CA2493470C - Particules revetues en surface de hyaluronane ou d'un de ses derives et leur utilisation a titre de vecteurs biologiques pour des matieres actives - Google Patents
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Abstract
« Particules revêtues en surface de hyaluronane ou d'un de ses dérivés et leur utilisation á titre de vecteurs biologiques pour des matières actives » La présente invention concerne des particules dont le c.oelig.ur est á base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, caractérisées en ce qu'elles sont revêtues, au moins partiellement en surface d'au moins un hyaluronane ou de l'un de ses dérivés, ledit hyaluronane étant un hyaluronane amphiphile, hydrosoluble et dont les fonctions carboxyliques sont en partie transformées pour figurer des groupes hydrophobes.
Description
Particules revêtues en surface de hyaluronane ou d'un de ses dérivés et leur utilisation à
titre de vecteurs biologiques pour des matières actives La présente invention concerne principalement des particules revêtues au moins partiellement en surface de hyaluronane ou dérivé et l'utilisation de ces particules à
titre de vecteurs biologiques pour des matières actives.
La vectorisation est une opération visant à moduler et si possible à
totalement maîtriser la distribution d'une substance, en l'associant à un système approprié appelé
vecteur.
Dans le domaine de la vectorisation, trois fonctions principales sont à
assurer :
- transporter la ou les matières actives dans les liquides biologiques de l'organisme, - acheminer les matières actives vers les organes à traiter, et - assurer la libération de ces matières actives.
A ces trois fonctions, s'ajoute une exigence de biodisponibilité du vecteur.
Il doit être biodégradable et ses sous-unités doivent être tolérées par l'organisme.
En fait, le devenir in vivo du vecteur est conditionné par sa taille, ses caractéristiques physico-chimiques et, en particulier, ses propriétés de surface qui, d'une part jouent un rôle déterminant avec les composants du milieu biologique et, d'autre part peuvent induire un comportement ciblé vers un site spécifique à traiter.
Les vecteurs biologiques, plus particulièrement concernés dans le cadre de la présente invention, appartiennent au domaine des particules, notamment nano-et micro-particules.
Des nano-particules et micro-particules de poly(acide lactique) (PLA) et/ou de polyester biodégradable dont les produits de dégradation sont des métabolites naturels d'un organisme humain, sont proposées depuis longtemps pour vectoriser des molécules bioactives pour différents types d'administration. Cependant, le caractère hydrophobe de la surface de ces particules ainsi que la présence de groupes carboxylates (extrémités des chaînes de PLA) entraînent une adsorption de protéines plasmatiques, les opsonines, responsables en particulier de la capture des particules par les cellules du Système des Phagocytes Mononucléés (SPM). Il en résulte une disparition rapide des particules du volume circulant en même temps qu'une accumulation dans les organes du SPM
(foie, rate, reins).
titre de vecteurs biologiques pour des matières actives La présente invention concerne principalement des particules revêtues au moins partiellement en surface de hyaluronane ou dérivé et l'utilisation de ces particules à
titre de vecteurs biologiques pour des matières actives.
La vectorisation est une opération visant à moduler et si possible à
totalement maîtriser la distribution d'une substance, en l'associant à un système approprié appelé
vecteur.
Dans le domaine de la vectorisation, trois fonctions principales sont à
assurer :
- transporter la ou les matières actives dans les liquides biologiques de l'organisme, - acheminer les matières actives vers les organes à traiter, et - assurer la libération de ces matières actives.
A ces trois fonctions, s'ajoute une exigence de biodisponibilité du vecteur.
Il doit être biodégradable et ses sous-unités doivent être tolérées par l'organisme.
En fait, le devenir in vivo du vecteur est conditionné par sa taille, ses caractéristiques physico-chimiques et, en particulier, ses propriétés de surface qui, d'une part jouent un rôle déterminant avec les composants du milieu biologique et, d'autre part peuvent induire un comportement ciblé vers un site spécifique à traiter.
Les vecteurs biologiques, plus particulièrement concernés dans le cadre de la présente invention, appartiennent au domaine des particules, notamment nano-et micro-particules.
Des nano-particules et micro-particules de poly(acide lactique) (PLA) et/ou de polyester biodégradable dont les produits de dégradation sont des métabolites naturels d'un organisme humain, sont proposées depuis longtemps pour vectoriser des molécules bioactives pour différents types d'administration. Cependant, le caractère hydrophobe de la surface de ces particules ainsi que la présence de groupes carboxylates (extrémités des chaînes de PLA) entraînent une adsorption de protéines plasmatiques, les opsonines, responsables en particulier de la capture des particules par les cellules du Système des Phagocytes Mononucléés (SPM). Il en résulte une disparition rapide des particules du volume circulant en même temps qu'une accumulation dans les organes du SPM
(foie, rate, reins).
2 PCT/FR2003/002299 La présente invention a notamment pour objectif de proposer de nouvelles particules possédant une durée de vie prolongée et particulièrement avantageuses pour véhiculer des matières actives biologiques ou synthétiques, intéressantes dans le domaine de la rhumatologie.
Dans ce domaine clinique, le praticien est souvent confronté à des pathologies inflammatoires et/ou dégénératives qui engendrent, à plus ou moins long terme, des dégradations parfois irréversibles du cartilage. Outre des traitements non spécifiques à base d'antalgiques et d'anti-inflammatoires non stéroïdiens, on peut avoir recours, entre autres, à des injections locales de corticoïdes. Les doses élevées de corticoïdes utilisées dans ce cas de figure peuvent, toutefois, induire des effets indésirables non négligeables. Par ailleurs, il est généralement nécessaire de multiplier ces injections en raison d'une action bénéfique trop réduite.
L'administration de ce type de matières actives par l'intermédiaire de particules serait donc une alternative particulièrement avantageuse aux thérapies conventionnelles.
En l'occurrence, la présente invention vise notamment à proposer un vecteur de type particules qui, d'une part est biodégradable et approprié au relargage contrôlé d'une matière active et, d'autre part est capable de cibler efficacement la libération de cette matière active au niveau des cellules tissulaires et plus particulièrement des cellules possédant des récepteurs spécifiques aux hyaluronanes, encore dénommés CD44.
Ces récepteurs sont notamment présents au niveau des cellules de la sphère articulaire comme par exemple les chondrocytes et les synoviocytes. Les chondrocytes sont des cellules impliquées dans la synthèse de la matrice cartilagineuse. Elles gèrent également le maintien de l'homéostasie du cartilage. Les synoviocytes qui sont des cellules localisées dans la membrane synoviale, sont pour leur part impliquées dans la synthèse du hyaluronane dans le liquide synoviale.
De manière inattendue, les inventeurs ont mis en évidence qu'il était possible de cibler efficacement le relargage d'une matière active encapsulée dans des particules vers des cellules possédant notamment ce type de récepteur, en les fonctionnalisant en surface avec du hyaluronane.
Un premier aspect de l'invention concerne donc des particules dont le coeur est à base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, caractérisées en ce qu'elles
Dans ce domaine clinique, le praticien est souvent confronté à des pathologies inflammatoires et/ou dégénératives qui engendrent, à plus ou moins long terme, des dégradations parfois irréversibles du cartilage. Outre des traitements non spécifiques à base d'antalgiques et d'anti-inflammatoires non stéroïdiens, on peut avoir recours, entre autres, à des injections locales de corticoïdes. Les doses élevées de corticoïdes utilisées dans ce cas de figure peuvent, toutefois, induire des effets indésirables non négligeables. Par ailleurs, il est généralement nécessaire de multiplier ces injections en raison d'une action bénéfique trop réduite.
L'administration de ce type de matières actives par l'intermédiaire de particules serait donc une alternative particulièrement avantageuse aux thérapies conventionnelles.
En l'occurrence, la présente invention vise notamment à proposer un vecteur de type particules qui, d'une part est biodégradable et approprié au relargage contrôlé d'une matière active et, d'autre part est capable de cibler efficacement la libération de cette matière active au niveau des cellules tissulaires et plus particulièrement des cellules possédant des récepteurs spécifiques aux hyaluronanes, encore dénommés CD44.
Ces récepteurs sont notamment présents au niveau des cellules de la sphère articulaire comme par exemple les chondrocytes et les synoviocytes. Les chondrocytes sont des cellules impliquées dans la synthèse de la matrice cartilagineuse. Elles gèrent également le maintien de l'homéostasie du cartilage. Les synoviocytes qui sont des cellules localisées dans la membrane synoviale, sont pour leur part impliquées dans la synthèse du hyaluronane dans le liquide synoviale.
De manière inattendue, les inventeurs ont mis en évidence qu'il était possible de cibler efficacement le relargage d'une matière active encapsulée dans des particules vers des cellules possédant notamment ce type de récepteur, en les fonctionnalisant en surface avec du hyaluronane.
