CA2438219A1 - Sequences impliquees dans les phenomenes de suppression tumorale reversion tumorale apoptose et/ou resistance aux virus et leur utilisation comme medicaments - Google Patents

Abstract

La pr~sente invention concerne notamment de nouvelles s~quences impliqu~es dans les voies mol~culaires de la suppression tumorale, la r~version tumorale, l'apoptose et/ou la r~sistance aux virus. Elle concerne ~galement l'utilisation de ces s~quences ou le traitement contre le cancer, maladies virales, maladies neurod~g~n~ratives ainsi qu'en mati­re de diagnostique ainsi que pour la mise en oeuvre de proc~d~s de criblage de compos~s ~ tester. Cette invention a ~galement pour objet des proc~d~s de d~tection et/ou de dosage des s~quences de l'invention ou de leurs produits d'expression dans un pr~l­vement biologique.

Description

SEQUENCES IMPLIQUEES DANS LES PHENOMENES
DE SUPPRESSION TUMORALE, REVERSION TUMORALE, APOPTOSE ET/OU RESISTANCE AUX VIRUS ET
LEUR UTILISATION COMME MEDICAMENTS
La présente invention concerne la mise en évidence de gènes impliqués dans les voies moléculaires de la suppression tumorale, la réversion tumorale, l'apoptose et/ou de la résistance aux virus.
La présente invention a été rendue possible par l'isolement d'ADNc 1o correspondant à des ARN messagers exprimés ou réprimés lors de la suppression tumorale, de la réversion tumorale et/ou lors du processus d'apoptose.
Afin d'isoler les gènes activés ou inhibés lors de la réversion tumorale, on a effectué un ratissage global de l'expression des gènes dans une lignée cellulaire maligne (U937) et une lignée cellulaire dérivée (IJS4) avec une suppression du phénotype malin. La comparaison des gènes exprimés (ARN
messagers exprimés dans les deux types de cellule) a permis de mettre en évidence des gènes exprimés différentiellement, c'est-à-dire exprimés dans l'une des cellules alors qu'ils ne le sont pas dans l'autre (les gènes peuvent être activés ou inhibés).
On en déduit aisément que ces gènes sont au moins impliqués dans le processus de cancérisation, dans un cas par leur absence, et, dans l'autre cas, par leur présence.
Pour cette étude différentielle, la méthode utilisée est la méthode décrite en 2000 par Brenner et al. (Froc. Natl. Acad, Sci USA, 97 (4), 1665-70).
De façon à élaborer un modèle, les Inventeurs ont fait les hypothèses suivantes : s'il était possible de sélectionner, à partir d'une tumeur qui soit sensible à l'effet cytopathique du parvovirus H-1, des cellules qui étaient résistantes, alors cette résistance pourrait être due à un changement de leur phénotype malin. Ceci a pu être démontré pour les cellules US4 sélectionnées à
partir des cellules cancéreuses U937. Contrairement à la lignée parentale U937, les

2 clones US4 (mais également US3 dont il ne sera pas question dans la présente invention) sont résistants à l'eiiet cytopathique du parvovinus H-1.
Au niveau moléculaire, on a pu remarquer que cette suppression du phénotype malin allait de paire avec une activation de l'expression du gène p21"'a~' et ce, indépendamment de l'expression du gène p53.
L'approche du problème selon la présente invention a permis d'isoler des séquences directement reliées à plusieurs fonctions précises. Dès lors, au contraire du séquençage aléatoire des EST, les séquences sont des séquences dont la fonction est connue du fait qu'elles sont impliquées dans le 1o processus de suppression du phénotype malin, de réversion tumorale, d'apoptose et/ou dans la résistance aux virus.
La réversion tumorale se distingue de la suppression tumorale par le fait qu'elle englobe un domaine plus large que celui des gènes suppresseurs de tumeurs. En d'autres termes, la réversion tumorale est réalisée par la mise en oeuvre de voies métaboliques et/ou moléculaires non limitées aux voies métaboliques et moléculaires dans lesquelles sont impliqués les gènes suppresseurs de tumeurs.
Ainsi, la présente invention concerne notamment de nouvelles séquences ainsi que l'utilisation de ces séquences en matière de diagnostic et 2o pour la mise en oeuvre de procédés de criblage de composés à tester.
L'invention concerne également des procédés de détection et/ou de dosage des séquences de l'invention ou de leurs) produits) d'expression dans un prélèvement biologique.
La présente invention concerne tout d' abord une séquence nucléotidique isolée comprenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe comprenant:
a) SEQ ID N° 1 à SEQ ID N° 1020, de préférence SEQ )D N°
72, b) une séquence nucléotidique d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence telle que définie en a),

3 c) une séquence nucléotidique présentant un pourcentage d'identité
d'au moins 80 %, après alignement optimal, avec une séquence définie en a) ou b), d) une séquence nucléotidique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence définie en a) ou b), et e) une séquence nucléotidique complémentaire où la séquence d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b), c) ou d).
La séquence nucléotidique selon l'invention définie en c) présente un l0 pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ci-dessus, de préférence d'au moins 90 %, de façon la plus préférée d'au moins 98 %.
Dans le cadre de la présente invention, SEQ m N° 72 est la séquence nucléotidique préférée et correspond au gène TPT 1 appelé également TCTP. Ce gène est notamment impliqué dans le phénomène de la réversion tumorale et a fait l'objet d'expérimentations plus poussées de la part des inventeurs comme indiqué
ci-après.
Par séquence nucléotidique, acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs.
Ainsi, les séquences nucléiques selon l'invention englobent également les PNA (Peptid Nucleic Acid), ou analogues.
Les fragments des séquences nucléotidiques de l'invention comprennent au moins 15 nucléotides consécutifs. Préférentiellement, ils

4 comprennent au moins 20 nucléotides consécutifs et encore plus préférentiellement, ils comprennent au moins 30 nucléotides consécutifs.
Il doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner les acides nucléiques obtenus par synthèse chimique.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides 1o nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d' acides nucléiques ou d' acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par «
fenêtre 2o de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith. et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch ( 1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité
de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de

