CA2389027A1 - Composition de marquage d'un produit solide ou liquide, procede de fabrication d'une telle composition, utilisation d'une telle composition et utilisation du procede de fabrication - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une composition de marquage d'un produit solide ou liquide et le procédé de fabrication d'une telle composition. Le procédé de fabrication d'une composition de marquage de produits solides ou liquides se caractérise en ce qu'il consiste à créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères à base physique minérale, en faisant par exemple réagir des microsphères de silice poreuse présentant des terminaisons amines primaires, avec des molécules fluorescentes présentant d es terminaisons réactives avec les amines primaires telle qu'une terminaison succinimidyl ester.
Description
Composition de marauaa_e d'un produit solide ou liguide, procédé de fabrication d'une telle composition, utilisation d'une telle composition et utilisation du procédé de fabrication s L'invention concerne une composition de marquage d'un produit solide ou liquide et le procédé de fabrication d'une telle composition.
L'invention concerne plus particulièrement une composition de marquage d'un produit solide ou liquide, comprenant des microsphères et des molécules fluorescentes, permettant une traçabilité secrète de produits.
1o II est connu dans l'art antérieur de marquer des produits liquides ou solides, par l'intermédiaire de microsphères ou microperles chargées de fluorescence, afin de permettre d'identifier et/ou de contrôler les mouvements des produits. Le brevet WO 94 04918 concerne une méthode de marquage de matériau, plus particulièrement de liquide, en ajoutant au 1s liquide un additif comprenant des particules telles que des microsphëres qui sont reconnues par des moyens de détection. Les microsphères sont constituées de matériaux polymères présentant un diamètre compris entre 0,05 et 100 Nm. Les moyens de détection peuvent être constitués par des composés fluorescents incorporés sans liaison covalente dans les 2o microsphères et des molécules d'ADN liées par une liaison covalente aux microsphères. Dans ce document, les composés fluorescents, utilisés comme marqueurs, permettent d'observer par microscopie à épifluorescence les microsphères qui demeurent invisibles à l'oeil nu et les microsphères servent à localiser les molécules d'ADN et de support à l'ADN, les molécules 2s d'ADN servant de traceur. Ainsi des microsphères chargées de molécules fluorescentes peuvent être additionnées à un liquide tel qu'un hydrocarbure, un vernis ou une encre par exemple. Un échantillon de liquide peut être prélevé et observé par un microscope sous une source de lumière spécifique pour permettre de dépister la fluorescence et ainsi de localiser les
L'invention concerne plus particulièrement une composition de marquage d'un produit solide ou liquide, comprenant des microsphères et des molécules fluorescentes, permettant une traçabilité secrète de produits.
1o II est connu dans l'art antérieur de marquer des produits liquides ou solides, par l'intermédiaire de microsphères ou microperles chargées de fluorescence, afin de permettre d'identifier et/ou de contrôler les mouvements des produits. Le brevet WO 94 04918 concerne une méthode de marquage de matériau, plus particulièrement de liquide, en ajoutant au 1s liquide un additif comprenant des particules telles que des microsphëres qui sont reconnues par des moyens de détection. Les microsphères sont constituées de matériaux polymères présentant un diamètre compris entre 0,05 et 100 Nm. Les moyens de détection peuvent être constitués par des composés fluorescents incorporés sans liaison covalente dans les 2o microsphères et des molécules d'ADN liées par une liaison covalente aux microsphères. Dans ce document, les composés fluorescents, utilisés comme marqueurs, permettent d'observer par microscopie à épifluorescence les microsphères qui demeurent invisibles à l'oeil nu et les microsphères servent à localiser les molécules d'ADN et de support à l'ADN, les molécules 2s d'ADN servant de traceur. Ainsi des microsphères chargées de molécules fluorescentes peuvent être additionnées à un liquide tel qu'un hydrocarbure, un vernis ou une encre par exemple. Un échantillon de liquide peut être prélevé et observé par un microscope sous une source de lumière spécifique pour permettre de dépister la fluorescence et ainsi de localiser les
2 microsphères. Lorsque les microsphères sont localisées, les molécules d'ADN peuvent être prélevées et être amplifiées par la technologie PCR
(Polymerise Chain Reaction) par l'intermédiaire de la clé moléculaire complémentaire des séquences des brins afin d'identifier les séquences et s par conséquent le produit marqué. De telles microsphères fluorescentes invisibles à l'oeil nu permettent ainsi de tracer secrètement les produits.
L'incorporation des molécules fluorescentes dans les microsphères peut être effectuée lors de la polymérisation des microsphères. De telles microsphères présentent une faible fluorescence et nécessitent des moyens 1o très précis pour ta détecter. Une autre méthode consiste à mélanger dans un solvant les microsphères avec les molécules fluorescentes, les microsphères se dilatant, sous l'effet du solvant ou d'une augmentation de la température, s'imprègnent de molécules fluorescentes. Une baisse de température ou l'évaporation du solvant permet ensuite d'emprisonner les molécules is fluorescentes à l'intérieur des microsphères.
II est également connu dans le brevet US 5,194,300 des microsphères fluorescentes utilisées pour le marquage de protéines et la détection de gènes spécifiques. Une microsphère fluorescente de ce type est fabriquée par la création à PH élevé, d'une liaison covalente entre une 2o microsphère de latex disposant en surface de greffes de groupement carboxyle, méthyle ester et hydroxyle ester et une diamine et une molécule fluorescente aminée. Les microsphères fluorescentes obtenues disposent d'une fluorescence importante qui leur permettra d'être facilement détectées.
II est également connu dans le brevet US 5,759,447 une mémoire 2s optique effaçable constituée d'un chromophore photoactif bistable lié par covalence à une microsphère en polymère telle que du polystyrène. Ce type de produit est principalement utilisé dans le domaine de l'informatique.
Pour présenter un intérêt dans le domaine du marquage de produits, les microsphères fluorescentes doivent préserver leur fluorescence dans le 3o temps quel que soit le milieu où elles sont placées. Or, II s'avère que les
(Polymerise Chain Reaction) par l'intermédiaire de la clé moléculaire complémentaire des séquences des brins afin d'identifier les séquences et s par conséquent le produit marqué. De telles microsphères fluorescentes invisibles à l'oeil nu permettent ainsi de tracer secrètement les produits.
L'incorporation des molécules fluorescentes dans les microsphères peut être effectuée lors de la polymérisation des microsphères. De telles microsphères présentent une faible fluorescence et nécessitent des moyens 1o très précis pour ta détecter. Une autre méthode consiste à mélanger dans un solvant les microsphères avec les molécules fluorescentes, les microsphères se dilatant, sous l'effet du solvant ou d'une augmentation de la température, s'imprègnent de molécules fluorescentes. Une baisse de température ou l'évaporation du solvant permet ensuite d'emprisonner les molécules is fluorescentes à l'intérieur des microsphères.
II est également connu dans le brevet US 5,194,300 des microsphères fluorescentes utilisées pour le marquage de protéines et la détection de gènes spécifiques. Une microsphère fluorescente de ce type est fabriquée par la création à PH élevé, d'une liaison covalente entre une 2o microsphère de latex disposant en surface de greffes de groupement carboxyle, méthyle ester et hydroxyle ester et une diamine et une molécule fluorescente aminée. Les microsphères fluorescentes obtenues disposent d'une fluorescence importante qui leur permettra d'être facilement détectées.
II est également connu dans le brevet US 5,759,447 une mémoire 2s optique effaçable constituée d'un chromophore photoactif bistable lié par covalence à une microsphère en polymère telle que du polystyrène. Ce type de produit est principalement utilisé dans le domaine de l'informatique.
