WO2024068960A1 - Procédé de production d'un modèle de myélome multiple humain en trois dimensions - Google Patents

Procédé de production d'un modèle de myélome multiple humain en trois dimensions Download PDF

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WO2024068960A1
WO2024068960A1 PCT/EP2023/077114 EP2023077114W WO2024068960A1 WO 2024068960 A1 WO2024068960 A1 WO 2024068960A1 EP 2023077114 W EP2023077114 W EP 2023077114W WO 2024068960 A1 WO2024068960 A1 WO 2024068960A1
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WO
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cells
spheroids
plasma cells
endothelial
culture
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Application number
PCT/EP2023/077114
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Inventor
Nicolas Lucien ESPAGNOLLE
Mélanie Alexandra GADELORGE
Jill CORRE
Original Assignee
Etablissement Français Du Sang
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Universite Toulouse Iii-Paul Sabatier
Centre National De La Recherche Scientifique
Centre Hospitalier Universitaire De Toulouse
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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • TITLE Process for producing a three-dimensional human multiple myeloma model
  • the present invention relates to the method of producing a three-dimensional (3D) model of multiple myeloma (MM), in the form of spheroids, by co-culture of mesenchymal stem/stromal cells, endothelial progenitors and primary plasma cells from patient(s). ) affected by MM.
  • the present invention also relates to the spheroids obtained by said process and their uses.
  • MM Multiple myeloma
  • Plasma cells are cells of the immune system derived from bone marrow (BM) which produce antibodies in order to protect the body against external attacks (bacteria, viruses).
  • BM bone marrow
  • genetic abnormalities can occur, transforming healthy plasma cells into malignant plasma cells. In the normal state, these plasma cells circulate in the blood whereas in MM pathology they return to the bone marrow where they cause damage at several levels.
  • Treatment currently makes it possible to prevent or relieve symptoms and complications, by destroying pathological plasma cells and slowing the progression of the disease.
  • the inventors have created a new human 3D tissue model of multiple myeloma. It includes the mesenchymal compartment, the vascular compartment and plasma cells, obtained from samples from patient(s) suffering from multiple myeloma, without the use of a cell line. The maintenance of the viability of plasma cells in coculture over more than 14 days has notably been resolved. This makes it possible to generate a fully human preclinical ex vivo model of multiple myeloma, genetically relevant for said patient, and comprising the mesenchymal, vascular and plasma cell compartments in the form of a spheroid.
  • This model makes it possible to envisage a breakthrough in personalized medicine thanks to the rapid creation of a model representative of the tumor tissues of the bone marrow of each patient.
  • the invention relates to a method for producing human multiple myeloma (MM) spheroids, comprising: a. Cultivating mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), endothelial cells and endothelial progenitors in culture medium; b. Harvesting cultured MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors; etc. The co-culture of MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors harvested with primary CD138+ plasma cells from a patient suffering from MM under conditions allowing the formation of spheroids.
  • MSCs mesenchymal stem/stromal cells
  • endothelial cells and endothelial progenitors in culture medium
  • Harvesting cultured MSCs endothelial cells and endothelial progenitors
  • the co-culture of MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors harvested with primary CD138+ plasma cells from
  • mesenchymal stem cells also called “mesenchymal stromal cells”
  • mesenchymal stromal cells we mean stem cells of mesodermal origin. They are characterized phenotypically by the co-expression of a certain number of markers such as for example CD73, CD90, CD105, CD146, and the absence of expression of other markers, in particular CD45, CD31 and CD34. They can come from bone marrow, adipose tissue, or umbilical cord blood.
  • the mesenchymal stem or stromal cells are of human origin and come from a patient with MM or a healthy subject. In a preferred mode, the mesenchymal stem/stromal cells cultured in step a. are primary cells.
  • endothelial progenitors we mean cells engaged in endothelial differentiation but which are not yet recognizable as endothelial cells under the microscope. They are characterized phenotypically by the expression of a certain number of markers such as for example CD133, CD34, CD31, VEGFR2.
  • endothelial cells we mean cells that are completely differentiated in the endothelial pathway and therefore recognizable as endothelial cells under the microscope. They are characterized phenotypically by the expression of a certain number of markers such as for example CD31, VE-Cadherin, von Willebrand factor, VEGFR2.
  • Endothelial progenitors and endothelial cells have the capacity to organize themselves into a network of endothelial cells, or vascular network, and therefore to organize themselves into vessels.
  • the endothelial progenitors and the endothelial cells cultured in step a) are primary cells.
  • Endothelial progenitors and endothelial cells can for example be obtained from bone marrow mononuclear cells.
  • the MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors were obtained from the same subject, that is to say from the same healthy subject or the same patient suffering from MM.
  • the MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors have been obtained from a single or the same sample, in particular a bone marrow sample, from said healthy subject or patient suffering from MM.
  • primary cell we mean a cell directly derived from a tissue and/or a sample of cells from an individual.
  • culture refers to the selection and multiplication of cultured cells.
  • the mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the endothelial progenitors and the endothelial cells are cultured jointly in the same culture medium and, preferably, in the same culture container. After extraction of the raw marrow, the cells are seeded, for example, at a density of 50,000 cells/cm 2 in flasks. The three cell types coexist and proliferate in this culture.
  • the culture takes place in 2 dimensions (2D), in the form of a monolayer at least partly adherent.
  • the culture preferably takes place until the cells are confluent.
  • the culture typically lasts for 3 to 30 days, preferably for 5 to 25 days, or 10 to 20 days, 12 to 16 days, 13 to 15 days, approximately 2 weeks.
  • the cells are not cultured in the presence of a hydrogel or a solid support (ossified tissue or other scaffold).
  • hydrogel we mean a gel in which the swelling agent is water.
  • the matrix of a hydrogel is generally a network of polymers.
  • a hydrogel we can cite in particular Matrigel, they can be formed based on fibrin, based on collagen, agarose, gelatin, synthetic polymer or a mixture of these.
  • cells are not cultured with an exogenous supply of complex biomolecules (e.g. cytokine, growth factors, hormones).
  • complex biomolecules e.g. cytokine, growth factors, hormones.
  • culture medium is meant a medium suitable for the culture of mesenchymal stem/stromal cells, endothelial progenitors and endothelial cells.
  • the culture medium is for example an RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum (FBS), a minimal essential medium a (MEM a), or an Endothelial cell Growth Medium 2 medium (EGM2, from Promocell) supplemented with 2 % FBS or platelet lysate (LP).
  • FBS fetal calf serum
  • MEM a minimal essential medium a
  • EGF2 Endothelial cell Growth Medium 2 medium
  • Promocell fetal calf serum
  • LP platelet lysate
  • the healthy subject or patient suffering from MM is a human being.
  • the patient has just been diagnosed with MM.
  • the patient with MM is diagnosed as having relapsed.
  • the cultured MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors are harvested. Harvesting is typically done by trypsinization, then washing. Other agents allowing the detachment of adherent cells without damage can replace trypsin.
  • the harvested MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors are then co-cultured with primary CD138+ plasma cells from a patient suffering from MM under conditions allowing the formation of spheroids.
  • plasma cells we mean cells of the immune system derived from bone marrow (BM) expressing the CD138+ marker. In the case of MM, plasma cells express the markers CD38+ and CD138+.
  • spheroids we mean a grouping of cells linked together in the three dimensions of space.
  • a spheroid comprises 500 to 750,000 cells, or even 1,000 to 500,000 cells.
  • the spheroids of the composition according to the invention have an average diameter of between 50 pm and 750 pm, preferably between 100 pm and 500 pm.
  • the cells are not cultured in the presence of a hydrogel or a solid support (ossified tissue or other scaffold).
  • the cells are not cultured with an exogenous supply of complex biomolecules (e.g. cytokine, growth factors, hormones, etc.).
  • complex biomolecules e.g. cytokine, growth factors, hormones, etc.
  • the spheroids according to the invention are formed by self-organization of MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors with plasma cells.
  • the spheroids according to the invention are therefore formed without hydrogel, support or exogenous supply of complex biomolecule. This approach makes it possible to limit bias and get closer to what is observed in vivo.
  • the use of hydrogel, support or exogenous supply of complex biomolecule can alter the behavior of certain products and thus lead to the underestimation or overestimation of the action potential of these products in vivo.
  • the primary CD138+ plasma cells come from a patient suffering from MM different from the patient suffering from MM, or from the healthy subject, from which the cultured MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors were obtained.
  • the production process then makes it possible to obtain heterologous human multiple myeloma (MM) spheroids.
