FR3045387A1

FR3045387A1 - Composition d’immunoglobulines humaines concentrees

Info

Publication number: FR3045387A1
Application number: FR1562767A
Authority: FR
Inventors: Cecile Jaume
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2017-06-23
Also published as: WO2017103514A1

Abstract

L'invention propose une composition pharmaceutique comprenant entre 160 et 200 g/L d'immunoglobulines G (IgG), entre 150 et 300 mM de glycine et entre 30 et 100 ppm de détergent non ionique. Le pH de la composition est en outre compris entre 4,6 et 5,4.

Description

Composition d’immunoglobulines humaines concentrées L’invention a trait à une formulation d’immunoglobulines G humaines, utiles en thérapie.

De nombreuses pathologies sont actuellement traitées par des compositions d’immunoglobulines G (IgG). On peut citer par exemple les déficits immunitaires primitifs avec défaut de production d'anticorps, la maladie de Kawasaki, le purpura thrombopénique immunologique de l'enfant et de l'adulte, les déficits immunitaires secondaires avec défaut de production d'anticorps, en particulier la leucémie lymphoïde chronique ou myélome associés à des infections à répétition, l’infection de l'enfant par le VIH associé à des infections bactériennes, les neuropathies motrices multifocales, le syndrome de Guillain-Barré, les infections aiguës sévères ou chroniques à Parvovirus B19, l'immunodéficience acquise ou constitutionnelle, la dermatomyosite cortico-résistante, la myasthénie aiguë, la polyradiculonévrite chronique idiopathique, le purpura thrombopénique immunologique, par exemple associé à l'infection par le VIH, le syndrome de l'homme raide (Stiffman syndrome), la neutropénie auto-immune, l’érythroblastopénie auto-immune résistante, le syndrome d'anti-coagulation acquise par auto-anticorps, la polyarthrite rhumatoïde, les uvéites, etc.

Pour le traitement de certaines pathologies, l’utilisation de compositions d’IgG aptes à l'administration sous-cutanée (IgSC) peut s’avérer particulièrement avantageuse. Cette voie d’administration offre en effet plus de flexibilité et d'indépendance aux patients, améliorant leur qualité de vie. A cette fin, des compositions d’immunoglobulines comprenant de fortes concentrations en IgG ont été développées. Cependant, il est connu que plus la concentration en IgG augmente, plus les problèmes de stabilité dans le temps augmentent. Notamment, on constate une formation plus importante d’oligomères et polymères dans de telles compositions. Les oligomères et polymères sont susceptibles d'activer le système du complément avec des risques associés de réactions anaphylactiques. Ces oligomères et polymères sont également susceptibles d’induire des phénomènes d’hypotension chez les patients traités. Ceci n’est pas souhaitable et est strictement contrôlé du point de vue règlementaire. De plus, la formation d’agrégats protéiques, due notamment à un stress thermique, mécanique ou chimique, participe à ces problèmes d’instabilité. A ce jour, les compositions d’IgG concentrées, c’est-à-dire comprenant au moins 16% d’IgG, ne donnent pas entière satisfaction en termes de stabilité notamment.

Dans ce contexte, les besoins en compositions d'IgG à des concentrations élevées, d’utilisation aisée, persistent. Résumé de l’invention :

En travaillant sur les problèmes de stabilité propres aux compositions d'IgG concentrées, la Demanderesse a mis au point une formulation particulière, combinant outre des IgG, de la glycine et un détergent non-ionique, tel que le Tween 80, dans des ratios particuliers participant à une plus grande stabilité de ladite formulation dans le temps. Plus particulièrement, la formulation d’IgG développée peut comprendre entre 16 et 20% d’IgG. De manière surprenante et avantageuse, la Demanderesse a mis en évidence qu’il est possible d’obtenir des compositions d’IgG concentrées particulièrement stables dans le temps, présentant différentes concentrations d’IgG et plus particulièrement entre 16 et 20% d’IgG, en utilisant des quantités en glycine et détergent non-ionique identiques pour toutes ces concentrations d’IgG. Π n’est donc pas nécessaire d’adapter les concentrations en ces excipients en fonction de la concentration en IgG finale souhaitée. En outre, la Demanderesse a réussi à mettre au point des compositions d’immunoglobulines concentrées particulièrement adaptées aux injections, par exemple par voie sous-cutanée, qui présentent une osmolalité sensiblement physiologique, tout en minimisant le nombre et les quantités d’excipients. L’invention permet d’une manière générale de rationaliser et simplifier les procédés de production de ces différentes compositions, conduisant à un gain de temps et une réduction des coûts de production considérables. Avantageusement, aucun autre excipient n’est nécessaire, et notamment pas d’acétate ni de mannitol, pour garantir une stabilité durant le stockage.

Un objet de l’invention est donc une composition pharmaceutique comprenant : entre 160 et 200 g/L d’immunoglobulines G (IgG) entre 150 et 300 mM de glycine entre 30 et 100 ppm de détergent non ionique le pH de la composition étant compris entre 4,6 et 5,4.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition est seulement constituée d’eau, d’IgG, glycine et détergent non ionique.

La composition selon l’invention comprend avantageusement 16% (160 g/L), 18% (180 g/L) ou 20% (200 g/L) d’IgG. D’une manière générale, dans le contexte de l’invention, les concentrations en IgG s’entendent +/- 5% de la concentration en g/L.

Selon un mode de réalisation préféré, les IgG sont des IgG humaines, notamment obtenues à partir de plasma.

Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en glycine est de 215 mM, +/- 10%. Une telle concentration en glycine est particulièrement adaptée pour les compositions d’IgG 16-20% destinées à être injectées en sous-cutané.

Dans un mode de réalisation particulier, le détergent non-ionique est du polysorbate 80, préférentiellement à une concentration d’environ 80 ppm.

La composition selon l’invention est avantageusement une composition prête à l’emploi.

La composition selon l’invention est avantageusement sous une forme adaptée pour une administration sous cutanée ou intramusculaire, de préférence une administration sous-cutanée.

Description détaillée: Définitions

On entend par « Immunoglobulines G » ou « IgG » dans le cadre de l'invention, des immunoglobulines polyvalentes qui sont essentiellement des IgG, incluant éventuellement des IgM. Il peut s’agir d’immunoglobulines entières, ou de fragments tels que F(ab')2 ou F(ab) et toute fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des immunoglobulines polyvalentes.

Le terme « stabilité » correspond à la stabilité physique et/ou chimique des IgG. Le terme « stabilité physique » se réfère à la réduction ou l’absence de formation d’agrégats insolubles ou solubles des formes dimériques, oligomériques ou polymériques des Ig, ainsi qu’à la réduction ou l’absence de toute dénaturation structurale de la molécule. Le terme « stabilité chimique » se réfère à la réduction ou l’absence de toute modification chimique des IgG pendant le stockage, à l’état solide ou sous forme dissoute, dans des conditions accélérées. Par exemple, les phénomènes d’hydrolyse, déamidation, et/ou oxydation sont évités ou retardés. L’oxydation des acides aminés contenant du soufre est limitée. La stabilité d’une composition d’IgG peut s’évaluer par inspection visuelle à l’aide notamment d’un dispositif à fibre optique (opalescence, formation de particules), par mesure de la turbidité au moyen d’un spectrophotomètre mesurant l’absorbance ou densité optique à 400 nm, par exemple, et/ou par mesure de la lumière diffusée (« dynamic light scattering (DLS) ») permettant de mesurer les particules en solution de tailles comprises entre 1 nm et 1 pm environ.

Dans le contexte de l’invention, l’expression « compris entre x et y » signifie que les valeurs x et y sont incluses.

Formulations :

De préférence, la concentration en IgG est de 160 g/L, 180 g/L ou 200 g/L, +/- 5%. Bien entendu, toute concentration en IgG comprise entre 160 g/L et 200 g/L, +/- 5% (référencées ci-après compositions IgG 16-20%) peut être envisagée.

Dans le contexte de la présente invention, les concentrations s’entendent au niveau de la composition finale, prête à l’emploi. Les concentrations sont déterminées vis à vis des compositions sous forme liquide, avant dessication, ou après reconstitution sous forme de préparation injectable.

De manière particulièrement avantageuse, la Demanderesse a mis en évidence qu’il est possible d’obtenir des compositions comprenant 16%, 18% ou 20% d’IgG particulièrement stables dans le temps en utilisant les mêmes excipients, dans les mêmes concentrations d’une composition à l’autre. Ainsi, selon l’invention, les compositions d’IgG 16%-20% comprennent avantageusement entre 150 et 300 mM de glycine, de manière préférée entre 175 et 285 mM, préférentiellement entre 190 et 240 mM et plus préférentiellement entre 210 et 235 mM. Dans un mode de réalisation particulier, la composition d’IgG 16-20% comprend 215 mM de glycine, +/- 10%.

De même, les compositions d’IgG 16%-20% comprennent avantageusement entre 30 et 100 ppm de détergent non ionique, préférentiellement au moins 50 ppm de détergent non ionique, plus préférentiellement au moins 60 ppm, de manière encore préférée au moins 80 ppm.

