CA2626823A1 - Polymeres a empreinte moleculaire, leur procede de preparation et leur utilisation pour detecter des molecules en milieu biologique - Google Patents

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Patrice Hildgen
Jerome Del Castillo
Jean-Michel Rabanel
Hamza Zouaoui
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Universite de Montreal
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Abstract

L'invention concerne un polymère à empreinte moléculaire, son procédé de préparation et son utilisation pour détecter une molécule cible dans un mili eu biologique. Le procédé comprend une étape de préparation d'un mélange d'au moins un polymère greffé par des groupements fonctionnels et d'une molécule cible, les groupements fonctionnels du polymère formant des interactions ave c des groupements spécifiques de la molécule cible. L'étape suivante implique l'obtention de particules solides ou d'un film comprenant la molécule cible complexée au polymère greffé à partir du mélange. La dernière étape consiste en l'élimination de la molécule cible du polymère greffé pour former le polymère à empreinte moléculaire. L'invention couvre aussi un kit de dépistage d'une molécule cible en milieu biologique comprenant le polymère à empreinte moléculaire et un moyen de détection.

Description

POLYMERES A EMPREINTE MOLÉCULAIRE, LEUR PROCÉDÉ DE
PRÉPARATION ET LEUR UTILISATION POUR DÉTECTER DES
MOLÉCULES EN MILIEU BIOLOGIQUE
DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne de nouveaux polymères à empreinte moléculaire capable de détecter des molécules cibles dans les milieux biologiques. L'invention concerne également le procédé de préparation de ces polymères à empreinte moléculaire et l'utilisation de ceux-ci pour détecter des molécules en milieu biiologique.

DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR
Polymères à empreinte moléculaire Les développements dans le domaine des polymères à empreinte moléculaire, ou "polymères imprimés" ("Molecular Imprinted Polymers" (MIP) en anglais) sont relativement récents. En 1993, la technologie a fait un bond en avant lorsque le groupe de Mosbach a montré que les polymères imprimés pouvaient être substitués aux anticorps dans des tests immunologiques (Vlatakis et al.
1993, Nature, 361, 645 - 647).

L'impression moléculaire consiste à créer des images complémentaires, les "empreintes moléculaires", d'une molécule dans un polymère synthétique. La molécule pour laquelle une empreinte doit être générée est mise en contact avec un mélange de monomères portant des groupements fonctionnels capables de la complexer, par exemple par des liaisons hydrogène, liaisons ioniques ou interactions hydrophobes. La polymérisation, conduite en présence d'un monomère réticulant, permet d'obtenir un réseau polymère rigide qui, après élimination de la molécule cible, porte des sites complémentaires de cette dernière, capables de la reconnaître de manière spécifique.
2 Comme indiqué ci-dessus, les procédés connus de préparation de polymères à
empreinte moléculaire impliquent une étape de polymérisation de monomères fonctionnalisés en présence d'une molécule cible pour laquelle on veui:
obtenir une empreinte. L'étape suivante est de retirer la molécule cible du polymère obtenu en y laissant son empreinte. Cette étape est critique puisqu'il faut pouvoir garder intacts les sites de reconnaissance de la molécule au sein du polymère imprimé.

Les polymères à empreinte moléculaire connus sont en majorité à base de polyacrylate ou polyméthacrylate. Ils peuvent être obtenus par exernple en faisant réagir des monomères "acide acrylique" ou "acide méthacrylique" en présence de la molécule cible. Dans ce cas, la réaction produit des hydrogels qu'il faut ensuite sécher pour obtenir le polymère imprimé. Toutefois, l'empreinte tend à se dénaturer lors du séchage, ce qui va se traduire par une spécificité du polymère imprimé qui est diminuée.

La demande de brevet des États-unis publiée le 6 décembre 2007 sous le No.
US 2007/0281366 Al décrit un procédé de préparation de polymères à
empreinte moléculaire comprenant plusieurs étapes. Dans la première étape une molécule cible (i.e. glucose oxydase) est mise en contact avec des monomères comportant des groupements fonctionnels (i.e. acide acrylique ou méthacrylique) capables d'interagir avec des groupements fonctionnels complémentaires de la molécule cible pour ainsi former un complexe dans lequel la molécule cible est liée aux monomères. La deuxième étape consiste en une polymérisation en présence de monomères supplémentaires (i.e.
acrylamide) et d'un agent de réticulation (i.e. N, N'-méthylènebisacrylarnide). A
l'issue de cette deuxième étape, on obtient un complexe polymérique irnprimé.
La troisième étape est la désactivation des groupements fonctionnels auxquels la molécule cible n'est pas attachée. Enfin, dans une quatrième étape la molécule cible est retirée du complexe polymérique et on obtient le polymère imprimé. Ce type de procédé est long à mettre en oeuvre et à optimiser.
3 Il y a donc un besoin pour des polymères à empreinte moléculaire spécifiques, faciles à synthétiser et à moindre coût.