  • MM multiple myeloma
  • the model of heterologous human MM spheroids obtained makes it possible to combine a stroma from a patient or healthy subject with the tumor plasma cells of another patient suffering from MM in order to study the impact of MM plasma cells on a healthy stroma and reveal therapeutic targets.
  • healthy plasma cells can be associated with MM stroma in order to study the impact of MM stroma on healthy plasma cells and reveal therapeutic targets.
  • the MSCs, endothelial cells, endothelial progenitors and primary CD138+ plasma cells were obtained from the same patient suffering from MM.
  • the production process then makes it possible to obtain autologous human multiple myeloma (MM) spheroids. Since bone marrow collection is an invasive procedure, preferably MSCs, endothelial cells, progenitors endothelial cells and primary CD138+ plasma cells were obtained from the same bone marrow sample from said patient suffering from MM.
  • This embodiment presents the additional difficulty of successfully preserving the primary CD138+ plasma cells, and preserving their viability, for the duration of the culture of the MSCs, endothelial cells, and endothelial progenitors, that is to say for 3 to 30 days of culture and usually about two weeks. Indeed, to be able to constitute autologous spheroids without resorting to a new bone marrow sample in the patient suffering from MM, it is necessary to freeze the primary CD138+ plasma cells while ensuring optimal viability of these plasma cells during the culture of the spheroids which follows.
  • the primary CD138+ plasma cells obtained from the same sample from the patient as the MSCs, endothelial cells, and endothelial progenitors were preserved, before co-culture, by freezing at a temperature less than or equal to - 70°C, preferably less than or equal to -75°C or even -80°C, in a cryopreservation medium.
  • This cryopreservation medium can be a medium consisting of 90% FCS + 10% DMSO (v/v), or 90% human albumin solution at 4% + 10% DMSO (v/v), or solutions of commercial cryopreservation such as Cryostor® CS10 (Sigma-Aldrich C2874).
  • the freezing of the primary CD138+ plasma cells is carried out in a time interval not exceeding 2 hours after the isolation of the primary CD138+ plasma cells from the bone marrow sample.
  • the co-culture of MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors with primary CD138+ plasma cells is done in a ULA (Ultra-Low Adherence) plate in order to promote the formation of spheroids.
  • the primary CD138+ plasma cells and MSCs are co-cultured with a number ratio of 1:1 to 4:1, preferably a ratio of approximately 2:1.
  • the co-culture is carried out for 4 to 14 days, for example 4 to 10 days, preferably for 6 to 8 days or even approximately 7 days.
  • the co-culture step is carried out with agitation, preferably light agitation.
  • the culture medium is for example an RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum (FBS), a minimal essential medium a (MEM a), or preferably, an Endothelial Growth Medium 2 medium (EGM2, from Promocell) supplemented 2% FCS or platelet lysate (LP).
  • FBS fetal calf serum
  • MEM a minimal essential medium a
  • EGF2 Endothelial Growth Medium 2 medium
  • LP platelet lysate
  • the cells are not cultured with an exogenous supply of complex biomolecules (e.g. cytokine, growth factors, hormones, etc.).
  • the invention also relates to the spheroids obtained or capable of being by the above spheroid production process.
  • These multiple myeloma (MM) spheroids human include stroma, vascular compartment and CD138+ plasma cells from a patient with MM.
  • the spheroids are preferably autologous, obtained by co-culture of MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors with primary CD138+ plasma cells from the same patient suffering from MM, preferably from the same sample.
  • the spheroids can also be heterologous in the case where the primary CD138+ plasma cells come from a patient with MM different from the patient with MM or healthy subject from which the cultured MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors were obtained.
  • the subject of the invention is the use of autologous multiple myeloma spheroids for the selection of a therapeutic treatment adapted to the patient suffering from MM, that is to say for the selection of a therapeutic treatment to which a patient suffering from multiple myeloma (MM) is likely to respond.
  • MM multiple myeloma
  • MM preferably as representative as possible of the patient's tumors
  • the spheroid models, preferably autologous, according to the invention can be used to study the responses of the tumor tissue of the patient suffering from MM (that from which the cells used to constitute the spheroids come) to different treatments or combinations of treatments.
  • the objective is to select a therapeutic treatment to which the patient is most likely to respond.
  • treatment we mean here achieving, partially or substantially, one or more of the following results: partially or completely reducing the extent of the disease, improving a clinical symptom or an indicator associated with the disease, delaying, inhibit or prevent the progression of the disease, or partially or completely delay, inhibit or prevent the occurrence of a relapse of the disease.
  • subject means here a human being suffering from multiple myeloma.
  • the invention also includes a method of selecting a therapeutic treatment to which a patient suffering from multiple myeloma (MM) is likely to respond thanks to autologous spheroids from said patient.
  • This selection process includes:
  • said at least one drug candidate is selected as a therapeutic treatment to which the patient suffering from MM is likely to respond if the viability of the measured myeloma plasma cells is reduced in relation to the viability of myeloma plasma cells obtained from autologous spheroids. cultured in control conditions (i.e. without the addition of a drug candidate or with the addition of a control buffer), or cultured in the presence of at least one other drug candidate.
  • the culture of the spheroids is carried out under the same conditions as defined previously in the process for producing autologous spheroids, except for the addition of said at least one drug candidate.
  • the selection method includes the preparation of autologous spheroids according to the method of the invention.
  • the MSCs, endothelial cells, endothelial progenitors and plasma cells constituting the autologous spheroids come from the same patient, preferably from the same bone marrow sample.
  • This selection process makes it possible to test the effectiveness of a drug candidate, or a combination of drugs.
  • the drug candidate, or the combination of drugs are added to the spheroid culture medium between the time of spheroid formation and up to 48 hours after their formation, and the culture is continued for a period of at least 3 days, for example 4 to 10 days, preferably for 6 to 8 days or even about 7 days.
  • a control culture is carried out, without the presence of drug candidate or in the presence of buffer, under the same culture conditions as in the presence of said at least one drug candidate.
  • drugs or drug candidates that can be used for the treatment of MM include melphalan, lenalidomide, bortezomib, dexamethasone, C34 (compound of formula (I) as described in application WO 2018/115476 A1,
  • the spheroids are then harvested and dissociated mechanically, for example in a thermomixer and/or by repeated aspiration and discharge using a micropipette, with or without the aid of one or more chemical agent(s).
  • s such as trypsin, collagenase, or AccuMax dissociation solution (Capricorn Scientific GmbH).
  • the dissociation of the spheroids can be carried out by incubation of the spheroids in a dissociation solution (comprising a protease and/or collagenase, and preferably comprising a combination of protease, collagenase and DNase, for example the AccuMax solution) with stirring (for example example in a thermomixer at 37°C and at 1200-1500 rpm or around 1400 rpm, for around 10 min), then the dissociation of the spheroids by aspiration/discharge using a micropipette, and the harvesting of the cells dissociated (for example by centrifugation).
  • a dissociation solution comprising a protease and/or collagenase, and preferably comprising a combination of protease, collagenase and DNase, for example the AccuMax solution
  • stirring for example example in a thermomixer at 37°C and at 1200-1500 rpm or around 1400 rpm,
  • the cells are then marked with markers making it possible to identify myeloma plasma cells, for example, with fluorochromes associated with specific antibodies such as CD38 to mark plasma cells in particular, and CD138 to identify CD38+ CD138+ myeloma plasma cells.
  • the cells are then resuspended and filtered before being analyzed by flow cytometry (FACS).
  • the fluorochrome markers associated with specific antibodies can be, for example, CD38 FITC and CD138 AF700.
  • the suspension and labeling solution is preferably a MACS solution and the cells are preferably filtered at 70 pm.
  • the viability of myeloma plasma cells is compared between the different culture conditions (control condition or with at least one drug candidate), a reduced viability of myeloma plasma cells compared to the control being the sign of a promising treatment.
  • the spheroids can be generated in approximately 2 weeks, on average, and the selection of a treatment adapted to the patient can be carried out in approximately 1 week from obtaining the spheroids, which represents a total of 3 weeks, as a general rule, to be able to define a personalized treatment for the patient with MM.
  • Figure 1 presents the viability rate of MM plasma cells within heterologous spheroids following their culture for 7 days with one or more drug candidates (melphalan 10pM, lenalidomide 10pM, C34 5pM, combination melphalan 10pM + C34 5pM, combination lenalidomide 10pM + C34 5pM) as well as a control condition.
  • the MM MSCs MM91, MM97, MM100
  • MM plasma cells (P64/65, P66) are the plasma cell component of the spheroid. Each number corresponds to a given MM patient.
