CA2491043A1 - Procede de preparation de cellules souches adultes animales ou humaines et utilisation desdites cellules souches en therapie. - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte au domaine de la régénération et la réparation tissulaire par transplantation cellulaire. Plus particulièrement, la présente invention vise un procédé de préparation de cellules souches adultes qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules. La présente invention vise également l'usage de ces cellules souches obtenues p ar le procédé d'extraction proposé dans des applications thérapeutiques, dont l a thérapie génique et cellulaire.Le procédé de préparation selon l'invention consiste essentiellement en : l'extraction cellulaire, la dissociation mécanique, la dissociation enzymatique, le maintien des cellules obtenues da ns un milieu de culture spécifique permettant de préserver la diversité et la plasticité, ledit procédé excluant la mise en culture des cellules.

Description

PROCÉDÉ DE PRÉPARATION DE CELLULES SOUCHES ADULTES
ANIMALES OU HUMAINES ET UTILISATION DESDITES CELLULES
SOUCHES EN THERAPIE.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la régénéra-tion et la réparation tissulaïre par transplantation cellulaire. Plus particulière-ment, la présente invention vise un procédé de préparation de cellules souches adultes qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules. La présente invention vise également l'usage de ces cellules souches obtenues par le procédé d'extraction proposé dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique et cellulaire.
DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR
Pour des raisons anatomiques et biologiques, le sang et ses dérivés ont été les premières cellules transplantées. Les greffes de cellules hématopoïétiques ont connu ~un chemin semblable. Depuis une vingtaine d'années, le transfert de cellules neuronales foetales est étudié comme approche thérapeutique dans les pathologies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson et plus récemment dans la chorée de Huntington. Les résultats cliniques sont cohérents et montrent une nette amélioration. La limi-tation majeure de cette dernière approche est la source de cellules trans-plantées. En effet, le recours à des cellules neuronales foetales rend difficile la diffusion de ce type d'approches thérapeutiques. Les autogreffes de kératino-cytes constituent une solution thérapeutique dans les cas de brûlures graves.
Un avantage de ce système : la capacité des kératinocytes, principales cellules de l'épiderme, à être cultivées ex vivo. Dans le même ordre d'idée, des cartilages défectueux ont pu être reconstruits par des chondrocytes amplifiés en culture puis greffés sous arthroscopie. Des approches similaires encore très expérimentales sont aussi en cours pour des organes comme le pancréas et le foie.
Ces données, encore trop restreintes, démontrent le potentiel de la médecine régénératrice par thérapie cellulaire. Les limitations à

2 l'extension de ces approches sont de plusieurs natures. Pour être capable de suppléer aux défaillances d'un tissu par thérapie cellulaire il faut disposer de sources cellulaires répondant aux caractéristiques suivantes - les cellules doivent être faciles à prélever ;
- elles doivent survivre aux sites d'injection ;
- elles doivent présenter une bonne capacité de proliféra-tion et de colonisation ;
- elles doivent être capables de se différencier pour obtenir un résultat fonctionnel.
II existe donc un besoin pour de nouveaux procédés permet-tant d'obtenir des cellules souches aptes à être utilisées, entre autres, dans le cadre de la régénération et la réparation tissulaire par transplantation cellu-taire.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention propose un procédé de préparation cellulaire répondant au besoin mentionné précédemment. Plus particulière-ment, la présente invention vise un procédé de préparation cellulaire capable de préserver la diversité et la plasticité des cellules souches de vertébrés provenant préférablement d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation ulté-rieure dans le cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par trans-plantation dans un animal, tel un être humain.
L'invention vise de plus un milieu de culture défini, particuliè-rement utile lors de la mise en oeuvre du procédé de préparation cellulaire.
La présente invention vise aussi la préparation cellulaire ou les cellules souches obtenues par le procédé de préparation de l'invention.
La présente invention vise également l'usage de ces cellules souches obtenues par le procédé de préparation proposé dans des applica-tions thérapeutiques, dont la thérapie génique ou cellulaire.
La présente invention vise aussi une composition cellulaire comprenant des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé de préparation de l'invention.