5 manière optimale, la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à
comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux 1o séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, de façon plus préférée d'au moins 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fission chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, de façon plus préférée au moins 98 %, d'identité
après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, de façon plus préférée au moins 98 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'acides nucléiques complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence

6 de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH

7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une.solution 0,15 M NaCI + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de l0 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à
20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC +
0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucléotides.
Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989.
Parmi les séquences nucléotidiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, de façon plus préférée d'au moins 98 %, après alignement optimal avec les séquences selon l'invention, on préfère également les séquences nucléiques variantes des séquences de l'invention, ou de leurs fragments, c'est-à-dire l'ensemble des séquences nucléiques correspondant à des variants alléliques, c'est-à-dire des variations individuelles des séquences de l'invention.
Par « séquence nucléotidique variante », on entend désigner tout ARN
ou ADNc résultant d'une mutation et/ou variation d'un site d'épissage de l'ADN
génomique correspondant aux séquences nucléotidiques de l'invention.
La présente invention a également pour objet un polypeptide codé par une séquence nucléotidique conforme à l'invention Par « polypeptide » on entend, au sens de la présente invention, 3o désigné indifféremment des protéines ou des peptides.

Selon un mode de réalisation particulier, les polypeptides conformes à
l'invention comprennent un polypeptide choisi parmi a) un polypeptide codé par une séquence nucléotidique conforme à
l'invention, b) un polypeptide présentant au moins 80 % d'identité avec un polypeptide tel que définit dans a), c) un fragment d'au moins S acides aminés d'un polypeptide tel que défini dans a) ou b), d) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide tel que défini dans a), b) ou c), et e) un polypeptide modifié d'un polypeptide tel que défini dans a), b), c) ou d).
L' évaluation du pourcentage d' identité s' entend après alignement optimal des séquences concernées. Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, de façon plus préférée d'au moins98 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier, une ou plusieurs délétion(s), troncation(s), un allongement, un fusion chimérique et/ou une ou plusieurs substitution(s).
Parmi les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 % et de façon plus préférée d'au moins 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence tel qu'un polypeptide conforme à la présente invention ou avec l'un de ses fragments, on préfère les polypeptides variants codés par les séquences nucléotidiques variantes telles que précédemment définies, en particulier les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins une mutation correspondant notamment à une troncation, délétion, substitution et/ou addition d'au moins un résidu par rapport aux séquences polypeptidiques de l'invention ou 3o avec un de leurs fragments.

8 La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression cellulaire caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon l'invention ou qu'il code pour un polypeptide selon l'invention. Un tel vecteur peut également contenir les éléments nécessaires à
l'expression et éventuellement à la sécrétion du polypeptide dans une cellule hôte.
Une telle cellule hôte est également objet de la présente invention.
Les vecteurs comprenant des séquences promotrices etlou de régulation font également partie de la présente invention. Lesdits vecteurs comportent de préférence un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison 1o de la traduction, ainsi que les régions appropriées de régulation de la transcription.
Ils doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent également posséder des signaux particuliers de nature à permettre la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique ou viral, les vecteurs 2o viraux pouvant notamment être des adénovirus (5), des rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques (Sbis). L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes.
Lorsque l'on souhaite l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus sont, par exemple, les rétrovirus (6), ou les AAV (7).
Avantageusement, les vecteurs conformes à l'invention comportent une séquence assurant le ciblage et/ou l'expression tissu spécifique.
Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC, bacterial artificiel chromosome), les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificiel chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse

9 artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.
De tels vecteurs sont préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, la transformation aprës perméabilisation chimique de la membrane, la fusion cellulaire.
L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les 1o cellules eucaryotes et procaryotes, transformées par les vecteurs selon l'invention ainsi que les animaux transgéniques, de préférence les mammifères, excepté
l'Homme, comprenant une desdites cellules transformées selon l'invention. Ces animaux peuvent être utilisés en temps que modèles, pour l'étude de l'étiologie de maladies inflammatoires et/ou immunes, et en particulier des maladies inflammatoires du tube digestif, ou pour l'étude de cancers.
Parmi les cellules utilisables aux sens de la présente invention, on peut citer les cellules bactériennes (8), mais aussi les cellules de levure (9), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères

(10), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO). On peut citer 2o également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant par exemple en oeuvre des baculovirus (11). Un hôte cellulaire préféré
pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules COS.
Parmi les mammifères selon l'invention, on préfère des animaux tels que les rongeurs, en particulier les souris, les rats ou les lapins, exprimant un polypeptide selon l'invention.
Ces animaux transgéniques sont obtenus par exemple par recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de ces cellules souches à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères.

Les animaux transgéniques selon l'invention peuvent ainsi surexprimer le gène codant pour la protéine selon l'invention, ou leur gène homologue, ou exprimer ledit gène dans lequel est introduite une mutation. Ces animaux transgéniques, en particulier des souris, sont obtenus par exemple par transfection 5 de copie de ce gène sous contrôle d'un promoteur fort de nature ubiquitaire, ou sélectif d'un type de tissu, ou après transcription virale.
Les cellules et mammifères selon l'invention sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide selon l'invention, comme décrit ci-dessous, et peuvent également servir à titre de modèle d'analyse.
1o Les cellules ou mammifères transformés tels que décrits précédemment peuvent aussi être utilisés à titre de modèles afin d'étudier les interactions entre les polypeptides selon l'invention, et les composés chimiques ou protéiques, impliqués directement ou indirectement dans les activités des polypeptides selon l'invention, ceci afin d'étudier les différents mécanismes et interactions mis en jeu.
Ils peuvent en particulier être utilisés pour la sélection de produits interagissant avec les polypeptides selon l'invention, ou leurs, à titre de cofacteur, ou d'inhibiteur, notamment compétitif, ou encore ayant une activité agoniste ou antagoniste de l'activité des polypeptides selon l'invention. De préférence, on 2o utilise lesdites cellules transformées ou animaux transgéniques à titre de modèle notamment pour la sélection de produits permettant de lutter contre les pathologies liées à une expression anormale de ce gène.
La présente invention a également pour objet un anticorps monoclonal ou polyclonal, un fragment de cet anticorps ou un anticorps chimérique capable de reconnaître spécifiquement un polypeptide conforme à la présente invention.
Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes bien connue de l'homme du métier.
Les anticorps selon l'invention sont par exemple des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')z. Ils peuvent également se présenter sous

