CA2771681A1 - Composition d'immunoglobulines g - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une composition d'immunoglobulines G comprenant du mannitol, de la glycine et un détergent non ionique, dans laquelle la concentration en immunoglobulines G est de 100 g/l ± 20g/l.

Description

Composition d'immunoglobulines G

L'invention concerne une composition d'immunoglobulines G comprenant du mannitol, de la glycine et un détergent non ionique.

De nombreuses pathologies sont actuellement traitées par des compositions d'immunoglobulines G (IgG). On peut citer par exemple les déficits immunitaires primitifs avec défaut de production d'anticorps, la maladie de Kawasaki, le purpura thrombopénique immunologique de l'enfant et de l'adulte, les déficits immunitaires secondaires avec défaut de production d'anticorps, en particulier la leucémie lymphoïde chronique ou myélome associés à des infections à répétition, l'infection de l'enfant par le VIH associée à des infections bactériennes, les neuropathies motrices multifocales, le syndrome de Guillain-Barré, les infections aiguës sévères ou chroniques à Parvovirus B19, l'immunodéficience acquise ou constitutionnelle, la dermatomyosite cortico-résistante, la myasthénie aiguë, la polyradiculonévrite chronique idiopathique, le purpura thrombopénique immunologique, par exemple associé à l'infection par le VIH, le syndrome de l'homme raide (Stiffman syndrome), la neutropénie auto-immune, l'erythroblastopénie auto-immune résistante, le syndrome d'anti-coagulation acquise par auto-anticorps, la polyarthrite rhumatoïde, etc.

Au cours de ces dernières années, la très forte demande d'IgG a engendré des situations de tension extrêmes sur les approvisionnements, pouvant aller jusqu'à
des situations de pénurie en Europe et aux Etats Unis d'Amérique.

Dans ce contexte, il y a un besoin grandissant de produire des compositions d'IgG, habituellement conditionnées à des pH acides et injectables par voie intraveineuse, à partir par exemple de plasmas humains. Avec l'essor de ces besoins en IgG, la stabilisation de ces compositions d'IgG injectables par voie intraveineuse (IgGIV) en vue de leur utilisation thérapeutique et de leur conservation revêt un caractère fondamental.

A cet égard, on sait qu'il est nécessaire de stabiliser les IgGIV pour éviter notamment la formation d'agrégats (oligomères et polymères) susceptibles d'activer le système du complément avec des risques associés de réactions

2 PCT/FR2009/052714 anaphylactiques. Par ailleurs, la présence de dimères dans les IgGIV a été
corrélée à des baisses de pression artérielle in vivo (Bleeker W.K. et al, Blood, 95, 2 000, p. 6-18 6 1). D'autres dégradations physicochimiques peuvent également intervenir au cours de la conservation des IgG comme, entre autres, l'oxydation et l'hydrolyse.

La stabilisation des IgG nécessite donc l'ajout de composés, classiquement choisis parmi les sucres et les acides aminés, afin d'obtenir non seulement des compositions d'IgG non dégradées appropriées à un usage thérapeutique mais également des compositions d'IgG présentant une stabilité accrue durant le stockage.

La stabilisation des formes lyophilisées de compositions protéiniques et notamment d'IgG, par l'ajout de stabilisants spécifiques, a fait l'objet de très nombreuses études.

Celles citées dans les publications scientifiques de M. Pikal, "Freeze-Drying of Proteins, Part 2 : Formulation Selection", Biopharm. 3(9); pp.26-30 (1990) et de Arakawa et al, Pharm. Res., 1991, 8(3), p. 285-291, montrent que l'ajout d'un excipient dans des compositions protéiniques avant lyophilisation, augmente la stabilité au cours de la lyophilisation et/ou la stabilité du produit lyophilisé lors du stockage. Parmi ces stabilisants, certains sont toutefois connus comme étant des agents précipitants de protéines supérieures à environ 100 kDa. Ainsi, l'utilisation de polyéthylène glycol (PEG) 3000-6000 est rédhibitoire dans la phase de congélation en vue de la lyophilisation de compositions protéiniques correspondantes. Osterberg et al (Pharm. Res., 1997, 14(7), p. 892-892) ont montré l'efficacité d'un mélange d'histidine, de saccharose, d'un tensioactif non ionique et de chlorure de sodium pour la stabilisation des formes lyophilisées du facteur VIII recombinant et l'ajout de PEG n'en a pas amélioré la stabilité.
En outre, Guo et al (Biomacromol., 2002, 3(4), p. 846-849) précisent que la lyophilisation de la peroxydase de raifort en présence de PEG, ne permet pas d'en conserver la structure native. La présence de PEG ne paraît donc pas souhaitable.

