BRPI1103285A2 - Estado de espressão de msh3 para determinar a responsividade de células cancerígenas ao tratamento quimioterápico com inibidores de parp e fármacos de platina - Google Patents

Abstract

ESTADO DE EXPRESSÃO DE MSH3 PARA DETERMINAR A RESPONSIVIDADE DE CÉLULAS CANCERÍGENAS AO TRATAMENTO QUIMIOTERÁPICO COM INIBIDORES DE PARP E FÁRMACOS DE PLATINA. São aqui revelados métodos para tratamento de um paciente em risco ou diagnosticado com câncer cólon-retal. O método da presente invenção determina a expressão global de MSH3 em células suspeitas de serem células de câncer cólon-retal do paciente e prevê a eficácia da terapia com um agente genotóxico antinaoplásico para tratamento do paciente, em que uma diminuição na expressão global de MSH3 nas células do paciente, quando comparada com a expressão de MSH3 em célula scólon-retais normais, indica uma predisposição à responsividade à terapia genotóxica com agente antineoplásico, em que a terapia compreende a administração de uma quantidade eficaz da terapia genotóxica com agente antineoplásico aos pacientes.

Description

estado de expressão de msh3 para determinar a responsividade de células cancerígenas ao tratamento quimioterapico com inibidores de parp e fármacos de platina

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada em geral ao campo

da detecção, prognóstico e tratamento de câncer e, mais particularmente, aos métodos para detecção da suscetibilidade de células de câncer cólon-retal aos agentes que danificam o DNA. FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Sem limitação do escopo da invenção, seus fundamentos são descritos em conexão com biomarcadores para a detecção de câncer do cólon e gastrenterológicos.

A Patente U.S. N0 7.252.955 concedida para Pant e cols. (2007) revela um ensaio e kit imunológico para pesquisa de câncer do cólon. Glicoproteínas fecais são extraídas de amostras individuais de tal forma que a imunogenicidade seja mantida. As glicoproteínas fecais purificadas são reagidas com anticorpos para o antígeno de 2 0 tumor do cólon e do ovário (COTA) . 0 antígeno de mucina COTA está especificamente presente em tecido de câncer cólon-retal, e não em cólons normais. A quantidade de COTA na amostra fecal é determinada e usada para indicar a presença de câncer do cólon. A Patente U.S. N0 7.575.92 8 concedida para Lin e cols.

revela genes para o diagnóstico de câncer cólon-retal. Resumidamente, essa patente fornece genes para o diagnóstico de câncer cólon-retal, por pesquisa de seqüências gênicas por: (1) liberação de células epiteliais por intestinos normais, pólipos de intestinos e tecido de câncer cólon-retal; (2) coleta de genes com expressão gênica altamente diferencial por hibridização subtrativa por supressão (SSH), e construção de uma biblioteca; (3) derivação de colônias com intensidades de sinal relativamente elevadas por tecido de câncer; (4) coleta de tecidos mais clinicamente de câncer por hibridização Northern, reação em cadeia de polimerase (PCR) em tempo real combinada com análise de bioinformação para afirmar variação entre expressão gênica diferencial; e (5) seleção dos genes mais adequados da referida biblioteca, e a utilização da seqüência gênica como reagente fornece os efeitos de diagnóstico precoce, especificidade, sensibilidade e segurança elevadas.

A Patente U.S. N0 7.022.472, concedida para Robbins e cols., revela mutações em genes de MLHl humano e MSH2 humano úteis no diagnóstico de câncer cólon-retal. Resumidamente, verificou-se que variantes dos genes de MLHl e MSH2 humanos poderiam ser usados para diagnosticar câncer cólon-retal hereditário não polipose (HNPCC) e/ou

2 0 determinar a suscetibilidade de um paciente para o

desenvolvimento de HNPCC. Métodos e composições para a identificação de novos genes de MLHl e MSH2 variantes também são fornecidos. Além disso, foram fornecidos modelos experimentais para câncer cólon-retal hereditário não polipose que compreendem esses genes variantes.

Finalmente, Publicação de Patente U.S. N0 20090305277, depositada por Baker e cols., descreve um método de previsão da probabilidade de que um paciente humano seja diagnosticado com câncer com base na determinação de um

3 0 nível de expressão de pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste em AURKB, Axina 2, BlK, BRAF, BRCA2, BUBl, C20 orfl, C200RF126, CASP9, CCNE2 variante 1, CDC2, CDC4, CENPA, CENPF, CLICl, CYR61, Cdx2, Chkl, DLCl, DUSPl, E2F1, EGR3, E124, ESPLl, FBX05, FGF2, FOS, FUT6, GSK3B, GrblO, HES6, HLA-G, HNRPAB, H0XB13, HSPEl, KIF22, KIFCl7 KLRKl, Ki- 67, LAT, LMYC, MAD2L1, MSH2, MSH3, NR4A1, PDGFA, PRDX2, RAB32, RAD54L, RANBP2, RCCl, R0CK2, RhoB, S100P, SAT, SODl, SOSl, STK15, TCF-1, T0P2A, TP53BP1, UBE2C, VCP e cMYC, ou sua expressão correspondente, e que uma expressão aumentada de um ou mais dos genes está correlacionada positivamente com uma probabilidade aumentada de uma resposta positiva à quimioterapia.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO Os presentes inventores demonstram aqui um desvio significante e inédito de achados prévios em relação aos níveis de expressão de MSH3 na avaliação do prognóstico e/ou previsão da resposta de câncer à quimioterapia no câncer cólon-retal.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um

2 0 método para tratamento de um paciente em risco ou

diagnosticado com um ou mais adenocarcinomas, o método compreendendo: a determinação da expressão global de MSH3 em células suspeitas de serem células de adenocarcinoma obtidas do paciente e previsão da eficácia da terapia com um agente antineoplásico para tratamento do paciente, em que uma diminuição na expressão global de MSH3 nas células do paciente, quando comparada com a expressão de MSH3 em células normais, indica uma predisposição â responsividade à terapia com agente antineoplásico, em que a terapia

3 0 compreende a administração de uma quantidade eficaz do agente antineoplásico ao paciente. Os adenocarcinomas aqui descritos acima são selecionados do grupo que consiste em câncer cólon-retal (CRC), câncer de pulmão, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer renal, câncer do figado, câncer testicular, câncer da bexiga, câncer vaginal, câncer de mama, câncer esofagiano, câncer pancreático e câncer de estômago. Em aspectos mais específicos, o adenocarcinoma é CRC e o adenocarcinoma compreende um tumor sólido.

Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível

global de expressão de MSH3 compreende a análise de células suspeitas de serem células de adenocarcinoma quanto à expressão de proteína de MSH3, expressão de ácido nucléico de MSH3, ou ambas. Em outro aspecto, a etapa de

determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a realização de análise por espectrometria de massa de ácidos nucléicos de MSH3 obtidos do indivíduo. Ainda em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a amplificação por

2 0 círculo rolante de uma porção de um ácido nucléico de MSH3

obtido do indivíduo. Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a hibridização com uma sonda alelo-específica, uma sonda de anticorpo, ou ambas. Em outro aspecto, a etapa

de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende imunoistoquímica.

Em um aspecto relacionado, o agente antineoplásico é selecionado do grupo que consiste em 1,3-bis(2-cloroetil)- 1-nitrosouréia, bussulfan, carmustina, clorambucil,

3 0 ciclofosfamida, dacarbazina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, etoposida, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, Iomustina7 mecloretamina, melfalan, mitomicina C, mitoxantrona, temozolomida, topotecan e radiação ionizante. Em um aspecto, o agente antineoplásico é um agente de ligação cruzada interfilamentar. Em outro aspecto, o agente antineoplásico é um agente de ligação cruzada interfilamentar selecionado de cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, furocumarinas ou psoraleno. Ainda em outro aspecto, o agente antineoplásico é um inibidor de poli(ADP-ribose)polimerase (PARP) selecionado do grupo que consiste em olaparib, derivados de isoindolinona, veliparib, iniparib e derivados de 4-metóxi- carbazol.

Outra modalidade da presente invenção fornece um método para tratamento de um paciente em risco ou diagnosticado com um adenocarcinoma, o método compreendendo: (i) a determinação da expressão global de MSH3 nas células suspeitas de serem células de adenocarcinoma obtidas do paciente, e (ii) a previsão da

2 0 eficácia da terapia com um agente antineoplásico para

tratamento do paciente, em que uma diminuição na expressão global de MSH3 nas células do paciente, quando comparada com a expressão de MSH3 em células normais, indica uma predisposição à responsividade à terapia com agente antineoplásico, em que a terapia compreende a administração de uma quantidade eficaz da terapia com agente antineoplásico ao paciente. Em um aspecto, os adenocarcinomas são selecionados do grupo que consiste em câncer cólon-retal (CRC), câncer de pulmão, câncer

3 0 cervical, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer renal, câncer do fígado, câncer testicular, câncer da bexiga, câncer vaginal, câncer de mama, câncer esofagiano, câncer pancreático e câncer de estômago. Em outro aspecto, o adenocarcinoma é CRC. Ainda em outro aspecto, o adenocarcinoma compreende um tumor sólido.

A etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3, como aqui descrita acima, compreende a análise das células suspeitas de serem células de adenocarcinoma quanto â expressão de proteína de MSH3, expressão de ácido nucléico de MSH3, ou ambas. Em um aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a realização de análise por espectrometria de massa de ácidos nucléicos de MSH3 obtidos do indivíduo. Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a amplificação por círculo rolante de uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo. Ainda em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a hibridização com uma sonda alelo-específica,

2 0 uma sonda de anticorpo, ou ambas. Em outro aspecto, a etapa

de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende imunoistoquímica.

Em um aspecto, o agente antineoplásico é selecionado do grupo que consiste em 1,3-bis(2-cloroetil)-1- nitrosouréia, bussulfan, carmustina, clorambucil,

ciclofosfamida, dacarbazina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, etoposida, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina, mecloretamina, melfalan, mitomicina C, mitoxantrona, temozolomida, topotecan e radiação

3 0 ionizante. Em outro aspecto, o agente antineoplásico é um agente de ligação cruzada interfilamentar. Em outro aspecto, o agente antineoplásico é um agente de ligação cruzada interfilamentar selecionado de cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, furocumarinas ou psoraleno.