  • Figure 2 presents the level of live MM plasma cells within spheroids following their culture for 7 days with one or more drug candidates (Carfilzomib 5-50nM, Pomalidomide 1 -1 OpM, Dexamethasone 1 pM, Isatuximab 1 pg /ml, Daratumumab 1 pg/ml) as well as a control condition (NT).
  • drug candidates Carfilzomib 5-50nM, Pomalidomide 1 -1 OpM, Dexamethasone 1 pM, Isatuximab 1 pg /ml, Daratumumab 1 pg/ml
  • NT control condition
  • DCD Daratumumab/Carfilzomib/Dexamethasone
  • DPD Daratumumab/Pomalidomide/Dexamethasone
  • ICD Isatuximab/Carfilzomib/Dexamethasone
  • IPD Isatuximab/Pomalidomide/Dexamethasone
  • CD Carfilzomib/Dexamethasone
  • PD Pomalidomide/Dexamethasone
  • Example 1 Studies of different plasma cell freezing protocols and cell viability study
  • the inventors sought to select a plasma cell freezing/thawing protocol that was most effective for preserving the viability of plasma cells. They studied this impact by quantifying their viability after thawing by counting with trypan blue on the Malassez cell.
  • MM myeloma
  • FBS 90% fetal calf serum
  • DMSO 10%DMSO
  • HSA human serum albumin
  • the freezing time was 31 days on average.
  • the plasma cells were then thawed and then counted with trypan blue using the Malassez cell.
  • Example 2 Culture of heterologous and autologous spheroids and study of cell viability by flow cytometry
  • the inventors sought to show the low impact on the viability of plasma cells of the stages of freezing and thawing, of culture within the spheroids and of dissociation of the spheroids before their marking. They studied this impact by quantifying their viability by flow cytometry. To do this, they sought to mark the cells with anti-CD38 and anti-CD138 antibodies coupled to fluorochromes to specifically select MM plasma cells.
  • MM myeloma
  • the MM plasma cells are separated and then counted in Malassez cells. Then they are frozen in CRYOSTOR or used directly fresh for heterologous cocultures.
  • MM total marrow cells are seeded according to their starting number and the cells are incubated at a temperature of 37°C and under an atmosphere with 5% carbon dioxide for approximately 2 weeks. Once confluence is reached, mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), endothelial cells, and endothelial progenitors are treated with trypsin and enumerated.
  • MSCs mesenchymal stem/stromal cells
  • endothelial cells endothelial progenitors are treated with trypsin and enumerated.
  • the MSC cells, endothelial cells and endothelial progenitors treated with trypsin and fresh or thawed plasma cells are suspended in 50pL of RPMI medium (10% FCS, 1% PS). a ratio of 1 MSC to 2 plasma cells.
  • the cells are then incubated at a temperature of 37°C and an atmosphere with 5% carbon dioxide with stirring.
  • 150pL of complete RPMI medium are added after 24 hours of incubation and the medium is renewed twice a week by removing 100pL of culture supernatant and adding 100pL of complete RPMI medium.
  • the cells from the spheroids are mechanically dissociated at 1400rpm with AccuMax® and then transferred to a tube suitable for flow cytometry and washed with PBS and labeled with anti-CD38 FITC and anti-CD138 AF700 antibodies in MACS buffer. The cells are then incubated at 4°C for 30 minutes, washed and resuspended in MACS buffer medium and filtered at 70 pm, labeled with DAPI before passing into flow cytometry.
  • the inventors observed that quantification of the viability of MM plasma cells was possible with this protocol and that the viability of MM plasma cells remained high after the manipulations of this protocol, even after 14 days of co-culture.
  • Example 3 3D spheroids with plasma cells from a multiple myeloma patient and response to treatment with melphalan
  • the inventors sought to demonstrate the viability of plasma cells within the spheroids as well as the accessibility of these for the therapeutic molecules tested.
  • MM multiple myeloma
  • the MM plasma cells are separated and then counted in Malassez cells. Then they are used freshly for cocultures or frozen in CRYOSTOR.
  • MM total marrow cells are seeded according to their starting number and the cells are incubated at a temperature of 37°C and under an atmosphere with 5% carbon dioxide for approximately 2 weeks. Once confluence is reached, mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), endothelial cells, and endothelial progenitors are treated with trypsin and enumerated.
  • MSCs mesenchymal stem/stromal cells
  • endothelial cells endothelial progenitors are treated with trypsin and enumerated.
  • the MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors treated with trypsin and fresh or thawed plasma cells are suspended in 50pL of RPMI medium (10% FCS, 1% PS). ratio of 1 MSC to 2 plasma cells. The cells are then incubated at a temperature of 37°C and an atmosphere with 5% carbon dioxide with stirring. 150pL of RPMI medium are added after 24 hours of incubation and the medium is renewed twice a week by removing 100pL of supernatant.
  • a 10 pm treatment of melphalan is added to the culture medium of the spheroids 48 hours after their formation and the culture is continued for 14 days. This selection process is completed by a control situation, without the presence of drug candidate. A part of the cultures is stopped after 7 (D+7) and 1 1 (D+11) days to analyze the viability of the plasma cells while the rest of the cultures are stopped after 14 days of culture (D+14) .
  • the cells from the spheroids are mechanically dissociated at 1400rpm with AccuMax® and then transferred to a tube suitable for flow cytometry and washed with PBS and labeled with the specific antibodies CD38 FITC and CD138 AF700 in MACS buffer. The cells are then incubated at 4°C for 30 minutes, washed and resuspended in MACS buffer medium and filtered at 70 pm, and finally marked with the viability marker DAPI, before passing into flow cytometry.
  • the viability of plasma cells in untreated MM spheroids increases from 50% on D+7 and D+1 1 to 60% on D+14 while plasma cells in MM spheroids treated with 10pM of melphalan have a viability of 5% on D+ 7, less than 5% on D+1 1 and less than 10% on D+14.
  • the inventors therefore show that the viability of plasma cells in untreated spheroids is greater (D7, D11, D14) than in the case of 2D cultures where the primary plasma cells do not survive beyond a few days.
  • MM myeloma
  • the MM plasma cells are separated and then counted in Malassez cells. Then they are used fresh or frozen at - 80°C in CRYOSTOR.
  • the MM total marrow cells are seeded according to their starting number and the cells are incubated at a temperature of 37°C and under an atmosphere with 5% carbon dioxide for approximately 2 weeks. Once confluence is reached, mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), endothelial cells, and endothelial progenitors are treated with trypsin and enumerated.
  • MSCs mesenchymal stem/stromal cells
  • endothelial cells endothelial cells
  • endothelial progenitors are treated with trypsin and enumerated.
  • the MSCs, endothelial cells and endothelial progenitors treated with trypsin and fresh or thawed plasma cells are suspended in 50pL of RPMI medium (10% FCS, 1% PS). ratio of 1 MSC to 2 plasma cells. The cells are then incubated at a temperature of 37°C and an atmosphere with 5% carbon dioxide with stirring. 150pL of RPMI medium are added after 24 hours of incubation and the medium is renewed twice a week by removing 1 OOpL of culture supernatant and adding 1 OOpL of RPMI medium.
  • the drug candidate, the candidate combination or the combination of candidates are added to the culture medium of the spheroids between the time of their formation and 48 hours after their formation and the culture is continued for 7 days. This selection process is completed by a control situation, without the presence of drug candidate, of the same culture duration as in the presence of drug candidate.
  • the cells from the spheroids are mechanically dissociated at 1400 rpm with AccuMax® and then transferred to a tube suitable for flow cytometry and washed with PBS and labeled with the specific antibodies CD38 FITC and CD138 AF700 in MACS buffer. The cells are then incubated at 4°C for 30 minutes, washed and resuspended in MACS buffer medium and filtered at 70 pm, and finally labeled with DAPI before passing into flow cytometry.
  • Figure 1 presents the viability rate of MM plasma cells within heterologous spheroids following their culture for 7 days with the different potential treatments tested as well as a control condition.
  • the MM MSCs (MM91, MM97, MM100) represent the stroma component of the spheroid.
  • MM plasma cells (P64/65, P66) are the plasma cell component of the spheroid. Each number corresponds to a given MM patient.
  • Figure 1 clearly shows the difference in behavior of plasma cells in the different conditions and the effectiveness of the combined treatments melphalan + C34 and lenalidomide + C34 in reducing the viability of MM plasma cells.
  • Example 5 Response of spheroids to different drug candidates and combination of candidates
  • Whole marrow cells from patients with multiple myeloma are first seeded in flasks in EGM2 medium according to their starting number in the tube. The cells are incubated at 37°C and 5% CO2 for approximately 2 weeks.