3 La présente invention porte également sur un procédé de préparation de cellules souches capables de réparer ou de régénérer in viv~
des tissus ou des organes d'un vertébré.
La présente invention porte aussi sur une méthode de traite-ment, caractérisée par l'implantation de cellules souches animales autologues ou hétérologues obtenues selon le procédé de l'invention chez un animal.
L'originalité de la présente invention porte sur le fait que, contrairement aux procédés de préparation cellulaire utilisés dans le domaine, le procédé de préparation de la présente invention permet - d'extraire les cellules dans des conditions définies sans protéine animale d'origine extractive, donc dans des conditions sûres du point de vue sanitaire ;
- de maintenir la viabilité cellulaire par l'utilisation de molécules anti-oxydantes et anti-apoptotiques ;
- de préserver la diversité cellulaire ;
- de maintenir le potentiel de plasticité cellulaire ;
- de maintenir le potentiel de différenciation ;
- d'améliorer l'implantation, la colonisation et la différencia-tion des cellules greffées ; et - de procéder à une transplantation des cellules sans avoir à passer par une étape d'expansion en culture in vitro.
Par exemple, dans le procédé de préparation cellulaire décrit dans l'article de Pouzet ef al. (2000. Circulation. 102 : 1112210-5), il n'y a pas d'extraction ou d'isolement cellulaire selon un procédé de digestion enzy-matique. Alternativement, le tissu musculaire est haché. De plus, il n'y a pas d'étape de préparation de cellules telle qu'entendue au sens de la présente invention. La conclusion de cette étude est d'ailleurs à l'effet qu'il ne serait pas possible de courtcircuiter la phase d'expansion en culture in vitro, la récupéra-tion fonctionnelle telle que discutée dans l'article de Pouzet et al.
dépendant plutôt du nombre de cellules. Selon le procédé de l'invention, le mode de préparation des cellules conduit avantageusement, sans expansion en culture

4 in vitro, à une colonisation très importante ainsi qu'à une récupération fonc-tionnelle rapide de l'organe traité.
DESCRIPTION DES FIGURES
Les Figures 1 à 5 sont des microphotographies illustrant la mise en évidence de cellules de muscle greffées dans le coeur de brebis. Les cellules ont été obtenues par dissociation enzymatique d'une biopsie de muscle squelettique puis directement implantées, sans phase d'expansion en culture in vitro, dans le myocarde de la même brebis (greffe autologue). La présence de cellules de muscle squelettique est révélée à l'aide de l'anticorps MY32 qui reconnaît spécifiquement la chaîne lourde de myosine squelettique.
La Figure 1 illustre la détection de cellules de muscle squelet-tique greffées avec l'anticorps MY32 par la présence, à l'intérieur de la paroi du myocarde, de zones de greffes massives (2 à 9 mm de diamètre) ou de foyers discrets (barre d'échelle, 250 microns).
La Figure 2 illustre l'immmunodétection de cellules de muscle squelettique avec l'anticorps MY32. Dans la paroi du myocarde, les fibres marquées par l'anticorps MY32 sont généralement alignées avec le réseau de cardiomyocytes natifs. Certaines fibres sont intensément marquées alors que d'autres ne sont que faiblement marquées; les cardiomyocytes natifs ne sont pas marqués (Barre d'échelle, 500 microns).
La Figure 3 montre des cellules greffées se différenciant en fibres musculaires et formant des sarcomères organisés (Barre d'échelle, 25 microns).
La Figure 4 illustre la spécificité immunohistochimique de l'anticorps MY32.
Coin supérieur gauche : détection immunohistochimique avec l'anticorps MY32 dans le muscle squelettique de brebis. On note les fibres intensément marquées (« fast twitch ») (en brun foncé) et les fibres faiblement marquées (« slow twitch ») caractéristiques d'une biopsie musclulaire (barre d'échelle, 25 microns).

Coin supérieur droit : détection immunohistochimique avec l'anticorps MY32 dans le myocarde de brebis greffé avec des cellules n'ayant pas subi de mise en culture in vitro (barre d'échelle, 25 microns).
Coin inférieur gauche : témoin immunohistochimique négatif

