CA2754399A1 - Nouvelles utilisations du fibrinogene - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'utilisation du fibrinogène pour la fabrication d'un médicament pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d'une hémorragie aiguë sévère, ledit médicament étant destiné à l'administration d'une quantité au moins égale à 4,5 g de fibrinogène en une dose unique.

Description

TITRE DE L'INVENTION
Nouvelles utilisations du fibrinogène DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine du traitement des hémorragies aiguës sévères, y compris mais non limité aux hémorragies du post-partum, hémorragies aiguës sévères post-traumatiques et chirurgicales (péri-opératoires) ART ANTERIEUR
Les hémorragies aiguës sévères (HAS) se définissent par la perte rapide - en quelques heures - d'au moins 20 à 30% de la masse sanguine d'un individu. Les principales situations d'HAS se rencontrent notamment en obstétrique (hémorragies du post-partum essentiellement), en traumatologie et en chirurgie, sans se limiter à ces situations.
Les troubles de la coagulation (coagulopathies) sont fréquents en situation d'HAS et sont directement ou indirectement liés à l'hémorragie. Parmi les facteurs de coagulation, le taux plasmatique de fibrinogène est chronologiquement le premier à chuter pour atteindre des valeurs critiques (Hippala et al., 1995, Anesth Analg, Vol. 81 : 360-365 ;
Torrielli et al., 1988, Rev Fr Gynecol Obstet, Vol. 83 : 7-9). Ces valeurs-seuils sont classiquement situées entre 0.5 et 1g/1 et correspondent aux concentrations permettant d'obtenir une coagulation sanguine satisfaisante, en situation stable non-hémorragique. Les mécanismes impliqués dans la baisse du taux de fibrinogène sont : 1/ les pertes directes, 2/ la dilution par les solutés de remplissage vasculaire, et 3/ la consommation de fibrinogène pour la formation de caillots.
Outre le fait que le fibrinogène est le premier facteur de la coagulation dont le taux sanguin chute, il a été montré que la baisse du taux de fibrinogène est un facteur de mauvais pronostic clinique, et cette baisse est associée à une évolution des patients d'autant plus sévère que la concentration en fibrinogène est basse (Charbit et al., 2006, Journal of Thrombosis and Haemostasis, Vol. 5 : 266-273 ; Karlsson et al., 2008, Transfusion, Vol. 48 (10) : 2152-2158).
Les conditions de prise en charge d'une HAS, en urgence, sont adaptées à
chaque cas individuel mais comportent des objectifs communs, incluant le traitement des troubles de la coagulation lorsqu'ils existent, ce qui est fréquent. Actuellement, l'administration de fibrinogène est recommandée lorsque le dosage de fibrinogène plasmatique atteint les valeurs critiques citées précédemment. Cette approche substitutive vise à corriger des situations de coagulopathies constituées, lesdites coagulopathies étant souvent au stade de coagulation intra-vasculaire disséminée (CIVD). Cette approche substitutive est tardive car elle est dépendante du délai nécessaire à l'obtention des résultats d'examens de laboratoire répétés, parfois longs à obtenir (près d'1 heure) pour diagnostiquer un déficit acquis en fibrinogène et documenter son évolution au cours du temps. De plus, selon cette approche substitutive,

2 PCT/FR2010/050380 l'administration de fibrinogène est répétée dans le temps car elle est conditionnée aux résultats des dosages répétés de fibrinogène. La dose de fibrinogène peut être administrée en plusieurs perfusions, chacune étant conditionnée par le rapport entre le déficit quantifié de fibrinogène et la valeur-seuil de fibrinogène sanguin à atteindre. Le fibrinogène est administré à un débit lent recommandé inférieur à 5m1/minute, ce qui est mal approprié à une situation d'urgence.
Lorsque le taux circulant de fibrinogène est inférieur à 1 g/L, du fibrinogène exogène est administré afin de permettre la formation d'un caillot normal. L'apport de fibrinogène exogène varie de 2 à 4 grammes, l'apport requis étant calculé au cas par cas et en temps réel en fonction des résultats des bilans successifs des paramètres de la coagulation décrits précédemment. Plus précisément, la quantité de fibrinogène à injecter est classiquement calculée selon la formule suivante : Quantité de fibrinogène exogène (en grammes) = [taux de fibrinogène circulant à atteindre (en g/L)] - [taux de fibrinogène circulant avant traitement (en g/L)] x 0,04 x [poids du malade (en kg)]. Ainsi, les quantités de fibrinogène à administrer successivement au cours du traitement sont calculées en fonction des bilans des paramètres de la coagulation également successifs dans le temps. On notera que le calcul précis de la quantité de fibrinogène exogène à administrer est considéré comme essentiel, afin d'éviter un excès de fibrinogène circulant, par exemple un taux de fibrinogène circulant supérieur à 5 g/L, susceptible de provoquer des thromboses.
On peut citer aussi l'administration d'un concentré plaquettaire comme moyen de traitement additionnel aux moyens de traitement décrits ci-dessus, en particulier dans les situations dans lesquelles le saignement persiste malgré l'apport de fibrinogène.
Les protocoles de traitement des hémorragies du post-partum qui sont actuellement pratiqués sont globalement satisfaisants. Toutefois, compte tenu du risque important de mortalité ou de morbidité lié à ces hémorragies aiguës sévères, il existe un besoin constant dans l'état de la technique pour des solutions techniques alternatives ou améliorées par rapport aux solutions existantes.
La nécessité de trouver des moyens de traitement alternatifs ou améliorés pour d'autres types d'hémorragies sévères aiguës, y compris des hémorragies sévères provoquées par des gestes chirurgicaux ou encore du fait de traumatismes physiques violents. Les autres hémorragies aiguës sévères présentent des points communs avec les hémorragies du post-partum, y compris des troubles de l'homéostasie.

RESUME DE L'INVENTION
La présente invention a pour objet l'utilisation du fibrinogène pour la fabrication d'un médicament utilisé dans le traitement d'une hémorragie aiguë sévère, ledit médicament apportant précocement et rapidement une quantité suffisante de fibrinogène permettant de restaurer la capacité coagulante du sang, indépendamment du taux de fibrinogène initial. Par

3 PCT/FR2010/050380 exemple, une quantité au moins égale à 4,5 g peut être administrée selon une durée d'administration inférieure à 30 minutes.
Selon l'invention, les hémorragies aiguës sévères englobent, sans se limiter à
ces domaines, les hémorragies du post-partum, les hémorragies péri-opératoires et les hémorragies post-traumatiques.
Le fibrinogène qui est administré concerne tout fibrinogène, quelle que soit son origine et sa nature L'invention est aussi relative à des compositions pharmaceutiques, préventives ou curatives, comprenant du fibrinogène, qui sont spécialement adaptées pour la mise en oeuvre des utilisations et des procédés ci-dessus.

DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 illustre la succession d'étapes dans le temps du protocole expérimental in vivo chez les porcs. La ligne horizontale représente le temps. Les barres verticales numérotées représentent les étapes successives du protocole. 1 : Etape d'anesthésie et d'instrumentation des animaux. 2 : Réalisation des mesures initiales de base ( baseline ) des paramètres explorés, respectivement HR (vitesse cardiaque pour Heart Rate ), MAP
(pression moyenne artérielle pour Mean Arterial Pressure ), PAP (pression artérielle pulmonaire pour Pulmonary Arterial Pressure ), PCWP (pression centrale de la clavette pulmonaire pour Pulmonary Central Wedge Pressure ), CVP (pression veineuse centrale pour Central Venous Pressure ), ROTEM , tests standard de la coagulation, hémoglobine, hématocrite, plaquettes. 3 : Etape de réalisation de l'hémodilution, au cours de laquelle on prélève 60% du volume sanguin, que l'on remplace par une composition de HES 130/0,4 (Voluven ), dans l'objectif d'atteindre une valeur de MCF inférieure à 40 mm. 4 : Etape de re-transfusion des globules rouges lavés, dans l'objectif d'atteindre une valeur d'hémoglobine de 5 à 6 g/dl. 5 :
Réalisation de l'étape de blessure osseuse. 7 : Réalisation des mesures des paramètres HR, MAP, PAP, PCWP, ROTEM , des tests de coagulation standard, de l'hémoglobine, de l'hématocrite, des plaquettes et de la perte sanguine aux temps respectifs de 15 minutes, 1 heure, 2 heures et 4 heures suivant l'administration du médicament (fibrinogène à différentes doses et composition placebo). 9 : Réalisation de l'étape de blessure hépatique. 9 : Etape de fin de l'expérimentation, 2 heures après la blessure hépatique, au cours de laquelle on mesure les paramètres HR, MAP, PAP, CVP, PCWP, ROTEM, les tests standard de coagulation sanguine, l'hémoglobine, l'hématocrite, les plaquettes et la perte sanguine.
La Figure 2 illustre les résultats de la mesure du temps de coagulation (CT) INTEM
selon la méthode ROTEM . Sur la partie supérieure de la Figure 2 sont représentés les résultats obtenus avec les animaux auxquels on a administré respectivement :
(i) une composition placebo, représentés par des losanges pleins, (ii) 37,7 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des carrés pleins, (iii) 75 mg/kg de fibrinogène humain, représentés