Pour présenter un intérêt dans le domaine du marquage de produits, les microsphères fluorescentes doivent préserver leur fluorescence dans le 3o temps quel que soit le milieu où elles sont placées. Or, II s'avère que les
3 microsphères fluorescentes présentées dans ces brevets antérieurs ne sont pas resistantes chimiquement et thermiquement. En effet, dans le cas où les microsphères incorporant les molécules fluorescentes, sont placées dans un milieu agressif tel qu'un milieu solvant, elles perdent leur fluorescence.
Dans s ce milieu, les microsphères se dilatent et libèrent les composés fluorescents.
Les molécules fluorescentes n'étant plus associées aux microsphères, les microsphères ne peuvent plus être localisées et ne remplissent plus leur rôle de marquage. Dans certains cas, les microsphères sont totalement détruites par le solvant. Dans le cas où les microsphères en polymère sont liées par 1o covalence aux molécules fluorescentes, le polymère constituant les microsphères, selon la nature du solvant, peut se dissoudre dans le solvant.
De même si la température devient trop élevé, le polymère peut se solubiliser. La solubilsation des polymères intervient en général entre 90 et 120°C. Or, les microsphères fluorescentes peuvent être utilisées pour le Is marquage de plastique et lors d'extrusion de plastique, les températures peuvent atteindre 300°C, provoquant alors cette solubilisation des microsphères fluorescentes dans le plastique.
Un but de l'invention est de proposer un procédé de fabrication d'une composition de marquage de produits solides ou liquides, basée sur 20 l'utilisation de microsphères fluorescentes résistantes chimiquement et thermiquement et dont la fluorescence tient dans le temps et dans les environnements agressifs tels que les solvants.
Ce but est atteint par un procédé de fabrication d'une composition de marquage de produits solides ou liquides, caractérisé en ce qu'il consiste à
2s créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères à base physique minérale.
Selon une autre particularité, ce procédé consiste à créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères à base de divinylbenzène.
Dans s ce milieu, les microsphères se dilatent et libèrent les composés fluorescents.
Les molécules fluorescentes n'étant plus associées aux microsphères, les microsphères ne peuvent plus être localisées et ne remplissent plus leur rôle de marquage. Dans certains cas, les microsphères sont totalement détruites par le solvant. Dans le cas où les microsphères en polymère sont liées par 1o covalence aux molécules fluorescentes, le polymère constituant les microsphères, selon la nature du solvant, peut se dissoudre dans le solvant.
De même si la température devient trop élevé, le polymère peut se solubiliser. La solubilsation des polymères intervient en général entre 90 et 120°C. Or, les microsphères fluorescentes peuvent être utilisées pour le Is marquage de plastique et lors d'extrusion de plastique, les températures peuvent atteindre 300°C, provoquant alors cette solubilisation des microsphères fluorescentes dans le plastique.
Un but de l'invention est de proposer un procédé de fabrication d'une composition de marquage de produits solides ou liquides, basée sur 20 l'utilisation de microsphères fluorescentes résistantes chimiquement et thermiquement et dont la fluorescence tient dans le temps et dans les environnements agressifs tels que les solvants.
Ce but est atteint par un procédé de fabrication d'une composition de marquage de produits solides ou liquides, caractérisé en ce qu'il consiste à
2s créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères à base physique minérale.
Selon une autre particularité, ce procédé consiste à créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères à base de divinylbenzène.
4 Selon une autre particularité, ce procédé consiste à créer la liaison covalente par une réaction des microsphères présentant des terminaisons amines primaires avec des molécules fluorescentes présentant des terminaisons réactives avec les amines primaires.
s Selon une autre particularité, les microsphères sont en silice poreuse.
Selon une autre particularité, les microsphères sont en silice pleine.
Selon une autre particularité, la molécule fluorescente présente une terminaison succinimidyl ester réagissant avec les greffes d'amines des 1o microsphères de silice pour former des liaisons carboxamide.
Selon une autre particularité, la molécule fluorescente est une molécule commercialisée sous la marque "ALEXA".
Selon une autre particularité, les microsphères sont de type "Uptisphères NHZ' commercialisées par la société InterChim ou de type is "Exsil Amino" commercialisées par la société YMC.
Selon une autre particularité, le procédé comprend - une étape de préparation d'une solution tampon à un pH
déterminé ;
- une étape de mise en solution de microsphères dans la solution 2o tampon ;
- une étape de mise en solution dans un solvant de molécules fluorescentes déshydratées ;
- une étape de mélange et d'agitation pendant un temps déterminé
de la solution de molécules fluorescentes et des microsphères, à une 2s température déterminée ;
- une étape de lavement des microsphères fluorescentes obtenues pour les séparer des sels du tampon, des molécules fluorescentes non liées et des molécules secondaires de la réaction ;
- et une étape d'évaporation du solvant.
3o Selon une autre particularité, le procédé comprend - une étape de préparation d'une solution tampon pour obtenir un pH
compris entre 7,8 et 8,5 ;
- une étape de mise en solution dans la solution tampon de microsphères de silice poreuse ;
s - une étape de mise en solution dans de l'eau déminéralisée de molécules fluorescentes déshydratées présentant une terminaison succinimidyl ester ;
- une étape de mélange et d'agitation pendant approximativement une heure, de la solution de molécules fluorescentes et des microsphères, à
Io température ambiante ;
- une étape de lavement des microsphères fluorescentes obtenues pour les séparer des sels du tampon, des molécules fluorescentes non liées et des molécules secondaires de la réaction ;
- et une étape d'évaporation du solvant.
is Selon une autre particularité, le procédé comprend une étape d'addition d'un traceur constitué par des brins d'ADN.
Selon une autre particularité, le procédé comprend une étape de couplage des brins d'ADN avec les microsphères.
Un autre but de l'invention est de proposer une composition de 2o marquage de produits solides ou liquides caractérisée en ce qu'elle comprend des microsphères à base physique minérale présentant des liaisons covalentes avec des molécules fluorescentes.
Selon une autre particularité, les molécules fluorescentes sont liées aux microsphères par des liaisons de type amide.
2s Selon une autre particularité, la composition comprend des microsphères présentant des liaisons carboxamide avec des molécules fluorescentes.
Selon une autre particularité, les microsphères sont des microsphères poreuses de silice présentant des greffes d'amines (NHz) assurant l'établissement des liaisons carboxamide avec les molécules fluorescentes.
Selon une autre particularité, les microsphères sont en silice pleine.
Selon une autre particularité, la composition comprend des traceurs s constitués de brins d'ADN.
Selon une autre particularité, des traceurs, constitués de brins d'ADN, sont liés par une liaison covalente aux microsphères.
Selon une autre particularité, la composition comprend des microsphères de 0,05 à 100 microns.
1o Selon une autre particularité, la composition de marquage selon l'invention est utilisée pour le marquage d'un vernis ou d'une encre.
Selon une autre particularité, la composition de marquage selon l'invention est utilisée pour le marquage de matériaux polymères ou de colle.
Selon une autre particularité, le matériau polymère est choisi parmi is le polystyrène non expansé, le polypropylène, le polyéthylène, le polyamide, le polyester, le polyméthacrylate de méthyle, le polycarbonate.
Selon une autre particularité, le matériau polymère est un film de 8 à
1000 Nm d'épaisseur.
Selon une autre particularité, le procédé de fabrication consistant à
2o créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères est utilisé pour l'étude comportementale de molécules fluorescentes.
