CA2158975A1 - Nouveaux derives utilisables en sequencage d'acides nucleiques - Google Patents

Nouveaux derives utilisables en sequencage d'acides nucleiques

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CA2158975A1 CA 2158975 CA2158975A CA2158975A1 CA 2158975 A1 CA2158975 A1 CA 2158975A1 CA 2158975 CA2158975 CA 2158975 CA 2158975 A CA2158975 A CA 2158975A CA 2158975 A1 CA2158975 A1 CA 2158975A1
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Bruno Canard
Simon Sarfati
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Abstract

L'invention concerne des esters de désoxyribonucléotides 5' triphosphates (dNTP) ou ribonucléotides 5' triphosphates (NTP) utilisables dans un procédé de séquençage d'acides nucléiques sans gel et répondant à l'une des formules (I), (II), (III) ou (IV).

Description

_ W094/~064 PCT/FR94/00345 NOUVEA~X DERIVES ~TTTT~RT.~S
EN 8EQUENCAGE D~Tn~ NUCLEIQUE8 La présente invention est relative à la synthese de

2'-désoxyribonucléotides-5' triphosphates substitués en position 3' du desoxyribose correspondant aux quatre nucléobases A, T, C et G et leur utilisation dans une nouvelle méthode de seguençage d'acides nucléiques.
La position 3' est estérifiée par un dérivé
particulier donnant a chaque nucléotide des propriétés fluorescentes spécifiques.
La synthese chimique d'un tel composé a déjà été
decrite pour le nucléotide dATP par Safarti et al., J.
Biol. Chem. (1990), 265, pp. 18902-18906.
L'existence d'un tel composé, ainsi que l'existence de composés voisins avec un ester fluorescent aux propriétés spectrales différentes rHiratsuka (1982), J.
Biol. Chem., 257, pp. 13354-13358] suggère à un scientifique averti que l'on puisse estérifier en position 3' des molécules "reporters" susceptibles d'utilisation pour un procede de séquençage faisant l'objet de la présente invention.
Ces nucléotides triphosphates estérifiés (3'-RT-dNTP) sont des substrats des ADN ou ARN polymerases lesquels lorsqu'ils sont incorporés conduisent a la terminAicon de la chaîne polynucléotidique.
Ils peuvent se prêter à trois réactions distinctes, à savoir l'incorporation par une acide nucléique polymérase dans une chaine en élongation, la déprotection de l'hydroxyle en 3' du désoxyribose permettant l'incorporation d'un 3'-RT-dNTP suivant. Ces propriétés sont utilisables dans une nouvelle méthode non radioactive ne reposant pas sur l'utilisation d'un gel, pour déterminer une séquence de nucléotides ou détecter des mutations dans une séquence d'ADN.

W094/~064 PCT~94/0034S ~

2iS8~ 2 Une des caracteristiques essentielles de ces nucléotides triphosphates estérifies est la réversibilité
_ situ de cette estérification permettant la restauration des groupes 3' ~hydroxy libres, la chaîne polynucléotidique pouvant subir-à nouveau une élongation lors d'une incubation avec ùn mélange de dNTP et d'ADN
polymérase.
Chaque ester de nucléotide ayant des propriétés fluorescentes spécifiques d'une base donnée, il est possible, après élimination et caractérisation de ce marqueur fluorescent de déterminer laquelle des nucléobases a ~té insérée.
La réitération du procédé fournit ainsi une méthode de détermination d'une séquence de nucléotides ou de détection de mutations ponctuelles dans une séquence de nucléotides ou de recherche de variants ou enfin de diagnostic de la présence d'une séquence oligonucléotidique particulière dans un échantillon.
Les techni ques de séquençage classique ont été
introduites il y a environ 15 ans par Sanger, F., Nicklen, S. et Coulson, A.R. t(1977) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74, pp. 5463-5467], d'une part, et par Maxam, A.M. and Gilbert, W. [(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74, pp. 560-564~, d'autre part.
Le séquençage didésoxy de Sanger est maintenant largement utilisé et est encore une méthode de choix pour déterminer une séquence de nucléotides à partir d'une matrice d'ADN simple brin.
Brievement, cette méthode est la suivante : pendant les 4 élongations de chaine enzymatique, les didésoxynucléotides sont insérés de façon aléatoire à la place de leur désoxynucléotide correspondant. Les réactions de séquençage génerent un mélange complexe gui est ensuite résolu par électrophorese sur gel de polyacrylamide.

W094t~0~ ~ I ~ 8 9 7 5 PCTIFR94/00345 Cette méthode est relativement complexe quant aux étapes suivant l'incorporation des didésoxynucléotides, notamment pour ce qui est de la résolution sur gel, d'une part, et d'acquisition de données, d'autre part.
On se trouve en effet en présence d'une grande diversite de produits genérés par l'élongation.
Differentes améliorations ont ensuite été apportées a cette technigue avec l'objectif de simplifier et d'alléger les manipulations expérimentales gu'elle implique.
Par exemple, dans la demande de brevet EP-0 531 169 Al, les auteurs ont développé une ~chn; que permettant de simplifier et d'affiner l'étape d'électrophorese en utilisant les t~hn;ques d'électrophorese en champ pulsé.
D'autres perfectionnements plus récents des t~r~n;ques de séquençage ont eté décrits dans la littérature. Nous en citerons deux :
- la techn;que "séquençage de DNA multiplexe" [G.M.
Church et S. Kieffer-Higgins, Science, 240, pp. 185-188 (1988)] ;
cette techn;que implique la formation de génomes artificiels à partir d'un mélange de fragments insérés dans des vecteurs multiples adjacents a différents oligonucléotides marqués ; le DNA est ensuite coupé
chimiquement et subit une électrophorèse, puis est transféré sur des membranes et sondé enfin avec des oligonucléotides complémentaires des sé~encec marquées dans le vecteur ;
- l'autre techn;que, bien connue, a été décrite dans O.
Ohara et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, pp.
6883-6887 (1989) ;
cette technique utilise également des systèmes de gel et de membranes permettant de repérer les fragments hybridés avec les sondes oligomériques.

W094/~064 PCT~94/0034S

~ 15 89~ S 4 Dans la demande de brevet international WO93/02212, les inventeurs décrivent un procédé d'amplification et de sequencage d'ADN et d'ARN en une seule étape.
Ce procédé implique 1'utilisation d'analogues de nucléotides de type désoxy con ~isant à la terminaison de la chaîne et ce, de façon réiterée, la separation des produits de la réaction étant faite ensuite sur gel de polyacrylamide.
La technologie du séquençage fait l'objet d'études intenses, principalement en raison du developpement des projets sur le genome. Beaucoup d'améliorations sont orientées vers la méthode didésoxy au niveau de plusieurs de ces étapes. On pourra citer par exemple les articles de Venter, C.J. et al. t(1992) T.I.B.S. 10, pp.8-11], de Prober, J.M. et al. [(1987) Science 238, pp. 336-341] et de Mathies, R.A. et Huang, X.C. [(1992), Nature 359, pp.
167-169].
De nouvelles approches sont en train d'apparaitre, comme le séquençage par hybridation [Strezoska, Z. et al.
(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, pp. 10089-10093] ou la microscopie à effet t~nel tDriscoll, R. J. et al.
(1990) Nature 346, pp. 294-296], lesquelles méthodes peuvent se développer largement si l'électrophorese sur gel est éliminée et remplacée par une variante simple et peu coûteuse, comme celle de l'invention.
Pour ce qui est des méthodes d'identification d'un nucléotide présent à une position définie dans un acide nucléique, la demande de brevet WO93/02212 décrit une telle méthode d'identification par incorporation d'un didésoxynucléotide, mais cette méthode, si elle permet la détection d'une mutation ponctuelle, ne permet en aucun cas la détermination d'une séquence dans la mesure ou aucune possibilité de restauration d'un nucléotide normal après incorporation du nucléotide modifié dans la chaine en croicc~nce n'est évoquée. De plus, elle néc~cite de positionner l'amorce à côté du nucléotide d'intérêt, et ~wo94/~n6J ~15897~ PCTnR94/~0345 ne permet pas de caractériser des mutations plus complexes comme de petites insertions ou délétions.
Enfin, les didesoxynucléotides sont de fabrication et d'utilisation coûteuses.
La demande de brevet W091/06678 decrit une méthode d'ADN sans gel et des dispositifs pour mettre en oeuvre cette méthode. La réaction y implique des dTNP bloqués en