11 d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable etlou quantifiable.
Les anticorps conformes à l'invention mais également les immunoconjugués sont donc capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon la présente invention.
Les anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir du sérum d'un animal immunisé contre les polypeptides de l'invention, notamment produits par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes ôpératoires usuels.
l0 On note notamment l'intérêt d'anticorps reconnaissant de façon spécifique les polypeptides, leurs variants ou leurs fragments immunogènes, selon l'invention.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique conforme à la présente invention en tant que sonde ou amorce pour la détection, l'identification, le dosage etlou l'amplification de séquences d'acides nucléiques.
Selon l'invention, les séquences nucléotidiques pouvant être utilisées comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage et/ou d'amplification de séquence d'acides nucléiques, présentent une 2o taille minimale de 15 bases, de préférence de 20 bases, ou mieux de 25 à 30 bases.
Les sondes et amorces selon l'invention peuvent être marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Les séquences nucléiques selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde ou amorce.
Les séquences sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces

12 ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives.
Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 355, le 3H ou le '2sI. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, favidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent ainsi être utilisées comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre l0 notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase) (llbis).
Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N° 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquencés. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorces les séquences nucléotidiques de l'invention et comme matrices, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés.
Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à
celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention.
D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entend désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu

13 connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ;
lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (12), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par (13), la technique 3SR (Self Sustained Sequence Replication) décrite par (14), la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) décrite par (15) la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR
(Ligase Chain Reaction) décrite par (16), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par (17), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par (18), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par (19).
Certaines de ces techniques ont depuis été perfectionnées.
Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilise avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention.
La technique d'hybridation de sondes peut être réalisée de manières diverses (20). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).

14 Selon un autre mode de mise en oeuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture.
Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de capture », est immobilisée sur un support et sert à
capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite « sonde de détection », marquée par un élément facilement détectable.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent par ailleurs présenter un intérêt quand elles sont utilisées au titre de nucléotides anti-sens, 1o c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Elles peuvent également être utilisées au titre de nucléotides sens lesquels, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique selon la présente invention pour la production ou la synthèse d'un polypeptide recombinant.
La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante, elle-même comprise dans la présente invention, se caractérise en ce 2o que l'on cultive les cellules transformées, notamment les cellules ou mammifères de la présente invention, dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant codé par une séquence nucléotidique selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Les polypeptides recombinants, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par ladite méthode de production, font également partie de l'invention.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.

Les séquences des polypeptides recombinants peuvent être également modifiées afin d'améliorer leur solubilité, en particulier dans les solvants aqueux.
De telles modifications sont connues de l'homme du métier comme par exemple la délétion de domaines hydrophobes ou la substitution d'acides 5 aminés hydrophobes par des acides aminés hydrophiles.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce ca.s, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression 1o dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur et d'une cellule hôte selon l'invention.
Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-

15 dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Les procédés utilisés pour la purification d'un polypeptide recombinant sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques, etc...
Les polypeptides selon la présente invention peuvent aussi être obtenus par synthèse chimique en utilisant l'une des nombreuses synthèses peptidiques connues, par exemple les techniques mettant en oeuvre des phases solides (21) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique.

16 Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention.
La présente invention a également pour objet une puce à ADN
caractérisée en ce qu'elle contient au moins une séquence nucléotidique conforme à la présente invention.
En fait, les séquences nucléotidiques selon l'invention que l'on entend utiliser à titre de sonde ou d'amorce pour la détection, l'identification, le dosage et/ou l'amplification de séquences d'acides nucléiques peuvent être immobilisées 1o sur un support, de manière covalente ou non covalente, ce support étant une puce à ADN ou un filtre à haute densité.
Par « puce à ADN » ou « filtre à haute densité », on entend désigner un support sur lequel sont fixées des séquences d'ADN, chacune d'entre elles pouvant être repérée par sa localisation géographique. Ces puces ou filtres diffèrent principalement par leur taille, le matériau du support, et éventuellement le nombre de séquences qui y sont fixées.
En particulier, on peut effectuer une synthèse in situ par adressage photochimique ou par jet d'encre. D'autres techniques consistent à effectuer une synthèse ex situ et à fixer les sondes sur le support de la puce à ADN par un dressage mécanique, électronique ou par jet d'encre. Ces différents procédés sont bien connus de l'homme du métier.
L'invention a également pour objet une puce à protéines comprenant un polypeptide ou un anticorps selon l'invention.
Une telle puce à protéines permet l'étude des interactions entre les polypeptides selon l'invention et d'autres protéines ou des composés chimiques et peut ainsi être utile pour le criblage de composés interagissant avec les polypeptides selon l'invention.
On peut également utiliser les puces à protéines selon l'invention pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre les polypeptides selon l'invention