Un premier aspect de l'invention concerne donc des particules dont le coeur est à base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, caractérisées en ce qu'elles
3 sont revêtues, au moins partiellement en surface, d'au moins un hyaluronane ou de l'un de ses dérivés.
Plus particulièrement, l'invention concerne des particules hydrosolubles, chaque particule comprenant :
un coeur à base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, le coeur étant revêtu, au moins partiellement en surface d'au moins un hyaluronane, le hyaluronane étant un hyaluronane amphiphile, hydrosoluble et dont les fonctions carboxyliques sont en partie transformées pour figurer des groupes hydrophobes, ces groupes hydrophobes étant ancrés dans le coeur en polymère des particules, et au moins une matière active encapsulée dans le coeur de polymère.
L'invention concerne également un vecteur pour la vectorisation d'au moins une matière active. Le vecteur comprend au moins des particules hydrosolubles, chaque particule hydrosoluble comprenant un coeur à base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, le coeur étant revêtu, au moins partiellement en surface d'au moins un hyaluronane, le hyaluronane étant un hyaluronane amphiphile, hydrosoluble et dont les fonctions carboxyliques sont en partie transformées pour figurer des groupes hydrophobes, ces groupes hydrophobes étant ancrés dans le coeur en polymère des particules.
L'invention concerne aussi l'utilisation de ce vecteur pour encapsuler et vectoriser au moins une matière active.
L'invention a de plus pour objet l'utilisation des particules ou du vecteur pour le traitement de l'arthrose.
L'invention concerne aussi l'utilisation du hyaluronane tel que défini ci-dessus à titre d'agent de ciblage en surface de particules et de capsules.
L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique ou de diagnostic comprenant au moins des particules telles que définies ci-dessus, associé(es) à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible.
3a L'invention concerne de plus une composition pharmaceutique ou de diagnostic comprenant au moins un vecteur tel que défini dans l'invention, et au moins une matière active.
De préférence, la composition comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible.
L'acide hyaluronique est un polysaccharide naturel constitué par une succession de motifs disaccharidique.s N-acétylglucosamine/acide glucuronique et dont les solutions aqueuses ont une viscosité élevée. Il est présent notamment dans le cordon ombilical, dans l'humeur vitrée et dans le liquide synovial. Il est également produit par certaines bactéries, notamment par des streptocoques hémolytiques des groupes A et C. La masse molaire de l'acide hyaluronique peut varier de 10 000 à 10 000 000 g environ, selon l'origine. L'acide hyaluronique est commercialisé notamment sous la forme de son sel de sodium (encore dénommé hyaluronate). On utilise le terme générique hyaluronane pour désigner indistinctement l'acide hyaluronique et les hyaluronates, notamment sous la forme de sels inorganiques ou organiques et en particulier les sels alcalins et/ou alcalino-terreux.
Plus particulièrement, ce hyaluronane est mis en oeuvre sous la forme d'un hyaluronane amphiphile, hydrosoluble dont les fonctions carboxyliques sont en partie transformées de manière à figurer des groupements hydrophobes. La fixation de ces groupements hydrophobes peut notamment être établie par réaction de ceux-ci avec les fonctions carboxyliques du hyaluronate selon une réaction d'estérification ou d'amidification. Cette transformation est effectuée à un taux suffisant pour conférer un comportement amphiphile audit hyaluronane.
La transformation des fonctions carboxyliques du hyaluronate peut ainsi être obtenue par une estérification et/ou amidification partielle de ces fonctions.
De tels dérivés sont notamment décrits dans FR 2 794 763.
Les groupes hydrophobes peuvent notamment dériver de l'estérification des fonctions carboxyliques par au moins un groupe choisi parmi :
3b des chaînes alkyles, linéaires ou ramifiées, saturées ou insaturées, pouvant être interrompues par un ou plusieurs hétéroatomes comme les atomes de S, O et N, et le cas échéant, substituées par au moins un noyau aromatique, et - des oligomères comme ceux dérivant des a-hydroxyacides.
Les chaînes alkyles peuvent posséder un nombre d'atomes de carbone supérieur à 5 et notamment supérieur à 10. Toutefois, dans le cas particulier où une telle chaîne est substituée par un noyau aromatique, son nombre d'atomes de carbone peut être
Plus particulièrement, l'invention concerne des particules hydrosolubles, chaque particule comprenant :
un coeur à base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, le coeur étant revêtu, au moins partiellement en surface d'au moins un hyaluronane, le hyaluronane étant un hyaluronane amphiphile, hydrosoluble et dont les fonctions carboxyliques sont en partie transformées pour figurer des groupes hydrophobes, ces groupes hydrophobes étant ancrés dans le coeur en polymère des particules, et au moins une matière active encapsulée dans le coeur de polymère.
L'invention concerne également un vecteur pour la vectorisation d'au moins une matière active. Le vecteur comprend au moins des particules hydrosolubles, chaque particule hydrosoluble comprenant un coeur à base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, le coeur étant revêtu, au moins partiellement en surface d'au moins un hyaluronane, le hyaluronane étant un hyaluronane amphiphile, hydrosoluble et dont les fonctions carboxyliques sont en partie transformées pour figurer des groupes hydrophobes, ces groupes hydrophobes étant ancrés dans le coeur en polymère des particules.
L'invention concerne aussi l'utilisation de ce vecteur pour encapsuler et vectoriser au moins une matière active.
L'invention a de plus pour objet l'utilisation des particules ou du vecteur pour le traitement de l'arthrose.
L'invention concerne aussi l'utilisation du hyaluronane tel que défini ci-dessus à titre d'agent de ciblage en surface de particules et de capsules.
L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique ou de diagnostic comprenant au moins des particules telles que définies ci-dessus, associé(es) à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible.
3a L'invention concerne de plus une composition pharmaceutique ou de diagnostic comprenant au moins un vecteur tel que défini dans l'invention, et au moins une matière active.
De préférence, la composition comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible.
L'acide hyaluronique est un polysaccharide naturel constitué par une succession de motifs disaccharidique.s N-acétylglucosamine/acide glucuronique et dont les solutions aqueuses ont une viscosité élevée. Il est présent notamment dans le cordon ombilical, dans l'humeur vitrée et dans le liquide synovial. Il est également produit par certaines bactéries, notamment par des streptocoques hémolytiques des groupes A et C. La masse molaire de l'acide hyaluronique peut varier de 10 000 à 10 000 000 g environ, selon l'origine. L'acide hyaluronique est commercialisé notamment sous la forme de son sel de sodium (encore dénommé hyaluronate). On utilise le terme générique hyaluronane pour désigner indistinctement l'acide hyaluronique et les hyaluronates, notamment sous la forme de sels inorganiques ou organiques et en particulier les sels alcalins et/ou alcalino-terreux.
Plus particulièrement, ce hyaluronane est mis en oeuvre sous la forme d'un hyaluronane amphiphile, hydrosoluble dont les fonctions carboxyliques sont en partie transformées de manière à figurer des groupements hydrophobes. La fixation de ces groupements hydrophobes peut notamment être établie par réaction de ceux-ci avec les fonctions carboxyliques du hyaluronate selon une réaction d'estérification ou d'amidification. Cette transformation est effectuée à un taux suffisant pour conférer un comportement amphiphile audit hyaluronane.
La transformation des fonctions carboxyliques du hyaluronate peut ainsi être obtenue par une estérification et/ou amidification partielle de ces fonctions.
De tels dérivés sont notamment décrits dans FR 2 794 763.
Les groupes hydrophobes peuvent notamment dériver de l'estérification des fonctions carboxyliques par au moins un groupe choisi parmi :
3b des chaînes alkyles, linéaires ou ramifiées, saturées ou insaturées, pouvant être interrompues par un ou plusieurs hétéroatomes comme les atomes de S, O et N, et le cas échéant, substituées par au moins un noyau aromatique, et - des oligomères comme ceux dérivant des a-hydroxyacides.
Les chaînes alkyles peuvent posséder un nombre d'atomes de carbone supérieur à 5 et notamment supérieur à 10. Toutefois, dans le cas particulier où une telle chaîne est substituée par un noyau aromatique, son nombre d'atomes de carbone peut être
4 PCT/FR2003/002299 réduit.
Le taux de transformation est généralement ajusté de manière à préserver une hydrosolubilité suffisante au dérivé hyaluronane amphiphile ainsi obtenu.
Il est également contrôlé en tenant compte de l'hydrophobie des groupes fixés sur le hyaluronane.
D'une manière générale, concernant les chaînes alkyles, plus la chaîne est longue, plus le taux de fixation au niveau du squelette hyaluronane pourra être faible.
Inversement, avec des chaînes alkyles courtes, le taux de fixation pourra être plus élevé. Il est clair que cet ajustement entre le taux de fixation et la longueur des chaînes alkyles relève des compétences de l'homme de l'art.