3'. Cependant, les enzymes et leur mode d'utilisation cités - notamment la séquénase - ne permettent pas l'utilisation simultanee de nucleotides estérifies en 3', ni la mise en oeuvre du procédé lorsque l'ADN a séquencer presente des répétitions d'un nucléotide donné ; la séquénase possède en effet une activité estérase intrinseque.
Une réaction idéale de sé~nç~ge produirait un seul produit d'addition de façon contrôl~e, permettant l'identification du nucléotide ajouté, avant la répétition du procedé, conduisant a une détermination de la séquence par étape et en temps réel.
La protection de l'extrémité 3' de la molécule d'ADN
en élongation, laguelle protection étant réversible, pourrait être une méthode conférant les propriétés désirées pour une telle réaction. Si, en outre, chaque nucléotide modifié a l'extrémité 3' porte un mar~uage individuel et distinct, on peut ainsi envisager de déterminer la séquence pas a pas, en temps réel.
L'invention consiste en la synthese de nouveaux dérivés de dNTP ou de NTP permettant leur utilisation comme terminateurs de croissance de chaîne d'acides nucléigues, cette terminaison pouvant être reversée par hydrolyse chimique ou enzymatique, notamment une estérase, étape du processus étant stable.
Ces dérivés peuvent être avantageusement utilisés dans tout procédé de séquençage tel que cité ci-dessus caractérisé en ce que le procédé utilise ou non un gel a une quelconque de ses étapes.

W094/~064 PCT~94/00345 ~15 89~ S 6 Les dNTP ou les NTP de l'invention sont plus particulierement caractérises par le fait qu'ils sont estérifies en 3' soit par des anthranylates, soit par l'acide caproïque amidifié par 4 .~`luorophores differents correspondant chacun à une bas~ soit enfin par l'acide 5-amino-2,5-didesoxy-D-riboni~ùe, soit par l'acide 6amino-2,3,6-tridésoxy-D-gluconique, tous deux également substitués sur la fonction amine par 4 fluorophores différents.
Ces quatre types d'esters étant representés par les formules I, II, III et IV suivantes :

O' O- , O~
O~--~--o--~--o--~--o B~ce O / \ (I) \\ / H

R4 ~ N ~ R1 o ¦ ~, C, G ,T ¦

(II) 1 ~

~ x FEUILLE DE REMPLACEMENT (~ 26 ~ W094/~064 ~ 21 5 8 9 7 ~ PCT~94/00345 ¦~,C,C,T¦

oli90NU-3~-s~ / O \

I (III) c o c - OH
c OH

¦ ~, C, c,T ¦

01 igoNu-3,-5, ~o\

c o (IV) C OH

C OH

La restauration de la fonction hydroxyle en 3' du sucre peut être restaurée soit par des bases telle la soude, soit par action d'une enzyme egalement dans les composés de la formule I et de la formule II. Pour ce qui est des composés de formules III et IV, l'invention FEUILLE ~E ~EMP~ACEAhE.~T (~ r 26~

W094/~064 PCTn~4/00345 ~1589~

consiste en un clivage du fluorophore en un site éloigne de 2 ou 3 carbones de la position 3' du nucléotide.
Cette réaction chimique génère des groupements réactifs qui produisent alors une reaction secondaire conduisant à la restauration de~l'hydroxyle en 3', soit deux étapes qui sont : ~
- une oxydation du diol vicinal par le periodate, - une énolisation, puis une ~-élimination de l'aldéhyde ainsi formé en 3' pour le composé III, - une elimination sous l'action de l'hydrazine dans le cas du composé IV (voir les détails dans la figure 9).
L'invention est egalement relative au procédé de synthèse de ces differentes classes de dNTP estérifiés en 3I con~l~isAnt à la synthese des 4 esters présentant des propriétés fluorométri~ues différentes.
L'invention est également relative à la construction et a l'utilisation d'une amorce en "épingle a cheveux"
phosphorylée en 5' présentant une partie de sa séquence en 3' identique à celle d'une amorce utilisée en PCR pour produire la matrice d'ADN a séquencer (voir exemple ci-dessous).
Le terme d'amorce signifie toute sequence d'oligonucléotides qui, hybridée avec une matrice d'acide nucléique permet à une polymérase d'initier la synthèse du brin complémentaire.
Une amorce en épingle à cheveu est liée de façon covalente par son extrémité 3' a l'extrémité 5' du brin d'acide nucléique portant la séquence recherchée.
L'utilisation de cette amorce en "épingle à cheveux"
permet d'utiliser des conditions basiques de déprotection de l'hydroxyle en 3' compatibles avec une réitération du procédé et ce, sans rajout d'amorce à chaque étape de détermination indirecte d'un nucléotide inséré. En effet, la re-hybridation de l'amorce s'effectue intra-moléculairement de façon immédiate.

~ W094/~064 21 5 8 9 7 5 PCT/FR94/00345 Enfin, l'invention est relative à l'utilisation de ces nucleotides estérifiés dans une méthode de détermination d'une séquence de nucleotides ne reposant pas sur l'utilisation d'un gel. Ladite sequence peut être préalablement amplifiée par la technique PCR.
L'utilisation de ces nucleotides esterifiés peut également être appliquée à la détection de mutations ponctuelles ou des petites mutations type délétions ou additions, ou enfin à la recherche de variants dans une sequence génétique donnée.
Enfin, ces nucléotides triphosphates modifiés peuvent être utilisés dans une méthode de diagnostic pour détecter la presence d'une séquence oligonucléotidique particulière dans un échantillon.
Enfin, l'invention concerne une trousse de diagnostic comprenant eventuellement une amorce PCR, une amorce de séquençage, 4 2'-désoxyribonucléotides estérifiés en 3' de façon réversible, et éventuellement une phase solide pour immobiliser l'acide nucléique cible ou l'amorce, et enfin une acide nucléique polymérase choisie en fonction de l'amorce.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'lNv~NllON:
L'invention est décrite plus en détail dans la description ci-apres ac~omr~gnée des figures dont la signification est la suivante :
- La Figure 1 représente la structure des esters d'anthranylates dans laquelle Rl à R4 représentent soit un groupe -H, soit un groupe -CH3 selon le 3'-RT-dNTP
considéré, . le 3'-Ant-dATP : Rl=R2=R3=R4=H, . le N-méthyl-3'-Ant-dCTP : Rl=CH3; R2=R3=R4=H, . le 3-méthyl-3'-Ant-dTTP : R1=R3=R4=H; R2=CH3 et . le 5-méthyl-3'-Ant-dCTP : Rl=R2=R4~H: R4=CH3.