Ainda em outro aspecto, o agente antineoplásico é um inibidor de poli(ADP-ribose)polimerase (PARP) selecionado do grupo que consiste em olaparib, derivados de isoindolinona, veliparib, iniparib e derivados de 4-metóxi- carbazol.

Ainda em outra modalidade, a presente invenção revela

um método para tratamento de um paciente em risco ou diagnosticado com câncer cólon-retal, o método compreendendo: a determinação da expressão global de MSH3 em células suspeitas de serem células de câncer cólon-retal

do paciente e previsão da eficácia da terapia com um agente antineoplásico para tratamento do paciente, em que uma diminuição na expressão global de MSH3 nas células do paciente, quando comparada com a expressão de MSH3 em células cólon-retais normais, indica uma predisposição à

2 0 responsividade à terapia com agente antineoplásico, em que

a terapia compreende a administração de uma quantidade eficaz da terapia com agente antineoplásico ao paciente.

Em um aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de uma amostra de

tecido suspeita de ser câncer cólon-retal quanto à expressão de proteína de MSH3. Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de uma amostra de tecido suspeita de ser câncer cólon-retal quanto à expressão de ácido nucléico

3 0 de MSH3. Ainda em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a realização de análise por espectrometria de massa de ácidos nucléicos de MSH3 obtidos do indivíduo. Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a amplificação por círculo rolante de uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo. Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a hibridização com uma sonda alelo-específica, uma sonda de anticorpo, ou ambas. Ainda em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende imunoistoquímica.

Em um aspecto, o agente antineoplásico é selecionado do grupo que consiste em 1,3-bis(2-cloroetil)-1- nitrosouréia, bussulfan, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida, dacarbazina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, etoposida, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina, mecloretamina, melfalan, mitomicina C, mitoxantrona, temozolomida, topotecan e radiação ionizante. Em um aspecto específico, o agente

2 0 antineoplásico é um agente de ligação cruzada

interfilamentar. Em outro aspecto, o agente antineoplásico é um agente de ligação cruzada interfilamentar selecionado de cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, furocumarinas ou psoraleno. Ainda em outro aspecto, o agente antineoplásico é um inibidor de poli(ADP-ribose)polimerase (PARP) selecionado do grupo que consiste em olaparib, derivados de isoindolinona, veliparib, iniparib e derivados de 4-metóxi- carbazol.

A presente invenção ainda fornece um método para a

3 0 seleção de uma terapia contra o câncer para um paciente em risco ou diagnosticado com câncer cólon-retal, o método compreendendo a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 do paciente e previsão da eficácia da terapia com um agente antineoplásico para tratamento do paciente com um agente antineoplásico, em que uma diminuição no nível global de expressão de MSH3 indica que o agente de ligação cruzada de DNA é uma terapia adequada para o paciente. Em um aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de uma amostra de tecido suspeita de ser câncer cólon-retal quanto à expressão de proteína de MSH3. Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de uma amostra de tecido suspeita de ser câncer cólon-retal quanto à expressão de ácido nucléico de MSH3. Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a realização de análise por espectrometria de massa de ácidos nucléicos de MSH3 obtidos do indivíduo. Ainda em outro aspecto do método aqui descrito acima, a etapa de determinação do nível

2 0 global de expressão de MSH3 compreende a amplificação por

círculo rolante de uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo. Em um aspecto relacionado do método, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a hibridização com uma sonda alelo-específica, sonda de anticorpo ou imunoistoquímica. Em um aspecto específico do método, o antineoplásico é um agente de ligação cruzada interfilamentar. Em outro aspecto, o antineoplásico é selecionado de cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, furocumarinas ou psoraleno. Em outro aspecto,

3 0 o agente antineoplásico é um inibidor de poli(ADP- ribose)polimerase (PARP) selecionado do grupo que consiste em olaparib, derivados de isoindolinona, veliparib, iniparib e derivados de 4-metóxi-carbazol.

Outra modalidade aqui revelada está relacionada a um método para estratificação de um paciente em um subgrupo de um experimento clinico de uma terapia contra o câncer, o método compreendendo: a determinação da expressão global de MSH3 em células suspeitas de serem células de câncer do paciente e previsão da eficácia da terapia com um fármaco- candidato para tratamento do paciente, em que uma diminuição na expressão global de MSH3 nas células do paciente, quando comparada com a expressão de MSH3 em células normais, indica uma predisposição à responsividade à terapia com o fármaco-candidato, em que a terapia compreende a administração de uma quantidade eficaz do fármaco-candidato aos pacientes, e o nível de expressão de MSH3 permite a estratificação do paciente em um subgrupo para o experimento clínico. Em um aspecto, as células de câncer são selecionadas do grupo que consiste em câncer

2 0 cólon-retal (CRC), câncer de pulmão, câncer cervical,

câncer ovariano, câncer de próstata, câncer renal, câncer do fígado, câncer testicular, câncer da bexiga, câncer vaginal, câncer de mama, câncer esofagiano, câncer pancreático e câncer de estômago. Em aspectos específicos, as células de câncer são células de câncer cólon-retal e as células de câncer estão em um tumor sólido.

Em um aspecto do método, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de uma amostra de tecido suspeita de ser câncer cólon-retal

3 0 quanto à expressão de proteína de MSH3, expressão de ácido nucléico de MSH3, ou ambas. Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a realização de análise por espectrometria de massa de ácidos nucléicos de MSH3 obtidos do indivíduo. Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a amplificação por círculo rolante de uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo. Ainda em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a hibridização com uma sonda alelo-específica ou uma sonda de anticorpo. Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende imunoistoquímica. Em um aspecto relacionado, o agente candidato é um agente genotóxico ou um inibidor de poli(ADP-ribose)polimerase (PARP).

Ainda em outra modalidade, a presente invenção descreve etapas para estratificação de um paciente em um subgrupo de câncer cólon-retal por um método que compreende as etapas de: determinação da expressão global de MSH3 em células suspeitas de serem células de câncer cólon-retal do paciente e previsão do estágio do câncer cólon-retal, em que uma diminuição na expressão global de MSH3 nas células do paciente, quando comparada com a expressão de MSH3 em células cólon-retais normais, indica progressão da doença. Em um aspecto, o método de estratificação acima revela a progressão da doença, e uma diminuição na expressão de MSH3 indica uma predisposição do câncer cólon-retal a uma terapia com agente antineoplásico.

A presente invenção revela ainda um método para 3 0 tratamento de um paciente em risco ou diagnosticado com câncer cólon-retal, o método compreendendo as etapas de:

(i) determinação da expressão global de MSH3 em células suspeitas de serem células de câncer cólon-retal do paciente que indica uma predisposição à responsividade à

terapia com um ou mais agentes de ligação cruzada de DNA,

(ii) determinação de uma diminuição continuada na expressão global de MSH3 no paciente, e (iii) administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação cruzada de DNA em uma quantidade suficiente para eliminar

células de câncer cólon-retal com expressão de MSH3 diminuída.

Em uma modalidade, a presente invenção está relacionada a um método de realização de um experimento clínico para avaliar um fármaco-candidato que supostamente

é útil no tratamento de um estado de doença associado à expressão do gene de MSH3, o método compreendendo: a) medição do nível de expressão de MSH3 pelo tecido suspeito de ter câncer cólon-retal de um conjunto de pacientes, b) administração de um fármaco-candidato a um primeiro

2 0 subconjunto dos pacientes, e de um placebo a um segundo

subconjunto dos pacientes, c) repetição da etapa (a) após a administração do fármaco-candidato ou do placebo, e d) determinação de se o fármaco-candidato reduz o número de células cólon-retais que possuem uma diminuição na

expressão de MSH3 que é estatisticamente significante, quando comparada com qualquer redução que ocorre no segundo subconjunto de pacientes, em que uma redução estatisticamente significante indica que o fármaco- candidato é útil no tratamento do referido estado de

3 0 doença. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para determinar se um câncer cólon-retal de mamífero tem probabilidade de ser resistente ou responsivo a um agente que danifica o DNA para o tratamento de câncer cólon-retal, o método compreendendo a(s) etapa(s) de: exame de uma amostra biológica do câncer quanto a uma diminuição na expressão global de MSH3 e identificação do câncer cólon-retal como tendo uma suscetibilidade aumentada ao agente que danifica o DNA, em que há expressão ou atividade diminuída de MSH3 em relação ao mesmo nível de expressão ou atividade do biomarcador no câncer que é responsivo ao agente que danifica o DNA.

Ainda em outra modalidade, a presente invenção revela um biomarcador para a progressão da doença de câncer cólon- retal, em que o biomarcador é MSH3, e uma diminuição na expressão global de MSH3 em células de câncer cólon-retal obtida de um paciente é indicativa de progressão da doença de câncer cólon-retal, quando comparada com a expressão de MSH3 em células normais de câncer cólon-retal ou células de

2 0 câncer cólon-retal obtidas em um ponto do tempo anterior do

mesmo paciente. Em um aspecto, o nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de uma amostra de tecido suspeita de ser câncer cólon-retal quanto à expressão de proteína de MSH3. Em outro aspecto, o nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de uma amostra de tecido suspeita de ser câncer cólon-retal quanto â expressão de ácido nucléico de MSH3. Em outro aspecto, o nível global de expressão de MSH3 compreende a realização de análise por espectrometria de massa de ácidos nucléicos

3 0 de MSH3 obtidos do indivíduo. Ainda em outro aspecto, o nível global de expressão de MSH3 compreende a amplificação por círculo rolante de uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo. Em outro aspecto, o nível global de expressão de MSH3 compreende a hibridização com uma sonda alelo-específica, sonda de anticorpo ou por imunoistoquímica.

A presente invenção ainda descreve um kit para um diagnóstico de câncer cólon-retal que compreende reagentes de detecção de biomarcador para determinação de um nível diferencial de expressão de MSH3 e instruções para seu uso no diagnóstico do risco para câncer cólon-retal. Em um aspecto, os níveis de expressão tanto de mRNA quanto de proteína de MSH3 em uma amostra de um paciente em risco para cólon-retal estão significativamente diminuídos, comparados com aqueles de um indivíduo normal. Em outro aspecto, o nível de expressão de mRNA de MSH3 está diminuído no paciente em risco para câncer cólon-retal, em comparação com um indivíduo normal. Ainda em outro aspecto, o nível de expressão de proteína de MSH3 está diminuído no paciente em risco para câncer cólon-retal, em comparação com um indivíduo normal.

