CA2584543A1 - Protection d'ingredients alimentaires bioactifs par l'utilisation d'ingredients leurres - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, dans lequel le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont protégés : physiquement, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt étant de préférence encapsulés ; et/ou au moyen d'au moins un ingrédient alimentaire leurre contenu dans ledit produit alimentaire, de sorte que leur métabolisation par le ou lesdits microorganismes vivants est réduite. L'invention concerne plus particulièrement un produit alimentaire contenant des microorganismes vivant s, des ingrédients bioactifs d'intérêt et des ingrédients leurres.
Description
Protection d'ingrédients alimentaires bioactifs par l'utilisation d'ingrédients leurres La présente invention se rapporte à un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, dans lequel le ou lesdits microorganismes vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont mis en oeuvre de manière à réduire la métabolisation du ou desdits ingrédients bioactifs par le ou lesdits microorganismes.
Le marché des ingrédients alimentaires, en particulier des peptides, bioactifs ou fonctionnels (i.e., ayant une activité bénéfique pour le consommateur soit localement dans le tube digestif, soit à distance dans l'organisme, après être passés dans le système circulatoire) est, depuis quelques années, en plein essor.
Les peptides bioactifs sont des séquences définies d'acides aminés qui sont inactives au sein de leur protéine d'origine, mais qui présentent des propriétés particulières une fois libérées par action enzymatique. On les appelle aussi peptides fonctionneis. Ces peptides bioactifs sont capables d'exercer, entre autres, un effet sur le système digestif, les défenses de l'organisme (par exemple, un effet antimicrobien ou immunomodulateur), le système cardiovasculaire (notamment un effet antithrombotique ou antihypertenseur), et/ou le système nerveux (tel qu'un effet sédatif et analgésique de type opioïde) (voir tableaux 1 et 2 ci-après).
Le tableau 1 ci-après liste les principaux peptides fonctionnels libérés par l'hydrolyse des protéines du lait humain et du lait de vache.
Le marché des ingrédients alimentaires, en particulier des peptides, bioactifs ou fonctionnels (i.e., ayant une activité bénéfique pour le consommateur soit localement dans le tube digestif, soit à distance dans l'organisme, après être passés dans le système circulatoire) est, depuis quelques années, en plein essor.
Les peptides bioactifs sont des séquences définies d'acides aminés qui sont inactives au sein de leur protéine d'origine, mais qui présentent des propriétés particulières une fois libérées par action enzymatique. On les appelle aussi peptides fonctionneis. Ces peptides bioactifs sont capables d'exercer, entre autres, un effet sur le système digestif, les défenses de l'organisme (par exemple, un effet antimicrobien ou immunomodulateur), le système cardiovasculaire (notamment un effet antithrombotique ou antihypertenseur), et/ou le système nerveux (tel qu'un effet sédatif et analgésique de type opioïde) (voir tableaux 1 et 2 ci-après).
Le tableau 1 ci-après liste les principaux peptides fonctionnels libérés par l'hydrolyse des protéines du lait humain et du lait de vache.
2 Tableau 1 Protéines originelles Peptides fonctionnels* Origine du lait** Activités décrites caséine a a casomorphine V activité opiacée caséine a exorphine V activité opiacée casokinine V activité antihypertensive caséine Q (3 casomorphine H V activité opiacée activité immunomodulatrice + activité
casokinine H V antihypertensive CPP H V action sur les minéraux caséine K CMP=GMP V modulation de la motricité gastrointestinale et de la libération d'hormones digestives casoxine H V antagoniste opiacé
casoplatellines activité antithromboti ue a lactalbumine fragments 50-53 H V activité opiacée
casokinine H V antihypertensive CPP H V action sur les minéraux caséine K CMP=GMP V modulation de la motricité gastrointestinale et de la libération d'hormones digestives casoxine H V antagoniste opiacé
casoplatellines activité antithromboti ue a lactalbumine fragments 50-53 H V activité opiacée
3 lactoglobuline lactorphines V activité opiacée + activité antihypertensive lactoferrine lactoferroxine V antagoniste opiacé
lactoransferrine H
(*) les séquences des acides aminés ne sont pas exactement les mêmes (") H: lait humain / V: lait de vache Le tableau 2 ci-après recense les principales activités physiologiques des peptides fonctionnels issus du lait connus à ce jour.
Tableau 2 ~-_ _--- -- - - ---- - -_ -- _ ----~
' Activités ; Peptides !
-In vitro In vivo animal In vivo homme Réf. ', production de CCK Beucher Caséinomacropeptide par cellule intestinale 1994 (CMP) de rat -------------- ----.-..----- - ---------------------------------- ------ --------- -- ------------- ------------------- --------- - ----------- ---------Veau: après ingestion de CMP (210 mg/kg), inhibition de la sécrétion Homme: après ingestion de gastrique et diminution de la CMP (4g), diminution de la Yvon 1994 concentration plasmatique en CKK sécrétion acide Ben Lapin après introduction dans lumen: Mansour f3 casomorphines effet antisecrétoire sur l'iléon 1988 ._ .- ------------ -..----- ------- ..-------- ---------------- -------------------- ---------- ----------------------- --------- -------- .._.. ----------------Chien: après administration Effet sur la intragastrique, modulation de Schusdziarra e digestion l'insulinémie post-prandiale; annulation 1983 >
de cet effet par la naloxone (3 casomorphines Plusieurs effets au Tomé 1987, ô
naturelles et certains niveau de l'iléon de 1988 - Mahé
de leurs analo ues lapin 1989 w Analogues de R Stimulation de Ben ô
casomorphines non l'absorption intestinale Mansour métabolisés d'électrolytes 1988 ô
Chien: administration 10g caséine/300mL eau par sonde Defilippi Caséine intragastrique: inhibition de la motilité 1995 du grêle, annulée par la naloxone.vs.
10g de protéine de soja: pas d'effet Tableau 2 (suite) - -- - -Activitës Peptides In vitro In vivo animal In vivo homme Réf. Lactoferricine Tomita Inhibition de la 0 Casocidine 1 1994 -(caséine a Sj) -165 croissance des Zucht 203 souches pathogènes 1995 Fragment caséine a Effet Inhibition de la antimicrobien S'B Souris, Mouton: efficace en Lahov (1-23 N terminal) croissance des = souches pathogènes injection IM contre Staphylococcus 1996 isracidine aureus Migliore-Fragment caséine Souris: effet protecteur en injection Samour humaine IV contre K. pneumoniae 1989 Fragments de a Prolifération des lactalbumine bovine lymphocytes humains Kayser ~
et de caséine K (PBL) activités par 1996 bovine Con A
(3 casokinine 10 et (3 Prolifération ou CD
casomorphine 7 de suppression des PBL Kayser W
s nthèse suivant concentration 1996 N
Stimulation de la ô
Caséine (3 humaine phagocytose des ô
54-59 globules rouges de Parker a lactalbumine 51- mouton par les 1984 ~
Effet immuno- 53 macrophages modulateur éritonéaux de souris Stimulation des macrophages périonéaux de la Migliore-Caséine (3 bovine souris Pas de protection in vivo Samour Caséine 191-193 1988 Caséine 63-68 Caséine K bovine Inhibition de la prolifération des Otani Caseino- lymphocytes B des 1992, macropeptides (106- plaques de Peyer 1995 169 chez souris et lapin Tableau 2 (suite) - - - - -- - - - - -- --_J~ _ - - ---Activités Peptides In vitro In vivo animal In vivo homme Réf.
Caséinoglycopeptid e bovin (bCGP) CGP isolé dans le plasma de Chabance 0 Caséinoglycopeptid nouveaux-nés après ingestion 1995 e humain (hCGP) de lait infantile ou lait de mère Inhibition de Jollès Peptide 106-116 de l'agrégation 1986 Effet caséine K bovine plaquettaire antithrombotique Tétrapeptide de Inhibition de lactotransferrine l'agrégation Raha humaine (39-42) plaquettaire 1988 -------- --- -------- - ----------- - -- ------------------------ --------- ----- -------- - --- ---- ------- - --- ------ ------ ------Rat et cobaye avec thrombose artérielle expérimentale: après Drouet injection IV, activité 1990 antithrombotique Hydrolysats enzymatiques de Inhibition de l'ACE Mullaly OD
lactoglobuline et d'~ 1997 >
Ln lactalbumine v~ w Fragments Rats recevant de l'angiotensine I: ô
synthétiques de Inhibition de l'ACE après injection IV, retour au niveau Kohmura o caséine humaine initial de pression artérielle 1989 Rats hypertendus: ingestion de 10 Peptides de lait ~
fermenté par L. mL lait fermenté / kg poids Masuda helveticus et S. corporel, on retrouve les peptides 1996 dans l'aorte avec inhibition de cerevisiae l'ACE
Effet Peptides issus de antihypertenseur lair fermenté par L. Rats hypertendus: après ingestion, Yamamot helveticus diminution de la pression artérielle o 1994 ~. b Peptides issus de la fermentation de lait par L. helveticus + Rats hypertendus: après ingestion, Nakamura S. cerevisiae Val- diminution de la pression artérielle 1995 Pro-Pro (VPP) /
II Rats normaux: pas d'effet Pro-Pro (IPP) ---___- ---------- ------------------ --- --- - --------- --Homme hypertendu (36 sujets): après 8 semaines d'ingestion de 95 mL/j, Hata 1996 diminution de la pression artérielle Tableau 2 (suite) ~- - - -_ _ --- O
Activités Peptides In vïtro In vivo animal In vivo homme Réf. ~----_ -~-_ - -,. -.-~_ -_ - -- ~- ---- - -Rats: après injection intra-carotides, accumulation de Ermisch 1983 casomorphines dans la zone sans casomorphines barrière hématoencéphalique --------------------------- ----------- - ----------- -------------- - ------------------------- ---------------- ------------Veaux nouveaux-nés: après leur premier repas de lait de vache, 0 Umbach 1985 casomorphines dans le sang --------------- -------------- -- ------ ----- ----- ---------------- ----- ----------- ------ --------------------- --------- -----------------------Mini-pores: après ingestion de caséine bovine, (3 casomorphine Meisel 1986 isolée du chyme duodénal -.._..----------------------.._.._ ------ ------ ---------.._..------- ----Chiots: après ingestion de lait de mère, existence de P Singh 1989 casomorphines dans le san.~ .... ._.._.. .._._._.._.._._._.._.
_._.._._......_._.._.. .._.._.._.._.._._.._.._.._.._ N
----Effets opiacés Homme: après ingestion de CD
lait de vache, présence de Svedberg 1985 ~ W
casomorphines dans le contenu intestinal 9 rêle ô
------------- ----- ....... .. .---- ------- --------- ----------- --------------------------------------------------- -----------.. ------ -----------.._.._..
mais pas dans le sang Teschemacher d'adulte 1986 Effet opioïde sur iléon isolé de 1O
Peptides de caséine (3 cobaye annulé par Yoshikawa 1986 humaine de synthèse la naloxone Effets opiôides antagonistes sur Chiba 1989 Casoxines (caséine x) muscle de l'iléon bovine et humaine isolé de cobaye Ces peptides sont le plus souvent obtenus par hydrolyse de protéines végétales (par exemple des protéines de soja) ou animales (par exemple, les caséines ou les protéines sériques du lait), hydrolyse générée par des procédés enzymatiques et/ou fermentaires, le plus souvent accompagnée d'une concentration de la fraction active, étape généralement nécessaire pour apporter le bénéfice santé visé. La fabrication et l'utilisation de ces peptides pour un bénéfice santé font l'objet d'une littérature abondante (voir la Danone World Newsletter N 17 de Septembre 1998).
Parmi les vecteurs alimentaires susceptibles d'accueillir de tels ingrédients, les produits laitiers fermentés figurent en bonne position de part leur bénéfice santé dû à la présence de ferments et de produits de fermentation (c'est-à-dire les molécules issues de la transformation, par les bactéries lactiques, des substrats présents dans le lait). Jusqu'à
présent, la communauté scientifique prenait surtout en compte les propriétés des ferments. Les chercheurs commencent depuis peu à
s'intéresser aux produits de fermentation, parmi lesquels certains peptides occupent une place particulière, car ce sont des messagers biologiques nombreux et spécifiques. Les produits laitiers fermentés paraissent donc particulièrement appropriés comme vecteurs d'hydrolysats de peptides bioactifs obtenus, par exemple, à partir de substrats laitiers comme les caséines ou les protéines sériques.