D'autres particularités et avantages de la présente invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description ci-après faite en 2s référence au dessin annexé dans lequel la figure unique représente une réaction de couplage selon l'invention d'une microsphère avec une molécule fluorescente.
La composition de marquage, selon l'invention, comprend des microsphères ou microperles et des molécules fluorescentes reliées entre 3o elles par des liaisons covalentes, par exemple de type amide. Cette liaison chimique entre les molécules fluorescentes et les microsphères est obtenue en faisant réagir des microsphères présentant des terminaisons amines (NHZ) avec des molécules fluorescentes présentant des terminaisons réactives aux amines primaires. Cette liaison chimique assure une liaison s stable quel que soit l'environnement. La désignation "molécules fluorescentes" représente toutes molécules dont la fluorescence peut être observée par un moyen de détection tel qu'un microscope à épifluorescence.
Les microsphères, dont la taille peut varier de 0,05 Nm à 100 Nm, peuvent être de natures différentes, organiques ou minérales. Selon un io mode de réalisation, les microsphères sont à base physique minérale et sont constituées de microsphères poreuses de silice greffées d'amines primaires.
La porosité des microsphères peut bien entendu varier. La surface active des microsphères, définie par le nombre de sites amines, est fonction de la porosité de celle-ci. A titre d'exemple, les microsphères poreuses de silice 1s sont de type "Uptisphères NHZ" commercialisées par la société InterChim ou de type "Exsil Amino" commercialisées par la société YMC, ces microsphères étant traditionnellement utilisées dans les colonnes de chromatographie. Elles présentent par exemple une porosité de l'ordre de 100 à 120 ä. Afin d'assurer une réaction de marquage optimale, les 2o microsphères doivent être parfaitement propres.
Selon une variante, les microsphères à base physique minérale sont en silice pleine, ce qui réduit la surface active de la microsphère. Les microsphères en silice pleines commercialisées par la société Bangs Laboratory comprennent en surface des greffes de groupement carboxyles.
2s Pour obtenir des Microsphères de silice pleine disposant de greffes amines primaires, on fait réagir des diamines sur les groupements carboxyles.
Selon une autre variante, les microsphères à base physique minérale sont en céramique. La céramique de ces microsphères en céramique commercialisées par la société « Sphere Service », est un mélange de silice dans une proportion allant de 55 à 65% et de métaux divers tels que du fer, de l'aluminium, du titane.
Les molécules fluorescentes utilisées dans la présente invention peuvent être observées au moyen d'un microscope à lampe à vapeur de s mercure ou xénon en utilisant un jeu de filtres adapté aux longueurs d'ondes d'excitation et d'émission de la molécule fluorescente. Ce jeu de filtre comprend un filtre d'excitation et un filtre d'émission provoquant la fluorescence par sélection d'un pic d'excitation et permet de mettre en évidence les molécules fluorescentes en améliorant le contraste entre la 1o sphère et l'environnement dans lequel se trouve la sphère. Afin d'assurer l'efficacité du produit de marquage, les molécules fluorescentes utilisées doivent être photostables et ainsi résister à une exposition prolongée à la lumière du jour de 30 jours minimum et à une exposition minimum de 3 minutes à la source d'excitation constituée par la lampe de mercure ou 1s xénon montée sur un microscope. Les molécules fluorescentes se dissolvent dans l'eau ou tout autre solvant afin de permettre la réaction de marquage ou couplage entre les molécules fluorescentes et les microsphères.
A titre d'exemple, la gamme de molécules fluorescentes de la société Molecular Probes, commercialisée sous la marque "ALEXA", peut 2o être utilisée. De même, la molécule fluorescente « FLUOR X »
commercialisée par la société Research Organics et les molécules de la gamme « BODIPY » commercialisées par Molecular Probes peuvent être utilisées. La molécule « FLUOR X » présente une terminaison succinimidyl ester. Les gammes "ALEXA" et « BODIPY » comprennent également des 2s molécules fluorescentes à terminaison succinimidyl ester de différentes longueurs d'onde d'excitation et d'émission à la vapeur de mercure. On peut imaginer pouvoir modifier la molécule fluorescente en fonction des greffes des microsphères.
Les molécules fluorescentes à terminaison succinimidyl ester, par 3o exemple de la gamme « ALEXA », sont conditionnées sous forme déshydratée dans des tubes de polypropylène et actuellement commercialisées dans des kits de marquage de protéines. Ces molécules fluorescentes, utilisées dans le domaine du marquage de protéines, présentent une fluorescence stable qui tient dans le temps. La terminaison s succinimidyl ester de cette molécule fluorescente permet de former une liaison carboxamide entre la microsphère et la molécule fluorescente selon la réaction illustrée à la figure 1, sur laquelle - "A" représente une microsphère greffée d'amine primaire (NHz), - "B" représente la molécule fluorescente présentant une terminaison io succinimidyl ester, "R," étant le groupement fluorescent de la molécule, - "C" représente la microsphère fluorescente, et - "D" représente le composé secondaire de la réaction.
Suivant la nature de la liaison, une solution tampon peut être ajoutée lors de la réaction de marquage afin d'ajuster les conditions de pH et is optimiser la réaction. Dans le cas d'une terminaison succinimidyl ester, le pH
du mélange doit étre compris entre 7 et 9, préférentiellement entre 7,8 et 8,5.
Le pH est augmenté par l'addition d'une solution tampon dépourvue d'ions ammonium ou d'amines primaires afin d'éviter toute réaction parasite. A titre d'exemple, une solution de bicarbonate de sodium peut étre utilisée comme 2o solution tampon.
Un exemple de réaction de marquage selon l'invention va à présent étre décrit. Dans cet exemple, la réaction consiste à faire réagir des microsphères poreuses de silice aminée avec des molécules fluorescentes de type "ALEXA", pour obtenir des microsphères de silice fluorescentes. Le 2s procédé de fabrication comprend les étapes suivantes - dans un bécher, préparer 30 ml d'une solution tampon de bicarbonate de sodium à 1 M, pour obtenir un pH de l'ordre de 8,3 (+/- 0,1 ) ;
- mettre en solution de 7,5 g microsphères, par exemple déshydratées, dans la solution tampon ;
30 - agiter pour bien disperser les microsphères dans la solution ;
- amener un tube contenant 5 mg de molécule fluorescente à
température ambiante ;
- mettre 1 ml d'eau déminéralisée dans le tube contenant les molécules fluorescentes, fermer le tube et le renverser plusieurs fois pour s bien solubiliser les molécules fluorescentes ;
verser le contenu du tube dans le bécher, rincer le tube avec 1 ml d'eau déminéralisée et verser l'eau de rinçage dans le bécher ;
- agiter magnétiquement avec une barre . d'agitation pendant approximativement une heure à température ambiante ;
io - laver les microsphères fluorescentes obtenues pour les séparer des sels du tampon, des molécules fluorescentes non liées et des molécules secondaires de la réaction ;
- évaporer l'eau.
Ce procédé permet ainsi d'obtenir des microsphères de silice is fluorescentes déshydratées. L'étape de lavement des microsphères peut se faire suivant deux méthodes différentes.
Selon la première méthode, les microsphères fluorescentes obtenues sont déposées dans un boudin de dialyse introduit dans un grand volume d'eau, par exemple 5 grammes de microsphères sous dialyse dans 3 litres d'eau. On agite l'ensemble, par exemple, par agitation magnétique, pendant plusieurs heures. La mesure du PH de l'eau avant et après dialyse indique alors que le transfert des sels depuis les microsphères fluorescentes vers l'eau se produit bien. La stabilisation du PH après plusieurs bains de dialyse indique la fin du lavement.