W094/~064 pcTn~94loo345 ,J
21S8~ lO
Toute autre combinaison de groupes substituants sur le cycle anthranylique fait également partie de l'invention.
- La Figure 2 représente la structure des esters d'acides caproïques, et une des voies~`de synthese de ces esters.
- La Figure 3 represehte la formule des derivés estérifiés en 3' par l'acide 5-amino-2-5-didesoxy D-ribonique substitue sur la fonction amine par quatre fluorophores differents, et la méthode de restauration de la fonction 3'OH du sucre par action du periodate, puis ~-élimination apres énolisation.
- La Figure 4 représente la cinétique d'incorporation des dérivés 3'-Ant dATP dans une chaine en élongation, en fonction de differentes quantités d'ADN polymérase.
- La Figure 5 représente l'incorporation du 3'-Ant dATP
en présence de différentes ADN polymérases - l'incubation est effectuée 60 minutes à 37-C avec une unite de chaque enzyme.
- Les Figures 6, 7 et 8 representent trois variantes de la méthode de séquençage utilisant les 3'-RT-dNTP de l'invention dans lesquelles les symboles ont la signification indiquée sous la Figure 6.
- La figure 9 représente le méc~n;cme de liberation de l'étiquette et de l'hydroxyle en 3' des 2'-désoxynucléotides triphosphates acylés en 3' par l'acide 6-amino 2,3,6-tridésoxy-D-gluconique substitué sur la fonction amine par différents fluorochromes.
- Les Figures 10 et 11 représentent respectivement les schemas de synthese de la 2'-désoxyadénosine et de la 2'-désoxyguanosine triphosphates acylées en 3' par l'acide 6-amino-caproïque substitué par un fluorochrome.
Les materiels et methodes utilisés sont les suivants:
- Produits pour la synthèse des dérivés :
L'anhydride isatoic, l'anhydride N-méthylisatoic, l'acide 2-amino-3-méthyl-benzoic, l'acide 2-amino-5-W094/~064 2 I 5 8 9 7 5 pcTn~4/oo3~5 méthyl-benzoic et l'acide 2-amino-6-methyl-benzoic proviennent de chez Aldrich. Les anhydrides correspondants ont eté préparés par action du phosgene ou du chloroformate d'éthyle sur les acides (Erdmann). Les nucléotides triphosphates, dATP, dGTP, dTTP et dCTP
proviennent de chez Boehringer Mannheim.
- Réaction d'incorporation :
L'ADN polymérase modifiee dépourvue d'exonuclease (Sequenase 2,0) provient de USB corp. (USA). Les 2'-3'-didéoxynucléotide / 2'-desoxynucléotide-5'-triphosphates, AMV-reverse transcriptase, M-MuLV reverse transcriptase proviennent de Boehringer (FRA). L'ADN polymerase T7 provient de Pharmacia (France), l'enzyme de Klenow provient d'Amersham (France). Une unité est l'activité
enzymatique qui incorpore 1,O nmole de nucléotides totaux dans un produit insoluble dans l'acide en 1 minute à 37 C
avec du poly(d(A-T)) comme matrice.
Les billes magn~tiques revêtues de streptavidine (~-280 Dynabeads) proviennent de Dynal (Norvege). Les ~-32P-dCTP (3000 Ci/mmole), c-35S-dATP (600 Ci/mmole), 3H-dGTP (14 Ci/mmole), 3H-dCTP (17 Ci/mmole), 3H-dTTP (45 Ci/mmole) proviennent d'Amersham (France).
Les oligonucleotides sont synthétisés avec un synthetiseur ABI et purifies avant emploi.
- Mesures spectrales :
Les spectres d'absorption sont enregistres a 25-C
dans un spectrophotomètre à double faisceau en presence de Tris-HCl 50 mM (pH 8,0). Les spectres d'emission de fluorescence et les spectres d'excitation sont mesurés à
25-C dans un spectrophotomètre à fluorescence Perkin-Elmer LS50B. Tous les dérivés d'acide libre sont excites à 310 nm, tandis que les dérivés 3'-anthranyloyles et 3'-methylanthranyloyles des désoxynucleotides sont excités à 330 nm. Les largeurs de fente pour l'excitation et l'émission sont de 2,5 nm.

W094/~064 PCT~94/00345 21~8~ 12 Les longueurs d'ondes d'absorption et d'emission pour chacun de ces dérives dNTP anthranyloyles, comparées à celles des dérives non substitues sont résumees dans le tableau I suivant dans lequel Rl, R2, R3 et R4 correspondant aux residus de la~>F'~gure 1.
TABLE~ 1 Free A~ds 3'-~- dNTP
Rl R2 R3 R4 ~m ~max~ dNTP I Am al,su,~on enissi~ Or~ cOrl enission H H H H 315 396.5 dATP 333 427 CH3 H H H 416.5 dGTP 356 141 H CH3 H H 312 403 dCI~P 432 H H CH3 H 317 409 dCI'P
H H H CH3 289 403 dlTP 435 - 8ynthese, purification et caractérisation des 2'-désoxynucléotide-5~-triphosphates marqués en 3' de façon reversible (3~-RT-dNTPs) :

a) Anthranylate dATP :
L'anthranylate dATP a ete prepare a partir dATP et d'anhydride isatoïque par un procéde similaire à celui decrit par Hiratsuka [T. Hiratsuka (1982) J. Biol. Chem.
257, pp. 13354-13358] pour la synthese de l'anthranylate ATP et a eté purifie par chromatographie sur Lichroprep RP18 (25-40 ~m), en utilisant 1 mM d'acetate de triethylammonium comme eluant, Le dATP n'ayant pas reagi est elue en premier.
L'Ant-dATP est ensuite elue avec un melange d'acetate de triethylammonium 1 mM et d'acetonitrile (9:1 v/v). Les fractions contenant l'Ant-dATP pur sont testées en FE U I LLE ~ E ~ ~ M ~ ' ~C E .~ ,5 W094/~064 ~ PCT/FR94/00345 ~ 2I~8975 chromatographie en couche mince sur des gels de silice en utilisant comme solvant le mélange CHCl2/MeOH/NH4OH
(65:35:10, v/v/v), puis lyophilisées.
20 mg de nucléotide pur (0.032 mol) sont obtenus a partir de 24 mg de dATP (0.04 mol), ce qui représente un rendement final de $0%.
L'identité et la pureté du composé sont vérifiées par spectrophotométrie W (A253/A333 = 4.3, ~253mM=20), par spectrométrie de masse (FAB+) M+ 610, m/e 611, (M+H)+.
Les propriétés spectrales du produit en RMN du proton et du phosphore sont les suivantes, a 300 MHz:
(300 MHz; D20) 8.44(s', lH, H-8), 8.11 (s, lH, H-2), 7.83 (d, lH, H-6A), 7.24 (t, 1 H, H-4A), 6.72 (d, lH, H-3A), 6.66 (t, lH, H-5A), 6.48 (dd, lH, ~-1), 5.62 (dd, lH, H-3'), 4.38 (m, lH, H-4'), 4.19 (m, lH, H-5'), 4.09 (m, lH, H-5"), 2.83 (m, lH, H-2'), 2.69 (m, lH, H-2").
3P (121.5 MH2; D2O)-10.02(d, P~), -10.84 (d, P~), -22.48 (t, P~)-b) Anthranylates de dCTP, dGTP et de dTTP :
La synthese, la purification et la caractérisation ont été effectuées par des méthodes similaires.
Les 3-méthyl, 5-méthyl et 6-méthyl isatoïc anhydrides ont été preparés par le procédé decrit par Erdmann ~E. Erdmann (1899) Berichte 3, pp. 2159-2172].
Leurs propriétés spectrales ont également été
mesurées, ainsi que celles du N-méthyl Ant-dGTP, du 3-méthyl Ant-dCTP, du 6-méthyl Ant-dTTP et du 5-méthyl Ant-dCTP.
c) Synthèse des esters de dNTP et d'acide caproïque, amidifiés par les fluorophores :
Le schéma est représenté dans la Figure 2.
L'hydroxyle en 5' du 2'-désoxy- nucléoside est protégé par un groupement diméthoxytrityle et l'alcool en position 3' est estérifié par action de l'anhydride de W094/~064 PCT~94/00345 215897~ `
^ 14 1'acide caproique dont 1~amine a été prealablement bloquée par un groupement benzyloxycarbonyle. L'alcool primaire en 5' est liberé en milieu faiblement acide puis phosphorylé. La fonction amine de 1'ester caproique est libérée par hydrogénolyse, puis substituée par le fluorophore.
Dans une dernière étape~,~ le monophosphate activé
sous la forme phosphoroimidazolate, est transformé en triphosphate par action du sel de tetra- tri- n-butylammonium de l'acide pyrophosphorique.
d) Synthese des purines triphosphates acylees en 3' par l'acide 6-amino-caproïque substitué par différents fluorochromes :
2'-désoxy-adénosine (figure 10) :
L'hydroxyle en 5' de la 2'-désoxy-adénosine acylée en 3' est phosphorylé par la chlorure de dibenzyle phosphate ; le phosphate et l'amine sont libérés par hydrogénolyse.
2'-désoxy-guanosine (figure 11) :
Le cas de la 2'-désoxy-guanosine est particulier; en effet, le chlorure de dibenzyle phosphate ne réagit pas avec le 5'OH. Il a été phosphorylé par action du cyanoéthyle phosphate en présence de dicyclocarbodiimide.
Au cours de l'hydrogénolyse du groupement benzyloxycarbonyle, le phosphodiester est transformé en phosphomonoester, par élimination intra-moléculaire du groupement cyanoéthyle. Un schéma de synthèse est représenté sur la Figure 11.

