CA2391638A1 - Procede pour maintenir la diversite et la plasticite cellulaire de cellules souches adultes de mammifere issues de biopsie tissulaire pour la therapie cellulaire - Google Patents
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Description
¿
PROCöDÉ POUR MAINTENIR LA DIVERSITÉ ET LA PLASTICITÉ
CELLULAIRE DE CELLULES SOUCHES ADULTES DE MAMMIF~RE ISSUES
DE BIOPSIE TISSULAIRE POUR LA THÉRAPIE CELLULAIRE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la régénération et la réparation tissulaire par transplantation cellulaire. Plus parüculièrement, la présente 1o invention vise un procédé de préparation de cellules souches adultes qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules. La présente invention vise également l'usage de ces cellules souches obtenues par le procédé d'extraction proposé
dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique.
DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR
Pour des raisons anatomiques et biologiques, le sang et ses dérivés ont éte les premières cellules transplantées. Les greffes de cellules hématopoïétiques ont connu un chemin semblable. Depuis une vingtaine d'années, Ie transfert de cellules
PROCöDÉ POUR MAINTENIR LA DIVERSITÉ ET LA PLASTICITÉ
CELLULAIRE DE CELLULES SOUCHES ADULTES DE MAMMIF~RE ISSUES
DE BIOPSIE TISSULAIRE POUR LA THÉRAPIE CELLULAIRE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la régénération et la réparation tissulaire par transplantation cellulaire. Plus parüculièrement, la présente 1o invention vise un procédé de préparation de cellules souches adultes qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules. La présente invention vise également l'usage de ces cellules souches obtenues par le procédé d'extraction proposé
dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique.
DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR
Pour des raisons anatomiques et biologiques, le sang et ses dérivés ont éte les premières cellules transplantées. Les greffes de cellules hématopoïétiques ont connu un chemin semblable. Depuis une vingtaine d'années, Ie transfert de cellules
2 0 neuronaies foetales est étudié comme approche thérapeutique dans les pathologies neurodégénératives comme (a maladie de Parkinson et plus récemment dans la chorée de Huntington. Les résultats cliniques sont cohérents et montrent une netté
amélioration. La limitation majeure de cette dernière approche est la source de cellules transplantées. En effet; le recours à des cellules neuronales foetales rend difficile la diffusion de ce type d'approches thérapeutiques. Les autogreffes de kératinocytes corrstituent une solution thérapeutique dans les cas de brûlures graves. Un avantage de ce systëme: la capacité des kératinocytes, principales cellules de l'épiderme, à être cultivées ex vivo. Dans le même ordre d'idée, des cartilages défectueux ont pu être reconstruits par des chondrocytes amplifiés en culture puis greffés sous arthroscopie. Des approches similaires encore très expérimentales sont aussi en cours pour des organes comme le pancréas et le foie.
Ces données, encore trop astreintes; démontrent le potentiel de la médecine régénératrice par thérapie cellulaire. Les limitations à l'extension de ces approches i sont de plusieurs natures.. Pour être capable de suppléer aux défaillances d'un tissu par thérapie cellulaire il faut disposer de sources cellulaires répondant aux caractéristiques vivantes - les cellules doivent être facile à prélever;
- elles doivent survivre aux sites d'injection;
elles doivent présenter une borane capacité de prolifération et de colonisation;
- elles doivent être capable de e différencier pour obtenir un résultat fonctionnel II existe donc un besoin pour de nouveaux procédés permettant d'obtenir des cellules souches aptes à être utilisées; enfire autres, dans le cadre de la régénération et la réparation tissulaire par transplantation cellulaire.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention porte sur la mise au point d'un procédé de préparation cellulaire capable de préserver la diversité et la plasticité des cellules souches de vertébrés provenant d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation ultérieure dans le cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par transplantation des cellules obtenues par le procédé de l'invention à un animal, tel un être humain.
L'invention vise de plus un milieu de culture défini particuliérement utile lors de la mise en oeuvre du procédé-de préparation cellulaire.
La présente invention vise aussi la préparation cellulaire ou les cellules souches obtenues par le procédé de préparation de l'invention.
La présente invention vi e également l'usage de ces cellules souches obtenues par le. :procédé de préparation proposé dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique ou cellulaire.
La prësente invention vise au si une composition cellulaire comprenant des .
cellules souches humaines ou animales obtenues elon le procédé de préparation de l'invention.
La présente invention porte également sur un procédé de préparation de cellules souches capables de réparer ou de régénérer in vivo des tissus ou des organes d'un vertébré,
amélioration. La limitation majeure de cette dernière approche est la source de cellules transplantées. En effet; le recours à des cellules neuronales foetales rend difficile la diffusion de ce type d'approches thérapeutiques. Les autogreffes de kératinocytes corrstituent une solution thérapeutique dans les cas de brûlures graves. Un avantage de ce systëme: la capacité des kératinocytes, principales cellules de l'épiderme, à être cultivées ex vivo. Dans le même ordre d'idée, des cartilages défectueux ont pu être reconstruits par des chondrocytes amplifiés en culture puis greffés sous arthroscopie. Des approches similaires encore très expérimentales sont aussi en cours pour des organes comme le pancréas et le foie.
Ces données, encore trop astreintes; démontrent le potentiel de la médecine régénératrice par thérapie cellulaire. Les limitations à l'extension de ces approches i sont de plusieurs natures.. Pour être capable de suppléer aux défaillances d'un tissu par thérapie cellulaire il faut disposer de sources cellulaires répondant aux caractéristiques vivantes - les cellules doivent être facile à prélever;
- elles doivent survivre aux sites d'injection;
elles doivent présenter une borane capacité de prolifération et de colonisation;
- elles doivent être capable de e différencier pour obtenir un résultat fonctionnel II existe donc un besoin pour de nouveaux procédés permettant d'obtenir des cellules souches aptes à être utilisées; enfire autres, dans le cadre de la régénération et la réparation tissulaire par transplantation cellulaire.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention porte sur la mise au point d'un procédé de préparation cellulaire capable de préserver la diversité et la plasticité des cellules souches de vertébrés provenant d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation ultérieure dans le cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par transplantation des cellules obtenues par le procédé de l'invention à un animal, tel un être humain.
L'invention vise de plus un milieu de culture défini particuliérement utile lors de la mise en oeuvre du procédé-de préparation cellulaire.
La présente invention vise aussi la préparation cellulaire ou les cellules souches obtenues par le procédé de préparation de l'invention.
La présente invention vi e également l'usage de ces cellules souches obtenues par le. :procédé de préparation proposé dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique ou cellulaire.
La prësente invention vise au si une composition cellulaire comprenant des .
cellules souches humaines ou animales obtenues elon le procédé de préparation de l'invention.
La présente invention porte également sur un procédé de préparation de cellules souches capables de réparer ou de régénérer in vivo des tissus ou des organes d'un vertébré,
3 La présente invention porte aussi sur une méthode de traitement caractérisé
par l'implar+tation de cellules souches animales autologues ou hétérologues obtenues selon le procédé de l'invention chez un animal.
L'originalité de la présente invention porte sur le fait que, contrairement aux procédés de préparation cellulaire utilisés ' dans le domaine, le procédé de prépâration de la présente invention permet - d'extraire les cellules dans des conditions définies sans protéine animale d'origine extractive, donc dans des conditions sûres du point de vue sanitaire ;
20 - de maintenir la viabilité cellulaire par l'utilisation de molécules anti-oxydantes et anti-apoptotiques;
- de préserver la diversité cellulaire;
- de maintenir le potentiel de plasticité cellulaire;
- de maintenir le potentiel de différenciation; et - d' améliorer' l'implantation, la colonisation et la différenciation des cellules greffées.
