CA2030783A1 - Procede de preparation de la proteine c activee et solution de proteine c activee ainsi obtenue - Google Patents
Procede de preparation de la proteine c activee et solution de proteine c activee ainsi obtenueInfo
- Publication number
- CA2030783A1 CA2030783A1 CA002030783A CA2030783A CA2030783A1 CA 2030783 A1 CA2030783 A1 CA 2030783A1 CA 002030783 A CA002030783 A CA 002030783A CA 2030783 A CA2030783 A CA 2030783A CA 2030783 A1 CA2030783 A1 CA 2030783A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- protein
- activated protein
- activated
- apc
- aprotinin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
2030783 9012028 PCTABS00102 La présente invention concerne un procédé de préparation de protéine C activée (APC) à partir d'un échantillon contenant ladite protéine C activée, caractérisée en ce qu'on fixe la protéine C activée sur de l'aprotinine insolubilisée puis qu'après lavage dudit complexe protéine C activée-aprotinine avec une solution tamponnée saline, ladite protéine C activée est recueillie par élution avec une solution aqueuse acide ou une solution contenant un agent chaotrope. L'invention concerne également la protéine C activée ainsi obtenue selon le procédé décrit précédemment.
Description
`: :VO 90/12028 PCI'/FR90/00258 PROCEDE DE PQEPARATION DE LA PROTEINE C ACTIVEE ET SOLVTION DE PROTEINE
C ACTIVEE AINSI OBTENUE.
La présente invention concerne un procédé de préparation de la protéine C activée (APC).
La protéine C est une glycoprotéine plasmatique dont la forme active est une sérine protéase (1,2).
La protéine C humaine est une protéine de poids moléculaire 62 000 constituée de deux chaînes. Une chaîne lourde de poids moléculaire 4 l 000 portant le site actif et une cha~ne légère de poids moléculaire 21 000, liées par un pont disulfure (2). Sa concentration plasmatique est de 3_5 mg/l-lo Comme d'autres protéines, en particulier plasmatiques, cette protéine est un facteur vitamine K dépendant. Elle est synthétisée par le foie sous forme d'un précurseur. Les 11 premiers acides glutamiques de la chaîne légère sont carboxylés en position gamma par une carboxylase hépatique ayant une vitamine K pour cofacteur (3). Ces résidus gamma-15 carboxyglutamiques sont impliqués dans l'interaction avec l'ion calcium (4).
Les phospholipidcs étant chargés négativement, le calcium réalise un pont ionique entre ceux-ci et la région appropriée des facteurs vitamine K
dépendants. La chaine légère possède par ailleurs un résidu béta-hydroxy--aspartique qui serait également impliqué dans l'intéraction avec le Ca++.
Le proenzyme est transformé en protéine C activée (APC) par une coupure d'un dodécapeptide dans la partie N-terminale de la chaine lourde (2). Cette réaction, qui se produit dans la microcirculation, est catalysée én présence de calcium par un complexe stoechiométrique 1:1 formé entre la thrombine et une protéine située à la surface des cellules . 25 endothéliales, la thrombomoduline ~S).
La forme active a une action antlcoagulantc en inactivant les cofacteurs do 18 cascade de coagulation V et Vlll par protéolyse limltée ~6).
L'enzyme acti~ augmenterait aussl la flbrinolyse en inactivant l'lnhibiteur `~ de l'activateur tissulaire du plasminogène.
~`'' ' , ~. ~
;~ .
.
',''`
. .
. ~.............. . ..
:~ . . .
- . .
'~3~7~
WO 90tl2028 2 PCI`/FR90/0025~ -L'APC n'exerce pleinement son activité qu'en présence d'un cofacteur, la protéine S, de phospholipides et de calcium. La protéine S est également une glycoprotéine plasmatique vitamine K dépendante. Elle est monocaténaire, de PM 75000, sa concentration plasmatique étant de 25 5 mg/l. Elle circule à 50 % 50US forme libre et à 50 % sous forme de complexe non covalent avec une protéine du système du complément la "C4-Binding Protéin" (C4BP) (7). Lorsque la protéine S est liée au C4BP
elle ne peut servir de cofacteur (7).
Contrairement aux autres enzymes vitamines K dépendants, la 10 protéine C est anticoagulante.
On connait des déficits congénitaux et acquis en protéine C.
On observe dans ce cas comme pour les déficits en AT lll une tendance aux accidents thrombotiques répétés.