Le détergent non ionique utilisé dans la composition selon l’invention est avantageusement choisi parmi les polysorbates et notamment parmi le polysorbate 80 (ou Tween®80 qui est du polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate), et le polysorbate 20 (ou Tween®20 qui est du polyoyéthylènesorbitanne-monolaurate). Eventuellement, le détergent non-ionique peut être choisi parmi le Triton® X 100 (octoxinol 10), poloxamères, polyoxyéthylène alkyl éthers, un bloc co-polymères d’éthylène/polypropylène et le Pluronic®F68 (polyéthylènepolypropylène glycol). Les détergents non ioniques peuvent également être combinés entre eux.

Selon un mode de réalisation préféré, la composition ne contient pas de mannitol. De même, selon un mode de réalisation préféré, la composition ne contient pas d’acétate. En effet, il a été montré que le mannitol et/ou l’acétate n’étaient pas nécessaires à la stabilisation d’une composition d’IgG 16-20%. Dans un autre mode de réalisation, la composition ne contient pas de sucre.

De manière avantageuse, la Demanderesse a mis en évidence que de telles compositions concentrées et stables présentent une osmolalité particulièrement adaptée à l’administration par injection, notamment sous-cutanée, et cela sans ajout en nombre et/ou quantités d’excipients. Ainsi, l’invention propose des compositions d’IgG 16-20% présentant une osmolalité mesurée comprise entre 270 et 310 mOsm/kg environ, ajustée par la glycine. Dans le contexte de l’invention, et sauf mention contraire, l’osmolalité de la composition s’entend de l’osmolalité mesurée dans ladite composition. L’osmolalité est avantageusement mesurée à l’aide d’un osmomètre calibré avec des solutions étalons, et notamment selon la méthode préconisée par la Pharmacopée Européenne, (Pharmacopée Européenne 5.0 de 2005 -01/2005:2.2.35.). Bien entendu, toute autre méthode de mesure de l’osmolalité peut être utilisée.

Dans un mode de réalisation préféré, les seuls excipients de la composition d’IgG 16-20% selon l’invention, sont la glycine et le détergent non-ionique. Une telle formulation permet une bonne stabilisation des compositions d’immunoglobulines et une réduction des durées et des coûts de préparation à l'échelle industrielle grâce à la présence d'un nombre et d’une quantité minimums efficaces d’excipients. Avantageusement, une telle composition présente une osmolalité compatible avec l’administration par injection, notamment par voie sous-cutanée.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition consiste essentiellement en des IgG, de la glycine, un détergent non-ionique et de l’eau, en ce sens que tout autre excipient qui pourrait être présent ne le serait qu’à l’état de trace.

Selon l’invention, le pH final de la composition est avantageusement compris entre 4,6 et 5,4. Préférentiellement, le pH est d’environ 4,7-5,1, encore plus préférentiellement entre 4,8-5,0. Un pH de 4,8-5,0 donne en effet des résultats particulièrement satisfaisants en termes de stabilité dans le temps. Le pH final s’entend du pH de la composition après formulation, c’est-à-dire dans la composition prête à l’emploi. Sauf mention contraire, dans la présente description, le pH de la composition désigne le pH final.

Une composition d’IgG 16%, 18% ou 20% préférée selon l’invention comprend : environ 215 mM de glycine au moins 50 ppm de polysorbate 80, préférentiellement au moins 60 ppm, de manière encore préférée au moins 80 ppm le pH de la composition étant de 4,8-5,0.

Une autre composition d’IgG 16%, 18% ou 20% préférée selon l’invention comprend : environ 250 mM de glycine au moins 50 ppm de polysorbate 80, préférentiellement au moins 60 ppm, de manière encore préférée au moins 80 ppm le pH de la composition étant de 4,8-5,0.

Une autre composition d’IgG 16%, 18% ou 20% préférée selon l’invention comprend : environ 285 mM de glycine au moins 50 ppm de polysorbate 80, préférentiellement au moins 60 ppm, de manière encore préférée au moins 80 ppm le pH de la composition étant de 4,8-5,0.

Une composition particulièrement préférée selon l’invention comprend :

- 160 g/L d’IgG environ 215 mM de glycine au moins 80 ppm de polysorbate 80 le pH de la composition étant de 4,8-5,0. L’osmolalité mesurée de cette composition à 16% d’IgG est avantageusement d’environ280 mOsm/kg, +/- 2%.

Une autre composition particulièrement préférée selon l’invention comprend :

- 180 g/L d’IgG environ 215 mM de glycine au moins 80 ppm de polysorbate 80 le pH de la composition étant de 4,8-5,0. L’osmolalité mesurée de cette composition à 18% d’IgG est avantageusement d’environ290 mOsm/kg, +/- 2%.

- 200 g/L d’IgG environ 215 mM de glycine au moins 80 ppm de polysorbate 80 le pH de la composition étant de 4,8-5,0. L’osmolalité mesurée de cette composition à 20% d’IgG est avantageusement d’environ 300 mOsm/kg, +/- 2%.

De manière surprenante et avantageuse, la demanderesse a mis en évidence qu’une concentration en glycine d’environ 215 mM, +/- 5% combinée à une concentration en polysorbate 80 d’au moins 50 ppm, est suffisante pour maintenir la composition d’immunoglobulines 16-20% stable tout en maintenant une osmolalité comprise entre 270 et 310 mOsm/kg dans la composition d’IgG 16-20%, alors que des concentrations supérieures auraient été attendues pour garantir la stabilité, augmentant parallèlement l’osmolalité desdites compositions. Or, une trop forte osmolalité peut être à l’origine d’une déshydratation des cellules (sortie de l’eau intracellulaire vers le milieu extracellulaire) préjudiciable au patient.

Les compositions selon l’invention comprennent avantageusement des immunoglobulines G humaines. Les IgG humaines sont généralement obtenues par fractionnement du plasma sanguin humain, et présentées dans un milieu aqueux. Le milieu aqueux est composé d'eau pour préparation injectable (eau PPI) pouvant contenir des excipients pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec les IgG. Les compositions d'IgG peuvent au préalable subir des étapes spécifiques d'inactivation/élimination de virus, tel qu’un traitement solvant détergent, une pasteurisation et/ou une nanofiltration. La composition selon l’invention comprend des IgG qui peuvent être polyclonales ou monoclonales. Les IgG peuvent être isolées à partir du sang humain ou animal ou produites par d’autres moyens, par exemple par des techniques de biologie moléculaire, par exemple dans des systèmes cellulaires bien connus de l’homme du métier. La composition selon l’invention est particulièrement adaptée aux IgG hautement purifiées. Avantageusement, les IgG de la présente invention sont obtenues par fractionnement du plasma humain. Des méthodes de fractionnement préférées du plasma humain sont décrites par Cohn et al (J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946), Kistler et al. (Vox Sang., 7, 1962, 414-424), Steinbuch et al (Rev. Franç. Et. Clin, et Biol., XIV, 1054, 1969) et dans la demande de brevet WO 94/9334. Une méthode de préparation d’une composition d’immunoglobulines G est également décrite dans la demande de brevet WO 02/092632.

Les compositions selon l’invention sont avantageusement sous forme liquide. La composition d'IgG 16-20% selon l’invention, sous forme liquide et après un stockage durant une période de 6 mois à 25°C présente un taux de polymères bien inférieur au taux maximum autorisé fixés par la Pharmacopée Européenne (3%), avantageusement inférieur à environ 1%.

Les compositions de l’invention peuvent être des compositions pharmaceutiques, c'est-à-dire adaptées à un usage thérapeutique. Les compositions pharmaceutiques de l’invention sont ainsi utiles comme médicaments, notamment afin de traiter les déficits immunitaires primitifs avec défaut de production d'anticorps, la maladie de Kawasaki, le purpura thrombopénique immunologique de l'enfant et de l'adulte, les déficits immunitaires secondaires avec défaut de production d'anticorps, en particulier la leucémie lymphoïde chronique ou myélome associés à des infections à répétition, l’infection de l'enfant par le VIH associé à des infections bactériennes, les neuropathies motrices multifocales, le syndrome de Guillain-Barré, les infections aiguës sévères ou chroniques à Parvovirus B19, l'immunodéficience acquise ou constitutionnelle, la dermatomyosite cortico-résistante, la myasthénie aiguë, la polyradiculonévrite chronique idiopathique, le purpura thrombopénique immunologique, par exemple associé à l'infection par le VIH, le syndrome de l'homme raide (Stiffman syndrome), la neutropénie auto-immune, l’erythroblastopénie auto-immune résistante, le syndrome d'anti-coagulation acquise par auto-anticorps, la polyarthrite rhumatoïde, les uvéites.