3 PCT/FR2009/052714 Des compositions d'IgGIV lyophilisées sont disponibles dans le commerce, par exemple sous les noms de marques PolygamTM (American Red Cross), Gammar IVTM (Armour Pharmaceutical Company) et VenoglobulinTMl (Alpha) contenant comme stabilisants du glucose à 2%, du saccharose à 5% et du D-mannitol à 2%
respectivement.

La demande de brevet international WO 97/04801 décrit l'effet de stabilisation de formulations d'anticorps monoclonaux lyophilisés (de type immunoglobulines G
et E) comprenant des excipients spécifiques. Parmi ces excipients, la combinaison glycine/mannitol n'est pas retenue pour défaut d'efficacité au regard d'autres combinaisons telles que saccharose/glycine et saccharose/mannitol.

On constate, toutefois, que des stabilisants appropriés aux formes lyophilisées des IgGIV peuvent être totalement inefficaces pour des compositions d'IgGIV
liquides.

Ainsi, les compositions d'IgGIV liquides, disponibles dans le commerce, comprennent des stabilisants spécifiques différents de ceux utilisés pour la forme lyophilisée correspondante. A titre d'exemple, les compositions liquides d'IgGIV
qui contiennent comme stabilisants du maltose à 10%, de la glycine de 0,16 à
0,24 M et du D-sorbitol à 5% sont respectivement connues sous les noms de marque OctagamTM, (Octapharma), GamunexTM 10% (Talecris) et VenoglobulinTM
(Alpha).

La nature différente des composés utilisés pour la stabilisation des compositions d'IgG sous forme liquide et sous forme lyophilisée, a amené certains auteurs à
rechercher des stabilisants ou mélanges de stabilisants identiques permettant de conserver les compositions d'IgG sous les deux formes à la fois. A cet égard, des études récentes ont porté sur la stabilisation de compositions d'IgGIV, Vigam-S et Vigam Liquid (noms de marques de National Blood Authority, Angleterre) liquides et après lyophilisation (Vigam-S) comprenant un mélange identique de stabilisants à savoir l'albumine et le saccharose (K. Chidick et al, Vox Sanguinis, 77, 204-209, 1999). Toutefois, la solution Vigam Liquid est conditionnée à un pH acide (pH
5) ce qui présente l'inconvénient de transformer, par hydrolyse, le saccharose en

4 PCT/FR2009/052714 sucres réducteurs (fructose et glucose) qui se condensent avec les résidus aminés de la lysine des IgG et de l'albumine pour donner une base de Schiff instable évoluant en des produits de Maillard (brunissement de la solution).
Il n'est bien entendu pas satisfaisant d'utiliser des excipients qui évoluent au cours de la conservation des IgG car la maîtrise de la réaction n'est pas possible, une fois celle-ci initiée.

Par ailleurs, certains des stabilisants cités précédemment, comme le maltose ou le saccharose, ne peuvent être utilisés sans risques chez des sujets présentant des insuffisances rénales et/ou souffrant de diabète.

Afin de palier les inconvénients précédents, la Demanderesse a mis au point une formulation stabilisante unique, qui assure la stabilisation à la fois des formes liquides et lyophilisées des IgG. Une formulation particulièrement efficace pour stabiliser les compositions d'immunoglobulines est décrite dans la demande de brevet internationale WO 2004/091656 déposée par la Demanderesse. Cette demande de brevet divulgue une composition contenant 50 g/I d'IgG, 50 g/I de mannitol, 10 g/I de glycine et 50 ppm de détergent, 50 ppm de détergent correspond à une concentration de 50 mg/1 de détergent.