A titre indicatif, pour une chaîne alkyle contenant de 15 à 20 atomes de carbone et en particulier 18 atomes de carbone, le taux d'estérification peut être d'au plus %, voire inférieur à 10 % et, notamment inférieur à 7 % et en particulier compris entre 0,05 et 5 %. Pour une chaîne alkyle contenant de 10 à 14 atomes de carbone et notamment 15 de 12 atomes de carbone, ce taux d'estérification peut être supérieur ou égal à 25 % et pour une chaîne alkyle de 6 atomes de carbone, il peut être de l'ordre de 50 %.
Ce taux de transformation est généralement ajusté de manière à permettre la fixation du dérivé hyaluronane en surface des particules grâce à l'interaction de ses groupements hydrophobes avec la matrice polymérique hydrophobe constituant les particules. En d'autres termes, les chaînes alkyles sont ancrées dans la matrice hydrophobe pendant la formation des particules. Dans le cas de la présente invention, la fonctionnalisation en surface des particules par hyaluronane ne fait pas intervenir de lien covalent ni ionique entre ces deux entités. La fixation du dérivé hyaluronane relève essentiellement d'interactions de type hydrophobe et Van der Waals.
Le taux de transformation est également ajusté de manière à ne pas affecter l'affinité naturelle du hyaluronane pour les récepteurs CD44.
La présence de hyaluronane en surface de particules est particulièrement avantageuse pour les diriger sélectivement vers les récepteurs CD44 présents notamment sur les cellules de la sphère articulaire. Grâce à cette enveloppe hyaluronane, les particules, selon l'invention, utilisées à titre de vecteur biologique pour une matière active biologique ou synthétique permettent avantageusement de cibler efficacement la libération de cette matière active au niveau des cellules à récepteurs CD44, par exemple des chondrocytes
Le taux de transformation est généralement ajusté de manière à préserver une hydrosolubilité suffisante au dérivé hyaluronane amphiphile ainsi obtenu.
Il est également contrôlé en tenant compte de l'hydrophobie des groupes fixés sur le hyaluronane.
D'une manière générale, concernant les chaînes alkyles, plus la chaîne est longue, plus le taux de fixation au niveau du squelette hyaluronane pourra être faible.
Inversement, avec des chaînes alkyles courtes, le taux de fixation pourra être plus élevé. Il est clair que cet ajustement entre le taux de fixation et la longueur des chaînes alkyles relève des compétences de l'homme de l'art.
A titre indicatif, pour une chaîne alkyle contenant de 15 à 20 atomes de carbone et en particulier 18 atomes de carbone, le taux d'estérification peut être d'au plus %, voire inférieur à 10 % et, notamment inférieur à 7 % et en particulier compris entre 0,05 et 5 %. Pour une chaîne alkyle contenant de 10 à 14 atomes de carbone et notamment 15 de 12 atomes de carbone, ce taux d'estérification peut être supérieur ou égal à 25 % et pour une chaîne alkyle de 6 atomes de carbone, il peut être de l'ordre de 50 %.
Ce taux de transformation est généralement ajusté de manière à permettre la fixation du dérivé hyaluronane en surface des particules grâce à l'interaction de ses groupements hydrophobes avec la matrice polymérique hydrophobe constituant les particules. En d'autres termes, les chaînes alkyles sont ancrées dans la matrice hydrophobe pendant la formation des particules. Dans le cas de la présente invention, la fonctionnalisation en surface des particules par hyaluronane ne fait pas intervenir de lien covalent ni ionique entre ces deux entités. La fixation du dérivé hyaluronane relève essentiellement d'interactions de type hydrophobe et Van der Waals.
Le taux de transformation est également ajusté de manière à ne pas affecter l'affinité naturelle du hyaluronane pour les récepteurs CD44.
La présence de hyaluronane en surface de particules est particulièrement avantageuse pour les diriger sélectivement vers les récepteurs CD44 présents notamment sur les cellules de la sphère articulaire. Grâce à cette enveloppe hyaluronane, les particules, selon l'invention, utilisées à titre de vecteur biologique pour une matière active biologique ou synthétique permettent avantageusement de cibler efficacement la libération de cette matière active au niveau des cellules à récepteurs CD44, par exemple des chondrocytes
5 PCT/FR2003/002299 et/ou des synoviocytes. Il en résulte une action contrôlée et prolongée de cette matière active au niveau de la lésion visée. Ce dernier aspect est particulièrement intéressant pour le bien-être du patient, dans la mesure où il donne accès à une meilleure disponibilité du médicament et donc, permet de réduire les quantités administrées et leur fréquence d'administration.
La biodégradabilité des particules revendiquées est, par ailleurs, également assurée grâce à la nature des polymères qui les constituent.
Au sens de l'invention, on entend désigner sous l'appellation biodégradable tout polymère qui se dissout ou se dégrade en une période acceptable pour l'application à
laquelle il est destiné, habituellement en thérapie in vivo. Généralement, cette période doit être inférieure à 5 ans et plus préférentiellement à une année lorsque l'on expose une solution physiologique correspondante à un pH de 6 à 8 et à une température comprise entre 25 C et 37 C.
Les polymères biodégradables selon l'invention sont ou dérivent de polymères biodégradables synthétiques ou naturels.
Concernant les polymères biodégradables organosolubles utilisables pour constituer le coeur des particules, ils peuvent notamment être choisis parmi les polyesters comme les poly(acide lactique) (PLA), poly(acide glycolique) (PGA), poly(c-caprolactone) (PCL), les polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, poly(alkylène tartrate), polyphosphazènes, polyaminoacides, polyamidoamines, polycarbonates, polyméthylidènemalonate, polysiloxane, le polyhydroxybutyrate ou le poly(acide malique), ainsi que leurs copolymères et dérivés.
Selon une variante particulière de l'invention, les particules revendiquées possèdent une matrice polymérique incorporant au moins un polymère différent du hyaluronane. Plus préférentiellement, cette matrice est constituée d'un ou plusieurs polymères autres que le hyaluronane.
Sont notamment préférés comme polymères organosolubles biodégradables selon l'invention, les polyesters comme les polyacide lactique), poly(acide glycolique), poly(s-caprolactone), et leurs copolymères, comme par exemple le poly(acide lactique-co-acide glycolique) (PLGA).
Selon une variante particulière de l'invention, les particules sont composées majoritairement c'est-à-dire à plus de 50 % en poids, en particulier plus de 75 % en poids,
La biodégradabilité des particules revendiquées est, par ailleurs, également assurée grâce à la nature des polymères qui les constituent.
Au sens de l'invention, on entend désigner sous l'appellation biodégradable tout polymère qui se dissout ou se dégrade en une période acceptable pour l'application à
laquelle il est destiné, habituellement en thérapie in vivo. Généralement, cette période doit être inférieure à 5 ans et plus préférentiellement à une année lorsque l'on expose une solution physiologique correspondante à un pH de 6 à 8 et à une température comprise entre 25 C et 37 C.
Les polymères biodégradables selon l'invention sont ou dérivent de polymères biodégradables synthétiques ou naturels.
Concernant les polymères biodégradables organosolubles utilisables pour constituer le coeur des particules, ils peuvent notamment être choisis parmi les polyesters comme les poly(acide lactique) (PLA), poly(acide glycolique) (PGA), poly(c-caprolactone) (PCL), les polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, poly(alkylène tartrate), polyphosphazènes, polyaminoacides, polyamidoamines, polycarbonates, polyméthylidènemalonate, polysiloxane, le polyhydroxybutyrate ou le poly(acide malique), ainsi que leurs copolymères et dérivés.
Selon une variante particulière de l'invention, les particules revendiquées possèdent une matrice polymérique incorporant au moins un polymère différent du hyaluronane. Plus préférentiellement, cette matrice est constituée d'un ou plusieurs polymères autres que le hyaluronane.
Sont notamment préférés comme polymères organosolubles biodégradables selon l'invention, les polyesters comme les polyacide lactique), poly(acide glycolique), poly(s-caprolactone), et leurs copolymères, comme par exemple le poly(acide lactique-co-acide glycolique) (PLGA).
Selon une variante particulière de l'invention, les particules sont composées majoritairement c'est-à-dire à plus de 50 % en poids, en particulier plus de 75 % en poids,
6 voire en totalité, de poly(acide lactique).
Les particules selon l'invention, comprennent de préférence au moins une matière active biologique ou synthétique de type médicament sous une forme encapsulée dans le coeur de polymère.
Comme matières actives biologiques, on peut plus particulièrement citer les peptides, les protéines, les carbohydrates, les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides ou leurs mélanges. Il peut également s'agir de molécules organiques ou inorganiques synthétiques, qui, administrées in vivo à un animal ou à un patient, sont susceptibles d'induire un effet biologique et/ou manifester une activité
thérapeutique. Il peut ainsi s'agir d'antigènes, d'enzymes, d'hormones, de récepteurs, de vitamines et/ou de minéraux.