L'utilisation thérapeutique de l'enzyme et du proenzyme est 15 intéressante. Ainsi, la protéine C peut être utilisée pour le traitement des déficits en protéirie C et en particulier chez les nouveau~ nés homozygotes qui développent un Purpura Fulminans.
Cette maladie, souvent léthale, est caractérisée par des lésions thrombotiques importantes qui nécessitent une thérapie par des 20 concentrés plasmatiques enrichis en protéine C. La forme hétérozygote peut entra~ner des épisodes thrombotiques légers à sévères ou être totalement asymptomatique.
La protéine C ainsi que la protéine C activée peuvent être employées pour la prophylaxie et le traitement des thromboses veineuses et 25 artérielles, embolies pulmonaires cérébrales et cardiaques, CIVD, chocs septiqu~s.
La protéine C actlvée peut être également utilisée pour le remplacement des anticoagulants classlque9 ~en partlculler l'héparine) sans Ieurs effets secondaires lors de thromboses artérielles ou veineuses, ' 30 t'interventlons chirurgicales, de phlébites, et dans le cas de réoclusion des infarctus du myocarde.
.
C ACTIVEE AINSI OBTENUE.
La présente invention concerne un procédé de préparation de la protéine C activée (APC).
La protéine C est une glycoprotéine plasmatique dont la forme active est une sérine protéase (1,2).
La protéine C humaine est une protéine de poids moléculaire 62 000 constituée de deux chaînes. Une chaîne lourde de poids moléculaire 4 l 000 portant le site actif et une cha~ne légère de poids moléculaire 21 000, liées par un pont disulfure (2). Sa concentration plasmatique est de 3_5 mg/l-lo Comme d'autres protéines, en particulier plasmatiques, cette protéine est un facteur vitamine K dépendant. Elle est synthétisée par le foie sous forme d'un précurseur. Les 11 premiers acides glutamiques de la chaîne légère sont carboxylés en position gamma par une carboxylase hépatique ayant une vitamine K pour cofacteur (3). Ces résidus gamma-15 carboxyglutamiques sont impliqués dans l'interaction avec l'ion calcium (4).
Les phospholipidcs étant chargés négativement, le calcium réalise un pont ionique entre ceux-ci et la région appropriée des facteurs vitamine K
dépendants. La chaine légère possède par ailleurs un résidu béta-hydroxy--aspartique qui serait également impliqué dans l'intéraction avec le Ca++.
Le proenzyme est transformé en protéine C activée (APC) par une coupure d'un dodécapeptide dans la partie N-terminale de la chaine lourde (2). Cette réaction, qui se produit dans la microcirculation, est catalysée én présence de calcium par un complexe stoechiométrique 1:1 formé entre la thrombine et une protéine située à la surface des cellules . 25 endothéliales, la thrombomoduline ~S).
La forme active a une action antlcoagulantc en inactivant les cofacteurs do 18 cascade de coagulation V et Vlll par protéolyse limltée ~6).
L'enzyme acti~ augmenterait aussl la flbrinolyse en inactivant l'lnhibiteur `~ de l'activateur tissulaire du plasminogène.
~`'' ' , ~. ~
;~ .
.
',''`
. .
. ~.............. . ..
:~ . . .
- . .
'~3~7~
WO 90tl2028 2 PCI`/FR90/0025~ -L'APC n'exerce pleinement son activité qu'en présence d'un cofacteur, la protéine S, de phospholipides et de calcium. La protéine S est également une glycoprotéine plasmatique vitamine K dépendante. Elle est monocaténaire, de PM 75000, sa concentration plasmatique étant de 25 5 mg/l. Elle circule à 50 % 50US forme libre et à 50 % sous forme de complexe non covalent avec une protéine du système du complément la "C4-Binding Protéin" (C4BP) (7). Lorsque la protéine S est liée au C4BP
elle ne peut servir de cofacteur (7).
Contrairement aux autres enzymes vitamines K dépendants, la 10 protéine C est anticoagulante.
On connait des déficits congénitaux et acquis en protéine C.
On observe dans ce cas comme pour les déficits en AT lll une tendance aux accidents thrombotiques répétés.
L'utilisation thérapeutique de l'enzyme et du proenzyme est 15 intéressante. Ainsi, la protéine C peut être utilisée pour le traitement des déficits en protéirie C et en particulier chez les nouveau~ nés homozygotes qui développent un Purpura Fulminans.
Cette maladie, souvent léthale, est caractérisée par des lésions thrombotiques importantes qui nécessitent une thérapie par des 20 concentrés plasmatiques enrichis en protéine C. La forme hétérozygote peut entra~ner des épisodes thrombotiques légers à sévères ou être totalement asymptomatique.