Un problème majeur se pose alors : les microorganismes et, en particulier, les bactéries lactiques utilisées dans la fabrication des produits laitiers frais (type yoghourts, spécialités laitières fermentées, boissons fermentées à base de lait, etc...), sont généralement capables de consommer les peptides pour satisfaire leurs besoins nutritionnels et, plus particulièrement leurs besoins en azote. On parlera à cet effet dans ce qui suit de métabolisation des peptides . Les bactéries lactiques sont en effet dotées de plusieurs systèmes de dégradation et/ou transport leur permettant de métaboliser les peptides, les faisant alors disparaître du milieu :
1/ un système protéolytique (protéases de paroi PRT) qui découpe protéines et gros peptides pour faciliter leur assimilation ( système de métabolisation extracellulaire ), 2/ des systèmes de transport vers l'intérieur de la cellule, dont l'un est spécifique des oligo-peptides d'une taille proche de 10 acides aminés, l'autre étant adapté au transport de di- et tri-peptides (les lactobacilles possèdent un système supplémentaire de perméases à tri-peptides) ( système(s) de transport vers l'intérieur de la cellule ), et 3/ un système enzymatique intracellulaire capable de dégrader les peptides en acides aminés (comprenant une quinzaine d'endo- et exopeptidases) ( système de métabolisation intracellulaire ).
Etant donné que la quantité de peptides naturellement présents dans le lait est généralement trop faible par rapport aux besoins des bactéries lactiques, il est commun d'accélérer leur croissance en fournissant un supplément de peptides. Ceux-ci sont alors totalement consommés pendant la fermentation.
En définitive, du fait : (i) du besoin en azote des bactéries lactiques, dont les peptides constituent la principale source dans le lait, (ii) de la capacité
de ces bactéries à consommer efficacement les peptides, et (iii) de la survie d'une population importante de bactéries lactiques dans les produits fermentés à base de lait, jusqu'à la date limite de consommation (DLC), la mise en uvre d'ingrédients à base de peptides fonctionnels dans les produits laitiers fermentés est difficile, voire impossible, car ces ingrédients sont le plus souvent consommés par les bactéries lactiques, pendant la fermentation, voire pendant le stockage des produits jusqu'à DLC.
En outre, non seulement ce problème de dégradation par métabolisation intempestive des peptides par les bactéries n'est pas spécifique à un peptide donné, mais il n'est pas non plus spécifique à un ferment (ou microorganisme, de préférence bactérie, capable de fermenter) particulier.
Il s'agit là d'un problème général, qui se pose quels que soient le ou les peptides et le ou les microorganismes considérés.
On citera, à titre d'exemple, le cas du peptide bioactif aS1 [91-100] (voir le brevet européen EP 0 714 910 ; peptide aux propriétés relaxantes contenu dans l'hydrolysat de protéines de lait commercialisé notamment par la société Ingredia : 51-53, Avenue Fernand Lobbedez BP 946 62033 ARRAS Cedex, France, sous le nom Lactium ). La Demanderesse a ainsi observé que la population de bactéries lactiques vivantes dans le produit fini continue de métaboliser le peptide bioactif pendant le stockage du produit fini, si bien qu'après seulement 10 jours (pour des produits frais dont la DLC est de 28 jours), entre 35 et 55% environ du peptide aS1 [91-100] ont disparu, ce qui est tout à fait inacceptable pour garantir un effet santé chez le consommateur (données non montrées).
Puisque la consommation du peptide bioactif est le fait de l'activité
métabolique des ferments, on pourrait envisager de réduire ce phénomène en détruisant tout ou partie des microorganismes, par exemple à l'aide d'un traitement thermique approprié (thermisation ou pasteurisation). En ce cas, il est possible de préserver le peptide aS1 [91-100] (par exemple après chauffage à 75 C pendant environ 1 min).
Toutefois, une telle solution présente de nombreux inconvénients :
- la thermisation d'une masse laitière fermentée implique l'usage de stabilisants ajoutés avant le traitement thermique (pectines, amidons, carraghénanes, etc...), ce qui complique le procédé et augmente sensiblement le coût de la formule ;
- la ligne de fabrication industrielle est plus complexe et demande un investissement spécifique plus important ;
- le produit ne bénéficie plus d'appellations liées aux produits 5 contenant des ferments vivants (type yoghourt) et perd de fait les bénéfices associés à la consommation de ferments lactiques ; et - l'impact organoleptique, généralement négatif, est significatif.
Il existe dès lors un besoin pour un produit alimentaire contenant à la fois 10 des microorganismes vivants, par exemple un yoghourt, et un ou plusieurs ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt, dans lequel ces ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt seraient protégés contre la métabolisation par lesdits microorganismes vivants, et ce, tout en préservant les qualités organoleptiques du produit alimentaire.
Par la présente invention, la Demanderesse apporte une solution qui permet de satisfaire le besoin existant.
La présente invention s'intéresse donc à un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont mis en ceuvre de manière à réduire la métabolisation du ou desdits ingrédients bioactifs par le ou lesdits microorganismes vivants.
Ainsi, la Demanderesse a pu montrer qu'un ou plusieurs ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt pouvaient être efficacement protégés contre la métabolisation par des microorganismes vivants, dès lors que les conditions de mise en oeuvre des uns avec les autres sont appropriées.
De telles conditions de mise en oeuvre appropriées peuvent faire appel à
divers moyens, parmi lesquels :
a) l'utilisation de microorganismes vivants dont la capacité à
métaboliser les ingrédients bioactifs est réduite ; et/ou b) l'utilisation d'ingrédients alimentaires leurres qui sont délibérément livrés en pâture aux microorganismes vivants ;
et/ou c) la mise en oeuvre d'une protection physique des ingrédients bioactifs, notamment par encapsulation de ces derniers.
On notera à cet égard qu'un ou plusieurs de, voire tous, ces moyens peuvent être avantageusement combinés au sein d'un même produit alimentaire.
Un objet de la présente invention est donc un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont protégés :
- physiquement, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt étant de préférence encapsulés ; et/ou - au moyen d'au moins un ingrédient alimentaire leurre contenu dans ledit produit alimentaire, de sorte que leur métabolisation par le ou lesdits microorganismes vivants est réduite.
Comme indiqué brièvement dans la description générale qui précède, par métabolisé ou métabolisation , on entend désigner selon la présente invention la transformation ou dégradation d'une substance par un ou plusieurs microorganismes vivants, visant à sa consommation à titre de source de nutriments, et ayant pour conséquence finale sa disparition, plus ou moins complète, du milieu.
Au sens de l'invention, la métabolisation d'un ingrédient est réduite si elle est inférieure à la métabolisation du même ingrédient lorsque ce dernier n'est pas protégé par au moins l'un des moyens prévus dans le cadre de la présente invention.
Avantageusement, et idéalement, cette métabolisation réduite tend vers, voire vaut, zéro, ce qui revient à peu, quasiment pas, voire pas, de métabolisation dudit ingrédient.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, la quantité résiduelle d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans ledit produit alimentaire est, 3 semaines après sa préparation, comprise entre 50 et 100 % environ par rapport à la quantité d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présente dans le produit juste après sa préparation.
Préférentiellement, ladite quantité résiduelle est comprise entre 80 et 100% environ.
Par quantité résiduelle en ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans ledit produit alimentaire , on entend désigner selon la présente invention le pourcentage d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présent dans ledit produit alimentaire lorsque ce dernier est maintenu dans des conditions de stockage adaptées (par exemple, de l'ordre de 4 à
10 C pour un produit frais) pendant 3 semaines, par rapport au pourcentage d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présent au départ, c'est-à-dire juste après fabrication du produit.
De préférence, le produit alimentaire selon l'invention contient au moins un ingrédient alimentaire leurre.
Par ingrédient alimentaire leurre , on entend désigner selon la présente invention un ingrédient alimentaire (de préférence un peptide, une protéine, un analogue ou un dérivé de ceux-ci, et leurs combinaisons) capable de servir de source de nutriments (notamment de source d'azote) pour des microorganismes vivants, et destiné à être préférentiellement métabolisé par lesdits microorganismes, de manière à détourner ces derniers des ingrédients bioactifs d'intérêt que l'on entend bien entendu préserver en priorité. Ainsi, l'ingrédient leurre représente une source nutritive pour les microorganismes, que l'on sacrifie délibérément afin de sauvegarder le plus possible les ingrédients bioactifs d'intérét. L'ingrédient alimentaire leurre agit à cet égard comme un inhibiteur compétitif du transport des ingrédients bioactifs d'intérêt.
On notera que, de manière tout à fait avantageuse, la présence d'ingrédients leurres dans le produit alimentaire permet d'utiliser n'importe quel microorganisme vivant approprié pour la fabrication dudit produit, sans qu'il soit nécessaire de tenir compte de sa capacité à métaboliser le(s) ingrédient(s) bioactif(s).
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le produit alimentaire contient entre environ 0,001 et 2% en poids d'ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) par rapport au poids total du produit fini.
Préférentiellement, le produit alimentaire contient entre environ 0,001 et 0,2% en poids d'ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) par rapport au poids total du produit fini.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, la vitesse de métabolisation du ou des ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) dans le produit alimentaire est, trois semaines après sa préparation, au moins égale à celle du ou des ingrédient(s) bioactif(s). Cette vitesse de métabolisation du ou des ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) est, de préférence, supérieure à celle du ou des ingrédients alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont choisis parmi - des protéines, - des peptides, - des analogues ou dérivés de ceux-ci, et - leurs combinaisons.
Préférentiellement, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt est choisi parmi : le peptide aSl [91-100] (voir le brevet européen EP 0 714 910), le peptide C6-as1194-199 (voir le brevet américain US 6 514 941), le peptide C7-R177-183 (voir le brevet américain US 6 514 941), le peptide C12-as123-34 (voir le brevet US américain 6514941), les caséinophosphopeptides, I'a-casomorphine, la caséine a exorphine, la casokinine, la [3-casomorphine, les caséinomacropeptides (CMP) aussi appelés glycomacropeptides (GMP) ou CaséinoGlycoMacropeptides (CGMP), la casoxine, les casoplatellines, les fragments 50-53, les 0-lactorphines, la lactoferroxine, les peptides Val-Pro-Pro (voir le brevet européen EP 0 583 074), Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-GIn (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Pro (voir la demande EP 1 302 207 et le brevet EP 0 821 968), IIe-Pro-Pro (voir Nakamura et al., 1995 ; et brevet japonais JP 6 197 786), des fragments, analogues, dérivés de ceux-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons (pour une revue, voir notamment la Danone World Newsletter N 17 de septembre 1998).
De manière encore plus préférée, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt est choisi parmi : le peptide aSl [91-100], des fragments, analogues, dérivés de celui-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons.
On entend par analogue , n'importe quelle version modifiée d'un composé initial, ici une protéine ou un peptide, ladite version modifiée pouvant être naturelle ou synthétique, dans laquelle un ou plusieurs atomes, tels que des atomes de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, ou des hétéroatomes tels que l'azote, le soufre ou un halogène, ont été ajoutés ou supprimés de la structure du composé initial, de manière à obtenir un nouveau composé moléculaire.
Un dérivé au sens de l'invention est n'importe quel composé qui présente une ressemblance ou un motif structurel en commun avec un composé de référence (protéine ou peptide). Entrent également dans cette définition, d'une part les composés qui, seuls ou avec d'autres composés, peuvent être des précurseurs ou des produits intermédiaires dans la synthèse d'un composé de référence, moyennant une ou plusieurs réactions chimiques, et d'autre part les composés qui peuvent être formés à partir dudit composé de référence, seul ou avec d'autres composés, via une ou plusieurs réactions chimiques.
Sont ainsi couverts par la définition de dérivés ci-dessus au moins les 5 hydrolysats, notamment trypsiques, de protéines et/ou peptides, les fractions d'hydrolysats, ainsi que les mélanges d'hydrolysats et/ou de fractions d'hydrolysats.
De plus, les termes analogue et dérivé d'un peptide ou d'une protéine susmentionnés couvrent par exemple un peptide ou une 10 protéine glycosylé(e) ou phosphorylé(e) ou encore ayant subi n'importe quel greffage de groupement chimique.
Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt et/ou l'ingrédient alimentaire leurre peuvent être des sucres ou des acides gras.
15 Avantageusement, le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont des sources nutritives d'azote pour le ou lesdits microorganismes vivants.
Préférentiellement, le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont choisis parmi :
- l'ingrédient Alatal 821 (comprenant un hydrolysat de protéines de lactosérum, commercialisé par la société
Fonterra (Europe) GmbH : 80 avenue de la Grande Armée 75017 Paris, France ;
- l'ingrédient Vitalarmor 950 (Armor Protéines, France) ;
- des fragments, analogues ou dérivés de ceux-ci ;
- des protéines et/ou peptides les contenant ; et - leurs combinaisons.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou lesdits microorganismes vivants ont une capacité intacte ou réduite de métabolisation du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
Selon la présente invention, une capacité réduite de métabolisation est telle que la quantité d'ingrédients bioactifs d'intérêt métabolisée pendant la fermentation (qui disparaît donc du milieu) est inférieure ou égale à 40%
de la quantité d'ingrédients initiale (avant fermentation).