17 dans le sérum de patients à tester. On peut également mettre en oeuvre une puce à
protéines comprenant un anticorps selon l'invention pour cette fois détecter la présence de polypeptides dans le sérum de patients susceptibles d'être reconnus par ledit anticorps.
La présente invention a également .pour objet l'utilisation d'un composé choisi parmi une séquence nucléotidique, un polypeptide, un vecteur, une cellule ou un anticorps selon l'invention pour la préparation d'un médicament.
Les pathologies plus spécifiquement visées sont les maladies virales et les maladies se caractérisant par le développement de cellules tumorales ou une 1o dégénérescence cellulaire comme la maladie d'Alzheimer ou la schizophrénie.
Ainsi, le susdit médicament est destiné à la prévention et/ou au traitement de ces maladies. En particulier, la maladie visée est le cancer.
L'un des intérêts de la présente invention est qu'elle a mis en évidence l'implication un grand nombre de séquences nucléotidiques dans les phénomènes de suppression tumorale, réversion tumorale, apoptose et/ou résistance virale.
Ces séquences s'expriment donc différentiellement lorsque l'un de ces susdits processus est enclenché. Par conséquent, en présence d'un patient dont on soupçonne le déclenchement de l'un de ces processus ou pour lequel on souhaite vérifier l'absence d'un tel déclenchement, il est utile de pouvoir déterminer, voire 2o de quantifier, l'expression d'une ou plusieurs séquences) conformes) à
l'invention à partir d'un prélèvement biologique dudit patient.
Eventuellement, l'analyse de l'expression d'une ou plusieurs desdites séquences peut s'accompagner d'une comparaison avec un niveau d'expression de référence correspondant à celui d'un individu sain.
Par conséquent, l'invention comprend donc également une méthode de diagnostic et/ou d'évaluation pronostique d'une maladie virale ou se caractérisant par un développement tumoral ou une dégénérescence cellulaire comprenant l'analyse de l'expression d'au moins une séquence de l'invention à partir d'un prélèvement biologique d'un patient à tester.

18 Selon un mode de réalisation préféré, ladite méthode comprend les étapes suivantes - isolement de l'ARN messager à partir d'un prélèvement biologique issu d'un patient à tester, - préparation de l'ADNc complémentaire à partir dudit ARN
messager, - éventuellement, amplification d'une portion d'ADN
complémentaire correspondant à au moins une séquence de l'invention, et - détection de l'ADN complémentaire éventuellement amplifié.
En particulier; l'analyse de l'expression de la séquence peut être réalisée au moyen d'une puce à ADN telle que ci-dessus décrite.
Parmi les séquences de la présente invention, certaines présentent la caractéristique d'être des récepteurs exprimés à la surface des cellules et afin d'en comprendre le mécanisme dans le cadre des processus ci-dessus mentionnés, il est intéressant de rechercher des composés susceptibles d'interagir avec ce récepteur, c'est-à-dire d'interagir avec un polypeptide conforme à l'invention, il faut aussi prévoir la protéine sécrétée. Ceci s'applique également aux polypeptides conformes à l'invention correspondant à des protéines sécrétées (à la surface ou à
l'extérieur des cellules), hormones-like... Par conséquent, la présente invention a également pour objet un procédé de criblage de composés susceptibles de se fixer sur un peptide conforme à l'invention et comprenant les étapes suivantes - mise en contact d'un polypeptide ou d'une cellule selon l'invention avec un composé candidat, et - détection de la formation d'un complexe entre ledit composé
candidat et ledit polypeptide ou ladite cellule.
Un procédé de criblage de composés peut également être intéressant relativement à des composés susceptibles d'interagir avec une séquence nucléotidique selon l'invention, voire avec les séquences nécessaires à
l'expression

19 ou la régulation de ces séquences. En effet, les composés sont susceptibles d'interagir avec lesdites séquences avec pour effet de réduire, d'inhiber ou au contraire de potentialiser l'expression des séquences en question. Un tel procédé
comprend les étapes suivantes - mise en contact d'une séquence nucléotidique ou d'une cellule selon l'invention avec un composé candidat, et - détection de la formation d'un complexe entre ledit composé
candidat et ladite séquence nucléotidique ou ladite cellule.
Pour des raisons invoquées plus haut, il peut donc être intéressant de 1o rechercher et/ou de doser, dans un échantillon ou prélèvement biologique d'un patient à tester, la présence d'une séquence nucléotidique selon l'invention.
Un tel procédé de détection et/ou de dosage comprend les étapes suivantes - n>ise en contact d'une séquence nucléotidique selon l'invention marquée avec l' échantillon biologique à tester, dans les conditions nécessaires à la formation d'un hybride, et - détection et/ou dosage de l'hybride éventuellement formé entre ladite séquence nucléotidique et l'acide nucléique présents dans ledit prélèvement biologique.
Ce procédé peut en outre comprendre une étape amplification de l'acide nucléique dudit prélèvement biologique à l'aide d'amorces choisies parmi les séquences nucléotidiques selon l'invention.
En particulier, ce procédé peut être réalisé au moyen de la puce à
ADN ci-dessus décrite.
L'homme du métier sait mettre en oeuvre un tel procédé et peut en particulier utiliser une trousse de réactifs comprenant a) une séquence nucléotidique selon l'invention utilisée en tant que sonde, b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation entre ladite sonde et l'acide nucléique du prélèvement biologique, c) les réactifs nécessaires à la détection et/ou le dosage de l'hybride formé entre ladite sonde et l'acide nucléique du prélèvement biologique.
Une telle trousse peut également contenir des contrôles positifs ou 5 négatifs afin d'assurer la qualité des résultats obtenus.
De la même manière, la détection et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention est également envisageable dans le cadre de la présente invention et ce procédé comprend donc les étapes suivantes - mise en contact du prélèvement biologique avec un anticorps 1o marqué selon l'invention, et - détection et/ou dosage du complexe formé par ledit anticorps de polypeptide présent dans ledit prélèvement.
Avantageusement, ce procédé peut être réalisé au moyen de la puce à
protéines telle que ci-dessus décrite. Là encore, l'homme du métier sait mettre en 15 oeuvre un tel procédé et peut en particulier, utiliser une trousse de réactifs, comprenant a) un anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'invention ;
b) éventuellement des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction antigène / anticorps ;
2o c) les réactifs permettant la détection du complexe antigène /
anticorps.
Enfin, la présente invention a également pour objet un support lisible par ordinateur ou un support informatique sur lequel sont enregistrées au moins une séquence nucléotidique selon la revendication 1 et/ou au moins une séquence de polypeptide tel que défini dans la revendication 3 ou 4. En particulier, ce support est choisi dans le groupe comprenant a) une disquette, b) un disque dur, c) une mémoire vive (RAM), 3o d) une mémoire morte (ROl~, e) un cédérom.