Par exemple, dans le procédé de préparation cellulaire décrit dans l'article de Pouzet et al. (2000. Circulation: 102 : 1112210-5), il n'y a pas d'extraction selon un procédé enzymatique: Alternativement; le tissu musculaire est haché. De plus, il n'y a pas d'étape de préparation. de cellules telle qu'entendue au sens de la présente invention.
La récupération fonctionnelle teNe que discutée dans l'article de Pouzet et al:
dépend du nombre de cellules alors que dans le procédé selon l'invention, le mode de préparation des- cellules conduit avantageusement à une colonisation Près importante ainsi qu'à une récupération fonctionnelle rapide de l'organe traitë.
DESCRIPTION DES FIGURES
Les Figures ~, 2 et 3 sont des microphotographies illustrant la mise en évidence de cellules de muscle greffées dans le coeur de brebis. Les cellules ont été
obtenues par dissociation enzymatique d'une biopsie de muscle squelettique puis directement implantées dans le myocarde de la méme brebis (greffe autologue).
La v présence de cellules de muscle squelettique est révélée à l'aide: de .l'anticorps MY32 qui reconnaît spécifiquement fa myosine de muscle squelettique. La Figure 1 illustre la présence de zones de greffes massives (2 à 9 mm de diamètre) à faible agrandissement (barre d'échelle, 250 microns). La Figure 2 montre des cellules colorées par (anticorps MY32 généralement alignées avec le réseau de cardiocytes.
Ces cellules peuvent être intensément marquées ou faiblement marquées; les cardiocytes ne sont pas marqués (Barre d'échelle,500 microns). La Figure 3 montre des cellules greffées se différenciant en fibres musculaires etformant des sarcorn'eres organisés (Barre d'échelle; 25 microns).
DESCRIPTION DES MODES DE RÉALISATION
PRÉFÉRÉS DE L'INVENTION
La présente invention porte donc sur la m9se au: point d'un procédé de préparation de cellules souches animale qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules provenant d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation ultérieure dans le cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par trânsplantation des cellules ainsi préparées chez un animal.
2 o i) Définitions Par « cellule souche », on entend les cellules qui ont 'a la fois la capacité
de s'autorenouveler et la capacité de se différencier en différents types de précurseurs cellulaires:
Par « diversité des cellules souches », on entend les cellules souches qui sont classées en fonction de leur stade de développement et de leur origine tissulaire. Plus particulièrement, on entend une classification de cellules souches embryonnaires ou adultes en fonction de leur origine tissulaire, par exemple, les cellules souches de la peau ou neuronales ou du muscle.
Par « plasticitë des cellules souches », on entend la capacitë pour ces 3o cellules de traverser les frontières de lignée; par exemple la capacité des cellules hématopo'iétiques à se différentier en hépatocytes:
i Par « régénération tissulaire », on entend la capacité à reformer un tissu soit par activation des cellules prvgénitrices du fiissu (par exemple tissu de la peau, du foie, du coeur, de l'os ou de tissus nerveux), soit par transplantation de ces cellules progënitrices. Plus particulièrement; il s'agit alors d'une néoformation tissulaire.
5 Par « réparation tissulaire »; on entend une opération qui permet de pallier un déficit sans avoir recours à un: processus derégénération. La réparation tissulaire se traduit par un apport e~cogène de cellules qui peuvent être différentes des cellules du tissu receveur.
Par « transplantation cellulaire » ï on entend une opération qui se caractérise 1o par un apport de cellules isolées. Cette transplantation peut être effectuée, par exemple, par injection directement dans le (issu ou dans la circulation affërente.
Par « animal », on entend tout organisme vivant qui peut être sujet à une transplantation cellulaire, et ceci lnelut les êtres vertébrés tels que notamment fes êtres humains; les animaux domestiques et sauvages, notamment les oiseaux.
ü) Procédé de préparation de cellules souches Un premier aspect de la présente invention vise un procédé de préparation de cellules souches de mammifère. Ce procédé comprend en général, les étapes suivantes:
2o a) l'extraction cellulaire;
b) la dissociation mécanique;
c) la'dissociation enzymatique; et d) le' maintien des cellules dans un milieu spécifique permettant de préserver la diversité.
Plus précisément, l'extraction cellulaire est obtenue tout d'abord suite à une biopsie pour fournir un fragment tissulaire; tel un fragment de muscle, de foie ou de peau. Par exemple; une biopsie musculaire est réalisèe sous anesthésie locale suite à une incision ou encore à l'aiguille. Le fragment tissulaire ainsi obtenu est ensuite humidifié dans un milieu défini, tel le DMEI2Q2 en présence de facteurs protecteurs 3o et de facteurs inhibant ia difFérenciation cellulaire (Pinset et Montarras), (1994) Celi Biology : A laboratory Handbook. Academic Press).
Préférablement-, le milieu défini' est un milieu ci-après nommé DPM
(Diversity, â
Protecfing MediUm) et comprend au moins:
- un milieu nutritif de base tamponné avec des tampons dépendants ou indépendants de la concentration en C02: Les milieux utilisés sont, dans la plupart des casa constitués d'un mélange dans un rapport 1 :1 de milieu de type DME efi de type F12. Parmi ceux-ci on peut cités en exemple le mélange DME/ F12 et DMEIMCDB 202;
un facteur protecteur, tel:
~ des anti-oxydants (acide ascorbique, N-acétyl cystéine) D des anti-caspases (Dose : environ 0.1 mU à 10 mU) ~ des protecteurs du métabolisme (L-Carnitine) des facteurs protecteurs des métaux (Transf~rrine) (Dose : environ 0.1 pglml à 100 pglml) - des hormones tels Gtucocorticoïdes, insuürae; acide rétinoïque, hormone thyroïdienne, minéralocorticoïdes, IGF1 ou IGF2 aux doses physiologiques Z 5 allant préférentiellement de 10'~ à 10'9 M.
- des facteurs inhibant la différenciation, tels:
D les FGF (Fibroblasf Growth Facfors). Parmi les facfieurs de Ia famille FGf, trois facteurs sont particulièrement importants et jouent un rôle similaire, soit FGF-2, FGF-6 et FGF-10. Chacun des facteurs de la 2 0 famille FGF est employé à des concentrations allant préférentiellement de 0.1 à 100 pg/ml.
D fEGF (Epidermal Growih Factor) (Dose : environ 0.1 ~rglml à 100 pglml) D le LiF (Leukemia inhibifory Factor) (Dose : environ 0.1 pg/ml à 100 pglml) [fraction non cellulaire du sang après coagulation]
25 D le sérum est également un facteur inhibant la différenciation et peut être utilisé à une concentration variant de 0 à 100 %.
Ce milieu DPM ainsi défini est utilisé lors du procédé de pr'eparation cellulaire:
L'absence de fluide animal dans le milieu défini, comme fe sérum par exemple, permet de garantir une meilteure sécurité infectieuse contre des virus, prions, etc.
30 et une meilleure reproductibilité du procédé de l'invention. Les prélèvements provenant de biopsies sont maintenus soit à température ambiante, soit conservés, préférablement, entre 4 et 6 °C dans le DPM pendant une période n'excédant préférablement pas 48 heures. il est clair que-la composition précise du DPM
pourra varier en fonction du type de biopsie tissulaire.