Détection de molécules en milieux biologiques Une des méthodes les plus connues de dépistage de molécules en milieux biologiques sont les tests ELISA. Les tests ELISA sont utilisés dans des domaines variés comme par exemple pour détecter des virus, des bactéries, des protéines, etc... L'application la plus connue du test ELISA est le déâpistage du VIH. Toutefois, ce type de test a également trouvé des applications dans l'industrie de l'alimentation, afin de détecter des allergènes dans des produits alimentaires, comme le lait, les cacahuètes, les noix et les oeufs. Une autre application connue de ce type de test est la détection quantitative d'antibiotiques comme par exemple dans les eaux usées, le lait, la viande, le sang, etc...

Un exemple d'utilisation du test ELISA est la détection d'antibiotiques présents dans le lait de vache. En effet, l'utilisation d'antibiotiques est répandue pour traiter des vaches (ou d'autres animaux d'élevage) pour des nialadies infectieuses ou pour faciliter la croissance.

Chaque année des quantités inestimables de lait impropre à la consornmation sont perdues à cause de la présence d'un taux trop élevé d'antibiotiques dans le lait. Cela représente des pertes économiques considérables. Ces pertes sont importantes car la détection se fait en général à l'usine de traitement du lait sur de très grands volumes.

De plus, lorsque des contrôles individuels des vaches sont effectués directement à la ferme, les épreuves de dépistage actuelles (test ELISA par exemple) signalent souvent à tort la présence de résidus (faux positifs) mais aussi leur absence (faux négatifs). Ces problèmes sont associés à des substances inhibitrices présentes dans le lait, à sa teneur en gras et en protéines, à des caractéristiques physiologiques des vaches ainsi qu'à des
4 indicateurs de leurs processus pathologiques. Le manque de fiabilité des épreuves de dépistage proviendrait de leur tendance à cibler les groupements fonctionnels des antibiotiques, qui diffèrent à l'intérieur d'une même classe de produits mais qui peuvent être présentes aussi sur des molécules non apparentées. Ceci expliquerait les problèmes de spécificité excessive pour certaines épreuves de dépistage et de spécificité insuffisante pour d'autres.
Les tests ELISA actuellement utilisés nécessitent aussi un personnel spécialisé.
Ils sont chers et donc peu fiables surtout lors de l'utilisation individuelle (chaque vache).

Un autre moyen de détection s'effectue en laboratoire par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS). Mais, encore une fois cette méthode est onéreuse et non-ambulatoire.

Il y a donc une nécessité de concevoir un moyen de détection fiable utilisable directement à la ferme au pis de la vache à moindre coût.

SOMMAIRE DE L'INVENTION

La présente invention a pour objet de surmonter les problèmes de l'art antérieur décrits ci-dessus. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet de nouveaux polymères à empreinte moléculaire préparés par un procédé simple, permettant de détecter de manière fiable et spécifique des molécules cibles en milieux biologiques. D'autres applications sont prévues comme la chromatographie spécifique, ou l'utilisation comme biosenseurs.

Selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un polymère à empreinte moléculaire destiné à détecter une molécule cible dans un milieu biologique. Le procédé comprend une première étape de préparation d'un mélange d'au moins un polymère greffé par des groupements fonctionnels et d'une molécule cible, les groupements fonctionnels du polymère formant des interactions avec des groupements spécifiques de la molécule cible. La deuxième étape implique l'obtention de particules solides ou d'un film comprenant la molécule cible complexée au polymère greffé à partir du mélange obtenu à la première étape. Enfin, la troisième étape consiste en l'élimination de la molécule cible qui était complexée au polymère greffé pour former le polymère à enipreinte
5 moléculaire.

Selon un second aspect, la présente invention concerne un polymère à
empreinte moléculaire obtenu par le procédé selon l'invention décrit ci-dessus.
Selon un troisième aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un polymère à empreinte moléculaire selon l'invention pour la détection de molécules dans un milieu biologique.

Selon un quatrième aspect, la prësente invention concerne un kit de dépistage de molécules dans un milieu biologique comprenant un polymère à ernpreinte moléculaire selon l'invention et un moyen de détection de la molécule.

L'invention et ses avantages ressortiront mieux de la description détaillée et des exemples qui suivent illustrant des modes de réalisations préférés de l'invention.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

La Fig. 1 représente schématiquement les différentes étapes du procédé de préparation d'un polymère à empreinte moléculaire selon un mode de réalisation préféré de l'invention.

La Fig. 2 représente schématiquement des exemples d'interactions possibles entre le PLA greffé avec des groupements fonctionnels et la tétracycline.