Finalmente, a presente invenção fornece um método para o diagnóstico ou detecção de progressão de câncer cólon- retal em um ser humano que compreende as etapas de: (i) identificação do ser humano suspeito de sofrer de câncer cólon-retal, (ii) obtenção de uma ou mais amostras biológicas do indivíduo, em que as amostras biológicas são selecionadas do grupo que consiste em uma amostra de tecido, uma amostra fecal, um homogeneizado de células e um ou mais fluidos biológicos, que compreende: (iii) medição de um padrão de expressão global de MSH3 em uma ou mais células obtidas das amostras biológicas do indivíduo, e (iv) comparação do padrão de expressão global do MSH3 da amostra biológica do indivíduo suspeito de sofrer de câncer cólon-retal com o padrão de expressão global de MSH3 de uma amostra biológica de um indivíduo normal, em que o indivíduo normal é um indivíduo saudável que não sofre de câncer cólon-retal, em que uma diminuição no padrão de expressão global do MSH3 na amostra biológica do indivíduo é indicativa da presença, risco para o desenvolvimento, ou ambos, de câncer cólon-retal.

Em um aspecto do método diagnóstico aqui revelado acima, uma diminuição significante nos níveis de expressão de mRNA de MSH3, proteína de MSH3, ou ambos, é indicativa da presença, risco para o desenvolvimento, ou ambos, de câncer cólon-retal invasivo. Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de uma ou mais células da amostra biológica quanto â expressão de ácido nucléico de MSH3. Em

2 0 outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de

expressão de MSH3 compreende a realização de análise por espectrometria de massa de ácidos nucléicos de MSH3 obtidos do indivíduo. Ainda em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a realização de uma amplificação por círculo rolante de uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo. Em um aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a hibridização com uma sonda alelo-específica ou uma sonda de anticorpo.

3 0 Em outro aspecto, a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende imunoistoquímica. Ainda em outro aspecto, o método é usado para tratamento de um paciente em risco ou que sofre de câncer cólon-retal, seleção de uma terapia com agente de ligação cruzada de DNA para um paciente em risco ou que sofre de câncer cólon- retal, estratificação de um paciente em um subgrupo de câncer cólon-retal ou para um experimento clínico de terapia de câncer cólon-retal, determinação da resistividade ou responsividade a um regime terapêutico para câncer cólon-retal, desenvolvimento de um kit para o diagnóstico de câncer cólon-retal, ou quaisquer combinações destes.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Para uma compreensão mais completa das características e vantagens da presente invenção, será feita agora referência a descrição detalhada da invenção, juntamente com as figuras que a acompanham, e nas quais:

A FIG. 1 mostra que a expressão de MSH3 dos clones derivados de HCT116+3+5 transfectados estavelmente com

2 0 shRNA de MSH3 é controlada por um sistema tet-off: (IA)

análise por Western blot de MSH3, MLHl e β-actina em HCT116, HCT116+3, HCT116+3+5, e os três clones derivados de células HCT116+3+5, Gl, G2 e G5, (IB) análise por Western blot de MSH3 e β-actina em células HCT116+3+5, Gl, G2 e G5 cultivadas no meio com e sem 1 pg/ml de doxiciclina. A expressão relativa de MSH3 foi calculada por densitometria e os resultados foram obtidos de três ou mais estudos independentes.

A FIG. 2 mostra que células deficientes em MSH3 são

3 0 mais sensíveis à cisplatina e oxaliplatina do que células proficientes em MSH3: (2A) Fração de sobrevida clonogênica de células HCTll6, HCT116+3, HCT116+3+5 e G5 tratadas com cisplatina, (2B) Fração de sobrevida clonogênica de células G5 cultivadas com e sem 1 pg/ml de doxiciclina, que foram tratadas com cisplatina, (2C) Fração de sobrevida clonogênica de células HCT116, HCT116+3, HCT116+3+5 e G5 tratadas com oxaliplatina, (2D) Fração de sobrevida clonogênica de células Gl, G2 e G5 cultivadas com e sem 1 pg/ml de doxiciclina, que também foram tratadas com oxaliplatina, (2E) Diminuição na população de fase S, e (2F) Aumento na população sub-Gl das células HCT116+3+5 e Gl, (2G) Diminuição na incorporação relativa de BrdU, comparado com controles não tratados, e (2H) Aumento nas células anti-caspase-3 ativa-positivas em

imunofluorescência nas células HCT116+3+5 e G5. Os dados são representados como média ± erro-padrão da média (SE) de três ou mais estudos independentes. A diferença estatística foi determinada por teste t de Student bilateral (two- sided) . Os asteriscos *, ** e *** representam p<0,05,

2 0 p<0,01 e p<0,001, respectivamente. NS representa p=0,05 ou

mais. Dados representativos de um dos três clones deficientes em MSH3 são mostrados nessa figura.

A FIG. 3 mostra que a depleção transitória de MSH3 por siRNA também sensibiliza células HCT116+3+5 à cisplatina e oxaliplatina: (3A) Análise por Western blot de MSH3 e |3- actina em células HCT116+3+5 depletadas de MSH3 por transfecção transitória de siRNA. Comparação da fração de sobrevida clonogênica de linhagens de células HCT116+3+5 tratadas com cisplatina, (3B) e oxaliplatina, (3C) após

3 0 transfecção entre análise por Western blot com siRNA não direcionado (controle) e com siRNA de MSH3, (3D) de MSH3 e j3-actina em células HT29 tratadas com siRNA não direcionado e com siRNA de MSH3. As células foram extraídas 72 horas após transfecção de siRNA. Comparação de frações de sobrevida clonogênica de células HT29 tratadas com cisplatina (3E) e oxaliplatina (3F) após transfecção com siRNA de controle e siRNA de MSH3. Os dados são representados como média ± erro padrão de cinco experimentos independentes. A diferença estatística foi determinada por teste t de Student bilateral. Os asteriscos * e ** representam p<0,05 e p<0,01, respectivamente; NS representa p>0,05 .

A FIG. 4 mostra que a depleção transitória de MLHl por siRNA não afeta a resistência à cisplatina e oxaliplatina das células proficientes e deficientes em MSH3: (4A). Análise por Western blot de MLHl e β-actina em células HCT116+3+5 e G5 depletadas de MLHl após transfecção transitória de siRNA, (4B) Fração de sobrevida clonogênica de células HCT116+3+5 e G5 tratadas com N-metil-N'-nitro-N-

2 0 nitrosoguanidina após transfecção com siRNA de controle ou

siRNA de MLHl. Comparação da fração de sobrevida clonogênica entre células HCT116+3+5 e G5 depletadas de MLHl tratadas com cisplatina (4C) e oxaliplatina (4D) . Os dados são representados como média ± erro padrão de quatro ou mais experimentos independentes. A diferença estatística foi determinada por teste t de Student bilateral. Os asteriscos * e ** representam p<0,05 e p<0,01, respectivamente; NS representa p>0,05.

A FIG. 5 demonstra que células deficientes em MSH3

3 0 mostram uma diminuição da eficiência do reparo da quebra da fita dupla de DNA: (5A) Coloração por imunofluorescência para formação de focos de pH2AX nas células HCT116+3+5, G5 com doxiciclina e G5 sem doxiciclina. As células foram tratadas com tratamento de 5 μΜ de oxaliplatina por 6 horas, e foram analisadas por imunofluorescência após as horas indicadas. Painel superior; DAPI, painel inferior: pH2AX, (5B) Declínio ineficiente de células pH2AX-positivas nas células deficientes em MSH3, (5C) Coloração por imunofluorescência para formação de focos de 53BP1 em células G5 com doxiciclina e G5 sem doxiciclina. As células foram tratadas com tratamento de 5 μΜ de oxaliplatina por 6 horas, e foram analisadas por imunofluorescência após 4 8 horas (5D) . Pelo menos 100 células foram contadas em cada lâmina. Os dados são representados como média ± erro padrão de três ou quatro experimentos independentes. A diferença estatística entre células G5 deficientes e proficientes em MSH3 foi determinada pelo teste t de Student bilateral. Os asteriscos * e *** representam p<0,05 e p<0,001, respectivamente.

A FIG. 6 mostra que células deficientes em MSH3 são

sensíveis a olaparib, um inibidor de PARP, e à combinação com oxaliplatina: (6A) Sobrevida clonogênica de HCT116+3+5, G5 sem doxiciclina e G5 células com doxiciclina, que foram tratadas com 2 μΜ de oxaliplatina, 2 μΜ de olaparib e a combinação desses dois fármacos, e (6B) Sobrevida clonogênica de células HT29 que foram tratadas com 1 μΜ de oxaliplatina, 2 μΜ de olaparib e a combinação desses dois fármacos. Os dados são representados como média ± erro padrão de três ou mais experimentos independentes. A diferença estatística foi determinada pelo teste t de Student bilateral. Os asteriscos *, ** e *** representam p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Embora a produção e a utilização de várias modalidades da presente invenção sejam discutidas em detalhe abaixo, deve ser observado que a presente invenção fornece muitos conceitos inventivos aplicáveis que podem ser exemplificados em diversos contextos específicos. As modalidades específicas aqui discutidas são meramente ilustrativas de formas específicas para produção e utilização da invenção, e não delimitam o escopo da invenção.

Para facilitar a compreensão desta invenção, vários termos serão definidos abaixo. Os termos aqui definidos possuem os significados comumente compreendidos por aqueles habilitados nas áreas relevantes à presente invenção. Termos como "um", "uma", "o" e "a" não visam se referir apenas a uma entidade no singular, mas incluem a classe geral da qual um exemplo específico pode ser usado para ilustração. A terminologia é aqui usada para descrever modalidades específicas da invenção, mas sua utilização não delimita a invenção, exceto como definido nas reivindicações.

As abreviações aqui usadas incluem: MMR, reparo de erro de pareamento; MSI, instabilidade microssatélite; CRC, câncer cólon-retal; MeG, 06-metilguanina; ICLs, ligações cruzadas interfilamentares; NER, reparo de excisão de nucleotídeo; HR, recombinação homóloga; PARP, poli(ADP- ribose)polimerase; EMAST, alterações microssatélites elevadas em repetições de tetranucleotídeos; DSB, quebra de fita dupla; BrdU, bromodesoxiuridina; pH2AX, H2AX fosforilado.