Lors de l'étape b) du procédé, le fragment tissulaire maintenu dans le milieu DPM est d'abord émincé jusqu'à l'obtention d'un homagénat cellulaire. Ceci est préférablement fait à l'aide de ciseaux chirurgicaux stériles mais tout autre outif semblable peut être utilisé. Par la suite, (extrait tissulaire homogéne ou -fhomogénat tissulaire est préférablement libéré d'une partie des érythrocytes et des adipocytes grâce à une, étape de lavage et de centrifugation par sédimentation douce de 1 à
g (Pinset et Montarras. 1994. Cell Biology : A Laboratory Handbook. Academic 10 Press).
Ä l'étape c) du procédé, fhomogénat tissulaire obtenu à l'étape b) est soumis à une digestion enzymatique pour optimiser la dissociation cellulaire: Lors de cette étape du procédé de l'invention, des 'enzymes protéolytiques d'origine bactérienne,, comme la collagénase etlou la pronase, sont préférablement utilisées.
Toutefois;
pour des raisons de sécurité sanitaire, on peut envisager l'utilisation de trypsine produite par génie génétique ou de toute autre enzyme acceptable. Ces enzymes peuvent ëtre utilisées seules ou en. combinaison à des concentrations variant, préférablement, de' 0.1 à 0.5%.
Ä titre d'exemple non limitatif, on peut procéder comme suit, lors de la mise en 2 0 oeuvre de l'étape c) du procédé
le culot de fragments tissulaires obtenu à l'étape b) est suspendu dans du milieu DPM additionné de collagénase à une concentration finale de 0,4 g par 100 ml.
La digestion enzymatique allant de 5 à 20 minutes peut être répétée plusieurs fois. La température de la réacfron enzymatique se situe préférablement entre 20°C et 37°C
2 5 avec agitation externe. La digestion enzymatique a lieu préférablement en plusieurs étapes, et ce, jusqu'à cinq étapes. Ä chaque étape, les fragments et les cellules sont séparés par centrifugation ménagée à 10 g. Le culot de fragments est alors resuspendu dans le milieu DPM additionné d'enzymes protéolytiques puis soumis à une nouvelle étape de digestion. Les cellules présentes dans le surnageant sont 30 récoltées par centrifugation à 200 g et resuspendues dans du milieu DPM. On aboutit ainsi à une suspension cellulaire qui additionne les cellules extraites des différentes étapes de digestion: La suspension cellulaire est ensuite filtrée sur filtre de nylon dont le diamètre des pores est préférablement d'environ 34 microns, pour éliminer les fragments tissulaires.
Ainsi, grâce au procédé de préparation de cellules souches selon la présente invention, i! est possible, par exemple, de préparer de maniére sûre et reproductible, une suspension cellulaire issue d'une biopsie,:rnusculaire qui maintient son potentiel de colonisation et de plasticité cellulaire. Par exemple, pour un gramme de tissu, il est possible de préparer de 1 x 1 Q6 à 2 x 106 cellules: l:'efficacité des procédés: pour (e maintien de (a diversité et de la plasticité cellulaire est évalué par de tests in vivo et de tests ex vivo: Dans les premiers; les suspensions cellulaires obtenues soni réintroduites dans l'animal aprés un marquage. A titre d'exemple une molécule fluorescente comme la Green Fluorescente Protein sera employée. Le marquage cellulaire permet de suivre le devenir des cellules injectées dans l'organisme, d'analyser leurs participations aux différents tissus et la différenciation des cellules injectées. Dans les conditions où l'on maintient la diversité.et la plasticité, les cellules injectées participent à .ia néoformation de différents tissus comme le muscle squelettique et cardiaque, les vaisseaux; les tendons, le cartilage, l'os; le tissu hématopoïétique. Cette diversité et cette plasticité cellulaire est dépendante du site d'injection soulignanf l'importance de l'environnement dans le devenir cellulaire.
Les tests ex vivo (en culture) permettent aussi de mesurer fa diversité
cellulaire et ia plasticité cellulaire. Ceux-ci sont basés sur l'analyse clonale et sur la réponse à différents inducteurs de la différenciation. Parmi ceux-ci on peut citer des facteurs de croissance comme l'insuline et les IGFs, Ies,TGFs, les BMPs;
le VEGF;
r des hormones comme les dérivés de l'acide rétinoique, les hormones thyroïdiennes, les glucocortico:~-des;
r des facteurs de ia matrice extracellulaire;
~~ des vitamines et agents: permettant la minéralisation;
r les composants de la matrice extracellulaire;
L'identification cellulaire est faite par des analyses immunologiques à l'aide de coloration spécifique et d'anticorps pécifiques qui permettent à la fois (identification et la quantification et par l'analyse transcriptomique., Les approches' complémentaires in vivo et ex vivo permettent de mesurer la diversité et la plasticité cellulaire qualitativement et quantitativement et d'ainsi valider les conditions permettant le maintien de la diversité cellulaire et de la plasticité
cellulaire.
Les cellules ainsi préparées 'sonf une source de cellules adéquates pour la thérapie cellulaire et peuvent être soit réimplantées directement dans un organisme, soit conservées pbur réimplantation ultérieure:
Le procédé de la présente invention peut comprendre une étape additionnelle, soit une étape de congélation. Cette étape optionnelle du procédé offre les avantages suivants ~~ conservation des prélèvements issulaires;
dissociation entre la préparation de 1a biopsie et la réimplantation cellulaire;
r caractérisation biologique et sanitaire avant le réimplantation cellulaire.
Ä titre d'exemple non limitatif, on peut procéder comme suit lors de cette étape de congélation 10~ à 2 x 1 Os cellules provenant de 1 gramme de tissu sont mises en présence de milieu DPM additionné d'agents cryopréservatifs, tel le DMSO. Pour le DMSO, la concentration utilisée est préférablement de 10%. Dans ces conditions, les cellules sont maintenues à 20°C pour une période d,e 10 minutes puis !a température est amenée lentement! en quelques heures; à moins 80°C. Finalement, les cellules sont transférées dans l'azote liquide. il est important de noter que ces conditions de conservation ont J'avantage de ne pas modifier les caractéristiques cellulaires:
Avant de procéder à la transplantation cellulaire dans le cadre des futures applications cliniques; il peut être préférable de caractérisée Ia suspension cellulaire obtenue par le procédé selon la présente invention. Cette caractérisation peut e"tee entreprise au niveau protéique gr"ace à l'utilisation de marqueurs cellulaires tels que ;
- P-Cam comme marqueur de cellule endothéliales - N-Cam comme marqueur de cei~ule neuronales et musculaires - Smooth muscle actin comme marqueurs de cellules du muscle lisse;
- GFAP comme marqueur de cellules güales;
- Myf5, Pax3,; Pax7, C-met et M-cadhérine comme marqueurs de cellules musculaires;
- Sca1+, C-Kit, CD45 et Cd34 comme.marqueurs de cellules souches.
s0 Cette caractérisation peut également être entreprise au niveau de la transcription par l'utilisation de biopuces contenant des oligonucléotides codant pour des gènes cellulaires -(par exemple; facteurs de transcription spécifiques et facteurs de la machinerie du cycle cellulaire) permettant d'identifier (es Cellules de la suspension cellulaire.
iii) Utilisations thérapeutiques Un deuxième aspect de la présente invention vise l'usage d'une suspension cellulaire ou de cellules souches obtenues par le procédé de (invention dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique; suite à une transplantation de ces cellules chez un être humain, par exemple. Plus particulièrement, la présente invention propose d'utiliser les cellules préparées parle procédé de l'invention dans le cadre d'une réparation et/ou régénération tissulaire par transplantation cellulaire.