La protéine C ainsi que la protéine C activée peuvent être employées pour la prophylaxie et le traitement des thromboses veineuses et 25 artérielles, embolies pulmonaires cérébrales et cardiaques, CIVD, chocs septiqu~s.
La protéine C actlvée peut être également utilisée pour le remplacement des anticoagulants classlque9 ~en partlculler l'héparine) sans Ieurs effets secondaires lors de thromboses artérielles ou veineuses, ' 30 t'interventlons chirurgicales, de phlébites, et dans le cas de réoclusion des infarctus du myocarde.
.
2~3~ Q)~
3 PCl/FR90/00258 Il existe une ~rande homologie structurale entre certains facteurs vitamines K dépendants et en particulier entre les facteurs VII, IX, X et protéine C. Ils ont de plus un poids moléculaire très voisin (respective-ment de 56 000, 57 000, 59 000, 62 000).
La similitude de ces caractéristiques moléculaires pose donc des difficultés dans l'isolement de ces différents facteurs.
La présente invention a précisément pour but de surmonter cet inconvénient et de proposer un procédé permettant d'obtenir rapidement la protéine C activée à partir d'une fraction sanguine plus ou moins enrichie 10 en protéine C.
Il a en effet été mis en évidence par les inventeurs que l'aprotinine qui est un polypeptide d'origine animale de 58 acides aminés inhibe l'APC. L'intéraction étant réversible, il a été possible de purifier l'APC sur aprotinine insolubilisée.
Plus particulièrement, il s'agit d'un procédé de préparation de protéine C activée à partir d'une matière première contenant ladite protéine activée, caractérisé en ce qu'on adsorbe la protéine C activée sur de l'aprotinine insolubilisée puis qu'après lavage dudit complexe APC-aprotinine avec une solution tamponnée saline, ladite protéine C activée 20 est recueillie par élution avec une solution aqueuse acide ou une solution d'un agent chaotrope.
~ La matière première contenant de la protéine C peut provenir ;~ d'origines diverses. Il peut s'agir de différentes fractions obtenues par ies technologies de fractionnement sanguin, par exemple il peut s'agir de la 25 fraction dite PPSa, ou bien de fractions telles que le prééluat de PPS~, des fractions obtenues lors du fractionnement à l'éthanol, ou bien des fractions obtenues par purification préalable, soit par immunopuriflcation comme cela e~t par exemple décrit dans le brevet européen n 138 222, ou blen des fractlons enrlchles en protéine C tels qu'elles sont décrites par exemple 30 dans ~ritish Journal of Haematology, 1988, 70, 436-440.
Selon un mode de roalisation particulier de l'invention, la matière première est un concentré de complexe prothrombique. La protéine C présente dans ce concentré y est activée par de la thrombine que l'on génère dans ladite matière première, par addition de calcium, ce calcium 35 étant par la suite éliminé de manière à permettre l'activation de la protéine C par la thrombine générée in situ. Dans ce cas, le calcium . .
- . , .
WO 90/12028 ~ 7 ~ 4 PCI`/FR90/00258 est ajouté à la matière première, à une concentralion comprise entre 10 et 100 mM, puis en est éliminé par dialyse ou diafiltration.
La fixation de l'APC est conduite de préférence à un pH
compris entre 7 et 9, en ~énéral à un pH optimum de 8 à 8,4 avec une force 5 ionique appropriée mais ne dépassant pas 0,4 M NaCI et de préférence inférieure à 0,25 M NaCl.
Le complexe ainsi formé entre l'aprotinine et l'APC est suffisamment stable, pour être soumis à une préélution avec des solutions salines sans que l'APC soit décrochée.
Pour éluer l'APC, il convient de prendre des conditions d'élution dissociant le complexe, notamment des pH extrêmes, en particulier des pH compris entre I et 3. La protéine C activée peut être également recueillie par élution avec une solution contenant un agent chaotrope par exemple le KSCN ou le NaSCN. L'agent chaotrope sera 15 ensuite éliminé par dialyse.
La réaction de complexation est très spécifique et le produit élué est exempt de facteur 11, de facteur Vll, de facteur IX et de facteur X, ceci lorsque l'on part de la fraction PPSL et ceci avec un rendement très satisfaisant.
Comme cela a été indiqué précédemment, la fraction traitée doit contenir la protéine C sous forme activée, cette activation peut être effectuée de différentes faSons, soit en utilisant la thrombine, ou bien en utilisant l'activateur spécifique de la protéine C extrait de venin de serpent, ou bien l'activateur naturel constitué de thrombine et de 25 thrombomoduline.