A titre représentatif et non limitatif des médicaments susceptibles d'être incorporés dans ces particules, on peut citer les composés anti-inflammatoires, les anesthésiants, les agents chimiothérapeutiques, les immunotoxines, les agents immunosuppresseurs, les stéroïdes, les antibiotiques, les antiviraux, les antifongiques, les antiparasitaires, les substances vaccinantes, les immunomodulateurs et les analgésiques.
Dans la mesure où les particules selon l'invention sont avantageusement ciblées vers les cellules de structure tissulaires comme par exemple les chondrocytes et synoviocytes, on peut privilégier l'utilisation à titre de matières actives des composés suivants : les anti-inflammatoires, des composants matriciels comme par exemple les glycosaminoglycanes, et des facteurs biologiques impliqués dans le processus de régénération et/ou protection du cartilage ou dans l'arthrose, et leur mélange. Les particules ont notamment pour avantage de protéger efficacement ce type de matière active particulièrement sensibles au phénomène de biodégradation.
Il peut également s'agir de composés biologiques plus particulièrement actifs vis-à-vis de l'arthrose comme par exemple la glucosâmine des glycosaminoglycannes, l'acide hyaluronique, le sulfate de chondroïtine et leurs mélanges.
6a Les particules conformes à l'invention peuvent comprendre jusqu'à 95 % en poids d'une matière active.
La matière active peut ainsi être présente en une quantité variant de 0,001 à
950 mg/g de particule et préférentiellement de 0,1 à 500 mg/g. Il est à noter que dans le cas de l'encapsulation de certains composés macromoléculaires (ADN, oligonucléotides,
Les particules selon l'invention, comprennent de préférence au moins une matière active biologique ou synthétique de type médicament sous une forme encapsulée dans le coeur de polymère.
Comme matières actives biologiques, on peut plus particulièrement citer les peptides, les protéines, les carbohydrates, les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides ou leurs mélanges. Il peut également s'agir de molécules organiques ou inorganiques synthétiques, qui, administrées in vivo à un animal ou à un patient, sont susceptibles d'induire un effet biologique et/ou manifester une activité
thérapeutique. Il peut ainsi s'agir d'antigènes, d'enzymes, d'hormones, de récepteurs, de vitamines et/ou de minéraux.
A titre représentatif et non limitatif des médicaments susceptibles d'être incorporés dans ces particules, on peut citer les composés anti-inflammatoires, les anesthésiants, les agents chimiothérapeutiques, les immunotoxines, les agents immunosuppresseurs, les stéroïdes, les antibiotiques, les antiviraux, les antifongiques, les antiparasitaires, les substances vaccinantes, les immunomodulateurs et les analgésiques.
Dans la mesure où les particules selon l'invention sont avantageusement ciblées vers les cellules de structure tissulaires comme par exemple les chondrocytes et synoviocytes, on peut privilégier l'utilisation à titre de matières actives des composés suivants : les anti-inflammatoires, des composants matriciels comme par exemple les glycosaminoglycanes, et des facteurs biologiques impliqués dans le processus de régénération et/ou protection du cartilage ou dans l'arthrose, et leur mélange. Les particules ont notamment pour avantage de protéger efficacement ce type de matière active particulièrement sensibles au phénomène de biodégradation.
Il peut également s'agir de composés biologiques plus particulièrement actifs vis-à-vis de l'arthrose comme par exemple la glucosâmine des glycosaminoglycannes, l'acide hyaluronique, le sulfate de chondroïtine et leurs mélanges.
6a Les particules conformes à l'invention peuvent comprendre jusqu'à 95 % en poids d'une matière active.
La matière active peut ainsi être présente en une quantité variant de 0,001 à
950 mg/g de particule et préférentiellement de 0,1 à 500 mg/g. Il est à noter que dans le cas de l'encapsulation de certains composés macromoléculaires (ADN, oligonucléotides,
7 PCT/FR2003/002299 protéines, peptides, etc) des charges encore plus faibles peuvent être suffisantes.
Les particules selon l'invention peuvent posséder une taille variant de 50 nm à
600 m et notamment de 80 nm à 250 m.
Les particules selon l'invention possédant une taille comprise entre 1 et 1000 nm sont dénommées nanoparticules. Les particules dont la taille varie de 1 à
plusieurs milliers de microns font référence à des microparticules.
Les particules sont généralement sous forme sphérique, mais peuvent également se présenter sous d'autres formes.
Les nanoparticules ou microparticules revendiquées peuvent être préparées selon des méthodes déjà décrites dans la littérature, et plus particulièrement peuvent être obtenues par la technique d'émulsion/évaporation du solvant et notamment celle décrite par R. Gurny et al. Development of biodégradable and injectable latices for controlled release ofpotent drugs Drug Dev. Ind. Pharm., vol. 7, p. 1-25 1981.
De manière inattendue, les inventeurs ont ainsi mis en évidence que les hyaluronanes amphiphiles précités pouvaient avantageusement être utilisés à la place des tensioactifs conventionnels pour la préparation de particules selon la technique émulsion/évaporation de solvant.
En fait, deux variantes de cette technique sont considérées selon la nature hydrophobe ou hydrophile de la matière active à encapsuler.
Lorsque que l'on cherche à encapsuler une matière active hydrophobe, on prépare une simple émulsion. Pour ce faire, le polymère biodégradable choisi est dissous dans la phase organique, notamment un solvant peu soluble dans l'eau comme par exemple du chlorure de méthylène ou de l'acétate d'éthyle, avec la matière active à
encapsuler. Le hyaluronane amphiphile, est pour sa part dissous dans la phase aqueuse qui sert de milieu dispersant à la phase organique. A l'issue du mélange de ces deux phases, le dérivé
hyaluronane se localise à l'interface eau/phase organique grâce à ses propriétés amphiphiles et stabilise ainsi l'émulsion. Lors de l'évaporation du solvant organique, les dérivés amphiphiles de hyaluronane demeurent avantageusement fixés à la surface des particules ainsi formées, les groupes hydrophobes étant ancrés plus ou moins profondément dans le coeur de polymère organosolubles formant les particules et la partie hydrophile, correspondant principalement au squelette hyaluronane, étant exposée à la surface. A la fin de l'évaporation du solvant, on récupère des particules conformes à
Les particules selon l'invention peuvent posséder une taille variant de 50 nm à
600 m et notamment de 80 nm à 250 m.
Les particules selon l'invention possédant une taille comprise entre 1 et 1000 nm sont dénommées nanoparticules. Les particules dont la taille varie de 1 à
plusieurs milliers de microns font référence à des microparticules.
Les particules sont généralement sous forme sphérique, mais peuvent également se présenter sous d'autres formes.
Les nanoparticules ou microparticules revendiquées peuvent être préparées selon des méthodes déjà décrites dans la littérature, et plus particulièrement peuvent être obtenues par la technique d'émulsion/évaporation du solvant et notamment celle décrite par R. Gurny et al. Development of biodégradable and injectable latices for controlled release ofpotent drugs Drug Dev. Ind. Pharm., vol. 7, p. 1-25 1981.
De manière inattendue, les inventeurs ont ainsi mis en évidence que les hyaluronanes amphiphiles précités pouvaient avantageusement être utilisés à la place des tensioactifs conventionnels pour la préparation de particules selon la technique émulsion/évaporation de solvant.
En fait, deux variantes de cette technique sont considérées selon la nature hydrophobe ou hydrophile de la matière active à encapsuler.
Lorsque que l'on cherche à encapsuler une matière active hydrophobe, on prépare une simple émulsion. Pour ce faire, le polymère biodégradable choisi est dissous dans la phase organique, notamment un solvant peu soluble dans l'eau comme par exemple du chlorure de méthylène ou de l'acétate d'éthyle, avec la matière active à
encapsuler. Le hyaluronane amphiphile, est pour sa part dissous dans la phase aqueuse qui sert de milieu dispersant à la phase organique. A l'issue du mélange de ces deux phases, le dérivé
hyaluronane se localise à l'interface eau/phase organique grâce à ses propriétés amphiphiles et stabilise ainsi l'émulsion. Lors de l'évaporation du solvant organique, les dérivés amphiphiles de hyaluronane demeurent avantageusement fixés à la surface des particules ainsi formées, les groupes hydrophobes étant ancrés plus ou moins profondément dans le coeur de polymère organosolubles formant les particules et la partie hydrophile, correspondant principalement au squelette hyaluronane, étant exposée à la surface. A la fin de l'évaporation du solvant, on récupère des particules conformes à
8 PCT/FR2003/002299 l'invention qui subissent ensuite un lavage à l'eau, une centrifugation ou une lyophilisation.
Dans le cas où la matière active à encapsuler est hydrophile à l'image des protéines et polysaccharides par exemple, on prépare une première émulsion de type huile dans eau, composée d'une phase organique contenant le polymère organosoluble biodégradable et d'une première phase aqueuse contenant la matière active.