  • Plasma cells from patients with multiple myeloma are first counted in Malassez cell and Trypan blue.
  • the cells are either frozen in Cryostor (autologous culture) or used directly for heterologous spheroid coculture.
  • the MSCs to be used for co-culture are trypsinized and then counted.
  • the plate is incubated at 37°C and 5% CO2 with orbital shaking for 24 hours at 73 rpm.
  • Carfilzomib is used at a concentration between 5-50nM
  • Pomalidomide is used at a concentration between 1 -1 OpM
  • Dexamethasone is used at a concentration between 1 pM
  • Isatuximab is used at a concentration between 1 pg/ml
  • Daratumumab is used at a concentration between 1 pg/ml.
  • Figure 2 presents the viability rate of MM plasma cells within heterologous spheroids following their culture for 7 days with the different treatments tested as well as a control condition (NT). The different treatments tested are indicated on the abscissa.
  • DCD Daratumumab/Carfilzomib/Dexamethasone
  • DPD Daratumumab/Pomalidomide/Dexamethasone
  • ICD Isatuximab/Carfilzomib/Dexamethasone
  • IPD Isatuximab/Pomalidomide/Dexamethasone
  • CD Carfilzomib/Dexamethasone
  • PD Pomalidomide/Dexamethasone.

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Abstract

La présente invention concerne le procédé de production d'un modèle tridimensionnel (3D) de myélome multiple (MM), sous forme de sphéroïdes, par co-culture de cellules souches/ stromales mésenchymateuses, de progéniteurs endothéliaux et de plasmocytes primaires de patient(s) atteint(s) de MM. La présente invention concerne également les sphéroïdes obtenus par ledit procédé et leurs utilisations.

Description

TITRE : Procédé de production d’un modèle de myélome multiple humain en trois dimensions
La présente invention concerne le procédé de production d’un modèle tridimensionnel (3D) de myélome multiple (MM), sous forme de sphéroïdes, par co-culture de cellules souches/stromales mésenchymateuses, de progéniteurs endothéliaux et de plasmocytes primaires de patient(s) atteint(s) de MM. La présente invention concerne également les sphéroïdes obtenus par ledit procédé et leurs utilisations.
Le myélome multiple (MM) est une hémopathie maligne, aussi appelé cancer de la moelle osseuse. Il se caractérise par la prolifération excessive dans la moelle osseuse d’un type de globule blanc, le plasmocyte, devenu anormal. Les plasmocytes sont des cellules du système immunitaire dérivées de la moelle osseuse (MO) qui produisent des anticorps dans le but de protéger l’organisme contre des attaques extérieures (bactéries, virus). Pendant le développement, des anomalies génétiques (délétion, translocation chromosomique) peuvent survenir, transformant ainsi des plasmocytes sains en plasmocytes malins. A l’état normal, ces plasmocytes circulent dans le sang alors que dans la pathologie du MM elles reviennent dans la moelle osseuse où elles causent des dommages à plusieurs niveaux.
Le myélome multiple reste une maladie incurable malgré de récents progrès thérapeutiques remarquables. La prise en charge permet actuellement de prévenir ou soulager les symptômes et les complications, en détruisant les plasmocytes pathologiques et en ralentissant la progression de la maladie.
A ce jour, le myélome multiple souffre de l’absence de modèles précliniques pertinents. En effet, les modèles murins sont coûteux, chronophages, et non représentatifs de la pathologie humaine. Les modèles en deux dimensions (2D) standards ne permettent pas la viabilité des plasmocytes primaires de patients et privilégient l’utilisation de lignées cellulaires, ce qui rend ces modèles trop éloignés de la physiopathologie de la maladie du MM.
La reproduction de moelle osseuse ex vivo humaine adulte est de plus en plus décrite dans la littérature afin de pallier aux modèles animaux qui sont coûteux, consommateurs en temps et tributaires de la barrière des espèces. Des études ont commencé à mettre en évidence des modèles 3D de moelle osseuse ex vivo humaine regroupant les compartiments mésenchymateux et vasculaire, généralement à partir de cellules issues de lignées. Par exemple, le compartiment vasculaire, jouant un rôle actif dans la prolifération des cellules souches hématopoïétiques (CSH), est souvent incorporé par l’intermédiaire de lignées cellulaires endothéliales de type HlIVEC. D’autres modèles nécessitent une étape chez la souris pour permettre la vascularisation ou des approches fonctionnelles. En outre, la demi-vie courte des plasmocytes ne permet pas leur incorporation de manière autologue dans les modèles 3D actuels et oblige à les ignorer ou à ajouter des lignées de plasmocytes tumoraux, ce qui ne permet pas une réponse pertinente du modèle par rapport au patient.
Les inventeurs ont créé un nouveau modèle tissulaire 3D humain de myélome multiple. Il comprend le compartiment mésenchymateux, le compartiment vasculaire et les plasmocytes, obtenus à partir de prélèvement(s) de patient(s) atteint(s) de myélome multiple, sans utilisation de lignée cellulaire. La maintenance de la viabilité des plasmocytes en coculture sur plus de 14 jours a notamment été résolue. Cela permet de générer un modèle ex vivo préclinique totalement humain de myélome multiple, pertinent génétiquement pour ledit patient, et comportant les compartiments mésenchymateux, vasculaire et plasmocytaire sous forme de sphéroïde.
Ce modèle permet d’envisager une avancée dans la médecine personnalisée grâce à la constitution rapide d’un modèle représentatif des tissus tumoraux de la moelle osseuse de chaque patient.
Description détaillée de l’invention
Procédé de production de sphéroïdes de myélome multiple humain
L’invention concerne un procédé de production de sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain, comprenant : a. La culture de cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM), de cellules endothéliales et de progéniteurs endothéliaux dans un milieu de culture ; b. La récolte des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux cultivés ; et c. La co-culture des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux récoltés avec des plasmocytes primaires CD138+ d’un patient atteint de MM dans des conditions permettant la formation de sphéroïdes.
Par « cellules souches mésenchymateuses », aussi appelées « cellules stromales mésenchymateuses », on entend des cellules souches d'origine mésodermique. Elles sont caractérisées phénotypiquement par la co-expression d'un certain nombre de marqueurs tels que par exemple CD73, CD90, CD105, CD146, et l'absence d'expression d'autres marqueurs, en particulier le CD45, le CD31 et le CD34. Elles peuvent être issues de la moelle osseuse, du tissu adipeux, ou du sang de cordon ombilical. Les cellules souches ou stromales mésenchymateuses sont d’origine humaine et proviennent d’un patient atteint de MM ou d’un sujet sain. Dans un mode préférentiel, les cellules souches/ stromales mésenchymateuses mises en culture à l’étape a. sont des cellules primaires.
Par « progéniteurs endothéliaux » on entend des cellules engagées dans la différenciation endothéliale mais qui ne sont pas encore reconnaissable comme cellules endothéliales au microscope. Elles sont caractérisées phénotypiquement par l’expression d'un certain nombre de marqueurs tels que par exemple CD133, CD34, CD31 , VEGFR2.
Par « cellules endothéliales » on entend des cellules complètement différenciées dans la voie endothéliale et donc reconnaissables comme cellules endothéliales au microscope. Elles sont caractérisées phénotypiquement par l’expression d'un certain nombre de marqueurs tels que par exemple CD31 , VE-Cadherine, von Willebrand factor, VEGFR2.
Les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales ont la capacité de s’organiser en réseau de cellules endothéliales, ou encore réseau vasculaire, et donc de s’organiser en vaisseaux.
Dans un mode préférentiel, les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales mis en culture à l’étape a) sont des cellules primaires. Les progéniteurs endothéliaux et des cellules endothéliales peuvent par exemple être obtenus à partir de cellules mononuclées de la moelle osseuse.
Dans un mode de réalisation, les CSM, les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux ont été obtenus à partir d’un même sujet, c’est-à-dire d’un même sujet sain ou d’un même patient atteint de MM. De préférence, les CSM, les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux ont été obtenus à partir d’un seul ou d’un même prélèvement, en particulier un prélèvement de moelle osseuse, à partir dudit sujet sain ou patient atteint de MM.
Par « cellule primaire », on entend une cellule directement issue d’un tissu et/ou d’un prélèvement de cellules d’un individu.
Le terme « culture » se rapporte à la sélection et à la multiplication des cellules cultivées.