Comme pour de nombreux médicaments injectables, les excipients des compositions d'IgIV peuvent induire des effets secondaires indésirables plus ou moins importants. Ces effets secondaires sont souvent dus aux excipients eux-mêmes qui peuvent être responsables, par exemple, de réactions allergiques. A
titre d'exemple, lorsqu'on administre 300 mL d'un concentré d'IgIV de la composition décrite dans la demande WO 2004/091656, la quantité d'excipient administrée au patient sera de 15 g de mannitol, 3 g de glycine et 15 mg de détergent.

Par ailleurs, il est connu que lorsque l'on augmente la concentration en immunoglobuline d'une composition d'IgG, il peut se former des oligomères et polymères dans ladite composition. Les oligomères et polymères sont susceptibles d'activer le système du complément avec des risques associés de réactions anaphylactiques. Ces oligomères et polymères sont également

5 PCT/FR2009/052714 susceptibles d'induire des hypotensions chez le patient traité. Ceci n'est pas souhaitable et strictement contrôlé du point de vue réglementaire. Pour éviter l'apparition d'oligomères et polymères lorsque l'on augmente la concentration en immunoglobuline d'une composition d'IgG, il faut généralement augmenter également la concentration en excipients. Cette augmentation de la concentration en excipients permet de stabiliser la composition d'IgG. En effet les excipients ont une fonction stabilisante et leur quantité est généralement corrélée à la quantité
de principe actif, notamment lorsque le principe actif est une immunoglobuline.
Partant de la composition stable décrite dans WO 2004/091656 contenant 50g/I
d'IgG, 50 g/I de mannitol, 10 g/I de glycine et 50 ppm de détergent, la Demanderesse s'est aperçu de manière surprenante que :

(i) non seulement il était possible d'obtenir une composition stable d'IgG à
une concentration de 100 g/I 20 g/I d'IgG tout en conservant les mêmes excipients et sans augmenter la concentration desdits excipients , (ii) mais en plus, qu'il était possible d'obtenir une composition stable d'IgG
à une concentration de 100 g/I 20 g/I en diminuant la concentration d'au moins un des excipients (glycine, mannitol ou détergent).

Ainsi la composition stable mise au point par la Demanderesse présente deux avantages majeurs par rapport à la composition déjà décrite dans WO
2004/091656:

- Premièrement, le fait d'avoir une plus grande concentration en IgG, c'est-à-dire une plus grande quantité de principe actif pour un même volume, permet d'administrer aux patients un volume moindre de ladite composition.
Le temps d'administration est donc significativement réduit, ce qui se traduit par moins de contrainte pour les patients traités.
- Deuxièmement, le fait d'administrer un volume moindre de ladite composition sans augmenter la concentration desdits excipients, de préférence en diminuant la concentration d'au moins un desdits excipients, se traduit par une diminution importante de la quantité d'excipients administrée au patient.

6 PCT/FR2009/052714 Par conséquent, pour une même quantité d'IgG, le volume d'une composition de concentration en IgG de 100 g/I sera deux fois moins important que le volume d'une composition de concentration en IgG de 50 g/I. Il en résulte qu'à
concentration en excipients identique, la quantité d'excipients administrée avec la composition de concentration en IgG de 100 g/I sera deux fois moins importante que la quantité d'excipients administrée avec la composition de concentration en IgG de 50 g/I. Le risque d'induire des effets secondaires liés aux excipients est donc significativement réduit.

L'invention concerne une composition d'immunoglobulines G comprenant du mannitol, de la glycine et un détergent non ionique caractérisée en ce que la concentration en immunoglobulines G est de 100 g/I 20 g/I.

Dans la suite de la description, la composition selon l'invention comprenant 100 g/I
g/I d'immunoglobulines G peut également être appelée composition d'IgG
10%

15 La composition selon l'invention est caractérisée par une concentration en immunoglobulines G de 100 g/L 20 g/I, c'est-à-dire que la composition selon l'invention peut présenter une concentration en immunoglobulines G comprise entre 80 g/I et 120 g/I. Avantageusement la composition selon l'invention présente une concentration en immunoglobulines G de 100 g/I 10 g/I, de préférence 100 20 g/I 5 g/I, de préférence 100 g/I.