5 avec l'anticorps MY32 dans un coeur de brebis normal (barre d'échelle, 250 microns).
Coin inférieur droit : témoin immunohistochimique négatif avec l'anticorps MY32 dans un coeur de brebis injecté avec du milieu seul (barre d'échelle, 250 microns).
La Figure 5 illustre la co-détection de cellules de muscle squelettique greffées et de cardiomyocytes avec l'anticorps MY32 et un anti-corps dirigé contre la connexine-43, protéine spécifique aux « gap junctions ou jonctions communicantes (points rouges). Cet essai n'a pas démontré la présence de connexine-43 à l'intérieur des cellules greffés ou entre les cellules greffées et leur microenvironnement.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
La présente invention porte donc sur la mise au point d'un procédé de préparation de cellules souches animales ou humaines qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules provenant préférablement d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation ultérieure dans le cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par transplantation directe des cellules, sans expansion en culture in vitro, ainsi préparées chez un animal ou chez l'homme.
Ainsi, il est entendu que la préparation initiale provenant d'une biopsie tissulaire est hétérogène ; par exemple, celle provenant d'une biospie de muscle squelettique peut contenir des myoblastes, fibroblastes, adipo-cytes, cellules nerveuses périphériques, cellules endothéliales et cellules de muscle lisse, en plus des cellules souches pluripotentes.
i) Définitions Par « cellule souche », on entend les cellules qui ont à la fois la capacité de s'autorenouveler et la capacité de se différencier en différents types de précurseurs cellulaires.

6 Par « diversité des cellules souches », on entend les cellules souches qui sont classées en fonction de leur stade de développement et de leur origine tissulaire. Plus particulièrement, on entend une classification de cellules souches embryonnaires ou adultes en fonction de leur origine tissu-taire, par exemple, les cellules souches de la peau ou neuronales ou du muscle.
Par « plasticité des cellules souches », on entend la capacité
pour ces cellules de traverser les frontières de lignée, par exemple la capacité
des cellules hématopoïétiques à se différencier en hépatocytes.
Par « régénération tissulaire », on entend la capacité à refor-mer un tissu soit par activation des cellules progénitrices du tissu (par exemple tissu de la peau, du foie, du coeur, de l'os ou de tissus nerveux), soit par transplantation directe, sans expansion en culture in vitro, de ces cellules progénitrices. Plus particulièrement, il s'agit alors d'une néoformation tissu-taire.
Par « réparation tissulaire », on entend une opération qui permet de pallier un déficit sans avoir recours à un processus de régénéra-tion. La réparation tissulaire se traduit par un apport exogène de cellules qui peuvent être différentes des cellules du tissu receveur.
Par « transplantation cellulaire », on entend une opération qui se caractérise par un apport de cellules isolées. Cette transplantation peut être effectuée, par exemple, par injection directement, sans expansion en culture in vitro, dans le tissu ou dans la circulation afférente.
Par « animal », on entend tout organisme vivant qui peut étre sujet à une transplantation cellulaire, et ceci inclut les êtres vertébrés tels que notamment les êtres humains, les animaux domestiques et sauvages, notamment les oiseaux.
ü) Procédé de préparation de cellules souches Un premier aspect de la présente invention vise un procédé
de préparation de cellules souches humaines ou animales. Ce procédé
consiste essentiellement en les étapes suivantes a) l'extraction cellulaire ;