Dans un mode de réalisation du procédé, à l’étape a), les cellules souches/ stromales mésenchymateuses (CSM), les progéniteurs endothéliaux et les cellules endothéliales sont cultivées conjointement dans un même milieu de culture et, de préférence, dans un même contenant de culture. Après extraction de la moelle brute, les cellules sont ensemencées par exemple à une densité de 50 000 cellules/cm2 dans des flasques. Les trois types cellulaires coexistent et prolifèrent dans cette culture.
Dans un mode de réalisation la culture a lieu en 2 dimensions (2D), sous forme de monocouche au moins en partie adhérente. La culture se déroule de préférence jusqu’à confluence des cellules. La culture dure typiquement pendant 3 à 30 jours, de préférence pendant 5 à 25 jours, ou encore 10 à 20 jours, 12 à 16 jours, 13 à 15 jours, environ 2 semaines.
De préférence, les cellules ne sont pas cultivées en présence d’un hydrogel ou d’un support solide (tissus ossifié ou autre scaffold).
Par « hydrogel », on entend un gel dans lequel l'agent gonflant est l'eau. La matrice d'un hydrogel est généralement un réseau de polymères. Comme hydrogel on peut citer notamment le Matrigel, ils peuvent être formés à base de fibrine, à base de collagène, d’agarose, de gélatine, de polymère synthétique ou d’un mélange de ceux-ci.
De préférence, les cellules ne sont pas cultivées avec un apport exogène de biomolécules complexes (par exemple cytokine, facteurs de croissance, hormones).
Par « milieu pour la culture », on entend un milieu adapté pour la culture de cellules souches/stromales mésenchymateuses, progéniteurs endothéliaux et cellules endothéliales. Le milieu de culture est par exemple un milieu RPMI supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF), un milieu essentiel minimal a (MEM a), ou un milieu Endothelial cell Growth Medium 2 (EGM2, de Promocell) supplémenté de 2% de SVF ou de lysat plaquettaire (LP). Il peut se présenter sous différentes formes mais est de préférence liquide et permet la culture de cellules eucaryotes, en particulier de cellules de mammifères et plus particulièrement de cellules humaines.
Selon l’invention, le sujet sain ou patient atteint de MM est un être humain. Selon certains modes de réalisation, le patient vient d’être diagnostiqué comme atteint de MM. Selon certains modes de réalisation, le patient atteint de MM est diagnostiqué en rechute.
A l’issue de l’étape de culture a), les CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux cultivés sont récoltés. La récolte se fait typiquement par trypsination, puis lavage. D’autres agents permettant le décollement des cellules adhérentes sans endommagement peuvent remplacer la trypsine.
Les CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux récoltés sont ensuite co-cultivés avec des plasmocytes primaires CD138+ d’un patient atteint de MM dans des conditions permettant la formation de sphéroïdes. Par « plasmocytes » on entend des cellules du système immunitaire dérivées de la moelle osseuse (MO) exprimant le marqueur CD138+. Dans le cas du MM, les plasmocytes expriment les marqueurs CD38+ et CD138+.
Par « sphéroïdes », on entend un regroupement de cellules liées entre elles dans les trois dimensions de l’espace. De préférence un sphéroïde comprend de 500 à 750 000 cellules, ou encore de 1 000 à 500 000 cellules. Les sphéroïdes de la composition selon l’invention ont un diamètre moyen compris entre 50 pm et 750 pm, de préférence compris entre 100 pm et 500 pm.
De préférence, les cellules ne sont pas cultivées en présence d’un hydrogel ou d’un support solide (tissus ossifié ou autre scaffold).
De préférence, les cellules ne sont pas cultivées avec un apport exogène de biomolécules complexes (par exemple cytokine, facteurs de croissance, hormones, etc...).
En effet, les sphéroïdes selon l’invention se forment par auto-organisation des CSM, des cellules endothéliales et des progéniteurs endothéliaux avec les plasmocytes. Les sphéroïdes selon l’invention se forment donc sans hydrogel, support ou apport exogène de biomolécule complexe. Cette approche permet de limiter les biais et se rapprocher davantage de ce qui est observé in vivo. L’utilisation d’hydrogel, de support ou d’apport exogène de biomolécule complexe peut altérer le comportement de certains produits et ainsi mener à la sous-estimation ou surestimation du potentiel d’action de ces produits in vivo.
Selon un mode de réalisation, les plasmocytes primaires CD138+ proviennent d’un patient atteint de MM différent du patient atteint de MM, ou du sujet sain, à partir duquel les CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux cultivés ont été obtenus. Le procédé de production permet alors l’obtention de sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain hétérologues. Le modèle de sphéroïdes de MM humain hétérologues obtenu permet de combiner un stroma d’un patient ou sujet sain avec les plasmocytes tumoraux d’un autre patient atteint de MM afin d’étudier l’impact de plasmocytes MM sur un stroma sain et révéler des cibles thérapeutiques. Inversement, des plasmocytes sains peuvent être associés à un stroma MM afin d’étudier l’impact d’un stroma MM sur des plasmocytes sains et révéler des cibles thérapeutiques.
Selon un autre mode de réalisation, les CSM, cellules endothéliales, progéniteurs endothéliaux et plasmocytes primaires CD138+ ont été obtenus à partir d’un même patient atteint de MM. Le procédé de production permet alors l’obtention de sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain autologues. Le prélèvement de moelle osseuse étant une procédure invasive, de préférence, les CSM, cellules endothéliales, progéniteurs endothéliaux et plasmocytes primaires CD138+ ont été obtenus à partir d’un même prélèvement de moelle osseuse dudit patient atteint de MM.
Ce mode de réalisation présente la difficulté supplémentaire de réussir à conserver les plasmocytes primaires CD138+, et préserver leur viabilité, le temps de la culture des CSM, cellules endothéliales, et progéniteurs endothéliaux, c’est-à-dire pendant 3 à 30 jours de culture et généralement environ deux semaines. En effet pour pouvoir constituer des sphéroïdes autologues sans recourir à un nouveau prélèvement de moelle osseuse chez le patient atteint de MM, il est nécessaire de congeler les plasmocytes primaires CD138+ tout en assurant une viabilité optimale de ces plasmocytes au cours de la culture des sphéroïdes qui suit.
Ainsi, de préférence, les plasmocytes primaires CD138+ issus d’un même prélèvement chez le patient que les CSM, cellules endothéliales, et progéniteurs endothéliaux, ont été conservés, avant mise en co-culture, par congélation à une température inférieure ou égale à -70°C, de préférence inférieure ou égale à -75°C ou encore à -80°C, dans un milieu de cryopréservation. Ce milieu de cryopréservation peut être un milieu constitué de 90% SVF + 10% DMSO (v/v), ou de 90% de solution d’albumine humaine à 4 % + 10% DMSO (v/v), ou des solutions de cryopréservation commerciales comme par exemple Cryostor® CS10 (Sigma-Aldrich C2874). De préférence, la congélation des plasmocytes primaires CD138+ est réalisée dans un intervalle de temps n’excédant pas 2h après l’isolement des plasmocytes primaires CD138+ à partir du prélèvement de moelle osseuse.
La co-culture des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux avec les plasmocytes primaires CD138+ se fait en plaque ULA (Ultra-Low Adherence) afin de favoriser la formation de sphéroïdes. Les plasmocytes primaires CD138+ et les CSM sont mis en co-culture avec un ratio, en nombre, de 1 :1 à 4 :1 , de préférence un ratio d’environ 2 :1 . La co-culture est réalisée pendant 4 à 14 jours, par exemple 4 à 10 jours, de préférence pendant 6 à 8 jours ou encore environ 7 jours. De préférence l’étape de co-culture est réalisée sous agitation, de préférence une faible agitation.
Le milieu de culture est par exemple un milieu RPMI supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF), un milieu essentiel minimal a (MEM a), ou de préférence, un milieu Endothelial Growth Medium 2 (EGM2, de Promocell) supplémenté de 2% de SVF ou de lysat plaquettaire (LP). De préférence, les cellules ne sont pas cultivées avec un apport exogène de biomolécules complexes (par exemple cytokine, facteurs de croissance, hormones, etc...).
L’invention concerne aussi les sphéroïdes obtenus ou susceptibles d’être par le procédé de production de sphéroïdes ci-dessus. Ces sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain comprennent un stroma, un compartiment vasculaire et des plasmocytes CD138+ d’un patient atteint de MM.
Les sphéroïdes sont de préférence autologues, obtenus par co-culture de CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux avec des plasmocytes primaires CD138+ issus d’un même patient atteint de MM, de préférence issus d’un même prélèvement.