Como aqui usado, o termo "câncer cólon-retal" inclui a definição médica bem aceita que define câncer cólon-retal como uma condição médica caracterizada por câncer de células do trato intestinal abaixo do intestino delgado (ou seja, o intestino grosso (cólon), incluindo o ceco, cólon ascendente, cólon transverso, cólon descendente, cólon sigmóide e reto). Adicionalmente, como aqui usado, o termo "câncer cólon-retal" também ainda inclui condições médicas que são caracterizadas por câncer de células do duodeno e do intestino delgado (jejuno e íleo).

O termo "amostra de tecido" (o termo "tecido" é usado de forma intercambiável com o termo "amostra de tecido") deve ser entendido como incluindo qualquer material composto por uma ou mais células, individualmente ou em complexo com qualquer matriz ou em associação com qualquer substância química. A definição deve incluir qualquer material biológico ou orgânico e qualquer subporção 2 0 celular, produto ou subproduto desta. A definição de "amostra de tecido" deve ser considerada como incluindo, sem limitação, esperma, ovos, embriões e componentes sangüíneos. Também estão incluídas dentro da definição de "tecido" para os objetivos desta invenção algumas estruturas acelulares definidas como, por exemplo, camadas dérmicas da pele que possuem uma origem celular, mas não são mais caracterizadas como celulares. O termo "fezes", como aqui usado, é um termo clínico que se refere às fezes excretadas por seres humanos. O termo "gene", como aqui usado, refere-se a uma proteína funcional, polipeptídeo ou unidade codificadora de peptídeo. Como será entendido por aqueles habilitados na técnica, esse termo funcional inclui tanto seqüências genômicas, seqüências de cDNA, ou fragmentos ou combinações destes, além de produtos gênicos, incluindo aqueles que foram alterados pela mão do homem. Genes purificados, ácidos nucléicos, proteína e semelhantes são usados para se referir àquelas entidades quando identificados e separados de pelo menos um ácido nucléico ou proteína contaminante

com o qual ele está normalmente associado. O termo "alelo" ou "forma alélica" refere-se a uma versão alternativa de um gene que codifica a mesma proteína funcional, mas que contém diferenças em termos de seqüência de nucleotídeos em relação a outra versão do mesmo gene.

Como aqui usado, o termo "ácido nucléico" ou "molécula

de ácido nucléico" refere-se aos polinucleotídeos, por exemplo, ácido desoxirribonucléico (DNA) ou ácido ribonucléico (RNA), oligonucleotídeos, fragmentos gerados pela reação em cadeia de polimerase (PCR) e fragmentos

2 0 gerados por qualquer um de ligação, corte, ação de

endonuclease e ação de exonuclease. Moléculas de ácido nucléico podem ser compostas por monômeros que são nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, DNA e RNA), ou análogos de nucleotídeos de ocorrência natural

(por exemplo, formas α-enantioméricas de nucleotídeos de ocorrência natural), ou uma combinação de ambos. Nucleotídeos modificados podem ter alterações em porções de açúcar e/ou em porções de base de pirimidina ou purina. Modificações de açúcar incluem, por exemplo, substituição

3 0 de um ou mais grupos hidroxil com halogênios, grupos alquil, aminas e grupos azido, ou os açúcares podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, toda a porção de açúcar pode ser substituída com estruturas estérica e eletronicamente similares, por exemplo, aza- açúcares e análogos carbocíclicos de açúcar. Exemplos de modificações em uma porção de base incluem purinas e pirimidinas alquiladas, purinas ou pirimidinas aciladas, ou outros substitutos heterocíclicos bem conhecidos. Monômeros de ácido nucléico podem ser ligados por ligações fosfodiéster ou análogos dessas ligações. Análogos de ligações fosfodiéster incluem fosforotioato,

fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato, e semelhantes. 0 termo "molécula de ácido nucléico" também inclui os denominados "ácidos nucléicos peptídicos", que compreendem bases de ácido nucléico de ocorrência natural ou modificadas anexadas a um arcabouço de poliamida. Os ácidos nucléicos podem ser de fita simples ou de fita dupla.

0 termo "hibridização", como aqui usado, refere-se ao

processo no qual dois polinucleotídeos de fita simples se ligam não covalentemente para formar um polinucleotídeo de fita dupla estável; a hibridização de fita tripla também é teoricamente possível. 0 polinucleotídeo de fita dupla (normalmente) resultante é um "híbrido". A proporção da população de polinucleotídeos que forma híbridos estáveis é aqui denominada "grau de hibridização". As hibridizações são normalmente realizadas sob condições estringentes, por exemplo, em uma concentração de sal de no máximo IMe uma 3 0 temperatura de pelo menos 25° C. Por exemplo, condições de χ SSPE (750 mM de NaCl, 50 mM de fosfato de Na, 5 mM de EDTA, pH 7,4) e uma temperatura de 25-30° C são adequadas para hibridizações de sonda alelo-específica. Para condições estringentes, veja, por exemplo, Sambrook, Fritsche e Maniatis. "Molecular Cloning A laboratory Manual" 2a Edição, Cold Spring Harbor Press (1989), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade para todas as finalidades acima.

0 termo "amplificação por circulo rolante (RCA)", como aqui usado, descreve um método de replicação e amplificação de DNA que resulta em uma fita de ácido nucléico que compreende uma ou mais cópias de uma seqüência que é complementar a uma seqüência do DNA circular original. Esse processo para amplificação (que gera cópias complementares) compreende a hibridização de um iniciador de oligonucleotídeo para o DNA circular-alvo, seguida por ciclagem isotérmica (por exemplo, na presença de uma ligase e uma DNA polimerase). Uma única rodada de amplificação com o uso de RCA resulta em uma grande amplificação das 2 0 seqüências no alvo circular para obter uma concentração elevada do oligonucleotídeo desejado em uma única fita de ácido nucléico. Como a seqüência de ácido nucléico desejada se torna a seqüência predominante (em termos de concentração) na mistura, ela é considerada "amplificada 2 5 por RCA". Com RCA, é possível amplificar uma única cópia de uma seqüência de ácido nucléico em particular até um nível detectável por diversas metodologias diferentes (por exemplo, hibridização com uma sonda marcada; a incorporação de iniciadores biotinilados, seguida por detecção do conjugado de avidina-enzima; incorporação de trifosfatos de desoxinucleotídeo marcados com 32P, por exemplo, dCTP ou dATP, no segmento amplificado).

Como aqui usado, o termo "sonda de anticorpo" refere- se a um anticorpo que é específico para e se liga a qualquer antígeno-alvo. Esse antígeno-alvo pode ser um peptídeo, proteína, carboidrato ou qualquer outro biopolímero ao qual um anticorpo se ligará com especificidade.

0 termo "biomarcador", como aqui usado, em várias modalidades, refere-se a uma substância bioquímica específica no corpo que possui uma característica molecular em particular que a torna útil para o diagnóstico e medição do progresso de doença ou dos efeitos do tratamento. Por exemplo, metabólitos ou biomarcadores comuns encontrados na respiração de uma pessoa, e a respectiva condição diagnostica da pessoa que fornece esse metabólito, incluem, sem limitação, acetaldeído (fonte: etanol, X-treonina; diagnóstico: intoxicação), acetona (fonte: acetoacetato; diagnóstico: dieta/diabetes), amônia (fonte: desaminação de 2 0 aminoácidos; diagnóstico: uremia e doença hepática), CO (monóxido de carbono) (fonte: CH2Cl2, % de COHb elevado; diagnóstico: poluição do ar em interiores), clorofórmio (fonte: compostos halogenados) , diclorobenzeno (fonte: compostos halogenados), dietilamina (fonte: colina; diagnóstico: supercrescimento bacteriano intestinal), H (hidrogênio) (fonte: intestinos; diagnóstico: intolerância à lactose), isopreno (fonte: ácido graxo; diagnóstico: estresse metabólico), metanotiol (fonte: metionina; diagnóstico: supercrescimento bacteriano intestinal), metiletilcetona (fonte: ácido graxo; diagnóstico: poluição do ar em interiores/dieta), O-toluidina (fonte: metabólito de carcinoma; diagnóstico: carcinoma broncogênico), sulfetos de pentano e sulfetos (fonte: peroxidação de lipídeo; diagnóstico: infarto do miocárdio), H2S (fonte: metabolismo; diagnóstico: doença periodontal /ovulação), MeS (fonte: metabolismo; diagnóstico: cirrose) e Me2S (fonte: infecção; diagnóstico: estomatite).

Como aqui usado, o termo "imunoistoquímica (IHC)", também conhecido como "imunocitoquímica (ICC)" quando aplicado às células, refere-se a uma ferramenta em patologia diagnostica, em que painéis de anticorpos monoclonais podem ser usados no diagnóstico diferencial de neoplasias indiferenciadas (por exemplo, para distinguir Iinfornas, carcinomas e sarcomas) para revelar marcadores específicos para certos tipos de tumor e outras doenças, para diagnosticar e definir o fenótipo de linfomas malignos e para demonstrar a presença de antígenos virais, oncoproteínas, receptores de hormônios e proteínas nucleares associadas à proliferação.

2 0 Como aqui usado, o termo "experimento clínico" inclui

qualquer estudo de pesquisa projetado para coletar dados clínicos sobre respostas a um tratamento particular, e inclui, sem limitação, experimentos clínicos de fase I7 fase II e fase III. São usados métodos padronizados para definir a população de pacientes e para a inclusão de indivíduos.

O termo diferenças "estatisticamente significantes" entre os . grupos estudados está relacionado à condição quando, com a utilização de uma análise estatística

3 0 apropriada (por exemplo, teste Qui-Quadrado, teste t) , a probabilidade de os grupos ser igual é de menos de 5%, por exemplo, p<0,05. Em outras palavras, a probabilidade de obtenção dos mesmos resultados de uma forma completamente aleatória é de menos de 5 em 100 tentativas.

0 termo "fármaco-candidato", como aqui usado, refere-

se a qualquer composto, qualquer que seja a origem, adequado para ser pesquisado quanto à sua atividade na redução do número de células cólon-retais que possuem expressão diminuída de MSH3 de acordo com os métodos da

presente invenção.

O termo "agente genotóxico", como aqui usado, é definido para incluir tanto agentes químicos quanto físicos capazes de causar danos ao DNA ou ao gene humano. Carcinógenos e mutágenos são exemplos comuns de agentes

genotóxicos químicos, enquanto radiação UV, raios Xeye semelhantes, quando produzem produto de DNA oxidado, são exemplos comuns de agentes genotóxicos físicos.