7 b) la dissociation mécanique ;
c) la dissociation enzymatique ; et le maintien des cellules dans un milieu spécifique permettant de préserver la diversité et la plasticité, ledit procédé excluant la mise en culture des cellules, c'est-à-dire une phase d'expansion en culture in vitro.
Plus précisément, l'extraction cellulaire est obtenue tout d'abord suite à une biopsie pour fournir un fragment tissulaire, tel un fragment de muscle, de foie ou de peau. Par exemple, une biopsie musculaire est réali-sée sous anesthésie locale suite à une incision ou encore à l'aiguille. Le fragment tissulaire ainsi obtenu est ensuite humidifié dans un milieu défini, tel le DME/202 en présence de facteurs protecteurs et de facteurs inhibant la différenciation cellulaire (Pinset et Montarras), (1994) Cell Biology : A
labora-tory Handbook. Academic Press).
Préférablement, le milieu défini est un milieu ci-après nommé
DPM (Diversity Protecting Medium) et comprend au moins - un milieu nutritif de base tamponné avec des tampons dépendants ou indépendants de la concentration en C02. Les milieux utilisés sont, dans la plupart des cas, constitués d'un mélange dans un rapport 1:1 de milieu de type DME et de type F12. Parmi ceux-ci on peut citer en exemple le mélange DME/ F12 et DME/MCDB 202;
- un facteur protecteur, tel D des anti-oxydants (acide ascorbique, N-acétyl cystéine) ' des anti-caspases (Dose : environ 0,1 mU à 10 mU) D des protecteurs du métabolisme (L-Carnitine) ~ des facteurs protecteurs des métaux (Transferrine) (Dose : environ 0,1 pg/ml à 100 pg/ml) - des hormones tels glucocorticoïdes, insuline, acide rétinoïque, hormone thyroïdienne, minéralocorticoïdes, IGF1 ou IGF2 aux doses physiologiques allant préférentiellement de 10-6 à 10-9 M.
- des facteurs inhibant la différenciation, tels les FGF (Fibrobiast Growth Factors). Parmi les facteurs de la famille FGF, trois facteurs sont particulièrement importants et jouent un ô
rôle similaire, soit FGF-2, FGF-6 et FGF-10. Chacun des facteurs de la famille FGF est employé à des concentrations allant préférentiellement de 0,1 à 100 pgiml.
D fEGF (Epidermal Growth Factor) (Dose : environ 0,1 Ng/ml à 100 pgiml) D le LIF (Leukemia Inhibitory Factor) (Dose : environ 0,1 pg/ml à 100 pg/ml) [fraction non cellulaire du sang après coagulation]
D le sérum est également un facteur inhibant la différenciation et peut étre utilisé à une concentration variant de 0 à 100 %.
Ce milieu DPM ainsi défini est utilisé lors du procédé de préparation cellulaire. L'absence de fluide animal dans le milieu défini, comme le sérum par exemple, permet de garantir une meilleure sécurité infectieuse contre des virus, prions, etc. et une meilleure reproductibilité du procédé de l'invention. Les prélèvements provenant de biopsies sont maintenus soit à
température ambiante, soit conservés, préférablement, entre 4 et 6°C
dans le DPM pendant une période n'excédant préférablement pas 48 heures. II est clair que la composition précise du DPM pourra varier en fonction du type de biopsie tissulaire.
Lors de l'étape b) du procédé, le fragment tissulaire maintenu dans le milieu DPM est d'abord émincé jusqu'à l'obtention d'un homogénat cellulaire. Ceci est préférablement fait à l'aide de ciseaux chirurgicaux stériles mais tout autre outil semblable peut être utilisé. Par la suite, l'extrait tissulaire homogène ou l'homogénat tissulaire est préférablement libéré d'une partie des érythrocytes et des adipocytes grâce à une étape de lavage et de centri-fugation par sédimentation douce de 1 à 10 g (Pinset et Montarras. 1994. Cell Biology : A Laboratory Handbook. Academic Press).
Ä l'étape c) du procédé, l'homogénat tissulaire obtenu à
l'étape b) est soumis à une digestion enzymatique pour optimiser la dissocia-tion cellulaire. Lors de cette étape du procédé de l'invention, des enzymes protéolytiques d'origine bactérienne, comme la collagènase et/ou la pronase, sont préférablement utilisées. Toutefois, pour des raisons de sécurité sani-taire, on peut envisager l'utilisation de trypsine produite par génie génétique ou de toute autre enzyme acceptable. Ces enzymes peuvent être utilisées seules ou en combinaison à des concentrations variant, préférablement, de 0,1 à 0,5%.
Ä titre d'exemple non limïtatif, on peut procéder comme suit, lors de la mise en oeuvre de l'étape c) du procédé
le culot de fragments tissulaires obtenu à l'étape b) est suspendu dans du milieu DPM additionné de collagénase à une concentration finale de 0,4 g par 100 ml. La digestion enzymatique allant de 5 à 20 minutes peut être répétée plusieurs fois. La température de la réaction enzymatique se i0 situe préférablement entre 20°C et 37°C avec agitation externe. La digestion enzymatique a lieu préférablement en plusieurs étapes, et ce, jusqu'à cinq étapes. Ä chaque étape, les fragments et les cellules sont séparés par centri-fugation ménagée à 10 g. Le culot de fragments est alors resuspendu dans le milieu DPM additionné d'enzymes protéolytiques puis soumis à une nouvelle étape de digestion. Les cellules présentes dans le surnageant sont récoltées par centrifugation à 200 g et resuspendues dans du milieu DPM. On aboutit ainsi à une suspension cellulaire qui additionne les cellules extraites des diffé-rentes étapes de digestion. La suspension cellulaire est ensuite filtrée sur filtre de nylon dont le diamètre des pores est préférablement d'environ 34 microns, pour éliminer les fragments tissulaires.
Ainsi, grâce au procédé de préparation de cellules souches selon la présente invention, il est possible, par exemple, de préparer de manière sûre et reproductible, sans expansion en culture in vitro, une suspen-sion cellulaire issue d'une biopsie musculaire qui maintient son potentiel de colonisation et de plasticité cellulaire. Par exemple, pour un gramme de tissu, il est possible de préparer de 1 x 106 à 2 x 106 cellules. L'efficacité des procé-dés pour le maintien de la diversité et de la plasticité cellulaire est évaluée par des tests in vivo et des tests ex vivo. Dans les premiers, les suspensions cellulaires obtenues sont réintroduites dans l'animal après un marquage. Ä
titre d'exemple une molécule fluorescente comme la Green Fluorescente Protein sera employée. Le marquage cellulaire permet de suivre le devenir des cellules injectées dans l'organisme, d'analyser leur participation aux diffé-rents tissus et la différenciation des cellules injectées. Dans les conditions où
l'on maintient la diversité et la plasticité, les cellules injectées participent à la néoformation de différents tissus comme le muscle squelettique et cardiaque, les vaisseaux, les tendons, le cartilage, l'os, le tissu hématopoïétique.
Cette 5 diversité et cette plasticité cellulaire est dépendante du site d'injection souli-gnant l'importance de l'environnement dans le devenir cellulaire.
Les tests ex vivo (en culture) permettent aussi de mesurer la diversité cellulaire et la plasticité cellulaire. Ceux-ci sont basés sur l'analyse clonale et sur la réponse à différents inducteurs de la différenciation. Parmi 10 ceux-ci on peut citer ~~ des facteurs de croissance comme l'insuline et les IGFs, les TGFs, les BMPs, le VEGF ;
~~ des hormones comme les dérivés de l'acide rétinoïque, les hormones thyroïdiennes, les glucocorticoïdes ;
r des facteurs de la matrice extracellulaire ;
~~ des vitamines et agents permettant la minéralisation ;
~~ les composants de la matrice extracellulaire.
L'identification cellulaire est faite par des analyses immuno-logiques à l'aide de coloration spécifique et d'anticorps spécifiques, qui permettent à la fois l'identification et la quantification et par l'analyse transcriptomique.
Les approches complémentaires in vivo et ex vivo permettent de mesurer la diversité et la plasticité cellulaire qualitativement et quantitati vement et d'ainsi valider les conditions permettant le maintien de la diversité
cellulaire et de la plasticité cellulaire.
Les cellules ainsi préparées sans expansion en culture in vitro sont une source de cellules adéquates pour la thérapie cellulaire et peuvent étre soit réimplantées directement dans un organisme, soit conservées pour réimplantation ultérieure.
Le procédé de la présente invention peut comprendre une étape additionnelle, soit une étape de congélation. Cette étape optionnelle du procédé offre les avantages suivants r conservation des prélèvements tissulaires ;
~~ dissociation entre la préparation de la biopsie et la réimplantation cellulaire ;
r caractérisation biologique et sanitaire avant le réimplanta-tion cellulaire.
Ä titre d'exemple non limitatif, on peut procéder comme suit lors de cette étape de congélation 106 à 2 x 106 cellules provenant de 1 gramme de tissu sont mises en présence de milieu DPM additionné d'agents cryopréservatifs, tel le DMSO. Pour le DMSO, la concentration utilisée est préférablement de 10%.
Dans ces conditions, les cellules sont maintenues à 20°C pour une période de 10 minutes puis la température est amenée lentement, en quelques heures, à
moins 80°C. Finalement, les cellules sont transférées dans de l'azote liquide.
II est important de noter que ces conditions de conservation ont l'avantage de ne pas modifier les caractéristiques cellulaires.
Avant de procéder à la transplantation cellulaire dans le cadre des futures applications cliniques, il peut ëtre préférable de caractériser la suspension cellulaire obtenue par le procédé selon la présente invention.
Cette caractérisation peut étre entreprïse au niveau protéique grâce à
l'utilisation de marqueurs cellulaires tels que - P-Cam comme marqueur de cellule endothéliales ;
- N-Cam comme marqueur de cellule neuronales et musculaires;
- Actine de muscle lisse comme marqueur de cellules du muscle lisse ;
- GFAP comme marqueur de cellules gliales ;
- Myf5, Pax3, Pax7, C-met et M-cadhérine comme marqueurs de cellules musculaires ;
- Sca1+, C-Kit, CD45 et CD34 comme marqueurs de cellules souches.
Cette caractérisation peut également étre entreprise au niveau de la transcription par l'utilisation de biopuces contenant des oligo-nucléotides codant pour des gènes cellulaires (par exemple, facteurs de transcription spécifiques et facteurs de la machinerie du cycle cellulaire) permettant d'identifier les cellules de la suspension cellulaire.
Conformément à l'invention, lesdites cellules souches sont des cellules souches animales ou humaines choisies dans le groupe constitué
par des cellules souches progénitrices d'un tissu.
Egalement conformément à l'invention, le tissu est choisi dans le groupe constitué par la peau, le foie, le coeur, l'os et les tissus nerveux.
iii) Utilisations thérapeutiques Un deuxième aspect de la présente invention vise l'usage d'une suspension cellulaire ou de cellules souches obtenues par le procédé
de l'invention dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique, suite à une transplantation de ces cellules chez un étre humain, par exemple.
Plus particulièrement, la présente invention propose d'utiliser les cellules préparées par le procédé de l'invention dans le cadre d'une réparation etlou régénération tissulaire par transplantation cellulaire sans expansion en culture in vitro. Les cellules ainsi préparées seront également utilisées comme vecteurs en thérapie génique.
Par exemple, les cellules souches adultes obtenues par le procédé de préparation selon l'invention peuvent servir dans le cadre d'une réparation de tissu osseux. Dans le cas présent, il s'agit de transplanter directement, sans expansion en culture in vifro, les cellules sur un site de réparation osseuse. Dans ce micro-environnement particulier, les cellules ou certaines d'entre elles peuvent adopter le phénotype osseux et ainsi participer à la réparation du tissu endommagé.
Le procédé de préparation cellulaire de la présente invention peut également fournir une suspension de cellules souches adultes de mammifère pouvant être utilisée lors d'une restauration du potentiel hémato-poïétique. En effet, la capacité des cellules souches de biopsie musculaire à
coloniser la moelle osseuse de souris irradiées et à contribuer à toutes les lignées hématopoïétiques, oblige à considérer le potentiel réparateur des cellules de biopsie musculaire dans le cas, par exemple, de leucémies.