- Inco~por~tion aes 3'-RT-~NTPs :
Environ 2 picomoles d'un 21-mer- 5'-biotinylé (5'-Bio-ATACTTTAAGGATATGTATCC-3') sont liées à des M-280 Dynabeads de la façon décrite par le fabricant et hybridées avec un excès (environ 50 pmoles) d'un oligonucléotide complémentaire présentant une queue 5' W094/~064 PCT~94/00345 ~ 21S8975 (dT)10~ (dC)5, (dG)5 ou (dA)5. L'hybridation est faite pendant une heure a temperature ambiante en présence de NaCl lM, de Tris-HCl 5 mM (pH 7,5) et d'EDTA 0,5 mM.
Après élimination de l'oligonucleotide non lié, les billes lavées sont mises sous suspension dans du tampon fourni par le fabricant et incubées en présence de 500 ~M
d'un 3'-RT-dNTP unique et d'ADN polymérase à 50 C. La réaction est terminée avec 20 mM d'EDTA, 0,01% de Triton X-100, les billes lavées et leur concentration déterminée au microscope avec une cellule hématocyter avant d'être essayées pour déterminer l'incorporation de la radioactivité (voir ci-après).
Comme ces analogues de nucléotides ne contiennent pas de groupe 3'-hydroxy, leur incorporation dans un brin d'ADN d'élongation aboutit à la terminaison de la chAfn~.
Ceci est montré dans la Figure 4, dans laquelle un substrat d'ADN est d'abord traité avec un 3'-RT-dATP et une ADN polymérase Taq pendant des périodes de temps différentes, avant d'être lavé et essayé pour déterminer les ~Lou~es 3'-hydroxy libres disponibles pour l~élongation de Ch~ ~ ne.
Dans ces conditions, environ 80% du substrat d'ADN
sont bloqués pour une élongation supplementaire dans les 10 minutes avec lO unités d'enzyme, puis il y a une diminution lente régulière de la quantité de groupes 3'-hydroxy disponibles. Lorsque les 3'-RT-dGTP, 3'-RT-dTTP
ou 3'-RT-dCTP sont testés avec leurs matrices respectives, des profils similaires sont obtenus. Si un 3'-RT-dNTP donné est incubé avec une ADN polymérase et une matrice qui ne correspond pas à son propre appariement de bases, aucune terminaison de chaîne ultérieure n'est observée, ce qui indique que le groupe 3' ne modifie pas le mec~;sme de reconnaissance de l'enzyme.
Ces résultats montrent que malgré un groupe 3' relativement volumineux, ces nucléotides modifiés sont W094/~064 PCT~94/00345 21~8975 16 encore acceptes par l'enzyme. De nombreux analogues de nucleotides de terminaison de chaîne sont des substrats pour différentes ADN polymérases. On a montré qu'il apparait un appariement de bases correct du substrat nucléotide avec son brin d'ADN servant de matrice et la formation de liaison phosphodiester même avec des j .
énantiomères de ~-L-ribosides tVan Draanen, N. et al.
(1992) J. Biol. Chem. 267, pp. 25019-25024], ce qui indique que la liaiæon de la portion sucre par l'enzyme n'est probablement pas spécifique.
Les nucléotides modifiés de l'invention sont en outre acceptes comme substrats par plusieurs ADN
polymérases.
La Figure 5 montre que des analogues synthétisés ici sont des substrats pour diff~rentes ADN polymérases, la Sequenase et la M-~uL~ reverse transcriptase ~tant les plus et moins efficaces dans les conditions testées ici, respectivement. Une ADN polymérase T7 non modifiée, une Taq polymérase et un fragment de Klenow d'ADN polymerase I commercialisé, sont aussi capables d'utiliser ces substrats. La Demanderesse n'a pas essayé d'optimiser l'incorporation avec une ADN polymérase donnée pour ce qui est de l'activité 3' --> 5'-exonucléase, l'aptitude au traitement en fonction de la distributivité, ou les cinétiques de condensation.
Cependant, il appara~t clairement que le procédé ne peut être réitéré pour la base suivante que si l'enzyme condense efficacement le nucléotide en 3' et ne possède pas d'activité exo 3' ---> 5' qui puisse enlever le nucléotide néocon~Pn~.
Il apparait aussi crucial pour le procédé décrit ici ~ue l'ADN polymérase ne possède pas d'activité esterase intrinsèque à sa chaîne polypeptidique.
Une telle activite existe chez le fragment de Klenow et chez la T7 ADN polymérase, modifiée ou non.

_W094/~064 PCT~4/00345 '~ 2158975 Cette activité est indépendante du degre de purification de l'enzyme, et donc portée par la même protéine que celle possedant 1'activité polymerase.
Comme cette activite esterase s'exerce en cours de polymérisation lorsqu'un nucléotide apparie correctement et estérifié en 3', cette activité estérase rend impossible le contrôle de la terminaison de chaine lorsque les 4 3'-RT-dNTPs sont utilisés en même temps.
Cependant, la Taq ADN polymérase ne possede pas cette activité esterase sous certaines conditions de réaction comme celles décrites ici, et est donc l'enzyme de choix pour le procédé de séquençage decrit ci-après.