Cette émulsion dite inversée est ensuite mise en présence d'une seconde phase aqueuse contenant le dérivé
hyaluronane amphiphile de manière à obtenir une double émulsion eau/huile/eau vis-à-vis de laquelle le hyaluronane anphiphile joue le rôle de stabilisant. Après évaporation du solvant, on récupère des particules conformes à la présente invention qui sont traitées comme précédemment.
Les conditions utilisées lors de la préparation des émulsions déterminent généralement la taille des particules et leur ajustement relève des compétences de l'homme de l'art.
L'utilisation d'un dérivé hyaluronane à titre d'agent stabilisant dans ce type de procédé de préparation de particules est donc particulièrement avantageuse à
au moins deux titres :
- elle permet de s'affranchir de la présence des agents tensioactifs systématiquement utilisés dans les procédés conventionnels. En l'occurrence, ces derniers ne sont pas toujours biocompatibles et parfois difficiles à éliminer en fin de synthèse ;
- elle conduit à l'issue de la synthèse des particules, à un vecteur manifestant une affinité sélective pour des cellules de structure tissulaires et plus particulièrement pour des cellules de la sphère articulaire et en particulier pour les chondrocytes et les synoviocytes.
La concentration de hyaluronane dans le milieu de synthèse des particules, détermine le taux de recouvrement des particules, c'est-à-dire la quantité de hyaluronane déposée à leur surface. Le dérivé hyaluronane est généralement réparti de manière homogène en surface des particules avec une densité surfacique pouvant varier de manière significative.
On peut également incorporer dans les particules, des composés à finalité de diagnostic. Il peut ainsi s'agir de substances détectables par rayons X, fluorescence, ultrasons, résonance magnétique nucléaire ou radioactivité. Les particules peuvent ainsi
Dans le cas où la matière active à encapsuler est hydrophile à l'image des protéines et polysaccharides par exemple, on prépare une première émulsion de type huile dans eau, composée d'une phase organique contenant le polymère organosoluble biodégradable et d'une première phase aqueuse contenant la matière active.
Cette émulsion dite inversée est ensuite mise en présence d'une seconde phase aqueuse contenant le dérivé
hyaluronane amphiphile de manière à obtenir une double émulsion eau/huile/eau vis-à-vis de laquelle le hyaluronane anphiphile joue le rôle de stabilisant. Après évaporation du solvant, on récupère des particules conformes à la présente invention qui sont traitées comme précédemment.
Les conditions utilisées lors de la préparation des émulsions déterminent généralement la taille des particules et leur ajustement relève des compétences de l'homme de l'art.
L'utilisation d'un dérivé hyaluronane à titre d'agent stabilisant dans ce type de procédé de préparation de particules est donc particulièrement avantageuse à
au moins deux titres :
- elle permet de s'affranchir de la présence des agents tensioactifs systématiquement utilisés dans les procédés conventionnels. En l'occurrence, ces derniers ne sont pas toujours biocompatibles et parfois difficiles à éliminer en fin de synthèse ;
- elle conduit à l'issue de la synthèse des particules, à un vecteur manifestant une affinité sélective pour des cellules de structure tissulaires et plus particulièrement pour des cellules de la sphère articulaire et en particulier pour les chondrocytes et les synoviocytes.
La concentration de hyaluronane dans le milieu de synthèse des particules, détermine le taux de recouvrement des particules, c'est-à-dire la quantité de hyaluronane déposée à leur surface. Le dérivé hyaluronane est généralement réparti de manière homogène en surface des particules avec une densité surfacique pouvant varier de manière significative.
On peut également incorporer dans les particules, des composés à finalité de diagnostic. Il peut ainsi s'agir de substances détectables par rayons X, fluorescence, ultrasons, résonance magnétique nucléaire ou radioactivité. Les particules peuvent ainsi
9 PCT/FR2003/002299 inclure des particules magnétiques, des matériaux radio-opaques, comme notamment le baryum ou des composés fluorescents. Alternativement, des émetteurs gamma (par exemple Indium ou Technetium) peuvent y être incorporés.
Comme décrit précédemment, la matière active est de préférence incorporée dans ces particules lors de leur processus de formation. Toutefois, lorsque cela s' avère possible, elle peut également être chargée au niveau des particules une fois que celles-ci sont obtenues.
Les particules selon l'invention peuvent être administrées de différentes façons, par exemple par voie orale ou parentérale et notamment par voies intra-articulaire, oculaire, pulmonaire, nasale, vaginale, cutanée et/ou buccale.
Les hyaluronanes présents en surface des particules selon l'invention, portant une multitude de fonctions OH réactives, il est en outre possible une fois les particules formées, de fixer à ses fonctions toutes sortes de molécules par des liaisons covalentes. A
titre illustratif et non limitatif de ce type de molécules, on peut notamment citer les molécules de type marqueurs et les composés susceptibles de potentialiser la fonction de ciblage assurée par le hyaluronane, comme par exemple des peptides RGD
(arginine glycine - acide aspartique) qui favorisent l'adhésion entre les cellules et leurs matrices extracellulaires.
Un second aspect de l'invention concerne un vecteur biologique notamment pour une ou plusieurs matière(s) active(s) biologique(s) ou synthétique(s) comprenant au moins des particules selon l'invention.
L'invention concerne également l'utilisation de ce vecteur, ou des particules revendiquées pour encapsuler au moins une matière active, biologique ou synthétique.
Un autre aspect de l'invention se rapporte à des compositions pharmaceutiques ou de diagnostic comprenant au moins un vecteur et notamment des particules selon l'invention, le cas échéant associé(es) à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible.
Comme évoqué précédemment, les particules revendiquées sont particulièrement avantageuses sur le plan pharmaceutique ou du diagnostic.
Elles assurent une protection satisfaisante de la matière active encapsulée.
Elles limitent la diffusion de cette matière active dans l'organisme grâce à l'effet stérique des particules en soi et à l'affinité naturelle du hyaluronane pour les récepteurs CD44. Elles
Comme décrit précédemment, la matière active est de préférence incorporée dans ces particules lors de leur processus de formation. Toutefois, lorsque cela s' avère possible, elle peut également être chargée au niveau des particules une fois que celles-ci sont obtenues.
Les particules selon l'invention peuvent être administrées de différentes façons, par exemple par voie orale ou parentérale et notamment par voies intra-articulaire, oculaire, pulmonaire, nasale, vaginale, cutanée et/ou buccale.
Les hyaluronanes présents en surface des particules selon l'invention, portant une multitude de fonctions OH réactives, il est en outre possible une fois les particules formées, de fixer à ses fonctions toutes sortes de molécules par des liaisons covalentes. A
titre illustratif et non limitatif de ce type de molécules, on peut notamment citer les molécules de type marqueurs et les composés susceptibles de potentialiser la fonction de ciblage assurée par le hyaluronane, comme par exemple des peptides RGD
(arginine glycine - acide aspartique) qui favorisent l'adhésion entre les cellules et leurs matrices extracellulaires.
Un second aspect de l'invention concerne un vecteur biologique notamment pour une ou plusieurs matière(s) active(s) biologique(s) ou synthétique(s) comprenant au moins des particules selon l'invention.
L'invention concerne également l'utilisation de ce vecteur, ou des particules revendiquées pour encapsuler au moins une matière active, biologique ou synthétique.
Un autre aspect de l'invention se rapporte à des compositions pharmaceutiques ou de diagnostic comprenant au moins un vecteur et notamment des particules selon l'invention, le cas échéant associé(es) à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible.
Comme évoqué précédemment, les particules revendiquées sont particulièrement avantageuses sur le plan pharmaceutique ou du diagnostic.
Elles assurent une protection satisfaisante de la matière active encapsulée.
Elles limitent la diffusion de cette matière active dans l'organisme grâce à l'effet stérique des particules en soi et à l'affinité naturelle du hyaluronane pour les récepteurs CD44. Elles
10 PCT/FR2003/002299 autorisent une libération progressive de cette substance active à proximité de la lésion et/ou des cellules visées permettant ainsi une action prolongée. Enfin, elles se dégradent lentement en produits bien tolérés par l'organisme.
Un autre aspect de la présente invention concerne l'utilisation de particules telles que définies ci-dessus voir d'un vecteur biologique en incorporant pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'arthrose.