Ceci se traduit mathématiquement par :
Qr0,6Qo(1) OU:
Qr quantité d'ingrédients bioactifs résiduelle (présente dans le miiieu après fermentation) Qo : quantité d'ingrédients bioactifs initiale La quantité d'ingrédients bioactifs résiduelle Qr peut être mesurée par une méthode de chromatographie liquide CLHP couplée à un détecteur de type MS/MS. Un exemple de procédure expérimentale est donné dans les exemples ci-dessous.
On préférera utiliser, en tant que microorganismes vivants, des bactéries, de préférence des bactéries lactiques, vivantes.
On choisira plus particulièrement les bactéries vivantes parmi :
o Streptococcus spp, de préférence Streptococcus thermophilus ;
o Lactobacillus spp ;
o Lactococcus spp ;
o Bifidobacterium spp.
De manière préférée, on choisira les bactéries vivantes parmi :
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures des Microorganismes (Institut Pasteur, Paris, France)) le 24/01/02 sous le numéro 1-2774 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à{a CNCM le 24/10/95 sous le numéro I-1630 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3301 ; et - Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3302.
De manière encore préférée, lesdites bactéries vivantes sont des bactéries S. thermophilus déposées à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211.
Avantageusement, le produit alimentaire contient au moins les bactéries vivantes S. thermophilus et Lactobacillus spp.
Préférentiellement, lesdites bactéries vivantes Streptococcus thermophilus sont choisies parmi S. thermophilus déposée à la CNCM le 24/01/02 sous 1e numéro 1-2774, S. thermophilus déposée à la CNCM 1e 24/10/95 sous le numéro 1-1630, S. thermophilus déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211, S. thermophilus déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3301, et S. thermophilus déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3302.
La teneur du produit alimentaire selon l'invention en microorganismes vivants peut varier et sera choisie par l'homme du métier à la lumière de ses connaissances générales dans le domaine. En pratique, on recherchera de préférence une teneur globale standard, par exemple de l'ordre de 10' à 109 bactéries par gramme de produit alimentaire.
Préférentiellement, le produit alimentaire selon la présente invention est un produit fermenté.
De manière encore préférée, ie produit alimentaire fermenté est un produit laitier ou végétal.
Par produit laitier , on entend désigner selon la présente invention, en plus du lait, ies produits dérivés du lait, tels la crème, la crème glacée, le beurre, le fromage, le yoghourt ; les produits secondaires, comme le lactosérum, la caséine ; ainsi que n'importe quel aliment préparé
contenant, comme ingrédient principal, du lait ou des constituants du lait.
Par produit végétal , on entend désigner, entre autres, des produits obtenus à partir d'une base végétale telle que, par exemple, les jus de fruits et les jus végétaux parmi lesquels le jus de soja, le jus d'avoine ou le jus de riz.
En outre, les définitions ci-dessus de produit laitier et produit végétal couvrent chacune n'importe quel produit à base d'un mélange de produits laitiers et végétaux, tels qu'un mélange de lait et de jus de fruits, par exemple.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un produit alimentaire tel que défini ci-dessus, dans lequel un ou plusieurs ingrédients alimentaires leurres sont ajoutés dans le mélange destiné à constituer ledit produit, de préférence après fermentation de celui-ci.
Selon un mode de réalisation, un ou plusieurs microorganisme(s) vivants et un ou plusieurs ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt et/ou un ou plusieurs ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) sont ajoutés les uns après les autres dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.
Alternativement, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou le ou lesdits microorganismes vivants et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont ajoutés simultanément dans ledit mélange.
Les conditions de culture des microorganismes dépendent desdits microorganismes et sont connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on précisera que les températures optimales de croissance pour S. thermophilus se situent généralement entre 36 et 42 C environ ;
elles se situent entre 42 et 46 C environ pour L. delbrueckii spp.
bulgaricus (que l'on trouve typiquement dans les yoghourts).
En règle générale, l'arrêt de la fermentation, qui dépend du pH que l'on souhaite atteindre, est obtenu par refroidissement rapide, ce qui permet de ralentir l'activité métabolique des microorganismes.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont préparés directement dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire. On parlera à cet égard de synthèse in situ du ou des ingrédients bioactifs et/ou du ou des ingrédients leurres.
En cas de synthèse in situ, on peut indifféremment prévoir que le ou lesdits microorganismes vivants sont ajoutés dans le mélange destiné à
constituer ledit produit alimentaire, avant, pendant ou après, la synthèse in situ du ou des ingrédients bioactifs et/ou du ou des ingrédients leurres.
La présente invention a en outre pour objet l'utilisation d'un produit alimentaire tel que décrit supra comme aliment fonctionnel.
Par aliment fonctionnel , on entend désigner un produit alimentaire qui affecte avantageusement une ou plusieurs fonctions cibles de l'organisme, indépendamment de ses effets nutritionnels. Il peut ainsi en résulter une amélioration de l'état de santé et/ou du bien-être et/ou une réduction des risques d'apparition de maladies chez un consommateur qui ingère des quantités normales dudit produit. A titre d'exemples d'activités d'un aliment fonctionnel , on citera notamment des activités anti-cancéreuses, immunostimulatrices, promotrices de la santé osseuse, anti-stress, opiacées, anti-hypertension, amélioratrices de la biodisponibilité du calcium, ou encore anti-microbiennes (Functional Food Science in Europe, 1998).
De tels aliments fonctionnels peuvent être destinés à l'homme et/ou aux animaux.
La présente invention a également pour objet l'utilisation, dans un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, d'au moins un ingrédient alimentaire leurre pour protéger le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt contre la métabolisation par le ou lesdits microorganismes vivants.
La présente invention est illustrée par les figures suivantes, qui ne sont en aucun cas limitatives.
5 Figure 1: Chromatogramme LC-MS illustrant la disparition du peptide bioactif aS1 [91-100] inclus dans l'ingrédient Lactium pendant la fermentation lactique. Le détecteur MS/MS est réglé de façon à ne faire apparaître que le signal des ions de m/z = 634.5 Da (masse du peptide aSl [91-100] doublement chargé) qui présentent, après fragmentation, 10 des ions fils de m/z = 991.5 Da ; 771.5 Da ; 658.3 Da (fragments caractéristiques du peptide aS1 [91-100]).
Figure 2: Identification et quantification des principaux peptides de l'ingrédient Lactium par LC-MS/MS avant et après fermentation du mix laitier par un ferment consistant en un mélange des souches I-15 2783 (déposée à la CNCM le 24/01/02), 1-2774 (déposée à!a CNCM le 24/01/02), I-2835 (déposée à la CNCM le 04/04/02) et le 1-1968 (déposée à la CNCM le 14/01/98). Après fermentation, ces peptides ne sont plus retrouvés qu'à l'état de traces et se confondent avec la ligne de base.
? signifie que l'identification de la séquence n'a pas été possible ou 20 n'est pas certaine ; seule la masse du peptide est alors rapportée.
Figure 3: Profils peptidiques comparés (chromatogrammes LC-MS/MS) d'un mix laitier contenant 1.5 g/L d'hydrolysat DMV C12 , avant (1) et après fermentation (2) jusqu'à pH 4.7 par le ferment lactique Hansen YC380. La quasi-totalité des peptides de l'hydrolysat, dont le peptide bioactif C12 (fragment aS1 [23-34]), a disparu suite à la métabolisation par les souches du ferment.
Figure 4: Courbes illustrant l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif aS1 [91-100] dans un produit fini constitué de 95% de masse fermentée par le ferment contenant les souches 1-2783, 1-2774, 1-2835 et 1-1968, et de 5% de sirop de sucre aromatisé contenant le peptide aS1 [91-100], pendant le stockage à 10 C. L'expérience a été réalisée à
raison de 4 essais indépendants El, E2, E3 et E4.
Figure 5: Courbes illustrant l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif aS1 [91-100], ajouté après fermentation dans un produit fermenté
puis thermisé à 75 C pendant 1 minute, et stocké à 10 C jusqu'à la date limite de consommation (DLC).
Figure 6 : Illustration de l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif aS1 [91-100] dans un produit fini constitué de 95% de masse fermentée par le ferment contenant la souche I-2774 et du formiate et de 5% de sirop de sucre aromatisé contenant le peptide aS1 [91-100]
(apporté sous la forme de Lactium , dosé à 1.5 g/Kg de produit fini), pendant le stockage à 10 C jusqu'à DLC.
Figure 7: Graphique illustrant le pourcentage de peptide aS1 [91-100]
résiduel après fermentation par rapport au témoin non fermenté (ferment contenant les souches l-2783, 1-2774, 1-2835 et 1-1968) en présence de concentrations croissantes (0.5, 1.0 et 1.5 g/L) d'hydrolysats leurres (Vitalarmor 950, Armor Protéines ; MPH955, Fonterra).
Figure 8 : Quantification de la quantité résiduelle de peptide aS1 [91-100]
après fermentation par le ferment contenant les souches l-2783, I-2774, I-2835 et 1-1968 en milieu lait, en fonction de la quantité initiale en ingrédient d'intérêt (Lactium, lx = 1.5 g/L) et d'ingrédient leurre (hydrolysat Vitalarmor 950, 1 x = 1.5 g/L).
D'autres caractéristiques et avantages de la présente . invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants, donnés à titre purement illustratif.
Exemples Exemple 1: Mise en oeuvre d'ingrédients bioactifs d'intérêt sans mettre en application l'invention revendiquée 1.1) Exemple avec le peptide bioactif aS1 [91-100] contenu dans l'hydrolysat Lactium La mise en ceuvre d'ingrédients du type peptide ou protéine, souvent apportés sous forme de poudres, est plus simple lorsque ceux-ci sont ajoutés lors de l'étape de préparation du mix laitier (poudrage du lait), avant le traitement thermique de sanitation (i.e., 95 C, 8 min) et, donc, avant la fermentation. En ce cas, le risque de métabolisation du peptide actif est très élevé. C'est, pour l'exemple, le cas lors de l'utilisation d'un ingrédient fonctionnel comme le Lactium (Ingredia, France) contenant un peptide bio-actif (fragment 91-100 de la caséine aSl).
Protocole : le milieu a été préparé par hydratation d'une poudre de lait écrémé à 120 g/L, additionné de 1.5 g/L d'ingrédient Lactium (correspondant à environ 30 mg/L de peptide bioactif aS1 [91-100]), puis pasteurisé à 95 C pendant 8 minutes.
Le ferment lactique a été ajouté à un taux de 0.02%, et la fermentation a été conduite à la température optimale du ferment sélectionné (entre 37 et 42 C), jusqu'à atteindre un pH de 4.70.
L'analyse des peptides résiduels, et notamment celle du peptide bioactif aS1 [91-100], a été conduite avec une méthode de chromatographie liquide CLHP couplée à un détecteur de type MS/MS comme décrit ci-aprés :
- l'échantillon a été préparé par dilution du milieu fermenté dans un mélange d'eau, de méthanol et d'acide trifluoroacétique (50/50/0.1%), dans un rapport de 1 à 6 environ. Le surnageant après centrifugation constituait l'échantillon représentatif du contenu peptidique du milieu fermenté.
- Cet échantillon a été injecté dans un système chromatographique CLHP de type Agilent 1100 (société Agilent Technologies France, 1 rue Galvani 91745 Massy cedex, France), équipé d'une colonne adaptée à l'analyse des peptides, de type Waters Symetry (5 m 2.1 x 150 mm, WAT056975, Waters France, 5, Rue Jacques Monod, 78280 Guyancourt) à la température de 40 C, débit de 0.25 mi/min.
Les peptides ont été élués de façon classique avec un gradient croissant de solvant B (Acétonitrile + 0.100 /o d'acide formique) dans le solvant A (Eau + 0.106% acide formique), sur une durée de 40 min à 2 heures en fonction de la résolution souhaitée.
- La détection a été effectuée à l'aide d'un détecteur spécifique de type MS/MS, par exemple avec un appareil à trappe ionique comme l'Esquire3000+ (Bruker Daltonique, rue de l'Industrie, 67166 Wissembourg Cedex), réglé soit pour l'analyse globale du contenu peptidique (mode MS-MS), soit pour la quantification précise et spécifique d'un peptide à partir de ses fragments caractéristiques. Par exemple, le peptide aS1 [91-100]) a été isolé à partir de sa masse (ion doublement chargé de masse 634.5 Da) et quantifié à partir de l'intensité de ses ions fils caractéristiques après fragmentation (ions de m/z de 991.5 Da, 771.5 Da et 658.3 Da). De façon encore plus précise, un étalon interne constitué du même peptide de synthèse deutéré deux fois (fragment caractéristique de 993.5 Da) a permis de prendre en compte et de s'affranchir d'éventuelles interférences liées à la matrice.