D'autre part, il est connu que les greffes de cellules muscu-laires cultivées, dans le muscle sont peu efficaces et caractérisées par une mort massive des cellules réimplantées dans les heures qui suivent leur injec-tion. II est par conséquent proposé que le procédé de préparation de cellules souches selon l'invention qui ne comporte pas de phase d'expansion en culture in vitro peut contribuer à la réparation du tissu musculaire. Les cellules contenues dans la suspension pourront répondre aux micro-environnements et ainsi restaurer des fonctions ou réparer le tissu musculaire.
En conséquence, l'invention a également pour objet l'utilisation des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies par thérapie cellulaire ou thérapie génique.
La présente invention a, en outre, pour objet, une cellule souche obtenue selon le procédé selon l'invention.
La présente invention a également pour objet une méthode de traitement comprenant une étape d'implantation de cellules souches animales autologues ou hétérologues obtenues selon le procédé selon l'invention chez un animal ou chez l'homme.
La présente invention a également pour objet une composition cellulaire comprenant des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé selon l'invention.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite composition, les cellules souches ont une capacité de colonisation et une capacité à permettre une récupération fonctionnelle.
EXEMPLE
L'exemple qui suit sert à illustrer l'étendue de l'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être effectuées sans que l'on échappe à l'esprit et à la portée de l'invention. Bien que l'on puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équi-valents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits.