- Elimination de8 margueurs fluore~ce~ts et restauration de l~hydroxyle en 3' :
a) Esters d'anthranylates :
A cette étape, un marqueur porté en 3' par le nucléotide inséré aurait deux rôles majeurs en établissant une distinction entre les quatre nucléobases possibles insérées et en bloquant un procedé ultérieur d'élongation. L'elimination du marqueur va fournir une identification indirecte de la base insérée ainsi que la régénération d'un groupe 3'-hydroxy libre disponible pour la répétition du procédé.
La nature de la liaison chimique entre la partie ribosyle et les substituants anthranyloyles est particulièrement importante. Les esters carboxyliques sont facilement hydrolysés par des quantites équivalentes d'ions hydroxyde compatibles avec la stabilité chimigue des ADN monocaténaires tNucleic Acid Chemistry, Townsend, L.B. and Tipson, S.R. eds., John Willey and Son, New-York et Jencks, W.P. (1969) Catalysis in C~Pr;~try and Enzymology, Dover publication, Inc., New-York]. De plus, de nombreuses différentes esterases et des sérine proté~s catalysent l'hydrolyse d'une large variété de ces esters [Heymann, E. et Mentlein, R. (1981) Methods W094/~064 PCT~94/00345 21$897S - 18 Enzymol. 77, pp. 333-344], comme le fait la protéinase K
sur un 3'-anthranyloyl-2'-dAMP du type I et II décrit page 6. Il pourrait être possible d'estérifier la position 3' avec un marqueur portant un bras d'espacement conçu spécifiquement pour po~oir être facilement et efficacement éliminé, sov~t enzymatiquement, soit chimiquement. ~
Ensuite, le 3'-RT-dAMP est ajouté au groupe 3'-hydroxy libre d'une matrice d'ADN comme cela est decrit plus haut et 1'ester carboxyligue ensuite hydrolyse avec de l'hydroxyde de sodium 0,1 M pendant 5 minutes a 37-C
(Tableau 2). Après re-hybridation du brin complémentaire, l'ADN polymérase pourrait incorporer entre 83 et 103% de radioactivité par rapport a la même matrice qui n'a pas été bloquée en 3'. Le fait que l'on ne récupère pas toujours 100% pourrait provenir d'une ré-hybridation incomplète de l'oligonucléotide plus que du traitement alcalin dur. Des conditions analogues d'hydrolyse d'un ester de ribosyle ont été rapportées par d'autres tFalbriard, J.G., Posternak, T. and Sutherland, E.W.
(1967) Biochim. Biophys. Acta 148, pp. 99-105 et Hiratsuka, T. (1982) J. Biol. Chem. 257, pp.
13354-13358]. La Demanderesse n'a pas observé une notable différence d'efficacité de l'hydrolyse d'ester entre les quatre 3'-RT-dNTPs incorporés.
b) Esters de l'acide caproïque :
La libération de l'acide caproique substitué par le fluorophore est réalisée par action d'une enzyme, par exemple une lipase ou une hydrolase.
Afin de faciliter la déprotection du phosphate, notamment pour application à des quantités de produits plus importantes, nous nous sommes orientés vers une autre méthode qui utilise comme agent de phosphorylation (P.T. Gilham et ~.G. Khorana. J.A.C.S. 1958, 80:6212-6222), le chlorure de dibenzyle phosphate ~ W094 ~ ~ ~ 21 5 8 9 7 5 PCTn~4/00345 (composé B: figure 9). Bien qu'elle soit assez limitative [48%~ pour la synthèse, cette solution offre un avantage non négligeable. En effet, a partir du compose (11), on obtient le composé (12) en une seule etape dlhydrogénolyse effectuee dans des conditions douces (température ambiante et pression atmosphérique).

E~N-CI + BnO~gH a ~ ~N-H + BnO--P~CI

HN~

~,ol BnO-P- o~
~/ b BnO

O NHR l O NHR
8. R~CBz 11. Rl=CBz HN~
~~ O~ NJ
'-P- ~,o~l o (a): toluène; N2; 25 C. 0 (b): B; pyridine; N2; -20 C. C~~
- (c): Pd/BaSO4; H2; EtOH 90%. O NH2 12.

W094/~064 PCT~94/00345 Pour la déprotection du composé (11), par hydrogénolyse (P.T. Gilham et H.G. Khorana. J.A.C.S.
1958, 80:6212-6222), nous avons essayé plusieurs conditions expérimentales:
- plusieurs solvants; acéta~te d'éthyle, éthanol, éthanol à 90% et tetrahydrofuranne~-- deux catalyseurs; pal ~ium sur charbon et sur sulfate de barium. i~
L'éthanol à 90%, en presence de palladium sur sulfate de barium, s'est avéré être le solvant idéal. En effet, dans celui-ci, la déprotection totale (perte des benzyles et du benzyloxycarbonyle) est quantitative et l'isolement du phosphomonoester, estérifié en 3' (composé
12) est assez aisé.
Pour la thymidine, nous avons choisi de lui assigner comme étiquette la fluorescéine (INTERBIOtech. Molecular Probes; "1992-1994 ~An~hook of fluorescent probes and research chemicals". 1992, 20-41) (FITC), celle-ci repondant aux critères établis précédemment :
- étiguette non radioactive ;
- absorption (~ = 76.103 1. mol~~.cm1 a ~x=495 nm dans le DMF et a pH=9) et émission à ~x=sl9 nm, toutes deux élevées.
Généralement, une fonction amine reagit avec une fonction isothiocyanate a un pH voisin de 11 (cette réaction a déja été réalisée au laboratoire (S.R. Sarfati et A. Namane, Tet. L~t. 1990, 31:2581-2584). Or, nous savons qu'a ce pH la chaîne aliphatique greffée en 3' est hydrolysée. Pour pallier cet inconvénient, nous avons fait agir le comrocé (12) avec la 5-isothiocyanate-fluorescéine dans un mélange pyridine/eau, à temperature ambiante. Ces conditions ont été décrites pour l'acide 6-amino-caproique et la 5-isothiocyanate-fluorescéine par F.S. Wusteman et P. Gacesa (Carbohydrates Research, 1993, 241:237-244) (schéma ci-dessous).

W094/23064 PCTtFR94tO0345 2158s75 Cette methode nous a permis, à la fois de ne pas observer la formation de TMP, comme cela a lieu en milieu alcalin et de récupérer la fraction du compose (12) qui n'avait pas réagi. Par ailleurs, les difficultés que nous avons rencontrees, vis-a-vis de la solubilité du produit nous ont amenés a évaluer le rendement par chromatographie liquide a haute performance (CLHP) sur une colonne a polarité de phase inversée et à ne purifier par ce moyen que la quantite nécpcc~ire a la caracterisation du produit.

W094/~064 PCT~94/00345 21~8975 Me O~OH

-O-P-O~ p,CO2- ' ` C~ NH2 C
O S
JJ~,,Me O 0~ Oq~o~ OH
O -\Q`J ~
~-J ,S, ~CO2-13 `C~~~ N~C~ N~l~
.. . .
O H H
b,c HN~ Me O-,P-O-,P-O-P-O ~ ~ 2-~ C--~--N~ C~ N
.. . .

(a): pyridine/eau; 25 C. (b): carbonyle diimidazole; DMF; 25 C.
(c); P207 (Bu3N H~4; DMF; 25 C.

A partir du composé (13), nous avions deux possibilités pour réaliser le triphosphate de l'analogue de la thymidine (compose 14). Une première méthode consiste à préparer le phosphoromorpholidate et a deplacer la morpholine par le sel de tétra-tri-n-W094l~064 ~15 8 9 7 5 PCT~4/00345 butylammonium de 1'acide pyrophosphorique (J.G. Moffat etH.G. Khorana, J.A.C.S., 1961, 83:649-658), une seconde à
traiter le compose (13) par le carbonyldiimidazole, puis à deplacer l'imidazole par le même sel d'acide pyrophosphorique (Y. Tor et P.D. Dervan, J.A.C.S., 1993, 115:4461-4467 ; R. Tipson et B. Townsed, Nucleic Acid Chemistry, Part 4 (Wiley-Interscience Publication, New-York) 1991, 337-340).
Nous avons choisi cette seconde méthode, en raison des conditions basiques et de température élevée nécessitées par la premiere, susceptibles d'hydrolyser la chaine aliphatique placee en 3'. Cette étape a été
réalisée sur une petite échelle et sur le phosphomonoester (composé 13) non purifié, sachant que l'isolement du composé (14) nécessiterait une purification par CLHP.
Un autre mode de protection particulierement avantageux est representé par la synthèse des analogues triphosphates de la 2'-désoxycytidine ; l'avantage de cette méthode en est que les quatre groupements hydrogénalisables du composé (19) peuvent être éliminés en une seule étape qui est l'étape (e).
- 8ynthese des analogues triphosphate~ de la 2'-y~y~i~in~ :
Partant de dC, nous avons protégé, a l'aide dul-(benzyloxycarbonyl) 3-éthylimidazolium tétrafluoro-borate, l'amine aromatique portée par la base selon lesconditions de Rappoport et al. (B.E. Watkins, J.S. Kiely et H. Ra~o~o~, J.A.C.S., 1982, 104:5702-5708) et la fonction alcool primaire 5' par diméthoxytritylation (M.J. Gait, Oligonucleotides synthesis a practical approach (IRL Press at Oxford University Press), 1984, 27-34 et 51 ; H. Schaller, G. Weimann, B. Lerch et H.G.
Khorana, J.A.C.S. 1963, 85:3821-3827) (composé 16; figure 11) .
-W094/~064 215 8 97 5 PCT~94/0034~ ~