Les résultats sont illustrés par la figure 1.
Lors de sa mise en oeuvre à ce stade (avant fermentation par un ferment consistant en un mélange des souches 1-2783 (déposée à la CNCM le 24/01/02), 1-2774 (déposée à la CNCM le 24/01/02), 1-2835 (déposée à la CNCM le 04/04/02) et 1-1968 (déposée à la CNCM le 14/01/98), ou un ferment tel que YC380 (Chr. Hansen SA, Le Moulin d'Aulnay, BP64, 91292 ARPAJON Cedex France), on a mis en évidence que plus de 95%
du peptide bioactif aS1 [91-100] étaient consommés après fermentation.
Ces observations montrent que l'incorporation de peptides bioactifs conformément à ce qui précède n'est pas applicable telle quelle à
l'obtention de produits alimentaires, notamment laitiers, supplémentés avec des quantités de peptides et/ou protéines bioactifs suffisamment stables dans le temps pour observer l'effet recherché chez le consommateur.
1. 2) Exemples avec d'autres peptides bioactifs d'intérêt Les résultats sont illustrés par les figures 2 et 3.
L'ingrédient Lactium contient de nombreux autres peptides, dont certains présentent potentiellement une activité biologique (comme le fragment 23-34 de la caséine aS1, que l'on retrouve aussi commercialisé
dans l'ingrédient C12 de la société DMV International). Il est intéressant de constater que la quasi-totalité des peptides apportés par l'ajout du Lactium sont largement consommés pendant la fermentation.
Quelle que soit leur origine (provenant des différentes caséines (XS1, aS2, K, 0) et leur taille (de 2 à 3 résidus jusqu'à 12 résidus et plus), tous les peptides sont globalement consommés pendant le processus de fermentation.
1.3) Mise en oeuvre du peptide bioactif aS1 [91-100] (Lactiurn ) avec d'autres ferments Afin de vérifier que ce phénomène n'était pas particulier aux deux ferments utilisés dans le paragraphe 1.1) ci-dessus, les principaux ferments industriels, ainsi que différentes souches pures rentrant dans la composition de ces ferments, ont été testés sur la base du même test : du lait reconstitué à partir de poudre de lait, auquel a été ajouté le Lactium à une dose de 1,5 g/L, a été fermenté dans des conditions standard (température optimale du ferment entre 37 et 42 C, arrêt de la fermentation à pH 4.7, 2 répétitions). L'analyse du taux de peptide bioactif aSl [91-100] a ensuite été réalisée sur l'échantillon avant et après fermentation.
Les résultats obtenus sur les souches pures sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous :
5 Tableau 3 Souches pures (S. thermophilus) % de peptide aS1 [91-100] restant après fermentation I-1630 (24/10/95) 0,3 1-1477 (22/09/94) 0,3 Souches pures (Lactobacillus) 1-1632 (24/10/95) 0,2 1-1519 (30/12/94) 0,1 1-1968 (14/01/98) 1,6 I-2809 (19/02/02 0,4 Dans le tableau 3 ci-dessus, qui reflète la consommation du peptide bioactif aS1 [91-100] par différents ferments et souches industrielles lors 10 de la fermentation d'un mix laitier contenant 1.5 g/L de Lactium , les souches pures ont été identifiées par leurs numéro et date de dépôt respectifs auprès de la CNCM (Institut Pasteur, Paris, France).
Le Tableau 3 montre que la totalité des ferments et souches testés métabolisent de 94 à 100% du peptide bioactif aS1 [91-100] pendant la 15 fermentation d'un mix laitier standard. La mise en oeuvre de cet ingrédient est donc impossible dans des conditions classiques pour produire des produits alimentaires, notamment laitiers, contenant des peptides et/ou protéines bioactifs en quantités suffisamment stables au cours du temps pour produire un effet chez le consommateur.
20 En outre, afin de vérifier que ce phénomène n'était pas particulier à
l'ingrédient Lactium , plusieurs combinaisons de ferments et d'autres ingrédients à base de peptides bioactifs ont été étudiées en mettant en ceuvre le même test (lait reconstitué + ingrédient à tester à une dose de 1,5 g/L, fermenté dans des conditions standard, arrêt de la fermentation à
pH 4.7, 2 répétitions). Les diverses combinaisons testées sont rapportées dans le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4 Ferments/souches Peptide aSl Autres peptides DMV DMV CPP
pures [91-100] dans Lactium C12 dans Lactium Mélange de 4 X X X X
souches:
1-2783 (24/01/02) 1-2774 (24/01/02) 1-2835 (04/04/02) 1-1968 (14101198) I-1630 (24/10/95) X X X
YC380 Hansen X X X X
Les ingrédients C12 et CPP produits par la société DMV International sont des hydrolysats de protéines de lait contenant des peptides bioactifs ciblant respectivement le contrôle de l'hypertension et l'assimilation des minéraux.
Sur l'ensemble des expérimentations, il est apparu que tous les ferments testés ont une importante capacité de métabolisation des peptides, quelles que soient leur nature et leur taille.
1.4) Ajout après fermentation Une alternative logique à la procédure étudiée ci-dessus est d'introduire l'ingrédient fonctionnel après la fermentation (procédé de type différentiation retardée ), par exemple avec le sirop permettant d'aromatiser la masse fermentée. La mise en ceuvre de la même quantité
d'ingrédient Lactium selon ce protocole conduit aux résultats illustrés par la figure 4.
Comme le montre la figure 4, même ajouté à froid (4 C) après fermentation, le peptide actif (apporté par l'équivalent de 1.5 g de Lactium par kg de produit fini) est rapidement dégradé au cours du stockage, pour ne laisser que 30 à 40% de la quantité initiale à la date limite de consommation (DLC).
Ainsi, la population de bactéries lactiques vivantes dans le produit fini continue de métaboliser le peptide bioactif pendant le stockage du produit fini, si bien qu'après seulement 10 jours (pour des produits frais dont la DLC est de 28 jours), entre 35 et 50% du peptide aS1 [91-100] ont disparu, ce qui reste inacceptable pour obtenir l'effet recherché chez le consommateur.
1.5) Traitement thermique du produit laitier fermenté contenant l'ingrédient bioactif d'intérêt En ce cas, il est possible d'assurer la stabilité du peptide aS1 [91-100]
(Figure 5), mais au détriment de la qualité globale du produit fini. Cette solution présente en effet de nombreux inconvénients :
- la thermisation d'une masse laitière fermentée implique l'usage de stabilisants ajoutés avant le traitement thermique (pectines, amidons, carraghenanes, etc...), ce qui complique le procédé et augmente sensiblement le coût de la formule ;
- la ligne de fabrication industrielle est plus complexe et demande un investissement spécifique plus important ;
- le produit ne bénéficie plus d'appellations liées aux produits contenant des ferments vivants (type yoghourt) et perd de fait les bénéfices associés à la consommation de ferments lactiques - l'impact organoleptique (généralement négatif) est significatif.
Exemple 2: Mise en oeuvre d'ingrédients bioactifs d'intérêt en mettant en application l'invention revendiquée La stratégie consiste à saturer les systèmes protéolytiques / de transport de peptides des bactéries lactiques en ajoutant une quantité suffisante d'un ou plusieurs peptides (peptides leurres ) préférés à celui / ceux que l'on cherche à protéger. L'effet protecteur existe à la fois pendant la fermentation et lors du stockage du produit fini jusqu'à DLC. La figure 6 présente un exemple de réalisation sur le modèle des essais précédents.
Comme le montre la figure 6, le peptide aS1 [91-100] apporté sous forme de Lactium après fermentation est en grande partie protégé en présence de l'hydrolysat de caséine Vitalarmor 950 (Armor Protéines, France) par rapport au témoin.
Le choix de la nature et de la quantité de peptide leurre à mettre en oeuvre pour une efficacité de protection suffisante est important. De nombreux hydrolysats commerciaux (essentiellement des hydrolysats enzymatiques de protéines de lait bovin) ont ainsi été testés et évalués, comme le résume le tableau 5 ci-dessous.
Le tableau 5 montre la consommation du peptide bioactif aS1 [91-100]
(apporté par l'équivalent de 1.5 g/L de Lactium ) pendant la fermentation par le ferment contenant les souches 1-2783, 1-2774, 1-2835 et 1-1968, en présence de différents hydrolysats commerciaux (concentration identique de 1.5 g/L).
Tableau 5 Hydrolysat leurre % [91-100]
(nom commercial) après Fermentation MPH 955 28,0 Alaco 70-14 33,8 WPH 917 1,7 WPH 955 56,6 Arla 20-21 6,2 WPH 926 29,1 DSE 6441 23,6 WPH948 12,8 Biozate 1 3,0 MPH 910 0,4 DSE 6060 0,5 Alatal 821 46,0 Vitalarmor 950 55,5 DMV C12 33,5 - MPH 955: hydrolysat de protéines de caséine, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - Alaco 70-14: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Reilingen, Allemagne - WPH 917: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Reilingen, Allemagne - WPH 955: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Reliingen, Allemagne - Arla 20-21 : hydrolysat de protéines de lactosérum, Arla Foods Ingredients Amba, 2 rue Victor Griffuelhes, 92772 Boulogne Cedex, France - WPH 926: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - DSE 6441 : hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - WPH948: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - Biozate 1 : hydrolysat de protéines de lactosérum, Davisco Foods International, 11000 West 78th Street, Suite 210 Eden Prairie, Minnesota - MPH 910: hydrolysat de protéines de caséine, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - DSE 6060: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne 10 - Alatal 821 : hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - Vitalarmor 950: hydrolysat de caséines, ARMOR PROTEINES 35460 Saint Brice en Cogles - DMV C 12: hydrolysat de protéines laitières, DMV INTERNATIONAL, 15 P.O. Box 105, Redhill Surrey RH1 3YH, Grande Bretagne D'après le tableau 5, certains hydrolysats n'ont que peu ou pas d'effet (il reste à peine quelques % de peptide aSl [91-100] après fermentation, même en leur présence). En revanche, d'autres ont un bon effet 20 protecteur puisque que l'on retrouve jusqu'à plus de 50% du peptide aS1 [91-100] après la fermentation.
La concentration en peptide leurre est aussi un facteur d'importance : plus celle-ci est élevée, plus la protection du peptide d'intérêt est forte, comme le montre la figure 7.
25 Plus globalement, c'est la proportion peptide d'intérêt/peptide leurre qui régule l'effet de protection plus ou moins efficace du peptide d'intérêt, comme le montre la figure 8.
La protection ainsi obtenue n'est pas spécifique au peptide aS1 [91-100], mais concerne la majeure partie des peptides de l'hydrolysat d'intérêt.
Il est ainsi possible de protéger, moyennant un choix judicieux d'ingrédient leurre apporté en quantité suffisante, tout type de peptide dans une large gamme de taille.
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lactoransferrine H
(*) les séquences des acides aminés ne sont pas exactement les mêmes (") H: lait humain / V: lait de vache Le tableau 2 ci-après recense les principales activités physiologiques des peptides fonctionnels issus du lait connus à ce jour.
Tableau 2 ~-_ _--- -- - - ---- - -_ -- _ ----~
' Activités ; Peptides !
-In vitro In vivo animal In vivo homme Réf. ', production de CCK Beucher Caséinomacropeptide par cellule intestinale 1994 (CMP) de rat -------------- ----.-..----- - ---------------------------------- ------ --------- -- ------------- ------------------- --------- - ----------- ---------Veau: après ingestion de CMP (210 mg/kg), inhibition de la sécrétion Homme: après ingestion de gastrique et diminution de la CMP (4g), diminution de la Yvon 1994 concentration plasmatique en CKK sécrétion acide Ben Lapin après introduction dans lumen: Mansour f3 casomorphines effet antisecrétoire sur l'iléon 1988 ._ .- ------------ -..----- ------- ..-------- ---------------- -------------------- ---------- ----------------------- --------- -------- .._.. ----------------Chien: après administration Effet sur la intragastrique, modulation de Schusdziarra e digestion l'insulinémie post-prandiale; annulation 1983 >
de cet effet par la naloxone (3 casomorphines Plusieurs effets au Tomé 1987, ô
naturelles et certains niveau de l'iléon de 1988 - Mahé
de leurs analo ues lapin 1989 w Analogues de R Stimulation de Ben ô
casomorphines non l'absorption intestinale Mansour métabolisés d'électrolytes 1988 ô
Chien: administration 10g caséine/300mL eau par sonde Defilippi Caséine intragastrique: inhibition de la motilité 1995 du grêle, annulée par la naloxone.vs.