O termo "agente antineoplásico" refere-se aos agentes que possuem a propriedade funcional de inibição do

2 0 desenvolvimento ou da progressão de uma neoplasia em um

mamífero, por exemplo, um ser humano, e também pode se referir à inibição de metástase ou potencial metastático.

O termo "kit" ou "kit de teste" representa combinações de reagentes e adjuvantes necessárias para uma análise.

Embora um kit de teste consista, na maioria dos casos, em várias unidades, elementos de análise em peça única também são disponíveis, que devem, do mesmo modo, ser considerados como kits de teste.

0 gene MSH3 (N° de Acesso P20585) é um dos genes de

3 0 reparo de erro de pareamento de DNA (MMR) que passou por mutação somática freqüentemente em cânceres deficientes em MMR. MSH3, junto com MSH2, forma o heteroduplex MutSJ3, que interage com ligações cruzadas interfilamentares (ICLs) induzidas por fármacos como, por exemplo, cisplatina e psoraleno. No entanto, o papel preciso de MSH3 na mediação dos efeitos citotóxicos de agentes indutores de ICL permanece pouco compreendido. Os presentes inventores demonstram aqui os efeitos da deficiência de MSH3 sobre a citotoxicidade causada por cisplatina e oxaliplatina, outro

fármaco de platina indutor de ICL.

Com o uso de clones isogênicos derivados de HCT116 nos quais a expressão de MSH3 é controlada por expressão de shRNA em um sistema tet-off, foi descoberto que a deficiência de MSH3 sensibilizou as células tanto à

cisplatina quanto à oxaliplatina em doses clinicamente relevantes. Curiosamente, infra-regulação induzida siRNA da proteína de MLHl não afetou a toxicidade MSH3-dependente desses fármacos, o que indica que esse processo não necessita da participação da via de MMR canônica.

2 0 Além disso, células deficientes em MSH3 mantiveram

níveis maiores de H2AX e 53BP1 fosforilados após tratamento com oxaliplatina em comparação com células proficientes em MSH3, o que sugere que MSH3 desempenha um papel importante no reparo de quebras de fitas duplas de DNA (DSB) . Esse

2 5 papel de MSH3 foi ainda apoiado pelos achados aqui

apresentados de que células deficientes em MSH3 foram sensíveis ao olaparib, um inibidor da poli(ADP- ribose)polimerase. Além disso, a combinação de oxaliplatina e olaparib exibiu um efeito sinérgico comparado com cada

3 0 tratamento individualmente. Coletivamente, esses resultados demonstram que a deficiência de MSH3 contribui para a citotoxicidade de fármacos de platina por meio do reparo deficiente em DSB. Esses dados permitem previsão e tratamentos eficazes para cânceres com deficiência de MSH3.

Os achados da presente invenção representam um desvio

significante e inédito de achados prévios em relação aos genes (incluindo MSH3) e conjuntos de genes úteis na avaliação do prognóstico e/ou previsão da resposta de câncer à quimioterapia. A Publicação de Patente U.S. N0 20090305277, depositada por Baker e cols., descreve um método de previsão de uma probabilidade de que um paciente seja humano diagnosticado com câncer com base na determinação de um nível de expressão de pelo menos um gene que é o oposto da presente invenção, especificamente, que um aumento na expressão de certos genes, incluindo, MSH3, está correlacionado positivamente com uma probabilidade aumentada de uma resposta positiva à quimioterapia. No entanto, o pedido não inclui dados celulares ou de tecidos, mas, ao invés disso, usa uma abordagem que explora um gene 2 0 genérico para chegar às suas conclusões.

0 sistema de reparo de erro de pareamento de DNA (MMR) é composto por várias proteínas como, por exemplo, MLHl, MSH2, MSH6, MSH3 e PMS2, elimina erros de replicação e mantém a estabilidade genômica. MutSa, um heterodímero de

2 5 MSH2/MSH6, reconhece erros de pareamento de base únicos,

enquanto Mutsp, um heterodímero de MSH2/MSH3, primariamente reconhece alças de inserção-deleção de 2-4 bp (1,2). O complexo MutL, principalmente MutLa, um heterodímero de MLH1/PMS2, forma um complexo ternário com um heterodímero

3 0 de MutS que liga os erros de pareamento aos erros de pareamento de DNA durante a replicação, e leva ao recrutamento de outras proteínas para completar o processo de MMR de DNA. Mutações de linhagem germinativa em genes de MMR resultam em síndrome de Lynch, que é caracterizada por predisposição hereditária a cânceres com instabilidade microssatélite (MSI) no cólon, endométrio, ovários e trato urinário (3,4). Em contraste, a deficiência de MMR resultante de metilação do promotor de MLHl causa tumores esporádicos com MSI, incluindo câncer cólon-retal (CRC) (aproximadamente 15%), câncer endometrial (20-25%) e câncer ovariano (aproximadamente 12%) (4-6) .

0 sistema de MMR também participa no reparo de certos adutos de DNA gerados por agentes que danificam o DNA como, por exemplo, agentes alquilantes e 6-tioguanina. A lesão citotóxica primária gerada por agentes alquilantes é Os- metilguanina (MeG) , que causa erros de pareamento MeG-C ou weG-T (7) . MutSa reconhece esses erros de pareamento e recruta MutLa para as reações de reparo subseqüentes (8,9). A perda de MutSa ou MutLa torna uma célula tolerante aos 2 0 efeitos citotóxicos desses fármacos, o que sugere que esses dois complexos também estão ligados a uma via de transdução de sinal que leva à interrupção do crescimento celular ou à morte celular (10,11).

Por outro lado, MutS{3 reconhece ligações cruzadas

2 5 interfilamentares (ICLs) geradas por vinculadores cruzados

de DNA como, por exemplo, psoraleno e cisplatina. MutS{3 está envolvido no reconhecimento e desacoplamento das ICLs induzidas por psoraleno em extratos de células de mamíferos (12) . Recentemente, foi demonstrado que MutSp interage com

3 0 XPA-RPA ou XPC-RAD23B, ambos envolvidos no reparo de excisão de nucleotídeo (NER), no reconhecimento de ICLs por psoraleno, e promove o processo de NER (13,14). 0 nível de recombinação homóloga (HR) que repara ICLs também é dependente de MutSj3, mas não de MutSa ou MLHl. Esses resultados sugerem que MutS{3 pode cooperar com as proteínas de NER, HR e anemia de Fanconi para o reparo de ICLs induzidas por psoraleno (15) . Além disso, MutSJ3 também se liga às ICLs induzidas por cisplatina junto com PARP-1, DNA ligase III, XRCC-I, Ku80 e Ku70, o que sugere que MutS{3 também pode cooperar com outras vias de reparo para reconhecer e reparar ICLs induzidas por fármacos de platina (16) .

A oxaliplatina, um fármaco de platina de terceira geração, é um dos fármacos cruciais que estão atualmente sendo usados para o tratamento de pacientes com CRC. Similar à cisplatina, a oxaliplatina também forma ligações cruzadas intrafilamentares e ICLs (17) . No entanto, os mecanismos moleculares detalhados envolvidos no reparo e efeitos citotóxicos de adutos induzidos por oxaliplatina,

2 0 especialmente ICLs, não foram intensamente explorados.

Considerando que o complexo de MutS{3 tem um papel no reparo de ICLs, os presentes inventores reconheceram que a deficiência de MSH3 pode interromper o reparo de ICLs induzido por fármacos de platina, resultando em citotoxicidade aumentada desses fármacos em pacientes com câncer. Adicionalmente, como a deficiência de MSH3 resulta em células com HR suprimida (15) e defeituosas em HR que são hipersensíveis aos inibidores de poli(ADP- ribose)polimerase (PARP) (18,19), os presentes inventores

3 0 reconheceram ainda que a deficiência de MSH3 também pode resultar na sensibilização das células aos inibidores de PARP. EM CRC com MSI, mutações frameshift freqüentes (2 0- 50%) dentro das repetições de mononucleotídeo [A]8 no éxon 7 de MSH3 resultam em perda ou redução de MSH3 (20-22) .

Recentemente, os presentes inventores verificaram que a população de células de câncer MSH3-negativas existe dentro de tecidos de CRC esporádicos que exibem níveis baixos de MSI e/ou alterações microssatélites elevadas em repetições de tetranucleotídeos (EMAST) (23). Se a deficiência de MSH3 dita a toxicidade de fármacos de platina e inibidores de PARP em um quadro clínico, o estado de MSH3 pode ser usado como um marcador preditivo para o resultado final de quimioterápico em pacientes com cânceres deficientes em MSH3. Para demonstrar que o estado de MSH3 pode ser usado como um marcador preditivo para o resultado quimioterápico final em pacientes com cânceres deficientes em MSH3, os presentes inventores usaram linhagens de células isogênicas nas quais a expressão da proteína de MSH3 pode ser regulada por meio da expressão de shRNA em um sistema tet-off, e 2 0 investigaram o efeito da deficiência de MSH3 na sensibilidade celular para dois fármacos de platina e um inibidor de PARP bem conhecido. Esses estudos revelaram novas evidências moleculares de que a deficiência de MSH3 em linhagens de células de CRC contribui para a 2 5 citotoxicidade de fármacos de platina, especialmente como resultado do reparo comprometido de quebra de fita dupla (DSB).

Reagentes - Cisplatina, oxaliplatina, .N-Metil--W' - Nitro-jW-Nitrosoguanidina (MNNG) e iodeto de propídio foram adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Olaparib, um inibidor de PARP, foi adquirido de Selleck Chemicals (Houston, TX).

Linhagens de células e cultura de células - As linhagens de células de câncer do cólon humano HCT116, HCT116+ch.3 (HCT116+3), HCT116+ch.3+ch.5 (HCT116+3+5) foram descritas previamente (10,23). As células HCT116+3+5 foram transfectadas estavelmente com um vetor retroviral regulado por tetraciclina, o TMP (Open Biosystems, Huntsville, AL) que codifica shRNA contra MSH3. Clones deficientes em MSH3 Gl, G2 e G5 estáveis foram isolados (veja os resultados e (23)). Células HCTll6, HCT116+3 e HCT116+3+5 foram desenvolvidas em IMDM (Invitrogen, Rockville, MD) com soro bovino fetal 10%. As células Gl, G2 e G5 foram mantidas em IMDM com soro bovino fetal 10% e 0,6 pg/ml de puromicina. Para desligar a expressão de shRNA de MSH3, 1 pg/ml de doxiciclina foi adicionado ao meio de cultura.