Exemple 1 : Réparation du tissu cardiague Introduction A la différence du muscle squelettique, le tissu cardiaque ne possède pas à l'état adulte de cellules souches capables de réparer ce tissu après une lésion. De ce fait, l'ischémie cardiaque est toujours accompagnée d'une insuffisance de contraction qui, si importante, conduit à l'insuffisance cardiaque. L'objectif de la thérapie cellulaire dans cette indication est de restaurer la fonction de contraction. Des expériences dans ce sens ont été
conduites chez l'Homme avec comme source de cellules, des cellules musculaires amplifiées en culture. Cette première démarche montre la faisa-bilité de l'approche, mais aussi, certaines limitations de la stratégie adoptée.
L'amplification d'un grand nombre de cellules musculaires dans des milieux comprenant des fluides anïmaux tel le sérum de veau foetal, et leur trans-plantation dans un tissu hétérotypique sont des opérations à la fois lourdes et non sans danger sanitaire potentiel (contaminants viraux, prions, etc.). La limitation essentielle de ce procédé réside dans le fait que les cellules ainsi injectées ont une plasticité restreinte qui ne donnent que des cellules muscu-laires squelettiques. Le procédé de préparation de cellules souches de la présente invention sans phase d'expansion en culture in vitro évite l'appauvrissement de la diversité cellulaire par la culture.
Description de la transplantation cardiaque chez la brebis Protocole anesthésigue : prémédication avec du midazolam, induction à l'aide d'étomidate, intubation trachéale et ventilation à pression positive avec de l'isoflurane dans 100% d'oxygène. La surveillance est assu-rée par électrocardioscopie, pression artérielle invasive, capnographie.
Analgésie postopératoire avec de la bupivacaïne (bloc intercostal lors de thoracotomie), morphine et de la flunixine méglumine.
Bioasie du muscle sguelettigue : Une biopsie du muscle squelettique (approximativement 10 g) est explantée stérilement à partir des biceps fémoraux gauches de chaque brebis. Le tissu ainsi prélevé est main tenu dans du DMEM (SIGMA) ou du DPM, tel que défini ci-dessus, à tempé-rature de la pièce jusqu'à digestion mécanique ou enzymatique. La plaie de l'animal est refermée de la façon habituelle. Les animaux récupèrent pendant environ trois heures, puis sont ré-anesthésiés lorsque les cellules sont prêtes à être réimplantées.
Extraction des cellules musculaires : Les expiants de muscle 5 squelettique sont pesés puis lavés dans du DMEM ou du DPM. Le tissu adipeux et fascia sont retirés et le muscle est émincé aux ciseaux jusqu'à
l'obtention d'un homogénat tissulaire. Les fragments de muscle sont ensuite sédimentés dans du DMEM ou du DPM à 300 rpm pendant 2 minutes puis débarrassés du surnageant.
10 Afin de libérer les cellules satellites, les fragments de muscle sont incubés à 37°C avec agitation dans 10 mL de DMEM ou de DPM addi-tionné de 0,4% (P/V) de collagénase (Type IA, SIGMA) brute. Après 20 minutes, les fragments sont centrifugés à 300 rpm pendant 2 minutes.
Le surnageant contenant les cellules isolées est conservé
15 dans du DMEM à 20 % (VN) de sérum de veau foetal ou du DPM. Le culot subit jusqu'à quatre digestions supplémentaires (Pinset, C. et Montarras, D.
Cell Systems for Ex-vivo Studies of Myogenesis : A Protocol for the Isolation of Stable muscle cell populations from newborn to adult mice dans Cell Biology : A Laboratory Handbook ; deuxième édition e. J. F. Celis, Academic Press ; 1998).
Les cellules extraites sont ensuite filtrées sur un filtre de nylon avec pores de 250 ~.m de diamètre (Polylabo SA). Les cellules ainsi prépa-rées ne subissent pas de phase d'expansion en culture in vitro.
Marcruage des cellules : Afin de marquer leurs noyaux, les cellules sont resuspendues dans 10 mL de DMEM sans sérum contenant 25 ~.g/mL de 4'-6-diamino-2-phénylindole (DAPI, SIGMA) pendant 10 minutes ou du DPM dans les mêmes conditions. Les cellules sont rincées quatre fois dans du DMEM ou du DPM afin d'enlever le DAPI. Les cellules mono-nucléées sont dénombrées avec une cellule de numération sous microscopie à fluorescence. La préparation cellulaire est ensuite resuspendue dans 1,2 mL
de DMEM ou de DPM sans sérum et conservée à 4°C jusqu'à l'implantation sans subir de phase d'expansion en culture in vitro.

