'élimination des marqueurs antibiotiques permet de montrer que l'étape d'élimination des marqueurs n'a pas d'effet sur l'activité invertase des souches (cf tableau lb).
Les souches témoin T2 et T3 présentent une activité invertase semblable aux différentes souches obtenues. La souche témoin T1 présente quant à elle un niveau d'activité invertase un peu plus élevé (cf tableau lb).
(iii) Dosage de l'activité maltase L'activité maltase de la souche de départ est bien inférieure à 80 unités.
Tableau 2 Souche de levure Activité maltase (en unités) Souche de départ 63 Ml 135 Al2 225 Tl 575 De manière surprenant, l'activité maltase de souches A10, Al 1 et Al2 selon l'invention est augmentée (entre 120 et 230 unités).

L'activité maltase d'une souche adaptée à une pâte sucrée (SPS) est de 40 unités et celle des souches large spectre témoin supérieure à 500 unités.
(iv) Mesure des forces fermentatives 5 Le caractère large spectre des souches obtenues est évalué en mesurant les forces fermentatives dans une pâte sans sucre et dans une pâte sucrée.
Les forces fermentatives des souches témoin large spectre Ti à T3, de la souche de départ et d'une souche adaptée à une pâte sucrée (SPS) sont également évaluées.
La souche adaptée à une pâte sucrée est, par définition, performante sur pâte sucrée, mais 10 n'est pas adaptée à des pâtes sans sucre.
Le tableau 3 indique les forces fermentatives dans une pâte sans sucre et le tableau 4 dans une pâte sucrée.
Tableau 3 Souche testée lère heure 2ème heure Total 2 heures Souche de départ 52 85 137 A10 + marqueur 52 92 144 Ail + marqueur 51 92 143 Ail 57 90 147 Al2 + marqueur 47 91 138 Al2 52 94 146 Ti 67 87 154 15 Les souches présentant plusieurs copies du gène SUC inactivées par disruption et la souche de départ présentent des forces fermentatives similaires dans une pâte sans sucre au cours de la première heure, qui sont bien supérieures à celle de la souche adaptée à une pâte sucrée, mais inférieures aux souches large spectre témoin (cf tableau 3).
La force fermentative des souches présentant plusieurs copies du gène SUC
inactivées par 20 disruption, au cours de la deuxième heure, dans une pâte sans sucre est supérieure à celle de la souche de départ et à celle des souches large spectre témoin (cf tableau 3).
Elles sont également nettement supérieures à la force fermentative de la souche adaptée à
une pâte sucrée.

La force fermentative des souches présentant plusieurs copies du gène SUC
inactivées par disruption, sur la totalité des 2 heures, dans une pâte sans sucre, est légèrement supérieure à la souche de départ et nettement supérieure à la souche adaptée à une pâte sucrée, et se situe au niveau des valeurs obtenues pour les souches large spectre témoin (cf tableau 3).
Les souches présentant plusieurs copies du gène SUC inactivées par disruption présentent donc un profil de force fermentative dans une pâte sans sucre bien particulier, qui présente des différences à la fois vis-à-vis de la souche de départ, de la souche adaptée à
une pâte sucrée et des souches large spectre témoin.
Tableau 4 Souche testée lère heure 2ème heure Total 2 heures Souche de départ 15 37 53 Ail + marqueur 41 83 124 Ail 45 84 129 Al2 + marqueur 36 74 109 Al2 35 73 108 Ti 48 80 127 Le tableau 4 indique les forces fermentatives obtenues en pâte sucrée.
La force fermentative des souches présentant plusieurs copies du gène SUC
inactivées par disruption, des souches large spectre témoin et de la souche adaptée à une pâte sucrée (SPS) est largement supérieure à celle de la souche de départ.
Les souches A10, Ail, la souche adaptée à une pâte sucrée (SPS) et la souche large spectre témoin T1 donnent des forces fermentatives similaires dans une pâte sucrée, au cours de la première heure, de la deuxième heure et sur la totalité des 2 heures.
La souche Al2 et les témoins large spectre T2 et T3 ont des forces fermentatives légèrement inférieures.
Les résultats obtenus montrent que les souches de levure A10, Ail et Al2 sont des souches de levure selon l'invention qui ont des propriétés large spectre très intéressantes.
Les souches de levure A10, Ail et Al2 correspondent respectivement aux souches déposées à
la CNCM sous les numéros 1-4339, 1-4340 et 1-4338.