Análise Western blot - Proteínas de lisados de células foram preparadas, separadas na SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF, como descrito previamente (31) . Anticorpo monoclonal de camundongo anti-hMSH3 (diluição; 1:250, Clone 52, BD Pharmingen, San Jose, CA), anticorpo monoclonal de camundongo anti-hMLHl (1:200, G168-728, BD Pharmingen) e anticorpo anti-p-actina (1:10.000, Clone AC- 15, Sigma-Aldrich) foram usados como anticorpos primários para a detecção de proteínas específicas. Anticorpo de cabra anti-camundongo (1:3.000, sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foi usado como um anticorpo secundário. A amplificação e A detecção do sinal foram obtidas por exposição da membrana ao reagente de ECL (GE 3 0 Healthcare, Piscataway, NJ) , seguido por visualização no sistema de imagem Storm (Amersham, Piscataway, NJ).

Ensaio de sobrevida clonogênica - Duzentas células foram semeadas em cada poço de uma placa de seis poços. Para a medição da citotoxicidade causada por cisplatina ou oxaliplatina, as células foram tratadas com os fármacos por 24 horas após as células terem sido anexadas à placa. Para a medição da citotoxicidade causada por olaparib, as células foram tratadas continuamente com o fármaco durante os experimentos. Após 8-10 dias, o número de colônias (colônias com >50 células) foi contado, e a alteração relativa na sobrevida clonogênica de células tratadas com fármaco versus células não tratadas foi determinada.

Análise do ciclo celular - Um milhão de células foram semeadas em placas de 10 cm. Após aderidas, as linhagens de células foram tratadas com oxaliplatina por 24 horas. Após mais 4 8 horas, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado, fixadas em etanol 70% gelado a -20°C de um dia para o outro ou por vários dias. As células fixadas em etanol (2 χ IO6) foram subseqüentemente lavadas com PBS duas vezes e 2 0 incubadas com 3 00 μΐ de PBS e RNase A 0,15% por 15 minutos a 37°C. As células foram coradas com 75 pg/ml de iodeto de propldio por 3 0 minutos e depois analisadas quanto ao teor de DNA usando o citômetro de fluxo FACSCantoII (BD Biosciences, San Jose, CA). Os dados do ciclo celular foram 2 5 analisados pelo software Flowjo (Tree Star, Ashland, 0R).

Ensaio de proliferação - 0 índice de proliferação foi medido por incorporação de bromodesoxiuridina (BrdU) em células HCT116+3+5 e G5, 48 horas após o tratamento de 24 horas inicial com cisplatina ou oxaliplatina ("Cell Proliferation ELISA, BrdU", Roche Diagnositics, Indianapolis, IN) . Os experimentos foram realizados em triplicata e foram obtidos dados de três ou quatro experimentos independentes.

Tratamento de siRNA - siRNA de MLHl, siRNA de MSH3 e siRNA não direcionado foram adquiridos de Dharmacon (Lafayette, CO) . Duzentas mil células foram semeadas em placas de 24 poços. Após incubação de um dia para o outro, as células foram transfectadas com 83 nM dos siRNAs direcionados ou siRNA não direcionados usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Dois dias após a transfecção, as células foram coletadas e plaqueadas novamente para ensaios de sobrevida clonogênica.

Coloração por imunofluorescência - Dez mil células foram desenvolvidas em lamínulas de vidro em uma placa de 12 poços. As células foram fixadas com paraformaldexdo 4% (pH 7,5) em PBS por 15 minutos, permeabilizadas com Triton X-IOO 0,3% por cinco minutos, e depois bloqueadas com soro de cabra 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA) por uma hora. As 2 0 células foram subseqüentemente incubadas com um anticorpo anti-caspase-3 ativa (1:500, G748, Promega, Madison, WI), um anticorpo anti-H2AX fosforilado (pH2AX) (1:5.000, JBW301, Millipore Corporation, Billerica, MA), ou um anticorpo anti-53BPl (1:600, ab21083, Abcam, Cambridge, MA)

2 5 por uma hora, seguido por um anticorpo secundário (1:800,

anticorpo de cabra anti-camundongo ou anti-coelho com Flúor Alexa 555, Invitrogen) por 40 minutos. "Prolong Gold" com DAPI (Invitrogen) foi usado na montagem do meio. As imagens foram obtidas usando um microscópio de epifluorescência

3 0 multicanais AxioSkop2 equipado com o software AxioVision (Carl Zeiss, Thornwood, NY).

A expressão de MSH3 é controlada por doxiciclina em clones deficientes em MSH3. Os presentes inventores primeiro determinaram se a expressão de MSH3 em clones de células Gl, G2 e G5 de células de CRC HCT116 é controlada por doxiciclina. Células HCT116 e HCT116+3 foram usadas como controles negativos e HCT116+3+5 como controle positivo para expressão de MSH3. Células HCT116 e HCT116+3 não mostraram expressão detectável de proteína de MSH3 (FIG. IA) , o que é consistente com células HCT116 que abrigam mutações frameshift homozigotas em uma repetição de mononucIeotídeo do éxon 7 de MSH3 (23). HCT116+3+5, geradas por HCT116+3 deficiente em MSH3 por transferência de uma cópia do cromossomo 5, mostraram expressão de MSH3. Embora nenhum MSH3 tenha sido detectado em clones Gl, G2 e G5 na ausência de doxiciclina, a adição de doxiciclina restaurou a expressão de MSH3 em todos esses clones a cerca de 40-60% dos níveis de HCT116+3+5 parental (FIGS. IA e 1B) . Embora possa ser tecnicamente desafiador esperar o bloqueio 2 0 completo para a produção de shRNA de MSH3 nessas linhagens de células até mesmo na presença de doxiciclina, o nível de proteína nesses resultados foi o suficiente para analisar o efeito de MSH3 sobre a sensibilidade ao fármaco nesse estudo, pois esse nível de MSH3 em células G5 é suficiente

2 5 para recuperar as funções de MSH3 em relação ao fenótipo

EMAST in vitro (23) .

Células deficientes em MSH3 são mais sensíveis à cisplatina e oxaliplatina do que células proficientes em MSH3. Para determinar se o estado de MSH3 afeta a

3 0 sensibilidade celular aos dois fármacos de platina, a sobrevida clonogênica de HCT116 e linhagens de células derivadas de HCT116 em células tratadas com cisplatina foi examinada. Não foram observadas diferenças significantes na sensibilidade à cisplatina entre linhagens de células HCT116 deficientes em MLHl e MSH3 e de células HCT116+3 deficientes somente em MLHl, enquanto uma resistência mais elevada foi observada em linhagens de células HCT116+3+5 proficientes em MSH3 (FIG. 2A) . Entre as várias linhagens de células, o clone G5 deficiente em MSH3 foi mais sensível do que seu HCT116+3+5 parental (FIG. 2A) . Para confirmar ainda mais que a existência de MSH3 influenciava a citotoxicidade induzida por cisplatina, a sobrevida clonogênica de G5 células na presença e ausência de doxiciclina foi comparada. Verificou-se que a restauração da expressão de MSH3 dessensibilizava as células à cisplatina (5 μΜ; FIG. 2B). Esses resultados indicam que a depleção de MSH3 levou à sensibilização de células à cisplatina. Também foi analisada a sobrevida clonogênica dos outros clones, Gl e G2, e verificou-se que esses clones 2 0 se comportaram similarmente ao G5 (dados não mostrados). Isso fortaleceu ainda mais o possível papel de MSH3 na citotoxicidade causada por cisplatina. A seguir, foi determinado se a deficiência de MSH3 também influenciava a sensibilidade celular à oxaliplatina. Surpreendentemente, os clones deficientes em MSH3 HCT116, HCT116+3 e G5 foram significativamente mais sensíveis à oxaliplatina do que o HCT116+3 +5 parental, como foi o caso para cisplatina (FIG. 2C) . Além disso, foi observado que a restauração de MSH3 nas células deficientes em MSH3 levou à restauração da insensibilidade â oxaliplatina (FIG. 2D) . A seguir, a taxa de inibição do crescimento e os níveis de apoptose entre células proficientes em MSH3 e células deficientes em MSH3 após tratamento com oxaliplatina foram comparados. Os presentes inventores verificaram que o grau de inibição do crescimento celular (FIG. 2E) e os níveis de apoptose foram significativamente maiores (FIG. 2F) em células deficientes em MSH3 do que em células proficientes em MSH3, usando citometria de fluxo. Ela também confirmou que a proliferação celular estava diminuída e a fração apoptótica estava aumentada em células deficientes em MSH3 tratadas com oxaliplatina, usando um ensaio de BrdU e uma imunofluorescência, respectivamente. A FIG. 2G mostra uma diminuição na incorporação relativa de BrdU comparada com controles não tratados, e a FIG. 2H mostra um aumento em células anti-caspase-3 ativa-positivas em

imunofluorescência nas células HCT116+3+5 e G5. Esses resultados são consistentes com os achados aqui apresentados sobre os resultados de inibição do crescimento obtidos por meio de ensaios clonogênicos. 2 0 A depleção de MSH3 por transfecção de siRNA também

sensibiliza células à cisplatina e oxaliplatina. Para confirmar ainda mais o papel de sensibilização à cisplatina e oxaliplatina relacionada a MSH3, as freqüências de sobrevida clonogênica de células transfectadas transitoriamente com siRNA de MSH3 e siRNA não direcionado foram determinadas. Nesses estudos, é demonstrado que a expressão de proteína de MSH3 era significativamente diminuída 72 horas após transfecção de siRNA (98% de inibição da expressão de MSH3 comparadas com células não tratadas) em células HCT116+3+5 (FIG. 3A). As células HCT116+3+5 foram transfectadas com siRNA de MSH3 e as células foram expostas à cisplatina (5 μΜ e 10 μΜ) ou oxaliplatina (2 μΜ e 5 μΜ) 48 horas após transfecção. Como mostrado nas FIGS. 3B e 3C, a transfecção de siRNA de MSH3 tornou as células HCT116+3+5 mais suscetíveis tanto à cisplatina quanto â oxaliplatina, em comparação com linhagens de células transfectadas com siRNA não direcionado. Para confirmar ainda mais essa sensibilidade aumentada aos fármacos de platina em células depletadas de MSH3, outra linhagem de células de câncer do cólon, HT2 9, foi transfectada com siRNA de MSH3 ou siRNA não direcionado. Foi confirmado que MSH3 estava quase completamente reprimida em células HT2 9 (FIG. 3D) e que células HT2 9 tratadas com siRNA de MSH3 se tornaram mais sensíveis tanto â cisplatina quanto à oxaliplatina (FIGS. 3E e 3F). Esses resultados fortalecem ainda mais os achados de que a deficiência de MSH3 sensibiliza as células tanto à cisplatina quanto à oxaliplatina.