Les compositions selon l’invention peuvent également subir une dessiccation pour obtenir une forme solide qui se conserve plus longtemps et est plus pratique pour le transport et la commercialisation. La dessiccation est un procédé d'élimination de l'eau à un stade poussé. Il s'agit d'une déshydratation visant à éliminer autant d'eau que possible. Ce phénomène peut être naturel ou forcé. Cette dessiccation peut être réalisée à l’aide des techniques de lyophilisation, d’atomisation et de cryoatomisation. Le mode préféré d’obtention de la forme solide des compositions selon l’invention est la lyophilisation. Les méthodes de lyophilisation sont bien connues de l’homme du métier, voir par exemple [Wang et al, Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1-60,2000]. D’autres procédés appropriés pour réduire le degré d’humidité ou la teneur en eau de ces compositions sont envisageables. De préférence le degré d’humidité est inférieur ou égal à 3% en poids, de préférence inférieur ou égal à 2,5%, de préférence inférieur ou égal à 2%, de préférence inférieur ou égal à 1,5%.

Les compositions selon l’invention peuvent être avantageusement soumises à une méthode d’élimination ou d’inactivation des agents infectieux, par exemple par chauffage à sec du lyophilisât.

Les compositions solides selon l’invention, de préférence sous forme lyophilisée, peuvent être dissoutes dans de l’eau pour préparations injectables (ou « water for injection ou WFI »), pour obtenir des formulations à usage thérapeutique.

Voies d’administration :

La composition d'IgG 16-20% selon l’invention est utile en thérapie, et notamment sous forme injectable, non seulement par voie intraveineuse, mais de manière plus intéressante, par voie sous-cutanée ou intramusculaire.

La voie sous-cutanée pour le traitement de maladies auto-immunes chroniques présente plusieurs avantages comme l'amélioration du confort du patient et une diminution des effets secondaires. L'administration sous-cutanée ne nécessite pas d'accès veineux ce qui constitue, dans certains cas, un avantage décisif lorsque l'absence d'abord veineux bloque l'accès au traitement, notamment pour les jeunes enfants. L'usage des immunoglobulines par voie sous-cutanée réduit également certains effets secondaires associés aux perfusions par voie intraveineuse, en particulier le risque de réactions systémiques. Les grandes variations de taux circulants observées par voie intraveineuse sont évitées, permettant une meilleure régulation du taux sérique dans la fourchette physiologique entre les perfusions. En dépit d'une biodisponibilité naturellement plus faible par la voie sous-cutanée, les immunoglobulines administrées par voie sous-cutanée (IgSC) ont une efficacité au moins équivalente à celle des immunoglobulines administrées par voie intraveineuse (IglV).

Enfin, la disponibilité des IgSC pour le traitement à domicile constitue un avantage important sinon décisif pour certains traitements. Elle offre plus de flexibilité et d'indépendance au patient, améliorant la qualité de vie des patients. L'accroissement de la concentration contribue au confort du patient en réduisant la fréquence d'injection. La concentration de l'IgSC est une caractéristique déterminante qui conditionne le volume d'injection et nombre de sites d'injection et en conséquence la fréquence d'administration.

Les exemples suivants illustrent l’invention sans en limiter la portée.

Exemples : Tests comparatifs entre différentes compositions d’IsG 16%. 18%. 20%

Une composition d’immunoglobulines G est préparée selon le procédé tel que décrit dans la demande EP1385886. Le produit obtenu est ensuite concentré à 160, 180 ou 200 g/L par ultrafiltration sur membrane en cellulose Ultracel C (Millipore®) de seuil de coupure 30 kDa afin d’obtenir le produit prêt à formuler (PPF). A/ Influence de la quantité de polysorbate 80 sur la stabilité de la composition

Les produits concentrés à 160 ou 200 g/L prêts à formuler sont additionnés de glycine, de polysorbate 80 et ajustés au pH désiré afin d’obtenir les compositions suivantes :

Tableau 1 : Compositions d’IgG 16%, 18%, 20% comprenant 285 mM de glycine et entre 0 et 100 ppm de polysorbate 80

Les compositions sont soumises à un stress d’agitation (stirring stress) sur plaque magnétique à 500 rpm pendant 8, 24, 48 ou 72h, les différentes analyses effectuées ensuite sont les suivantes : • Inspection visuelle : opalescence, couleur et formation de particules visibles sont déterminées par inspection visuelle effectuée avec une mireuse Pharmacopée Européenne en utilisant des standards de couleur de la Pharmacopée Européenne 2.2.2

Les résultats obtenus sont les suivants :

Tableau 2 : Inspection visuelle avant et après 8h de stress d’agitation (stirring)

Légende: Opalescence: Op: Opalescent; S Op: légèrement Opalescent, V S Op: très légèrement Opalescent; V Op: très Opalescent

Particules: 0: sans particules ; 1: peu de particules; 2: particules; 3: nombreuses particules; 4: très nombreuses particules

Après 8h de stress d’agitation, les résultats montrent, qu’à la fois pour les compositions comprenant 160 g/L et 200 g/L d’immunoglobulines, l’absence de polysorbate 80 favorise les phénomènes d’opalescence et de formation de particules. Une quantité minimale de 20 ppm de polysorbate 80 est nécessaire en présence de glycine (285 MmM) pour stabiliser la composition. Pour des concentrations en polysorbate 80 comprises entre 30 et 100 ppm, les résultats montrent une opalescence et des niveaux de particules comparables et ce, quelle que soit la concentration en immunoglobulines (160 g/L et 200 g/L).

Une concentration de polysorbate 80 comprise entre 30 et 100 ppm est donc efficace pour assurer la stabilité de la composition d’immunoglobulines à 160 g/L ou 200 g/L en présence de glycine (285 mM). • Turbidité (DO à 400nm) : la turbidité est déterminée par mesure de l’absorbance à 400 nm. De l’eau pour injection est utilisée comme blanc.

Les résultats obtenus sont les suivants :

Tableau 3 : Mesure de DO à 400 nm avant et après 8h de stress d’agitation

Les résultats montrent une légère augmentation de la DO à 400 nm (d’environ 2 fois par rapport à la valeur à T0) en présence de 30-100 ppm de polysorbate 80.

Une concentration de polysorbate 80 comprise entre 30 et 100 ppm est donc efficace pour assurer la stabilité de la composition d’immunoglobulines à 160 g/L ou 200 g/L en présence de glycine (285 mM). • DLS/SLS : cette technique suit l’état d’agrégation de la solution. La DLS (dynamic light scattering) donne la mesure de la taille (diamètre hydrodynamique) des objets en solution, approximativement entre lnm et lpm. Chaque population de taille est ainsi suivie. La SLS (static light scattering) suit le phénomène d’agrégation dans son ensemble. La mesure est effectuée par ajout de 40 mM de NaCl à la solution. La mesure est effectuée sur échantillon dilué à 80 g/L en eau pour injection.

Les résultats obtenus sont les suivants :

Tableau 4: Intensité des monomères à 90° (%) avant et après 24h, 48h et 72h de stress d’agitation (stirring).

Tableau 5: Intensité totale diffusée à 90° (u.a) avant et après 24h, 48h et 72h de stress d’agitation (stirring).

Les résultats montrent, pour les compositions comprenant 160 g/L et 200 g/L d’immunoglobulines, que l’absence ou la faible quantité de polysorbate 80 favorise la diminution des formes monomères et la formation de formes agrégées. Une quantité supérieure à 20 ppm de polysorbate 80 est nécessaire en présence de glycine (285 mM) pour stabiliser la composition. Après 24h de stress d’agitation (stirring), pour des concentrations en polysorbate 80 comprises entre 30 et 100 ppm, les résultats ne montrent pas de différence significative et ce, quelle que soit la concentration en immunoglobulines (160 g/L et 200 g/L). Le degré d’intensité de monomère et l’intensité globale sont similaires au sein de chaque concentration d’immunoglobulines (160 g/L ou 200 g/L).

Une concentration de polysorbate 80 comprise entre 30 et 100 ppm est donc efficace pour assurer la stabilité de la composition d’immunoglobulines à 160 g/L ou 200 g/L en présence de glycine (285 mM). • Particules subvisibles (MFI) : les particules subvisibles supérieures à 2 pm, 10 pm et 25 pm sont comptées en utilisant la technique d’imagerie microfluidique.

Les résultats obtenus sont les suivants :

Tableau 6 : Particules subvisibles mesurées par MFI avant et après 8h de stress d’agitation (stirring).

Les résultats montrent, pour les compositions comprenant 160 g/L et 200 g/L d’immunoglobulines, que l’absence ou la faible quantité de polysorbate 80 favorise une importante formation de particules subvisibles (agrégats et polymères). Une quantité supérieure à 20 ppm de polysorbate 80 est nécessaire en présence de glycine (285 mM) pour stabiliser la composition. Une protection équivalente contre l’agrégation est obtenue avec des concentrations comprises entre 30 et 100 ppm de polysorbate 80 et ce, quelle que soit la concentration en immunoglobulines (160 g/L et 200 g/L). Une concentration de polysorbate 80 comprise entre 30 et 100 ppm est donc efficace pour assurer la stabilité de la composition d’immunoglobulines à 160 g/L ou 200 g/L en présence de glycine (285 mM).