La glycine, anciennement appelée glycocolle ou acide aminoacétique est le plus simple des acides aminés. De préférence, la concentration en glycine de la composition selon l'invention est comprise entre 4 g/I et 10 g/I.

Le mannitol ou 1,2,3,4,5,6-hexanehexol (C6H14O6) est un polyol ou sucre-alcool"
similaire au xylitol ou au sorbitol. Le mannitol a été choisi par la Demanderesse sur des critères de stabilité à des pH acides de conditionnement des compositions d'IgG, ce qui évite des réactions de Maillard sur les immunoglobulines G, sur des critères de compatibilité pharmaceutique et sur des critères relatifs à leur action stabilisante des compositions d'immunoglobulines sous forme liquide. La concentration en mannitol suffisante pour stabiliser la composition selon l'invention

7 PCT/FR2009/052714 est inférieure ou égale à 50 g/I. De préférence, la concentration en mannitol de la composition selon l'invention est comprise entre 20 g/l et 50 g/I. Toutes les formes du mannitol peuvent être utilisées.

Un détergent non-ionique approprié utilisé dans la composition selon l'invention est avantageusement choisi parmi le Tween 80 ou polysorbate 80 (polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate), le Tween 20 (polyoxyéthylènesorbitanne-monolaurate), le Triton X 100 (octoxinol 10) et le Pluronic F68 (polyéthylènepolypropylène glycol). De préférence, le Tween 80 ou le Triton X100 sont utilisés. Les détergents non ioniques peuvent également être combinés entre eux. De préférence, le détergent est présent à une concentration comprise entre 20 et 100 mg/l, de préférence entre 30 et 60 mg/l, de préférence entre 40 et 60 mg/1 et de préférence entre 40 et 50 mg/l. De préférence le détergent est le polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate (polysorbate 80).

Dans un mode de réalisation préféré, on utilise entre 30 et 60, de préférence entre 40 et 50mg/I de polysorbate 80, de préférence 50mg/I.

Dans un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention comprend, ou est de préférence constituée de - 100 g/l d'IgG

- 32 g/l de mannitol - 7 g/l de glycine - 50 mg/1 de polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate (polysorbate 80).
De préférence la composition de l'invention présente un pH de 4,6 0,2.

La composition d'IgG 10% selon l'invention peut comprendre, outre le mannitol, la glycine et un détergent non ionique, au moins un autre additif. Cet additif peut aussi bien représenter un composé choisi parmi les différentes catégories de stabilisants classiquement utilisés dans le domaine technique de l'invention, tels que les tensioactifs, les sucres et les acides aminés, qu'un excipient ajouté
à la

8 PCT/FR2009/052714 formulation afin d'en ajuster, par exemple, le pH, la force ionique etc.
Alternativement, la composition d'IgG 10% selon l'invention ne comprend pas d'autres excipients que lesdits mannitol, glycine et détergent non ionique.
Une telle composition d'IgG 10% exclusivement constituée de ces trois composés selon l'invention, présente l'avantage d'offrir une bonne stabilisation des compositions d'IgG 10% et une réduction des durées et des coûts de préparation à l'échelle industrielle grâce à la présence d'un nombre minimal efficace d'excipients ainsi que la présence d'une quantité minimale efficace d'excipients.
La composition selon l'invention est avantageusement sous forme liquide.

Dans le cadre de l'invention, les compositions d'IgG liquides signifient des solutions aqueuses de compositions d'IgG polyclonales, directement obtenues par fractionnement du plasma humain, Le milieu aqueux représente de l'eau pour préparation injectable (eau PPI) pouvant contenir des excipients pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec les IgG. Les compositions d'IgG peuvent au préalable subir des étapes spécifiques d'inactivation/élimination de virus, tel qu'un traitement solvant détergent, une pasteurisation et/ou une nanofiltration. La composition selon l'invention comprend des IgG qui peuvent être polyclonales ou monoclonales. Les IgG peuvent être isolées à partir du sang humain ou animal ou produites par d'autres moyens, par exemple par des techniques de biologie moléculaire, par exemple dans des systèmes cellulaires bien connus de l'homme du métier. La composition selon l'invention est particulièrement adaptée aux IgG hautement purifiées. Avantageusement, les IgG
de la présente invention sont obtenues par fractionnement du plasma humain.
Des méthodes de fractionnement préférées du plasma humain sont décrites par Cohn et al (J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946), Kistler et al. (Vox Sang., 7, 1962, 424), Steinbuch et al (Rev. Franç. Et. Clin. et Biol., XIV, 1054, 1969) et dans la demande de brevet WO 94/9334, ces documents sont incorporés par référence dans leur globalité. Une méthode de préparation d'une composition d'immunoglobulines G est également décrite dans la demande de brevet WO
02/092632, incorporée par référence dans sa globalité.