A sensibilidade à cisplatina ou oxaliplatina em

2 0 células proficientes em MSH3 e células deficientes em MSH3

ocorre independentemente do estado de MLHl em células de câncer do cólon. Do ponto de vista clínico, é importante determinar se o estado de MSH3 influencia a sensibilidade à cisplatina e oxaliplatina em pacientes com cânceres que também são deficientes em MLHl. Para solucionar essa questão, a sensibilidade de células G5 deficientes em MSH3 e células proficientes em MSH3 à cisplatina e oxaliplatina por indução de infra-regulação mediada por siRNA da expressão de MLHl foi comparada (FIG. 4A). Quando MLHl era

3 0 infra-regulado tanto em células HCT116+3+5 quanto em células G5 transfectadas com siRNA de MLHl, ambas as linhagens de células se tornaram mais resistes a MNNG em comparação com linhagens de células não tratadas de controle (FIG. 4B), validando a repressão funcional de MLHl nessas condições (10,11). Curiosamente, nesse cenário, foi observado que células G5 foram mais sensíveis à cisplatina e oxaliplatina (2 μΜ e 5 μΜ) do que células HCT116+3+5 (FIGS. 4C e 4D). Esses resultados demonstram que a sensibilidade MSH3-dependente â cisplatina e oxaliplatina ocorre independentemente de estado de MLHl.

Células deficientes em MSH3 demonstram níveis sustentados de pH2AX e 53BP1 após tratamento com oxaliplatina. Os fármacos de platina induzem ligações cruzadas intrafilamentares de DNA e ICLs, e algumas das lesões eventualmente levam a quebras secundárias de fitas duplas de DNA (DSBs), presumivelmente em conseqüência de uma forquilha de replicação colapsada (24). Para determinar se MSH3 está envolvido no reparo de DSBs, foram analisadas as alterações tempo-dependentes nos níveis de pH2AX nuclear, um marcador substituto para DSBs de DNA (25), usando coloração por imunofluorescência. Verificou-se que não há diferenças no número de células focos de pH2AX- positivas antes e depois do tratamento com oxaliplatina em linhagens de células proficientes e deficientes em MSH3. Em 2 5 contraste, foi observada uma taxa de redução menor no número de células focos de pH2AX-positivas nas células G5 deficientes em MSH3 comparada com células G5 com restauração de MSH3 quando com linhagens de células HCT116+3+5 durante tratamento de 48 e 72 horas com oxaliplatina (FIGS. 5A e 5B), indicando que o reparo de DSB está comprometido somente em linhagens de células deficientes em MSH3. Para confirmar ainda mais essa ineficiência no reparo de DSB, foram feitos ensaios de imunofluorescência usando um anticorpo anti-53BPl, outro marcador para detecção de DSB de DNA. Níveis sustentados de 53BP1 em células G5 deficientes em MSH3 após tratamento com oxaliplatina foram confirmados (FIGS. 5C e 5D) . Esses resultados mostram que a sensibilidade mais elevada de células deficientes em MSH3 à oxaliplatina pode, em parte, ser conseqüência de uma eficiência de reparo de DSB de DNA reduzida, e não por uma diferença quantitativa na carga de dano de DNA induzido por tratamento.

Células deficientes em MSH3 também são sensíveis ao olaparib, um inibidor de PARP. Os inibidores de PARP aumentam o número de quebras de fita única, o que eventualmente leva às DSBs de DNA que são reparadas pelo sistema de HR. Células com HR defeituosa são hipersensíveis aos inibidores de PARP por causa de sua incapacidade de reparar essas DSBs (18,19) . 0 possível papel de MSH3 no 2 0 reparo de DSB evidenciado pelos resultados (FIGS. 5A-5D) motivou o exame adicional para determinar se células deficientes em MSH3 também são sensíveis aos inibidores de PARP. Como mostrado na FIG. 6A, células G5 deficientes em MSH3 foram mais sensíveis ao olaparib do que a linhagem de

2 5 células G5 com restauração de MSH3. Esses dados apoiam

claramente o papel de MSH3 em reparos de DSB em células de CRC. Além disso, a combinação de oxaliplatina e olaparib exibiu um efeito sinérgico na citotoxicidade nas células G5 deficientes em MSH3, comparadas com células HCT116+3+5

3 0 parentais. Esse efeito foi confirmado com duas outras linhagens de células de câncer do cólon, HT29 (FIG. 6B) e SW4 8 0 (dados não mostrados) , em um sistema de knockdown transitório com o uso de siRNA de MSH3. Esses resultados demonstram uma terapia combinada de fãrmacos de platina e inibidores de PARP em cânceres deficientes em MSH3.

0 presente estudo elucidou que uma perda de MSH3 afeta a sensibilidade celular causada por fármacos de platina. Essa observação pode ser usada para estabelecer estratégias diagnosticas e terapêuticas nas quais o estado de MSH3 pode ser usado como um marcador preditivo para o resultado quimioterápico final em pacientes com tumores deficientes em MSH3. Resumidamente, com o uso das linhagens de células isogênicas de câncer do cólon nas quais a expressão de MSH3 é regulada por um sistema tet-off, foi demonstrado que a depleção da expressão de MSH3 em células de câncer do cólon as sensibilizou não apenas à cisplatina, mas também à oxaliplatina e a um inibidor de PARP. Esses dados sugerem que esses efeitos podem ser mais bem explicados pela habilidade reduzida de células deficientes em MSH3 para reparar DSBs que surgem após tratamento com esses fãrmacos, embora os mecanismos precisos pelos quais MSH3 está envolvido no reparo de DSB de DNA necessitem ser mais bem explorados. Essa é a primeira demonstração de que a inibição seletiva de MSH3 aumenta a sensibilidade celular aos fármacos de platina e ao inibidor de PARP. Além disso, esses resultados demonstram que o aumento MSH3-dependente da sensibilidade à cisplatina e oxaliplatina não é influenciado por infra-regulação de MLHl e é provavelmente independente do sistema MMR canônico. 3 0 O papel dos homólogos de MutS e MutL no reparo para ICLs foi bem estudado usando ICLs por psoraleno (12-15,26). Esses dados sugerem que MutS{3 está envolvido tanto no reconhecimento quanto no processamento de certos tipos de ICLs em cooperação com outras proteínas como, por exemplo, proteínas de NER e HR, e o fato de que MutS{3 também funciona no reparo de ICL independente de seu papel primário em MMR. Os achados aqui apresentados mostram que células depletadas de MSH3 são sensíveis à cisplatina e oxaliplatina, e isso ocorre independentemente da função MLHl, o que é consistente com esses achados usando ICLs por psoraleno.

Esses resultados mostram que MutSJ3 está envolvido no reparo de DSBs tóxicas induzidas por adutos de ICL. Primeiro, há evidências de que MSH3 fica co-localizado com as lesões de DSB induzidas por laser (27) e por carcinógenos como, por exemplo, cromo (VI) (28) . Segundo, os presentes inventores reconheceram que níveis sustentados de pH2AX e 53BP1 se co-localizam com DSBs em células deficientes em MSH3 após tratamento com oxaliplatina, 2 0 comparadas com células proficientes em MSH3. Terceiro, células deficientes era MSH3 são sensíveis a um inibidor de PARP que induz DSBs. Dessa forma, esses resultados mostram que DSBs não reparadas em conseqüência de deficiência de MSH3 são a causa direta de morte celular. No entanto, um

2 5 estudo recente mostrou que tumores que ocorrem em

camundongos MSH2-null são mais resistentes â cisplatina e à combinação de 5-FU mais oxaliplatina do que tumores em camundongos que possuem as mutações de MSH2 G674D (29) . Curiosamente, embora essa mutação missense resulte em perda

3 0 de atividade de MMR, ela ainda retém sensibilidade ao dano de DNA. Esses resultados mostram que MSH2 possuem funções distintas na atividade de MMR e quimiossensibilidade (29). MSH2 e MLHl demonstraram ser necessários para a ativação de várias proteínas envolvidas em vias apoptéticas como, por exemplo, JNK e c-Abl, após tratamento com cisplatina (3 0); no entanto, não está claro se MutSa ou MutS{3, ou ambos, estão envolvidos nas vias de sinalização causadas por cisplatina ou oxaliplatina. No entanto, como os resultados indicam que a perda de MSH3 aumenta a sensibilidade à

cisplatina e oxaliplatina, é provável que MutSp está envolvido principalmente no reparo de dano de DNA, e MutSa está envolvido tanto no reparo quanto nas vias de sinalização que levam ã morte celular. Estudos posteriores podem elucidar o papel exato de MutSa ou Mutsp no reparo de

dano de DNA e na sinalização de danos causados por esses fármacos.

Os resultados em relação a sensibilidade de células deficientes em MSH3 à cisplatina e oxaliplatina são inconsistentes com um relato prévio por Vaisman e cols.

2 0 (31) . Aquele estudo relatou que a sensibilidade a esses fármacos não diferiu entre as células HHUA deficientes em MSH3 e as células HHUA proficientes em MSH3 complementadas com cromossomo 5 (31) . Em seu estudo, a influência por centenas de outros genes do cromossomo 5 não pode ser

2 5 excluída; portanto, os dados aqui contidos são mais

robustos, na medida em que foram usados clones isogênicos de células de câncer do cólon HCT116, nos quais a expressão de MSH3 foi seletivamente regulada como necessário.