La Fig. 3 illustre le taux de recouvrement dans le lait de polymères à
erripreinte moléculaire spécifiques à la tètracycline selon l'invention, en comparaison à
des polymères non imprimés (B polyrnère greffé avec COOH, OH et Benzyle dans une proportion de 1/1/1, A polymère greffé avec OH et COOH 1/1).
6 La Fig. 4 illustre le taux de recouvrement dans le lait de polymères à en-ipreinte moléculaire spécifiques à la tétracycline selon l'invention, en fonction du mélange de polymères greffés utilisé pour la préparation du polymère iimprimé
(B polymère greffé avec COOH, OH et Benzyle dans une proportion de 1/1/1, A
polymère greffé avec OH et COOH 1/1).

DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
Définitions Les expressions "polymère à empreinte moléculaire" et " polymère in-iprimé"
sont utilisées indépendamment pour définir le polymère à erripreinte moléculaire selon l'invention.

Le terme "interaction" est utilisée pour indiquer toute interaction, non covalente et non ionique, entre les groupements fonctionnels du polymère greffé et des groupements spécifiques de la molécule cible. Ces interactions incluent les interactions électrostatiques, les interactions de Van der Waals, les liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes, et les interactions aromatiques (interactions Tr- n entre cycles aromatiques).

L'expression "molécule cible" est utilisée pour représenter toute molécule que l'on souhaite détecter dans un milieu biologique. Ces molécules cibles selon l'invention sont de préférence des antibiotiques ou des hormones corriportant une combinaison de groupements fonctionnels tels que aromatiques, de groupements hydroxyles carboxyliques, carbonyles ou amino dans leur structure. Les antibiotiques sont par exemple des antibiotiques de la classe des tétracyclines, des sulfamides ou des quinolones. Les hormones sont de préférence des hormones stéroïdiennes, comme par exemple les oestrogènes (oestradiol, estriol ou estrone).

Le "polymère greffé" selon l'invention est un polymère tel que par exemple un polyester, un polyhydroxyacide, un acide polylactique, un acide polyglycolique,
7 un polylactame, ou leurs copolymères sur lequel est greffé au moins un groupement fonctionnel capable de former des interactions avec des groupements spécifiques de la molécule cible. Le polymère greffé selon l'invention peut par exemple être obtenu à partir du polymère décrit dans la demande de brevet No. US 2005/0203270 Al sur lequel des groupements fonctionnels sont greffés. De manière avantageuse, le polymère greffé est un acide polylactique (PLA) greffé.

Comme indiqué ci-dessus, les "groupements fonctionnels" greffés sur le polymère sont des groupements capables de former des interactions avec des groupements spécifiques de la molécule cible. Les molécules cibles selon l'invention étant préférentiellement des molécules comportant au moins un groupement aromatique et au moins un groupement hydroxyle et/ou amino dans leur structure, les groupements fonctionnels du polymère greffé seront de préférence des groupements se terminant par des fonctions hydroxyle, amino, aromatique ou acide carboxylique.

Description de modes de réalisations préférés de l'invention Les inventeurs de la présente invention ont mis au point une méthode tout à
fait originale pour obtenir des polymères à empreinte moléculaire destinés à
détecter une molécule cible dans un milieu biologique, à partir de polymères déjà construits. La polymérisation est faite au préalable et l'empreinte est produite par la suite au moyen d'un mécanisme strictement physique.

La Figure 1 représente les différentes étapes d'un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention. Plus particulièrement, le procédé de préparation des polymères à empreinte moléculaire selon l'invention comprend une première étape de préparation d'un mélange comportant au moins un polymère greffé par des groupements fonctionnels et la molécule cible. Le mélange est préparé en présence d'un solvant ou un mélange de solvants capable dans lequel le ou les polymères greffés et la molécule cible sont tous les deux solubles. Lorsque le polymère greffé et la molécule cible sont en
8 contact, des interactions physiques se produisent entre les groupements fonctionnels du polymère et des groupements spécifiques de la molécule cible.
Il se forme ainsi un "complexe polymère(s)-molécule cible" qui va déterrniner la structure finale du polymère imprimé obtenu à la fin du procédé.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le polymère greffé est un polymère tel que le polymère décrit dans la demande de brevet No.
2005/0203270 Al sur lequel des groupements fonctionnels sont éventuellement greffés.

Ainsi, le polymère greffé peut être un polymère de formule (I) suivante:

Z H

Rz m (I) ~-~ y,-~ x A B
dans laquelle:

Z est -O- ou -NH-;

R, représente une chaîne d'un hydroxyacide ou d'un aminoacide dérivant d'un monomère (A) étant un ester ou diester cyclique ou un amide ou ciiamide cyclique;

R2 représente un groupement-CH2-O-CH2-CH-R3 avec R3 = OH, NH2, COOH ou COOBn (Bn is benzyl) dérivant d'un époxyde (B);

n est le nombre d'unité dérivant du monomère (A);
m est le nombre d'unités dérivant de l'époxyde (B);
x est égal à n+m;

et le rapport m/x est compris entre 0.005 et 0.30.
9 De préférence, le polymère est obtenu à partir du dilactide (3,6-diméthyl-1,4-dioxane-2,5-dione) comme monomère (A). Ainsi, le polymère obtenu est un acide polylactique fonctionnalisé de formule I dans laquelle Z = O et R, = -CH3.