Cortaines fractions pourront déjà contenir la protéine C sous forme activée, dans ce cas l'activation ne sera bien évidemment pas nécessaire.
Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence ` 30 d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
EXEMPLE 1:
La matière première utilisée pour cet exemple est une 35 protéine C obtenue par immunopurification.
, ` - O90/12028 PCI/FR90/00258 Immunopurification de la protéine C:
Une sous fraction du plasma enrichie en protéine C est adsorbée sur une colonne d'anticorps monoclonaux anti-protéine C
insolubilisés sur du Sepharose 4-B activé au bromure de cyano~ène 5 (Pharmacia). L'anticorps monoclonal employé reconnait la protéine C et ne reconnait pas l'APC.
Une préélution est effectuée avec un tampon Tris-HCI 50 mM
pH 8, NaCl 0,5 M. L'élution est réalisée avec une solution 3 M thiocyanate de potassium. L'éluat obtenu est concentré et dialysé jusqu'à 75 mM NaCI
10 tamponné à pH 8.
On obtient ainsi une solution de protéine C et aussi bien le rapport antigène sur concentration protéique que l'électrophorèse en SDS
PAGE montrent un haut degré de purification.
Le proenzyme est activé par un des activateurs connus:
15 thrombine-thrombomoduline, thrombine, extraits de venin d'Agkistrodon Contortrix ou de Russell's Viper. Ces activateurs peuvent être ajoutés dans la fraction en solution ou insolubilisés sur une matrice. Dans ce dernier cas, I'activation se fait en batch ou sur une colonne.
2 ml de protéine C immunopurifiée activée sont déposées sur 20 une colonne (1 x S) d'aprotinine-Sepharose 4-~ (Pharmacia) (5 mg d'aprotinine par ml de gel) équilibrée par un tampon Tris-HCI 50 mM pH 8, NaCl 75 mM.
Une préélution est réalisée avec un tampon Tris-HCI 50 mM
pH 8, NaCI 0,S M.
~5 L'APC est éluée en abaissant le pH avec une ~olution d'HCI
0,1 N et le pH est aussitôt remonté à ~.
Le do~age amidolytlque, I'actlvlté coagulante ainsi que l'immunoélectrophorèse unidimensionnelle Laurell anti protéine C
montrent que l'on retrouve de la protéine C activée uniquement dans 30 l'éluat HCl.
:; , ' . : ' , . ' :
' ' WO 90/12028 PCI/FR90/002.
EXEMPLE 2:
La matière première utilisée pour ce deuxième exemple est un concentré du complexe prothrombique ~PPSB). La protéine C contenue dans cette préparation est activée par un activateur comme pour l'exemple 1.
100 ml de matière première sont déposés sur une colonne 5 (1 x 5) d'aprotinine-Sepharose 4-~ ( Pharmacia ) (5 m~ d'aprotinine par ml de gel) équilibrée par un tampon Tris-HCL 50 mM pH 8, NaCl 0,15 M.
Une préélution est effectuée avec un tampon Tris-HCI 50 mM
pH 8, NaCl 0,5 M.
Aucune ac~ivité protéine C activée n'est décelable dans la 10 fraction non retenue et dans la préélution 0,5 M NaCI.
L'APC spécifiquement retenue sur la matrice est éluée en abaissant le pH avec une solution d'HCl 0,1 N. Le pH est immédiatement remonté à 8.
La fraction éluée présente les caractéristiques de l'APC tant 15 sur le point activité biolo~ique que du comportement électrophorétique et de l'antigénicité. Les techniques utilisées sont respectivement dosages des activités anticoagulante et amidolytique, identification immunologique et électrophorèse SDS PAGE avec et sans réducteur.
20 EXEMPLE 3:
:` ' Du calcium (25 mM final) est ajouté à la fraction dite PPSE~
d'un concentré du complexe prothrombique. Après agitation douce pendant 30 minutes à 4 heures, le calcium est élimlné par dlalyse ou dlaflltratlon 25 contre un tampon contenant par exomplo ~0 mM Tri~HC4 0,1~ M NaCI
pH 7,4. ,~
Par la suite, I'activatlon de la protéine C s'effectue sous agitation douce à température ambiante ou à 4C pendant 8 à 24 heures.
La fraction ainsi obtenue est déposée sur aprotinine-Sépharose 30 afin de purifier la protéine C activée.
Cette purification de la protéine C activée est réalisée selon le procédé décrit précédemment.
.. .