4 PCT/FR2010/050380 par des triangles noirs pleins et (iv) 150 mg/kg de fibrinogène, représentés par des triangles inversés gris. Sur la partie inférieure de la Figure 3 sont représentés les résultats obtenus avec les animaux auxquels on a administré respectivement : (i) une composition placebo, représentés par des losanges pleins, (ii) 300 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des carrés pleins, (iii) 450 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des triangles gris pleins et (iv) 600 mg/kg de fibrinogène, représentés par des triangles inversés gris. En ordonnées :
temps de coagulation (CT), exprimé en secondes. En abscisse, les différentes étapes successives de l'expérimentation in vivo, de gauche à droite respectivement :
(i) après instrumentation et avant traitement des animaux, (ii) après hémodilution, (iii) 15 minutes après administration du médicament, (iv) 1 heure après administration du médicament, (v) 2 heures après administration du médicament, (vi) 4 heures après administration du médicament et (vii) 2 heures après avoir réalisé la blessure hépatique ou avant la mort.
La Figure 3 illustre les résultats de la mesure du maximum de fermeté du caillot (MCF) INTEM selon la méthode ROTEM . Sur la partie supérieure de la Figure 3 sont représentés les résultats obtenus avec les animaux auxquels on a administré respectivement :
(i) une composition placebo, représentés par des losanges pleins, (ii) 37,7 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des carrés pleins, (iii) 75 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des triangles noirs pleins et (iv) 150 mg/kg de fibrinogène, représentés par des triangles inversés gris. Sur la partie inférieure de la Figure 3 sont représentés les résultats obtenus avec les animaux auxquels on a administré respectivement : (i) une composition placebo, représentés par des losanges pleins, (ii) 300 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des carrés pleins, (iii) 450 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des triangles gris pleins et (iv) 600 mg/kg de fibrinogène, représentés par des triangles inversés gris. En ordonnées :
maximum de fermeté du caillot (MCF), exprimé en millimètres. En abscisse, les différentes étapes successives de l'expérimentation in vivo, de gauche à droite respectivement : (i) après instrumentation et avant traitement des animaux, (ii) après hémodilution, (iii) 15 minutes après administration du médicament, (iv) 1 heure après administration du médicament, (v) 2 heures après administration du médicament, (vi) 4 heures après administration du médicament et (vii) 2 heures après avoir réalisé la blessure hépatique ou avant la mort.
La Figure 4 illustre les résultats de la mesure du maximum de fermeté du caillot (MCF) PLASMA EXTEM (FibTEM modifié) selon la méthode ROTEM . Sur la partie supérieure de la Figure 4 sont représentés les résultats obtenus avec les animaux auxquels on a administré
respectivement : (i) une composition placebo, représentés par des losanges pleins, (ii) 37,7 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des carrés pleins, (iii) 75 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des triangles noirs pleins et (iv) 150 mg/kg de fibrinogène, représentés par des triangles inversés gris. Sur la partie inférieure de la Figure 4 sont représentés les résultats obtenus avec les animaux auxquels on a administré respectivement :
(i) une composition placebo, représentés par des losanges pleins, (ii) 300 mg/kg de fibrinogène

5 PCT/FR2010/050380 humain, représentés par des carrés pleins, (iii) 450 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des triangles gris pleins et (iv) 600 mg/kg de fibrinogène, représentés par des triangles inversés gris. En ordonnées : maximum de fermeté du caillot (MCF), exprimé en millimètres. En abscisse, les différentes étapes successives de l'expérimentation in vivo, de gauche à droite respectivement : (i) après instrumentation et avant traitement des animaux, (ii) après hémodilution, (iii) 15 minutes après administration du médicament, (iv) 1 heure après administration du médicament, (v) 2 heures après administration du médicament, (vi) 4 heures après administration du médicament et (vii) 2 heures après avoir réalisé la blessure hépatique ou avant la mort.
La Figure 5 illustre les résultats des mesures de la concentration en fibrinogène plasmatique. Les courbes représentent les résultats obtenus avec les animaux auxquels on a administré respectivement : (i) une composition placebo, représentés par des losanges pleins, sur la courbe inférieure de la figure 5, (ii) 37,5 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des carrés pleins sur la courbe immédiatement supérieure à la courbe précédente, (iii) 75 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des triangles noirs pleins sur la courbe immédiatement supérieure à la courbe précédente, (iv) 150 mg/kg de fibrinogène, représentés par des triangles inversés gris sur la courbe immédiatement supérieure à la courbe précédente, (v) 300 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des carrés pleins sur la courbe immédiatement supérieure à la courbe précédente, (vi) 450 mg/kg de fibrinogène humain, représentés par des triangles gris pleins sur la courbe immédiatement supérieure à la courbe précédente, et (vii) 600 mg/kg de fibrinogène, représentés par des triangles gris sur la courbe immédiatement supérieure à la courbe précédente et qui est aussi la courbe supérieure de la Figure 5. En ordonnées : concentration plasmatique en fibrinogène, exprimée en mg/dl. En abscisse, les différentes étapes successives de l'expérimentation in vivo, de gauche à droite respectivement : (i) après instrumentation et avant traitement des animaux, (ii) après hémodilution, (iii) 15 minutes après administration du médicament, (iv) 1 heure après administration du médicament, (v) 2 heures après administration du médicament, (vi) 4 heures après administration du médicament et (vii) 2 heures après avoir réalisé la blessure hépatique ou avant la mort.
La Figure 6 illustre les résultats des mesures de maximum de fermeté du caillot (MCF) INTEM selon la méthode ROTEM en fonction de la dose de fibrinogène administrée aux animaux. En ordonnées : valeur de maximum de fermeté du caillot (MCF), exprimée en millimètres. En abscisse, concentration en fibrinogène humain, exprimée en mg/dl.
La Figure 7 illustre les mesures de perte sanguine et de capacité de coagulation. En ordonnées : valeur de perte sanguine et valeur de taille du caillot, exprimée en ml/kg. Sur la figure 7, les valeurs respectives de taille du caillot (< clot ) et de perte sanguine ( liquid ) sont représentées par des barres adjacentes, pour chacune des concentrations croissantes de fibrinogène humain administrées aux animaux et pour la composition placebo. De la gauche

6 PCT/FR2010/050380 vers la droite de la figure 7, chaque paire de barres adjacentes (clot/liquid) représente les valeurs respectives pour (i) 37,5 mg/kg de fibrinogène, (ii) 75 mg/kg de fibrinogène, (iii) 150 mg/kg de fibrinogène, (iv) 300 mg/kg de fibrinogène, (v) 450 mg/kg de fibrinogène, (vi) 600 mg/kg de fibrinogène et (vii) la composition placebo.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
De manière surprenante, on a montré selon l'invention que dans le traitement des hémorragies aiguës sévères, même en l'absence d'un déficit avéré en fibrinogène, l'administration précoce et rapide d'une forte dose unique de fibrinogène est capable de contrôler l'hémorragie aiguë sévère et de prévenir son évolution vers une hémorragie incontrôlable.
Selon l'invention, une dose forte de fibrinogène exogène, administrée d'une manière précoce et rapide, permet d'interrompre, en cas d'hémorragie aigüe sévère, l'évolution d'une coagulopathie débutante et occulte, constituée en majeure partie par une diminution progressive de la capacité coagulante du sang, elle-même provoquée principalement par la diminution du fibrinogène endogène, vers une coagulopathie constituée qui peut être à l'origine d'une hémorragie incontrôlable.
L'administration du fibrinogène exogène, dans les conditions précisées dans cette invention, constitue de cette manière à la fois un traitement de l'hémorragie aigüe sévère et une prévention de son évolution néfaste vers une hémorragie incontrôlable.
Selon l'invention, une quantité prédéterminée de fibrinogène exogène permet de contrôler une hémorragie aiguë sévère sans nécessité de réaliser un dosage préalable du taux de fibrinogène circulant. En effet le principe du traitement selon l'invention n'est pas de combler un déficit en fibrinogène, c'est-à-dire d'apporter une quantité de fibrinogène à partir d'une valeur seuil sanguine prédéterminée comme étant critique pour atteindre une valeur-cible sanguine présupposée efficace, mais de restaurer le plus rapidement possible la capacité coagulante du sang.
Or, tenir compte du dosage de fibrinogène pour déterminer la nécessité
d'administrer du fibrinogène, et pour déterminer la quantité du fibrinogène qui doit être administrée, impose que les résultats de mesure du taux sanguin de fibrinogène soient disponibles pour l'équipe médicale. On précise que les résultats de la mesure du taux sanguin de fibrinogène ne sont en général disponibles qu'après au moins 45 minutes à 1 heure suivant le prélèvement sanguin, même en situation d'urgence. Cette perte de temps dans l'administration du traitement d'une urgence thérapeutique peut entraîner que la valeur du taux sanguin de fibrinogène du patient, au moment où les résultats de mesure sont disponibles, soit inférieure à la valeur-seuil précitée, ce qui peut dans certains cas significativement affecter les chances de survie du patient.
Or, il a été montré dans l'invention que l'administration de fibrinogène était efficace sans la nécessité de connaître au préalable le taux sanguin initial de fibrinogène.
On a donc montré