Conclusion ; les résultats obtenus par différentes méthodes analytiques complémentaires démontrent qu’une concentration de polysorbate 80 comprise entre 30 et 100 ppm est efficace pour assurer la stabilité de la composition d’immunoglobulines à 160 g/L ou 200 g/L en présence de glycine (285 mM). B/ Influence de la quantité de glycine sur la stabilité de la composition

Les produits concentrés à 160, 180 ou 200 g/L prêts à formuler sont additionnés de glycine, de polysorbate 80 et ajustés au pH désiré afin d’obtenir les compositions suivantes :

Tableau 7 : Compositions d’IgG 16%, 18%, 20% comprenant entre 215 et 285 mM de glycine et 80 ppm de polysorbate 80

Les compositions sont soumises à 2 différents types de stress : o un stress d’agitation (stirring stress) sur plaque magnétique à 500 rpm pendant 8, 24, 48 ou 72h o un stress thermique (heating stress) par chauffage en bain thermostaté à 55°C pendant lh

Les différentes analyses effectuées sont les suivantes : • Inspection visuelle : opalescence, couleur et formation de particules visibles sont déterminées par inspection visuelle effectuée avec une mireuse Pharmacopée Européenne en utilisant des standards de couleur de la Pharmacopée Européenne 2.2.2

Les résultats obtenus sont les suivants :

Tableau 8 : Inspection visuelle avant et après stress d’agitation (stirring) ou stress thermique

Légende:

Opalescence: Op: Opalescent; S Op: légèrement Opalescent, V S Op: très légèrement Opalescent; V Op: très Opalescent Particules: 0: sans particules; 1: peu de particules; 2: particules; 3: nombreuses particules; 4: très nombreuses particules

Les résultats ne montrent aucune évolution en stress thermique par rapport au TO, alors qu’en stress d’agitation, on note l’apparition de quelques particules. On n’observe pas de différence significative entre les compositions comprenant différentes concentrations de glycine (215 à 285 mM).

Des concentrations de glycine comprises entre 215 et 285 mM sont donc adaptées à des formulations comprenant du polysorbate 80 afin d’assurer une bonne stabilité des compositions. • Turbidité (DO à 400 nm) : la turbidité est déterminée par mesure de l’absorbance à 400nm. De l’eau pour injection est utilisée comme blanc.

Les résultats obtenus sont les suivants :

Tableau 9 : Mesure de DO à 400 nm avant et après stress thermique et stress d’agitation

Les résultats montrent après le stress thermique une légère augmentation de la turbidité sans distinction entre les différentes compositions à différentes concentrations de glycine.

Après les stress d’agitation, on note une hétérogénéité des résultats qui s’explique par l’hétérogénéité du stress d’agitation. La concentration la plus faible en glycine (215 mM) semble réduire la turbidité, en particulier sur la composition ayant la plus forte concentration en immunoglobulines (200 g/L). • DLS/SLS : cette technique suit l’état d’agrégation de la solution. La DLS (dynamic light scattering) donne la mesure de la taille (diamètre hydrodynamique) des objets en solution, approximativement entre lnm et lpm. Chaque population de taille est ainsi suivie. La SLS (static light scattering) suit le phénomène d’agrégation dans son ensemble. La mesure est effectuée par ajout de 40 mM de NaCl à la solution. La mesure est effectuée sur échantillon dilué à 80 g/L en eau pour injection.

Les résultats obtenus sont les suivants :

Tableau 10 : Mesure du pourcentage de monomères et de l’intensité totale après lh, 8h et 24h de stress thermique

Les résultats montrent après le stress thermique une diminution des formes monomères et une augmentation de l’intensité totale avec l’augmentation de la concentration en immunoglobulines. Aucune différence significative n’est observée entre les différentes compositions à différentes concentrations de glycine.

Après 8h de stress d’agitation, le niveau des monomères décroît d’environ 50% sans différence significative entre les compositions. Après 24h de stress d’agitation en revanche, révolution du pourcentage de monomères et de l’intensité globale montrent une moindre agrégation à 215 mM de glycine pour les compositions à 160 et 200 g/L d’immunoglobulines, et à 250 mM de glycine pour la composition à 180 g/L. L’hétérogénéité des résultats entre les différentes compositions d’immunoglobulines (160, 180 et 200 g/L) s’explique par la non homogénéité du stress d’agitation.

Les résultats montrent qu’une concentration de 215mM de glycine dans une composition comprenant du polysorbate 80 permet d’assurer la stabilité de cette composition. C/ Compositions mises en stabilité long terme

Les produits concentrés à 160, 180 ou 200 g/L prêts à formuler sont additionnés de glycine, de polysorbate 80 et ajustés au pH désiré afin d’obtenir les compositions suivantes pour mise en stabilité :

Tableau 11 : Compositions d’IgG 16%, 18% et 20% comprenant 215 mM de glycine et 80 ppm de polysorbate 80

Après filtration stérilisante sur filtre 0.22pm (Sartopore), les compositions sont réparties aseptiquement en flacons verre (type I), qui sont ensuite bouchés et entreposés à l’envers, dans une enceinte régulée à • 5° ±3°C, • 25°C ±2°C / humidité résiduelle 60% ±5%, • 30°C ±2°C / humidité résiduelle 65% ±5% ou,

• 40°C ±2°C

Les différentes analyses effectuées sont les suivantes : • Inspection visuelle : opalescence et formation de particules visibles sont déterminées par inspection visuelle effectuée avec une mireuse Pharmacopée Européenne • pH : l’évolution du pH peut être signe de la dégradation du produit. Le pH est mesuré directement dans la solution • Concentration en protéines totales : l’absorbance à 280nm permet selon la loi de Beer-Lambert de déterminer la concentration en protéines totales dans la formulation. L’essai est effectué en triplicate, dans des microcellules UV après dilution au 1/400 en eau pour injection par pesée des échantillons. Le coefficient d’extinction moléculaire pour le produit est 1.4 L/g/cm. • Turbidité (DO à 400 nm) : la turbidité est déterminée par mesure de l’absorbance à 400 nm. De l’eau pour injection est utilisée comme blanc. • DLS/SLS : cette technique suit l’état d’agrégation de la solution. La DLS (dynamic light scattering) donne la mesure de la taille (diamètre hydrodynamique) des objets en solution, approximativement entre 1 nm et 1 pm. Chaque population de taille est ainsi suivie. La SLS (static light scattering) suit le phénomène d’agrégation dans son ensemble. La mesure est effectuée par ajout de 40 mM de naCl à la solution. La mesure est effectuée sur échantillon dilué à 80 g/L en eau pour injection. • Particules subvisibles (MFI) : les particules subvisibles supérieures à 2 pm, 10 pm et 25 pm sont comptées en utilisant la technique d’imagerie microfluidique. • HPSEC : la chromatographie par exclusion de taille haute performance est utilisée pour évaluer le niveau de fragmentation et d’aggrégation du produit. L’analyse du chromatogramme des mesures de densité optique à 208 nm détermine le % de monomères, dimères, polymères et fragments.

Les résultats obtenus pour la composition I16G215T à 160 g/L d’immunoglobulines sont les suivants :

Tableau 12 : Résultats de stabilité à 5°C à TO et T3mois pour la composition I16G215T

Tableau 13 : Résultats de stabilité à 25°C à TO et T3mois pour la composition I16G215T

Tableau 14 : Résultats de stabilité à 30°C à TO et T3mois pour la composition I16G215T

Tableau 15 : Résultats de stabilité à 40°C à TO et T3mois pour la composition I16G215T

Les résultats obtenus pour la composition I18G215T à 180 g/L d’immunoglobulines sont les suivants :

Tableau 16 : Résultats de stabilité à 5°C à T0 et T3mois pour la composition I18G215T

Tableau 18 : Résultats de stabilité à 25°C à T0 et T3mois pour la composition I18G215T

Tableau 19 : Résultats de stabilité à 30°C à TO et T3mois pour la composition I18G215T

Tableau 20 : Résultats de stabilité à 40°C à TO et T3mois pour la composition I18G215T

Les résultats obtenus pour la composition I20G215T à 200 g/L d’immunoglobulines sont les suivants :

Tableau 21 : Résultats de stabilité à 5°C à ΤΟ, T3 et T6mois pour la composition I20G215T

Tableau 22 : Résultats de stabilité à 25°C à ΤΟ, T3 et T6mois pour la composition I20G215T

Tableau 23 : Résultats de stabilité à 30°C à ΤΟ, T3 et T6mois pour la composition I20G215T

Tableau 24 : Résultats de stabilité à 40°C à ΤΟ, T3 et T6mois pour la composition I20G215T

Les tests à 40°C permettent d’accélérer les phénomènes observés lors de la mise en stabilité des compositions du fait du fort stress appliqué. Les méthodes utilisées montrent bien une évolution des critères suivis, confirmant la pertinence des méthodes sélectionnées pour l’évaluation des formulations lors du suivi de stabilité.