Nous avons ensuite introduit la chaîne aliphatiquepar action de l'anhydride (6') sur le composé (16) (D.H.
Rammler et H.G. Khorana, J.A.C.S. 1963, 85:1997-2002).
Cette synthèse du composé (17) a aussi ete réalisée par acylation "directe" du composé (6) sur le composé (16), en présence de 1,8-dicyclohe~lcarbodiimide (DCCI), dans des conditions stoechiometriques et avec un rendement équivalent (85%).
Après deprotection de la fonction hydroxyle primaire S' du composé (17), effectuée en milieu acide comme décrit (M.J. Gait, Oligonucleotides synthesis a practical approach (IRL Press at Oxford University Press), 1984, 27-34 et 51 ; H. Schaller, G. Weimann, B. Lerch et H.G.
Khorana, J.A.C.S. 1963, 85:3821-3827), nous avons phosphorylé le ~u".~é (18) par action du chlorure de dibenzyle phosphate (P.T. Gilham et H.G. Khorana.
J.A.C.S. 1958, 80:6212-6222) (composé B ; figure 9).
Cette étape, assez limitative (48%), a permis d'o~tenir le composé (19) attendu. Sa deprotection, par hydrogénolyse (P.T. Gilham et H.G; Khorana. J.A.C.S.
1958, 80:6212-6222 ; B.E. Watkins, J.S. Kiely et H.
Rappoport, J.A.C.S., 1982, 104:5702-5708 ; J.H. Rigby, T.L. Moore et S. Rege, J.O.C. 1986, 51:2400-2402), a ete réalisée dans des conditions identiques a celles employees pour l'analogue de la thymidine et avec un rendement élevé (78%).

2 pcT~4loo34s ~ W094/~064 ~ 8 9 7 5 N~3 N~ N~

R2~o~
~_/ a ou b ~_/ c ~J
OH C~ NHRl C NHR
O O
16. R2=DMTr; 17. Rl=R4= CBz; R2= DMTr 18. R1=R4= CBz R4= CBz . 0~ ,0, ~ e BnO

C--~--NH2 jC, NHR
O O
19. R~R4, CBz (a): 6; DCCI; DMAP; CH3CN; 25 C.
(b): 6'; DMAP; CH3CN; 25 C. (c): PhSO3H 2%; CH2CI2 70 / MeOH 30.
(d): B; pyridine; N2; -20 C. (e): PdlBaSO4; H2; EtOH 90%.

Nous avons ensuite choisi dans un premier temps comme etiquette de la 2'-desoxycytidine (dC), l'acide N-méthylisatoïque (figure 13) pour plusieurs raisons :
- 1'action de l'anhydride N-methylisatoique n'affecte pas 1'amine aromatique portee par la base W094/~064 21~ 8 97 5 PCTn~s4l00345 pyrimidique de dC (B. Canard et R.S. Sarfati, 1994 (Gene, sous presse) ;
- cette etiquette, excitee à ~x=338 nm, emet a une longueur d'onde, ~X=416,5 nm, distincte de celle de la fluorescéine (~x d'émission=519 nm);
- la synthèse du composé (21) nous permettrait de vérifier rapidement si notre strategie pour obtenir le triphosphate, a partir du monophosphate étiqueté en 3' par 1'intermediaire de la chaine aliphatique (composé 6), était bonne.
A partir du ~.J.~o;~é (21) synthétisé dans les mêmes conditions experimentales que pour l'analogue de la thymidine avec la 5-isothiocyanate-fluorescéine (F.S.
Wusteman et P. Gacesa Carbohydrates Re~rchl 1993, 241:237-244), nous avons préparé le triphosphate, par traitement successif du composé (21) avec le carbonyldiimidazole et avec 1'acide pyrophosphorique, sel de tétra-tri-n-butylammonium (Y. Tor et P.D. Dervan, J.A.C.S., 1993, 115:4461-4467 ; R. Tipson et B. Townsed, Nucleic Acid Chemistry, Part 4 (Wiley-Interscience Publication, New-York) 1991, 337-340). Le ~ o~é (22), ainsi obtenu, a été purifié par chromatographie et caractérisé par résonance magnétigue nucléaire du phosphore.
Ces bons résultats ont incité a étiquetter, également, le composé (20) avec la rhodamine (INTERBIOtech. Molecular Probes; "1992-1994 Handbook of fluorescent probes and research chemicals". 1992, 20-41).
En effet, cette dernière fluoresce beaucoup plus fortement que l'acide N-méthylisatoïque et a une longueur d'onde, toujours distincte de celle de la fluorescéine, d'émission=596 nm.
En raison de la faible solubilité du composé (23), seulement, une fraction a été purifiée par CLHP pour le caractériser.

PCT/~94/00345

4 ~ 21~975 0--P-0~ -0-P-0~ 0 NHCH3 20. `C~~~ NH2 21 `C~~ N_C~Ib N~ b,c 0 ,0, ,, 0~ NJ
~O--P- O--P- O--P, - 0~,o 1 d 0 0 ~0~ 7 ~--J O NHCH3 Z2. ` C~~~ N~C~¢~

NJ~ N_~0~ N ~
,, 0~ NJ ~J
~ S
23. ~C ~ N_C~N

(a): anhydride N-methylisatoïque; pyridine/eau; 25 C.
(b): carbonyle dii",ida20le; DMF; 25 C.
(c): P207 ~Bu3N~H)4; DMF; 25 C.
(d): chlorure d isotl,:ocyanate de rhodamine; pyridine/eau; NaHC03; 25C.

c) Esters de l'acide 5-amino-2,5-didésoxy D-ribonique : .
Le schéma de la Figure 3 indique comment la libération et la restauration du groupe hydroxyle sont réalisées : le diol vicinal est oxydé par le periodate, W094/~064 PCT~94/00345 ~158975 28 cette oxydation conduisant, d'une part, à un aldéhyde substitué par le fluorophore dont l'absorption et l'émission de fluorescence peuvent être mesurées par les méthodes decrites plus haut, et, d'autre part, à un oligonucléotide substitue par un aldéhyde, lequel, après enolisation, est éliminé par ~-élimination, libérant ainsi l'hydroxyle en 3'. r, L'utilisation d'une oxydation par le periodate est compatible avec une nouvelle élongation sans re-hybridation de l'amorce puisque ces conditions ne dénaturent pas l'ADN double chaine tel l'amorce hybridée sur la matrice a séquencer.
L'ensemble des operations peut être ainsi réitéré
jusqu'a ce que la sequence d'intérêt soit entierement séquencee.
Le schéma de la figure 9 illustre bien les avantages de ce type de composés ; en effet, en synthese oligonucl~otidique, les sucres sont souvent temporairement protégés sous la forme d'esters de l'acide lévulinique, les lévulinates (J.H. VanBoom et al., Tetrahedron Lett. 4875 (1976)). Entre autres intérêts de ces esters, la déprotection des alcools est quantitative en 1 minute, à pH neutre et a température ambiante. Dans ces conditions, les oligonucléotides sont stables.
Les nucléotides acylés en 3' par l'acide 6-amino-2,3,6-tridésoxy-~-gluconique oxydés par le periodate, liberent quantitativement le fluorochrome et un ester qui ne diffère de l'ester levulinique que par le remplacement d'un méthyle par un hydrogène (une cétone par un aldéhyde).