7 PCT/FR2010/050380 que le traitement d'une HAS peut être réalisé par une administration précoce de fibrinogène, sans mesure préalable du taux sanguin, dès la réalisation d'un diagnostic clinique d'hémorragie aiguë sévère On a ainsi montré selon l'invention que l'administration de fibrinogène à des patients affectés d'une hémorragie aiguë sévère peut être réalisée avec une quantité
unique de fibrinogène, afin de restaurer d'emblée la capacité coagulante du sang, donc sans nécessiter une adaptation de la quantité de fibrinogène en fonction du patient à traiter.
En particulier, on a montré selon l'invention que l'on peut traiter avec succès les hémorragies aiguës sévères par administration d'une quantité prédéterminée de fibrinogène exogène, sans nécessité de réaliser un dosage préalable du taux de fibrinogène circulant.
De manière surprenante, on a montré selon l'invention que l'administration précoce et rapide à un patient affecté d'une hémorragie aiguë sévère, d'une forte dose unique de fibrinogène sans dosage du taux de fibrinogène circulant préalablement à
l'administration, permet d'améliorer ou de prévenir l'aggravation de troubles de l'hémostase irréversibles qu'est susceptible de subir ledit patient, et ceci, sans provoquer de thrombose.
De plus, il a également été montré selon l'invention que le traitement d'une hémorragie aiguë sévère peut être réalisée par administration précoce et rapide d'une dose unique importante de fibrinogène, d'une quantité au moins égale à 4,5 g, c'est à dire sans nécessiter la réalisation de plusieurs administrations séquentielles de fibrinogène exogène durant la totalité
de la période de traitement et/ou de suivi du patient, liée à l'adaptation de la quantité de fibrinogène en fonction des taux de fibrinogène.
Les exemples illustrent une étude chez l'animal chez lesquels a été
administrée une gamme de doses de fibrinogène allant de 37,5 mg/kg à 600 mg/kg, suivant une modèle d'hémodilution provoqué par un choc traumatique avec une perte de 60% du volume sanguin, qui est ensuite remplacé par une solution à 6% d'amidon hydroxyéthylé (HES).
Les résultats montrent que le temps de coagulation et le maximum de fermeté du caillot sont significativement affectés par l'hémodilution. L'administration de fibrinogène induit une augmentation de toutes les mesures de la fermeté du caillot, de manière dose-dépendante. Les résultats des exemples montrent qu'un traitement des animaux ayant subi une hémorragie par une dose de fibrinogène de 50 mg/kg restaure totalement les valeurs de maximum de fermeté
du caillot dés 15 minutes suivant la fin de l'infusion de fibrinogène, cet effet étant maintenu jusqu'à la fin de l'expérimentation. Avec des doses plus importantes de fibrinogène, on atteint un plateau pour les valeurs EXTEM MCF (test ROTEM ). En revanche, avec des doses croissantes de fibrinogène, les valeurs de INTEM MCF (test ROTEM : -coagulation indépendante des plaquettes) continuent à augmenter, comme cela est illustré
sur la figure 6.
Les résultats des exemples montrent que la production de thrombine chez les animaux auxquels on a administré le fibrinogène ne diffère pas de la production de thrombine dans le groupe d'animaux témoin. Une analyse statistique de la perte sanguine montre un effet dose-

8 PCT/FR2010/050380 réponse significatif (p = 0.02), ce qui indique une réduction de la perte sanguine totale avec les doses croissantes de fibrinogène jusqu'à 400 mg/kg, un plateau étant atteint pour une dose de fibrinogène de 600 mg/kg, comme cela est illustré dans la figure 7. Les résultats des exemples montrent que la concentration de fibrinogène obtenue chez les animaux ayant reçu 300 mg/kg de fibrinogène était proche de la valeur de base obtenue chez les animaux témoins n'ayant pas subi d'hémorragie. La concentration de fibrinogène chez les animaux ayant été
traités avec 400 mg/kg de fibrinogène était même supérieure au même groupe d'animaux témoins.
De manière importante, on a montré dans les exemples que, même avec les fortes doses de fibrinogène, aucun signe d'hypercoagulation n'a été observé après analyse des paramètres biologiques ou histologiques.
Les résultats des exemples confirment que la fermeté du caillot est affectée par des niveaux faibles de fibrinogène, les niveaux faibles de fibrinogène étant provoqués dans le modèle expérimental utilisé par une coagulopathie de dilution. Les résultats des exemples confirment le rôle clé du fibrinogène dans ce type de coagulopathie. Le rôle du fibrinogène est encore confirmé part le fait que la seule administration de fibrinogène a un potentiel intrinsèque de corriger les effets de la coagulopathie, de manière dose-dépendante.
Egalement, les résultats des exemples montrent qu'au moins la restauration complète de la concentration de fibrinogène jusqu'aux niveaux normaux (test ROTEM , EXTEM MCF) ou même jusqu'à des niveaux légèrement supérieurs à la normale (INTEM MCF et poids du caillot) est nécessaire pour que la coagulation optimale soit rétablie.
Comme déjà mentionné, il est remarquable que même aux fortes doses de fibrinogène, aucun signe d'hypercoagulation potentielle n'ait pu être mis en évidence.
Ainsi, les résultats des exemples montrent que l'administration d'une forte dose unique de fibrinogène, sans dosage du taux de fibrinogène circulant préalable à
l'administration, permet de prévenir l'aggravation de troubles de l'hémostase, et ceci en toute sécurité pour le patient puisque, de manière tout à fait surprenante, aucun effet potentiel d'hypercoagulation n'est observé, même avec des fortes doses de fibrinogène.
De plus, on a montré que l'administration d'une dose unique élevée de fibrinogène conformément à l'invention n'induisait pas de réaction d'hypersensibilité
(mesure des niveaux d'histamine plasmatique). Les niveaux d'histamine plasmatique sont restés stables, pour toutes les doses de fibrinogène (37,5 mg/kg à 600 mg/kg).
De plus, les concentrations plasmatiques de TNF-a ont été réduites ou sont demeurées stables après l'administration du fibrinogène. Enfin, il n'a jamais été
détecté d'endothéline-1.
L'ensemble de ces résultats confirment le caractère d'innocuité pour le patient de l'administration de fibrinogène en une dose unique importante et de façon rapide pour le traitement d'une hémorragie aigüe sévère.
La présente invention est relative à l'utilisation du fibrinogène pour la fabrication d'un médicament pour son utilisation dans le traitement d'une hémorragie aiguë
sévère, ledit

9 PCT/FR2010/050380 médicament étant destiné à l'administration d'une quantité au moins égale à
4,5 g de fibrinogène, en une dose unique.
L'invention concerne aussi le fibrinogène pour son utilisation dans le traitement d'une hémorragie aiguë sévère, destiné à l'administration par voie parentérale, préférentiellement par voie intraveineuse.
L'invention a également trait à une méthode pour la prévention ou le traitement d'une hémorragie aiguë sévère, comprenant une étape d'administration de fibrinogène en une quantité au moins égale à 4,5 g.
Il a été montré qu'une étape unique d'administration de la quantité
prédéterminée au moins égale à 4,5 g de fibrinogène était suffisante pour la prévention ou le traitement des hémorragies aiguës sévères.
On a montré dans les exemples que l'administration d'une quantité
prédéterminée au moins égale à 4,5 g de fibrinogène est efficace et n'entraîne pas d'effet indésirable lorsque la durée d'administration du fibrinogène est rapide. En particulier, dans le modèle expérimental du porc illustré dans les exemples, une quantité de 600 mg/kg de fibrinogène pouvait être administrée selon une durée de l'étape d'administration de 30 minutes.
Transposés chez l'homme, les résultats des exemples montrent qu'une dose de 6 g de fibrinogène peut être administrée très rapidement, selon une durée de l'étape d'administration inférieure à 30 minutes.
Selon l'invention, une durée de l'étape d'administration du fibrinogène inférieur à 30 minutes, englobe les durées inférieures à 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, ou 6 minutes.
Dans le cas spécifiquement illustré dans les exemples, l'étape d'administration d'une quantité de 6 g de fibrinogène est de cinq minutes, sans provoquer d'effet indésirable au patient.
Selon l'invention, une durée de l'étape d'administration du fibrinogène inférieure à 30 minutes englobe une durée de l'étape d'administration supérieure à 1 minute.
Avec l'utilisation du fibrinogène selon l'invention, on évite le recours obligatoire à un dosage du taux de fibrinogène circulant chez le patient antérieurement à
l'administration du fibrinogène, ce qui constitue un avantage technique important pour la prévention ou le traitement de situations d'urgence clinique des patients, patients pour lesquels une intervention préventive ou thérapeutique rapide peut être déterminante concernant les chances de survie du patient.
Ainsi, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est en outre caractérisée en ce que le médicament est destiné à l'administration d'une quantité au moins égale à 4,5 g de fibrinogène en une dose unique, sans contrôle ou dosage du taux circulant de fibrinogène préalablement à
son administration au patient. En conséquence, la méthode de prévention ou de traitement de l'invention peut être en outre caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas d'étape de contrôle ou