Les résultats montrent que les 3 compositions à 160, 180 et 200 g/L d’immunoglobulines comprenant 80 ppm de polysorbate 80 et 215 mM à pH 5,0 sont stables au moins sur 3 mois à 25°C comme à 30°C.

Claims

Composition d’immunoglobulines humaines concentrées L’invention a trait à une formulation d’immunoglobulines G humaines, utiles en thérapie. De nombreuses pathologies sont actuellement traitées par des compositions d’immunoglobulines G (IgG). On peut citer par exemple les déficits immunitaires primitifs avec défaut de production d'anticorps, la maladie de Kawasaki, le purpura thrombopénique immunologique de l'enfant et de l'adulte, les déficits immunitaires secondaires avec défaut de production d'anticorps, en particulier la leucémie lymphoïde chronique ou myélome associés à des infections à répétition, l’infection de l'enfant par le VIH associé à des infections bactériennes, les neuropathies motrices multifocales, le syndrome de Guillain-Barré, les infections aiguës sévères ou chroniques à Parvovirus B19, l'immunodéficience acquise ou constitutionnelle, la dermatomyosite cortico-résistante, la myasthénie aiguë, la polyradiculonévrite chronique idiopathique, le purpura thrombopénique immunologique, par exemple associé à l'infection par le VIH, le syndrome de l'homme raide (Stiffman syndrome), la neutropénie auto-immune, l’érythroblastopénie auto-immune résistante, le syndrome d'anti-coagulation acquise par auto-anticorps, la polyarthrite rhumatoïde, les uvéites, etc. Pour le traitement de certaines pathologies, l’utilisation de compositions d’IgG aptes à l'administration sous-cutanée (IgSC) peut s’avérer particulièrement avantageuse. Cette voie d’administration offre en effet plus de flexibilité et d'indépendance aux patients, améliorant leur qualité de vie. A cette fin, des compositions d’immunoglobulines comprenant de fortes concentrations en IgG ont été développées. Cependant, il est connu que plus la concentration en IgG augmente, plus les problèmes de stabilité dans le temps augmentent. Notamment, on constate une formation plus importante d’oligomères et polymères dans de telles compositions. Les oligomères et polymères sont susceptibles d'activer le système du complément avec des risques associés de réactions anaphylactiques. Ces oligomères et polymères sont également susceptibles d’induire des phénomènes d’hypotension chez les patients traités. Ceci n’est pas souhaitable et est strictement contrôlé du point de vue règlementaire. De plus, la formation d’agrégats protéiques, due notamment à un stress thermique, mécanique ou chimique, participe à ces problèmes d’instabilité. A ce jour, les compositions d’IgG concentrées, c’est-à-dire comprenant au moins 16% d’IgG, ne donnent pas entière satisfaction en termes de stabilité notamment. Dans ce contexte, les besoins en compositions d'IgG à des concentrations élevées, d’utilisation aisée, persistent. Résumé de l’invention : En travaillant sur les problèmes de stabilité propres aux compositions d'IgG concentrées, la Demanderesse a mis au point une formulation particulière, combinant outre des IgG, de la glycine et un détergent non-ionique, tel que le Tween 80, dans des ratios particuliers participant à une plus grande stabilité de ladite formulation dans le temps. Plus particulièrement, la formulation d’IgG développée peut comprendre entre 16 et 20% d’IgG. De manière surprenante et avantageuse, la Demanderesse a mis en évidence qu’il est possible d’obtenir des compositions d’IgG concentrées particulièrement stables dans le temps, présentant différentes concentrations d’IgG et plus particulièrement entre 16 et 20% d’IgG, en utilisant des quantités en glycine et détergent non-ionique identiques pour toutes ces concentrations d’IgG. Π n’est donc pas nécessaire d’adapter les concentrations en ces excipients en fonction de la concentration en IgG finale souhaitée. En outre, la Demanderesse a réussi à mettre au point des compositions d’immunoglobulines concentrées particulièrement adaptées aux injections, par exemple par voie sous-cutanée, qui présentent une osmolalité sensiblement physiologique, tout en minimisant le nombre et les quantités d’excipients. L’invention permet d’une manière générale de rationaliser et simplifier les procédés de production de ces différentes compositions, conduisant à un gain de temps et une réduction des coûts de production considérables. Avantageusement, aucun autre excipient n’est nécessaire, et notamment pas d’acétate ni de mannitol, pour garantir une stabilité durant le stockage. Un objet de l’invention est donc une composition pharmaceutique comprenant : entre 160 et 200 g/L d’immunoglobulines G (IgG) entre 150 et 300 mM de glycine entre 30 et 100 ppm de détergent non ionique le pH de la composition étant compris entre 4,6 et 5,4. Dans un mode de réalisation particulier, la composition est seulement constituée d’eau, d’IgG, glycine et détergent non ionique. La composition selon l’invention comprend avantageusement 16% (160 g/L), 18% (180 g/L) ou 20% (200 g/L) d’IgG. D’une manière générale, dans le contexte de l’invention, les concentrations en IgG s’entendent +/- 5% de la concentration en g/L. Selon un mode de réalisation préféré, les IgG sont des IgG humaines, notamment obtenues à partir de plasma. Dans un mode de réalisation particulier, la concentration en glycine est de 215 mM, +/- 10%. Une telle concentration en glycine est particulièrement adaptée pour les compositions d’IgG 16-20% destinées à être injectées en sous-cutané. Dans un mode de réalisation particulier, le détergent non-ionique est du polysorbate 80, préférentiellement à une concentration d’environ 80 ppm. La composition selon l’invention est avantageusement une composition prête à l’emploi. La composition selon l’invention est avantageusement sous une forme adaptée pour une administration sous cutanée ou intramusculaire, de préférence une administration sous-cutanée. Description détaillée: Définitions On entend par « Immunoglobulines G » ou « IgG » dans le cadre de l'invention, des immunoglobulines polyvalentes qui sont essentiellement des IgG, incluant éventuellement des IgM. Il peut s’agir d’immunoglobulines entières, ou de fragments tels que F(ab')2 ou F(ab) et toute fraction intermédiaire obtenue au cours du procédé de fabrication des immunoglobulines polyvalentes. Le terme « stabilité » correspond à la stabilité physique et/ou chimique des IgG. Le terme « stabilité physique » se réfère à la réduction ou l’absence de formation d’agrégats insolubles ou solubles des formes dimériques, oligomériques ou polymériques des Ig, ainsi qu’à la réduction ou l’absence de toute dénaturation structurale de la molécule. Le terme « stabilité chimique » se réfère à la réduction ou l’absence de toute modification chimique des IgG pendant le stockage, à l’état solide ou sous forme dissoute, dans des conditions accélérées. Par exemple, les phénomènes d’hydrolyse, déamidation, et/ou oxydation sont évités ou retardés. L’oxydation des acides aminés contenant du soufre est limitée. La stabilité d’une composition d’IgG peut s’évaluer par inspection visuelle à l’aide notamment d’un dispositif à fibre optique (opalescence, formation de particules), par mesure de la turbidité au moyen d’un spectrophotomètre mesurant l’absorbance ou densité optique à 400 nm, par exemple, et/ou par mesure de la lumière diffusée (« dynamic light scattering (DLS) ») permettant de mesurer les particules en solution de tailles comprises entre 1 nm et 1 pm environ. Dans le contexte de l’invention, l’expression « compris entre x et y » signifie que les valeurs x et y sont incluses. Formulations : De préférence, la concentration en IgG est de 160 g/L, 180 g/L ou 200 g/L, +/- 5%. Bien entendu, toute concentration en IgG comprise entre 160 g/L et 200 g/L, +/- 5% (référencées ci-après compositions IgG 16-20%) peut être envisagée. Dans le contexte de la présente invention, les concentrations s’entendent au niveau de la composition finale, prête à l’emploi. Les concentrations sont déterminées vis à vis des compositions sous forme liquide, avant dessication, ou après reconstitution sous forme de préparation injectable. De manière particulièrement avantageuse, la Demanderesse a mis en évidence qu’il est possible d’obtenir des compositions comprenant 16%, 18% ou 20% d’IgG particulièrement stables dans le temps en utilisant les mêmes excipients, dans les mêmes concentrations d’une composition à l’autre. Ainsi, selon l’invention, les compositions d’IgG 16%-20% comprennent avantageusement entre 150 et 300 mM de glycine, de manière préférée entre 175 et 285 mM, préférentiellement entre 190 et 240 mM et plus préférentiellement entre 210 et 235 mM. Dans un mode de réalisation particulier, la composition d’IgG 16-20% comprend 215 mM de glycine, +/- 10%. De même, les compositions d’IgG 16%-20% comprennent avantageusement entre 30 et 100 ppm de détergent non ionique, préférentiellement au moins 50 ppm de détergent non ionique, plus préférentiellement au moins 60 ppm, de manière encore préférée au moins 80 ppm. Le détergent non ionique utilisé dans la composition selon l’invention est avantageusement choisi parmi les polysorbates et notamment parmi le polysorbate 80 (ou Tween®80 qui est du polyoxyéthylènesorbitanne-monooléate), et le polysorbate 20 (ou Tween®20 qui est du polyoyéthylènesorbitanne-monolaurate). Eventuellement, le détergent non-ionique peut être choisi parmi le Triton® X 100 (octoxinol 10), poloxamères, polyoxyéthylène alkyl éthers, un bloc co-polymères d’éthylène/polypropylène et le Pluronic®F68 (polyéthylènepolypropylène glycol). Les détergents non ioniques peuvent également être combinés entre eux. Selon un mode de réalisation préféré, la composition ne contient pas de mannitol. De même, selon un mode de réalisation préféré, la composition ne contient pas d’acétate. En effet, il a été montré que le mannitol et/ou l’acétate n’étaient pas nécessaires à la stabilisation d’une composition d’IgG 16-20%. Dans un autre mode de réalisation, la composition ne contient pas de sucre. De manière avantageuse, la Demanderesse a mis en évidence que de telles compositions concentrées et stables présentent une osmolalité particulièrement adaptée à l’administration par injection, notamment sous-cutanée, et cela sans ajout en nombre et/ou quantités d’excipients. Ainsi, l’invention propose des compositions d’IgG 16-20% présentant une osmolalité mesurée comprise entre 270 et 310 mOsm/kg environ, ajustée par la glycine. Dans le contexte de l’invention, et sauf mention contraire, l’osmolalité de la composition s’entend de l’osmolalité mesurée dans ladite composition. L’osmolalité est avantageusement mesurée à l’aide d’un osmomètre calibré avec des solutions étalons, et notamment selon la méthode préconisée par la Pharmacopée Européenne, (Pharmacopée Européenne 5.0 de 2005 -01/2005:2.2.35.). Bien entendu, toute autre méthode de mesure de l’osmolalité peut être utilisée. Dans un mode de réalisation