2s Selon la deuxième méthode, les microsphères fluorescentes sont dispersées dans un grand volume d'eau. On agite et on laisse au repos pendant plusieurs heures, les microsphères sédimentent alors lentement.
Ensuite on retire l'eau chargée en sets et en molécules fluorescentes non liées. La mesure du PH de l'eau avant et après la dispersion indique que le 3o transfert des sels depuis les microsphères vers l'eau se produit bien. La stabilisation du PH après plusieurs bains indique la fin du lavement. Après lavement, on peut éventuellement passer d'une base aqueuse à une base solvant.
Selon une variante de réalisation, les microsphères sont des s microsphères de copolymères contenant 10% de divinylbenzène. Ces microsphères disposant d'un certain taux de greffes amines sont, par exemple, synthétisées par la société « DYNO » en Norvège. Ces microsphères de base physique réticulée, tout comme les microsphères à
base physique minérale et à l'inverse des microsphères à base polymère tel 1o que le polystyrène (PS) ou le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), sont compatibles avec des solvants agressifs tels que ceux utilisés dans les encres comme l'éthylacétate. En revanche ces microsphères en divinylbenzène ne sont pas résistantes thermiquement et ne pourront pas être utilisées pour le marquage de produits en matériau polymère.
1s Le contrôle du marquage des microsphères peut être effectué par observation au microscope à épifluorescence. Une répartition homogène des molécules fluorescentes sur les microsphères est obtenue par un bon dosage de la quantité de fluorescence utilisée par gramme de microsphères.
Ce dosage, qui peut être défini de façon empirique, est fonction de la 2o réactivité des microsphères et des molécules fluorescentes. Le dosage dépend ainsi de plusieurs paramètres. Ces paramètres sont la densité et la porosité des microsphères, le nombre de sites amines (NH2) disponibles par microsphère, l'activité des molécules fluorescentes, la masse molaire de la molécule fluorescente et le volume de la réaction.
2s Quantitativement le marquage se caractérise par le rapport R de la masse de molécules fluorescentes dépensées par gramme de microsphères marquées. Dans l'exemple décrit précédemment, le rapport R est de l'ordre de 0,67 °/oo~
Pour leur conservation, les microsphères de silice fluorescente seront protégées de la lumière, par exemple dans un flacon de polypropylène ambré, conservé à une température de l'ordre de 4°C.
Les microsphères, conservées sous forme de poudre, peuvent être s utilisées telles quelles dans différentes applications. Pour le marquage ou la traçabilité secrète de liquides, tels que des hydrocarbures, vernis ou boues, les microsphères sont mises en solution dans un solvant miscible au liquide que l'on désire marquer. Des additifs tels que des mouillants ou dispersants peuvent être ajoutés pour assurer une dispersion homogène des 1o microsphères fluorescentes de silice dans les différentes solutions.
Suivant la concentration en microsphères fluorescentes, l'observation d'un échantillon d'un produit liquide marqué peut être précédée d'une étape de concentration ou de récupération des microsphères fluorescentes, par exemple, par un procédé de centrifugation ou un procédé de filtration ou un 1s procédé de récupération magnétique basé sur l'utilisation de microsphères disposant d'une base physique magnétique, par exemple, en céramique. Les microsphères fluorescentes selon l'invention peuvent être insérées dans une encre ou vernis. L'encre ou le vernis peuvent ensuite être appliqués sur différents supports, tels que des emballages, afin de marquer ledit support et 20 les produits qu'il contient. A titre d'exempte, les microsphères peuvent être mises en solution dans un solvant alcool/ester pour le marquage d'encres d'héliogravure ou de flexographie. Un solvant (cyclohexanol/
Ethoxypropylacetate) peut être utilisé pour la traçabilité des encres et vernis de tampographie. D'autres types de solvant peuvent être utilisés pour le 2s marquage d'encres et vernis utilisés dans les procédés "offset" ou de sérigraphie. Les microsphères sont mises en solution dans l'eau pour le marquage de systèmes aqueux. Les microsphères fluorescentes selon l'invention peuvent également être insérées dans des produits lors de leur fabrication, tels que dans la résine utilisée pour la fabrication de contre-3o plaqués. Les microsphères fluorescentes peuvent être utilisées pour le marquage de colle ou de matériaux polymères, tels que le polystyrène non expansé, le polypropylène, le polyéthylène, le polyamide, le polyester, le le polyméthacrylate de méthyle,... Pour le marquage, par exemple, de produits en matériau plastique obtenus par un passage en extrusion, on mélange s (directement ou par l'intermédiaire d'un mélange maître) tes microsphères minérales fluorescentes sèches à des granulés de polymère ou à une poudre de polymères. Le mélange est extrudé puis transformé en film (par étirement, par le procédé bulbe), en fil (par filières), en.forme spécifique (par injection dans un moule). Les matériaux polymères ne sont pas toujours 1o extrudés, ils peuvent être « thermoformer », c'est-à-dire mouler sous pression et sous la chaleur. Ils peuvent également « polymériser » par réaction chimique et/ou sous l'action de la chaleur ou de rayonnement UV.
Les microsphères peuvent également être insérées en tant qu'additif lors de l'étape de polymérisation du matériau polymère. Le polystyrène est par 1s exemple utilisé dans la fabrication de plaques ou de films, le polyéthylène dans la fabrication d'emballage flexible ou de « blister », le polypropylène dans la fabrication de film de polypropylène servant de support aux billets de banque, le polyamide et le polyester dans la fabrication de fil textile, le le polyméthacrylate de méthyle dans la fabrication de matériaux de base de 2o stylos ou de briquet, le polycarbonate dans la fabrication d'emballage, les élastomères dans la fabrication de poupées ou de revêtement de manches d'outils.
La nature physique des microsphères peut être choisie en fonction de l'utilisation qui en sera faite. Les microsphères de silice seront de 2s préférence utilisées pour le marquage de produits très agressifs, ou destinés à être portés à haute température. Les températures de fabrication de produit en matériau polymère étant souvent élevées, les microsphères de silice, résistantes thermiquement, sont parfaitement adaptées pour le marquage de ces produits en matériau polymère. Bien entendu différents 3o types de liaison covalentes peuvent être envisagés entre la microsphère et la molécule fluorescente. Dans le cas de liaison de type amide, des fluorescences présentant des terminaisons isothiocyanate ou chlorure de sulfonyl peuvent être utilisées pour former respectivement des liaisons thio-urée et sulfonamide.
s Le choix de la taille des microsphères est effectué en fonction de leur application. Dans le cas de l'insertion de microsphères fluorescentes dans une encre opaque destinée à être appliquée sur des produits pour leur marquage, la taille des microsphères sera fonction .de l'épaisseur de la couche d'encre déposée. Afin d'éviter qu'un grand nombre de microsphères 1o fluorescentes ne soient perdues dans la masse d'encre déposée et que seules les microsphères fluorescentes de surface soient visibles au microscope, la taille des microsphères est sensiblement égale à l'épaisseur de la couche d'encre opaque. Selon le procédé d'application de l'encre, la couche peut atteindre une épaisseur de 30 à 100 Nm ou être de l'ordre de 1 1s à 2 Nm, obtenue, par exemple, par un procédé d'héliogravure. Dans le cas de vernis déposés sur des produits ou de matériaux polymères translucides, la taille des microsphères a peu d'importance étant donné que la fluorescence des microsphères comprises dans la masse pourra être observée à travers le vernis ou le matériau polymère. Dans le cas du 2o marquage de liquides tels que des hydrocarbures ou des boues, la taille des microsphères peut être fonction du procédé de concentration utilisé. Pour des produits en matériau polymère coloré, on peut dans certains cas observer les microsphères fluorescentes à travers la masse opacifiante du plastique. Dans d'autres cas, on procède par dissolution du polymère Zs marqué et par filtration du produit de dissolution. Les micosphères sont alors observées sur les membranes de filtration du produit de dissolution.