10 PCT/FR2010/050380 de dosage du taux de fibrinogène circulant, préalablement à l'étape d'administration du fibrinogène.
Egalement, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est en outre caractérisée en ce que le médicament est destiné à l'administration d'une quantité au moins égale à 4,5 g de fibrinogène en une dose unique, sans contrôle ou dosage du taux circulant de fibrinogène postérieurement à son administration au patient. En conséquence, la méthode de prévention ou de traitement de l'invention peut être en outre caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas d'étape de contrôle ou de dosage du taux de fibrinogène circulant, postérieurement à l'étape d'administration du fibrinogène.
Très subsidiairement, l'absence de dosage du taux de fibrinogène circulant représente aussi un avantage économique concernant le coût global de l'acte médical préventif ou curatif.
La quantité de fibrinogène peut être d'au moins 4,5 g, 4,6 g, 4,7g, 4,8 g, 4,9 g, 5 g, 5,1 g, 5,2 g, 5,3 g, 5,4 g, 5,5 g, 5,6 g, 5,7 g, 5,8 g ou 5,9 g.
Bien que la quantité maximale de fibrinogène à administrer ne soit pas une caractéristique essentielle, ladite quantité préférentielle de fibrinogène est préférentiellement d'au plus 15 g et de manière tout à fait préférée d'au plus 12 g.
Préférentiellement, la quantité de fibrinogène est d'environ 6 g, ce qui englobe une quantité de fibrinogène allant de 5,5 g à 6,5 g, y compris de 5,8 g à 6,2 g.
L'utilisation du fibrinogène selon l'invention est adaptée à la fois à la prévention et au traitement de certaines hémorragies aiguës sévères.
A titre d'exemple, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est adaptée au traitement des hémorragies du post-partum.
Au sens conventionnel médical, une hémorragie du post-partum est définie comme un saignement d'un volume de plus de 500 mL pendant la période de 24 heures qui suit l'accouchement.
On connaît aujourd'hui divers facteurs de risque d'hémorragie du post-partum, parmi lesquels une anémie persistante, l'existence d'une pathologie congénitale de l'hémostase, des situations à risque d'atonie utérine (p. ex. multiparité, sur-distension utérine, travail long ou au contraire trop rapide, l'existence d'une chorioamniotite), des situations à
risque d'anomalie de rétraction de l'utérus (p. ex. rétention placentaires ou caillots, utérus fibromateux ou malformé, placenta accreta), des troubles acquis de l'hémostase, des lésions de la filière génitale y compris l'épisiotomie, une inversion utérine, une rupture utérine ou encore une césarienne.
Ainsi, chez des patientes chez lesquelles existe un risque significatif de déclenchement d'une hémorragie du post-partum, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention peut être effectuée à titre préventif.
Toutefois, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est principalement effectuée à titre curatif, chez des patients ayant effectivement déjà déclenché une hémorragie du post-partum.

11 PCT/FR2010/050380 Similairement, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est adaptée à la prévention et au traitement des hémorragies provoquées lors d'une intervention chirurgicale.
En effet, le chirurgien praticien peut déterminer à l'avance, de par son expérience, les actes chirurgicaux pour lesquels les risques de provoquer une hémorragie aiguë sévère sont importants.
C'est la raison pour laquelle l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est également adaptée à la prévention ou au traitement des hémorragies aiguës sévères provoquées lors d'un acte chirurgical, c'est-à-dire lors d'une intervention chirurgicale.
Une autre situation d'hémorragie aiguë sévère de grande urgence est représentée par le choc hémorragique traumatique, provoqué à la suite d'un traumatisme physique important, qui est souvent associé à une chute brutale de la volémie et à une anémie aiguë.
Dans le cas de choc hémorragique traumatique, le pronostic vital du patient est directement relié au volume de perte sanguine et à la rapidité de la prise en charge thérapeutique. Il s'agit d'une autre situation d'hémorragie aiguë pour laquelle un aspect primordial de la stratégie thérapeutique est de rétablir l'hémostase.
Ainsi, selon un autre aspect, l'utilisation du fibrinogène selon l'invention est adaptée au traitement des hémorragies aiguës sévères provoquée par un traumatisme physique, appelées aussi chocs hémorragiques traumatiques.
De manière tout à fait préférée, le fibrinogène consiste en du fibrinogène humain.
Dans certains modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention, le fibrinogène consiste en un fibrinogène purifié d'origine naturelle.
Dans d'autres modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention, le fibrinogène consiste en un fibrinogène recombinant. On peut utiliser par exemple un fibrinogène recombinant préparé selon l'un quelconque des procédés décrits dans les demandes internationales PCT publiées sous les n WO-207/103447, WO-2005/010178, WO-ou encore WO-1995/022249. Ledit fibrinogène recombinant peut se présenter sous la forme d'une composition pharmaceutique dans laquelle les molécules de fibrinogène recombinant sont combinées à un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Dans les modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention dans lesquels le fibrinogène consiste en du fibrinogène purifié d'origine naturelle, ledit fibrinogène est purifié à
partir de plasma humain et est le cas échéant combiné à un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
On peut par exemple utiliser du fibrinogène purifié d'origine naturelle préparé comme décrit dans la demande de brevet européen publiée sous le n EP 1 739 093. Il s'agit d'un fibrinogène purifié d'origine naturelle se présentant sous la forme d'un concentré de fibrinogène obtenu par un procédé de purification à partir d'une fraction de plasma humain solubilisée qui comprend les étapes successives de :
a) purification chromatographique comprenant les étapes de i) chargement d'un échangeur d'anions de type base faible en ladite fraction solubilisée, préalablement équilibré par un

12 PCT/FR2010/050380 tampon de force ionique prédéterminée de pH basique, ii) élution d'une colle biologique par augmentation de la force ionique dudit tampon, b) séparation du Facteur XIII à partir du fibrinogène par ajout dans au moins une partie de l'éluat de colle biologique d'au moins un agent chimique précipitant du Facteur XIII, et récupération de la solution résultante de surnageant de fibrinogène purifié, et c) diafiltration des solutions de fibrinogène, de colle biologique et de FXIII
remis en solution, suivie d'une lyophilisation desdites solutions.
On peut aussi utiliser du fibrinogène purifié d'origine naturelle préparé
comme décrit dans la demande PCT n WO-2005/004901. Il s'agit d'un fibrinogène purifié
d'origine naturelle se présentant sous la forme d'un concentré de fibrinogène obtenu par un procédé de purification comprenant une étape d'inactivation virale par traitement thermique d'un lyophilisat de protéines cryoprécipitables du plasma humain. Le procédé décrit dans la demande PCT n WO-2005/004901 est caractérisé notamment par l'ajout, avant la mise des protéines cryoprécipitables sous la forme d'un lyophilisat, d'une formulation stabilisante et solubilisante comprenant un mélange d'arginine, d'au moins un acide aminé hydrophobe et de citrate tri-sodique.
On peut aussi utiliser du fibrinogène purifié d'origine naturelle préparé
selon le procédé
général décrit dans la demande de brevet européen n EP 1 739 093 et qui comprend une étape d'inactivation virale du type de celle décrite pour le procédé divulgué
dans la demande PCT n WO-2005/004901.
Le fibrinogène purifié d'origine naturelle obtenu sous la forme d'un concentré
de fibrinogène de plasma humain par un procédé choisi parmi les procédés décrits dans la demande de brevet européen n EP 1 739 093 ou dans la demande PCT n WO-possède l'avantage de comprendre une forte concentration de fibrinogène humain, de l'ordre de 15g/I à 20g/I.
Un tel concentré de fibrinogène humain, qui peut aussi être désigné FGT1 dans la présente description, est particulièrement bien adapté aux utilisations du fibrinogène selon l'invention qui requièrent l'administration d'une quantité importante de fibrinogène au moins égale à 4,5g, préférentiellement dans une dose unique, du fait d'un fort taux de récupération en fibrinogène de ce type de concentré. Un autre avantage de ce type de concentré
de fibrinogène humain d'origine plasmatique est la faible teneur dudit concentré en les autres protéines plasmatiques, ce qui réduit considérablement la quantité totale de protéines plasmatiques qui sont administrées au patient.
Un avantage supplémentaire est le haut degré de sécurisation virale de ce type de concentré de fibrinogène humain.
Dans certains modes de réalisation préférés, le fibrinogène se présente sous la forme d'un lyophilisat, le cas échéant en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.