préféré, les seuls excipients de la composition d’IgG 16-20% selon l’invention, sont la glycine et le détergent non-ionique. Une telle formulation permet une bonne stabilisation des compositions d’immunoglobulines et une réduction des durées et des coûts de préparation à l'échelle industrielle grâce à la présence d'un nombre et d’une quantité minimums efficaces d’excipients. Avantageusement, une telle composition présente une osmolalité compatible avec l’administration par injection, notamment par voie sous-cutanée. Dans un mode de réalisation particulier, la composition consiste essentiellement en des IgG, de la glycine, un détergent non-ionique et de l’eau, en ce sens que tout autre excipient qui pourrait être présent ne le serait qu’à l’état de trace. Selon l’invention, le pH final de la composition est avantageusement compris entre 4,6 et 5,4. Préférentiellement, le pH est d’environ 4,7-5,1, encore plus préférentiellement entre 4,8-5,0. Un pH de 4,8-5,0 donne en effet des résultats particulièrement satisfaisants en termes de stabilité dans le temps. Le pH final s’entend du pH de la composition après formulation, c’est-à-dire dans la composition prête à l’emploi. Sauf mention contraire, dans la présente description, le pH de la composition désigne le pH final. Une composition d’IgG 16%, 18% ou 20% préférée selon l’invention comprend : environ 215 mM de glycine au moins 50 ppm de polysorbate 80, préférentiellement au moins 60 ppm, de manière encore préférée au moins 80 ppm le pH de la composition étant de 4,8-5,0. Une autre composition d’IgG 16%, 18% ou 20% préférée selon l’invention comprend : environ 250 mM de glycine au moins 50 ppm de polysorbate 80, préférentiellement au moins 60 ppm, de manière encore préférée au moins 80 ppm le pH de la composition étant de 4,8-5,0. Une autre composition d’IgG 16%, 18% ou 20% préférée selon l’invention comprend : environ 285 mM de glycine au moins 50 ppm de polysorbate 80, préférentiellement au moins 60 ppm, de manière encore préférée au moins 80 ppm le pH de la composition étant de 4,8-5,0. Une composition particulièrement préférée selon l’invention comprend : - 160 g/L d’IgG environ 215 mM de glycine au moins 80 ppm de polysorbate 80 le pH de la composition étant de 4,8-5,0. L’osmolalité mesurée de cette composition à 16% d’IgG est avantageusement d’environ280 mOsm/kg, +/- 2%. Une autre composition particulièrement préférée selon l’invention comprend : - 180 g/L d’IgG environ 215 mM de glycine au moins 80 ppm de polysorbate 80 le pH de la composition étant de 4,8-5,0. L’osmolalité mesurée de cette composition à 18% d’IgG est avantageusement d’environ290 mOsm/kg, +/- 2%. Une autre composition particulièrement préférée selon l’invention comprend : - 200 g/L d’IgG environ 215 mM de glycine au moins 80 ppm de polysorbate 80 le pH de la composition étant de 4,8-5,0. L’osmolalité mesurée de cette composition à 20% d’IgG est avantageusement d’environ 300 mOsm/kg, +/- 2%. De manière surprenante et avantageuse, la demanderesse a mis en évidence qu’une concentration en glycine d’environ 215 mM, +/- 5% combinée à une concentration en polysorbate 80 d’au moins 50 ppm, est suffisante pour maintenir la composition d’immunoglobulines 16-20% stable tout en maintenant une osmolalité comprise entre 270 et 310 mOsm/kg dans la composition d’IgG 16-20%, alors que des concentrations supérieures auraient été attendues pour garantir la stabilité, augmentant parallèlement l’osmolalité desdites compositions. Or, une trop forte osmolalité peut être à l’origine d’une déshydratation des cellules (sortie de l’eau intracellulaire vers le milieu extracellulaire) préjudiciable au patient. Les compositions selon l’invention comprennent avantageusement des immunoglobulines G humaines. Les IgG humaines sont généralement obtenues par fractionnement du plasma sanguin humain, et présentées dans un milieu aqueux. Le milieu aqueux est composé d'eau pour préparation injectable (eau PPI) pouvant contenir des excipients pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec les IgG. Les compositions d'IgG peuvent au préalable subir des étapes spécifiques d'inactivation/élimination de virus, tel qu’un traitement solvant détergent, une pasteurisation et/ou une nanofiltration. La composition selon l’invention comprend des IgG qui peuvent être polyclonales ou monoclonales. Les IgG peuvent être isolées à partir du sang humain ou animal ou produites par d’autres moyens, par exemple par des techniques de biologie moléculaire, par exemple dans des systèmes cellulaires bien connus de l’homme du métier. La composition selon l’invention est particulièrement adaptée aux IgG hautement purifiées. Avantageusement, les IgG de la présente invention sont obtenues par fractionnement du plasma humain. Des méthodes de fractionnement préférées du plasma humain sont décrites par Cohn et al (J. Am. Chem. Soc., 68, 459, 1946), Kistler et al. (Vox Sang., 7, 1962, 414-424), Steinbuch et al (Rev. Franç. Et. Clin, et Biol., XIV, 1054, 1969) et dans la demande de brevet WO 94/9334. Une méthode de préparation d’une composition d’immunoglobulines G est également décrite dans la demande de brevet WO 02/092632. Les compositions selon l’invention sont avantageusement sous forme liquide. La composition d'IgG 16-20% selon l’invention, sous forme liquide et après un stockage durant une période de 6 mois à 25°C présente un taux de polymères bien inférieur au taux maximum autorisé fixés par la Pharmacopée Européenne (3%), avantageusement inférieur à environ 1%. Les compositions de l’invention peuvent être des compositions pharmaceutiques, c'est-à-dire adaptées à un usage thérapeutique. Les compositions pharmaceutiques de l’invention sont ainsi utiles comme médicaments, notamment afin de traiter les déficits immunitaires primitifs avec défaut de production d'anticorps, la maladie de Kawasaki, le purpura thrombopénique immunologique de l'enfant et de l'adulte, les déficits immunitaires secondaires avec défaut de production d'anticorps, en particulier la leucémie lymphoïde chronique ou myélome associés à des infections à répétition, l’infection de l'enfant par le VIH associé à des infections bactériennes, les neuropathies motrices multifocales, le syndrome de Guillain-Barré, les infections aiguës sévères ou chroniques à Parvovirus B19, l'immunodéficience acquise ou constitutionnelle, la dermatomyosite cortico-résistante, la myasthénie aiguë, la polyradiculonévrite chronique idiopathique, le purpura thrombopénique immunologique, par exemple associé à l'infection par le VIH, le syndrome de l'homme raide (Stiffman syndrome), la neutropénie auto-immune, l’erythroblastopénie auto-immune résistante, le syndrome d'anti-coagulation acquise par auto-anticorps, la polyarthrite rhumatoïde, les uvéites. Les compositions selon l’invention peuvent également subir une dessiccation pour obtenir une forme solide qui se conserve plus longtemps et est plus pratique pour le transport et la commercialisation. La dessiccation est un procédé d'élimination de l'eau à un stade poussé. Il s'agit d'une déshydratation visant à éliminer autant d'eau que possible. Ce phénomène peut être naturel ou forcé. Cette dessiccation peut être réalisée à l’aide des techniques de lyophilisation, d’atomisation et de cryoatomisation. Le mode préféré d’obtention de la forme solide des compositions selon l’invention est la lyophilisation. Les méthodes de lyophilisation sont bien connues de l’homme du métier, voir par exemple [Wang et al, Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1-60,2000]. D’autres procédés appropriés pour réduire le degré d’humidité ou la teneur en eau de ces compositions sont envisageables. De préférence le degré d’humidité est inférieur ou égal à 3% en poids, de préférence inférieur ou égal à 2,5%, de préférence inférieur ou égal à 2%, de préférence inférieur ou égal à 1,5%. Les compositions selon l’invention peuvent être avantageusement soumises à une méthode d’élimination ou d’inactivation des agents infectieux, par exemple par chauffage à sec du lyophilisât. Les compositions solides selon l’invention, de préférence sous forme lyophilisée, peuvent être dissoutes dans de l’eau pour préparations injectables (ou « water for injection ou WFI »), pour obtenir des formulations à usage thérapeutique. Voies d’administration : La composition d'IgG 16-20% selon l’invention est utile en thérapie, et notamment sous forme injectable, non seulement par voie intraveineuse, mais de manière plus intéressante, par voie sous-cutanée ou intramusculaire. La voie sous-cutanée pour le traitement de maladies auto-immunes chroniques présente plusieurs avantages comme l'amélioration du confort du patient et une diminution des effets secondaires. L'administration sous-cutanée ne nécessite pas d'accès veineux ce qui constitue, dans certains cas, un avantage décisif lorsque l'absence d'abord veineux bloque l'accès au traitement, notamment pour les jeunes enfants. L'usage des immunoglobulines par voie sous-cutanée réduit également certains effets secondaires associés aux perfusions par voie intraveineuse, en particulier le risque de réactions systémiques. Les grandes variations de taux circulants observées par voie intraveineuse sont évitées, permettant une meilleure régulation du taux sérique dans la fourchette physiologique entre les perfusions. En dépit d'une biodisponibilité naturellement plus faible par la voie sous-cutanée, les immunoglobulines administrées par voie sous-cutanée (IgSC) ont une efficacité au moins équivalente à celle des immunoglobulines administrées par voie intraveineuse (IglV). Enfin, la disponibilité des IgSC pour le traitement à domicile constitue un avantage important sinon décisif pour certains traitements. Elle offre plus de flexibilité et d'indépendance au patient, améliorant la qualité de vie des patients. L'accroissement de la concentration contribue au confort du patient en réduisant la fréquence d'injection. La concentration de l'IgSC est une caractéristique déterminante qui conditionne le volume d'injection et nombre de sites d'injection et en conséquence la fréquence d'administration. Les exemples suivants illustrent l’invention sans en limiter la portée. Exemples : Tests comparatifs entre différentes compositions d’IgG 16%. 18%. 20% Une composition d’immunoglobulines G est préparée selon le procédé tel que décrit dans la demande EP1385886. Le produit obtenu est ensuite concentré à 160, 180 ou 200 g/L par ultrafiltration sur membrane en cellulose Ultracel C (Millipore®) de seuil de coupure 30 kDa afin d’obtenir le produit prêt à formuler (PPF). A/ Influence de la quantité de polysorbate 80 sur la stabilité de la composition Les produits concentrés à 160 ou 200 g/L prêts à formuler sont additionnés de glycine, de polysorbate 80 et ajustés au pH désiré afin d’obtenir les compositions suivantes : Tableau 1 : Compositions d’IgG 16%, 18%, 20% comprenant 285 mM de glycine et entre 0 et 100 ppm de polysorbate 80