Selon un mode de réalisation, les microsphères fluorescentes selon l'invention sont associées à un traceur, de type ADN, pour assurer l'inviolabilité du marquage. Les molécules d'ADN synthétisées peuvent être 3o déposées en même temps que les microsphères sur les produits à marquer, les microsphères servant alors uniquement à localiser les brins d'ADN. La réaction de liaison de l'ADN avec les microsphères peut étre effectuée avant ou après la réaction de marquage des microsphères avec les molécules fluorescentes décrites précédemment. Dans le cas de microsphères de s polymères ou copolymères, des liaisons covalentes de différentes natures peuvent être envisagées.
La composition de marquage, selon l'invention, permet de réaliser un marquage efficace et durable d'un grand nombre de produits qui demeurait impossible par l'utilisation des microsphères à base polymère de l'art 1o antérieur. De plus, le procédé de fabrication selon l'invention, consistant à
créer une liaison covalente entre les molécules fluorescentes et les microsphères, peut être utilisé pour faciliter l'étude des comportements de molécules fluorescentes, tels que la durée de vie de la fluorescence. Dans le cas, par exemple, de molécules fluorescentes destinées au marquage de 1s protéines, il est plus facile d'étudier le comportement de la molécule sur un support tel qu'une microsphère que sur une protéine. La présence d'une liaison covalente stable entre la molécule fluorescente et la microsphère permet d'assurer une étude comportementale efficace de la molécule fluorescente. Dans le cas de molécules fluorescentes destinées aux zo protéines, l'étude sur microsphère selon l'invention est d'autant plus réaliste que les accroches entre la molécule fluorescente et la microsphère et entre la molécule fluorescente et la protéine sont de même nature, constituées chacune par une liaison covalente.
II doit être évident pour les personnes versées dans l'art que la 2s présente invention permet des modes de réalisation sous de nombreuses autres formes spécifiques sans l'éloigner du domaine d'application de l'invention comme revendiqué. Par conséquent, les présents modes de réalisation doivent être considérés à titre d'illustration, mais peuvent être modifiés dans le domaine défini par la portée des revendications jointes, et 30 l'invention ne doit pas être limitée aux détails donnés ci-dessus.
s Selon une autre particularité, les microsphères sont en silice poreuse.
Selon une autre particularité, les microsphères sont en silice pleine.
Selon une autre particularité, la molécule fluorescente présente une terminaison succinimidyl ester réagissant avec les greffes d'amines des 1o microsphères de silice pour former des liaisons carboxamide.
Selon une autre particularité, la molécule fluorescente est une molécule commercialisée sous la marque "ALEXA".
Selon une autre particularité, les microsphères sont de type "Uptisphères NHZ' commercialisées par la société InterChim ou de type is "Exsil Amino" commercialisées par la société YMC.
Selon une autre particularité, le procédé comprend - une étape de préparation d'une solution tampon à un pH
déterminé ;
- une étape de mise en solution de microsphères dans la solution 2o tampon ;
- une étape de mise en solution dans un solvant de molécules fluorescentes déshydratées ;
- une étape de mélange et d'agitation pendant un temps déterminé
de la solution de molécules fluorescentes et des microsphères, à une 2s température déterminée ;
- une étape de lavement des microsphères fluorescentes obtenues pour les séparer des sels du tampon, des molécules fluorescentes non liées et des molécules secondaires de la réaction ;
- et une étape d'évaporation du solvant.
3o Selon une autre particularité, le procédé comprend - une étape de préparation d'une solution tampon pour obtenir un pH
compris entre 7,8 et 8,5 ;
- une étape de mise en solution dans la solution tampon de microsphères de silice poreuse ;
s - une étape de mise en solution dans de l'eau déminéralisée de molécules fluorescentes déshydratées présentant une terminaison succinimidyl ester ;
- une étape de mélange et d'agitation pendant approximativement une heure, de la solution de molécules fluorescentes et des microsphères, à
Io température ambiante ;
- une étape de lavement des microsphères fluorescentes obtenues pour les séparer des sels du tampon, des molécules fluorescentes non liées et des molécules secondaires de la réaction ;
- et une étape d'évaporation du solvant.
is Selon une autre particularité, le procédé comprend une étape d'addition d'un traceur constitué par des brins d'ADN.
Selon une autre particularité, le procédé comprend une étape de couplage des brins d'ADN avec les microsphères.
Un autre but de l'invention est de proposer une composition de 2o marquage de produits solides ou liquides caractérisée en ce qu'elle comprend des microsphères à base physique minérale présentant des liaisons covalentes avec des molécules fluorescentes.
Selon une autre particularité, les molécules fluorescentes sont liées aux microsphères par des liaisons de type amide.
2s Selon une autre particularité, la composition comprend des microsphères présentant des liaisons carboxamide avec des molécules fluorescentes.
Selon une autre particularité, les microsphères sont des microsphères poreuses de silice présentant des greffes d'amines (NHz) assurant l'établissement des liaisons carboxamide avec les molécules fluorescentes.
Selon une autre particularité, les microsphères sont en silice pleine.
Selon une autre particularité, la composition comprend des traceurs s constitués de brins d'ADN.
Selon une autre particularité, des traceurs, constitués de brins d'ADN, sont liés par une liaison covalente aux microsphères.
Selon une autre particularité, la composition comprend des microsphères de 0,05 à 100 microns.
1o Selon une autre particularité, la composition de marquage selon l'invention est utilisée pour le marquage d'un vernis ou d'une encre.
Selon une autre particularité, la composition de marquage selon l'invention est utilisée pour le marquage de matériaux polymères ou de colle.
Selon une autre particularité, le matériau polymère est choisi parmi is le polystyrène non expansé, le polypropylène, le polyéthylène, le polyamide, le polyester, le polyméthacrylate de méthyle, le polycarbonate.
Selon une autre particularité, le matériau polymère est un film de 8 à
1000 Nm d'épaisseur.
Selon une autre particularité, le procédé de fabrication consistant à
2o créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères est utilisé pour l'étude comportementale de molécules fluorescentes.
D'autres particularités et avantages de la présente invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description ci-après faite en 2s référence au dessin annexé dans lequel la figure unique représente une réaction de couplage selon l'invention d'une microsphère avec une molécule fluorescente.
La composition de marquage, selon l'invention, comprend des microsphères ou microperles et des molécules fluorescentes reliées entre 3o elles par des liaisons covalentes, par exemple de type amide. Cette liaison chimique entre les molécules fluorescentes et les microsphères est obtenue en faisant réagir des microsphères présentant des terminaisons amines (NHZ) avec des molécules fluorescentes présentant des terminaisons réactives aux amines primaires. Cette liaison chimique assure une liaison s stable quel que soit l'environnement. La désignation "molécules fluorescentes" représente toutes molécules dont la fluorescence peut être observée par un moyen de détection tel qu'un microscope à épifluorescence.
Les microsphères, dont la taille peut varier de 0,05 Nm à 100 Nm, peuvent être de natures différentes, organiques ou minérales. Selon un io mode de réalisation, les microsphères sont à base physique minérale et sont constituées de microsphères poreuses de silice greffées d'amines primaires.