Les cellules ainsi préparées seront également utilisées comme vecteurs en thérapie génique.
Par exemple; ' les cellules souches adultes obtenues par le procédé de préparation selon l'invention peuvent servir dans le cadre d'une réparation de tissu osseux. Dans le cas présent; if s'agit de transpl nter les cellules sur un site de réparation osseuse. Dans ce micro-environnement particulier, les cellules ou 2 0 certaines d'entre elles peuvent adopter le phénotype osseux et ainsi participer à la réparation du tissu endommagé.
Le procédé de préparation cellulaire de la présente invention peut ëgalement fournir une suspension de cellules souches adultes de mammifère pouvant être utilisée lors d'une restauration du potentiel hématopo'iétique. En effet, la capacité
des cellules souches de biopsie musculaire à coloniser la moelle osseuse de souris irradiées et à contribuer à toutes les lignées hématopoiétiques, oblige à
considérer le potentiel réparateur des cellules de biopsie musculaire dans le cas, par exemple, de leucémies D'autre part, il est connu que les greffes; de cellules musculaires cultivées, dans le muscle sont peu efficaces et caractérisées par une mort massive des cellules réimplantées dans les heures qui suivent' leur injection. II est par conséquent proposé que le procédé de préparation de cellules souches selon l'invention peut contribuer à la réparation du tissu musculaire. Les cellules contenues dans la suspension pourront répondre aux micro-environnements et ainsi restaurer des fonctions ou réparer le tissu musculaire.
EXEMPLE
L'exemple qui suif sert à illustrer l'étendue de l'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y étre effectuées sans que l'on échappe à l'esprit-età la portée de l'invention. Bien que l'on 1o puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
Exemule 1 : Réparation du tissu cardiague Introduction A la différence du muscle squelettique, le tissu cardiaque ne posséde pas à
l'état adulte de cellule souche capable de réparer ce tissu après une lésion.
De ce fait, l'ischémie cardiaque est toujours accompagnée d'une insuffisance de 2 o contraction qui si importante conduit à l'insuffisance cardiaque.
L'objectif de la thérapie cellulaire dans cette indication est de restaurer la fonction de contraction.
Des expériences dans ce sens ont été conduites chez l'Homme avec comme source de cellules, des cellules musculaires amplifiées en culture. Cette première démarche montre la faisabilité de l'approche, mais aussi; certaines limitations de la 25 stratégie adoptée. L'amplification d'un grand nombre de cellules musculaires dans des milieux comprenant des fluides animaux tel le sérum de veau foetal, et leur transplantation dans un tissu hétérotypique sont des opérations à la fois lourdes et non sans danger sanitaire potentiel (contaminants viraux; prions, etc.). La limitation essentielle de ce procédé réside dans le fait que Les cellules ainsi injectées ont une 30 plasticité restreinte; qui ne donnent que des cellules musculaires squelettiques. Le procédé de préparation de cellules souches de la présente invention évite l'appauvrissement de la diversité cellulaire par la culture.
Description de la transplantation cardiaque chez ia brebis Protocole anesthésigue . prémédication avec du midaxofam, induction à l'aide d'étomidate, intubation trachéale et ventilation à pression positive avec de l'isof(urane dans 100°f° d'oxygène. La surveillance est assurée par:
électrocardioscopie, pression artérielle invasive, capnographie. Analgésie ' postopératoire avec de la bupivaca'ine (bloc intercostal lors de thoracotomie), morphine et de la flunixine méglumine.
Biopsie du muscle QUelettigue : Une biopsie du muscle squelettique (approximativement 10 g) est explantée stérilement à partir des biceps fémoraux gauches de chaque brebis. Le tissu ainsi prélevé est maintenu dans du DMEM
(SIGMA) à température de la pièce jusqu'à digestion mécanique ou enzymatique:
La plaie de l'animal est refermée de la façon habituelle: Les animaux récupèrent pendant environ trois heures, puis sont ré-anesthésiés lorsque les cellules sont prêtes à être réimplantées.
Extraction des cellules musculaires : Les expiants de muscle squelettique sont pesés puis lavés dans du DMEM. Le tissu adipeux et fascia sont retires et le muscle est émincé aux ciseaux jusqu'à (obtention d'un homogenat tissulaire. Les fragments 2o de muscle ont ensuite sédirnentés dans du DMEM à 300 rpm pendant 2 minutes puis débarrassés du surnageant.
Afin de Iibéref les cellules satellites, les fragments de muscle sont incubés à
37°C avec agitation dans 10 mL de DMEM additionnée de 0;4% (PN) de collagénase (Type IA, SIGMA) brute: Après 20 minutes les fragments sont centrifugés à 300 rpm pendant 2 minutes.
Le surnageant contenant les cellules isolées est conservé dans du DMEM à
20 % (VN) de sérum de veau foetal. Le culot subit jusqu'à quatre digestions supplémentaires (Pinset, C. et Montarras, D. Cell ~ystems for Ex-vivo Studies of Myogenesis ': A 'Protocol for the Isoration of Stable muscle eell populations from newborn to adult mice dans Cell Biology : A Laboratory Handboak ; deuxième édition e. J. F. Celis, Academic Press; 1998).
Les cellules extraites sont ensuite filtrées sur un filtre de nylon avec pores de 250 p;m de diamètre (Polylabo SA).
MarGmage des cellules : Afin le marquer leurs noyaux, les cellules .sont resuspendues dans 10 mL de DMEM sans sérum contenant 25 ~glmL de 4'-6-diamino-2-phénylindole (DAPI, SIGMA) pendant 10 minutes. Les cellules sont rincées quatre fais dans du DMEM afin d-'enlever le DAPI. Les cellules mononucléées sont dénombrées avec une cellule de numération sous microscopie 1 o à fluorescence. La préparation cellulaire est. ensuite resuspendue dans 1.2 mL de DMEM sans sérum et conservée à 4°C jusqu'à l'implantation.
Greffe cellulaire : Les brebis pPéalablement anesthésiées selon la méthode décrite ci-dessus sont placées en décubitus latéral droit pour une thoracotomie gauche sur le Sème espace intercostal. Après péricardiotomie et suspension du péricarde, les cellules dans du DMEM sont injectées (0.1 mL par site) à l'aide d'une seringue à
insuline connectée à un épijet 27 G, sur 10 zones du ventricule gauche. Une cartographie des vaisseaux coronaires est établie pour repérer les sites d'injection dans le myocarde. Des points de sutures épicardiques de repérage sont réalisés 2 o pour au moins deux injections. Le thorax est refermé de là manière habituelle et les animaux récupèrent sous régime analgésiqc~e (morphine à 0.5 mg/kg IM BiD;
flunixine 1 mg/kg IM une fois) jusqu'au lendemain inclusyement.
Cultures cellulaires témoins : Afin de confirmer la présence de cellules précurseurs du muscle dans la préparation cellulaire, un échantillon de 100 ~.L de la suspension cellulaire est ensemencé dans une boîte de culture contenant du DMEM avec sérum de veau foetal. Les,cellules sont maintenues à titre de témoin dans une atmosphère à 5% de C02. Trois à sept jours suivant l'ensemencement, les cellules servent à une immunodétection du facteur de régulation spécifique MyoD (DAKO) 3o telle que décrite par Mon#arras, D. et al. (Culturel AllyfS Hull and MyoD
Null Muscle Precursor Ceils Display Distinct Growth Defects. Bioi Ceil 2000;92 :565-72).
iQ
Rés u ltats La procédure d'injection cellulaire n'a pas d'effet sérieux sur les animaux.