Les molécules cibles qui sont avantageusement utilisées dans le procédé selon l'invention, sont des antibiotiques ou des hormones comportant une combinaison de groupements fonctionnels tels que aromatiques, groupements hydroxyles, caroboxyliques, carbonyles ou amino dans leur structure. Les antibiotiques sont par exemple des antibiotiques de la classe des tétracyclines, des sulfamides ou des quinolones. Les hormones sont de préférerice des hormones stéroïdiennes, comme par exemple les oestrogènes. De préférence, les antibiotiques utilisés en tant que molécules cibles selon l'invention sont de la classe des tétracyclines et des sulfamides.

Le choix des polymères greffés et plus particulièrement de leurs groupements fonctionnels et des molécules cibles tels que définis ci-dessus est dicté par la possibilité de former des interactions entre les groupements fonctionnels du polymère et des groupements spécifiques de la molécule cible. En effet, la structure finale du polymère imprimé et sa spécificité vis-à-vis de la miolécule cible à détecter par la suite est déterminée par ses interactions. Ainsi, plus le nombre d'interactions possible sera élevé, plus le polymère à erripreinte moléculaire sera spécifique à la molécule cible. Par exemple, si la rriolécule cible selon l'invention comprend au moins un groupement aromatique, le choix d'un polymère greffé par un groupement fonctionnel comportant égalernent un groupement aromatique s'avérera intéressant sachant que des interactions de type 1r-rr entre les deux groupements aromatiques pourront se faire. De plus, si la molécule cible comporte au moins une fonction amino ou hydroxyle, le polymère greffé pourra avantageusement comporter lui aussi des fonctions amino ou hydroxyle, ou bien acide carboxylique pour former avec les groupements amino ou hydroxyle de la molécule cible des interactions de type liaison hydrogène et interactions électrostatiques.

On comprendra que dans le mélange préparé à la première étape du procédé, il est également possible de mettre la molécule cible en contact avec plus d'un polymère greffé. Avantageusement, on peut mettre la molécule cible en contact avec plusieurs polymères greffés, chacun possédant un type de groupement 5 fonctionnel. Par exemple dans le cas du PLA greffé, il est possible de miettre en contact la molécule cible avec à la fois un PLA greffé possédant un grou,pement fonctionnel R2 se terminant par un COOH, et un PLA greffé possédant un groupement fonctionnel R2 se terminant par un COOBn.

Le mélange du ou des polymères greffés avec la molécule cible se fait
10 avantageusement en présence d'un solvant ou d'un mélange de solvants.
Ainsi, on peut par exemple utiliser un solvant unique dans lequel les pollymères greffés et la molécule cible sont tous les deux solubles, ou bien on peut utiliser un mélange de solvants comprenant un solvant dans lequel les pollymères greffés sont solubles et un solvant dans lequel la molécule cible est soluble.
Le choix des solvants est évident à une personne dans le domaine selon la nature du polymère et celle de la molécule cible. En se référant à la littératuire il est possible de connaître quels solvants solubilisent le polymère et la rriolécule cible visés.

Dans le cas du PLA, un solvant de dissolution approprié est par exemple l'acétone ou encore le dichorométhane. Les tétracyclines sont par exemple solubles dans le méthanol. Le sulfaméthoxazole, de la famille des sulfamides, est avantageusement dissout dans l'éthanol. En général, la dissolution se fait à
température ambiante.

La deuxième étape du procédé selon l'invention implique l'obtention de particules solides ou d'un film comprenant le "complexe polymère-n-iolécule cible". Le film peut être obtenu à partir du mélange complexe polymère-molécule cible-solvant(s) qui est par exemple étalé en couche et le ou les solvants sont évaporés. Les particules sont avantageusement obtenues par précipitation, soit par évaporation sous vide, soit par nébulisation. La
11 nébulisation peut se faire par exemple en utilisant un séchoir de Büchi B-La taille des particules peut varier de quelques centaines de nanomètres à
quelques centaines de microns selon le type de polymère greffé et de molécule cible. La taille des particules est également un paramètre que l'horrime du métier est en mesure d'optimiser selon la sensibilité souhaité. De la même manière, une personne dans le domaine est en mesure d'optimiser la surface spécifique des particules et/ou le ratio polymères/molécule cible.

Dans le cas d'un complexe PLA-tétracylcine, les particules obtenues dans ce cas ont une taille qui est de l'ordre de 4 à 6 pm.

La troisième étape du procédé selon l'invention consiste en l'élimination de la molécule cible qui était liée au polymère greffé pour former le polymère à
empreinte moléculaire. L'élimination de la molécule cible peut se faire par exemple par lavage avec un solvant qui ne dissout pas le polymère.
L'acétonitrile est avantageusement utilisé dans le cas des tétracyclines et l'eau convient comme solvant de lavage dans le cas des sulfamides.