.~ "
WO 90/12028 7 PCr/FR90/00258 BIBLIOGRAPHIE
1) Stenflo J., (1976), J. Biol. Chem. 251, 355-363 10 2) Kisiel W., (1979), J. Clin. Invest. 64, 761-769 3) Ferlund P., Stenflo J. (i982), J. Biol. Chem. 257,12170-12179
La similitude de ces caractéristiques moléculaires pose donc des difficultés dans l'isolement de ces différents facteurs.
La présente invention a précisément pour but de surmonter cet inconvénient et de proposer un procédé permettant d'obtenir rapidement la protéine C activée à partir d'une fraction sanguine plus ou moins enrichie 10 en protéine C.
Il a en effet été mis en évidence par les inventeurs que l'aprotinine qui est un polypeptide d'origine animale de 58 acides aminés inhibe l'APC. L'intéraction étant réversible, il a été possible de purifier l'APC sur aprotinine insolubilisée.
Plus particulièrement, il s'agit d'un procédé de préparation de protéine C activée à partir d'une matière première contenant ladite protéine activée, caractérisé en ce qu'on adsorbe la protéine C activée sur de l'aprotinine insolubilisée puis qu'après lavage dudit complexe APC-aprotinine avec une solution tamponnée saline, ladite protéine C activée 20 est recueillie par élution avec une solution aqueuse acide ou une solution d'un agent chaotrope.
~ La matière première contenant de la protéine C peut provenir ;~ d'origines diverses. Il peut s'agir de différentes fractions obtenues par ies technologies de fractionnement sanguin, par exemple il peut s'agir de la 25 fraction dite PPSa, ou bien de fractions telles que le prééluat de PPS~, des fractions obtenues lors du fractionnement à l'éthanol, ou bien des fractions obtenues par purification préalable, soit par immunopuriflcation comme cela e~t par exemple décrit dans le brevet européen n 138 222, ou blen des fractlons enrlchles en protéine C tels qu'elles sont décrites par exemple 30 dans ~ritish Journal of Haematology, 1988, 70, 436-440.
Selon un mode de roalisation particulier de l'invention, la matière première est un concentré de complexe prothrombique. La protéine C présente dans ce concentré y est activée par de la thrombine que l'on génère dans ladite matière première, par addition de calcium, ce calcium 35 étant par la suite éliminé de manière à permettre l'activation de la protéine C par la thrombine générée in situ. Dans ce cas, le calcium . .
- . , .
WO 90/12028 ~ 7 ~ 4 PCI`/FR90/00258 est ajouté à la matière première, à une concentralion comprise entre 10 et 100 mM, puis en est éliminé par dialyse ou diafiltration.
La fixation de l'APC est conduite de préférence à un pH
compris entre 7 et 9, en ~énéral à un pH optimum de 8 à 8,4 avec une force 5 ionique appropriée mais ne dépassant pas 0,4 M NaCI et de préférence inférieure à 0,25 M NaCl.
Le complexe ainsi formé entre l'aprotinine et l'APC est suffisamment stable, pour être soumis à une préélution avec des solutions salines sans que l'APC soit décrochée.
Pour éluer l'APC, il convient de prendre des conditions d'élution dissociant le complexe, notamment des pH extrêmes, en particulier des pH compris entre I et 3. La protéine C activée peut être également recueillie par élution avec une solution contenant un agent chaotrope par exemple le KSCN ou le NaSCN. L'agent chaotrope sera 15 ensuite éliminé par dialyse.
La réaction de complexation est très spécifique et le produit élué est exempt de facteur 11, de facteur Vll, de facteur IX et de facteur X, ceci lorsque l'on part de la fraction PPSL et ceci avec un rendement très satisfaisant.
Comme cela a été indiqué précédemment, la fraction traitée doit contenir la protéine C sous forme activée, cette activation peut être effectuée de différentes faSons, soit en utilisant la thrombine, ou bien en utilisant l'activateur spécifique de la protéine C extrait de venin de serpent, ou bien l'activateur naturel constitué de thrombine et de 25 thrombomoduline.
Cortaines fractions pourront déjà contenir la protéine C sous forme activée, dans ce cas l'activation ne sera bien évidemment pas nécessaire.
Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence ` 30 d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
EXEMPLE 1:
La matière première utilisée pour cet exemple est une 35 protéine C obtenue par immunopurification.
, ` - O90/12028 PCI/FR90/00258 Immunopurification de la protéine C:
Une sous fraction du plasma enrichie en protéine C est adsorbée sur une colonne d'anticorps monoclonaux anti-protéine C
insolubilisés sur du Sepharose 4-B activé au bromure de cyano~ène 5 (Pharmacia). L'anticorps monoclonal employé reconnait la protéine C et ne reconnait pas l'APC.