9 PCT/FR2009/052714 La composition d'IgG 10% de l'invention sous forme liquide et/ou sous forme lyophilisée peut en outre être à usage thérapeutique et notamment injectable par voie intraveineuse, parentérale ou sous-cutanée. La composition d'IgG 10% de l'invention, sous forme liquide après un stockage durant une période de 6 mois à
5 C ou à 25 C présente un taux de polymères bien en deçà des normes fixées par la Pharmacopée Européenne (3%), avantageusement inférieur à environ 0,3%.

La composition de l'invention peut être une composition pharmaceutique, c'est-à-dire adaptée à un usage thérapeutique.

Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.

LEGENDE DES FIGURES:

La figure 1 est un graphe représentant la mesure de la turbidité sur les compositions testées stressées et non stressées.

La figure 2 est un graphe représentant le pourcentage d'activité anti-HBs des lots durant les 6 mois de stabilité aux 2 températures de stockage par rapport à
T0.

La figure 3 est un graphe représentant l'activité anti-complémentaire des solutions après stress d'agitation ou sans stress (NS) en fonction de la dose de détergent ajoutée.

EXEMPLES :

Exemple I: Préparation des compositions d'IgG 10% à tester Une composition d'IgG a été obtenue selon la méthode développée par la Demanderesse dans la demande de brevet internationale WO 2007/077365 ou WO 02/092632. Cette composition, contenant environ 100 g/l d'IgG (IgG 10%), est ajustée à un pH compris entre 4,6 et 4,8.

A cette composition d'IgG 10%, on ajoute le mannitol, la glycine et le Polysorbate 80 seuls ou en mélange dans les concentrations précisées au Tableau 1.

10 PCT/FR2009/052714 Tableau 1: Caractéristiques des solutions test Composition en Composition F1 Composition F2 Composition F3 excipients IgG (g/I) 100 100 100 Glycine (g/I) 22,5 7 7 Mannitol (g/I) 0 32 32 Polysorbate 80 0 0 40 (g/I) pH final 4,6 0,1 4,6 0,1 4,6 0,1 Exemple 2 : Stress appliqués aux compositions Les compositions de l'exemple 1 (F1, F2 et F3) sont ensuite soumises à
différents essais de stress thermique, d'agitation et d'oxydation.

Le stress thermique est effectué selon la publication de P. Fernandes et al, Vox Sanguinis, 1980,39, p. 101-112. En résumé, des échantillons de 5 ml de solution test sont placés dans des flacons en verre sertis de 10 ml et sont ensuite chauffés au bain-marie à 60 C pendant 2 heures.

Le stress d'agitation est effectué comme décrit dans la publication de H.
Levine et al, Journal of Parental Science & technology, 1991, vol. 45, n 3, p. 160 165.
Ainsi, on place des échantillons de 5 ml de solution test dans des flacons en verre sertis de 10 ml protégés de la lumière, puis chaque flacon est mis en position couchée sur un agitateur IKA Vibrax XR (provenant de chez Fisher Scientific, France), et est ensuite agité à 500 tours par minute pendant 18 heures à température ambiante.

Le stress d'oxydation est réalisé sur des échantillons de 10 ml de solution test placés dans des flacons en verre de 30 ml. On ajout du peroxyde d'hydrogène (H202) dans chaque échantillon de manière à obtenir une concentration finale en

11 PCT/FR2009/052714 [H2O2] égale à 9 mM. Après bouchage et homogénéisation des flacons, ceux-ci sont incubés 1 h à 25 C.