13 PCT/FR2010/050380 Dans certains modes de réalisation préférés, le fibrinogène se présente sous la forme d'un lyophilisat, le cas échéant en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables, contenu dans un récipient dont l'atmosphère intérieure est maintenue à une pression inférieure à la pression atmosphérique.
Avantageusement, le volume intérieur du récipient est maintenu sous une dépression de vide partiel.
Préférentiellement, ledit concentré de fibrinogène lyophilisé est contenu dans un dispositif de reconstitution sous vide. La solution de fibrinogène à
administrer au patient peut être préparée extemporanément par ajout dans le flacon sous vide du volume approprié d'un solvant adapté, par exemple de l'eau ou une solution saline, stérile et apyrogène. De manière générale, la solution de fibrinogène obtenue après reconstitution à partir du concentré lyophilisé
de fibrinogène est conservée au plus pendant 7 jours, préférentiellement au plus 24 heures, à
25 C ou préférentiellement au plus 6 heures, à 25 C.
Dans certains modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention, le fibrinogène purifié
ou le fibrinogène recombinant se présente sous la forme d'une composition pharmaceutique dans laquelle ledit fibrinogène est combiné avec un ou plusieurs excipients choisis parmi le chlorhydrate de lysine, le trometamol, la glycine, le citrate de sodium et le chlorure de sodium.
Dans certains modes de réalisation, ledit fibrinogène est combiné avec la totalité des excipients suivants : le chlorhydrate de lysine, le trometamol, la glycine, le citrate de sodium et le chlorure de sodium. De préférence, pour la reconstitution de la composition pharmaceutique liquide à
administrer, le solvant utilisé consiste en de l'eau pour préparations injectables.
Dans d'autres modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention, le fibrinogène purifié
ou le fibrinogène recombinant se présente sous la forme d'une composition pharmaceutique dans laquelle ledit fibrinogène est combiné avec un ou plusieurs excipients choisis parmi le chlorhydrate d'arginine, l'isoleucine, le chlorhydrate de lysine, la glycine, et le citrate de sodium.
Dans certains modes de réalisation, ledit fibrinogène est combiné avec la totalité des excipients suivants : le chlorhydrate d'arginine, l'isoleucine, le chlorhydrate de lysine, la glycine, et le citrate de sodium. De préférence, pour la reconstitution de la composition pharmaceutique liquide à administrer, le solvant utilisé consiste en de l'eau pour préparations injectables.
Un flacon de concentré de fibrinogène FGT1 à reconstituer avec 100 ml d'eau PPI
est constitué de 1.5 g de fibrinogène, 4 g d'Arginine, l g d'Isoleucine, 0,2 g d'hydrochloride de Lysine, 0,2 g de Glycine et 0,25 g de citrate de sodium Dans encore d'autres modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention, le fibrinogène purifié ou le fibrinogène recombinant se présente sous la forme d'une composition pharmaceutique dans laquelle ledit fibrinogène est combiné avec un ou plusieurs excipients choisis parmi l'albumine humaine, le chlorure de sodium, le chlorhydrate d'arginine, le citrate de sodium, et l'hydroxyde de sodium. Dans certains modes de réalisation, ledit fibrinogène est combiné avec la totalité des excipients suivants : l'albumine humaine, le chlorure de sodium, le chlorhydrate d'arginine, le citrate de sodium, et l'hydroxyde de sodium. De préférence, pour la

14 PCT/FR2010/050380 reconstitution de la composition pharmaceutique liquide à administrer, le solvant utilisé consiste en de l'eau pour préparations injectables.
De préférence, l'étape d'administration du fibrinogène à une quantité au moins égale à
4,5 g est réalisée avec un médicament adapté à une injection par voie parentérale, du type des compositions pharmaceutiques décrites ci-dessus.
Dans les modes de réalisation préférés de l'utilisation du fibrinogène selon l'invention, celle-ci est réalisée avec un médicament adapté à une administration par la voie intraveineuse (IV). Ainsi, dans des modes de réalisation préférés d'une méthode de traitement préventif ou curatif selon l'invention, l'étape d'administration du fibrinogène en une quantité au moins égale à 4,5 g consiste en une étape d'administration par voie intraveineuse.
Dans certains modes de réalisation de l'utilisation selon l'invention, on utilise des récipients sous vide renfermant un concentré lyophilisé de fibrinogène comprenant une quantité
de 1,5 g de fibrinogène, ce qui signifie que le contenu de quatre récipients sont utilisés pour préparer l'administration de la quantité désirée de fibrinogène en une dose unique d'environ 6 g.
Dans certains modes de réalisation préférés, la composition liquide reconstituée contenant le fibrinogène humain est administrée par voie intraveineuse selon un débit d'administration allant de 5 mUminute à 30 mUminute. De préférence, la composition liquide reconstituée de fibrinogène humain est administrée par voie intraveineuse selon un débit d'environ 20 mUminute, ce qui englobe de 15 mUminute à 25 mUminute. Un débit important d'administration de ce type est justifié par l'urgence à réduire les troubles de l'homéostasie chez les patients affectés d'une hémorragie aiguë sévère.
La présente invention est également relative à une composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, du fibrinogène, ladite composition pharmaceutique étant caractérisée en ce qu'elle est adaptée à l'administration par voie parentérale d'une dose unique comprenant une quantité de fibrinogène au moins égale à 4,5 g, préférentiellement d'environ 6 g, de fibrinogène.
La présente invention est en outre illustrée, sans y être limitée, aux exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : Traitement d'hémorragies du post-partum A. Matériels et méthodes Patients La présente étude porte sur 320 patientes ayant donné naissance par voie vaginale ou par césarienne, à plus de 27 semaines de grossesse et présentant une hémorragie post-partum sévère.

15 PCT/FR2010/050380 L'hémorragie post-partum sévère se caractérise par un volume d'hémorragie supérieur ou égal à 1000 mL et résistante à 2 lignes de traitement utérotonique.

Concentré de fibrinogène humain plasmatique Les patientes sont traitées par une simple administration d'un bolus de 6 g de FGT1, injecté par voie intraveineuse, immédiatement après reconstitution. Le concentré de fibrinogène humain contient 1,5g de fibrinogène Protocoles de traitement L'administration du bolus de 6 g de fibrinogène est réalisée sans dosage préalable du taux de fibrinogène circulant.

Observations cliniques après traitement Le volume de sang perdu après administration du FGT1 est suivi après l'administration du traitement consistant en 6g de FGT1 administré par voie intraveineuse rapide ainsi que le temps écoulé entre l'administration du FGT1 et la fin de l'hémorragie. Le succès de la thérapeutique sera évalué sur l'absence de recours à des ressources ultimes, de transfusion massive et de décès au bout de 12 heures.

Exemple 2 : Efficacité dans un modèle de porc hémorragique A. Matériels et méthodes A.1. Objectif de l'étude L'étude de l'exemple 2 a consisté à comparer l'efficacité de différentes doses (de 37,5 mg/kg à 600 mg/kg) de compositions de fibrinogène (compositions de concentré
de fibrinogène humain désignées "FGT1 ") chez les porcs. L'effet sur l'hémostase et sur la perte sanguine a été
mesuré chez les animaux après l'application de blessures osseuses et hépatiques standardisées.
Objectifs Les objectifs de l'étude de l'exemple 2 étaient de déterminer:
- si l'efficacité d'un traitement pro-coagulant avec différentes concentrations de fibrinogène induisait des effets différents sur l'hémostase et la perte sanguine;
- si une administration unique de doses croissantes de concentré de fibrinogène induisait des niveaux de fibrinogène plasmatique distincts et/ou entraînait des temps de demi-vie plasmatique distincts pour le fibrinogène; et

16 PCT/FR2010/050380 - si le traitement pro-coagulant avec le concentré de fibrinogène induisait une situation d'hypercoagulation associée à des complications thrombo-emboliques subséquentes.

A.2. Animaux Cette étude a été réalisée chez quarante-deux porcs sains âgés de 12 à 14 semaines et ayant un poids corporel allant de 25 à 35 kg. Le modèle animal a été utilisé
afin de déterminer la dynamique de fermeté du caillot et de perte sanguine dans une situation où
du fibrinogène est administré après l'induction d'une coagulopathie de dilution.
A.3. Anesthésie La pré-médication des animaux a été réalisée avec de l'azaperone (4 mg/kg, injection intra-musculaire-StresnilTM, Janssen, Vienne, Autriche) et de l'atropine (0,1 mg/kg par injection intra-musculaire) une heure avant le début de l'expérience. L'induction et le maintien de l'anesthésie ont été réalisés avec du propofol (1-2 mg/kg par injection intraveineuse). Pour l'induction de l'analgésie, on a injecté du piritramide (30 mg, opioïde avec un temps de demi-vies d'environ 4 à 8 heures-DipidolorTM, Janssen, Vienne, Autriche). La relaxation musculaire a été réalisée par l'utilisation de 0,6 mg/kg par heure de rocuronium après anesthésie endotrachéale.
Après l'obtention de l'anesthésie endotrachéale, on a anatomiquement préparé
l'artère fémorale, les deux veines fémorales ainsi que l'artère sous-clavière. Le besoin de base pour le remplacement de liquide (4 mg/kg de poids corporel) a été réalisé au cours de l'essai avec des cristalloïdes (solution de lactate de Ringer). Puis on a placé dans ces vaisseaux les cathéters invasifs suivant:
- un cathéter de large diamètre (accès veineux à double lumière avec une longueur de 20 cm), - un cathéter de Swan-Ganz, et - un moyen de mesure invasif de la pression sanguine artérielle.