10g de protéine de soja: pas d'effet Tableau 2 (suite) - -- - -Activitës Peptides In vitro In vivo animal In vivo homme Réf. Lactoferricine Tomita Inhibition de la 0 Casocidine 1 1994 -(caséine a Sj) -165 croissance des Zucht 203 souches pathogènes 1995 Fragment caséine a Effet Inhibition de la antimicrobien S'B Souris, Mouton: efficace en Lahov (1-23 N terminal) croissance des = souches pathogènes injection IM contre Staphylococcus 1996 isracidine aureus Migliore-Fragment caséine Souris: effet protecteur en injection Samour humaine IV contre K. pneumoniae 1989 Fragments de a Prolifération des lactalbumine bovine lymphocytes humains Kayser ~
et de caséine K (PBL) activités par 1996 bovine Con A
(3 casokinine 10 et (3 Prolifération ou CD
casomorphine 7 de suppression des PBL Kayser W
s nthèse suivant concentration 1996 N
Stimulation de la ô
Caséine (3 humaine phagocytose des ô
54-59 globules rouges de Parker a lactalbumine 51- mouton par les 1984 ~
Effet immuno- 53 macrophages modulateur éritonéaux de souris Stimulation des macrophages périonéaux de la Migliore-Caséine (3 bovine souris Pas de protection in vivo Samour Caséine 191-193 1988 Caséine 63-68 Caséine K bovine Inhibition de la prolifération des Otani Caseino- lymphocytes B des 1992, macropeptides (106- plaques de Peyer 1995 169 chez souris et lapin Tableau 2 (suite) - - - - -- - - - - -- --_J~ _ - - ---Activités Peptides In vitro In vivo animal In vivo homme Réf.
Caséinoglycopeptid e bovin (bCGP) CGP isolé dans le plasma de Chabance 0 Caséinoglycopeptid nouveaux-nés après ingestion 1995 e humain (hCGP) de lait infantile ou lait de mère Inhibition de Jollès Peptide 106-116 de l'agrégation 1986 Effet caséine K bovine plaquettaire antithrombotique Tétrapeptide de Inhibition de lactotransferrine l'agrégation Raha humaine (39-42) plaquettaire 1988 -------- --- -------- - ----------- - -- ------------------------ --------- ----- -------- - --- ---- ------- - --- ------ ------ ------Rat et cobaye avec thrombose artérielle expérimentale: après Drouet injection IV, activité 1990 antithrombotique Hydrolysats enzymatiques de Inhibition de l'ACE Mullaly OD
lactoglobuline et d'~ 1997 >
Ln lactalbumine v~ w Fragments Rats recevant de l'angiotensine I: ô
synthétiques de Inhibition de l'ACE après injection IV, retour au niveau Kohmura o caséine humaine initial de pression artérielle 1989 Rats hypertendus: ingestion de 10 Peptides de lait ~
fermenté par L. mL lait fermenté / kg poids Masuda helveticus et S. corporel, on retrouve les peptides 1996 dans l'aorte avec inhibition de cerevisiae l'ACE
Effet Peptides issus de antihypertenseur lair fermenté par L. Rats hypertendus: après ingestion, Yamamot helveticus diminution de la pression artérielle o 1994 ~. b Peptides issus de la fermentation de lait par L. helveticus + Rats hypertendus: après ingestion, Nakamura S. cerevisiae Val- diminution de la pression artérielle 1995 Pro-Pro (VPP) /
II Rats normaux: pas d'effet Pro-Pro (IPP) ---___- ---------- ------------------ --- --- - --------- --Homme hypertendu (36 sujets): après 8 semaines d'ingestion de 95 mL/j, Hata 1996 diminution de la pression artérielle Tableau 2 (suite) ~- - - -_ _ --- O
Activités Peptides In vïtro In vivo animal In vivo homme Réf. ~----_ -~-_ - -,. -.-~_ -_ - -- ~- ---- - -Rats: après injection intra-carotides, accumulation de Ermisch 1983 casomorphines dans la zone sans casomorphines barrière hématoencéphalique --------------------------- ----------- - ----------- -------------- - ------------------------- ---------------- ------------Veaux nouveaux-nés: après leur premier repas de lait de vache, 0 Umbach 1985 casomorphines dans le sang --------------- -------------- -- ------ ----- ----- ---------------- ----- ----------- ------ --------------------- --------- -----------------------Mini-pores: après ingestion de caséine bovine, (3 casomorphine Meisel 1986 isolée du chyme duodénal -.._..----------------------.._.._ ------ ------ ---------.._..------- ----Chiots: après ingestion de lait de mère, existence de P Singh 1989 casomorphines dans le san.~ .... ._.._.. .._._._.._.._._._.._.
_._.._._......_._.._.. .._.._.._.._.._._.._.._.._.._ N
----Effets opiacés Homme: après ingestion de CD
lait de vache, présence de Svedberg 1985 ~ W
casomorphines dans le contenu intestinal 9 rêle ô
------------- ----- ....... .. .---- ------- --------- ----------- --------------------------------------------------- -----------.. ------ -----------.._.._..
mais pas dans le sang Teschemacher d'adulte 1986 Effet opioïde sur iléon isolé de 1O
Peptides de caséine (3 cobaye annulé par Yoshikawa 1986 humaine de synthèse la naloxone Effets opiôides antagonistes sur Chiba 1989 Casoxines (caséine x) muscle de l'iléon bovine et humaine isolé de cobaye Ces peptides sont le plus souvent obtenus par hydrolyse de protéines végétales (par exemple des protéines de soja) ou animales (par exemple, les caséines ou les protéines sériques du lait), hydrolyse générée par des procédés enzymatiques et/ou fermentaires, le plus souvent accompagnée d'une concentration de la fraction active, étape généralement nécessaire pour apporter le bénéfice santé visé. La fabrication et l'utilisation de ces peptides pour un bénéfice santé font l'objet d'une littérature abondante (voir la Danone World Newsletter N 17 de Septembre 1998).
Parmi les vecteurs alimentaires susceptibles d'accueillir de tels ingrédients, les produits laitiers fermentés figurent en bonne position de part leur bénéfice santé dû à la présence de ferments et de produits de fermentation (c'est-à-dire les molécules issues de la transformation, par les bactéries lactiques, des substrats présents dans le lait). Jusqu'à
présent, la communauté scientifique prenait surtout en compte les propriétés des ferments. Les chercheurs commencent depuis peu à
s'intéresser aux produits de fermentation, parmi lesquels certains peptides occupent une place particulière, car ce sont des messagers biologiques nombreux et spécifiques. Les produits laitiers fermentés paraissent donc particulièrement appropriés comme vecteurs d'hydrolysats de peptides bioactifs obtenus, par exemple, à partir de substrats laitiers comme les caséines ou les protéines sériques.
Un problème majeur se pose alors : les microorganismes et, en particulier, les bactéries lactiques utilisées dans la fabrication des produits laitiers frais (type yoghourts, spécialités laitières fermentées, boissons fermentées à base de lait, etc...), sont généralement capables de consommer les peptides pour satisfaire leurs besoins nutritionnels et, plus particulièrement leurs besoins en azote. On parlera à cet effet dans ce qui suit de métabolisation des peptides . Les bactéries lactiques sont en effet dotées de plusieurs systèmes de dégradation et/ou transport leur permettant de métaboliser les peptides, les faisant alors disparaître du milieu :
1/ un système protéolytique (protéases de paroi PRT) qui découpe protéines et gros peptides pour faciliter leur assimilation ( système de métabolisation extracellulaire ), 2/ des systèmes de transport vers l'intérieur de la cellule, dont l'un est spécifique des oligo-peptides d'une taille proche de 10 acides aminés, l'autre étant adapté au transport de di- et tri-peptides (les lactobacilles possèdent un système supplémentaire de perméases à tri-peptides) ( système(s) de transport vers l'intérieur de la cellule ), et 3/ un système enzymatique intracellulaire capable de dégrader les peptides en acides aminés (comprenant une quinzaine d'endo- et exopeptidases) ( système de métabolisation intracellulaire ).
Etant donné que la quantité de peptides naturellement présents dans le lait est généralement trop faible par rapport aux besoins des bactéries lactiques, il est commun d'accélérer leur croissance en fournissant un supplément de peptides. Ceux-ci sont alors totalement consommés pendant la fermentation.
En définitive, du fait : (i) du besoin en azote des bactéries lactiques, dont les peptides constituent la principale source dans le lait, (ii) de la capacité
de ces bactéries à consommer efficacement les peptides, et (iii) de la survie d'une population importante de bactéries lactiques dans les produits fermentés à base de lait, jusqu'à la date limite de consommation (DLC), la mise en uvre d'ingrédients à base de peptides fonctionnels dans les produits laitiers fermentés est difficile, voire impossible, car ces ingrédients sont le plus souvent consommés par les bactéries lactiques, pendant la fermentation, voire pendant le stockage des produits jusqu'à DLC.
En outre, non seulement ce problème de dégradation par métabolisation intempestive des peptides par les bactéries n'est pas spécifique à un peptide donné, mais il n'est pas non plus spécifique à un ferment (ou microorganisme, de préférence bactérie, capable de fermenter) particulier.
Il s'agit là d'un problème général, qui se pose quels que soient le ou les peptides et le ou les microorganismes considérés.
On citera, à titre d'exemple, le cas du peptide bioactif aS1 [91-100] (voir le brevet européen EP 0 714 910 ; peptide aux propriétés relaxantes contenu dans l'hydrolysat de protéines de lait commercialisé notamment par la société Ingredia : 51-53, Avenue Fernand Lobbedez BP 946 62033 ARRAS Cedex, France, sous le nom Lactium ). La Demanderesse a ainsi observé que la population de bactéries lactiques vivantes dans le produit fini continue de métaboliser le peptide bioactif pendant le stockage du produit fini, si bien qu'après seulement 10 jours (pour des produits frais dont la DLC est de 28 jours), entre 35 et 55% environ du peptide aS1 [91-100] ont disparu, ce qui est tout à fait inacceptable pour garantir un effet santé chez le consommateur (données non montrées).
Puisque la consommation du peptide bioactif est le fait de l'activité
métabolique des ferments, on pourrait envisager de réduire ce phénomène en détruisant tout ou partie des microorganismes, par exemple à l'aide d'un traitement thermique approprié (thermisation ou pasteurisation). En ce cas, il est possible de préserver le peptide aS1 [91-100] (par exemple après chauffage à 75 C pendant environ 1 min).
Toutefois, une telle solution présente de nombreux inconvénients :
- la thermisation d'une masse laitière fermentée implique l'usage de stabilisants ajoutés avant le traitement thermique (pectines, amidons, carraghénanes, etc...), ce qui complique le procédé et augmente sensiblement le coût de la formule ;
- la ligne de fabrication industrielle est plus complexe et demande un investissement spécifique plus important ;
- le produit ne bénéficie plus d'appellations liées aux produits 5 contenant des ferments vivants (type yoghourt) et perd de fait les bénéfices associés à la consommation de ferments lactiques ; et - l'impact organoleptique, généralement négatif, est significatif.
Il existe dès lors un besoin pour un produit alimentaire contenant à la fois 10 des microorganismes vivants, par exemple un yoghourt, et un ou plusieurs ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt, dans lequel ces ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt seraient protégés contre la métabolisation par lesdits microorganismes vivants, et ce, tout en préservant les qualités organoleptiques du produit alimentaire.
Par la présente invention, la Demanderesse apporte une solution qui permet de satisfaire le besoin existant.
La présente invention s'intéresse donc à un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont mis en ceuvre de manière à réduire la métabolisation du ou desdits ingrédients bioactifs par le ou lesdits microorganismes vivants.
Ainsi, la Demanderesse a pu montrer qu'un ou plusieurs ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt pouvaient être efficacement protégés contre la métabolisation par des microorganismes vivants, dès lors que les conditions de mise en oeuvre des uns avec les autres sont appropriées.
De telles conditions de mise en oeuvre appropriées peuvent faire appel à
divers moyens, parmi lesquels :
a) l'utilisation de microorganismes vivants dont la capacité à
métaboliser les ingrédients bioactifs est réduite ; et/ou b) l'utilisation d'ingrédients alimentaires leurres qui sont délibérément livrés en pâture aux microorganismes vivants ;
et/ou c) la mise en oeuvre d'une protection physique des ingrédients bioactifs, notamment par encapsulation de ces derniers.
On notera à cet égard qu'un ou plusieurs de, voire tous, ces moyens peuvent être avantageusement combinés au sein d'un même produit alimentaire.
Un objet de la présente invention est donc un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont protégés :
- physiquement, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt étant de préférence encapsulés ; et/ou - au moyen d'au moins un ingrédient alimentaire leurre contenu dans ledit produit alimentaire, de sorte que leur métabolisation par le ou lesdits microorganismes vivants est réduite.