A l'issu de cette troisième étape du procédé, on obtient un polyimère à
empreinte moléculaire spécifique à la molécule cible qui a été utilisée dans le procédé. Le polymère obtenu peut être présenté sous la forme de poudre, de bandelette, de film, de colonne etc.

Le polymère à empreinte moléculaire ainsi obtenu peut donc être utilisé pour la détection de la molécule cible dans un milieu biologique. Par exemple, le polymère à empreinte moléculaire peut être utilisé pour détecter la molécule cible dans le lait, l'urine, le sang, la viande, les eaux consommables ou usées, etc.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le polymère à erripreinte moléculaire est un polymère à base de PLA tel que décrit ci-dessus, qui est spécifique à un antibiotique de la famille des tétracyclines ou des sulfamides.
Ainsi, ce polymère à empreinte moléculaire est utilisé pour détecter ce type d'antibiotique dans un milieu biologique tel le lait ou l'urine. De préférence, le
12 polymère à empreinte moléculaire selon l'invention permet de détecter une tétracycline ou un sulfamide présent dans le lait.

La présente invention fournit également un kit de dépistage de molécules dans un milieu biologique. Le kit comprend un polymère à empreinte moléculaire obtenu selon le procédé décrit ci-dessus et un moyen de détectiori de la molécule. L'utilisation d'un tel kit est simple. Elle implique une première étape de mise en contact du milieu biologique qui est sensé contenir la molécule cible avec le polymère à empreinte moléculaire. Si la molécule cible est en effet présente dans le milieu biologique, elle est "reconnue" par le polymère à
empreinte moléculaire et est retenue au sein du polymère. La deuxièmE: étape lors de l'utilisation du kit est de détecter la molécule cible ainsi retenue par un moyen de détection, de préférence visuel.

Étant donné que la molécule cible selon l'invention comporte avantageusement un cycle aromatique, une détection visuelle grâce à une lampe UV est de choix.
L'utilisation d'une lampe UV ne requiert pas de formation technique ou la présence d'un technicien pour voir une fluorescence, d'où l'avantage de ce type de détection qui offre un résultat fiable.

D'autres moyens de détection sont envisageable et vont dépendre de la nature de la molécule cible. Par exemple, si la molécule cible est la tétracycline, la détection peut également se faire par colorimétrie. En effet, on sait d'après la pharmacopée que la tétracycline réagit avec le chlorure de fer, la solution passant d'une couleur jaune à brune. Toute méthode colorimétrique basée sur la réactivité spécifique des groupements fonctionnels de la molécule cible peut être utilisée. Des méthodes par interaction de fluorescence d'un groupement (anthracène) porté par le polymère peuvent également être utilisées.

Un tel kit est particulièrement intéressant par exemple pour détecter un antibiotique, tel que par exemple une tétracycline, présent dans le lait directement au pis de la vache. Le kit peut se trouver sous la forme d'une trousse de dépistage utilisable directement par l'éleveur. Par exemple, cette
13 trousse comprend le polymère à empreinte moléculaire présent sur une lamelle sous une forme stable. L'éleveur prélève un échantillon de lait d'une vache qui a été traitée par la tétracycline et le dépose sur la lamelle pour qu'il soit en contact avec le polymère à empreinte moléculaire. De préférence, l'échantillon reste en contact avec le polymère imprimé pour un temps déterminé pour chaque molécule cible (12h pour les tétracyclines dans le test préalable).
Après ce temps, l'éleveur observe la lamelle sous une lampe UV. Dans le cas où
l'éleveur observe une fluorescence, il doit s'interdire la traite de la vactie car la tétracycline n'est pas totalement éliminée de son organisme. Au cas d'une absence de fluorescence, le taux de tétracycline dans le lait est inférieur au seuil de détection du polymère imprimé, qui correspond au taux maximal de tétracycline accepté dans le lait. L'éleveur peut donc continuer à traire la vache.
Cela présente une approche tout à fait simple, rapide, spécifique, écoriomique et applicable au pied de la vache par des personnes n'ayant pas nécessairement besoin d'une formation spécifique.

Exemples Dans les exemples qui suivent, le polymère à empreinte moléculaire testé est à
base d'acide polylactique (PLA). La molécule cible est de la famille des tétracyclines. Plus précisément, des tests ont été effectués avec la tétracycline (TC) et l'oxytétracycline (oxy-TC) dont les structures sont représentées ci-dessous.