Puis, les mesures initiales des valeurs de base ont été réalisées (repère de temps n 2 sur la figure 1).

A.4. Hémodilution Après avoir été instrumentés comme décrit ci-dessus, les animaux ont subi une hémodilution normovolémique avec une solution à 6% de HES 130/0,4 (Voluven , Fresenius co., Bad Homburg, Allemagne).
Le sang a été prélevé chez les animaux, étape par étape, en utilisant les cathéters larges et le sang a été remplacé avec la solution colloïdale dans un rapport de 1:1. Pour

17 PCT/FR2010/050380 l'obtention d'une perte totale sanguine estimée d'environ 60%, les animaux avec un poids de par exemple 30 kg ont été infusés avec 1700 ml de solution HES à 6%: 130/0,4 (Voluven , Fresenius co., Bad Homburg, Allemagne). Après réalisation de l'hémodilution, le sang collecté a été traité dans un système de type cell saver (Cats , Fresenius), a été
concentré et transfusé à nouveau, afin de prévenir une anémie liée à l'hémodynamique.
L'hémodilution normovolémique a été atteinte lorsque la coagulopathie résultante a atteint une valeur de fermeté maximale du caillot (MCF) inférieure à 40 mm, comme cela était mesuré
par thromboélastométrie (repères de temps n03 et 4 sur la figure 1).

A.5. Blessure osseuse standardisée On a réalisé une blessure osseuse standardisée par forage d'un trou de 3 mm dans la tête du tibia à une profondeur requise pour pénétrer la moelle osseuse, cinq minutes avant l'administration du médicament testé. Cinq minutes après la blessure osseuse, on a réalisé une mesure de fibrinogène (repère de temps n 5 sur la figure 1), suivie par une administration du médicament de test (repère de temps n 6 sur la figure 1). L'excès sanguin a été éliminé par succion de la surface de la blessure entre l'os et le muscle et réuni dans une cuve de collecte.
On a également déterminé la durée jusqu'à l'hémostase. Dans le cas où la perte sanguine due à la blessure osseuse a excédé 500 ml, l'hémorragie a été stoppée par compression en utilisant un bandage de gaz standard, afin de s'assurer que le porc était stable d'un point de vue hémodynamique pour les quatre heures suivantes d'observation.
Quinze minutes après l'administration du médicament testé, on a réalisé des déterminations additionnelles de tous les paramètres mesurés (paramètre de temps n 4). De plus, une heure, deux heures et quatre heures après l'administration du médicament testé, on a réalisé des mesures de tous les paramètres (repère de temps n 7 sur la figure 1).
A.6. Blessure hépatique standardisée Quatre heures après l'administration du fibrinogène, on a réalisé une blessure hépatique standardisée en pratiquant une incision centrale du ligament falciforme au-dessus du lobe hépatique central, en utilisant un gabarit. L'incision hépatique résultante a une longueur d'environ 8 cm et une profondeur d'environ 2 cm (repère de temps n 8 sur la figure 1). Aucun effet sur la circulation médiée par les catécholamines n'est intervenu. La réalisation d'une blessure hépatique standardisée a été choisie de manière à démontrer que la coagulation altérée affectait négativement la mortalité.
Deux heures après avoir réalisé la blessure hépatique ou immédiatement avant la mort suspectée, on a réalisé des mesures de tous les paramètres (repère de temps n 9 sur la figure 1). Deux heures après le traumatisme hépatique, les animaux survivants ont été
euthanasiés en leur administrant une infusion de potassium. Conformément aux résultats d'une étude pilote antérieure, une évaluation de suivi pendant deux heures a été considérée comme étant

18 PCT/FR2010/050380 suffisante (Fries et al., 2006, Br. J. Anaesth., Vol. 97 (4) : 460-467 ; Fries et al., 2005, Br. J.
Anaesth., Vol. 95 (2) : 172-177).
On précise que l'étude a été réalisée en aveugle.

A.7. Distribution aléatoire des animaux ( randomization ) En utilisant un programme d'ordinateur approprié, les animaux ont été
distribués de manière aléatoire (randomisés) dans les groupes 1 à 6 (1 : 37,5 mg/kg, 2 : 75 mg/kg, 3 : 150 mg/kg, 4: 300 mg/kg, 5: 450 mg/kg et 6: 600 mg/kg).

A.8. Protocole expérimental Le protocole expérimental est notamment illustré par la figure 1 et par le Tableau ci-dessous, dans lequel les détails du traitement des 42 porcs inclus dans l'étude sont décrits.
Tableau 1 Dose de Volume de Vitesse Nombre fibrinogène la dose de d'infusion d'animaux (mg/kg) fibrinogène (mUmin)*
(mUkg) ou de NaCI
Placebo (0 40 de NaCI 40 6 mg/kg) 37,5 2,5 2,5 6 * pour un porc de 30 kg.

L'administration de fibrinogène a été réalisée par infusion pendant 30 minutes.
A.9. Échantillonnage du sang et méthodes d'analyse Tous les échantillons de sang ont été collectés à partir de l'artère fémorale et le premier volume de 5 ml de sang a été éliminé. Les échantillons de sang pour l'étude ROTEM et l'analyse de la coagulation ont été collectés dans des tubes de 3 ml contenant 0,3 ml (0,106 mol/L de tampon citrate de sodium à pH 5,5 (Sarstedt, Nuermbrecht, Allemagne).
Les échantillons de sang pour les besoins du comptage des cellules sanguines ont été collectés dans des tubes de 2,7 ml contenant 1,6 mg d'EDTA/ml (Sarstedt, Nuermbrecht, Allemagne).
Tous les tests ont été réalisés par le même expérimentateur. Le temps de prothrombine (PT), le

19 PCT/FR2010/050380 temps de génération de thombine (TGT), le temps de thromboplastine partielle (PTT-LA1), la concentration de fibrinogène, l'antithrombine (AT) et la thrombine-antithrombine (TAT) ont été
déterminés par des méthodes de laboratoire standards en utilisant les tests appropriés de Dade Behring, Marburg, Allemagne et l'appareil de coagulométrie Amelung (Baxter, Royaume-Uni).
Pour les mesures de D-dimer, on a utilisé le test D-dimer-0020008500 (Instrumentation Laboratory Company, Lexington, Etats-Unis). Le comptage des cellules sanguines a été réalisé
en utilisant le compteur Sysmex Poch-100i (Sysmex, Lake Zurich, Illinois, Etats-Unis).

A.10. Thromboélastrométrie rotative (ROTEM ) ROTEM est un outil de diagnostic du type "point d'intervention" ("Point of care"), qui permet un test de la coagulation sur le sang total sans nécessiter de test de laboratoire coûteux en temps. De plus, et au contraire des tests de coagulation standard, cette méthode permet d'évaluer l'information sur la qualité du caillot, et tout spécialement sur la fermeté du caillot.
ROTEM consiste en une modification du concept de thromboélastographie qui a été
développé à l'origine par Hartert en 1948. La méthode consiste en un capteur cylindrique qui est immergé dans une cuvette contenant l'échantillon de sang. Le capteur est en rotation à un degré de 4,75 selon son axe longitudinal. Ce mouvement est altéré dés que les brins de fibrine commencent à se former entre la cuvette et le capteur. Cette inhibition est détectée par un changement du facteur de réflexion lumineuse qui est détectée en continu et transformée en une courbe classique typique de type ROTEM dans laquelle sont déterminés les paramètres suivants:
- CT, qui signifie le temps de coagulation ("Clotting time"), exprimé en secondes, qui est le temps écoulé jusqu'au début de la coagulation, - CFT, qui signifie le temps de formation du caillot ("Clot Formation Time"), exprimé
en secondes, et qui le temps écoulé entre le début de la coagulation et le moment où une amplitude de 20 mm est atteinte, - MCF, qui signifie le maximum de fermeté du caillot ("Maximum Clot Firmness"), qui est exprimé en millimètres, et qui est l'amplitude maximale, et - le pourcentage de lyse maximum ("Maximum Lysis (%)"), qui est le pourcentage d'amplitude (MCF), 60 minutes après le début de la coagulation.

Tests ROTEMM
Différents tests d'agents activateurs de la coagulation sont disponibles, comme détaillé ci-dessous. Les tests utilisés dans l'exemple 2 sont le test INTEM et le test FIBTEM
modifié.

20 PCT/FR2010/050380 - INTEM: lorsqu'on réalise un test INTEM, la coagulation est activée via la voie intrinsèque. Le réactif INTEM contient de l'acide ellagique qui est un activateur fort de la voie de la coagulation intrinsèque.
- EXTEM: lorsqu'on réalise un test EXTEM, la coagulation est activée par le facteur tissulaire.
- FIBTEM: le test FIBTEM active la coagulation avec le facteur tissulaire. Au même moment, la fonction des thrombocytes est altérée en ajoutant de la cytochalasine D.
Cela résulte en la formation d'un caillot qui est uniquement induit par le fibrinogène.
- Le test FIBTEM modifié a été utilisé du fait que des expériences antérieures ont montré que les thrombocytes de porc ne peuvent pas être complètement bloqués par la cytochalasine D. Pour cette raison, les thrombocytes ont été
complètement éliminés de ce test en réalisant un test EXTEM sur un échantillon plasmatique au lieu de sang total (FIBTEM modifié).