Comme indiqué brièvement dans la description générale qui précède, par métabolisé ou métabolisation , on entend désigner selon la présente invention la transformation ou dégradation d'une substance par un ou plusieurs microorganismes vivants, visant à sa consommation à titre de source de nutriments, et ayant pour conséquence finale sa disparition, plus ou moins complète, du milieu.
Au sens de l'invention, la métabolisation d'un ingrédient est réduite si elle est inférieure à la métabolisation du même ingrédient lorsque ce dernier n'est pas protégé par au moins l'un des moyens prévus dans le cadre de la présente invention.
Avantageusement, et idéalement, cette métabolisation réduite tend vers, voire vaut, zéro, ce qui revient à peu, quasiment pas, voire pas, de métabolisation dudit ingrédient.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, la quantité résiduelle d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans ledit produit alimentaire est, 3 semaines après sa préparation, comprise entre 50 et 100 % environ par rapport à la quantité d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présente dans le produit juste après sa préparation.
Préférentiellement, ladite quantité résiduelle est comprise entre 80 et 100% environ.
Par quantité résiduelle en ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans ledit produit alimentaire , on entend désigner selon la présente invention le pourcentage d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présent dans ledit produit alimentaire lorsque ce dernier est maintenu dans des conditions de stockage adaptées (par exemple, de l'ordre de 4 à
10 C pour un produit frais) pendant 3 semaines, par rapport au pourcentage d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présent au départ, c'est-à-dire juste après fabrication du produit.
De préférence, le produit alimentaire selon l'invention contient au moins un ingrédient alimentaire leurre.
Par ingrédient alimentaire leurre , on entend désigner selon la présente invention un ingrédient alimentaire (de préférence un peptide, une protéine, un analogue ou un dérivé de ceux-ci, et leurs combinaisons) capable de servir de source de nutriments (notamment de source d'azote) pour des microorganismes vivants, et destiné à être préférentiellement métabolisé par lesdits microorganismes, de manière à détourner ces derniers des ingrédients bioactifs d'intérêt que l'on entend bien entendu préserver en priorité. Ainsi, l'ingrédient leurre représente une source nutritive pour les microorganismes, que l'on sacrifie délibérément afin de sauvegarder le plus possible les ingrédients bioactifs d'intérét. L'ingrédient alimentaire leurre agit à cet égard comme un inhibiteur compétitif du transport des ingrédients bioactifs d'intérêt.
On notera que, de manière tout à fait avantageuse, la présence d'ingrédients leurres dans le produit alimentaire permet d'utiliser n'importe quel microorganisme vivant approprié pour la fabrication dudit produit, sans qu'il soit nécessaire de tenir compte de sa capacité à métaboliser le(s) ingrédient(s) bioactif(s).
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le produit alimentaire contient entre environ 0,001 et 2% en poids d'ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) par rapport au poids total du produit fini.
Préférentiellement, le produit alimentaire contient entre environ 0,001 et 0,2% en poids d'ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) par rapport au poids total du produit fini.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, la vitesse de métabolisation du ou des ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) dans le produit alimentaire est, trois semaines après sa préparation, au moins égale à celle du ou des ingrédient(s) bioactif(s). Cette vitesse de métabolisation du ou des ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) est, de préférence, supérieure à celle du ou des ingrédients alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont choisis parmi - des protéines, - des peptides, - des analogues ou dérivés de ceux-ci, et - leurs combinaisons.
Préférentiellement, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt est choisi parmi : le peptide aSl [91-100] (voir le brevet européen EP 0 714 910), le peptide C6-as1194-199 (voir le brevet américain US 6 514 941), le peptide C7-R177-183 (voir le brevet américain US 6 514 941), le peptide C12-as123-34 (voir le brevet US américain 6514941), les caséinophosphopeptides, I'a-casomorphine, la caséine a exorphine, la casokinine, la [3-casomorphine, les caséinomacropeptides (CMP) aussi appelés glycomacropeptides (GMP) ou CaséinoGlycoMacropeptides (CGMP), la casoxine, les casoplatellines, les fragments 50-53, les 0-lactorphines, la lactoferroxine, les peptides Val-Pro-Pro (voir le brevet européen EP 0 583 074), Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-GIn (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu (voir la demande EP 0 737 690), Tyr-Pro (voir la demande EP 1 302 207 et le brevet EP 0 821 968), IIe-Pro-Pro (voir Nakamura et al., 1995 ; et brevet japonais JP 6 197 786), des fragments, analogues, dérivés de ceux-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons (pour une revue, voir notamment la Danone World Newsletter N 17 de septembre 1998).
De manière encore plus préférée, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt est choisi parmi : le peptide aSl [91-100], des fragments, analogues, dérivés de celui-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons.
On entend par analogue , n'importe quelle version modifiée d'un composé initial, ici une protéine ou un peptide, ladite version modifiée pouvant être naturelle ou synthétique, dans laquelle un ou plusieurs atomes, tels que des atomes de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, ou des hétéroatomes tels que l'azote, le soufre ou un halogène, ont été ajoutés ou supprimés de la structure du composé initial, de manière à obtenir un nouveau composé moléculaire.
Un dérivé au sens de l'invention est n'importe quel composé qui présente une ressemblance ou un motif structurel en commun avec un composé de référence (protéine ou peptide). Entrent également dans cette définition, d'une part les composés qui, seuls ou avec d'autres composés, peuvent être des précurseurs ou des produits intermédiaires dans la synthèse d'un composé de référence, moyennant une ou plusieurs réactions chimiques, et d'autre part les composés qui peuvent être formés à partir dudit composé de référence, seul ou avec d'autres composés, via une ou plusieurs réactions chimiques.
Sont ainsi couverts par la définition de dérivés ci-dessus au moins les 5 hydrolysats, notamment trypsiques, de protéines et/ou peptides, les fractions d'hydrolysats, ainsi que les mélanges d'hydrolysats et/ou de fractions d'hydrolysats.
De plus, les termes analogue et dérivé d'un peptide ou d'une protéine susmentionnés couvrent par exemple un peptide ou une 10 protéine glycosylé(e) ou phosphorylé(e) ou encore ayant subi n'importe quel greffage de groupement chimique.
Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt et/ou l'ingrédient alimentaire leurre peuvent être des sucres ou des acides gras.
15 Avantageusement, le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont des sources nutritives d'azote pour le ou lesdits microorganismes vivants.
Préférentiellement, le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont choisis parmi :
- l'ingrédient Alatal 821 (comprenant un hydrolysat de protéines de lactosérum, commercialisé par la société
Fonterra (Europe) GmbH : 80 avenue de la Grande Armée 75017 Paris, France ;
- l'ingrédient Vitalarmor 950 (Armor Protéines, France) ;
- des fragments, analogues ou dérivés de ceux-ci ;
- des protéines et/ou peptides les contenant ; et - leurs combinaisons.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou lesdits microorganismes vivants ont une capacité intacte ou réduite de métabolisation du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
Selon la présente invention, une capacité réduite de métabolisation est telle que la quantité d'ingrédients bioactifs d'intérêt métabolisée pendant la fermentation (qui disparaît donc du milieu) est inférieure ou égale à 40%
de la quantité d'ingrédients initiale (avant fermentation).
Ceci se traduit mathématiquement par :
Qr0,6Qo(1) OU:
Qr quantité d'ingrédients bioactifs résiduelle (présente dans le miiieu après fermentation) Qo : quantité d'ingrédients bioactifs initiale La quantité d'ingrédients bioactifs résiduelle Qr peut être mesurée par une méthode de chromatographie liquide CLHP couplée à un détecteur de type MS/MS. Un exemple de procédure expérimentale est donné dans les exemples ci-dessous.
On préférera utiliser, en tant que microorganismes vivants, des bactéries, de préférence des bactéries lactiques, vivantes.
On choisira plus particulièrement les bactéries vivantes parmi :
o Streptococcus spp, de préférence Streptococcus thermophilus ;
o Lactobacillus spp ;
o Lactococcus spp ;
o Bifidobacterium spp.
De manière préférée, on choisira les bactéries vivantes parmi :
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures des Microorganismes (Institut Pasteur, Paris, France)) le 24/01/02 sous le numéro 1-2774 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à{a CNCM le 24/10/95 sous le numéro I-1630 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3301 ; et - Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3302.
De manière encore préférée, lesdites bactéries vivantes sont des bactéries S. thermophilus déposées à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211.
Avantageusement, le produit alimentaire contient au moins les bactéries vivantes S. thermophilus et Lactobacillus spp.
Préférentiellement, lesdites bactéries vivantes Streptococcus thermophilus sont choisies parmi S. thermophilus déposée à la CNCM le 24/01/02 sous 1e numéro 1-2774, S. thermophilus déposée à la CNCM 1e 24/10/95 sous le numéro 1-1630, S. thermophilus déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro 1-3211, S. thermophilus déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3301, et S. thermophilus déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro 1-3302.
La teneur du produit alimentaire selon l'invention en microorganismes vivants peut varier et sera choisie par l'homme du métier à la lumière de ses connaissances générales dans le domaine. En pratique, on recherchera de préférence une teneur globale standard, par exemple de l'ordre de 10' à 109 bactéries par gramme de produit alimentaire.
Préférentiellement, le produit alimentaire selon la présente invention est un produit fermenté.
De manière encore préférée, ie produit alimentaire fermenté est un produit laitier ou végétal.
Par produit laitier , on entend désigner selon la présente invention, en plus du lait, ies produits dérivés du lait, tels la crème, la crème glacée, le beurre, le fromage, le yoghourt ; les produits secondaires, comme le lactosérum, la caséine ; ainsi que n'importe quel aliment préparé
contenant, comme ingrédient principal, du lait ou des constituants du lait.
Par produit végétal , on entend désigner, entre autres, des produits obtenus à partir d'une base végétale telle que, par exemple, les jus de fruits et les jus végétaux parmi lesquels le jus de soja, le jus d'avoine ou le jus de riz.
En outre, les définitions ci-dessus de produit laitier et produit végétal couvrent chacune n'importe quel produit à base d'un mélange de produits laitiers et végétaux, tels qu'un mélange de lait et de jus de fruits, par exemple.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un produit alimentaire tel que défini ci-dessus, dans lequel un ou plusieurs ingrédients alimentaires leurres sont ajoutés dans le mélange destiné à constituer ledit produit, de préférence après fermentation de celui-ci.
Selon un mode de réalisation, un ou plusieurs microorganisme(s) vivants et un ou plusieurs ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt et/ou un ou plusieurs ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) sont ajoutés les uns après les autres dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.
Alternativement, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou le ou lesdits microorganismes vivants et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont ajoutés simultanément dans ledit mélange.
Les conditions de culture des microorganismes dépendent desdits microorganismes et sont connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, on précisera que les températures optimales de croissance pour S. thermophilus se situent généralement entre 36 et 42 C environ ;
elles se situent entre 42 et 46 C environ pour L. delbrueckii spp.
bulgaricus (que l'on trouve typiquement dans les yoghourts).
En règle générale, l'arrêt de la fermentation, qui dépend du pH que l'on souhaite atteindre, est obtenu par refroidissement rapide, ce qui permet de ralentir l'activité métabolique des microorganismes.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont préparés directement dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire. On parlera à cet égard de synthèse in situ du ou des ingrédients bioactifs et/ou du ou des ingrédients leurres.
En cas de synthèse in situ, on peut indifféremment prévoir que le ou lesdits microorganismes vivants sont ajoutés dans le mélange destiné à
constituer ledit produit alimentaire, avant, pendant ou après, la synthèse in situ du ou des ingrédients bioactifs et/ou du ou des ingrédients leurres.
La présente invention a en outre pour objet l'utilisation d'un produit alimentaire tel que décrit supra comme aliment fonctionnel.
Par aliment fonctionnel , on entend désigner un produit alimentaire qui affecte avantageusement une ou plusieurs fonctions cibles de l'organisme, indépendamment de ses effets nutritionnels. Il peut ainsi en résulter une amélioration de l'état de santé et/ou du bien-être et/ou une réduction des risques d'apparition de maladies chez un consommateur qui ingère des quantités normales dudit produit. A titre d'exemples d'activités d'un aliment fonctionnel , on citera notamment des activités anti-cancéreuses, immunostimulatrices, promotrices de la santé osseuse, anti-stress, opiacées, anti-hypertension, amélioratrices de la biodisponibilité du calcium, ou encore anti-microbiennes (Functional Food Science in Europe, 1998).
De tels aliments fonctionnels peuvent être destinés à l'homme et/ou aux animaux.