L'invention n'est pas limitée à la présente description mais qu'elle en embrasse au contraire toutes les variantes et sera mieux comprise à la lumière des données expérimentales ci-après.
FIGURES
La figure 1 représente une courbe de croissance tumorale des groupes U937 et US4 chez des souris SCID.
1o La figure 2 représente une courbe de poids corporel des souris portant une tumeur U937 ou US4.
La figure 3 illustre:
a/ l'analyse de l'expression du gène TPT1/TCTP dans les lignées U937/US4.2 et dans les lignées MCF7/MCF7+SIAH1 par Northern Blot. Les quantités de transcrits totaux sont vérifiés par le contrôle de la GAPDH ;
b/ l'analyse en Western Blot de l'expression de la protéine TCTP dans le modèle U937/US4.2, dans le modèle MCF7/MCF7+siah et analyse de l'expression de l'homologue murin de TCTP, TCTP MOUSE, dans le système M1/LTR6 après 20h d'induction à 32°C ;
c/ l'analyse de l'expression de TCTP dans les cellules U937 transfectées par l'ami-sens TPT1/TCTP. Les clones I et III sont comparés au contrôle, cellules U937 avec le vecteur seul.
Sur le panneau de droite, détection du clivage de la PARP, marqueur de l'apoptose, dans les clones I et III, cellules U937 transfectées par l'anti-sens TPTl/TCTP. Des cellules de Jurkat traitées avec un anticorps anti-Fas (anti-CD95), inducteur d'apoptose, servent de contrôle ;
d/ la caractérisation des cellules apoptotiques par double marquage FITC-Annexin V et iodure de propidium (PI).
Les cellules U937 + vecteur contrôle et les cellules U937 + anti-sens 3o TPTI/TCTP sont simultanément marquées par l'annexine V couplée au FITC (qui se lie à la phosphatidylsérine des cellules apoptotiques en phase précoce) et PI
(qui ne marque que les cellules nécrotiques dont la membrane plasmique est lésée).
L'analyse cytofluorométrique permet de dénombrer le pourcentage de cellules apoptotiques (Annexin+,pI-), nécrotiques (Annexin+, pI+ ou Annexin-, PI+) et intactes (Annexin-, PI-) ;
e/ l'évaluation de fapoptose dans les cellules transfectées par l'anti-sens TPT1/TCTP, par le marquage in situ des extrémités 3' libres de l'ADN
nucléaire : méthode TUNEL ("Terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling"). Ce marquage permet de mettre en évidence in situ la fragmentation de fADN nucléaire résultant de l'activation des endonucléases au cours de l'apoptose. Les cellules apoptotiques apparaissent en vert.
f/ l'étude de la tumorigénicité in vivo des cellules U937 transfectées par : le vecteur seul (courbe supérieure - 91 tumeurs/100), un anti-sens présénilinl (deuxième courbe en partant du haut - 12 tumeurs/20), SIAH1 (courbe du milieu - 12 tumeurs/20) et un anti-sens TPT1/TCTP, clone I et III
(les 2 courbes inférieures - 8 tumeurs/20 et 4 tumeurs/20). 10 millions de cellules injectées dans chaque flanc et dans chaque épaule.
La figure 4 représente des cellules cultivées sur une matrice tumorale 2o extracellulaire (Matrigel). La lignée 184B 5, cellules épithéliales mammaires transformées par le benzo(a)pyrene, est utilisée comme contrôle pour la formation des acini. Les cellules tumorales T47D et MCF7 forment des colonies irrégulières.
Les cellules MCF7 transfectées par SIAH1 récupèrent partiellement une structure organisée. Les cellules MCF7 et T47D transfectées par l'ami-sens TPT1/TCTP
aboutissent à une réorganisation cellulaire comparable à la formation normale des acini. Les cellules apparaissant en vert (taches claires sur la figure) sont marquées par un anticorps anti-E Cadherin couplé à la FITC et les noyaux marqués par le PI apparaissent en rouge (taches plus foncées).

Analyse par Western Blot de l'expression de TCTP dans les cellules MCF7 et T47D transfectées par l'ami-sens TPT1/TCTP.
1- DONNEES RELATIVES AUX CELLULES U937 et US4 Comme vu précédemment, la présente invention met en oeuvre les cellules parentales U937 et les cellules « dérivées » US4. En fait, les cellules US4 et les cellules US3 (dont il n'est pas question dans le cadre de la présente invention) partagent certaines caractéristiques. Leur mode d'obtention ainsi que leurs propriétés sont rapportés ci-après.
1o Sélection et caractérisation des cellules US3 et US4 Les cellules U937 ont été soumises à deux séries de dilution limitée jusqu'à l'obtention d'une unique population clonale. Ces cellules ont été
infectées avec le parvovirus H-1. L'effet cytopathique du virus crée une mort cellulaire massive épargnant deux clones résistants que sont US3 et US4 après trois mois de culture continue. La survivance des cellules est définie comme le nombre relatif de cellules viables dans la culture infectée par le virus H-1 par rapport à la culture non traitée, telle que mesurée quatre jours après la réinfection. Pour mesurer le tumorigénicité, 10' cellules de U937, US3 ou US4 ont été injectées de façon souscutanée dans des souris scid/scid (âgées de 4 ou S semaines). La 2o tumorigénicité est exprimée par le nombre des tumeurs développées par les souris dans les deux mois suivant l'injection.
L'approche était la suivante : à partir de populations clonales de cellules malignes, des sous-clones ont été dérivés avec un phénotype tumorigénique supprimé. Cette sélection faite par le biais du parvovirus H-1 est réalisée par l'élimination des cellules tumorales qui sont préférentiellement tuées tout en épargnant les cellules normales. La sélection des cellules résistantes à
l'effet cytopathique du parvovirus H-1 en dehors d'une tumeur sensible peut donner lieu à des cellules qui ont un phénotype malin réduit.
Sur cette base, une population clonale de cellules U937 a été isolée, 3o ces cellules sont sensibles à l'effet cytopathique du parvovirus H-1 et les clones US3 et US4 sont quant à eux résistants au virus. Les clones US3 et US4 ont un fort phénotype tumorigénique supprimé tandis que les cellules parentales U937 développent des tumeurs dans 80 % des cas parmi les souris scid/scid ayant été
infectées par le parvovirus, les cellules US3 ne forment qu'une unique tumeur et les cellules US4 développent une tumeur pour 20 inoculations avec 10' cellules.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau ci-dessous.
Résistance au parvovirus H-1 et tumorigénicité des cellules U937 US3et US4 Lignes cellulairesSurvivance des cellulesTumorignicit chez les l'infection au virussouris scid/scid U937 0,4 16/20 2- MATÉRIELS ET MÉTHODES
Il s'agit de comparer la croissance de tumeurs sous-cutanées dans des souris SCID induites par injection sous-cutanée de lignées cellulaires leucémiques humaines U937 et US4 transfectées.
A. Lunées cellulaires leucémigues et conditions de culture Toutes les cellules injectées des lignées cellulaires U937 (ATCC) et US4 ont été fournies sous la forme de suspensions cellulaires dans des flacons complétés avec du milieu de culture RPMI-1640 supplémentées avec 2mM L-2o glutamine, du sérum bovin fétal à 10 % et de la gentamycine.
La lignée cellulaire U937 est une lignée cellulaire monocytique humain CD4+ dérivée d'un patient qui présent un lymphome histiocytique düI'us (I).
Les cellules ont été comptées dans un hémocytomètre et leur viabilité
a été testée avec des exclusions de colorants bleu trypan à 0,25 %. La viabilité