Les sphéroïdes peuvent aussi être hétérologues dans le cas où les plasmocytes primaires CD138+ proviennent d’un patient atteint de MM différent du patient atteint de MM ou sujet sain à partir duquel les CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux cultivés ont été obtenus.
Utilisation des sphéroïdes
L’invention a pour objet l’utilisation de sphéroïdes autologues de myélome multiple pour la sélection d’un traitement thérapeutique adapté au patient atteint de MM, c'est à dire pour la sélection d’un traitement thérapeutique auquel un patient atteint de myélome multiple (MM) est susceptible de répondre.
En effet la construction d’un modèle 3D de MM le plus représentatif possible des tumeurs du malade permet un suivi clinique et une médecine personnalisée. Les modèles sphéroïdes, de préférence autologues, selon l’invention peuvent être utilisés afin d’étudier les réponses du tissu tumoral du patient atteint de MM (celui dont proviennent les cellules utilisées pour constituer les sphéroïdes) à différents traitements ou combinaison de traitements. Ainsi l’objectif est de sélectionner un traitement thérapeutique auquel le patient est le plus susceptible de répondre.
Par « traitement » ou « traiter », on entend ici atteindre, partiellement ou substantiellement, un ou plusieurs des résultats suivants : réduire partiellement ou totalement l'étendue de la maladie, améliorer un symptôme clinique ou un indicateur associé à la maladie, retarder, inhiber ou prévenir la progression de la maladie, ou partiellement ou totalement retarder, inhiber ou prévenir la survenue d'une rechute de la maladie.
Par « sujet », « patient » ou « malade », on entend ici un être humain atteint de myélome multiple.
Procédé de sélection d’un traitement thérapeutique
L’invention comprend également un procédé de sélection d’un traitement thérapeutique auquel un patient atteint de myélome multiple (MM) est susceptible de répondre grâce à des sphéroïdes autologues issus dudit patient. Ce procédé de sélection comprend :
-la culture des sphéroïdes autologues dudit patient dans un milieu de culture en présence d’au moins un candidat médicament pour le traitement du MM, pendant une période d’au moins 3 jours,
- la récolte des sphéroïdes autologues et leur dissociation de manière à collecter leurs plasmocytes myélomateux,
- l’analyse de la viabilité des plasmocytes myélomateux collectés ; et
- la sélection dudit au moins un candidat médicament en tant que traitement thérapeutique auquel le patient atteint de MM est susceptible de répondre, sur la base de la viabilité mesurée des plasmocytes myélomateux collectés.
Selon un mode de réalisation, ledit au moins un candidat médicament est sélectionné en tant que traitement thérapeutique auquel le patient atteint de MM est susceptible de répondre si la viabilité des plasmocytes myélomateux mesurée est diminuée par rapport à la viabilité de plasmocytes myélomateux obtenus de sphéroïdes autologues cultivés en condition contrôle (c’est-à-dire sans ajoute de candidat médicament ou avec ajout d’un tampon témoin), ou cultivés en présence d’au moins un autre candidat médicament.
La culture des sphéroïdes se fait dans les mêmes conditions que définies précédemment dans le procédé de production de sphéroïdes autologues, si ce n’est l’ajout dudit au moins un candidat médicament. Selon un mode de réalisation, le procédé de sélection inclut la préparation de sphéroïdes autologues selon le procédé de l’invention.
Les CSM, les cellules endothéliales, les progéniteurs endothéliaux et les plasmocytes constituant les sphéroïdes autologues sont issus d’un même patient, de préférence d’un même prélèvement de moelle osseuse.
Ce procédé de sélection permet de tester l’efficacité d’un candidat médicament, ou d’une combinaison de médicaments. Le candidat médicament, ou la combinaison de médicaments sont ajoutés au milieu de culture des sphéroïdes entre le moment de la formation des sphéroïdes et jusqu’à 48h après leur formation, et la culture est poursuivie pendant une période d’au moins 3 jours, par exemple 4 à 10 jours, de préférence pendant 6 à 8 jours ou encore environ 7 jours.
En parallèle, une culture de contrôle est réalisée, sans présence de candidat médicament ou en présence de tampon, dans les mêmes conditions de culture qu’en présence dudit au moins un candidat médicament. Des exemples de médicaments ou candidats médicaments utilisables pour le traitement du MM incluent le melphalan, le lénalidomide, le bortézomib, la dexaméthasone, le C34 (composé de formule (I) tel que décrit dans la demande WO 2018/115476 A1 ,
[Chem 1 ]
Figure imgf000010_0001
Les sphéroïdes sont ensuite récoltés et dissociés mécaniquement, par exemple dans un thermomixer et/ou par une répétition d’aspirations et de refoulements à l’aide d’une micropipette, avec ou sans aide d’un ou plusieurs agent(s) chimique(s) tel(s) que la trypsine, la collagénase, ou la solution de dissociation AccuMax (Capricorn Scientific GmbH). En particulier la dissociation des sphéroïdes peut être réalisée par incubation des sphéroïdes dans une solution de dissociation (comprenant une protéase et/ou collagénase, et comprenant de préférence une association de protéase, collagénase et DNase, par exemple la solution AccuMax) sous agitation (par exemple dans un appareil thermomixer à 37°C et à 1200-1500 rpm ou encore environ 1400 rpm, pendant environ 10 min), puis la dissociation des sphéroïdes par aspiration/refoulement à l’aide d’une micropipette, et la récolte des cellules dissociées (par exemple par centrifugation).
Les cellules sont ensuite marquées avec des marqueurs permettant d’identifier les plasmocytes myélomateux, par exemple, avec des fluorochromes associés à des anticorps spécifiques tels que CD38 pour marquer notamment les plasmocytes, et CD138 pour identifier les plasmocytes myélomateux CD38+ CD138+. Les cellules sont ensuite resuspendues et filtrées avant d’être analysées par cytométrie en flux (FACS). Les marqueurs fluorochromes associés à des anticorps spécifiques peuvent être par exemple CD38 FITC et CD138 AF700. La solution de suspension et de marquage est de préférence une solution MACS et les cellules sont de préférences filtrées à 70pm. La viabilité des plasmocytes myélomateux est comparée entre les différentes conditions de culture (condition contrôle ou avec au moins un candidat médicament), une viabilité diminuée des plasmocytes myélomateux par rapport au contrôle étant le signe d’un traitement prometteur.
Ce procédé est plus rapide que l’utilisation de modèles murins et une réponse plus pertinente en raison de la proximité génétique entre le modèle et le patient, d’autant plus quand le modèle sphéroïdal est autologue. En effet, les sphéroïdes peuvent être générés en 2 semaines environ, en moyenne, et la sélection d’un traitement adapté au patient peut être réalisée en 1 semaine environ à partir de l’obtention des sphéroïdes, ce qui représente un total de 3 semaines, en règle générale, pour pouvoir définir un traitement personnalisé pour le patient atteint de MM.
Description des figures
[Fig 1 ] La Figure 1 présente le taux de viabilité de plasmocytes MM au sein de sphéroïdes hétérologues suite à leur culture pendant 7 jours avec un ou plusieurs candidats médicaments (melphalan 10pM, lénalidomide 10pM, C34 5pM, combinaison melphalan 10pM + C34 5pM, combinaison lénalidomide 10pM + C34 5pM) ainsi qu’une condition de contrôle. En abscisse, les CSM MM (MM91 , MM97, MM100) représentent la composante stromale du sphéroïde. Les plasmocytes MM (P64/65, P66) sont la composante plasmocytaire du sphéroïde. Chaque numéro correspond à un patient MM donné.
[Fig 2] La Figure 2 présente le taux de plasmocytes MM vivants au sein de sphéroïdes suite à leur culture pendant 7 jours avec un ou plusieurs candidats médicaments (Carfilzomib 5-50nM, Pomalidomide 1 -1 OpM, Dexaméthasone 1 pM, Isatuximab 1 pg/ml, Daratumumab 1 pg/ml) ainsi qu’une condition de contrôle (NT). En abscisse, les différents traitements testés :
DCD: Daratumumab/Carfilzomib/Dexamethasone,
DPD: Daratumumab/Pomalidomide/Dexaméthasone,
ICD: Isatuximab/Carfilzomib/Dexaméthasone,
IPD: Isatuximab/Pomalidomide/Dexaméthasone,
CD: Carfilzomib/Dexaméthasone,
PD: Pomalidomide/Dexaméthasone).
Exemples
Exemple 1 : Etudes de différents protocoles de congélation des plasmocytes et étude de viabilité des cellules
Dans cet exemple, les inventeurs ont cherché à sélectionner un protocole de congélation/décongélation des plasmocytes le plus efficace pour la conservation de la viabilité des plasmocytes. Ils ont étudié cet impact en quantifiant leur viabilité après décongélation en comptant au bleu trypan à la cellule de Malassez.