Les compositions sont soumises à un stress d’agitation (stirring stress) sur plaque magnétique à 500 rpm pendant 8, 24, 48 ou 72h, les différentes analyses effectuées ensuite sont les suivantes : • Inspection visuelle : opalescence, couleur et formation de particules visibles sont déterminées par inspection visuelle effectuée avec une mireuse Pharmacopée Européenne en utilisant des standards de couleur de la Pharmacopée Européenne 2.2.2 Les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 2 : Inspection visuelle avant et après 8h de stress d’agitation (stirring)

Légende: Opalescence: Op: Opalescent; S Op: légèrement Opalescent, V S Op: très légèrement Opalescent; V Op: très Opalescent Particules: 0: sans particules ; 1: peu de particules; 2: particules; 3: nombreuses particules; 4: très nombreuses particules Après 8h de stress d’agitation, les résultats montrent, qu’à la fois pour les compositions comprenant 160 g/L et 200 g/L d’immunoglobulines, l’absence de polysorbate 80 favorise les phénomènes d’opalescence et de formation de particules. Une quantité minimale de 20 ppm de polysorbate 80 est nécessaire en présence de glycine (285 MmM) pour stabiliser la composition. Pour des concentrations en polysorbate 80 comprises entre 30 et 100 ppm, les résultats montrent une opalescence et des niveaux de particules comparables et ce, quelle que soit la concentration en immunoglobulines (160 g/L et 200 g/L). Une concentration de polysorbate 80 comprise entre 30 et 100 ppm est donc efficace pour assurer la stabilité de la composition d’immunoglobulines à 160 g/L ou 200 g/L en présence de glycine (285 mM). • Turbidité (DO à 400nm) : la turbidité est déterminée par mesure de l’absorbance à 400 nm. De l’eau pour injection est utilisée comme blanc. Les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 3 : Mesure de DO à 400 nm avant et après 8h de stress d’agitation

Les résultats montrent une légère augmentation de la DO à 400 nm (d’environ 2 fois par rapport à la valeur à T0) en présence de 30-100 ppm de polysorbate 80. Une concentration de polysorbate 80 comprise entre 30 et 100 ppm est donc efficace pour assurer la stabilité de la composition d’immunoglobulines à 160 g/L ou 200 g/L en présence de glycine (285 mM). • DLS/SLS : cette technique suit l’état d’agrégation de la solution. La DLS (dynamic light scattering) donne la mesure de la taille (diamètre hydrodynamique) des objets en solution, approximativement entre lnm et lpm. Chaque population de taille est ainsi suivie. La SLS (static light scattering) suit le phénomène d’agrégation dans son ensemble. La mesure est effectuée par ajout de 40 mM de NaCl à la solution. La mesure est effectuée sur échantillon dilué à 80 g/L en eau pour injection. Les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 4: Intensité des monomères à 90° (%) avant et après 24h, 48h et 72h de stress d’agitation (stirring).

Tableau 5: Intensité totale diffusée à 90° (u.a) avant et après 24h, 48h et 72h de stress d’agitation (stirring).

Les résultats montrent, pour les compositions comprenant 160 g/L et 200 g/L d’immunoglobulines, que l’absence ou la faible quantité de polysorbate 80 favorise la diminution des formes monomères et la formation de formes agrégées. Une quantité supérieure à 20 ppm de polysorbate 80 est nécessaire en présence de glycine (285 mM) pour stabiliser la composition. Après 24h de stress d’agitation (stirring), pour des concentrations en polysorbate 80 comprises entre 30 et 100 ppm, les résultats ne montrent pas de différence significative et ce, quelle que soit la concentration en immunoglobulines (160 g/L et 200 g/L). Le degré d’intensité de monomère et l’intensité globale sont similaires au sein de chaque concentration d’immunoglobulines (160 g/L ou 200 g/L). Une concentration de polysorbate 80 comprise entre 30 et 100 ppm est donc efficace pour assurer la stabilité de la composition d’immunoglobulines à 160 g/L ou 200 g/L en présence de glycine (285 mM). • Particules subvisibles (MFI) : les particules subvisibles supérieures à 2 pm, 10 pm et 25 pm sont comptées en utilisant la technique d’imagerie microfluidique. Les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 6 : Particules subvisibles mesurées par MFI avant et après 8h de stress d’agitation (stirring).