était respectivement de 95,5 % et 90,5 % pour les cellules U937 et les cellules US4. Les cellules U937 et US4 ont été centrifugées puis resuspendues dans un milieu RPMI avant d'être injectées à des souris SCID.
5 B. Les animaux 10 souris femelles SCID en bonne santé (CB 17/IcrHsd), âgées de 31 semaines et pesant entre 20 et 25 g ont été fournies par Harlan France (Gannat, France). Les animaux ont été observés pendant 7 jours dans un local particulier du Déposant qui est l'unité de soin des animaux sans pathogène spécifique (SPF
pour 1o specific-pathogen-free) avant leur traitement. L'unité de soin des animaux (INRA, Dijon, France) est autorisée par les Ministres français de l'Agriculture et de la Recherche (agrément n° A21100). Les expérimentations animales sont réalisées selon les directives éthiques européennes sur les expérimentations animales (2) et les directives britanniques de bien-être des animaux dans le cadre de néoplasie 15 expérimentale (3).
B.1. Environnement Les animaux ont été maintenus dans des pièces dans des conditions contrôlées de température (24 ~ 1°C), d'humidité (55 ~ 1 %), de période de lumière (12 h de lumière / 12 h de nuit) et de renouvellement d'air. Les animaux

20 ont été maintenus dans les conditions SFP et la température et l'humidité
de la pièce ont été continuellement surveillées. Le système d'aération a été
programmé
pour donner lieu à 14 renouvellement d'air par heure sans recirculation. De l'air frais venant de l'extérieur passe à l'intérieur d'une série de filtres avant d'être düiùsé régulièrement dans chaque pièce. Une pression élevée (2 mm) a été
25 maintenue dans les pièces d'expérimentations pour empêcher la contamination ou la dü~'usion de pathogènes à l'intérieur d'une colonie de souris. Tout le personnel travaillant dans les conditions SPF a suivi les directives spécifiques eu égard à
l'hygiène et aux tenues vestimentaires quand elles entraient dans la zone d' élevage.