Les particules peuvent également être incorporées dans des capsules, ou incorporées dans des implants, gels ou tablettes. Elles peuvent également être formulées directement dans un fluide de type huile par exemple et être injectées directement au niveau du site biologique à traiter.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de hyaluronane ou dérivé
amphiphile tel que défini précédemment à titre d'agent de ciblage en surface de particules, en particulier constituées d'au moins un polymère biodégradable ou de capsules, notamment creuses. Ces particules ou capsules peuvent notamment être des nano-ou micro-sphères ou des nano- ou micro-particules.
Les exemples et figures présentés ci-après sont soumis à titre illustratif et non limitatif du domaine de l'invention.
FIGURES :
Figure L: Représentation de la prolifération cellulaire de chondrocytes de rats cultivés en système monocouche après 48 h de traitement en présence de nanoparticules à
base de PLA (témoin) et de PLA revêtue de hyaluronane amphiphile.
Figure 2 : Représentation de la prolifération cellulaire et activité de synthèse en protéoglycanes, de chondrocytes cultivés sur billes d'alginate (culture tridimensionnelle) après 48 heures de traitement en présence de nanoparticules à base de PLA
(témoin) et de PLA revêtue de hyaluronane amphiphile.
MATERIEL ET METHODE
Synthèse des HA modifiés A titre d'exemple, est décrite ci-dessous la synthèse d'un hyaluronane substitué
par des chaînes aliphatiques à 18 carbones.
Le hyaluronate de sodium (HA, M, = 600 000 g/mol) provient de la Société
Un autre aspect de la présente invention concerne l'utilisation de particules telles que définies ci-dessus voir d'un vecteur biologique en incorporant pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'arthrose.
Les particules peuvent également être incorporées dans des capsules, ou incorporées dans des implants, gels ou tablettes. Elles peuvent également être formulées directement dans un fluide de type huile par exemple et être injectées directement au niveau du site biologique à traiter.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de hyaluronane ou dérivé
amphiphile tel que défini précédemment à titre d'agent de ciblage en surface de particules, en particulier constituées d'au moins un polymère biodégradable ou de capsules, notamment creuses. Ces particules ou capsules peuvent notamment être des nano-ou micro-sphères ou des nano- ou micro-particules.
Les exemples et figures présentés ci-après sont soumis à titre illustratif et non limitatif du domaine de l'invention.
FIGURES :
Figure L: Représentation de la prolifération cellulaire de chondrocytes de rats cultivés en système monocouche après 48 h de traitement en présence de nanoparticules à
base de PLA (témoin) et de PLA revêtue de hyaluronane amphiphile.
Figure 2 : Représentation de la prolifération cellulaire et activité de synthèse en protéoglycanes, de chondrocytes cultivés sur billes d'alginate (culture tridimensionnelle) après 48 heures de traitement en présence de nanoparticules à base de PLA
(témoin) et de PLA revêtue de hyaluronane amphiphile.
MATERIEL ET METHODE
Synthèse des HA modifiés A titre d'exemple, est décrite ci-dessous la synthèse d'un hyaluronane substitué
par des chaînes aliphatiques à 18 carbones.
Le hyaluronate de sodium (HA, M, = 600 000 g/mol) provient de la Société
11 PCT/FR2003/002299 Bioibérica (Barcelone, Espagne).
1 g de hyaluronate de sodium est dissous dans 100 ml d'eau distillée. La solution est mise en contact pendant 15 minutes avec 5 g de résine Dowex 50*8 échangeuse de cations conditionnée en H+ à 2,5 meq/g (stoechiométrie 1:6).
Après filtration, la solution contenant la forme acide du polysaccharide est neutralisée à pH 7 à
l'hydroxyde de tétrabutylammonium, puis lyophilisée. On obtient ainsi le hyaluronate de tétrabutylammonium HA-TBA.
1 g de HA-TBA est dissous dans 100 ml de diméthylsulfoxyde. 36 l de C18H37Br sont ajoutés. Après 24 h de réaction à 30 C sous agitation, le mélange est mis en dialyse : 1 jour contre eau distillée, 6 jours contre eau distillée + acide NaN3 (1/2500) puis 1 jour contre eau distillée. Enfin, la solution dialysée est lyophilisée.
On obtient ainsi un dérivé du hyaluronate de sodium dont environ 4 % des fonctions carboxyliques sont estérifiées par des chaînes à 18 carbones.
EXEMPLE 1 :
Synthèse et caractérisation de particules conformes à l'invention.
A titre d'exemple, est donné ci-dessous le protocole de synthèse 'de particules recouvertes du hyaluronate amphiphile HA-C18-1,3 % c'est-à-dire d'un polymère contenant 1,3 chaînes alkyle à 18 carbones pour 100 motifs glucose.
Le poly(D,L-acide lactique) (PLA, M,,, = 106 000g/mol) et le dichorométhane (CH2Cl2) sont des produits Sigma-Aldrich (France).
10 mg de HA-C18-1,3 % sont dissous pendant 24 h sous agitation dans 10 ml d'eau distillée. On ajoute 1 ml de CH2Cl2 contenant 25 mg de PLA. Une émulsion huile dans eau stable est réalisée par l'utilisation d'un vortex pendant 30 s puis des ultra-sons à
une puissance de 10 W en mode pulsé (50 % de cycle actif) pendant 60 s. Le solvant organique est ensuite évaporé sous agitation, à température et pression ambiantes pendant 2 h. La suspension aqueuse de particules ainsi obtenue est lavée à l'eau par 3 centrifugations successives de 10 mn à 12 000 tr/mn.
Les particules obtenues dans ces conditions ont un diamètre moyen de 450 Mn (diamètre moyen en intensité, déterminé par spectroscopie à corrélation de photons sur un appareil Malvern 4600).
1 g de hyaluronate de sodium est dissous dans 100 ml d'eau distillée. La solution est mise en contact pendant 15 minutes avec 5 g de résine Dowex 50*8 échangeuse de cations conditionnée en H+ à 2,5 meq/g (stoechiométrie 1:6).
Après filtration, la solution contenant la forme acide du polysaccharide est neutralisée à pH 7 à
l'hydroxyde de tétrabutylammonium, puis lyophilisée. On obtient ainsi le hyaluronate de tétrabutylammonium HA-TBA.
1 g de HA-TBA est dissous dans 100 ml de diméthylsulfoxyde. 36 l de C18H37Br sont ajoutés. Après 24 h de réaction à 30 C sous agitation, le mélange est mis en dialyse : 1 jour contre eau distillée, 6 jours contre eau distillée + acide NaN3 (1/2500) puis 1 jour contre eau distillée. Enfin, la solution dialysée est lyophilisée.
On obtient ainsi un dérivé du hyaluronate de sodium dont environ 4 % des fonctions carboxyliques sont estérifiées par des chaînes à 18 carbones.
EXEMPLE 1 :
Synthèse et caractérisation de particules conformes à l'invention.
A titre d'exemple, est donné ci-dessous le protocole de synthèse 'de particules recouvertes du hyaluronate amphiphile HA-C18-1,3 % c'est-à-dire d'un polymère contenant 1,3 chaînes alkyle à 18 carbones pour 100 motifs glucose.
Le poly(D,L-acide lactique) (PLA, M,,, = 106 000g/mol) et le dichorométhane (CH2Cl2) sont des produits Sigma-Aldrich (France).
10 mg de HA-C18-1,3 % sont dissous pendant 24 h sous agitation dans 10 ml d'eau distillée. On ajoute 1 ml de CH2Cl2 contenant 25 mg de PLA. Une émulsion huile dans eau stable est réalisée par l'utilisation d'un vortex pendant 30 s puis des ultra-sons à
une puissance de 10 W en mode pulsé (50 % de cycle actif) pendant 60 s. Le solvant organique est ensuite évaporé sous agitation, à température et pression ambiantes pendant 2 h. La suspension aqueuse de particules ainsi obtenue est lavée à l'eau par 3 centrifugations successives de 10 mn à 12 000 tr/mn.
Les particules obtenues dans ces conditions ont un diamètre moyen de 450 Mn (diamètre moyen en intensité, déterminé par spectroscopie à corrélation de photons sur un appareil Malvern 4600).
12 PCT/FR2003/002299 EXEMPLE 2:
Evaluation biologique in vitro des particules conformes à l'invention.
Des chondrocytes (cellules du cartilage) de rats obtenus après digestion de fragments de cartilage par la pronase et par la collagénase, sont mis en culture dans du DMEM (Gibco BRL, RU) en présence de particules obtenues selon l'exemple 1.
Deux systèmes de culture sont utilisés :
1) un système en monocouche classique applicable à tous les types cellulaires et qui permet d'appréhender les paramètres généraux de biocompatibilité tels que la viabilité et la prolifération.
Les chondrocytes sont répartis dans des plaques de culture à 24 puits à raison d'environ 100 000 chondrocytes par puits. Une suspension de nanoparticules recouvertes de HA amphiphile et synthétisées selon l'exemple 1, est préparée dans le milieu de culture DMEM de façon à avoir en moyenne environ 107 particules par ml. 1 ml de cette suspension est mis en contact avec les chondrocytes dans les puits de culture ce qui donne un ratio moyen d'environ 100 particules par chondrocytes. Le contact est maintenu pendant 48 h.