La porosité des microsphères peut bien entendu varier. La surface active des microsphères, définie par le nombre de sites amines, est fonction de la porosité de celle-ci. A titre d'exemple, les microsphères poreuses de silice 1s sont de type "Uptisphères NHZ" commercialisées par la société InterChim ou de type "Exsil Amino" commercialisées par la société YMC, ces microsphères étant traditionnellement utilisées dans les colonnes de chromatographie. Elles présentent par exemple une porosité de l'ordre de 100 à 120 ä. Afin d'assurer une réaction de marquage optimale, les 2o microsphères doivent être parfaitement propres.
Selon une variante, les microsphères à base physique minérale sont en silice pleine, ce qui réduit la surface active de la microsphère. Les microsphères en silice pleines commercialisées par la société Bangs Laboratory comprennent en surface des greffes de groupement carboxyles.
2s Pour obtenir des Microsphères de silice pleine disposant de greffes amines primaires, on fait réagir des diamines sur les groupements carboxyles.
Selon une autre variante, les microsphères à base physique minérale sont en céramique. La céramique de ces microsphères en céramique commercialisées par la société « Sphere Service », est un mélange de silice dans une proportion allant de 55 à 65% et de métaux divers tels que du fer, de l'aluminium, du titane.
Les molécules fluorescentes utilisées dans la présente invention peuvent être observées au moyen d'un microscope à lampe à vapeur de s mercure ou xénon en utilisant un jeu de filtres adapté aux longueurs d'ondes d'excitation et d'émission de la molécule fluorescente. Ce jeu de filtre comprend un filtre d'excitation et un filtre d'émission provoquant la fluorescence par sélection d'un pic d'excitation et permet de mettre en évidence les molécules fluorescentes en améliorant le contraste entre la 1o sphère et l'environnement dans lequel se trouve la sphère. Afin d'assurer l'efficacité du produit de marquage, les molécules fluorescentes utilisées doivent être photostables et ainsi résister à une exposition prolongée à la lumière du jour de 30 jours minimum et à une exposition minimum de 3 minutes à la source d'excitation constituée par la lampe de mercure ou 1s xénon montée sur un microscope. Les molécules fluorescentes se dissolvent dans l'eau ou tout autre solvant afin de permettre la réaction de marquage ou couplage entre les molécules fluorescentes et les microsphères.
A titre d'exemple, la gamme de molécules fluorescentes de la société Molecular Probes, commercialisée sous la marque "ALEXA", peut 2o être utilisée. De même, la molécule fluorescente « FLUOR X »
commercialisée par la société Research Organics et les molécules de la gamme « BODIPY » commercialisées par Molecular Probes peuvent être utilisées. La molécule « FLUOR X » présente une terminaison succinimidyl ester. Les gammes "ALEXA" et « BODIPY » comprennent également des 2s molécules fluorescentes à terminaison succinimidyl ester de différentes longueurs d'onde d'excitation et d'émission à la vapeur de mercure. On peut imaginer pouvoir modifier la molécule fluorescente en fonction des greffes des microsphères.
Les molécules fluorescentes à terminaison succinimidyl ester, par 3o exemple de la gamme « ALEXA », sont conditionnées sous forme déshydratée dans des tubes de polypropylène et actuellement commercialisées dans des kits de marquage de protéines. Ces molécules fluorescentes, utilisées dans le domaine du marquage de protéines, présentent une fluorescence stable qui tient dans le temps. La terminaison s succinimidyl ester de cette molécule fluorescente permet de former une liaison carboxamide entre la microsphère et la molécule fluorescente selon la réaction illustrée à la figure 1, sur laquelle - "A" représente une microsphère greffée d'amine primaire (NHz), - "B" représente la molécule fluorescente présentant une terminaison io succinimidyl ester, "R," étant le groupement fluorescent de la molécule, - "C" représente la microsphère fluorescente, et - "D" représente le composé secondaire de la réaction.
Suivant la nature de la liaison, une solution tampon peut être ajoutée lors de la réaction de marquage afin d'ajuster les conditions de pH et is optimiser la réaction. Dans le cas d'une terminaison succinimidyl ester, le pH
du mélange doit étre compris entre 7 et 9, préférentiellement entre 7,8 et 8,5.
Le pH est augmenté par l'addition d'une solution tampon dépourvue d'ions ammonium ou d'amines primaires afin d'éviter toute réaction parasite. A titre d'exemple, une solution de bicarbonate de sodium peut étre utilisée comme 2o solution tampon.
Un exemple de réaction de marquage selon l'invention va à présent étre décrit. Dans cet exemple, la réaction consiste à faire réagir des microsphères poreuses de silice aminée avec des molécules fluorescentes de type "ALEXA", pour obtenir des microsphères de silice fluorescentes. Le 2s procédé de fabrication comprend les étapes suivantes - dans un bécher, préparer 30 ml d'une solution tampon de bicarbonate de sodium à 1 M, pour obtenir un pH de l'ordre de 8,3 (+/- 0,1 ) ;
- mettre en solution de 7,5 g microsphères, par exemple déshydratées, dans la solution tampon ;
30 - agiter pour bien disperser les microsphères dans la solution ;
- amener un tube contenant 5 mg de molécule fluorescente à
température ambiante ;
- mettre 1 ml d'eau déminéralisée dans le tube contenant les molécules fluorescentes, fermer le tube et le renverser plusieurs fois pour s bien solubiliser les molécules fluorescentes ;
verser le contenu du tube dans le bécher, rincer le tube avec 1 ml d'eau déminéralisée et verser l'eau de rinçage dans le bécher ;
- agiter magnétiquement avec une barre . d'agitation pendant approximativement une heure à température ambiante ;
io - laver les microsphères fluorescentes obtenues pour les séparer des sels du tampon, des molécules fluorescentes non liées et des molécules secondaires de la réaction ;
- évaporer l'eau.
Ce procédé permet ainsi d'obtenir des microsphères de silice is fluorescentes déshydratées. L'étape de lavement des microsphères peut se faire suivant deux méthodes différentes.
Selon la première méthode, les microsphères fluorescentes obtenues sont déposées dans un boudin de dialyse introduit dans un grand volume d'eau, par exemple 5 grammes de microsphères sous dialyse dans 3 litres d'eau. On agite l'ensemble, par exemple, par agitation magnétique, pendant plusieurs heures. La mesure du PH de l'eau avant et après dialyse indique alors que le transfert des sels depuis les microsphères fluorescentes vers l'eau se produit bien. La stabilisation du PH après plusieurs bains de dialyse indique la fin du lavement.
2s Selon la deuxième méthode, les microsphères fluorescentes sont dispersées dans un grand volume d'eau. On agite et on laisse au repos pendant plusieurs heures, les microsphères sédimentent alors lentement.
Ensuite on retire l'eau chargée en sets et en molécules fluorescentes non liées. La mesure du PH de l'eau avant et après la dispersion indique que le 3o transfert des sels depuis les microsphères vers l'eau se produit bien. La stabilisation du PH après plusieurs bains indique la fin du lavement. Après lavement, on peut éventuellement passer d'une base aqueuse à une base solvant.
Selon une variante de réalisation, les microsphères sont des s microsphères de copolymères contenant 10% de divinylbenzène. Ces microsphères disposant d'un certain taux de greffes amines sont, par exemple, synthétisées par la société « DYNO » en Norvège. Ces microsphères de base physique réticulée, tout comme les microsphères à
base physique minérale et à l'inverse des microsphères à base polymère tel 1o que le polystyrène (PS) ou le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), sont compatibles avec des solvants agressifs tels que ceux utilisés dans les encres comme l'éthylacétate. En revanche ces microsphères en divinylbenzène ne sont pas résistantes thermiquement et ne pourront pas être utilisées pour le marquage de produits en matériau polymère.