OH
I I I
\`,.= H OH
HCH
s N
H3C~ CH3 Tétracycline (TC)
14 OH O OH O O
OH
N
1 I i \ \\\`,.= H OH
HO CH H i ""-C
3 OH /N~
H3C cH, Oxytétracycline (Oxy-TC) Le PLA comporte de longues chaînes filiformes qui sont construites par la réaction du groupement acide d'une molécule d'acide lactique sur le groupement hydroxyle d'une autre pour donner une jonction ester selon la réaction suivante:

HP ~ Catalys t+ CH3 0 CH3 0 p Heat O-CH-CI O-CH-CI-CH3 n Lactide Polylactide La Figure 1 illustre des exemples d'interactions possibles entre le PLA une fois greffé, avec les groupements fonctionnels et la tétracycline. Ces interactions comprennent par exemple des liaisons hydrogène entre les fonctions acide carboxylique des groupements fonctionnels greffés sur le PLA et les groupements hydroxyles de la tétracycline. La Figure 1 montre aussi la possibilité d'interactions entre le cycle aromatique de la tétracycline et le phényle d'un groupement fonctionnel greffé sur le PLA.

1- Synthèse des polymères PLA greffés 1.1- Synthèse du PLA-allyle o o aH3 SnPh4 (1:10 000) 0 180C ( 6 heures) F-~c 0 0 PLA Å
3,6-Diméthyl-1,4-dioxane Glycidyl éther P(,A-allyr 0 -2,5-dione ( dilactide>) d'allyle 1) Mettre le SnPh4 (tétraphényle étain) dans un creuset avec un ratio (1 10 5 000) par rapport au 3,6-diméthyl-1,4-dioxane-2,5-dione et mélanger;
2) Mettre le mélange préparé à l'étape 1 dans un ballon à fond rond de 250 mI;
3) Ajouter du toluène (juste assez pour que le produit soit totalement submergé);
10 4) Évaporer le toluène à l'aide d'un évaporateur rotatif (140 rpm, 45 C);
5) Mettre le ballon à fond rond de 250 ml dans un dessiccateur contenant du P205 (pentoxyde de phosphore) pour la nuit;
6) Prendre le ballon à fond rond de 250 ml contenant le 3,6-diméthyl-1,4-dioxane-2,5-dione + SnPh4;
15 7) Ajouter le volume calculé de glycidyl éther d'allyle dans le ballon;
8) Purger le ballon de 250 mL avec de l'argon (répéter cette étape 3 fois);
9) Préchauffer le bain de paraffine et le régler à 180 C ;
10) Laisser réagir pendant environ 6 heures ;
11) Une fois refroidi, mettre le ballon à fond rond dans un dessiccateur contenant du P205 (pentoxyde de phosphore), faire le vide et le laisser pour la nuit;
12) Dissoudre le produit dans environ 100-125 ml d'acétone;
13) Récupérer le PLA-allyl dans un grand volume d'eau;
16 14) Mettre le produit obtenu dans un dessiccateur contenant c-u P205 (pentoxyde de phosphore) et faire le vide.

1.2- Synthèse du PLA-OH par hydroboration du PLA-allyle Hbon O 1=~- TI-F
1}-F, (TC O
2 N~-I (3-`~, ~-~O
~ c~ ~ ~ PLA~,~ Å
PL,4allSl C PLArqi O

1) Dissoudre la quantité voulue de PLA-allyle dans 300 ml de THF dans un ballon à fond rond de 2 I;
2) Ajouter au ballon à fond rond de 21 le volume calculé de BH3=THF 1 M, goutte à goutte; (1 équivalent de BH3-THF 1 M pour 1% de groupement allyle);
3) Laisser réagir pendant environ 2 heures;
4) Une fois les 2 heures écoulées, ajouter respectivement les volumes calculés de H20, de la solution de NaOH 3N (hydroxyde de so(lium) et de H202 30% (peroxyde d'hydrogène);
5) Après 1 heure, ajouter 300 ml de H20 au produit obtenu à l'étape 4, puis évaporer le mélange réactionnel à l'aide d'un évaporateur rotatif (160 rpm et T = 45 C);
6) Dissoudre le produit obtenu dans 50 ml d'acétone;
7) Ajouter 100 ml de H20 au liquide obtenu à l'étape 6, et évaporer l'acétone à l'aide de l'évaporateur rotatif (160 rpm et T = 45 C);
8) Mettre le produit obtenu dans un dessiccateur contenant clu P205 (pentoxyde de phosphore), faire le vide et laisser pendant la nuit.
17 1.3- Synthèse du PLA-COOH : Oxydation de Jones Oxydation de Jones o :::