~ WO 94/23064 21 5 8 9 7 5 pcT/FR94/oo34s lA,T,G,C¦ ~ A.T G.C
¦~moroe (n ~ses) ~ O~,O~ ¦ 3~-arnoroB ~n ba~es) ~~C~

O=C O=C H`C~O
CH2 CH2 ~ CHzM~R
c~ CH2 --OH H O
--~HR

IATG.C~ I ~tG.CI
¦ S_rKn~ ~n base~ 0~0 ~ 4unon:e (n ba~es) J~

,,, OH ~_,o O-G
o CH2 ~ c." r ~

Les alcools sont régéneres par le méC~n;-cme suivant:
dans un melange hydrazine-pyridine-acide acetique-eau, a pH neutre, la fonction cétone est transformee en hydrazone, le doublet libre sur l'azote attaque le carbonyle et l'alcool est liberé.

FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) WO 94/23064 PCT/FR94/00345 ~
~58`~7~ ~: 30 I A,T G,C ¦ ~ ~T,G,C ¦ ~ AT.~:,C ¦

O H~-N~z O~ OH
o-c = ~ N NH

N-N~

Les hydrazones se forment plus facilement à partir des aldéhydes que des cétones, la restauration du 3'-OH
devrait donc être plus rapide à partir d'un aldéhyde.
Ce type de composés présente donc de nombreux avantages : ils sont déprotégeables rapidement a température ambian~e, à pH neutre et surtout quantitativement.

- Exemple d'un séquencaqe de nucléotide le lonq du qène rpoB d'une souche résistante a la rifampicine de Mycobacterium leprae :
La démonstration que le procédé décrit ci-dessus peut être utilisé pour identifier les séquences de nucléotides dans un mélange complexe d'acides nurléiques simple chaine dans un tube ou dans une colonne, laquelle m~thode évite l'étape d'électrophorèse en gel de polyacrylamide, est illustrée par l'exemple ci-dessous.
1) Echantillon d'ADN et cible de sé~uençage :
Dans cet exemple, la sequence nucléotidique destinée à être analysee est une partie du gene de la sous-unité
de l'ARN polymérase de Mycobacterium leprae (rpoB).

FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26) ~ W094/~064 PCTI ~ 4/00345 213~8975 Un changement d'un amino acide dans le codon 425 dans le gene confère à la bactérie une resistance à la rifampicine. Des mutations aux positions 1, 2 ou 3 dans le codon sauvage ont étè déjà décrites et qui remplacent une serine par une leucine, une phénylalanine ou méthionine [Honoré N. et Cole S.T. (1993), Antimicrobiol.
Agence and Chemotherapy 37, n- 3, pp. 414-418].
Le matériel biologique de depart est obtenu comme décrit dans la référence ci-dessus mentionnée brièvement, des cellules de M. leprae résistantes à la rifampicine sont extraites de la plante de pied de souris et sont lysées par une t~ch~;que de congélation/ébullition et les échantillons soumis à une amplification par PCR en utilisant les amorces 1 et 2 spécifiques du gene rpoB. Le produit d'amplification est ensuite analysé par électrophorese en gel d'agarose et utilisé comme un échantillon d'ADN de départ dans le présent exemple.
2) Amorce oligonucléotidique :
L'amorce 1 et le Brpo B22 de la référence ci-dessus.
C'est une amorce 5' biotinylée avec la sé~uence suivante:

5'-CAGGACGTCGAGGCGATCAC-3'.
L'amorce 2 est choisie dans la sequence adjacente au nucléotide à analyser dans le codon 425 du gène rpoB.
Il est constitué de 21 nucléotides avec la séguence suivante :
5'-CP~C~ACCCGGGCCCAGCGC-3' laquelle séquence correspond au type sauvage du gène rpoB
de M. leprae en aval du codon 425.
L'amorce 3 est l'amorce en "épingle à cheveux"
dècrite dans le texte ci-dessus et dans la Figure 7.
Son extrémité 5' est phosphorylée et a la séquence nucléotidi~ue suivante :
5'-GGGCGGCGGGGCTTTATTTGCCCCGCCGCCCCAAACCACCCGGGCCCAGCGC-3 Ces amorces ont été obtenues sous une forme purifiée auprès de la Société ~ corp. (Paris, France).

W094/~064 PCTI~ 4/00345 ., 21~ 89~ 5 32 3) Préparation des matrices pour le séquençage :
Les amorces 1 et 2 sont utilisées exactement comme decrit dans la réference ci-dessus (Honoré et al.) pour produire un fragment d'ampli~ication par PCR utilisable pour le séquençage du codo`~ 425 d'un échantillon inconnu de M. leprae dans un volume de reaction final de 100 ~1.
Un aliquot (10 ~1) est analysé par électrophorese en gel d'agarose pour vérifier que 1'amplification PCR est correcte.
100 ~1 du produit d'amplification PCR sont ensuite absorbes sur des billes magnétiques (M280 Dynabeads, streptavidine, Dynal corp., Norvège) recouvertes de streptavidine et prélavées et les chaines d'ADN non biotinylees et dénaturées et élevées de sa chaine complémentaire qui reste liée aux billes en utilisant 0,1 M de NaOH tel que décrit par le fabricant.
Après plusieurs lavages, la matrice d'ADN simple chaine liée au ~U~UL L est dans une forme purifiée sans interférer avec des amorces ou des nucléotides.
4) Ligation de l'amorce en "épingle a cheveux" n- 3:
La matrice liée au support est resuspendue dans un tampon de ligation (40 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM
DTT, 0,5 mM ATP), 5 nm de l'amorce n- 3 en "epingle a cheveux" sont ajoutés au mélange, le tube est chauffé 2 minutes a 69-C et 30 minutes a 37-C.
Apres l'addition de 40 unités d'ADN ligase T4 (Boehringer corp., Allemagne), le mélange est incube pendant 3 h a température ambiante avec agitation de temps en temps.
Le produit ainsi lié attaché aux billes et lavé
plusieurs fois comme cela est décrit par le fabricant, le dernier lavage étant dans un tampon TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA) et enfin resuspendu dans 120 ~1 d'eau distillée stérile.

W094/~064 ~15 8 9 7 5 PCTIFR94/00345 5) Réaction de séquençage :
a) Incorporation d'un 3' RT-dNMP a l'extrémité 3' OH
de l'amorce 3 en "épingle à cheveux" lié (matrice de séquençage) :
La matrice de séquençage est maintenant étendue par l'amorce en "épingle à cheveux" qui donne une extremité
3' OH bloquée (voir Figure 7). La solution suivante (solution d'élongation) est ajoutée à la matrice liée aux billes :
- 10 ~1 d'un tampon concentré 10 fois (donné par le fabricant), - 10 ~1 de glycerol, - 50 ~1 de 3' RT-dNTP à la concentration de 2 mM chacun:
3'-anthranyloyle dATP, 3'-N-méthyl-anthranyloyle dGTP, 3'-5-méthyl-anthranyloyle dCTP, 3'-6-méthyl-anthranyloyle dTTP, - 10 ~1 de Taq polymérase (5 unités/~l, Boehringer corp., Allemagne). ~
Le tube est incubé à 50-C pendant 30 minutes avec une agitation douce occasionnelle et ensuite transféré
sur un séparateur magnétique pour éli m i n~r les nucléotides non incorporés : 3 lavages avec 10 mM de Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0,02% Triton X-100, suivis par 2 lavages avec 0,02% de Triton X-100 et 1 lavage avec de l'eau distillée stérile.
b) Elimination de la protection en 3' :
L'eau distillée stérile est enlevee et 30 ~1 de NaOH
0,1 M sont ajoutés directement sur les billes.
L'incubation est ensuite réalisée a 50-C pendant 10 minutes. L'échantillon est ensuite magnétisé, le surnageant collecté, 30 ~1 de 0,1 M NaOH sont ajoutés de nouveau sur les billes et incubés a 50-C pendant 10 minutes, puis après une séparation magnétique, le deuxieme surnageant est mélangé avec le premier avant l'analyse spectrofluorométrique.
-W094/~064 PCT~94/00345 2~589~5 ~