B.2. L'élevage Les animaux ont été logés dans des cages en polycarbonate (UAR, Epinay sur Orge, France) qui ont été équipées de façon à leur fournir de la nournture et de l'eau. La taille standard des cages utilisées est de 637 cm2 pour 10 souris selon les procédures opérationnelles standard internes. La litière pour animaux et formée de copeaux de bois stériles (IJAR) et remplacées 2 fois par semaine.
B.3. Alimentation et boisson L'alimentation animale a été achetée chez Extralabo (Provins, France).
1o L'alimentation a été fournie ad libitum et a été placée sur le couvercle métallique au sommet de la cage. L'eau a également été fournit ad libitum à partir de bouteilles d'eau équipées de robinets en caoutchouc. Les bouteilles d'eau ont été
lavées, stérilisées et replacées une fois par semaine. La fourniture d'eau a été
stérilisée par filtration avec un filtre absolu de 0,2 p.m.
B.4. Identification de l'animal et de la cage Après répartition aléatoire, les animaux ont été identifiés avec 2 numéros différents gravés sur les deux oreilles. Chaque cage a été marquée avec un code spécifique.
C- Données egnérimentales et traitements C.1. Induction de tumeurs chez les souris SCID
Avant l'injection cellulaire, les souris SCID ont été réparties de façon aléatoire en 2 groupes, à raison de 5 souris par groupe. 10' cellules tumorales US4 ou U937 dans 0,2 ml du milieu RPMI ont été inoculées de façon sous-cutanée au temps 0 pour chaque point d'injection dans des souris SCID. Chaque animal a reçu 4 injections de cellules tumorales localisées en différentes zones. Une dans chaque flanc et une dans chaque épaule.
C.2. Collecte des tumeurs Quand les tumeurs ont atteint un volume de 1 500 mm3, les souris ont été tuées et les tumeurs ont été collectées, pesées et congelées dans l'azote liquide, stockée à - 80°C puis marquées spécifiquement.
C.3. Contrôle des souris Le forène d'isoflurane (Minerve, Bondouble, France) a été utilisé pour anesthésier les animaux avant l'injection de cellules pour le sacrifice. Après l'injection de cellules tumorales, les souris ont été observées pendant 5 heures. La viabilité, le comportement, le poids corporel des souris et la croissance de la l0 tumeur sous-cutanée ont été enregistrés deux fois par semaine.
Pendant la durée de l'expérimentation, les animaux ont été tués sous anesthésie avec l'isoflurane par dislocation cervicale si l'un des signes suivants apparaissait - signe de souffrance (cachexie, affaiblissement, diflxculté à se déplacer ou à manger), - croissance tumorale jusqu'à 10 % du poids corporel, - ulcération tumorale et mise à nue persistante, - position de la tumeur interférant avec le mouvement et/ou l' alimentation, - perte de poids de 20 % pendant trois jours consécutifs.
Une autopsie de chaque animal a été réalisée pour détecter la présence d'éventuelles métastases ou d'anomalies morphologiques.
D- Présentation des données D.1. Paramètres de survie Le calcul pour le temps de survie médian et moyen a été exprimé
comme suit Temps de survie moyen = Sl / (SZ-NT) Avec : S 1 = la somme des survivants journaliers à partir du jour 0 jusqu'à la fin de l'expérimentation (sans les survivants « non pris en compte »*) S2 = le nombre d'animaux à l'origine NT = le nombre d'animaux « non pris en considération »*
* « non pris en considération » : il s'agit d'animaux avec des tumeurs plus petites que la limite prédéterminée considérés comme résultant d'un défaut d'implantation de la tumeur.
D.2. Système d'inhibition de la tumeur La taille tumorale a été mesurée deux fois par semaine avec un compas et le volume tumoral (en mm3) sera estimé selon la formule : (longeur x largeur2)/2 (4). Les expérimentations ont été arrêtées quand les tailles tumorales des souris atteignaient 1 500 mm3.
- Après le sacrifice, les tumeurs ont été excisées et pesées.
- La courbe de la croissance tumorale des groupes US4 et U937 a été tracée en utilisant la moyenne des volumes tumoraux.
- Le temps de doublage tumoral des groupes US4 et U937 a été définit comme la période requise pour atteindre un volume tumoral moyen de 200 % durant la période de croissance.
- La période de croissance spécifique sur un ou deux temps de doublage (TD) à
partir d'injections de cellules est définit comme suit période de croissance spécifique = (TD US4- TD U937) / TD U937 - la période de croissance a été calculée comme la différence du temps de croissance médian du groupe US4 et du groupe U937 pour atteindre la même taille tumorale.
D.3. Tests statistiques Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel StatView~ (Abacus Concept, Berkeleley, USA). Les analyses statistiques des changements de poids corporels moyens, du temps de doublage tumoral et du temps pour atteindre le « V » a été réalisé en utilisant le test de Bonferroni/Dunn.
Une valeur p < 0,05 a été considérée comme significative. Tous les groupes ont été comparés avec eux-mêmes.

E- Résultats Les courbes de vôlumes tumoraux et de poids corporels moyens sont montrés sur les figures 1 et 2 respectivement.
Aucune perte significative de poids corporel des souris SCID à partir des 2 groupes n'a été observée entre le jour 8 et le jour 19.
Une différence significative est observée concernant le temps pour atteindre « V » entre les 2 groupes de souris SCID tandis qu'aucune différence significative n'a été observée pour le changement de poids corporel moyen (jour 19 jour 8) et pour le temps de doublage.
Les autopsies réalisées n'ont pas montrées la présence de métastases ou de développements de nodosité suspicieuse. La collecte des tumeurs a été
réalisée sur les animaux sacrifiés après anesthésie et dislocation cervicale.
Les tumeurs ont été immédiatement mises dans des tubes, congelées dans de l'azote liquide et stockées à - 80°C. Les tumeurs excisées avaient une forme ovoïde, une consistance modérée et une couleur rosâtre. Les interactions de la tumeur avec son environnement (tissu cutané et musculaire a été limité et superficiel).
F- Conclusions 2o La lignée cellulaire US4 a montré un taux de prise significativement plus bas comparée à la lignée cellulaire U937 chez les souris SCID.
Le retard de croissance entre les tumeurs US4 et U937 a été de 23,5 jours et le temps de doublage a été équivalent.
3- IMPLICATION DE TPTl/TCTP DANS LA REVERSION
TUMORALE
Afin d'étudier l'implication de TPTl/TCTP (Translationally controlled Tumor Protein encodage the Histamine Releasing Factor) dans la réversion tumorale, l'expression du gène (Figure 3a) et l'expression de la protéine (Figure 3b) dans différents modèles cellulaires de réversion tumorale : U937/US4.2, MCF7/MCF7+SIAH1 et M1/LTR6, ont été analysés. Le niveau d'expression de TPT1/TCTP est fortement diminué dans les cellules révertantes par rapport aux cellules tumorales.
5 Pour aborder l'aspect physiologique de cette diminution, les cellules tumorales U937 ont été transfectées par l'anti-sens TPT1/TCTP. Après avoir vérifié la chute de l'expression de TPT1/TCTP (Figure 3c, panneau gauche), les inventeurs ont détecté ses conséquences dans l'apoptose par trois méthodes différentes : détection du clivage de la PARP, marquage à l'AnnexinV et méthode 10 TUNEL (respectivement figure 3 c, panneau droit; figure 3 d ; figure 3 e) La baisse de l'expression de TPT1/TCTP dans les cellules tumorales en culture augmente l'apoptose.
Les inventeurs ont alors examiné in vivo les conséquences physiologiques de cette perte de fonction de TPT1/TCTP. Nous avons injecté des 15 cellules U937 transfectées par l'anti-sens TPT1/TCTP à des souris et observé une diminution drastique du nombre de tumeurs formées lorsque l'expression de TPT1/TCTP est diminuée (Figure 3f).
Parallèlement à ces résultats, la réduction de TPT1/TCTP, obtenue par transfection d'ARN double brin spécifique de TPT1/TCTP (siRNA), dans des 20 cellules MCF7 et T47D, cultivées sur une matrice extracellulaire, conduit à
une réorganisation cellulaire en acini comparable à une structure normale (Figure 4).