Exemple 3 : mesure de la turbidité

Chacune des compositions de l'exemple 1 (F1, F2 et F3) est soumise ou non à un stress tel que défini à l'exemple 2. Une mesure de la turbidité est réalisée sur chaque échantillon. Plus les valeurs de turbidité mesurées sont faibles, plus les solutions d'IgG sont stables face au stress appliqué.

Les différents résultats de mesure obtenus après l'application des différents stress précédents, sont présentés dans le Tableau 2.

Tableau 2 Turbidité (NTU*) Solution test Avant stress Après stress Après stress Après stress d'agitation thermique d'oxydation F1 3,0 11,9 16,2 4,1 F2 2,8 12,4 13,8 4,5 F3 2,7 2,7 9,5 2,7 *NTU : Normalized Turbidity Units Les résultats montrent que la turbidité de la composition F3 est la seule à ne pas évoluer après les stress d'agitation et d'oxydation. C'est aussi la valeur la moins élevée après le stress thermique (Figure 1).

Exemple 4: Mesure de l'activité anti complémentaire (AAC) (Méthode 2.6.17 de la pharmacopée européenne)

12 PCT/FR2009/052714 Les compositions F1, F2 et F3, stressées ou pas, sont soumises au test d'AAC
(Méthode 2.6.17 de la pharmacopée européenne) avant et après chaque stress tel que décrit dans l'exemple 2. Ce test décrit l'aptitude des immunoglobulines à
activer le système du complément, une activation trop puissante du complément pouvant nuire à la tolérance du produit lors de son injection. Les solutions oxydées n'ont pas été données à analyser, la présence d'eau oxygénée perturbant le dosage.

Le tableau 3 présente les l'AAC des solutions avant et après stress.
Tableau 3 AAC (%) Solution test Avant stress Après stress Après stress d'agitation thermique Seule la formulation F3 est conforme à la norme de la Pharmacopée européenne au départ et après agitation. Les formulations F1 et F2 ont une AAC non conforme dans tous les cas étudiés.

Exemple 5 : aspect visuel Chacune des compositions de l'exemple 1 (F1, F2 et F3) sont soumises ou non à
un stress tel que défini à l'exemple 2. On observe ensuite au travers d'une mireuse pharmacopée (Méthode 2.9.20 de la pharmacopée européenne) l'aspect visuel de chacun des échantillons. L'aspect visuel permet de détecter la présence de particules de grandes tailles dans la composition. L'apparition de telles particules traduit une dénaturation de la solution protéique.

13 PCT/FR2009/052714 Tableau 4 Aspect visuel Solution test Avant stress Après stress Après stress Après d'agitation thermique oxydation F1 sans agrégats agrégats agrégats sans agrégats F2 sans agrégats agrégats agrégats sans agrégats F3 sans agrégats sans agrégats sans agrégats sans agrégats Seule la formulation F3 ne présente pas d'agrégats visibles dans tous les cas étudiés et supporte l'agitation et l'oxydation sans modification apparente.

Exemple 6 : Mesure DLS (Dynamic Light Scattering) Chacune des compositions de l'exemple 1 (F1, F2 et F3) sont soumises ou non à
un stress tel que défini à l'exemple 2. Les échantillons sont ensuite analysés dans un appareil mesurant la taille des particules par diffusion dynamique de la lumière (nanosizer Malvern). L'appareil permet de mesurer l'intensité de rayonnement de stokes émis par les particules de taille comprise entre 0,6 nm et 6 pm. Les particules > 100 nm correspondent aux agrégats de protéines. Le tableau 4 présente l'intensité relevée pour chaque échantillon pour des particules de taille >
100 nm (et < à 6 pm).

Tableau 5 DLS :% intensité des particules de taille > 100 nm Solution test Avant stress Après stress Après stress Après d'agitation thermique oxydation F l 0 40* 49* 0 F2 0 46* 77* 3

14 PCT/FR2009/052714 Seules les solutions oxydées et la formulation F3 agitée sont pratiquement identiques aux solutions non stressées.