A.11. Echantillonnage de tissus, conservation, préparation des lames d'essais et examen microscopique Les échantillons des tissus provenant des organes (poumons, coeur, reins, intestins et foie) ont été prélevés à la fin de chaque expérience après dissection de l'animal. Les échantillons ont été immédiatement immergés dans une solution de formaline à
10%. Après déhydratation par une séquence ascendante d'étapes mettant en oeuvre des échantillons d'alcool, les échantillons ont été inclus dans de la paraffine et coupés selon des tranches de 7 m d'épaisseur. Les lames d'essais ont été colorées par la technique de coloration classique hématoxyline/éosine, puis ont été examinées.

A.12. Analyse statistique Le test de Shapiro Wilks a été utilisé afin de vérifier la normalité de la distribution des variables de l'étude. La présomption de normalité de la distribution a été
rejetée pour les variables suivantes: ZVD, WEDGE, SPO2, CT, ALPHA.
Pour ces variables, seuls des tests non paramétriques sont valides.
Tests paramétriques: on a utilisé l'analyse de variance (ANOVA) pour des mesures répétées afin d'évaluer les différences entre les groupes de test . Une valeur de signification de 0,05 a été retenue pour les groupes d'effets, les mesures, et la mesure du groupe x.
Des comparaisons multiples ont été évaluées contre le groupe placebo en utilisant le protocole de Dunnett.

21 PCT/FR2010/050380 Un test non paramétrique a été réalisé en utilisant le test de Kruskal-Wallis:
on a comparé tous les groupes dans un seul test. Un niveau de signification statistique de 0,05 a été
retenu.
Le test de Wilcoxon a été comparé pour chaque groupe de test, avec le groupe placebo.
Du fait du protocole de comparaison multiple de Bonferroni, seules des valeurs de P
inférieures à 0,0084 (0,05 divisé par le nombre de comparaisons (6)) ont été
retenues comme valeurs statistiquement significatives.
Un test de Jonckheere-Terpstra a été utilisé afin d'évaluer si la perte sanguine totale diminuait avec les doses croissantes de fibrinogène. Du fait que la distribution de la perte sanguine totale n'est pas normale, ce test non paramétrique pour des différences ordonnées dans les groupes de traitement est approprié (non parametric statistical methods, Hollander and Wolfe, 1973). Le test de Jonckheere-Terpstra teste l'hypothèse nulle que la distribution de la perte totale sanguine ne diffère pas selon les groupes ayant reçu des doses distinctes de fibrinogène (respectivement témoin, 37,5 mg/kg, 75 mg/kg, 150 mg/kg, 300 mg/kg, 450 mg/kg et 600 mg/kg).
On a utilisé le test de Student afin de comparer les paramètres spécifiques aux valeurs témoins de base après hémodilution.

B. Résultats B.1. Paramètres de la coagulation 1) Paramètres ROTEMM
Les paramètres ROTEM ont été significativement affectés après l'hémodilution avec Voluven . Le temps de coagulation a augmenté et la valeur du maximum de fermeté du caillot a diminué significativement après l'infusion de Voluven (p<0,0001). De la même manière, l'angle a a diminué significativement et la durée de formation du caillot significativement augmenté (p<0,001). L'administration de fibrinogène n'a pas significativement raccourci la durée prolongée de coagulation mais a significativement accru le MCF (p<0,001 contre le placebo pour les groupes correspondants aux doses 150 mg/kg à 600 mg/kg, 15 minutes après achèvement de l'infusion de fibrinogène) et l'angle a (p<0,05 contre le placebo pour tous les groupes de dosage 15 minutes après achèvement de l'infusion de fibrinogène).
Dans le cadre d'une hémodilution à 60%, les résultats montrent que le traitement avec une dose de 150 mg/kg de fibrinogène est capable de restaurer complètement les valeurs de MCF de base initiales.
Des doses plus importantes de fibrinogène ont induit un accroissement des valeurs de INTEM
MCF jusqu'à un maximum de 80 mm, valeur à laquelle un plateau est atteint (figures 2-4 et 6).
2) Tests standard de coagulation

22 PCT/FR2010/050380 La valeur de PT a augmenté significativement de 11,11 +/- 0,7 Is à 17,43 +/-1,9 Is après hémodilution (p<0,0001 contre valeur de base initiale ou BL pour BaseLine ). Après l'administration de fibrinogène, les valeurs de PT ont augmenté
significativement jusqu'à 14,54 +/- 1,44 s, comparées à l'hémodilution (p<0,0001); cependant, il n'y a pas eu de différence significative entre les groupes.
Les valeurs de aPTT ont augmenté significativement de 10,94 +/- 3,34 s initialement jusqu'à 21,7 +/- 2,72 s après hémodilution (p<0,001).
Après administration du fibrinogène, la valeur de aPTT est restée élevée comparée à la valeur initiale. Il n'y avait pas de différence entre les groupes, à
l'exception du groupe F qui a présenté une valeur significativement accrue de aPTT, comparé au groupe placebo et aux autres groupes de dosage, à tous les temps après l'administration du médicament.
La valeur de D-dimer a été significativement accrue comparée au placebo, au temps quatre heures après l'administration de fibrinogène pour les groupes E et F
(p<0,01). Pour les groupes A, D, E et F, on a montré un accroissement significatif de la valeur de D-dimer à la fin de l'expérience (p<0,05 pour le groupe A et p<0,001 pour les groupes D, E et F).
Les valeurs de TAT et de génération de thrombine (méthode Calatzis) ne se distinguaient pas des valeurs du groupe placébo.

3) Concentration en fibrinogène plasmatique La concentration en fibrinogène plasmatique a significativement diminué après l'hémodilution, comparé à la valeur de base (p<0,0001) comme cela est illustré
sur la figure 5.
Tous les animaux traités avec des doses de fibrinogène de 150 mg/kg ou plus ont présenté un accroissement significatif des niveaux de fibrinogène plasmatique comparés au placebo, aux temps 15 minutes, 1 heure, 2 heures et 4 heures après le traitement (p<0,001).
Le groupe B a présenté une augmentation significative de la concentration en fibrinogène seulement 15 minutes, 1 heure et 4 heures après le traitement (p<0,05). Tous les groupes ont présenté une réduction dans les niveaux de fibrinogène 2 heures après la blessure hépatique ou juste avant la mort. Cependant, les animaux traités avec des doses de 300 mg/kg ou plus de fibrinogène ont présenté des niveaux de fibrinogène significativement accrus au temps 2 heures, comparés au placebo.

B.2. Comptage sanguin Après le prélèvement de 60% du volume total sanguin et le remplacement du sang avec du Voluven , les valeurs d'hémoglobine ont significativement chuté à des niveaux entre 3-4 g/dl (p<0,0001, contre la valeur de base initiale BL ). L'hématocrite a significativement chuté de manière parallèle à des valeurs entre 11% et 13% (p<0,0001). Après re-transfusion des globules rouges, les valeurs d'hémoglobine et d'hématocrite ont significativement augmenté

23 PCT/FR2010/050380 jusqu'à 5-6 g/dl et jusqu'à 18-20% respectivement (p<0,0001 contre la valeur de base initiale BL pour les deux paramètres).

B.3. Hémodynamique et saturation mixte en oxygène La saturation mixte en oxygène veineux a significativement augmenté après hémodilution (p<0,0001 contre la valeur de base initiale de base BL ) et a augmenté à
nouveau après la re-transfusion des globules rouges (p<0,01 après hémodilution). Il y a eu une augmentation significative dans la saturation mixte de l'oxygène veineux (p<0,001), 2 heures après la blessure hépatique/ ou juste avant la mort des animaux, comparé au temps après re-transfusion des globules rouges.

B.4. Perte sanguine La perte totale sanguine après la blessure osseuse et la blessure hépatique était de:
- 42,12 +/- 18,792 ml/kg dans le groupe placebo, -41,55+/- 13,944 ml/kg à 37,5 mg/kg de fibrinogène, -34,30+/- 13,593 ml/kg à 75 mg/kg de fibrinogène, - 29,41 +/- 12,508 ml/kg à 150 mg/kg de fibrinogène, -29,79+/- 10,155 ml/kg à 300 mg/kg de fibrinogène, -26,59+/- 16,250 ml/kg à 450 mg/kg de fibrinogène, et -28,02+/- 10,325 ml/kg à 600 mg/kg de fibrinogène.
L'analyse statistique a montré un effet dose-réponse significatif (p=0,02), indiquant une réduction de la perte totale sanguine pour des doses croissantes de fibrinogène.
Les animaux qui ont reçu 150 mg/kg de fibrinogène ou des doses plus grandes ont présenté une augmentation significative dans la capacité de formation du caillot, comme cela est illustré par un accroissement significatif de la taille du caillot, formé
à la surface du foie après la blessure (150 mg/kg: p<0,05 contre placébo; 300-600 mg/kg: p<0,01 contre placébo), comme cela est illustré sur la figure 7.