a~ PLA PLA y"' 01 irpL""
PLq- O PLA-COOH O

1) Dissoudre la quantité voulue de PLA-OH dans 500 ml d'acétone dans un ballon à fond rond de 2 I;
2) Ajouter goutte à goutte, le réactif de Jones (2 équivalents d'o)(yde de chrome VI (Cr03) pour du PLA-OH 1 !o,);
3) Laisser réagir pendant environ 3 heures;
4) Après les 3 heures, ajouter environ 30 ml d'isopropanoi (i-PrOH) afin d'arrêter la réaction (l'isopropanol va détruire le réactif de Jones);
5) Ajouter 500 ml de la solution de HCI 1 N et évaporer le niélange réactionnel à l'aide de l'évaporateur rotatif (190-200 rpm et T = 45 C);
6) Après environ 3 heures, vider le liquide restant dans le ballon dans le bac de récupération des acides;
7) Dissoudre le gel jaunâtre dans 50 ml d'acétone;
8) Ajouter 125 ml d'eau distillée;
9) Évaporer l'acétone à l'aide de l'évaporateur rotatif (160 rpm et T = 45 C);
10) Mettre le produit obtenu dans un dessiccateur contenant du P205 (pentoxyde de phosphore), faire le vide et laisser pendant la nuit.
18 1.4- Synthèse du PLA-COCI

Ho 0 a o Qilorure de thionyle O ~Z 0 T arribiante PLA \ C 0 PLA PLA Cr, n n PLA-COOH p PLA-COCI 0 1) Dissoudre 500 mg de PLA-COOH dans 5 ml de chloroforme (CHC13);
2) Mettre 5 ml de chlorure de thionyle (SOCI2) dans un ballon à fond rond de 100 ml;
3) Ajouter goutte-à-goutte la solution obtenue à l'étape 1 dans le ballon;
4) Laisser réagir pendant environ 2 heures;
5) Évaporer le solvant à l'aide de I' évaporateur rotatif (145 rpm et T
40 C);
6) Mettre le produit obtenu dans un dessiccateur contenant du P205 (pentoxyde de phosphore), faire le vide et laisser pendant la nuit.

1.5- Synthèse du PLA-OBn CI 0 Bn0 O
BnOH + 0 ---~ 0 PLA 0D0PLA PLA OD"OPLA
0 5% 0 5 i A une solution de 110 mg de polymère PLA-COCI dans du chloroforrrie sont ajoutés 100 ml d'alcool benzylique, 100 ml de pyridine et 10 mg de DMAP. Le mélange réactionnel est agité durant 3 h, puis neutralisé avec du HCI 1 N. Le
19 produit est récupéré par élimination par évaporation du chloroforme en présence d'eau. Ce polymère a été caractérisé par résonance magnétique nucléaire'H pour détecter les différents groupements existants ainsi que de s'assurer de la présence du groupement benzyle. Sa masse moléculalire a été
calculée à l'aide d'une chromatographie par perméation de gel.

2- Préparation des Polymères à empreinte moléculaire à base de PLA
2.1- Polymère à empreinte moléculaire A

On prépare dans un bécher un mélange de 250 mg de PLA 5% + 200 mg de PLA-OH + 200mg de PLA-COOH +200 mg de TC dans 100 ml d'acétone (milieu de dissolution du PLA)+ 100 ml de méthanol (milieu de dissolution de la TC hydrochloride). Le mélange est placé sous agitation magnétique jusqu'à
dissolution complète, à température de la pièce. Le mélange est traité à
travers un séchoir par nébulisation du type Büchi B-290TM dans les conditions suivantes: température d'entrée de 50 C, aspiration à 90% et pompe à 30%.
Des particules comprenant le "complexe PLA-greffé-TC" de taille nioyenne d'environ 4 à 5 pm sont obtenues.

Ensuite les particules sont lavées avec un mélange acétonitrile/eau/acide acétique (92.5/2.5/5) v/v/v afin d'éliminer la TC. II y a deux méthodes de lavage possible. La première consiste à prendre des tubes de 15 ml dans lesquels on met 50 mg des particules avec 13 ml de la solution de lavage puis on agite sous vortex pendant 10 min. L'étape suivante consiste à mettre les tubes dans une centrifugeuse à 3000 G, à une température stable de 20 C pendant 15 min. On récupère le surnageant, on prend un échantillon qu'on fait passer dans un appareil HPLC pour une détection de la tétracycline. L'opération doit être répétée 6 fois jusqu'à la disparition du pic détectable.
L'autre méthode de lavage consiste à remplir une colonne de garde de 5 cm (SuperlcoTM, Bellafonte, USA) avec les particules de PLA-greffé-TC puis de faire passer la solution de lavage dans le système à un débit de 1 mI/min.
Cette méthode est simple car on peut observer la variation du taux de la TC

directement sur l'écran du système. L'opération dure à peu près 3 heures jusqu'à ce que la courbe soit linéaire et proche de zéro.

2.2- Polymère à empreinte moléculaire B

On prépare un mélange 1/3 de PLA-OH, 1/3 de PLA-COOH et 1/3 de PLA-OBn 5 avec 200 mg de TC dans 100 mi d'acétone et 100 ml de méthanol comme solvants. Le mélange est placé sous agitation magnétique jusqu'à dissolution complète, à température de la pièce. Les solvants sont ensuite éliminés par évaporation sous vide. On obtient une poudre blanche poreuse avec des tailles moyennes de particules aux alentours de 5 à 6 m, visibles au microscope 10 optique.