Suite à un prélèvement de moelle osseuse totale au diagnostic chez des patients touchés par le myélome multiple (MM), les cellules de plasmocytes MM sont séparées puis dénombrées en cellule de Malassez. Elles ont ensuite été soumises à une congélation selon un des protocoles suivant :
A : Tampon 90% sérum de veau fœtal (SVF) : 10%DMSO ; congélation -80°C immédiate
B : Tampon 90% sérum albumine humaine (HSA) : 10%DMSO ; congélation -80°C immédiate
- C : Tampon CryoStor® CS10 (Sigma-Aldrich, référence de produit C2874) ; congélation -80°C immédiate
D : Tampon CryoStor® CS 10 ; congélation -20°C pendant 2h puis -80°C
E : Tampon CryoStor® CS10 ; congélation -20°C pour la nuit puis -80°C
Le temps de congélation a été de 31 jours en moyenne.
Les plasmocytes ont été ensuite décongelés puis comptés au bleu trypan à la cellule de Malassez.
[Table 1]
Figure imgf000012_0001
Les résultats du tableau ci-dessus montrent que les conditions de congélation courantes, à savoir 90% SVF ou HSA + 10% DMSO, semblent moins efficaces en comparaison à des conditions de congélation immédiates avec CryoStor®.
Exemple 2 : Culture des sphéroïdes hétérologues et autologues et étude de viabilité des cellules par cytométrie en flux
Dans cet exemple, les inventeurs ont cherché à montrer le faible impact sur la viabilité des plasmocytes des étapes de congélation et décongélation, de culture au sein des sphéroïdes et de dissociation des sphéroïdes avant leur marquage. Ils ont étudié cet impact en quantifiant leur viabilité par cytométrie en flux. Pour cela, ils ont cherché à marquer les cellules avec des anticorps anti-CD38 et anti-CD138 couplés à des fluorochromes pour sélectionner spécifiquement les plasmocytes MM.
Suite à un prélèvement de moelle osseuse totale au diagnostic chez des patients touchés par le myélome multiple (MM), les cellules de plasmocytes MM sont séparées puis dénombrées en cellule de Malassez. Puis elles sont congelées en CRYOSTOR ou utilisés directement fraiches pour les cocultures hétérologues. Issu d’un autre patient, les cellules de moelle totale MM sont ensemencées selon leur nombre de départ et les cellules sont incubées à une température de 37°C et sous une atmosphère avec 5% de dioxyde carbone durant environ 2 semaines. Une fois la confluence atteinte, les cellules souches/ stromales mésenchymateuses (CSM), les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux sont traités à la trypsine et dénombrées.
Sur des plaques ULA (Ultra-Low Adherence) sont mise en suspension dans 50pL de milieu RPMI (10% SVF, 1 % PS) les cellules CSM, les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux traités à la trypsine et les plasmocytes frais ou décongelés dans un ratio de 1 CSM pour 2 plasmocytes. Les cellules sont ensuite incubées à une température de 37°C et une atmosphère avec 5% de dioxyde de carbone sous agitation. 150pL de milieu RPMI complet sont ajoutés après 24h d’incubation et le milieu est renouvelé 2 fois par semaine en retirant 100pL de surnageant de culture et en ajoutant 100pL de milieu RPMI complet.
Les cellules des sphéroïdes sont dissociées mécaniquement à 1400rpm avec de l’AccuMax® et puis transférées en tube adapté à la cytométrie en flux et lavées avec du PBS et marquées avec les anticorps anti-CD38 FITC et anti-CD138 AF700 en tampon MACS. Les cellules sont ensuite incubées à 4°C pendant 30 minutes, lavées et resuspendues dans un milieu tampon MACS et filtrées à 70pm, marquées au DAPI avant de passer en cytométrie en flux.
Les inventeurs ont observé que la quantification de la viabilité des plasmocytes MM était possible avec ce protocole et que la viabilité des plasmocytes MM reste haute après les manipulations de ce protocole, même après 14 jours de co-culture.
Exemple 3 : Sphéroïdes 3D avec plasmocytes d’un patient à myélome multiple et réaction au traitement avec melphalan
Dans cet exemple, les inventeurs ont cherché à démontré la viabilité des plasmocytes au sein des sphéroïdes ainsi que l’accessibilité de ceux-ci pour les molécules thérapeutiques testées. Suite à un prélèvement de moelle osseuse totale au diagnostic chez des patients touchés par le myélome multiple (MM), les cellules de plasmocytes MM sont séparées puis dénombrées en cellule de Malassez. Puis elles sont utilisés fraichement pour les cocultures ou congelées en CRYOSTOR. Les cellules de moelle totale MM sont ensemencées selon leur nombre de départ et les cellules sont incubées à une température de 37°C et sous une atmosphère avec 5% de dioxyde carbone durant environ 2 semaines. Une fois la confluence atteinte, les cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM), les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux sont traités à la trypsine et dénombrées.
Sur des plaques ULA (Ultra-Low Adherence) sont mise en suspension dans 50pL de milieu RPMI (10% SVF, 1% PS) les CSM, les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux traités à la trypsine et les plasmocytes frais ou décongelés dans un ratio de 1 CSM pour 2 plasmocytes. Les cellules sont ensuite incubées à une température de 37°C et une atmosphère avec 5% de dioxyde de carbone sous agitation. 150pL de milieu RPMI sont ajoutés après 24h d’incubation et le milieu est renouvelé 2 fois par semaine en retirant 100pL de surnageant.
Un traitement de melphalan 10pm est ajouté au milieu de culture des sphéroïdes 48h après leur formation et la culture est poursuivie pendant 14 jours. Ce procédé de sélection est complété par une situation de contrôle, sans présence de candidat médicament. Une partie des cultures est arrêté au bout de 7 (J+7) et 1 1 (J+11 ) jours pour analyser la viabilité des plasmocytes tandis que le reste des cultures est arrêté au bout de 14 jours de culture (J+14).
Les cellules des sphéroïdes sont dissociées mécaniquement à 1400rpm avec de l’AccuMax® et puis transférées en tube adapté à la cytométrie en flux et lavées avec du PBS et marquées avec les anticorps spécifiques CD38 FITC et CD138 AF700 en tampon MACS. Les cellules sont ensuite incubées à 4°C pendant 30 minutes, lavées et resuspendues dans un milieu tampon MACS et filtrées à 70pm, et enfin marquées avec le marqueur de viabilité DAPI, avant de passer en cytométrie en flux.
La viabilité des plasmocytes en sphéroïdes MM non traités passent de 50% à J+7 et J+1 1 à 60% en J+14 alors que les plasmocytes en sphéroïdes MM traités avec 10pM de melphalan ont une viabilité de 5% à J+7, moins de 5% à J+1 1 et moins de 10% en J+14.
Premièrement les inventeurs montrent donc que la viabilité des plasmocytes en sphéroïdes non-traités est plus importante (J7, J11 , J14) que dans le cas des cultures 2D où les plasmocytes primaires ne survivent pas au-delà de quelques jours.
Ensuite, les inventeurs montrent que la localisation des plasmocytes au sein des sphéroïdes n’empêche pas une forte réponse au traitement (ici melphalan 10pM). Exemple 4 : Réponse de sphéroïdes MM hétérologues à différents candidats médicaments
Suite à un prélèvement de moelle osseuse totale au diagnostic chez des patients touchés par le myélome multiple (MM), les cellules de plasmocytes MM sont séparées puis dénombrées en cellule de Malassez. Puis elles sont utilisées fraichement ou congelées à - 80°C en CRYOSTOR. Issu du même ou d’un patient différent, les cellules de moelle totale MM sont ensemencées selon leur nombre de départ et les cellules sont incubées à une température de 37°C et sous une atmosphère avec 5% de dioxyde carbone durant environ 2 semaines. Une fois la confluence atteinte, les cellules souches/ stromales mésenchymateuses (CSM), les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux sont traités à la trypsine et dénombrées.
Sur des plaques ULA (Ultra-Low Adherence) sont mise en suspension dans 50pL de milieu RPMI (10% SVF, 1% PS) les CSM, les cellules endothéliales et les progéniteurs endothéliaux traités à la trypsine et les plasmocytes frais ou décongelés dans un ratio de 1 CSM pour 2 plasmocytes. Les cellules sont ensuite incubées à une température de 37°C et une atmosphère avec 5% de dioxyde de carbone sous agitation. 150pL de milieu RPMI sont ajoutés après 24h d’incubation et le milieu est renouvelé 2 fois par semaine en retirant 1 OOpL de surnageant de culture et en ajoutant 1 OOpL de milieu RPMI.