* A noter que les valeurs obtenues pour F1 et F2 avec le stress d'agitation et le stress thermique sont erronées car elles ne prennent pas en compte les particules > 6 pm (limite haute des particules pouvant être détectées) présente dans les échantillons. Ces particules > 6 pm sont nombreuses et observées à l'ceil nu (voir exemple 4).

Exemple 7 : Stabilité des compositions (6 mois) Pour étudier la stabilité d'une formulation d'IgG selon l'invention, concentrée à
10%, 3 lots laboratoire (LLO1, LL02 et LL03, issus de différents lots d'IgG à
5%) ont été fabriqués et mis en stabilité à 5 C et 25 C pour une durée de 6 mois.

La formulation des lots est pratiquement telle que définie dans la composition de l'exemple 1 c'est-à-dire à une concentration finale en protéines de 100 g/l, en mannitol de 32 g/l, en glycine de 7 g/l et en polysorbate 80 de 40 + 5 mg/l.

Les mesures de turbidité et d'AAC sont effectuées et l'aspect visuel est évalué sur chacun des lots comme décrit dans les exemples précédents.

Quatre autres paramètres sont également mesurés au cours du temps : le dosage des anticorps contre l'antigène de surface de l'hépatite B (activité anti-HBs) selon la Pharmacopée Européenne (2.7.1), l'intégrité de la fonction Fc selon la Pharmacopée Européenne (2.7.9), le dosage de l'activateur de prékallikréine (pKa) et de la kallikréine et le dosage de la distribution de taille moléculaire (ou DTM).

Résultats :

= Turbidité, AAC, intégrité de la fonction Fc, teneurs en pKa et kallikréine et aspect visuel pour chaque lot LL01, LL02 et LL03 au cours du temps :

15 PCT/FR2009/052714 La turbidité, l'aspect, la fonction Fc, les teneurs en pré-kallikréine et kallikréine sont stables à 5 C et à 25 C dans les 3 lots et n'évoluent pas de manière significative.

Il n'y a par ailleurs, pas de variation significative des résultats d'activité
anti-complémentaire qui restent tous dans la norme de la Pharmacopée Européenne.

= Activité anti-HBs des lots LL01, LL02 et LL03 au cours du temps :

A chaque échéance, le pourcentage d'activité anti-HBs est calculé par rapport à
TO de la manière suivante :

Pourcentage d'activité (%/TO) = (100 X Tx)/T0 avec Tx = activité à l'échéance.

La figure 2 donne une représentation des résultats obtenus en pourcentage d'activité anti-HBs durant les 6 mois de stabilité aux 2 températures de stockage.
L'activité anti-HBs des solutions en stabilité à 25 C diminue dès 1 mois dans les 3 lots pour devenir non conforme aux spécifications internes fixées ( 20 %) pour les LL01 et LL03, tandis que l'activité anti-HBs n'évolue pas de manière significative à
5 C. Ce phénomène de baisse de l'activité anti-HBs est comparable à celui observé sur l'IgG 5 % et n'est donc pas lié à la concentration des Ig.

= DTM :

Malgré une légère hausse au cours du temps, notamment à 25 C, les taux de polymères et de fragments restent dans les limites d'alerte (< 1 % pour les polymères et < 3 % pour les fragments).

A 6 mois le taux des dimères avoisine les 10 % et reste aussi dans les limites d'alerte fixées (< 13 %).

En conclusion, les trois lots de laboratoire d'IgG 10 % sont stables 6 mois à
5 C et C sur les paramètres étudiés. On observe néanmoins une baisse de l'activité
25 anti-HBs à 25 C qui semble corrélée à l'augmentation du taux de fragments.

16 PCT/FR2009/052714 Exemple 8 : dose optimale de détergent Une étude quantitative du détergent est réalisée pour déterminer la dose optimale pour assurer la stabilité du produit.

On travaille sur des solutions à 100 g/l en protéines formulées à 7 g/l en glycine, 32 g/l en mannitol et à des doses croissantes de polysorbate 80 de 0 à 100 mg/1 par pas de 10 mg/1 (soit un total de 10 échantillons testés). Le pH de ces solutions est ajusté à 4,6.

Les mesures de turbidité et d'AAC sont effectuées et l'aspect visuel est évalué sur chaque échantillon comme décrit dans les exemples précédents.