REFERENCES
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d'Application du 19 avril 1988 (3) United Kingdom co-coordinating committee on cancer research guidelines for welfare of animais in experimental neoplasia, Br. J. Cancer, 77:1-10, 1998.
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Company, Rockford, 111, 2ème éd., (1984).

Claims (29)

REVENDICATIONS

1. Séquence nucléotidique isolée comprenant une séquence nucléotidique choisie dans le groupe comprenant a) SEQ ID No 72, b) une séquence nucléotidique d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence telle que définie en a), c) une séquence nucléotidique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, après alignement optimal, avec une séquence définie en a) ou b), d) une séquence nucléotidique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence définie en a) ou b), et e) une séquence nucléotidique complémentaire ou la séquence d'ARN
correspondant à une séquence telle que définie en a), b), c) ou d).
caractérisée par le fait que son expression est impliquée lors de la suppression tumorale, la réversion tumorale, l'apoptose et/ou la résistance virale.

2. Polypeptide codé par une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1.

3. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi :
a) un polypeptide selon la revendication 2, b) un polypeptide présentant au moins 80 % d'identité avec un polypeptide tel que défini dans a), c) un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'un polypeptide tel que défini dans a) ou b), d) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide tel que défini dans a), b) ou c), et e) un polypeptide modifié d'un polypeptide tel que défini dans a), b), c) ou d).

4. Vecteur de clonage et/ou d'expression cellulaire caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1 ou codant pour un polypeptide selon la revendication 2 ou 3.

5. Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral choisi parmi un adénovirus, un rétrovirus, un virus herpès ou un poxvirus.

6. Vecteur selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur à
acide nucléique nu.

7. Vecteur selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte une séquence assurant le ciblage et/ou l'expression tissu spécifique.

8. Cellule hôte transformée par un vecteur d'expression selon l'une des revendications 4 à 7.

9. Animal, de préférence un mammifère excepté l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule selon la revendication 8.

10. Anticorps monoclonal ou polyclonal, fragment de cet anticorps ou anticorps chimérique, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'une des revendications 2 et 3.

11. Utilisation d'une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1 en tant que sonde ou amorce pour la détection, l'identification, le dosage et/ou l'amplification de séquences d'acides nucléiques.

12. Utilisation in vitro d'une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1, comme nucléotide sens ou antisens.

13. Utilisation d'une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1 pour la production d'un polypeptide recombinant.

14. Procédé d'obtention d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce qu'on utilise une cellule selon la revendication 8 dans des conditions permettant l'expression dudit polypeptide et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.

15. Puce à ADN caractérisée en ce qu'elle contient au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1.

16. Puce à protéines caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide selon la revendication 2 ou 3 ou un anticorps selon la revendication 10.

17. Utilisation d'un composé choisi parmi;
a) une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1, b) un polypeptide selon la revendication 2 ou 3, c) un vecteur selon l'une des revendications 4 à 7, d) une cellule selon la revendication 8, e) un anticorps selon la revendication 10, pour la préparation d'un médicament

18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée par le fait que le médicament est destiné à la prévention et/ou au traitement de maladies virales ou se caractérisant par le développement de cellules tumorales ou une dégénérescence cellulaire.

19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée par le fait que la maladie est le cancer.

20. Méthode de diagnostic et/ou d'évaluation pronostique d'une maladie virale ou se caractérisant par un développement tumoral ou un dégénérescence cellulaire comprenant l'analyse de l'expression d'au moins une séquence correspondant à SEQ ID N° 72, à partir d'un prélèvement biologique d'un patient à tester.

21. Méthode de diagnostic et/ou d'évaluation pronostique selon la revendication 20, comprenant les étapes suivantes:
- isolement de l'ARN messager à partir d'un prélèvement biologique issu d'un patient à tester, - préparation de l'ADN complémentaire à partir dudit ARN messager, - éventuellement, amplification de portions d'ADN complémentaire correspondant à au moins une séquence correspondant à SEQ ID N° 72, - détection de l'ADN complémentaire éventuellement amplifié.

22. Méthode de diagnostic et/ou d'évaluation pronostique selon la revendication 21, dans laquelle l'analyse de l'expression de la séquence est réalisée au moyen d'une puce à ADN selon la revendication 15.

23. Procédé de criblage de composés susceptibles d'interagir avec une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- mise en contact d'une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1, ou d'une cellule selon la revendication 8 avec un composé candidat, et - détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ladite séquence nucléotidique ou ladite cellule.

24. Procédé de criblage de composés susceptibles de se fixer sur un polypeptide selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact d'un polypeptide selon la revendication 2 ou 3 ou d'une cellule selon la revendication 8 avec un composé candidat, et - détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit polypeptide ou ladite cellule.

25. Procédé de détection et/ou de dosage d'une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1 dans un prélèvement biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact d'une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 1 marquée avec le prélèvement biologique à tester, dans les conditions nécessaires à la formation d'un hybride, - détection et/ou dosage de l'hybride éventuellement formé entre ladite séquence nucléotidique et l'acide nucléique présent dans ledit prélèvement biologique.

26. Procédé de détection et/ou de dosage selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'amplification de l'acide nucléique dudit prélèvement biologique à l'aide d'amorces choisies parmi les séquences nucléotidiques telles que définies dans la revendication 1.

27. Procédé de détection et/ou de dosage selon la revendication 25 ou 26, caractérisé par le fait qu'il est réalisé au moyen de la puce à ADN telle que définie dans la revendication 15.

28. Procédé de détection et/ou de dosage d'un polypeptide tel que défini dans la revendication 2 ou 3 dans un prélèvement biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact du prélèvement biologique avec un anticorps marqué tel que défini dans la revendication 10, - détection et/ou dosage du complexe formé entre ledit anticorps et le polypeptide présent dans ledit prélèvement.

29. Procédé de détection et/ou de dosage d'un polypeptide selon la revendication 28, caractérisé par le fait qu'il est réalisé au moyen de la puce à protéines telle que définie dans la revendication 16.