Le lavage des particules pour éliminer la TC se fait comme indiqué ci-dessus pour le polymère à empreinte moléculaire A.

2.3- Polymère à empreinte moléculaire C

Le polymère C est préparé de la même manière que décrit ci-dessus pour le 15 polymère B si ce n'est que l'oxytétracycline est utilisée à la place de la tétracycline.

3- Caractérisation des Polymères à empreinte moléculaire de PL.A

Les polymères à empreinte moléculaire A et B ont été testés sur du lait qui contient la molécule cible. Du lait sans ajout de l'antibiotique et des NIP
20 (polymères non imprimés) servent de témoins.

On procède comme suit : 5 ml de lait sont mélangés avec 5ml d'acétoriitrile en présence de 1 mg de TC. Après agitation, on laisse reposer pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, on centrifuge la solution pendant 20 rninutes à une vitesse de 5000 g. Le surnageant est par la suite transféré dans des flacons. L'opération est répétée plusieurs fois afin d'avoir assez de cette solution. 110 mg de A ou B lavés préalablement avec la solution de lavage sont
21 incubés dans 20 ml de lait pendant 24 h. Les NIP sont soumis aux mêmes conditions.

Pour fin de validation un dosage HPLC a été réalisé pour déterminer le taux de recouvrement de ces polymères A et B. Les résultats sont représentés sur les Figures 3 et 4.

Le graphique de la Figure 3 démontre que la tétracycline a été détectée dans le lait sur les polymères à empreinte moléculaire A et B.

Le graphique de la Figure 4 compare le taux de recouvrement de A et E3, c'est-à-dire le taux de recouvrement en fonction du mélange de polymères greffés utilisé pour la préparation du polymère imprimé (B polymère greffé avec COOH, OH et Benzyle dans une proportion de 1/1/1, A polymère greffé avec OH et COOH 1/1). L'introduction du groupement benzyle dans B a augmenté
significativement le taux de détection par rapport à A.

4- Kit de détection Un intérêt de l'invention est de produire une méthode de détectioin de la présence des résidus d'antibiotiques dans le lait assez simple et au pied de la vache. Concernant la détection visuelle des résidus, deux approches ont été
retenues. A cause de la présence du cycle aromatique dans le pharmacophore de la tétracycline, une détection visuelle grâce à une lampe UV est un bon choix. L'utilisation d'une lampe UV ne requiert pas de formation technique ou la présence d'un technicien pour voir une fluorescence, d'où l'avantage de cette nouvelle approche qui offre un résultat fiable et sur place. D'après la pharmacopée, la tétracycline réagit aussi avec le chlorure de fer ce qui offrirait une détection colorimétrique. La solution passant d'une couleur jaune à brune.

Les tests ont été effectués sur des échantillons de tétracycline ayant des concentrations allant de 0 à 200 g/I.

La solution avec le chlorure de fer a été préparée en 3 concentrations différentes 1 M, 2M et 3M. Après plusieurs essais, la détection colorimétrique,
22 qui se manifeste comme une coloration grise de la solution, s'est avéré très efficace à partir d'une concentration de 150 g/I.

Avec la lampe UV, la détection (fluorescence) peut se faire pour une concentration de 50 g/I. La lampe UV s'avère comme un outil de détection fiable et économique à la fois. Dans le cas d'une fluorescence, l'éleveur doit arrêter de traire la vache car la tétracycline n'est pas totalement éliminée de son organisme. En absence de fluorescence, le taux de tétracycline dans ce lait est inférieur à 50 g/I, donc le fermier peut continue à traire la vache.

Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en détail ci-haut et illustrés dans les exemples, l'invention n'est pas limitée à
ces seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications peuvent y être effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ni de l'esprit de l'invention.

Claims (4)

1- Un procédé de préparation d'un polymère à empreinte moléculaire destiné
à détecter une molécule cible dans un milieu biologique, comprenant les étapes suivantes:
a) préparation d'un mélange d'au moins un polymère greffé par des groupements fonctionnels et de la molécule cible, les groupements fonctionnels du polymère formant des interactions avec des groupements spécifiques de la molécule cible;
b) obtention de particules solides ou d'un film comprenant la molécule cible complexée au polymère greffé à partir du mélange obtenu à
l'étape a);
c) élimination de la molécule cible qui étaient complexée au polymère greffé pour former le polymère à empreinte moléculaire.
2- Un polymère à empreinte moléculaire obtenu par le procédé tel que défini à la revendication 1.
3- Utilisation d'un polymère à empreinte moléculaire tel que défini à la revendication 2 pour la détection de molécules cibles dans un milieu biologique.
4- Un kit de dépistage d'une molécule cible dans un milieu biologique comprenant un polymère à empreinte moléculaire tel que défini à la revendication 2 et un moyen de détection de la molécule.
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