Greffe cellulaire : Les brebis préalablement anesthésiées selon la méthode décrite ci-dessus sont placées en décubitus latéral droit pour une thoracotomie gauche sur le Sème espace intercostal. Après péri-cardiotomie et suspension du péricarde, les cellules dans du DMEM ou du DPM sont injectées (0,1 mL par site) à l'aide d'une seringue à insuline connectée à un épijet 27 G, sur 10 zones du ventricule gauche. Une carto-graphie des vaisseaux coronaires est établie pour repérer les sites d'injection dans le myocarde. Des points de sutures épicardiques de repérage sont réali-sés pour au moins deux injections. Le thorax est refermé de la manière habi-tuelle et les animaux récupèrent sous régime analgésique (morphine à 0,5 mg/kg IM BID, flunixine 1 mg/kg IM une fois) jusqu'au lendemain inclusive-ment.
Cultures cellulaires témoins : Afin de confirmer la présence de cellules précurseurs du muscle dans la préparation cellulaire, un échantillon de 100 p,L de la suspension cellulaire est ensemencé dans une boîte de culture contenant du DMEM ou du DPM avec sérum de veau foetal. Les cellules sont maintenues à titre de témoin dans une atmosphère à 5% de C02. Trois à sept jours suivant l'ensemencement, les cellules servent à une immunodétection du facteur de régulation spécifique MyoD (DAKO) telle que décrite par Montarras, D. et al. (Cultured MyfS Null and MyoD Null Muscle Precursor Cells Display Distinct Growth Defects. Biol Cell 2000 ;92 :565-72).
Résultats La procédure d'injection cellulaire n'a pas d'effet sérieux sur les animaux. Une arythmie ventriculaire survient lors de l'insertion de l'aiguille et lors de l'injection des cellules mais se résorbe lorsque l'aiguille est retirée.
Le dénombrement des cellules permet de déterminer l'injection de 1.7 +!- 0.3 x 10' cellules mononucléées marquées au DAPI.
L'expression de la chaîne lourde de la myosine squelettique (MY32) est détectée à 3 semaines post-implantation dans 8 animaux sur 8, ce qui confirme la survie cellulaire et l'expression myogénique des cellules implantées. De larges surfaces de greffon (de 2 à 9 mm de diamètre) ou de discrets foyers sont observés à l'intérieur de la paroi du myocarde (Figure 1 ).