Les résultats montrent, pour les compositions comprenant 160 g/L et 200 g/L d’immunoglobulines, que l’absence ou la faible quantité de polysorbate 80 favorise une importante formation de particules subvisibles (agrégats et polymères). Une quantité supérieure à 20 ppm de polysorbate 80 est nécessaire en présence de glycine (285 mM) pour stabiliser la composition. Une protection équivalente contre l’agrégation est obtenue avec des concentrations comprises entre 30 et 100 ppm de polysorbate 80 et ce, quelle que soit la concentration en immunoglobulines (160 g/L et 200 g/L). Une concentration de polysorbate 80 comprise entre 30 et 100 ppm est donc efficace pour assurer la stabilité de la composition d’immunoglobulines à 160 g/L ou 200 g/L en présence de glycine (285 mM). Conclusion ; les résultats obtenus par différentes méthodes analytiques complémentaires démontrent qu’une concentration de polysorbate 80 comprise entre 30 et 100 ppm est efficace pour assurer la stabilité de la composition d’immunoglobulines à 160 g/L ou 200 g/L en présence de glycine (285 mM). B/ Influence de la quantité de glycine sur la stabilité de la composition Les produits concentrés à 160, 180 ou 200 g/L prêts à formuler sont additionnés de glycine, de polysorbate 80 et ajustés au pH désiré afin d’obtenir les compositions suivantes : Tableau 7 : Compositions d’IgG 16%, 18%, 20% comprenant entre 215 et 285 mM de glycine et 80 ppm de polysorbate 80

Les compositions sont soumises à 2 différents types de stress : o un stress d’agitation (stirring stress) sur plaque magnétique à 500 rpm pendant 8, 24, 48 ou 72h o un stress thermique (heating stress) par chauffage en bain thermostaté à 55°C pendant lh Les différentes analyses effectuées sont les suivantes : • Inspection visuelle : opalescence, couleur et formation de particules visibles sont déterminées par inspection visuelle effectuée avec une mireuse Pharmacopée Européenne en utilisant des standards de couleur de la Pharmacopée Européenne 2.2.2 Les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 8 : Inspection visuelle avant et après stress d’agitation (stirring) ou stress thermique

Légende: Opalescence: Op: Opalescent; S Op: légèrement Opalescent, V S Op: très légèrement Opalescent; V Op: très Opalescent Particules: 0: sans particules; 1: peu de particules; 2: particules; 3: nombreuses particules; 4: très nombreuses particules Les résultats ne montrent aucune évolution en stress thermique par rapport au TO, alors qu’en stress d’agitation, on note l’apparition de quelques particules. On n’observe pas de différence significative entre les compositions comprenant différentes concentrations de glycine (215 à 285 mM). Des concentrations de glycine comprises entre 215 et 285 mM sont donc adaptées à des formulations comprenant du polysorbate 80 afin d’assurer une bonne stabilité des compositions. • Turbidité (DO à 400 nm) : la turbidité est déterminée par mesure de l’absorbance à 400nm. De l’eau pour injection est utilisée comme blanc. Les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 9 : Mesure de DO à 400 nm avant et après stress thermique et stress d’agitation

Les résultats montrent après le stress thermique une légère augmentation de la turbidité sans distinction entre les différentes compositions à différentes concentrations de glycine. Après les stress d’agitation, on note une hétérogénéité des résultats qui s’explique par l’hétérogénéité du stress d’agitation. La concentration la plus faible en glycine (215 mM) semble réduire la turbidité, en particulier sur la composition ayant la plus forte concentration en immunoglobulines (200 g/L). • DLS/SLS : cette technique suit l’état d’agrégation de la solution. La DLS (dynamic light scattering) donne la mesure de la taille (diamètre hydrodynamique) des objets en solution, approximativement entre lnm et lpm. Chaque population de taille est ainsi suivie. La SLS (static light scattering) suit le phénomène d’agrégation dans son ensemble. La mesure est effectuée par ajout de 40 mM de NaCl à la solution. La mesure est effectuée sur échantillon dilué à 80 g/L en eau pour injection. Les résultats obtenus sont les suivants : Tableau 10 : Mesure du pourcentage de monomères et de l’intensité totale après lh, 8h et 24h de stress thermique

Les résultats montrent après le stress thermique une diminution des formes monomères et une augmentation de l’intensité totale avec l’augmentation de la concentration en immunoglobulines. Aucune différence significative n’est observée entre les différentes compositions à différentes concentrations de glycine. Après 8h de stress d’agitation, le niveau des monomères décroît d’environ 50% sans différence significative entre les compositions. Après 24h de stress d’agitation en revanche, révolution du pourcentage de monomères et de l’intensité globale montrent une moindre agrégation à 215 mM de glycine pour les compositions à 160 et 200 g/L d’immunoglobulines, et à 250 mM de glycine pour la composition à 180 g/L. L’hétérogénéité des résultats entre les différentes compositions d’immunoglobulines (160, 180 et 200 g/L) s’explique par la non homogénéité du stress d’agitation. Les résultats montrent qu’une concentration de 215mM de glycine dans une composition comprenant du polysorbate 80 permet d’assurer la stabilité de cette composition. C/ Compositions mises en stabilité long terme Les produits concentrés à 160, 180 ou 200 g/L prêts à formuler sont additionnés de glycine, de polysorbate 80 et ajustés au pH désiré afin d’obtenir les compositions suivantes pour mise en stabilité : Tableau 11 : Compositions d’IgG 16%, 18% et 20% comprenant 215 mM de glycine et 80 ppm de polysorbate 80

Après filtration stérilisante sur filtre 0.22pm (Sartopore), les compositions sont réparties aseptiquement en flacons verre (type I), qui sont ensuite bouchés et entreposés à l’envers, dans une enceinte régulée à • 5° ±3°C, • 25°C ±2°C / humidité résiduelle 60% ±5%, • 30°C ±2°C / humidité résiduelle 65% ±5% ou, • 40°C ±2°C Les différentes analyses effectuées sont les suivantes : • Inspection visuelle : opalescence et formation de particules visibles sont déterminées par inspection visuelle effectuée avec une mireuse Pharmacopée Européenne • pH : l’évolution du pH peut être signe de la dégradation du produit. Le pH est mesuré directement dans la solution • Concentration en protéines totales : l’absorbance à 280nm permet selon la loi de Beer-Lambert de déterminer la concentration en protéines totales dans la formulation. L’essai est effectué en triplicate, dans des microcellules UV après dilution au 1/400 en eau pour injection par pesée des échantillons. Le coefficient d’extinction moléculaire pour le produit est 1.4 L/g/cm. • Turbidité (DO à 400 nm) : la turbidité est déterminée par mesure de l’absorbance à 400 nm. De l’eau pour injection est utilisée comme blanc. • DLS/SLS : cette technique suit l’état d’agrégation de la solution. La DLS (dynamic light scattering) donne la mesure de la taille (diamètre hydrodynamique) des objets en solution, approximativement entre 1 nm et 1 pm. Chaque population de taille est ainsi suivie. La SLS (static light scattering) suit le phénomène d’agrégation dans son ensemble. La mesure est effectuée par ajout de 40 mM de naCl à la solution. La mesure est effectuée sur échantillon dilué à 80 g/L en eau pour injection. • Particules subvisibles (MFI) : les particules subvisibles supérieures à 2 pm, 10 pm et 25 pm sont comptées en utilisant la technique d’imagerie microfluidique. • HPSEC : la chromatographie par exclusion de taille haute performance est utilisée pour évaluer le niveau de fragmentation et d’aggrégation du produit. L’analyse du chromatogramme des mesures de densité optique à 208 nm détermine le % de monomères, dimères, polymères et fragments. Les résultats obtenus pour la composition I16G215T à 160 g/L d’immunoglobulines sont les suivants : Tableau 12 : Résultats de stabilité à 5°C à TO et T3mois pour la composition I16G215T

Tableau 13 : Résultats de stabilité à 25°C à TO et T3mois pour la composition I16G215T

Tableau 14 : Résultats de stabilité à 30°C à TO et T3mois pour la composition I16G215T

Tableau 15 : Résultats de stabilité à 40°C à TO et T3mois pour la composition I16G215T

Les résultats obtenus pour la composition I18G215T à 180 g/L d’immunoglobulines sont les suivants : Tableau 16 : Résultats de stabilité à 5°C à T0 et T3mois pour la composition I18G215T

Tableau 18 : Résultats de stabilité à 25°C à T0 et T3mois pour la composition I18G215T

Tableau 19 : Résultats de stabilité à 30°C à TO et T3mois pour la composition I18G215T

Tableau 20 : Résultats de stabilité à 40°C à TO et T3mois pour la composition I18G215T

Les résultats obtenus pour la composition I20G215T à 200 g/L d’immunoglobulines sont les suivants : Tableau 21 : Résultats de stabilité à 5°C à ΤΟ, T3 et T6mois pour la composition I20G215T

Tableau 22 : Résultats de stabilité à 25°C à ΤΟ, T3 et T6mois pour la composition I20G215T

Tableau 23 : Résultats de stabilité à 30°C à ΤΟ, T3 et T6mois pour la composition I20G215T

Tableau 24 : Résultats de stabilité à 40°C à ΤΟ, T3 et T6mois pour la composition I20G215T

Les tests à 40°C permettent d’accélérer les phénomènes observés lors de la mise en stabilité des compositions du fait du fort stress appliqué. Les méthodes utilisées montrent bien une évolution des critères suivis, confirmant la pertinence des méthodes sélectionnées pour l’évaluation des formulations lors du suivi de stabilité. Les résultats montrent que les 3 compositions à 160, 180 et 200 g/L d’immunoglobulines comprenant 80 ppm de polysorbate 80 et 215 mM à pH 5,0 sont stables au moins sur 3 mois à 25°C comme à 30°C.