1s Le contrôle du marquage des microsphères peut être effectué par observation au microscope à épifluorescence. Une répartition homogène des molécules fluorescentes sur les microsphères est obtenue par un bon dosage de la quantité de fluorescence utilisée par gramme de microsphères.
Ce dosage, qui peut être défini de façon empirique, est fonction de la 2o réactivité des microsphères et des molécules fluorescentes. Le dosage dépend ainsi de plusieurs paramètres. Ces paramètres sont la densité et la porosité des microsphères, le nombre de sites amines (NH2) disponibles par microsphère, l'activité des molécules fluorescentes, la masse molaire de la molécule fluorescente et le volume de la réaction.
2s Quantitativement le marquage se caractérise par le rapport R de la masse de molécules fluorescentes dépensées par gramme de microsphères marquées. Dans l'exemple décrit précédemment, le rapport R est de l'ordre de 0,67 °/oo~
Pour leur conservation, les microsphères de silice fluorescente seront protégées de la lumière, par exemple dans un flacon de polypropylène ambré, conservé à une température de l'ordre de 4°C.
Les microsphères, conservées sous forme de poudre, peuvent être s utilisées telles quelles dans différentes applications. Pour le marquage ou la traçabilité secrète de liquides, tels que des hydrocarbures, vernis ou boues, les microsphères sont mises en solution dans un solvant miscible au liquide que l'on désire marquer. Des additifs tels que des mouillants ou dispersants peuvent être ajoutés pour assurer une dispersion homogène des 1o microsphères fluorescentes de silice dans les différentes solutions.
Suivant la concentration en microsphères fluorescentes, l'observation d'un échantillon d'un produit liquide marqué peut être précédée d'une étape de concentration ou de récupération des microsphères fluorescentes, par exemple, par un procédé de centrifugation ou un procédé de filtration ou un 1s procédé de récupération magnétique basé sur l'utilisation de microsphères disposant d'une base physique magnétique, par exemple, en céramique. Les microsphères fluorescentes selon l'invention peuvent être insérées dans une encre ou vernis. L'encre ou le vernis peuvent ensuite être appliqués sur différents supports, tels que des emballages, afin de marquer ledit support et 20 les produits qu'il contient. A titre d'exempte, les microsphères peuvent être mises en solution dans un solvant alcool/ester pour le marquage d'encres d'héliogravure ou de flexographie. Un solvant (cyclohexanol/
Ethoxypropylacetate) peut être utilisé pour la traçabilité des encres et vernis de tampographie. D'autres types de solvant peuvent être utilisés pour le 2s marquage d'encres et vernis utilisés dans les procédés "offset" ou de sérigraphie. Les microsphères sont mises en solution dans l'eau pour le marquage de systèmes aqueux. Les microsphères fluorescentes selon l'invention peuvent également être insérées dans des produits lors de leur fabrication, tels que dans la résine utilisée pour la fabrication de contre-3o plaqués. Les microsphères fluorescentes peuvent être utilisées pour le marquage de colle ou de matériaux polymères, tels que le polystyrène non expansé, le polypropylène, le polyéthylène, le polyamide, le polyester, le le polyméthacrylate de méthyle,... Pour le marquage, par exemple, de produits en matériau plastique obtenus par un passage en extrusion, on mélange s (directement ou par l'intermédiaire d'un mélange maître) tes microsphères minérales fluorescentes sèches à des granulés de polymère ou à une poudre de polymères. Le mélange est extrudé puis transformé en film (par étirement, par le procédé bulbe), en fil (par filières), en.forme spécifique (par injection dans un moule). Les matériaux polymères ne sont pas toujours 1o extrudés, ils peuvent être « thermoformer », c'est-à-dire mouler sous pression et sous la chaleur. Ils peuvent également « polymériser » par réaction chimique et/ou sous l'action de la chaleur ou de rayonnement UV.
Les microsphères peuvent également être insérées en tant qu'additif lors de l'étape de polymérisation du matériau polymère. Le polystyrène est par 1s exemple utilisé dans la fabrication de plaques ou de films, le polyéthylène dans la fabrication d'emballage flexible ou de « blister », le polypropylène dans la fabrication de film de polypropylène servant de support aux billets de banque, le polyamide et le polyester dans la fabrication de fil textile, le le polyméthacrylate de méthyle dans la fabrication de matériaux de base de 2o stylos ou de briquet, le polycarbonate dans la fabrication d'emballage, les élastomères dans la fabrication de poupées ou de revêtement de manches d'outils.
La nature physique des microsphères peut être choisie en fonction de l'utilisation qui en sera faite. Les microsphères de silice seront de 2s préférence utilisées pour le marquage de produits très agressifs, ou destinés à être portés à haute température. Les températures de fabrication de produit en matériau polymère étant souvent élevées, les microsphères de silice, résistantes thermiquement, sont parfaitement adaptées pour le marquage de ces produits en matériau polymère. Bien entendu différents 3o types de liaison covalentes peuvent être envisagés entre la microsphère et la molécule fluorescente. Dans le cas de liaison de type amide, des fluorescences présentant des terminaisons isothiocyanate ou chlorure de sulfonyl peuvent être utilisées pour former respectivement des liaisons thio-urée et sulfonamide.
s Le choix de la taille des microsphères est effectué en fonction de leur application. Dans le cas de l'insertion de microsphères fluorescentes dans une encre opaque destinée à être appliquée sur des produits pour leur marquage, la taille des microsphères sera fonction .de l'épaisseur de la couche d'encre déposée. Afin d'éviter qu'un grand nombre de microsphères 1o fluorescentes ne soient perdues dans la masse d'encre déposée et que seules les microsphères fluorescentes de surface soient visibles au microscope, la taille des microsphères est sensiblement égale à l'épaisseur de la couche d'encre opaque. Selon le procédé d'application de l'encre, la couche peut atteindre une épaisseur de 30 à 100 Nm ou être de l'ordre de 1 1s à 2 Nm, obtenue, par exemple, par un procédé d'héliogravure. Dans le cas de vernis déposés sur des produits ou de matériaux polymères translucides, la taille des microsphères a peu d'importance étant donné que la fluorescence des microsphères comprises dans la masse pourra être observée à travers le vernis ou le matériau polymère. Dans le cas du 2o marquage de liquides tels que des hydrocarbures ou des boues, la taille des microsphères peut être fonction du procédé de concentration utilisé. Pour des produits en matériau polymère coloré, on peut dans certains cas observer les microsphères fluorescentes à travers la masse opacifiante du plastique. Dans d'autres cas, on procède par dissolution du polymère Zs marqué et par filtration du produit de dissolution. Les micosphères sont alors observées sur les membranes de filtration du produit de dissolution.
Selon un mode de réalisation, les microsphères fluorescentes selon l'invention sont associées à un traceur, de type ADN, pour assurer l'inviolabilité du marquage. Les molécules d'ADN synthétisées peuvent être 3o déposées en même temps que les microsphères sur les produits à marquer, les microsphères servant alors uniquement à localiser les brins d'ADN. La réaction de liaison de l'ADN avec les microsphères peut étre effectuée avant ou après la réaction de marquage des microsphères avec les molécules fluorescentes décrites précédemment. Dans le cas de microsphères de s polymères ou copolymères, des liaisons covalentes de différentes natures peuvent être envisagées.