= Turbidité et aspect visuel :

Seule la formulation sans polysorbate 80 présente une modification de son aspect visuel après agitation et une turbidité très élevée: il y a apparition d'agrégats.

= AAC :

Les résultats montrent que l'activité anti-complémentaire (AAC) est non conforme à la norme de la pharmacopée européenne pour les échantillons dosés à 10 et 20 mg/1 de polysorbate 80 (Figure 3).

Une limite inférieure de 30 mg/1 de polysorbate est donc retenue car l'activité anti-complémentaire reste conforme pour des concentrations supérieures à 30 mg/l.
Entre 40 et 100 mg/1 de polysorbate 80, l'activité anti-complémentaire, ainsi que tous les autres paramètres testés, restent constants.

Exemple 9 : Stabilité d'une formulation à 50mg/l polysorbate 80 Trois lots de la formulation suivante ont été préparés :
- 100 g/l d'IgG
- 32 g/l de mannitol

17 PCT/FR2009/052714 - 7 g/I de glycine - 50 mg/1 de polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate (polysorbate 80).
Le pH est ajusté à 4,6 0,2.

La stabilité de ces trois lots a été testée à 5 C et à 25 C, pendant 18 mois.
Pour cela, les paramètres suivants ont été contrôlés.

Tableau 6 :

analyses Valeurs attendues Aspect de la solution limpide ou légèrement opalescent, incolore ou légèrement jaune, sans particules visibles pH 4,6 0,2 Turbidité (NTU) pas d'évolution / To Polymères (%) < 1,0 %
Dimères (%) < 13,0 %
Monomères (%) NA
Fragments (%) < 3,0 %
AAC(%) <_50%
Anti-HBs (UI/ml) 20 % valeur à To IgG (g/I) pas d'évolution / To IgG1 (g/I) pas d'évolution / To IgG2 (g/I) pas d'évolution / To IgG3 (g/I) pas d'évolution / To IgG4 (g/I) pas d'évolution / To pKa (UI/ml) <_ 35 UI/ml Kallicréine (UI/ml) < 2 UI/ml Fonction Fc (%) >_ 60 %

Les trois lots se sont montrés stables à 5 C, les paramètres mesurés étant conformes aux spécifications de la Pharmacopée Européenne après 18 mois de stockage.

Les trois lots se sont montrés stables à 25 C également, les paramètres mesurés étant conformes aux spécifications de la Pharmacopée Européenne après 18 mois de stockage, seul le taux de fragments a présenté une hausse et l'activité
anti-HBs a présenté une baisse, mais qui reste conforme aux spécifications de la Pharmacopée Européenne.

Claims (13)

1. Composition d'immunoglobulines G comprenant du mannitol, de la glycine et un détergent non ionique, caractérisée en ce que la concentration en immunoglobulines G est de 100 g/l ~ 20g/l.

2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que la concentration en glycine est comprise entre 4 g/l et 10 g/l.

3. Composition selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la concentration en détergent non ionique est comprise entre 20 et 100 mg/l.

4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la concentration en mannitol est comprise entre 20 g/l et 50 g/l.

5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, sous forme liquide.

6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle les seuls excipients sont le mannitol, la glycine et ledit détergent non ionique.

7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le détergent non ionique est choisi parmi le polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate, le polyoyéthylènesorbitanne-monolaurate, l'octoxinol 10 et le polyéthylènepolypropylène glycol.

8. Composition selon la revendication 7, comprenant de 20 à 100 mg/l de polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate (polysorbate 80).

9. Composition selon la revendication 8, comprenant de 30 à 60 mg/l de polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate.

10. Composition selon la revendication 9, comprenant de 40 à 50mg/l de polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate, de préférence 50mg/l.

11. Composition selon la revendication 10, comprenant :

- 100 g/l d'IgG
- 32 g/l de mannitol - 7 g/l de glycine - 50 mg/l de polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate (polysorbate 80).

12. Composition selon la revendication 11, présentant un pH de 4,6 ~ 0,2.

13. Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que les immunoglobulines G sont obtenues par fractionnement du plasma humain.