La présente invention a également pour objet l'utilisation, dans un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, d'au moins un ingrédient alimentaire leurre pour protéger le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt contre la métabolisation par le ou lesdits microorganismes vivants.
La présente invention est illustrée par les figures suivantes, qui ne sont en aucun cas limitatives.
5 Figure 1: Chromatogramme LC-MS illustrant la disparition du peptide bioactif aS1 [91-100] inclus dans l'ingrédient Lactium pendant la fermentation lactique. Le détecteur MS/MS est réglé de façon à ne faire apparaître que le signal des ions de m/z = 634.5 Da (masse du peptide aSl [91-100] doublement chargé) qui présentent, après fragmentation, 10 des ions fils de m/z = 991.5 Da ; 771.5 Da ; 658.3 Da (fragments caractéristiques du peptide aS1 [91-100]).
Figure 2: Identification et quantification des principaux peptides de l'ingrédient Lactium par LC-MS/MS avant et après fermentation du mix laitier par un ferment consistant en un mélange des souches I-15 2783 (déposée à la CNCM le 24/01/02), 1-2774 (déposée à!a CNCM le 24/01/02), I-2835 (déposée à la CNCM le 04/04/02) et le 1-1968 (déposée à la CNCM le 14/01/98). Après fermentation, ces peptides ne sont plus retrouvés qu'à l'état de traces et se confondent avec la ligne de base.
? signifie que l'identification de la séquence n'a pas été possible ou 20 n'est pas certaine ; seule la masse du peptide est alors rapportée.
Figure 3: Profils peptidiques comparés (chromatogrammes LC-MS/MS) d'un mix laitier contenant 1.5 g/L d'hydrolysat DMV C12 , avant (1) et après fermentation (2) jusqu'à pH 4.7 par le ferment lactique Hansen YC380. La quasi-totalité des peptides de l'hydrolysat, dont le peptide bioactif C12 (fragment aS1 [23-34]), a disparu suite à la métabolisation par les souches du ferment.
Figure 4: Courbes illustrant l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif aS1 [91-100] dans un produit fini constitué de 95% de masse fermentée par le ferment contenant les souches 1-2783, 1-2774, 1-2835 et 1-1968, et de 5% de sirop de sucre aromatisé contenant le peptide aS1 [91-100], pendant le stockage à 10 C. L'expérience a été réalisée à
raison de 4 essais indépendants El, E2, E3 et E4.
Figure 5: Courbes illustrant l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif aS1 [91-100], ajouté après fermentation dans un produit fermenté
puis thermisé à 75 C pendant 1 minute, et stocké à 10 C jusqu'à la date limite de consommation (DLC).
Figure 6 : Illustration de l'évolution de la teneur résiduelle en peptide bioactif aS1 [91-100] dans un produit fini constitué de 95% de masse fermentée par le ferment contenant la souche I-2774 et du formiate et de 5% de sirop de sucre aromatisé contenant le peptide aS1 [91-100]
(apporté sous la forme de Lactium , dosé à 1.5 g/Kg de produit fini), pendant le stockage à 10 C jusqu'à DLC.
Figure 7: Graphique illustrant le pourcentage de peptide aS1 [91-100]
résiduel après fermentation par rapport au témoin non fermenté (ferment contenant les souches l-2783, 1-2774, 1-2835 et 1-1968) en présence de concentrations croissantes (0.5, 1.0 et 1.5 g/L) d'hydrolysats leurres (Vitalarmor 950, Armor Protéines ; MPH955, Fonterra).
Figure 8 : Quantification de la quantité résiduelle de peptide aS1 [91-100]
après fermentation par le ferment contenant les souches l-2783, I-2774, I-2835 et 1-1968 en milieu lait, en fonction de la quantité initiale en ingrédient d'intérêt (Lactium, lx = 1.5 g/L) et d'ingrédient leurre (hydrolysat Vitalarmor 950, 1 x = 1.5 g/L).
D'autres caractéristiques et avantages de la présente . invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants, donnés à titre purement illustratif.
Exemples Exemple 1: Mise en oeuvre d'ingrédients bioactifs d'intérêt sans mettre en application l'invention revendiquée 1.1) Exemple avec le peptide bioactif aS1 [91-100] contenu dans l'hydrolysat Lactium La mise en ceuvre d'ingrédients du type peptide ou protéine, souvent apportés sous forme de poudres, est plus simple lorsque ceux-ci sont ajoutés lors de l'étape de préparation du mix laitier (poudrage du lait), avant le traitement thermique de sanitation (i.e., 95 C, 8 min) et, donc, avant la fermentation. En ce cas, le risque de métabolisation du peptide actif est très élevé. C'est, pour l'exemple, le cas lors de l'utilisation d'un ingrédient fonctionnel comme le Lactium (Ingredia, France) contenant un peptide bio-actif (fragment 91-100 de la caséine aSl).
Protocole : le milieu a été préparé par hydratation d'une poudre de lait écrémé à 120 g/L, additionné de 1.5 g/L d'ingrédient Lactium (correspondant à environ 30 mg/L de peptide bioactif aS1 [91-100]), puis pasteurisé à 95 C pendant 8 minutes.
Le ferment lactique a été ajouté à un taux de 0.02%, et la fermentation a été conduite à la température optimale du ferment sélectionné (entre 37 et 42 C), jusqu'à atteindre un pH de 4.70.
L'analyse des peptides résiduels, et notamment celle du peptide bioactif aS1 [91-100], a été conduite avec une méthode de chromatographie liquide CLHP couplée à un détecteur de type MS/MS comme décrit ci-aprés :
- l'échantillon a été préparé par dilution du milieu fermenté dans un mélange d'eau, de méthanol et d'acide trifluoroacétique (50/50/0.1%), dans un rapport de 1 à 6 environ. Le surnageant après centrifugation constituait l'échantillon représentatif du contenu peptidique du milieu fermenté.
- Cet échantillon a été injecté dans un système chromatographique CLHP de type Agilent 1100 (société Agilent Technologies France, 1 rue Galvani 91745 Massy cedex, France), équipé d'une colonne adaptée à l'analyse des peptides, de type Waters Symetry (5 m 2.1 x 150 mm, WAT056975, Waters France, 5, Rue Jacques Monod, 78280 Guyancourt) à la température de 40 C, débit de 0.25 mi/min.
Les peptides ont été élués de façon classique avec un gradient croissant de solvant B (Acétonitrile + 0.100 /o d'acide formique) dans le solvant A (Eau + 0.106% acide formique), sur une durée de 40 min à 2 heures en fonction de la résolution souhaitée.
- La détection a été effectuée à l'aide d'un détecteur spécifique de type MS/MS, par exemple avec un appareil à trappe ionique comme l'Esquire3000+ (Bruker Daltonique, rue de l'Industrie, 67166 Wissembourg Cedex), réglé soit pour l'analyse globale du contenu peptidique (mode MS-MS), soit pour la quantification précise et spécifique d'un peptide à partir de ses fragments caractéristiques. Par exemple, le peptide aS1 [91-100]) a été isolé à partir de sa masse (ion doublement chargé de masse 634.5 Da) et quantifié à partir de l'intensité de ses ions fils caractéristiques après fragmentation (ions de m/z de 991.5 Da, 771.5 Da et 658.3 Da). De façon encore plus précise, un étalon interne constitué du même peptide de synthèse deutéré deux fois (fragment caractéristique de 993.5 Da) a permis de prendre en compte et de s'affranchir d'éventuelles interférences liées à la matrice.
Les résultats sont illustrés par la figure 1.
Lors de sa mise en oeuvre à ce stade (avant fermentation par un ferment consistant en un mélange des souches 1-2783 (déposée à la CNCM le 24/01/02), 1-2774 (déposée à la CNCM le 24/01/02), 1-2835 (déposée à la CNCM le 04/04/02) et 1-1968 (déposée à la CNCM le 14/01/98), ou un ferment tel que YC380 (Chr. Hansen SA, Le Moulin d'Aulnay, BP64, 91292 ARPAJON Cedex France), on a mis en évidence que plus de 95%
du peptide bioactif aS1 [91-100] étaient consommés après fermentation.
Ces observations montrent que l'incorporation de peptides bioactifs conformément à ce qui précède n'est pas applicable telle quelle à
l'obtention de produits alimentaires, notamment laitiers, supplémentés avec des quantités de peptides et/ou protéines bioactifs suffisamment stables dans le temps pour observer l'effet recherché chez le consommateur.
1. 2) Exemples avec d'autres peptides bioactifs d'intérêt Les résultats sont illustrés par les figures 2 et 3.
L'ingrédient Lactium contient de nombreux autres peptides, dont certains présentent potentiellement une activité biologique (comme le fragment 23-34 de la caséine aS1, que l'on retrouve aussi commercialisé
dans l'ingrédient C12 de la société DMV International). Il est intéressant de constater que la quasi-totalité des peptides apportés par l'ajout du Lactium sont largement consommés pendant la fermentation.
Quelle que soit leur origine (provenant des différentes caséines (XS1, aS2, K, 0) et leur taille (de 2 à 3 résidus jusqu'à 12 résidus et plus), tous les peptides sont globalement consommés pendant le processus de fermentation.
1.3) Mise en oeuvre du peptide bioactif aS1 [91-100] (Lactiurn ) avec d'autres ferments Afin de vérifier que ce phénomène n'était pas particulier aux deux ferments utilisés dans le paragraphe 1.1) ci-dessus, les principaux ferments industriels, ainsi que différentes souches pures rentrant dans la composition de ces ferments, ont été testés sur la base du même test : du lait reconstitué à partir de poudre de lait, auquel a été ajouté le Lactium à une dose de 1,5 g/L, a été fermenté dans des conditions standard (température optimale du ferment entre 37 et 42 C, arrêt de la fermentation à pH 4.7, 2 répétitions). L'analyse du taux de peptide bioactif aSl [91-100] a ensuite été réalisée sur l'échantillon avant et après fermentation.
Les résultats obtenus sur les souches pures sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous :
5 Tableau 3 Souches pures (S. thermophilus) % de peptide aS1 [91-100] restant après fermentation I-1630 (24/10/95) 0,3 1-1477 (22/09/94) 0,3 Souches pures (Lactobacillus) 1-1632 (24/10/95) 0,2 1-1519 (30/12/94) 0,1 1-1968 (14/01/98) 1,6 I-2809 (19/02/02 0,4 Dans le tableau 3 ci-dessus, qui reflète la consommation du peptide bioactif aS1 [91-100] par différents ferments et souches industrielles lors 10 de la fermentation d'un mix laitier contenant 1.5 g/L de Lactium , les souches pures ont été identifiées par leurs numéro et date de dépôt respectifs auprès de la CNCM (Institut Pasteur, Paris, France).
Le Tableau 3 montre que la totalité des ferments et souches testés métabolisent de 94 à 100% du peptide bioactif aS1 [91-100] pendant la 15 fermentation d'un mix laitier standard. La mise en oeuvre de cet ingrédient est donc impossible dans des conditions classiques pour produire des produits alimentaires, notamment laitiers, contenant des peptides et/ou protéines bioactifs en quantités suffisamment stables au cours du temps pour produire un effet chez le consommateur.
20 En outre, afin de vérifier que ce phénomène n'était pas particulier à
l'ingrédient Lactium , plusieurs combinaisons de ferments et d'autres ingrédients à base de peptides bioactifs ont été étudiées en mettant en ceuvre le même test (lait reconstitué + ingrédient à tester à une dose de 1,5 g/L, fermenté dans des conditions standard, arrêt de la fermentation à
pH 4.7, 2 répétitions). Les diverses combinaisons testées sont rapportées dans le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4 Ferments/souches Peptide aSl Autres peptides DMV DMV CPP
pures [91-100] dans Lactium C12 dans Lactium Mélange de 4 X X X X
souches:
1-2783 (24/01/02) 1-2774 (24/01/02) 1-2835 (04/04/02) 1-1968 (14101198) I-1630 (24/10/95) X X X
YC380 Hansen X X X X
Les ingrédients C12 et CPP produits par la société DMV International sont des hydrolysats de protéines de lait contenant des peptides bioactifs ciblant respectivement le contrôle de l'hypertension et l'assimilation des minéraux.
Sur l'ensemble des expérimentations, il est apparu que tous les ferments testés ont une importante capacité de métabolisation des peptides, quelles que soient leur nature et leur taille.
1.4) Ajout après fermentation Une alternative logique à la procédure étudiée ci-dessus est d'introduire l'ingrédient fonctionnel après la fermentation (procédé de type différentiation retardée ), par exemple avec le sirop permettant d'aromatiser la masse fermentée. La mise en ceuvre de la même quantité
d'ingrédient Lactium selon ce protocole conduit aux résultats illustrés par la figure 4.