Une préélution est effectuée avec un tampon Tris-HCI 50 mM
pH 8, NaCl 0,5 M. L'élution est réalisée avec une solution 3 M thiocyanate de potassium. L'éluat obtenu est concentré et dialysé jusqu'à 75 mM NaCI
10 tamponné à pH 8.
On obtient ainsi une solution de protéine C et aussi bien le rapport antigène sur concentration protéique que l'électrophorèse en SDS
PAGE montrent un haut degré de purification.
Le proenzyme est activé par un des activateurs connus:
15 thrombine-thrombomoduline, thrombine, extraits de venin d'Agkistrodon Contortrix ou de Russell's Viper. Ces activateurs peuvent être ajoutés dans la fraction en solution ou insolubilisés sur une matrice. Dans ce dernier cas, I'activation se fait en batch ou sur une colonne.
2 ml de protéine C immunopurifiée activée sont déposées sur 20 une colonne (1 x S) d'aprotinine-Sepharose 4-~ (Pharmacia) (5 mg d'aprotinine par ml de gel) équilibrée par un tampon Tris-HCI 50 mM pH 8, NaCl 75 mM.
Une préélution est réalisée avec un tampon Tris-HCI 50 mM
pH 8, NaCI 0,S M.
~5 L'APC est éluée en abaissant le pH avec une ~olution d'HCI
0,1 N et le pH est aussitôt remonté à ~.
Le do~age amidolytlque, I'actlvlté coagulante ainsi que l'immunoélectrophorèse unidimensionnelle Laurell anti protéine C
montrent que l'on retrouve de la protéine C activée uniquement dans 30 l'éluat HCl.
:; , ' . : ' , . ' :
' ' WO 90/12028 PCI/FR90/002.
EXEMPLE 2:
La matière première utilisée pour ce deuxième exemple est un concentré du complexe prothrombique ~PPSB). La protéine C contenue dans cette préparation est activée par un activateur comme pour l'exemple 1.
100 ml de matière première sont déposés sur une colonne 5 (1 x 5) d'aprotinine-Sepharose 4-~ ( Pharmacia ) (5 m~ d'aprotinine par ml de gel) équilibrée par un tampon Tris-HCL 50 mM pH 8, NaCl 0,15 M.
Une préélution est effectuée avec un tampon Tris-HCI 50 mM
pH 8, NaCl 0,5 M.
Aucune ac~ivité protéine C activée n'est décelable dans la 10 fraction non retenue et dans la préélution 0,5 M NaCI.
L'APC spécifiquement retenue sur la matrice est éluée en abaissant le pH avec une solution d'HCl 0,1 N. Le pH est immédiatement remonté à 8.
La fraction éluée présente les caractéristiques de l'APC tant 15 sur le point activité biolo~ique que du comportement électrophorétique et de l'antigénicité. Les techniques utilisées sont respectivement dosages des activités anticoagulante et amidolytique, identification immunologique et électrophorèse SDS PAGE avec et sans réducteur.
20 EXEMPLE 3:
:` ' Du calcium (25 mM final) est ajouté à la fraction dite PPSE~
d'un concentré du complexe prothrombique. Après agitation douce pendant 30 minutes à 4 heures, le calcium est élimlné par dlalyse ou dlaflltratlon 25 contre un tampon contenant par exomplo ~0 mM Tri~HC4 0,1~ M NaCI
pH 7,4. ,~
Par la suite, I'activatlon de la protéine C s'effectue sous agitation douce à température ambiante ou à 4C pendant 8 à 24 heures.
La fraction ainsi obtenue est déposée sur aprotinine-Sépharose 30 afin de purifier la protéine C activée.
Cette purification de la protéine C activée est réalisée selon le procédé décrit précédemment.
.. .
.~ "
WO 90/12028 7 PCr/FR90/00258 BIBLIOGRAPHIE
1) Stenflo J., (1976), J. Biol. Chem. 251, 355-363 10 2) Kisiel W., (1979), J. Clin. Invest. 64, 761-769 3) Ferlund P., Stenflo J. (i982), J. Biol. Chem. 257,12170-12179
4) Nelsestuen G.L., Kisiel W., Di Scipio R.G., (1978), biochemistry 17,2134-2138
5) Esmon C.T., Owen W.G., (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78,2249-22S2
6~ Walker F.J., Sexton P.W., Esmon C.T., (1979), Biochim Biophys. Acta 571,333-342
7) Dahlback B., (1986) J. Biol. Chem. 261,12022-12027 ~ ; -,:
~' :. , :; .