B.6. Examen histologique L'examen histologique des reins, des intestins, de la rate, des poumons, du c ur et du foie des animaux n'a pas permis de montrer une quelconque thrombose microvasculaire dans les vaisseaux.

Conclusion Il est connu que, en raison d'une hémorragie massive, la concentration plasmatique en fibrinogène a atteint des niveaux critiques avant n'importe quel autre facteur de coagulation.

24 PCT/FR2010/050380 La première ligne de traitement pour une hémorragie sévère consiste en l'administration de liquides cristalloïdes et colloïdes afin de maintenir la normovolèmie.
Cependant, les colloïdes et tout spécialement l'amidon hydroxyéthylé (HES) sont connus pour affecter la polymérisation de la fibrine.
La conséquence est une résistance diminuée du caillot qui peut conduire à une perte sanguine subséquente.
Le premier résultat principal de l'étude de l'exemple 2 est que l'administration de fibrinogène est capable de réverser la coagulopathie de dilution de manière dose-dépendante.
Les mesures ROTEM ont clairement montré que le maximum de fermeté du caillot (MCF) était augmentée et normalisée après l'administration de fibrinogène.
Les valeurs de INTEM ont montré que l'administration de 150 mg/kg de fibrinogène étaient capables de restaurer complètement les valeurs de MCF initiales.
Le test FIBTEM modifié a montré la même tendance concernant les valeurs de MCF
cependant, pour les dosages de 300, 450 et 600 mg/kg, les valeurs de MCF ont augmenté bien au-delà des niveaux initiaux.
Tous les animaux ont présenté un accroissement dose-dépendant de la concentration du fibrinogène plasmatique, qui était stable pendant la totalité de la durée de l'expérience.
Il est important de noter que, même si la concentration de fibrinogène plasmatique a augmenté au-delà des niveaux initiaux, les valeurs de MCF INTEM n'ont pas suivi cette augmentation de manière linéaire : à des concentrations de fibrinogène plasmatique de 350 mg/dl, les valeurs de MCF ont atteint un plateau ; un accroissement supplémentaire de la concentration de fibrinogène n'a pas conduit à une augmentation des valeurs de MCF.
Ces résultats suggèrent l'existence d'un mécanisme de sauvegarde qui prévient une sur-réaction du processus de coagulation dans une situation de biodisponibilité en excès du fibrinogène. La présence de plaquettes semble être cruciale pour la mise en place de ce mécanisme, puisque les données de EXTEM plasmatique (ou les plaquettes sont pratiquement absentes) ne suggère pas un tel comportement : tout spécialement dans les groupes à haut dosage (300-600 mg/kg) les valeurs de MCF augmentent bien au-delà de la valeur de base initiale ( baseline ).
De manière surprenante, les résultats à l'exemple 2 montrent que le fibrinogène n'induit pas d'état d'hyper-coagulation, ni n'induit d'évènements thrombo-emboliques.
En particulier, on n'a pas détecté de signes d'évènements thrombo-emboliques, que ce soit du point de vue macroscopique ou du point de vue microscopique.
Le fibrinogène n'a affecté ni la production de trombine, ni le TAT.
A la connaissance du demandeur, les résultats présentés dans l'exemple 2 sont les premiers à montrer que des doses de fibrinogène aussi élevées que 12 fois le dosage de fibrinogène recommandé chez l'humain (selon la Société autrichienne d'Anesthesiologie, Reanimation and Intensive Care Medicine, accessible sur internet à l'adresse suivante :

25 PCT/FR2010/050380 http:,,',/www.oeagri.at/dateîarchiv,,'l 16/Traumainduziertes%2OGerinnun smana ement. df, peuvent être administrées in vivo.

Les résultats de l'exemple 2 ont aussi montré une réduction de la perte sanguine après l'administration de fibrinogène et un accroissement, dose-dépendant, de la taille du caillot après blessure hépatique.
Ces résultats sont à mettre en parallèle avec les données concernant une augmentation des valeurs de MCF après le traitement par le fibrinogène et ont montré
clairement que la capacité de formation du caillot était améliorée après administration du fibrinogène.
Notamment, des doses de fibrinogènes de 150mg/kg ou supérieur ont significativement accru la taille du caillot.
En résumé, l'étude de l'exemple 2 confirme que l'administration d'un concentré
de fibrinogène humain (FGTW) est capable de réverser la coagulopathie de dilution de manière dose-dépendante. Un traitement a une dose de 150mg/kg est capable de restaurer complètement les valeurs de MCF jusqu'au valeur initiale de base. Les résultats de l'exemple 2 montre également que les valeurs de MCF INTEM atteignent un plateau à des concentrations de fibrinogène plasmatique de 350 mg/dl. Des concentrations plus importantes de fibrinogène plasmatique n'augmentent pas davantages les valeurs de MCF. L'administration de fibrinogène réduit significativement la perte sanguine après blessure hépatique et augmente la capacité de coagulation de manière dépendante de la dose.
Ces résultats suggèrent que des doses encore plus importantes de fibrinogène sont d'une totale innocuité chez l'homme, du fait que l'on pas détecté
d'hypercoagulabilité. Un traitement à des doses douze fois supérieures à la dose recommandée chez l'homme ne produit aucun effet indésirable telle que la thrombose ou une embolie pulmonaire.
Les résultats des exemples montrent également qu'une dose importante de fibrinogène peut être administrée selon une durée de l'étape d'administration qui est très courte, sans provoquer d'effet indésirable.
Comme cela est détaillé ci-dessous, les résultats de l'exemple 2, lorsqu'ils sont transposés à une administration de fibrinogène chez l'homme, indiquent qu'une dose de 6 g de fibrinogène peut être administrée selon une durée de l'étape d'administration de cinq minutes, l'administration de fibrinogène ayant pour effet de prévenir ou stopper une hémorragie, sans simultanément entraîner d'effet indésirable pour le patient. Plus précisément, les résultats de l'exemple 2 montrent que les effets bénéfiques attendus sur le rétablissement des paramètres hémodynamiques, sans provoquer d'effet indésirable, sont obtenus en administrant au modèle expérimental de porc qui est illustré une quantité de fibrinogène de 600 mg/kg avec une durée de l'étape d'administration de 30 minutes, c'est-à-dire une dose de fibrinogène de 0,02 g/kg/min. On précise que la composition de concentré de fibrinogène qui a été
utilisée à
l'exemple 2 (composition FGT1 ) a une concentration en fibrinogène humain de 15 g/l, soit

26 PCT/FR2010/050380 0,015 g/ml. Pour obtenir une dose de fibrinogène de 0,02 g/kg/min, on administre aux porcs une dose de la composition FGT1 précitée de 1,33 ml/kg/min. Transposée à un patient humain ayant un poids de 60 kg, l'administration d'une dose de composition FGT1 de 1,33 ml/kg/min consiste à administrer la composition FGT1 audit patient selon une vitesse d'administration de 80 ml/min. Ainsi, pour une dose de fibrinogène de 6 g à
administrer audit patient humain, en utilisant la composition FGT1 , il est nécessaire d'administrer un volume de 400 ml de la composition FGT1 audit patient, à la vitesse d'administration de 80 ml/min.
En conséquence, la dose de 6 g de fibrinogène, avec la vitesse d'administration précitée, peut être administrée audit patient humain en cinq minutes.

Claims (12)

1. Utilisation du fibrinogène pour la fabrication d'un médicament pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d'une hémorragie aiguë sévère, ledit médicament étant destiné à
l'administration d'une quantité au moins égale à 4,5 g de fibrinogène en une dose unique et de façon rapide avec une durée d'administration inférieure à 30 minutes.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit médicament est adapté à
l'administration par voie parentérale, préférentiellement par voie intraveineuse.

3. Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que ledit médicament est administré de façon indépendante du taux initial de fibrinogène,

4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit médicament permet de restaurer la capacité coagulante sanguine.

5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit médicament permet de contrôler l'hémorragie aigüe sévère et de prévenir son évolution vers une hémorragie incontrôlable.

6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, destiné au traitement des hémorragies aiguës sévères du post-partum.

7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, destiné à la prévention ou au traitement des hémorragies aiguës sévères lors d'une intervention chirurgicale.

8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement des hémorragies aiguës sévères post-traumatiques.

9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné à la prévention et au traitement d'autres hémorragies aiguës sévères.

10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le fibrinogène est choisi parmi un fibrinogène recombinant et un fibrinogène naturel purifié.

11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le fibrinogène consiste en un concentré de fibrinogène à haute sécurité virale.

12. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de principe actif, du fibrinogène, caractérisée en ce qu'elle est adaptée à l'administration par voie parentérale d'une dose unique comprenant une quantité au moins égale à 4,5 g.