Comme le montre la figure 4, même ajouté à froid (4 C) après fermentation, le peptide actif (apporté par l'équivalent de 1.5 g de Lactium par kg de produit fini) est rapidement dégradé au cours du stockage, pour ne laisser que 30 à 40% de la quantité initiale à la date limite de consommation (DLC).
Ainsi, la population de bactéries lactiques vivantes dans le produit fini continue de métaboliser le peptide bioactif pendant le stockage du produit fini, si bien qu'après seulement 10 jours (pour des produits frais dont la DLC est de 28 jours), entre 35 et 50% du peptide aS1 [91-100] ont disparu, ce qui reste inacceptable pour obtenir l'effet recherché chez le consommateur.
1.5) Traitement thermique du produit laitier fermenté contenant l'ingrédient bioactif d'intérêt En ce cas, il est possible d'assurer la stabilité du peptide aS1 [91-100]
(Figure 5), mais au détriment de la qualité globale du produit fini. Cette solution présente en effet de nombreux inconvénients :
- la thermisation d'une masse laitière fermentée implique l'usage de stabilisants ajoutés avant le traitement thermique (pectines, amidons, carraghenanes, etc...), ce qui complique le procédé et augmente sensiblement le coût de la formule ;
- la ligne de fabrication industrielle est plus complexe et demande un investissement spécifique plus important ;
- le produit ne bénéficie plus d'appellations liées aux produits contenant des ferments vivants (type yoghourt) et perd de fait les bénéfices associés à la consommation de ferments lactiques - l'impact organoleptique (généralement négatif) est significatif.
Exemple 2: Mise en oeuvre d'ingrédients bioactifs d'intérêt en mettant en application l'invention revendiquée La stratégie consiste à saturer les systèmes protéolytiques / de transport de peptides des bactéries lactiques en ajoutant une quantité suffisante d'un ou plusieurs peptides (peptides leurres ) préférés à celui / ceux que l'on cherche à protéger. L'effet protecteur existe à la fois pendant la fermentation et lors du stockage du produit fini jusqu'à DLC. La figure 6 présente un exemple de réalisation sur le modèle des essais précédents.
Comme le montre la figure 6, le peptide aS1 [91-100] apporté sous forme de Lactium après fermentation est en grande partie protégé en présence de l'hydrolysat de caséine Vitalarmor 950 (Armor Protéines, France) par rapport au témoin.
Le choix de la nature et de la quantité de peptide leurre à mettre en oeuvre pour une efficacité de protection suffisante est important. De nombreux hydrolysats commerciaux (essentiellement des hydrolysats enzymatiques de protéines de lait bovin) ont ainsi été testés et évalués, comme le résume le tableau 5 ci-dessous.
Le tableau 5 montre la consommation du peptide bioactif aS1 [91-100]
(apporté par l'équivalent de 1.5 g/L de Lactium ) pendant la fermentation par le ferment contenant les souches 1-2783, 1-2774, 1-2835 et 1-1968, en présence de différents hydrolysats commerciaux (concentration identique de 1.5 g/L).
Tableau 5 Hydrolysat leurre % [91-100]
(nom commercial) après Fermentation MPH 955 28,0 Alaco 70-14 33,8 WPH 917 1,7 WPH 955 56,6 Arla 20-21 6,2 WPH 926 29,1 DSE 6441 23,6 WPH948 12,8 Biozate 1 3,0 MPH 910 0,4 DSE 6060 0,5 Alatal 821 46,0 Vitalarmor 950 55,5 DMV C12 33,5 - MPH 955: hydrolysat de protéines de caséine, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - Alaco 70-14: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Reilingen, Allemagne - WPH 917: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Reilingen, Allemagne - WPH 955: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Reliingen, Allemagne - Arla 20-21 : hydrolysat de protéines de lactosérum, Arla Foods Ingredients Amba, 2 rue Victor Griffuelhes, 92772 Boulogne Cedex, France - WPH 926: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - DSE 6441 : hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - WPH948: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - Biozate 1 : hydrolysat de protéines de lactosérum, Davisco Foods International, 11000 West 78th Street, Suite 210 Eden Prairie, Minnesota - MPH 910: hydrolysat de protéines de caséine, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - DSE 6060: hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne 10 - Alatal 821 : hydrolysat de protéines de lactosérum, NZMP Gmbh, Siemensstrasse 6-14, D-25462, Rellingen, Allemagne - Vitalarmor 950: hydrolysat de caséines, ARMOR PROTEINES 35460 Saint Brice en Cogles - DMV C 12: hydrolysat de protéines laitières, DMV INTERNATIONAL, 15 P.O. Box 105, Redhill Surrey RH1 3YH, Grande Bretagne D'après le tableau 5, certains hydrolysats n'ont que peu ou pas d'effet (il reste à peine quelques % de peptide aSl [91-100] après fermentation, même en leur présence). En revanche, d'autres ont un bon effet 20 protecteur puisque que l'on retrouve jusqu'à plus de 50% du peptide aS1 [91-100] après la fermentation.
La concentration en peptide leurre est aussi un facteur d'importance : plus celle-ci est élevée, plus la protection du peptide d'intérêt est forte, comme le montre la figure 7.
25 Plus globalement, c'est la proportion peptide d'intérêt/peptide leurre qui régule l'effet de protection plus ou moins efficace du peptide d'intérêt, comme le montre la figure 8.
La protection ainsi obtenue n'est pas spécifique au peptide aS1 [91-100], mais concerne la majeure partie des peptides de l'hydrolysat d'intérêt.
Il est ainsi possible de protéger, moyennant un choix judicieux d'ingrédient leurre apporté en quantité suffisante, tout type de peptide dans une large gamme de taille.
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Claims (28)
1. Produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, caractérisé
en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont protégés au moyen d'au moins un ingrédient alimentaire leurre contenu dans ledit produit alimentaire, de sorte que leur métabolisation par le ou lesdits microorganismes vivants est réduite.
en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont protégés au moyen d'au moins un ingrédient alimentaire leurre contenu dans ledit produit alimentaire, de sorte que leur métabolisation par le ou lesdits microorganismes vivants est réduite.
2. Produit alimentaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité résiduelle d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans ledit produit alimentaire est, 3 semaines après sa préparation, comprise entre 50 et 100 % environ par rapport à la quantité d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présente dans le produit juste après sa préparation.
3. Produit alimentaire selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite quantité résiduelle est comprise entre 80 et 100% environ par rapport à ladite quantité d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présente dans le produit juste après sa préparation.
4. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, caractérisé en ce qu'il contient entre environ 0,001 et 2% en poids d'ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) par rapport au poids total du produit fini.
3, caractérisé en ce qu'il contient entre environ 0,001 et 2% en poids d'ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) par rapport au poids total du produit fini.
5. Produit alimentaire selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il contient entre environ 0,001 et 0,2% en poids d'ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) par rapport au poids total du produit fini.
6. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à
5, caractérisé en ce que la vitesse de métabolisation du ou des ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) dans ledit produit alimentaire est, 3 semaines après sa préparation, au moins égale à celle du ou des ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt.
5, caractérisé en ce que la vitesse de métabolisation du ou des ingrédient(s) alimentaire(s) leurre(s) dans ledit produit alimentaire est, 3 semaines après sa préparation, au moins égale à celle du ou des ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt.
7. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à
6, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont choisis parmi:
- des protéines, - des peptides, - des analogues ou dérivés de ceux-ci, et - leurs combinaisons.
6, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont choisis parmi:
- des protéines, - des peptides, - des analogues ou dérivés de ceux-ci, et - leurs combinaisons.
8. Produit alimentaire selon la revendication 7, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont choisis parmi :
le peptide .alpha.S1 [91-100], le peptide C6-.alpha.s1 194-199, le peptide C7-.beta.177-183, le peptide C12-.alpha.s1 23-34, les caséinophosphopeptides, l'.alpha.-casomorphine, la caséine a exorphine, la casokinine, la .beta.-casomorphine, les caséinomacropeptides et les glycomacropeptides, la casoxine, les casoplatellines, les fragments 50-53, les .beta.-lactorphines, la lactoferroxine, les peptides Val-Pro-Pro, Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln, Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu, Tyr-Pro, Ile-Pro-Pro, des fragments, analogues, dérivés de ceux-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons.
le peptide .alpha.S1 [91-100], le peptide C6-.alpha.s1 194-199, le peptide C7-.beta.177-183, le peptide C12-.alpha.s1 23-34, les caséinophosphopeptides, l'.alpha.-casomorphine, la caséine a exorphine, la casokinine, la .beta.-casomorphine, les caséinomacropeptides et les glycomacropeptides, la casoxine, les casoplatellines, les fragments 50-53, les .beta.-lactorphines, la lactoferroxine, les peptides Val-Pro-Pro, Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln, Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu, Tyr-Pro, Ile-Pro-Pro, des fragments, analogues, dérivés de ceux-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons.
9. Produit alimentaire selon la revendication 8, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont choisis parmi :
le peptide .alpha.S1 [91-100], des fragments, analogues, dérivés de celui-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons.
le peptide .alpha.S1 [91-100], des fragments, analogues, dérivés de celui-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs combinaisons.
10. Produit alimentaire selon la revendication 7, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont des sources nutritives d'azote pour le ou lesdits microorganismes vivants.
11. Produit alimentaire selon la revendication 10, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont choisis parmi:
- l'ingrédient Alatal 821 ;
- l'ingrédient Vitalarmor 950 ;
- des fragments, analogues ou dérivés de ceux-ci ;
- des protéines et/ou peptides les contenant ; et - leurs combinaisons.
- l'ingrédient Alatal 821 ;
- l'ingrédient Vitalarmor 950 ;
- des fragments, analogues ou dérivés de ceux-ci ;
- des protéines et/ou peptides les contenant ; et - leurs combinaisons.
12. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à
11, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants ont une capacité intacte ou réduite de métabolisation du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
11, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants ont une capacité intacte ou réduite de métabolisation du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
13. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à
12, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants sont des bactéries, de préférence des bactéries lactiques, vivantes.
12, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants sont des bactéries, de préférence des bactéries lactiques, vivantes.
14. Produit alimentaire selon la revendication 13, caractérisé en ce que lesdites bactéries vivantes sont choisies parmi:
- Streptococcus spp, de préférence Streptococcus thermophilus ;
- Lactobacillus spp, - Lactococcus spp ; et - Bifidobacterium spp.
- Streptococcus spp, de préférence Streptococcus thermophilus ;
- Lactobacillus spp, - Lactococcus spp ; et - Bifidobacterium spp.
15. Produit alimentaire selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il contient au moins les bactéries vivantes S. thermophilus et Lactobacillus spp.
16. Produit alimentaire selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que lesdites bactéries vivantes S. thermophilus sont choisies parmi :
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 24/01/02 sous le numéro I-2774 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 24/10/95 sous le numéro I-1630 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro I-3211 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro I-3301 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro I-3302.
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 24/01/02 sous le numéro I-2774 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 24/10/95 sous le numéro I-1630 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le numéro I-3211 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro I-3301 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le numéro I-3302.
17. Produit alimentaire selon la revendication 16, caractérisé en ce que lesdites bactéries vivantes sont des bactéries S. thermophilus déposées à
la CNCM le 10/05/04 sous le numéro I-3211.
la CNCM le 10/05/04 sous le numéro I-3211.
18. Produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à
17, caractérisé en ce qu'il est un produit fermenté.
17, caractérisé en ce qu'il est un produit fermenté.
19. Produit alimentaire selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il est un produit laitier ou végétal.
20. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont ajoutés dans le mélange destiné à
constituer ledit produit alimentaire, après fermentation de celui-ci.
constituer ledit produit alimentaire, après fermentation de celui-ci.
21. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont ajoutés les uns après les autres dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.
22. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont ajoutés simultanément dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.
23. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou le ou lesdits ingrédients alimentaires leurres sont préparés directement dans le mélange destiné à
constituer ledit produit alimentaire.
constituer ledit produit alimentaire.
24. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon la revendication 23, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants sont ajoutés, dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire, avant la synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou du ou desdits ingrédients alimentaires leurres.
25. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon la revendication 23, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants sont ajoutés, dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire, pendant la synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou du ou desdits ingrédients alimentaires leurres.
26. Procédé de préparation d'un produit alimentaire selon la revendication 23, caractérisé en ce que le ou lesdits microorganismes vivants sont ajoutés, dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire, après la synthèse in situ du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt et/ou du ou desdits ingrédients alimentaires leurres.
27. Utilisation d'un produit alimentaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 19 comme aliment fonctionnel.
28. Utilisation, dans un produit alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, d'au moins un ingrédient alimentaire leurre pour protéger le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt contre la métabolisation par le ou lesdits microorganismes vivants.
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