'; ~ ',;
.:
: '
~' :. , :; .
'; ~ ',;
.:
: '
Claims (10)
1. Procédé de préparation de protéine C (APC) activée à
partir d'une matière première contenant ladite protéine C activée, caractérisé en ce qu'on adsorbe l'APC sur de l'aprotinine insolubilisée puis qu'après lavage du dit complexe APC-aprotinine avec une solution tamponnée saline, ladite protéine C activée est recueillie par élution avec une solution aqueuse acide ou une solution d'un agent chaotrope.
partir d'une matière première contenant ladite protéine C activée, caractérisé en ce qu'on adsorbe l'APC sur de l'aprotinine insolubilisée puis qu'après lavage du dit complexe APC-aprotinine avec une solution tamponnée saline, ladite protéine C activée est recueillie par élution avec une solution aqueuse acide ou une solution d'un agent chaotrope.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la fixation de la protéine C activée sur l'aprotinine insolubilisée est réalisée à un pH compris entre 7 et 9 et de préférence entre 8 et 8,4.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la protéine C activée est recueillie par élution avec une solution aqueuse acide de pH situé entre 1 et 3.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la protéine C activée est recueillie par élution avec une solution contenant un agent chaïotrope choisi de préférence parmi le KSCN ou le NaSCN, ledit agent chaotrope étant ensuite éliminé par dialyse.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le lavage du complexe protéine C activée-aprotinine est effectué
avec une solution tamponnée saline de pH de l'ordre de 8.
avec une solution tamponnée saline de pH de l'ordre de 8.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'aprotinine est insolubilisée sur une matrice à des concentrations comprises entre 0,5 et 5 mg par ml de gel.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la matière première contenant ladite APC est choisie parmi :
- la protéine C immunopurifiée activée et, - le PPSB traité par un activateur de la protéine C.
- la protéine C immunopurifiée activée et, - le PPSB traité par un activateur de la protéine C.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que la matière première est un concentré du complexe prothrombique et, en ce que la protéine C y est activée par de la thrombine généré dans ladite matière première par addition de calcium, ledit calcium étant par la suite éliminé de manière à permettre l'activation de la protéine C par ladite thrombine.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le calcium est ajouté à la matière première, à une concentration comprise entre 10 et 100 mM.
10. Solution de protéine C activée, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par un procédé selon l'une des revendications 1 à 9.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8904814A FR2645865B1 (fr) | 1989-04-12 | 1989-04-12 | Procede de preparation de la proteine c activee et solution de proteine c activee ainsi obtenue |
| FR89/04814 | 1989-04-12 | ||
| FR909002028A FR2658517B2 (fr) | 1989-04-12 | 1990-02-20 | Preparation de la proteine c activee et solution de proteine c activee ainsi obtenue. |
| FR90/02028 | 1990-02-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2030783A1 true CA2030783A1 (fr) | 1990-10-13 |
Family
ID=26227270
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002030783A Abandoned CA2030783A1 (fr) | 1989-04-12 | 1990-04-10 | Procede de preparation de la proteine c activee et solution de proteine c activee ainsi obtenue |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5198534A (fr) |
| EP (1) | EP0424498B1 (fr) |
| JP (1) | JPH03505531A (fr) |
| KR (1) | KR920700220A (fr) |
| AT (1) | ATE106893T1 (fr) |
| CA (1) | CA2030783A1 (fr) |
| DE (1) | DE69009668T2 (fr) |
| DK (1) | DK0424498T3 (fr) |
| ES (1) | ES2054355T3 (fr) |
| FR (1) | FR2658517B2 (fr) |
| MA (1) | MA21807A1 (fr) |
| PL (1) | PL284757A1 (fr) |
| WO (1) | WO1990012028A1 (fr) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT397615B (de) * | 1991-05-14 | 1994-05-25 | Immuno Ag | Arzneimittel enthaltend protein c |
| AT402262B (de) * | 1991-06-20 | 1997-03-25 | Immuno Ag | Arzneimittel enthaltend aktiviertes protein c |
| DE4320294A1 (de) * | 1993-06-18 | 1994-12-22 | Immuno Ag | Verwendung von humanem Protein C zur Verhinderung und Behandlung von Thrombozytenablagerungen |