EXEMPLE 2: EVALUATION DES LEVURES OBTENUES A PARTIR DES SOUCHES
SELON L'INVENTION EN PANIFICATION
Matériel et Méthodes (i) Production de levures Les levures sont produites à partir des souches de levure selon l'invention dans des fermenteurs de 20 litres, en mode semi-continu, comme décrit dans le livre de référence Yeast Technology , 2ème édition, 1991, G. Reed et T.W. Nagodawithana, publié
par Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
Les levures sont produites sous la forme de levure liquide et de levure pressée.
(ii) Essais de panification Les levures ainsi obtenues sont évaluées dans une application selon un schéma direct, dans une pâte contenant une concentration élevée en saccharose (25% de saccharose en pourcentage du boulanger).
La recette utilisée est indiquée dans le tableau 5 ci-dessous.
L'améliorant apporte le mélange d'oxydants et de réducteurs, les enzymes ainsi que les émulsifiants classiques permettant une optimisation du processus de fabrication de ce schéma de panification direct, une bonne qualité et une bonne conservation des pains obtenus.
Tableau 5 Ingrédients Quantités (% du boulanger) Farine 100 Eau 46 Levure 6 Matières grasses 7,5 Améliorant 1 Saccharose 25 Sel 1,7 Le protocole appliqué est le suivant :
1. Peser les ingrédients solides, 2. Mesurer la température ambiante et la température de la farine, 3. Régler la température de l'eau de manière à obtenir une température de pâte de 27 C +/-0,5 C, 4. Placer les ingrédients dans une cuve Mac Duffy0 d'un pétrin HobartA2000, 5. Mélanger les ingrédients secs en 1 em vitesse pendant 1 min, puis ajouter la matière grasse, l'eau et la levure, 6. Démarrer le pétrissage selon le programme suivant :
* en 1ere vitesse pendant 5 min, * laisser reposer pendant 4 min, * en 2eme vitesse pendant 5 min, 7. Obtenir une pâte ayant une température de 27 C +/- 0.5 C, 8. Prélever 50 g de pâte, bouler sommairement et placer dans un pot de Risograph ; placer ledit pot dans un bain-marie à 30 C, brancher le pot à l'appareil de mesure et lancer la mesure pendant 2 heures, 9. Effectuer le pointage de la masse dans une ambiance à 22 C pendant 10 min, 10. Diviser en pâtons de 320 g, 11. Bouler et couvrir, 12. Laisser reposer pendant 10 min, 13. Façonner la pâte, 14. Mettre en moules les pâtons de 320 g (dimensions des moules : base de 185x75 mm; haut du moule de 200x90 mm; hauteur du moule de 75mm), 15. Déterminer le temps d'apprêt dans un incubateur Stéricult0 à 35 C et 90%
d'humidité
relative, le temps d'apprêt étant le temps entre la mise dans l'incubateur et le moment où
la pâte atteint une hauteur de 85mm dans le moule, 16. Cuire dans un four à balancelle REEDO à 180 C pendant 21 min, 17. Mesurer le volume des pains après un refroidissement d'au moins une heure.
Les paramètres évalués sont :
- le temps d'apprêt, exprimé en pourcentage par rapport à une levure de référence, - le volume spécifique du pain (volume du pain rapporté à la masse, VS), exprimé
en pourcentage par rapport à une levure de référence, et - le dégagement gazeux (DG) mesuré au Risograph à 2h à 30 C, à partir d'un pâton de 50g, exprimé en pourcentage par rapport à une levure de référence.
Résultats Les levures produites à partir de la souche de levure Al 1 sont évaluées dans une application contenant beaucoup de saccharose (schéma direct avec 25% saccharose).