Une arythmie ventriculaire survient lors de l'insertion de l'aiguille et lors de l'injection des cellules mais se résorbe lorsque l'aiguille est retirée. Le dénombrement des cellules permet de déterminer l'injection de 1:7 +/- 0.3 x 1 n' cellules mononucléées marquées au DAPI.
L'expression de la chaîne lourde de la myosine squelettique (MY32) est détectée à 3 semaines post-implantation dans 8 animaux ur 8; ce qui confirme la survie cellulaire et l'expression myogénique des cellules implantées. De larges 1o surfaces de greffon (de 2 à 9 mm de diamètre) ou de discrets foyers sont observés à l'intérieur de la paroi du myocarde (Figure 1). Des cellules isolées sont aussi observées dans le tissu adipeux du péricarde. Ä !'intérieur de la paroi du myocarde;
les fibres positives pour l'expression de MY32 sont généralement alignées avec des cardiocytes natifs. Certaines de ces fibres ont fortement marquées à
l'anticorps dirigé contre MY32alors-que d'autres ne sont que faiblement marquées (Figure 2):
Ces fibres ne sont pas couplées électro-mécaniquement entre elles ou avec les cardiocytes natifs tel que démontré par immunohistochimie négative à la connexine-43.
Les cellules implantées développent des sarcomères organisés et présentent 2 o soit une morphologie allongée'caractéristique de myotubeà multinucléés fusionnés, soit une morphologïe qui demeure mononucléée (Figure 3). Ces cellules du muscle squelettique possèdent des noyaux observés en périphérie ou au centre. Une fibrose de remplacement et des régions présentant des cellules mononucléées de la réponse inflammatoire sont aussi ob ervées.
2 5 Aucun marquage au DAPI n'est observé dans. les cours explantés. Ceci peut être dû à une division cellulaire active entraïnant une dilution du DAPI. En effet, dans les cultures cellulaires servant de témoins, Ie DAPI devient indétectable après 6 à 8 doublements de population cellulaire:
Les boîtes d;e culture servant de témoins sont obseivées quotidiennement.
3 o L'immunodétection du facteur de régulation spécifique du muscle squelettique MyoD
montrent qu'approximativement 50% des cellules en culture sont des cellules précurseurs du muscle squelettique: Quand on permet aux cellules de fusionner, toutes les cellules montrent de nombreux myotubes .une semaine suivant l'ensemencement.
Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en' détails ci-dessus et illustrés-dans les dessins annexës, l'invention n'est pas (imitée 5 à ces seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications peuvent y "etre effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ou de l'esprit de, l'invention.
par l'implar+tation de cellules souches animales autologues ou hétérologues obtenues selon le procédé de l'invention chez un animal.
L'originalité de la présente invention porte sur le fait que, contrairement aux procédés de préparation cellulaire utilisés ' dans le domaine, le procédé de prépâration de la présente invention permet - d'extraire les cellules dans des conditions définies sans protéine animale d'origine extractive, donc dans des conditions sûres du point de vue sanitaire ;
20 - de maintenir la viabilité cellulaire par l'utilisation de molécules anti-oxydantes et anti-apoptotiques;
- de préserver la diversité cellulaire;
- de maintenir le potentiel de plasticité cellulaire;
- de maintenir le potentiel de différenciation; et - d' améliorer' l'implantation, la colonisation et la différenciation des cellules greffées.
Par exemple, dans le procédé de préparation cellulaire décrit dans l'article de Pouzet et al. (2000. Circulation: 102 : 1112210-5), il n'y a pas d'extraction selon un procédé enzymatique: Alternativement; le tissu musculaire est haché. De plus, il n'y a pas d'étape de préparation. de cellules telle qu'entendue au sens de la présente invention.
La récupération fonctionnelle teNe que discutée dans l'article de Pouzet et al:
dépend du nombre de cellules alors que dans le procédé selon l'invention, le mode de préparation des- cellules conduit avantageusement à une colonisation Près importante ainsi qu'à une récupération fonctionnelle rapide de l'organe traitë.
DESCRIPTION DES FIGURES
Les Figures ~, 2 et 3 sont des microphotographies illustrant la mise en évidence de cellules de muscle greffées dans le coeur de brebis. Les cellules ont été
obtenues par dissociation enzymatique d'une biopsie de muscle squelettique puis directement implantées dans le myocarde de la méme brebis (greffe autologue).
La v présence de cellules de muscle squelettique est révélée à l'aide: de .l'anticorps MY32 qui reconnaît spécifiquement fa myosine de muscle squelettique. La Figure 1 illustre la présence de zones de greffes massives (2 à 9 mm de diamètre) à faible agrandissement (barre d'échelle, 250 microns). La Figure 2 montre des cellules colorées par (anticorps MY32 généralement alignées avec le réseau de cardiocytes.
Ces cellules peuvent être intensément marquées ou faiblement marquées; les cardiocytes ne sont pas marqués (Barre d'échelle,500 microns). La Figure 3 montre des cellules greffées se différenciant en fibres musculaires etformant des sarcorn'eres organisés (Barre d'échelle; 25 microns).
DESCRIPTION DES MODES DE RÉALISATION
PRÉFÉRÉS DE L'INVENTION
La présente invention porte donc sur la m9se au: point d'un procédé de préparation de cellules souches animale qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules provenant d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation ultérieure dans le cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par trânsplantation des cellules ainsi préparées chez un animal.
2 o i) Définitions Par « cellule souche », on entend les cellules qui ont 'a la fois la capacité
de s'autorenouveler et la capacité de se différencier en différents types de précurseurs cellulaires:
Par « diversité des cellules souches », on entend les cellules souches qui sont classées en fonction de leur stade de développement et de leur origine tissulaire. Plus particulièrement, on entend une classification de cellules souches embryonnaires ou adultes en fonction de leur origine tissulaire, par exemple, les cellules souches de la peau ou neuronales ou du muscle.
Par « plasticitë des cellules souches », on entend la capacitë pour ces 3o cellules de traverser les frontières de lignée; par exemple la capacité des cellules hématopo'iétiques à se différentier en hépatocytes:
i Par « régénération tissulaire », on entend la capacité à reformer un tissu soit par activation des cellules prvgénitrices du fiissu (par exemple tissu de la peau, du foie, du coeur, de l'os ou de tissus nerveux), soit par transplantation de ces cellules progënitrices. Plus particulièrement; il s'agit alors d'une néoformation tissulaire.
5 Par « réparation tissulaire »; on entend une opération qui permet de pallier un déficit sans avoir recours à un: processus derégénération. La réparation tissulaire se traduit par un apport e~cogène de cellules qui peuvent être différentes des cellules du tissu receveur.
Par « transplantation cellulaire » ï on entend une opération qui se caractérise 1o par un apport de cellules isolées. Cette transplantation peut être effectuée, par exemple, par injection directement dans le (issu ou dans la circulation affërente.
Par « animal », on entend tout organisme vivant qui peut être sujet à une transplantation cellulaire, et ceci lnelut les êtres vertébrés tels que notamment fes êtres humains; les animaux domestiques et sauvages, notamment les oiseaux.
ü) Procédé de préparation de cellules souches Un premier aspect de la présente invention vise un procédé de préparation de cellules souches de mammifère. Ce procédé comprend en général, les étapes suivantes:
2o a) l'extraction cellulaire;
b) la dissociation mécanique;
c) la'dissociation enzymatique; et d) le' maintien des cellules dans un milieu spécifique permettant de préserver la diversité.