La composition de marquage, selon l'invention, permet de réaliser un marquage efficace et durable d'un grand nombre de produits qui demeurait impossible par l'utilisation des microsphères à base polymère de l'art 1o antérieur. De plus, le procédé de fabrication selon l'invention, consistant à
créer une liaison covalente entre les molécules fluorescentes et les microsphères, peut être utilisé pour faciliter l'étude des comportements de molécules fluorescentes, tels que la durée de vie de la fluorescence. Dans le cas, par exemple, de molécules fluorescentes destinées au marquage de 1s protéines, il est plus facile d'étudier le comportement de la molécule sur un support tel qu'une microsphère que sur une protéine. La présence d'une liaison covalente stable entre la molécule fluorescente et la microsphère permet d'assurer une étude comportementale efficace de la molécule fluorescente. Dans le cas de molécules fluorescentes destinées aux zo protéines, l'étude sur microsphère selon l'invention est d'autant plus réaliste que les accroches entre la molécule fluorescente et la microsphère et entre la molécule fluorescente et la protéine sont de même nature, constituées chacune par une liaison covalente.
II doit être évident pour les personnes versées dans l'art que la 2s présente invention permet des modes de réalisation sous de nombreuses autres formes spécifiques sans l'éloigner du domaine d'application de l'invention comme revendiqué. Par conséquent, les présents modes de réalisation doivent être considérés à titre d'illustration, mais peuvent être modifiés dans le domaine défini par la portée des revendications jointes, et 30 l'invention ne doit pas être limitée aux détails donnés ci-dessus.
Claims (25)
1. Procédé de fabrication d'une composition de marquage de produits solides ou liquides, caractérisé en ce qu'il consiste à créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères à
base physique minérale.
base physique minérale.
2. Procédé de fabrication d'une composition de marquage de produits solides ou liquides, caractérisé en ce qu'il consiste à créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères à
base de divinylbenzène.
base de divinylbenzène.
3. Procédé de fabrication d'une composition de marquage de produits solides ou liquides selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à créer la liaison covalente par une réaction des microsphères présentant des terminaisons amines primaires avec des molécules fluorescentes présentant des terminaisons réactives avec les amines primaires.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce les microsphères sont en silice poreuse.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les microsphères sont en silice pleine.
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que la molécule fluorescente présente une terminaison succinimidyl ester réagissant avec les greffes d'amines des microsphères de silice pour former des liaisons carboxamide.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la molécule fluorescente est une molécule commercialisée sous la marque "ALEXA".
8. Procédé selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que les microsphères sont de type "Uptisphères NH2" commercialisées par la société InterChim ou de type "Exsil Amino" commercialisées par la société
YMC.
YMC.
9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé
en ce qu'il comprend - une étape de préparation d'une solution tampon à un pH
déterminé;
- une étape de mise en solution de microsphères dans la solution tampon;
- une étape de mise en solution dans un solvant de molécules fluorescentes déshydratées;
- une étape de mélange et d'agitation pendant un temps déterminé
de la solution de molécules fluorescentes et des microsphères, à une température déterminée;
- une étape de lavement des microsphères fluorescentes obtenues pour les séparer des sels du tampon, des molécules fluorescentes non liées et des molécules secondaires de la réction;
- et une étape d'évaporation du solvant.
en ce qu'il comprend - une étape de préparation d'une solution tampon à un pH
déterminé;
- une étape de mise en solution de microsphères dans la solution tampon;
- une étape de mise en solution dans un solvant de molécules fluorescentes déshydratées;
- une étape de mélange et d'agitation pendant un temps déterminé
de la solution de molécules fluorescentes et des microsphères, à une température déterminée;
- une étape de lavement des microsphères fluorescentes obtenues pour les séparer des sels du tampon, des molécules fluorescentes non liées et des molécules secondaires de la réction;
- et une étape d'évaporation du solvant.
10. Procédé selon l'une des revendications 4 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend - une étape de préparation d'une solution tampon pour obtenir un pH
compris entre 7,8 et 8,5;
- une étape de mise en solution dans la solution tampon de microsphères de silice poreuse;
- une étape de mise en solution dans de l'eau déminéralisée de molécules fluorescentes déshydratées présentant une terminaison succinimidyl ester;
- une étape de mélange et d'agitation pendant approximativement une heure, de la solution de molécules fluorescentes et des microsphères, à
température ambiante;
- une étape de lavement des microsphères fluorescentes obtenues pour les séparer des sels du tampon, des molécules fluorescentes non liées et des molécules secondaires de la réaction;
- et une étape d'évaporation du solvant.
compris entre 7,8 et 8,5;
- une étape de mise en solution dans la solution tampon de microsphères de silice poreuse;
- une étape de mise en solution dans de l'eau déminéralisée de molécules fluorescentes déshydratées présentant une terminaison succinimidyl ester;
- une étape de mélange et d'agitation pendant approximativement une heure, de la solution de molécules fluorescentes et des microsphères, à
température ambiante;
- une étape de lavement des microsphères fluorescentes obtenues pour les séparer des sels du tampon, des molécules fluorescentes non liées et des molécules secondaires de la réaction;
- et une étape d'évaporation du solvant.
11. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé
en ce qu'il comprend une étape d'addition d'un traceur constitué par des brins d'ADN.
en ce qu'il comprend une étape d'addition d'un traceur constitué par des brins d'ADN.
12. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé
en ce qu'il comprend une étape de couplage des brins d'ADN avec les microsphères.
en ce qu'il comprend une étape de couplage des brins d'ADN avec les microsphères.
13. Composition pour le marquage de produits liquides ou solides caractérisée en ce qu'elle comprend des microsphères à base physique minérale présentant des liaisons covalentes avec des molécules fluorescentes.
14. Composition de marquage selon la revendication 13, caractérisée en ce que les molécules fluorescentes sont liées aux microsphères par des liaisons de type amide.
15. Composition de marquage selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comprend des microsphères présentant des liaisons carboxamide avec des molécules fluorescentes.
16. Composition de marquage selon la revendication 15, caractérisée en ce que les microsphères sont des microsphères poreuses de silice présentant des greffes d'amines (NH2) assurant l'établissement des liaisons carboxamide avec les molécules fluorescentes.
17. Composition de marquage selon la revendication 16, caractérisée en ce que les microsphères sont en silice pleine.
18. Composition de marquage selon l'une des revendications 13 à
16, caractérisée en ce qu'elle comprend des traceurs constitués de brins d'ADN.
16, caractérisée en ce qu'elle comprend des traceurs constitués de brins d'ADN.
19. Composition de marquage selon l'une des revendications 13 à
17, caractérisée en ce que des traceurs, constitués de brins d'ADN, sont liés par une liaison covalente aux microsphères.
17, caractérisée en ce que des traceurs, constitués de brins d'ADN, sont liés par une liaison covalente aux microsphères.
20. Composition de marquage selon l'une des revendications 13 à
19, caractérisée en ce qu'elle comprend des microsphères de 0,05 à 100 microns.
19, caractérisée en ce qu'elle comprend des microsphères de 0,05 à 100 microns.
21. Utilisation d'une composition de marquage selon l'une des revendications 13 à 20 pour le marquage d'un vernis ou d'une encre.
22. Utilisation d'une composition de marquage selon l'une des revendications 13 à 20 pour le marquage de matériaux polymères ou de colle.
23. Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que le matériau polymère est choisi parmi le polystyrène non expansé, le polypropylène, le polyéthylène, le polyamide, le polyester, le le polyméthacrylate de méthyle, le polycarbonate.
24. Utilisation selon la revendication 22, caractérisé en ce que le matériau polymère est un film de 8 à 1000 µm d'épaisseur.
25. Utilisation du procédé de fabrication consistant à créer une liaison covalente entre des molécules fluorescentes et des microsphères selon l'une des revendications 1 à 12, pour l'étude comportementale de molécules fluorescentes.
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