Le tableau 6 présente les résultats obtenus avec des levures issues de la souche A 11 selon l'invention, en comparaison avec la souche de départ et deux souches adaptées à une pâte sucrée (SPS1 et SPS2).
La souche SPS1 est une souche standard parmi les souches adaptées à une pâte sucrée, et la souche SPS2 est la meilleure souche adaptée à une pâte sucrée du Demandeur.
Tableau 6 Souche utilisée Levure Temps d'apprêt VS (%) DG
(%) (%) Souche de Levure liquide +20 -13 -26 départ Levure pressée +29 -20 -36 Souche Ail Levure liquide -13 +9 +27 Levure pressée -11 +9 +24 SPS1 Levure pressée -1 +1 -1 5P52 Levure pressée -24 +26 +47 Les pourcentages sont calculés par rapport aux valeurs obtenues avec une levure de référence.
Comme attendu, les levures issues de la souche de départ ne sont pas du tout adaptées à une panification en pâte sucrée.
Les levures issues de la souche Ail selon l'invention donnent des valeurs de temps d'apprêt, volume spécifique du pain et dégagement gazeux qui se situent entre les valeurs obtenues avec les levures issues de la souche SPS1 et celles obtenues avec les levures issues de la souche 5P52.
Les levures issues de la souche Ail sont donc appropriées pour une utilisation dans des pâtes sucrées.

Claims (18)

1. Souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre, caractérisée en ce que :
- n copies d'un gène SUC sont inactivées, n étant un nombre entier tel que l'activité invertase de ladite souche est inférieure ou égale à 20 unités, et - l'activité maltase de ladite souche avant l'inactivation des n copies du gène SUC est inférieure à 80 unités.

2. Souche selon la revendication 1, caractérisée en ce que n est supérieur ou égal à 2, de préférence supérieur ou égal à 4, plus préférentiellement supérieur ou égal à
8.

3. Souche selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'au moins une copie d'un gène SUC est inactivée par disruption.

4. Souche selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence d'ADN exogène.

5. Souche selon l'une des revendications 1 à 4, choisie parmi la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-4339, la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-4340 et la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro I-4338.

6. Procédé d'obtention d'une souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre, comprenant les étapes de :
- sélection d'une souche de Saccharomyces cerevisiae présentant :
~ une activité maltase inférieure à 80 unités, et ~ une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans sucre, - inactivation de m copies d'un gène SUC de ladite souche sélectionnée, m étant un nombre entier tel que l'activité invertase de la souche sélectionnée et inactivée est inférieure ou égale à 20 unités.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que m est supérieur ou égal à 2, de préférence supérieur ou égal à 4, plus préférentiellement supérieur ou égal à

8.

8. Procédé selon la revendication 6 ou 7, caractérisé en ce que l'étape d'inactivation de m copies d'un gène SUC comprend l'inactivation de la transcription d'au moins une copie d'un gène SUC, la délétion d'au moins une copie d'un gène SUC, l'insertion d'au moins une séquence dans au moins une copie d'un gène SUC, la disruption d'au moins une copie d'un gène SUC et/ou une mutation dans au moins une copie d'un gène SUC.

9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que l'étape d'inactivation comprend :
- une étape a) de transformation de ladite souche sélectionnée avec une cassette de disruption comprenant un marqueur de sélection, - une étape b) de sélection des souches transformées ayant intégré la cassette de disruption, - une éventuelle étape c) d'élimination du marqueur de sélection.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la cassette de disruption comprend un marqueur de sélection encadré par deux séquences lox, lesdites séquences lox étant encadrées par deux séquences de recombinaison homologue.

11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une fois la série d'étapes suivante :
- au moins deux répétitions de l'étape a) de transformation suivie de l'étape b) de sélection, et - une étape c) d'élimination des marqueurs de sélection.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que chaque étape a) de transformation est effectuée avec une cassette de disruption comprenant un marqueur de sélection différent et/ou au moins une séquence de recombinaison homologue différente.

13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce qu'il comprend trois fois ladite série d'étapes et en ce qu'au moins deux séries comprennent quatre répétitions de l'étape a) de transformation suivie de l'étape b) de sélection.

14. Souche de Saccharomyces cerevisiae large spectre obtenue par le procédé
selon l'une des revendications 6 à 13.

15. Souche de levure dérivée d'une souche selon l'une des revendications 1 à 5 ou 14, caractérisée en ce que ladite souche dérivée est une souche large spectre.

16. Levure obtenue par culture d'une souche de levure selon l'une des revendications 1 à
ou 14, ou d'une souche dérivée selon la revendication 15.

17. Utilisation d'une levure selon la revendication 16, pour la fabrication de produits de panification.

18. Utilisation d'une diminution de l'activité invertase pour obtenir une souche de levure large spectre à partir d'une souche de levure présentant une faible activité
maltase et une force fermentative supérieure ou égale à 110 ml dans une pâte sans sucre.