La figure 1 montre qu'après ce contact de 48 h avec des particules recouvertes de HA amphiphiles substitués à différents taux par des chaînes à 18 ou 12 atomes de carbone, la viabilité et la prolifération des chondrocytes sont similaires à
celles obtenues avec le témoin.
En revanche, on peut observer que dans ces conditions expérimentales, la présence des particules de PLA nues modifie significativement ces paramètres.
2) un système tridimensionnel : dans le cas des chondrocytes, on complète l'analyse précédente par l'étude d'une culture dans des billes d'alginate de calcium qui sont enrichies ou non en particules conformes à l'invention, afin d'appréhender l'activité
de synthèse des protéoglycanes du chondrocyte dans cet environnement nano ou microparticulaire.
Les culots cellulaires sont suspendus dans une solution d'alginate de sodium à
2 % dans du NaCI stérile 0,9 % et contenant les particules recouvertes de HA, de façon à
avoir approximativement 500 000 chondrocytes par ml et en moyenne environ 200
Evaluation biologique in vitro des particules conformes à l'invention.
Des chondrocytes (cellules du cartilage) de rats obtenus après digestion de fragments de cartilage par la pronase et par la collagénase, sont mis en culture dans du DMEM (Gibco BRL, RU) en présence de particules obtenues selon l'exemple 1.
Deux systèmes de culture sont utilisés :
1) un système en monocouche classique applicable à tous les types cellulaires et qui permet d'appréhender les paramètres généraux de biocompatibilité tels que la viabilité et la prolifération.
Les chondrocytes sont répartis dans des plaques de culture à 24 puits à raison d'environ 100 000 chondrocytes par puits. Une suspension de nanoparticules recouvertes de HA amphiphile et synthétisées selon l'exemple 1, est préparée dans le milieu de culture DMEM de façon à avoir en moyenne environ 107 particules par ml. 1 ml de cette suspension est mis en contact avec les chondrocytes dans les puits de culture ce qui donne un ratio moyen d'environ 100 particules par chondrocytes. Le contact est maintenu pendant 48 h.
La figure 1 montre qu'après ce contact de 48 h avec des particules recouvertes de HA amphiphiles substitués à différents taux par des chaînes à 18 ou 12 atomes de carbone, la viabilité et la prolifération des chondrocytes sont similaires à
celles obtenues avec le témoin.
En revanche, on peut observer que dans ces conditions expérimentales, la présence des particules de PLA nues modifie significativement ces paramètres.
2) un système tridimensionnel : dans le cas des chondrocytes, on complète l'analyse précédente par l'étude d'une culture dans des billes d'alginate de calcium qui sont enrichies ou non en particules conformes à l'invention, afin d'appréhender l'activité
de synthèse des protéoglycanes du chondrocyte dans cet environnement nano ou microparticulaire.
Les culots cellulaires sont suspendus dans une solution d'alginate de sodium à
2 % dans du NaCI stérile 0,9 % et contenant les particules recouvertes de HA, de façon à
avoir approximativement 500 000 chondrocytes par ml et en moyenne environ 200
13 PCT/FR2003/002299 nanoparticules par chondrocyte. La suspension résultante est alors déposée au goutte à
goutte dans une solution de CaC12 100 MM à l'aide d'une seringue de 2 ml équipée d'une aiguille 0,8x25, ce qui permet de former des billes d'environ 2 mm de diamètre au contact du CaC12. Après repos de 20 mn dans la solution de CaC12, les billes sont lavées 2 fois de suite par du NaC10,9 %.
La figure 2 montre que le contact avec des nanosphères recouvertes de HA
amphiphiles substitués à différents taux par des chaînes à 18 ou 12 atomes de carbone, ne perturbe pas significativement la prolifération et l'activité métabolique des chondrocytes dans cet environnement.
goutte dans une solution de CaC12 100 MM à l'aide d'une seringue de 2 ml équipée d'une aiguille 0,8x25, ce qui permet de former des billes d'environ 2 mm de diamètre au contact du CaC12. Après repos de 20 mn dans la solution de CaC12, les billes sont lavées 2 fois de suite par du NaC10,9 %.
La figure 2 montre que le contact avec des nanosphères recouvertes de HA
amphiphiles substitués à différents taux par des chaînes à 18 ou 12 atomes de carbone, ne perturbe pas significativement la prolifération et l'activité métabolique des chondrocytes dans cet environnement.
Claims (57)
1. Particules hydrosolubles, chaque particule comprenant :
un coeur à base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, ledit coeur étant revêtu, au moins partiellement en surface d'au moins un hyaluronane, ledit hyaluronane étant un hyaluronane amphiphile, hydrosoluble et dont les fonctions carboxyliques sont en partie transformées pour figurer des groupes hydrophobes, ces groupes hydrophobes étant ancrés dans le coeur en polymère des particules, et au moins une matière active encapsulée dans le coeur de polymère.
un coeur à base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, ledit coeur étant revêtu, au moins partiellement en surface d'au moins un hyaluronane, ledit hyaluronane étant un hyaluronane amphiphile, hydrosoluble et dont les fonctions carboxyliques sont en partie transformées pour figurer des groupes hydrophobes, ces groupes hydrophobes étant ancrés dans le coeur en polymère des particules, et au moins une matière active encapsulée dans le coeur de polymère.
2. Particules selon la revendication 1, dans lesquelles les groupes hydrophobes sont fixés au hyaluronane par des fonctions esters et/ou amides.
3. Particules selon la revendication 1 ou 2, dans lesquelles les fonctions carboxyliques sont en partie estérifiés à l'aide d'au moins un groupe choisi parmi des chaînes alkyles, linéaires ou ramifiées, saturées ou insaturées, le cas échéant interrompues par un ou plusieurs hétéroatomes et le cas échéant substituées par un noyau aromatique et des oligomères dérivant d'.alpha.-hydroxyacides.
4. Particules selon la revendication 3, dans lesquelles les chaînes alkyles possèdent un nombre d'atomes de carbone supérieur à 5.
5. Particules selon la revendication 3 ou 4, dans lesquelles les chaînes alkyles possèdent un nombre d'atomes de carbone supérieur à 10.
6. Particules selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lesquelles les fonctions carboxyliques sont estérifiés avec un taux d'estérification d'au plus 15% lorsque les chaînes alkyles possèdent un nombre d'atomes de carbone variant de 15 à 20.
7. Particules selon la revendication 6, dans lesquelles le hyaluronane est estérifié par une chaîne alkyle possédant 18 atomes de carbone.
8. Particules selon la revendication 7, dans lesquelles le taux d'estérification est inférieur à 7%.
9. Particules selon la revendication 3 ou 4, dans lesquelles les fonctions carboxyliques sont estérifiés avec un taux d'estérification supérieur ou égal à 25%
lorsque les chaînes alkyles possèdent un nombre d'atomes de carbone variant de à 14.
lorsque les chaînes alkyles possèdent un nombre d'atomes de carbone variant de à 14.
10. Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lesquelles le polymère organosoluble biodégradable est choisi parmi les polymères biodégradables synthétiques.
11. Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lesquelles le polymère organosoluble biodégradable est choisi parmi les polymères biodégradables naturels.
12. Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lesquelles le polymère organosoluble biodégradable est un polymère choisi parmi les polyesters, les polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, poly(alkylène tartrate), polyphosphazènes, polyaminoacides, polyamidoamines, polycarbonate, polyméhtylidènemalonate, polysiloxane, polyhydroxybutyrate, poly(acide malique), et leurs copolymères.
13. Particules selon la revendications 12, dans lesquelles les polyesters sont choisis parmi le poly(acide lactique), poly(acide glycolique), poly(.epsilon.-caprolactone) et leurs copolymères.
14. Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lesquelles la matière active encapsulée est au moins une matière biologique choisie dans le groupe constitué par les peptides, les protéines, les carbohydrates, les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides, les antigènes, les enzymes, les hormones, les récepteurs, les vitamines, les composants matriciels, les facteurs biologiques impliqués dans le processus de régénération et/ou protection du cartilage ou dans l'arthrose, et leurs mélanges.
15. Particules selon la revendication 14, dans lesquelles les composants matriciels sont choisis parmi les glycosaminoglycanes.
16. Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lesquelles la matière active encapsulée est choisie dans le groupe constitué
de la glucosamine, l'acide hyaluronique, le sulfate de chondroïtine et leurs mélanges.
de la glucosamine, l'acide hyaluronique, le sulfate de chondroïtine et leurs mélanges.
17. Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lesquelles la matière active est au moins une matière pharmaceutiquement active synthétique choisie dans le groupe constitué par les composés anti-inflammatoires, les anesthésiants, les agents chimiothérapeutiques, les immunotoxines, agents immunosuppresseurs, les stéroïdes, les antibiotiques, les antiviraux, les antifongiques, les antiparasitaires, les substances vaccinantes, les immunomodulateurs et les analgésiques.
18.Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, comprenant jusqu'à 95 % en poids de la matière active encapsulée.
19. Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, ayant une taille variant de 50 nm à 600 µm.
20. Particules selon l'une des revendications 1 à 19, ayant une taille variant de 80 nm à 250 µm.
21.Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, lesdites particules étant des nanoparticules.
22. Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, lesdites particules étant des microparticules.
23. Particules selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, obtenues par la technique d'émulsion/évaporation du solvant en utilisant à titre d'agent stabilisant d'émulsion au moins ledit hyaluronane amphiphile.
24. Utilisation de particules telles que définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 23, pour le traitement de l'arthrose.
25. Utilisation de particules telles que définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 23, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'arthrose.
26. Composition pharmaceutique ou de diagnostic comprenant au moins des particules telles que définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 23, associé(es) à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible.
27. Utilisation de la composition pharmaceutique selon la revendication 26, pour le traitement de l'arthrose.
28. Utilisation du hyaluronane tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 9, à titre d'agent de ciblage en surface de particules ou de capsules.
29. Utilisation selon la revendication 28, dans laquelle les particules ou capsules sont des nano- ou micro-sphères ou des nano- ou micro-particules.
30. Vecteur biologique pour la vectorisation d'au moins une matière active, ledit vecteur comprenant au moins des particules hydrosolubles, chaque particule hydrosoluble comprenant un coeur à base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, ledit coeur étant revêtu, au moins partiellement en surface d'au moins un hyaluronane, ledit hyaluronane étant un hyaluronane amphiphile, hydrosoluble et dont les fonctions carboxyliques sont en partie transformées pour figurer des groupes hydrophobes, ces groupes hydrophobes étant ancrés dans le c ur en polymère des particules.
31. Le vecteur biologique selon la revendication 30, dans lequel les groupes hydrophobes sont fixés au hyaluronane par des fonctions esters et/ou amides.
32.Le vecteur biologique selon la revendication 30 ou 31, dans lequel les fonctions carboxyliques sont en partie estérifiés à l'aide d'au moins un groupe choisi parmi des chaînes alkyles, linéaires ou ramifiées, saturées ou insaturées le cas échéant interrompues par un ou plusieurs hétéroatomes et le cas échéant substituées par un noyau aromatique et des oligomères dérivant d'.alpha.-hydroxyacides.
33. Le vecteur biologique selon la revendication 32, dans lequel les chaînes alkyles possèdent un nombre d'atomes de carbone supérieur à 5.
34. Le vecteur biologique selon la revendication 32 ou 33, dans lequel les chaînes alkyles possèdent un nombre d'atomes de carbone supérieur à 10.
35. Le vecteur biologique selon l'une quelconque des revendications 32 à
34, dans lequel les fonctions carboxyliques sont estérifiés avec un taux d'estérification d'au plus 15% lorsque les chaînes alkyles possèdent un nombre d'atomes de carbone variant de 15 à 20.
34, dans lequel les fonctions carboxyliques sont estérifiés avec un taux d'estérification d'au plus 15% lorsque les chaînes alkyles possèdent un nombre d'atomes de carbone variant de 15 à 20.
36. Le vecteur biologique selon la revendication 35, dans lequel le hyaluronane est estérifié par une chaîne alkyle possédant 18 atomes de carbone.
37. Le vecteur biologique selon la revendication 35, dans lequel le taux d'estérification est inférieur à 7%.
38. Le vecteur biologique selon la revendication 32 ou 33, dans lequel les fonctions carboxyliques sont estérifiés avec un taux d'estérification supérieur ou égal à 25% lorsque les chaînes alkyles possèdent un nombre d'atomes de carbone variant de 10 à 14.
39. Le vecteur biologique selon l'une quelconque des revendications 30 à
38, dans lesquelles que le polymère organosoluble biodégradable est choisi parmi les polymères biodégradables synthétiques.
38, dans lesquelles que le polymère organosoluble biodégradable est choisi parmi les polymères biodégradables synthétiques.
40. Le vecteur biologique selon l'une quelconque des revendications 30 à
38, dans lesquelles que le polymère organosoluble biodégradable est choisi parmi les polymères biodégradables naturels.
38, dans lesquelles que le polymère organosoluble biodégradable est choisi parmi les polymères biodégradables naturels.
41. Le vecteur biologique selon l'une quelconque des revendications 30 à
38, dans lesquelles que le polymère organosoluble biodégradable est un polymère choisi parmi les polyesters, les polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, poly(alkylène tartrate), polyphosphazènes, polyaminoacides, polyamidoamines, polycarbonate, polyméhtylidènemalonate, polysiloxane, polyhydroxybutyrate, poly(acide malique) et leurs copolymères.
38, dans lesquelles que le polymère organosoluble biodégradable est un polymère choisi parmi les polyesters, les polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters, poly(alkylène tartrate), polyphosphazènes, polyaminoacides, polyamidoamines, polycarbonate, polyméhtylidènemalonate, polysiloxane, polyhydroxybutyrate, poly(acide malique) et leurs copolymères.
42.Le vecteur biologique selon la revendication 41, dans lesquelles que les polyesters sont choisis parmi le poly(acide lactique), poly(acide glycolique), poly(c-caprolactone) et leurs copolymères.
43. Le vecteur biologique selon l'une quelconque des revendications 30 à
42, dans lequel lesdites particules possèdent une taille variant de 50 nm à
600 µm.
42, dans lequel lesdites particules possèdent une taille variant de 50 nm à
600 µm.
44. Le vecteur biologique selon l'une des revendications 30 à 43, dans lequel lesdites particules possèdent une taille variant de 80 nm à 250 µm.
45. Le vecteur biologique selon l'une quelconque des revendications 30 à
42, dans lequel lesdites particules sont des nanoparticules.
42, dans lequel lesdites particules sont des nanoparticules.
46. Le vecteur biologique selon l'une quelconque des revendications 30 à
42, dans lequel lesdites particules sont des microparticules.
42, dans lequel lesdites particules sont des microparticules.
47. Le vecteur biologique selon l'une quelconque des revendications 30 à
46, dans lequel lesdites particules sont obtenues par la technique d'émulsion/évaporation du solvant en utilisant à titre d'agent stabilisant d'émulsion au moins ledit hyaluronane amphiphile.
46, dans lequel lesdites particules sont obtenues par la technique d'émulsion/évaporation du solvant en utilisant à titre d'agent stabilisant d'émulsion au moins ledit hyaluronane amphiphile.
48. Utilisation d'un vecteur tel que défini dans l'une quelconque des revendications 30 à 47, pour encapsuler au moins une matière active.
49. Utilisation selon la revendication 48, dans laquelle la matière active encapsulée est au moins une matière biologique choisie dans le groupe constitué par les peptides, les protéines, les carbohydrates, les acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides, les antigènes, les enzymes, les hormones, les récepteurs, les vitamines, les composants matriciels, les glycosaminoglycanes, les facteurs biologiques impliqués dans le processus de régénération et/ou protection du cartilage ou dans l'arthrose, et leurs mélanges.
50. Utilisation selon la revendication 49, dans laquelle les composants matriciels sont choisis parmi les glycosaminoglycanes.
51. Utilisation selon la revendication 48, dans laquelle la matière active encapsulée est choisie dans le groupe constitué par la glucosamine, l'acide hyaluronique, le sulfate de chondroïtine et leurs mélanges.
52. Utilisation selon la revendication 48, dans laquelle la matière active est au moins une matière pharmaceutiquement active synthétique choisie dans le groupe constitué par les composés anti-inflammatoires, les anesthésiants, les agents chimiothérapeutiques, les immunotoxines, agents immunosuppresseurs, les stéroïdes, les antibiotiques, les antiviraux, les antifongiques, les antiparasitaires, les substances vaccinantes, les immunomodulateurs et les analgésiques.
53. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 48 à 52, pour le traitement de l'arthrose.
54. Utilisation d'un vecteur tel que défini dans l'une quelconque des revendications 30 à 47 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de l'arthrose.
55. Composition pharmaceutique ou de diagnostic comprenant au moins un vecteur tel que défini dans l'une quelconque des revendications 30 à 47, et au moins une matière active.
56. Composition pharmaceutique ou de diagnostic selon la revendication 55, comprenant en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible.
57. Utilisation de la composition pharmaceutique selon la revendication 55 ou 56, pour le traitement de l'arthrose.
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| Misra et al. | Microscale and nanoscale chitosan-based particles for biomedical use |
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