Plus précisément, l'extraction cellulaire est obtenue tout d'abord suite à une biopsie pour fournir un fragment tissulaire; tel un fragment de muscle, de foie ou de peau. Par exemple; une biopsie musculaire est réalisèe sous anesthésie locale suite à une incision ou encore à l'aiguille. Le fragment tissulaire ainsi obtenu est ensuite humidifié dans un milieu défini, tel le DMEI2Q2 en présence de facteurs protecteurs 3o et de facteurs inhibant ia difFérenciation cellulaire (Pinset et Montarras), (1994) Celi Biology : A laboratory Handbook. Academic Press).
Préférablement-, le milieu défini' est un milieu ci-après nommé DPM
(Diversity, â
Protecfing MediUm) et comprend au moins:
- un milieu nutritif de base tamponné avec des tampons dépendants ou indépendants de la concentration en C02: Les milieux utilisés sont, dans la plupart des casa constitués d'un mélange dans un rapport 1 :1 de milieu de type DME efi de type F12. Parmi ceux-ci on peut cités en exemple le mélange DME/ F12 et DMEIMCDB 202;
un facteur protecteur, tel:
~ des anti-oxydants (acide ascorbique, N-acétyl cystéine) D des anti-caspases (Dose : environ 0.1 mU à 10 mU) ~ des protecteurs du métabolisme (L-Carnitine) des facteurs protecteurs des métaux (Transf~rrine) (Dose : environ 0.1 pglml à 100 pglml) - des hormones tels Gtucocorticoïdes, insuürae; acide rétinoïque, hormone thyroïdienne, minéralocorticoïdes, IGF1 ou IGF2 aux doses physiologiques Z 5 allant préférentiellement de 10'~ à 10'9 M.
- des facteurs inhibant la différenciation, tels:
D les FGF (Fibroblasf Growth Facfors). Parmi les facfieurs de Ia famille FGf, trois facteurs sont particulièrement importants et jouent un rôle similaire, soit FGF-2, FGF-6 et FGF-10. Chacun des facteurs de la 2 0 famille FGF est employé à des concentrations allant préférentiellement de 0.1 à 100 pg/ml.
D fEGF (Epidermal Growih Factor) (Dose : environ 0.1 ~rglml à 100 pglml) D le LiF (Leukemia inhibifory Factor) (Dose : environ 0.1 pg/ml à 100 pglml) [fraction non cellulaire du sang après coagulation]
25 D le sérum est également un facteur inhibant la différenciation et peut être utilisé à une concentration variant de 0 à 100 %.
Ce milieu DPM ainsi défini est utilisé lors du procédé de pr'eparation cellulaire:
L'absence de fluide animal dans le milieu défini, comme fe sérum par exemple, permet de garantir une meilteure sécurité infectieuse contre des virus, prions, etc.
30 et une meilleure reproductibilité du procédé de l'invention. Les prélèvements provenant de biopsies sont maintenus soit à température ambiante, soit conservés, préférablement, entre 4 et 6 °C dans le DPM pendant une période n'excédant préférablement pas 48 heures. il est clair que-la composition précise du DPM
pourra varier en fonction du type de biopsie tissulaire.
Lors de l'étape b) du procédé, le fragment tissulaire maintenu dans le milieu DPM est d'abord émincé jusqu'à l'obtention d'un homagénat cellulaire. Ceci est préférablement fait à l'aide de ciseaux chirurgicaux stériles mais tout autre outif semblable peut être utilisé. Par la suite, (extrait tissulaire homogéne ou -fhomogénat tissulaire est préférablement libéré d'une partie des érythrocytes et des adipocytes grâce à une, étape de lavage et de centrifugation par sédimentation douce de 1 à
g (Pinset et Montarras. 1994. Cell Biology : A Laboratory Handbook. Academic 10 Press).
Ä l'étape c) du procédé, fhomogénat tissulaire obtenu à l'étape b) est soumis à une digestion enzymatique pour optimiser la dissociation cellulaire: Lors de cette étape du procédé de l'invention, des 'enzymes protéolytiques d'origine bactérienne,, comme la collagénase etlou la pronase, sont préférablement utilisées.
Toutefois;
pour des raisons de sécurité sanitaire, on peut envisager l'utilisation de trypsine produite par génie génétique ou de toute autre enzyme acceptable. Ces enzymes peuvent ëtre utilisées seules ou en. combinaison à des concentrations variant, préférablement, de' 0.1 à 0.5%.
Ä titre d'exemple non limitatif, on peut procéder comme suit, lors de la mise en 2 0 oeuvre de l'étape c) du procédé
le culot de fragments tissulaires obtenu à l'étape b) est suspendu dans du milieu DPM additionné de collagénase à une concentration finale de 0,4 g par 100 ml.
La digestion enzymatique allant de 5 à 20 minutes peut être répétée plusieurs fois. La température de la réacfron enzymatique se situe préférablement entre 20°C et 37°C
2 5 avec agitation externe. La digestion enzymatique a lieu préférablement en plusieurs étapes, et ce, jusqu'à cinq étapes. Ä chaque étape, les fragments et les cellules sont séparés par centrifugation ménagée à 10 g. Le culot de fragments est alors resuspendu dans le milieu DPM additionné d'enzymes protéolytiques puis soumis à une nouvelle étape de digestion. Les cellules présentes dans le surnageant sont 30 récoltées par centrifugation à 200 g et resuspendues dans du milieu DPM. On aboutit ainsi à une suspension cellulaire qui additionne les cellules extraites des différentes étapes de digestion: La suspension cellulaire est ensuite filtrée sur filtre de nylon dont le diamètre des pores est préférablement d'environ 34 microns, pour éliminer les fragments tissulaires.
Ainsi, grâce au procédé de préparation de cellules souches selon la présente invention, i! est possible, par exemple, de préparer de maniére sûre et reproductible, une suspension cellulaire issue d'une biopsie,:rnusculaire qui maintient son potentiel de colonisation et de plasticité cellulaire. Par exemple, pour un gramme de tissu, il est possible de préparer de 1 x 1 Q6 à 2 x 106 cellules: l:'efficacité des procédés: pour (e maintien de (a diversité et de la plasticité cellulaire est évalué par de tests in vivo et de tests ex vivo: Dans les premiers; les suspensions cellulaires obtenues soni réintroduites dans l'animal aprés un marquage. A titre d'exemple une molécule fluorescente comme la Green Fluorescente Protein sera employée. Le marquage cellulaire permet de suivre le devenir des cellules injectées dans l'organisme, d'analyser leurs participations aux différents tissus et la différenciation des cellules injectées. Dans les conditions où l'on maintient la diversité.et la plasticité, les cellules injectées participent à .ia néoformation de différents tissus comme le muscle squelettique et cardiaque, les vaisseaux; les tendons, le cartilage, l'os; le tissu hématopoïétique. Cette diversité et cette plasticité cellulaire est dépendante du site d'injection soulignanf l'importance de l'environnement dans le devenir cellulaire.
Les tests ex vivo (en culture) permettent aussi de mesurer fa diversité
cellulaire et ia plasticité cellulaire. Ceux-ci sont basés sur l'analyse clonale et sur la réponse à différents inducteurs de la différenciation. Parmi ceux-ci on peut citer des facteurs de croissance comme l'insuline et les IGFs, Ies,TGFs, les BMPs;
le VEGF;
r des hormones comme les dérivés de l'acide rétinoique, les hormones thyroïdiennes, les glucocortico:~-des;
r des facteurs de ia matrice extracellulaire;
~~ des vitamines et agents: permettant la minéralisation;
r les composants de la matrice extracellulaire;
L'identification cellulaire est faite par des analyses immunologiques à l'aide de coloration spécifique et d'anticorps pécifiques qui permettent à la fois (identification et la quantification et par l'analyse transcriptomique., Les approches' complémentaires in vivo et ex vivo permettent de mesurer la diversité et la plasticité cellulaire qualitativement et quantitativement et d'ainsi valider les conditions permettant le maintien de la diversité cellulaire et de la plasticité
cellulaire.