Le candidat médicament, la candidate combinaison ou la combinaison des candidats sont ajoutés au milieu de culture des sphéroïdes entre le moment de leur formation et 48h après leur formation et la culture est poursuivie pendant 7 jours. Ce procédé de sélection est complété par une situation de contrôle, sans présence de candidat médicament, de même durée de culture qu’en présence de candidat médicament.
Les traitements testés sont les suivants :
- melphalan 10pM, lénalidomide 10pM,
- C34 5pM,
- combinaison melphalan 10pM + C34 5pM, combinaison lénalidomide 10pM + C34 5pM
Les cellules des sphéroïdes sont dissociées mécaniquement à 1400rpm avec de l’AccuMax® et puis transférées en tube adapté à la cytométrie à flux et lavées avec du PBS et marquées avec les anticorps spécifiques CD38 FITC et CD138 AF700 en tampon MACS. Les cellules sont ensuite incubées à 4°C pendant 30 minutes, lavées et resuspendues dans un milieu tampon MACS et filtrées à 70pm, et enfin marquées au DAPI avant de passer en cytométrie en flux. La Figure 1 présente le taux de viabilité de plasmocytes MM au sein de sphéroïdes hétérologues suite à leur culture pendant 7 jours avec les différents traitements potentiels testés ainsi qu’une condition de contrôle. En abscisse, les CSM MM (MM91 , MM97, MM100) représentent la composante stroma du sphéroïde. Les plasmocytes MM (P64/65, P66) sont la composante plasmocytaire du sphéroïde. Chaque numéro correspond à un patient MM donné.
La Figure 1 montre bien la différence de comportement des plasmocytes dans les différentes conditions et l’efficacité des traitements combinés melphalan + C34 et lénalidomide + C34 pour diminuer la viabilité des plasmocytes MM.
Exemple 5 : Réponse de sphéroïdes à différents candidats médicaments et combinaison de candidats
Les cellules de moelle totale de patients atteints de myélome multiple (MM), sont d’abord ensemencées dans des flasques en milieu EGM2 selon leur nombre de départ dans le tube. Les cellules sont incubées à 37°C et 5% CO2 durant environ 2 semaines.
Les cellules de plasmocytes de patients atteints de myélome multiple (MM) sont d’abord dénombrées en cellule de Malassez et bleu Trypan. Les cellules sont soit congelées en Cryostor (culture en autologue) soit utilisées directement pour la coculture hétérologue en sphéroïde.
Les CSM à utiliser pour la co-culture sont trypsinées puis dénombrées.
Sur plaque ULA 96 puits, et en milieu RPMI (10% SVF) :
- Pour chaque échantillon de plasmocytes récupérés (frais ou décongelés), un témoin (en triplicat) avec cellules seules est réalisé (50 000 plasmocytes/puits).
- Chaque échantillon de plasmocyte est co-cultivé avec chaque échantillon de CSM trypsinées (ratio 1 :2 = 50 000 CSM pour 100 000 plasmocytes par puits, 50 pL/puits)
- La plaque est incubée à 37°C et 5% CO2 sous agitation orbitale durant 24h à 73 rpm.
- 150 pL de milieu (avec médicament ou pas) sont ajoutés dans le milieu avant d’incuber la plaque ULA de nouveau. Le milieu est changé une fois par semaine par retrait de 100 pL/puits et ajout de 100 pL de milieu neuf (avec ou sans médicament). - La culture s’arrête à J7 et les sphéroïdes sont dissociées suivant le protocole décrit précédemment.
Le Carfilzomib est utilisé à une concentration comprise entre 5-50nM, le Pomalidomide est utilisé à une concentration comprise entre 1 -1 OpM, Dexaméthasone est utilisé à une concentration de 1 pM, l’Isatuximab est utilisé à une concentration de 1 pg/ml, le Daratumumab est utilisé à une concentration comprise entre 1 pg/ml.
La Figure 2 présente le taux de viabilité de plasmocytes MM au sein de sphéroïdes hétérologues suite à leur culture pendant 7 jours avec les différents traitements testés ainsi qu’une condition de contrôle (NT). En abscisse est indiqué les différents traitements testés. DCD: Daratumumab/Carfilzomib/Dexamethasone,
DPD: Daratumumab/Pomalidomide/Dexaméthasone,
ICD: Isatuximab/Carfilzomib/Dexaméthasone,
IPD: Isatuximab/Pomalidomide/Dexaméthasone,
CD: Carfilzomib/Dexaméthasone,
PD: Pomalidomide/Dexaméthasone.
A gauche du graphique, des cellules de plasmocytes congelées ont été utilisées, chaque modalité a été répétée 4 fois (n=4). A droite du graphique, des cellules de plasmocytes fraiches ont été utilisées, c’est-à-dire qu’elles n’ont pas été congelées avant d’être cocultivées pour former les sphéroïdes; ici chaque modalité a été répétée 3 fois (n=3).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production de sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain, comprenant : a. La culture de cellules souches/ stromales mésenchymateuses (CSM), de cellules endothéliales et de progéniteurs endothéliaux dans un milieu de culture ; b. La récolte des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux cultivés ; et c. La co-culture des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux récoltés avec des plasmocytes primaires CD138+ d’un patient atteint de MM dans des conditions permettant la formation de sphéroïdes.
2. Procédé de production selon la revendication 1 , dans lequel les CSM, cellules endothéliales, progéniteurs endothéliaux et plasmocytes primaires CD138+ ont été obtenus à partir d’un même patient atteint de MM.
3. Procédé de production selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les CSM, cellules endothéliales, progéniteurs endothéliaux et plasmocytes primaires CD138+ ont été obtenus à partir d’un même prélèvement de moelle osseuse dudit patient atteint de MM.
4. Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux sont cultivés à l’étape a. pendant 3 à 30 jours.
5. Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel les plasmocytes primaires CD138+ ont été conservés, avant mise en co-culture, par congélation à une température inférieure ou égale à -70°C dans un milieu de cryopréservation.
6. Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les plasmocytes primaires CD138+ et les CSM sont mis en co-culture avec un ratio d’environ 2 :1.
7. Procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la co-culture des CSM, cellules endothéliales et progéniteurs endothéliaux avec les plasmocytes primaires est réalisée pendant 4 à 14 jours.
8. Sphéroïdes de myélome multiple (MM) humain obtenus par un procédé de production selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant un stroma, un compartiment vasculaire et des plasmocytes CD138+ de patient(s) atteint(s) de MM.
9. Sphéroïdes de MM selon la revendication 8, où lesdits sphéroïdes sont des sphéroïdes autologues.
10. Utilisation de sphéroïdes autologues de myélome multiple (MM) tels que définis dans la revendication 9 pour la sélection d’un traitement thérapeutique auquel un patient atteint de MM est susceptible de répondre.
11 . Procédé de sélection d’un traitement thérapeutique auquel un patient atteint de myélome multiple (MM) est susceptible de répondre comprenant : a. La culture de sphéroïdes autologues selon la revendication 9, dans un milieu de culture en présence d’au moins un candidat médicament pour le traitement du MM, pendant une période d’au moins 3 jours ; b. La récolte des sphéroïdes autologues et leur dissociation de manière à collecter les plasmocytes myélomateux présents dans les sphéroïdes autologues ; c. L’analyse de la viabilité des plasmocytes myélomateux collectés ; et d. La sélection dudit au moins un candidat médicament en tant que traitement thérapeutique auquel le patient atteint de MM est susceptible de répondre, sur la base de la viabilité mesurée des plasmocytes myélomateux collectés.
12. Procédé de sélection d’un traitement thérapeutique selon la revendication 1 1 , dans lequel ledit au moins un candidat médicament est sélectionné en tant que traitement thérapeutique auquel le patient atteint de MM est susceptible de répondre si la viabilité des plasmocytes myélomateux mesurée est diminuée par rapport à la viabilité de plasmocytes myélomateux obtenus de sphéroïdes autologues cultivés en condition contrôle ou cultivés en présence d’au moins un autre candidat médicament.
13. Procédé de sélection d’un traitement thérapeutique selon la revendication 1 1 ou 12, dans lequel ledit au moins un candidat médicament est ajouté dans le milieu de culture des sphéroïdes autologues entre le moment de formation des sphéroïdes et jusqu’à 48 h après leur formation, et la culture est poursuivie pendant ladite période d’au moins 3 jours.
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