Les billes sont immé~iatement lavées exactementcomme ci-dessus apres l'étape d'incorporation et 120 ~1 de la suspension de billes~est maintenant prête pour une nouvelle reaction d'~ext~nsion.
c) Identification du marquage en 3' correspondant au nucléotide incorporé :

6,6 ~1 de Tris 0,5 M pH 8 sont ajoutes aux surnageants rassembles et le mélange est soumis a une analyse spectrofluorométrique comme décrit plus haut en utilisant un spectrofluoromètre Perkin-Elmer L50B et la cellule de détection spectrofluorométrique HPLC
correspondante.
La calibration est réalisée en utilisant des solutions temoins contenant 0,1 M NaOH et 50 mM Tris pH
8.
Des spectres individuels correspondant aux 4 derivés dépourvus d'anthranylate sont réalisés dans le même tampon et leur émission maximale déterminée.
Ensuite, leurs spectres d'excitation sont déterminés comme décrit plus haut.
De cette manière, chaque marqueur est défini avec deux longueurs d'ondes spécifiques, à savoir le maximum en nanomètres pour l'excitation et pour l'émission.
Après avoir chargé l'échantillon dans la cellule de détection, l'excitation est réalisée à 310 nm et le spectre d'émission est mesuré entre 340 nm et 500 nm.
Le spectre est corrigé de tout effet venant du tampon en soustrayant le spectre du témoin, la courbe est lissée et les longueurs d'ondes correspondant au m~ lr décrit ci-dessus sont déterminées en utilisant un programme d'ordinateur fourni par le fabricant.
Les surnageants soumis à l'analyse spectrofluorométrique donnent comme résultat 317 nm et 409 nm pour les maximum d'excitation et d'émission respectivement.

W094l~064 ~1 5 8 9 7 ~ PCT/FR94/00345 Ceci identifie de façon non ambigue un résidu dC
incorporé à l'extrémite 3' de la matrice de séquençage.
6) Réitération du procédé : sequençage du codon 425 du gène rpoB de M. leprae d'un isolat résistant à la rifampicine :
Les 120 ~l de suspension de billes sont maintenant soumis de nouveau aux étapes 5 a), b), c) de la réaction de séquençage, afin d'identifier le nucléotide suivant du codon 425 de l'isolat résistant à la rifampicine de M.
leprae.
Dans ce cas, les maximum d'excitation et d'émission sont de 315 nm et de 397 nm respectivement et ceci identifie un résidu dA in~ol~oLé après le dC de la précédente réaction.
Le cycle de séquençage complet suivant (étape 5 a), b), c)) identifie les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission à 289 nm et 403 nm respectivement, ce qui est typique d'un rèsidu dT incorporé à l'extrémité 3' de la matrice de séquençage.
Ainsi, des expériences nous concluons que la séquence nucléotidique du codon 425 du gène rpoB de l'échantillon analysé est ATG, ce qui code pour une méthionine au lieu d'une serine, la derniere étant caractéristique du phénotype sauvage.
Du fait que cette sorte de mutation a été décrite dans des isolats de type rpoB3 (voir Honoré N. et al.), les expériences décrites ci-dessus donnent les bases moléculaires de la résistance a la rifampicine dans le gène de l'isolat de M. leprae.

Claims (10)

1. Esters de désoxyribonucleotides 5' triphosphates (dNTP) ou ribonucléotides 5' triphosphates (NTP), caractérisés par le fait qu'ils sont des anthranylates répondant a la formule générale suivante :

(I) dans laquelle R1, R2, R3 ou R4 sont soit un atome d'hydrogène (H), soit un groupe méthyle (CH3), soit un groupe autre pourvu que les propriétés du résidu soient conservées, et dans laquelle l'hydroxyle en 3' peut être restauré par libération du dérivé anthranylique en milieu basique ou par action d'une enzyme, par exemple une lipase ou une hydrolase.
2. Esters selon la revendication 1, caractérisés par les substitutions suivantes :
R1=R2=R3=R4=H dans le 3' anthranylate-dATP
R1=CH3, R2=R3=R4=H dans le N-méthyl 3' anthranylate-dGTP
R2=CH3, R1=R3=R4=H dans le 3-méthyl 3' anthranylate-dTTP
R4=CH3,R1=R2=R4=H dans le 5-méthyl 3' anthranylate-dCTP.
3. Esters de désoxyribonucléotides 5' triphosphates (dNTP) ou ribonucléotides 5' triphosphates (NTP), caractérisés par la formule suivante :

(II) dans laquelle l'hydroxyle en 3' peut être restauré par libération de l'acide caproique substitué par un quelconque fluorophore en milieu basique ou par action d'une enzyme, par exemple une lipase ou une hydrolase.
4. Esters de désoxyribonucléotides 5' triphosphates (dNTP) ou ribonucléotides 5' triphosphates (NTP), caractérisés en ce qu'ils répondent à l'une des formules suivantes:

OligoNu-3' -5' (III) OligoNu-3' -5' (IV) dans laquelle X représente une substance susceptible de donner un signal, notamment un fluorophore, ou un hydrogène, et dans laquelle l'hydroxyle en 3' peut être libéré en deux étapes qui sont :
- une oxydation du diol vicinal par le periodate, - une énolisation et .beta.-élimination de l'aldéhyde en 3'.
5. Utilisation des esters selon l'une des revendications 1 à 4, dans un procédé de séquençage d'une chaine polynucléotidique comprenant les étapes de :
a) construction et utilisation d'une amorce, b) addition à partir de cette amorce, ou de toute autre amorce, par une acide nucléigue polymérase, d'une nucléotide triphosphate estérifié en 3'OH de telle façon que son integration bloque toute élongation ultérieure et que l'ester porte un marquage spécifique de chacune des quatre bases constituant ces nucléotides modifies, c) restauration de la fonction 3'OH par hydrolyse chimique ou enzymatique de l'ester formé, d) caractérisation de l'hydrolysat formé caractéristique d'un nucléotide donné, e) réitération des étapes a), b), c) et d) pour caractériser le nucleotide suivant.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisé
en ce gue l'amorce et une amorce en "épingle a cheveux"
phosphorylée en 5' et présentant une partie de sa séquence en 3' identique a celle d'une amorce utilisée en PCR pour produire la matrice d'ADN a séquencer et qui, après ligation à la matrice d'ADN a séquencer, cette amorce est compatible avec une deprotection en milieu basique.
7. Utilisation selon la revendication 5, caractérisé
en ce que l'ester est porteur d'un composé détectable en fluorescence, les caractéristiques d'excitation et d'émission dudit compose étant caracteristiques pour chacun des quatre nucléotides.
8. Utilisation des esters selon l'une des revendications 1 à 4 à la détection de mutations ponctuelles dans une séquence d'acides nucléiques, ou de variants impliquant entre 2 et 20 nucléotides.
9. Utilisation des esters selon l'une des revendications 1 à 4 à la recherche d'une séquence particulière dans un mélange complexes d'acides nucléiques.
10. Trousse de diagnostic de la présence dans un échantillon d'une séquence d'acides nucléiques que l'on souhaite analyser et comprenant :
- une amorce de séquençage, - 4 désoxyribonucléotides estérifiés en 3' de façon réversible, - éventuellement une phase solide pour immobiliser l'acide nucléique à analyser ou l'amorce, - une acide nucléique polymérase choisie en fonction de l'amorce, et préférentiellement sans activité 3' ---> 5' exonucléasique, préférentiellement l'ADN Taq polymérase.
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