Les cellules ainsi préparées 'sonf une source de cellules adéquates pour la thérapie cellulaire et peuvent être soit réimplantées directement dans un organisme, soit conservées pbur réimplantation ultérieure:
Le procédé de la présente invention peut comprendre une étape additionnelle, soit une étape de congélation. Cette étape optionnelle du procédé offre les avantages suivants ~~ conservation des prélèvements issulaires;
dissociation entre la préparation de 1a biopsie et la réimplantation cellulaire;
r caractérisation biologique et sanitaire avant le réimplantation cellulaire.
Ä titre d'exemple non limitatif, on peut procéder comme suit lors de cette étape de congélation 10~ à 2 x 1 Os cellules provenant de 1 gramme de tissu sont mises en présence de milieu DPM additionné d'agents cryopréservatifs, tel le DMSO. Pour le DMSO, la concentration utilisée est préférablement de 10%. Dans ces conditions, les cellules sont maintenues à 20°C pour une période d,e 10 minutes puis !a température est amenée lentement! en quelques heures; à moins 80°C. Finalement, les cellules sont transférées dans l'azote liquide. il est important de noter que ces conditions de conservation ont J'avantage de ne pas modifier les caractéristiques cellulaires:
Avant de procéder à la transplantation cellulaire dans le cadre des futures applications cliniques; il peut être préférable de caractérisée Ia suspension cellulaire obtenue par le procédé selon la présente invention. Cette caractérisation peut e"tee entreprise au niveau protéique gr"ace à l'utilisation de marqueurs cellulaires tels que ;
- P-Cam comme marqueur de cellule endothéliales - N-Cam comme marqueur de cei~ule neuronales et musculaires - Smooth muscle actin comme marqueurs de cellules du muscle lisse;
- GFAP comme marqueur de cellules güales;
- Myf5, Pax3,; Pax7, C-met et M-cadhérine comme marqueurs de cellules musculaires;
- Sca1+, C-Kit, CD45 et Cd34 comme.marqueurs de cellules souches.
s0 Cette caractérisation peut également être entreprise au niveau de la transcription par l'utilisation de biopuces contenant des oligonucléotides codant pour des gènes cellulaires -(par exemple; facteurs de transcription spécifiques et facteurs de la machinerie du cycle cellulaire) permettant d'identifier (es Cellules de la suspension cellulaire.
iii) Utilisations thérapeutiques Un deuxième aspect de la présente invention vise l'usage d'une suspension cellulaire ou de cellules souches obtenues par le procédé de (invention dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique; suite à une transplantation de ces cellules chez un être humain, par exemple. Plus particulièrement, la présente invention propose d'utiliser les cellules préparées parle procédé de l'invention dans le cadre d'une réparation et/ou régénération tissulaire par transplantation cellulaire.
Les cellules ainsi préparées seront également utilisées comme vecteurs en thérapie génique.
Par exemple; ' les cellules souches adultes obtenues par le procédé de préparation selon l'invention peuvent servir dans le cadre d'une réparation de tissu osseux. Dans le cas présent; if s'agit de transpl nter les cellules sur un site de réparation osseuse. Dans ce micro-environnement particulier, les cellules ou 2 0 certaines d'entre elles peuvent adopter le phénotype osseux et ainsi participer à la réparation du tissu endommagé.
Le procédé de préparation cellulaire de la présente invention peut ëgalement fournir une suspension de cellules souches adultes de mammifère pouvant être utilisée lors d'une restauration du potentiel hématopo'iétique. En effet, la capacité
des cellules souches de biopsie musculaire à coloniser la moelle osseuse de souris irradiées et à contribuer à toutes les lignées hématopoiétiques, oblige à
considérer le potentiel réparateur des cellules de biopsie musculaire dans le cas, par exemple, de leucémies D'autre part, il est connu que les greffes; de cellules musculaires cultivées, dans le muscle sont peu efficaces et caractérisées par une mort massive des cellules réimplantées dans les heures qui suivent' leur injection. II est par conséquent proposé que le procédé de préparation de cellules souches selon l'invention peut contribuer à la réparation du tissu musculaire. Les cellules contenues dans la suspension pourront répondre aux micro-environnements et ainsi restaurer des fonctions ou réparer le tissu musculaire.
EXEMPLE
L'exemple qui suif sert à illustrer l'étendue de l'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y étre effectuées sans que l'on échappe à l'esprit-età la portée de l'invention. Bien que l'on 1o puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.
Exemule 1 : Réparation du tissu cardiague Introduction A la différence du muscle squelettique, le tissu cardiaque ne posséde pas à
l'état adulte de cellule souche capable de réparer ce tissu après une lésion.
De ce fait, l'ischémie cardiaque est toujours accompagnée d'une insuffisance de 2 o contraction qui si importante conduit à l'insuffisance cardiaque.
L'objectif de la thérapie cellulaire dans cette indication est de restaurer la fonction de contraction.
Des expériences dans ce sens ont été conduites chez l'Homme avec comme source de cellules, des cellules musculaires amplifiées en culture. Cette première démarche montre la faisabilité de l'approche, mais aussi; certaines limitations de la 25 stratégie adoptée. L'amplification d'un grand nombre de cellules musculaires dans des milieux comprenant des fluides animaux tel le sérum de veau foetal, et leur transplantation dans un tissu hétérotypique sont des opérations à la fois lourdes et non sans danger sanitaire potentiel (contaminants viraux; prions, etc.). La limitation essentielle de ce procédé réside dans le fait que Les cellules ainsi injectées ont une 30 plasticité restreinte; qui ne donnent que des cellules musculaires squelettiques. Le procédé de préparation de cellules souches de la présente invention évite l'appauvrissement de la diversité cellulaire par la culture.
Description de la transplantation cardiaque chez ia brebis Protocole anesthésigue . prémédication avec du midaxofam, induction à l'aide d'étomidate, intubation trachéale et ventilation à pression positive avec de l'isof(urane dans 100°f° d'oxygène. La surveillance est assurée par:
électrocardioscopie, pression artérielle invasive, capnographie. Analgésie ' postopératoire avec de la bupivaca'ine (bloc intercostal lors de thoracotomie), morphine et de la flunixine méglumine.
Biopsie du muscle QUelettigue : Une biopsie du muscle squelettique (approximativement 10 g) est explantée stérilement à partir des biceps fémoraux gauches de chaque brebis. Le tissu ainsi prélevé est maintenu dans du DMEM
(SIGMA) à température de la pièce jusqu'à digestion mécanique ou enzymatique:
La plaie de l'animal est refermée de la façon habituelle: Les animaux récupèrent pendant environ trois heures, puis sont ré-anesthésiés lorsque les cellules sont prêtes à être réimplantées.
Extraction des cellules musculaires : Les expiants de muscle squelettique sont pesés puis lavés dans du DMEM. Le tissu adipeux et fascia sont retires et le muscle est émincé aux ciseaux jusqu'à (obtention d'un homogenat tissulaire. Les fragments 2o de muscle ont ensuite sédirnentés dans du DMEM à 300 rpm pendant 2 minutes puis débarrassés du surnageant.