Des cellules isolées sont aussi observées dans le tissu adipeux du péricarde.
Ä l'intérieur de la paroi du myocarde, les fibres positives pour l'expression de MY32 sont généralement alignées avec des cardiomyocytes natifs. Certaines de ces fibres sont fortement marquées à l'anticorps dirigé contre MY32, alors que d'autres ne sont que faiblement marquées (Figure 2). Ces fibres ne sont pas couplées électro-mécaniquement entre elles ou avec les cardiomyocytes natifs tel que démontré par immunohistochimie négative à la connexine-43.
Les cellules implantées développent des sarcomères organi-sés et présentent soit une morphologie allongée caractéristique de myotubes multinucléés fusionnés, soit une morphologie qui demeure mononucléée (Figure 3). Ces cellules du muscle squelettique possèdent des noyaux obser-vés en périphérie ou au centre. Une fibrose de remplacement et des régions présentant des cellules mononucléées de la réponse inflammatoire sont aussi observées.
Aucun marquage au DAPI n'est observé dans les coeurs explantés. Ceci peut être dû à une division cellulaire active entraînant une dilution du DAPI. En effet, dans les cultures cellulaires servant de témoins, le DAPI devient indétectable après 6 à 8 doublements de population cellulaire.
Les boîtes de culture servant de témoins sont observées quotidiennement. L'immunodétection du facteur de régulation spécifique du muscle squelettique MyoD montrent qu'approximativement 50% des cellules en culture sont des cellules précurseurs du muscle squelettique. Quand on permet aux cellules de fusionner, toutes les cellules montrent de nombreux myotubes une semaine suivant l'ensemencement.
Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en détails ci-dessus et illustrés dans les dessins annexés, l'invention n'est pas limitée à ces seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications peuvent y être effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ou de l'esprit de l'invention.

Claims (9)

REVENDICATIONS

1 o) Procédé de préparation de cellules souches humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement en - l'extraction cellulaire - la dissociation mécanique - la dissociation enzymatique - le maintien des cellules obtenues dans un milieu de culture spécifique permettant de préserver la diversité et la plasticité, ledit procédé excluant la mise en culture des cellules.

2 o) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu de culture spécifique comprend au moins a) un milieu nutritif;
b) un facteur protecteur;
c) des hormones;
d) des facteurs inhibant la différenciation.

3 o) Procédé de préparation de cellules souches selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdites cellules souches sont des cellules souches animales ou humaines choisies dans le groupe constitué par des cellules souches progénitrices d'un tissu.

4 o) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le tissu est choisi dans le groupe constitué par la peau, le foie, le coeur, l'os et les tissus nerveux.

o) Utilisation des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies par théra-pie cellulaire ou thérapie génique.

6 o) Cellule souche obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 4.

7 o) Méthode de traitement comprenant une étape d'implantation de cellules souches animales autologues ou hétérologues obtenues selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 4 chez un animal.

8 o) Composition cellulaire comprenant des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 4.

9 o) Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que les cellules souches ont une capacité de colonisation et une capacité à
permettre une récupération fonctionnelle.