| US6867045B1 (en) * | 1994-11-14 | 2005-03-15 | The Scripps Research Institute | Method for diagnosis of thrombotic disorders |
| JP3745805B2 (ja) * | 1995-10-24 | 2006-02-15 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | トロンボモジュリンの精製方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8319538D0 (en) * | 1983-07-20 | 1983-08-24 | Beecham Group Plc | Compounds |
| US4849403A (en) * | 1985-05-29 | 1989-07-18 | Pentapharm Ag | Protein C activator, methods of preparation and use thereof |
| EP0287028B1 (fr) * | 1987-04-17 | 1993-07-21 | Teijin Limited | Méthode pour la séparation de protéine C humaine activée |
-
1990
- 1990-02-20 FR FR909002028A patent/FR2658517B2/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 DK DK90907093.0T patent/DK0424498T3/da active
- 1990-04-10 WO PCT/FR1990/000258 patent/WO1990012028A1/fr not_active Ceased
- 1990-04-10 US US07/613,843 patent/US5198534A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-10 JP JP2506627A patent/JPH03505531A/ja active Pending
- 1990-04-10 DE DE69009668T patent/DE69009668T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-04-10 CA CA002030783A patent/CA2030783A1/fr not_active Abandoned
- 1990-04-10 AT AT90907093T patent/ATE106893T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-04-10 EP EP90907093A patent/EP0424498B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-10 KR KR1019900702600A patent/KR920700220A/ko not_active Ceased
- 1990-04-10 ES ES90907093T patent/ES2054355T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-04-12 MA MA22067A patent/MA21807A1/fr unknown
- 1990-04-12 PL PL28475790A patent/PL284757A1/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1990012028A1 (fr) | 1990-10-18 |
| US5198534A (en) | 1993-03-30 |
| ATE106893T1 (de) | 1994-06-15 |
| MA21807A1 (fr) | 1990-12-31 |
| EP0424498A1 (fr) | 1991-05-02 |
| FR2658517B2 (fr) | 1992-06-19 |
| DE69009668D1 (de) | 1994-07-14 |
| DK0424498T3 (da) | 1994-07-04 |
| ES2054355T3 (es) | 1994-08-01 |
| PL284757A1 (en) | 1991-01-14 |
| FR2658517A2 (fr) | 1991-08-23 |
| EP0424498B1 (fr) | 1994-06-08 |
| KR920700220A (ko) | 1992-02-19 |
| JPH03505531A (ja) | 1991-12-05 |
| DE69009668T2 (de) | 1994-10-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0528701B1 (fr) | Procédé de préparation d'un concentré de thrombine humaine destiné à un usage thérapeutique | |
| KR930007434B1 (ko) | 혈액응고 억제 단백질 제조방법 | |
| Esmon et al. | Protein C activation | |
| EP0317376B2 (fr) | Préparation de concentré de facteur IX humain de haute pureté et d'autres protéines plasmatiques | |
| Stewart et al. | Purification and characterization of human converting enzyme (kininase II) | |
| EP0346241B1 (fr) | Procédé de préparation d'une fraction concentrée en facteur Vlla et son application à titre de médicament | |
| FR2972114A1 (fr) | Un nouveau leurre moleculaire procoagulant pour le traitement des hemophiles a ou b avec ou sans inhibiteur | |
| Markland Jr | [19] Crotalase | |
| AU671586B2 (en) | Preparation of factor IX | |
| JPH0775572A (ja) | ウイルスを不活性化したＸａ因子調製物 | |
| EP0424498B1 (fr) | Procede de preparation de la proteine c activee | |
| US5393666A (en) | Method of activating prothrombin | |
| JP3819935B2 (ja) | トロンビンの調製 | |
| US5510248A (en) | Stable recombinant meizothrombin-like polypeptides | |
| US11591587B2 (en) | Process for plasminogen purification starting from human plasma | |
| Walker | Interactions of protein S with membranes | |
| FR2645865A1 (fr) | Procede de preparation de la proteine c activee et solution de proteine c activee ainsi obtenue | |
| CN1109891A (zh) | 防止蛋白质c降解的方法 | |
| CA2471410A1 (fr) | Methode de purification de proteines solubles de soies de l. obliqua par activation de la prothrombine; procede de determination partielle de sequence d'acides amines d'activateurde la prothrombine; procede de determination d'activation de la prothrombine de fraction ii; sequences de fragments n-terminale et internes | |
| CA3036425C (fr) | Procede de purification de plasminogene a partir de plasma humain | |
| Morita et al. | γ-Carboxyglutamic Acid (Gla)-Domainless Blood Coagulation Factc IXa Species: Preparation and Properties | |
| JPH07100032B2 (ja) | 高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZDE | Discontinued |