Afin de Iibéref les cellules satellites, les fragments de muscle sont incubés à
37°C avec agitation dans 10 mL de DMEM additionnée de 0;4% (PN) de collagénase (Type IA, SIGMA) brute: Après 20 minutes les fragments sont centrifugés à 300 rpm pendant 2 minutes.
Le surnageant contenant les cellules isolées est conservé dans du DMEM à
20 % (VN) de sérum de veau foetal. Le culot subit jusqu'à quatre digestions supplémentaires (Pinset, C. et Montarras, D. Cell ~ystems for Ex-vivo Studies of Myogenesis ': A 'Protocol for the Isoration of Stable muscle eell populations from newborn to adult mice dans Cell Biology : A Laboratory Handboak ; deuxième édition e. J. F. Celis, Academic Press; 1998).
Les cellules extraites sont ensuite filtrées sur un filtre de nylon avec pores de 250 p;m de diamètre (Polylabo SA).
MarGmage des cellules : Afin le marquer leurs noyaux, les cellules .sont resuspendues dans 10 mL de DMEM sans sérum contenant 25 ~glmL de 4'-6-diamino-2-phénylindole (DAPI, SIGMA) pendant 10 minutes. Les cellules sont rincées quatre fais dans du DMEM afin d-'enlever le DAPI. Les cellules mononucléées sont dénombrées avec une cellule de numération sous microscopie 1 o à fluorescence. La préparation cellulaire est. ensuite resuspendue dans 1.2 mL de DMEM sans sérum et conservée à 4°C jusqu'à l'implantation.
Greffe cellulaire : Les brebis pPéalablement anesthésiées selon la méthode décrite ci-dessus sont placées en décubitus latéral droit pour une thoracotomie gauche sur le Sème espace intercostal. Après péricardiotomie et suspension du péricarde, les cellules dans du DMEM sont injectées (0.1 mL par site) à l'aide d'une seringue à
insuline connectée à un épijet 27 G, sur 10 zones du ventricule gauche. Une cartographie des vaisseaux coronaires est établie pour repérer les sites d'injection dans le myocarde. Des points de sutures épicardiques de repérage sont réalisés 2 o pour au moins deux injections. Le thorax est refermé de là manière habituelle et les animaux récupèrent sous régime analgésiqc~e (morphine à 0.5 mg/kg IM BiD;
flunixine 1 mg/kg IM une fois) jusqu'au lendemain inclusyement.
Cultures cellulaires témoins : Afin de confirmer la présence de cellules précurseurs du muscle dans la préparation cellulaire, un échantillon de 100 ~.L de la suspension cellulaire est ensemencé dans une boîte de culture contenant du DMEM avec sérum de veau foetal. Les,cellules sont maintenues à titre de témoin dans une atmosphère à 5% de C02. Trois à sept jours suivant l'ensemencement, les cellules servent à une immunodétection du facteur de régulation spécifique MyoD (DAKO) 3o telle que décrite par Mon#arras, D. et al. (Culturel AllyfS Hull and MyoD
Null Muscle Precursor Ceils Display Distinct Growth Defects. Bioi Ceil 2000;92 :565-72).
iQ
Rés u ltats La procédure d'injection cellulaire n'a pas d'effet sérieux sur les animaux.
Une arythmie ventriculaire survient lors de l'insertion de l'aiguille et lors de l'injection des cellules mais se résorbe lorsque l'aiguille est retirée. Le dénombrement des cellules permet de déterminer l'injection de 1:7 +/- 0.3 x 1 n' cellules mononucléées marquées au DAPI.
L'expression de la chaîne lourde de la myosine squelettique (MY32) est détectée à 3 semaines post-implantation dans 8 animaux ur 8; ce qui confirme la survie cellulaire et l'expression myogénique des cellules implantées. De larges 1o surfaces de greffon (de 2 à 9 mm de diamètre) ou de discrets foyers sont observés à l'intérieur de la paroi du myocarde (Figure 1). Des cellules isolées sont aussi observées dans le tissu adipeux du péricarde. Ä !'intérieur de la paroi du myocarde;
les fibres positives pour l'expression de MY32 sont généralement alignées avec des cardiocytes natifs. Certaines de ces fibres ont fortement marquées à
l'anticorps dirigé contre MY32alors-que d'autres ne sont que faiblement marquées (Figure 2):
Ces fibres ne sont pas couplées électro-mécaniquement entre elles ou avec les cardiocytes natifs tel que démontré par immunohistochimie négative à la connexine-43.
Les cellules implantées développent des sarcomères organisés et présentent 2 o soit une morphologie allongée'caractéristique de myotubeà multinucléés fusionnés, soit une morphologïe qui demeure mononucléée (Figure 3). Ces cellules du muscle squelettique possèdent des noyaux observés en périphérie ou au centre. Une fibrose de remplacement et des régions présentant des cellules mononucléées de la réponse inflammatoire sont aussi ob ervées.
2 5 Aucun marquage au DAPI n'est observé dans. les cours explantés. Ceci peut être dû à une division cellulaire active entraïnant une dilution du DAPI. En effet, dans les cultures cellulaires servant de témoins, Ie DAPI devient indétectable après 6 à 8 doublements de population cellulaire:
Les boîtes d;e culture servant de témoins sont obseivées quotidiennement.
3 o L'immunodétection du facteur de régulation spécifique du muscle squelettique MyoD
montrent qu'approximativement 50% des cellules en culture sont des cellules précurseurs du muscle squelettique: Quand on permet aux cellules de fusionner, toutes les cellules montrent de nombreux myotubes .une semaine suivant l'ensemencement.
Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en' détails ci-dessus et illustrés-dans les dessins annexës, l'invention n'est pas (imitée 5 à ces seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications peuvent y "etre effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ou de l'esprit de, l'invention.
Claims (9)
1. Procédé de préparation cellulaire capable de préserver la diversité et la plasticité
des cellules souches de vertébrés.
des cellules souches de vertébrés.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérise en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- l'extraction cellulaire - la dissociation mécanique - la dissociation enzymatique - le maintien de cellules obtenues dans un milieu spécifique permettant de préserver la diversité et la plasticité.
- l'extraction cellulaire - la dissociation mécanique - la dissociation enzymatique - le maintien de cellules obtenues dans un milieu spécifique permettant de préserver la diversité et la plasticité.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est constitué d'un milieu de culture spécifique comprenant au moins:
a) un milieu nutritif;
b) un facteur protecteur;
c) des hormones;
d) des facteurs inhibant la différentiation.
a) un milieu nutritif;
b) un facteur protecteur;
c) des hormones;
d) des facteurs inhibant la différentiation.
4. Procédé de préparation cellulaire selon l'une quelconque des revendications à 3 dans lequel les cellules souches sont des cellules souches animales choisies dans le groupe constitué par des cellules souches progénitrices des différents tissus tels que la peau, le foie, le coeur, l'os ou les tissus nerveux.
5. Procédé de préparation de cellules souches capables de réparer ou de régénérer in vivo des tissus ou des organes d'un vertébré.
6. Utilisation des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé
de l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour permettre le traitement de maladies par thérapie cellulaire ou thérapie génique.
de l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour permettre le traitement de maladies par thérapie cellulaire ou thérapie génique.
7. Méthode de traitement comprenant une étape d'implantation de cellules souches animales autologues ou hétérologues obtenues selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 5 chez un animal.
8. Composition cellulaire comprenant des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 5.
9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que les cellule souches ont une capacité de colonisation et une capacité à permettre une récupération fonctionnelle.
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZDE | Dead |