De um ponto de vista clínico, os resultados aqui

3 0 apresentados demonstram que uma população considerável de pacientes com CRC com MSI pode se beneficiar dos regimes de tratamento à base de oxaliplatina, inibidores de PARP ou, em particular, uma combinação dos dois. No CRC, muitos estudos recentes demonstraram que pacientes com câncer com MSI em estágio III não se beneficiam da quimioterapia adjuvante com 5-FU (32-34). Além disso, Bertagnolli e cols. relataram que pacientes com MSI-CRC em estágio III se beneficiam de quimioterapia adjuvante contendo 5-FU e irinotecan (35), enquanto outro estudo relatou que esses pacientes não tiveram nenhum benefício com esse tratamento adjuvante (36). Esses resultados inconsistentes despertam a possibilidade de que pode haver subgrupos de pacientes que possuem quimiossensibilidades diferentes entre CRC com MSI. Por exemplo, esses resultados mostram que há pelo menos duas subpopulações de CRC deficiente em MLHl, CRC proficiente em MSH3 e CRC deficiente em MSH3, e esses podem responder diferencialmente à oxaliplatina, a um inibidor de PARP e à sua combinação, dependendo do estado de MSH3.

Além de MSH3, vários outros genes de reparo de DNA

2 0 estão mutados em cânceres com MSI. MREllA e RAD5 0, cujos

produtos são formados no complexo de reparo de DSB MREllA- hRAD50-NBSl, estão entre os genes mais freqüentemente mutados em cânceres com MSI (22) . Foi demonstrado que mutações em MREllA e RAD50 aumentam a sensibilidade ao irinotecan, que induz DSBs secundárias, em células cultivadas (37,38). Esses resultados mostram que a deficiência de MSH3 sensibilizou as células ao SN-38, um metabólito ativo de irinotecan (dados não mostrados). Além disso, foi demonstrado que a perda de fosfatase e homólogo

3 0 de tensina, outro gene freqüentemente mutado no câncer com MSI, sensibiliza as células aos inibidores de PARP por meio de ineficiência do reparo por HR (39,40). Dessa forma, a análise desses genes ou proteínas que estão envolvidos no reparo de DSB poderia ser útil para prever o resultado terapêutico final em pacientes com câncer com MSI. São necessários estudos clínicos para validar marcadores preditivos para terapia farmacológica em câncer com MSI.

Previamente, os presentes inventores demonstraram que a perda de expressão de MSH3 causou os fenótipos de EMAST e de baixa MSI, e que a perda de expressão focai de MSH3 estava associada com EMAST nos tecidos esporádicos de CRC (23). Além disso, a maioria dos CRCs com baixa MSI e alguma proporção de tumores de MSS exibiam EMAST, o que sugere que esses tecidos podem ter apresentado deficiência de MSH3 (23). A deficiência de MSH3 está possivelmente relacionada à progressão da doença no CRC deficiente em MLHl (20), e CRC com MSI baixa possui prognóstico ruim (41,42), despertando a possibilidade de que a perda de MSH3 possa estar relacionada à promoção de metástase ou recorrência de

2 0 CRC. Nesse cenário, o tratamento de CRC esporádico contendo

populações de células de câncer MSH3-negativas com fármacos de platina ou inibidores de PARP, ou ambos, pode inibir a progressão da doença.

Em conclusão, é aqui demonstrado que células deficientes em MSH3 são sensíveis à cisplatina, oxaliplatina e a um inibidor de PARP, possivelmente resultando de reparo reduzido para DSBs de DNA. Esses achados contribuem para uma melhor compreensão do papel de MSH3 para o reparo de DNA e sensibilidade farmacológica, e

3 0 para prever e aprimorar o resultado terapêutico final de pacientes com cânceres deficientes em MSH3.

É contemplado que qualquer modalidade discutida nesta especificação pode ser implementada com relação a qualquer método, kit, reagente ou composição da invenção, e vice- versa. Além disso, as composições da invenção podem ser usadas para se obter os métodos da invenção.

Será compreendido que modalidades particulares aqui descritas são mostradas como forma de ilustração, e não como limitações da invenção. As características principais

desta invenção podem ser empregadas em várias modalidades, sem se afastar do escopo da invenção. Aqueles habilitados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando no máximo experimentação de rotina, diversos equivalentes aos procedimentos específicos aqui descritos.

Esses equivalentes são considerados como incluídos no escopo desta invenção e são cobertos pelas reivindicações.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados na especificação são indicativos do nível de conhecimento daqueles habilitados na técnica à qual esta invenção

2 0 pertence. Todas as publicações e pedidos de patente são

aqui incorporados por referência no mesmo grau como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

0 uso da palavra "um" ou "uma", quando utilizada em

conjunto com o termo "que compreende" nas reivindicações e/ou na especificação, pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais de um" . O uso do termo "ou" nas

3 0 reivindicações visa significar "e/ou", a menos que explicitamente indicado para se referir somente às alternativas, ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a revelação apoie a definição que se refere somente às alternativas e "e/ou". Ao longo deste pedido, o termo "cerca de" é usado para indicar que um valor inclui a variação de erro inerente para o invento, o método sendo empregado para determinar o valor, ou a variação que existe entre os indivíduos do estudo.

Como usado nesta especificação e nas reivindicações, as palavras "que compreende" (e qualquer forma de "que compreende", por exemplo, "compreendem" e "compreende"), "que possui" (e qualquer forma de "que possui", por exemplo, "possuem" e "possui"), "que inclui" (e qualquer forma de "que inclui", por exemplo, "inclui" e "incluem") ou "que contém" (e qualquer forma de "que contém", por exemplo, "contém" e "contêm") são inclusivas ou em aberto e não excluem elementos ou etapas do método adicionais, não citadas. Como aqui usada, a frase "que consiste basicamente em" limita o escopo de uma reivindicação aos materiais ou

2 0 etapas especificadas e àqueles que não afetam materialmente

as características básicas e inéditas da invenção reivindicada. Como aqui usada, a frase "que consiste em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação, exceto para, por exemplo, impurezas normalmente associadas ao elemento ou limitação.

0 termo "ou combinações destes", como aqui usado, refere-se a todas as permutações e combinações dos itens listados que precedem o termo. Por exemplo, "A, B, C ou combinações destes" visa incluir pelo menos um de: A, B, C,

3 0 AB, AC, BC ou ABC e, se a ordem é importante em um contexto em particular, também BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC ou CAB. Continuando com esse exemplo, são expressamente incluídas combinações que contêm repetições de um ou mais itens ou termos, por exemplo, BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, e assim por diante. Aqueles habilitados na técnica compreenderão que tipicamente não há limite para o número de itens ou termos em qualquer combinação, a menos que de outro modo fique evidente pelo contexto.

Como aqui usadas, palavras de aproximações como, por exemplo, sem limitação, "cerca de", "substancial" ou "substancialmente", referem-se a uma condição que, quando assim modificada, é subentendida como não necessariamente absoluta ou perfeita, mas seria considerada suficientemente próxima por aqueles habilitados na técnica para garantir a designação da condição como estando presente. A extensão â qual a descrição pode variar dependerá da dimensão que uma alteração pode assumir e ainda assim ser reconhecida por aqueles habilitados na técnica como uma característica modificada que ainda tem as características e capacidades

2 0 necessárias da característica não modificada. Em geral, mas

sujeito à discussão precedente, um valor numérico aqui apresentado que é modificado por uma palavra de aproximação como, por exemplo, "cerca de", pode variar do valor estabelecido por pelo menos ±1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 ou 15%.

Todas as composições e/ou métodos aqui revelados e reivindicados podem ser feitos e executados sem experimentação desnecessária à luz da presente revelação. Embora as composições e os métodos desta invenção tenham

3 0 sido descritos em termos de modalidades preferidas, ficará evidente para aqueles habilitados na técnica que podem ser aplicadas variações às composições e/ou aos métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas do método aqui descritas, sem se afastar do conceito, espírito e escopo da invenção.

Todos esses substitutos e modificações similares aparentes para aqueles habilitados na técnica são considerados com incluídos no espírito, escopo e conceito da invenção, como definida pelas reivindicações em anexo.

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31. Vaisraan, A., Varchenko, M., Umar, A., Kunkel, T.A., Risinger, J.I., Barrett, J.C., Hamilton, T.C. e Chaney, S.G. (1998) Câncer Res. 58, 3.579-3.585.

32. Ribic, C.M., Sargent, D.J., Moore, M.J.,

Thibodeau, S.N., French, A.J., Goldberg, R.M., Hamilton, S.R., Laurent-Puig, P., Gryfe, R., Shepherd, L. E., Tu, D., Redston, M. e Gallinger, S. (2003) N. Engl. J. Med. 349, 247-257.

33. Popat, S., Hubner, R. e Houlston, R.S. (2005) J.

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34. Sargent, D.J., Marsoni, S., Monges, G., Thibodeau, S.N., Labianca, R., Hamilton, S.R., French, A.J., Kabat,

B., Foster, N.R., Torri, V., Ribic, C., Grothey, A., Moore, M., Zaniboni, A., Seitz, J.F., Sinicrope, F. e Gallinger,

S. (2010) J. Clin. Oncol. 28, 3.219-3.226.

35. Bertagnolli, M.M., Niedzwiecki, D., Compton, C.C., Hahn, H.P., Hall, M., Damas, B., Jewell, S.D., Mayer, R.J., Goldberg, R.M., Saltz, L.B., Warren, R.S. e Redston,

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37. Vilar, E., Scaltriti, M., Balmana, J., Saura, C., Guzman, M., Arribas, J., Baselga, J. e Tabernero, J. (2008)

Br. J. Câncer 99, 1.607-1.612.

38. Rodriguez, R., Hansen, L.T., Phear, G., Scorah, J., Spang-Thomsen, M., Cox, A., Helleday, T. e Meuth, M. (2008) Clin. Câncer Res. 14, 5.476-5.483.

39. Mendes-Pereira, A.M., Martin, S.A., Brough, R.,

McCarthy, A., Taylor, J.R., Kim, J.S., Waldman, T., Lord, C.J. e Ashworth, A. (2009) EMBO Mol. Med. 1, 315-322.

40. McEllin, B., Camacho, C.V., Mukherjee, B., Hahm, B., Tomimatsu, N., Bachoo, R.M. e Burma, S. (2 010) Câncer

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41. Kohonen-Corish, M.R., Daniel, J.J., Chan, C., Lin, B.P., Kwun, S.Y., Dent, O.F., Dhillon, V.S., Trent, R.J., Chapuis, P.H. e Bokey, E. L. (2005) J. Clin. Oncol. 23, 2.318-2.324 .

42. Wright, C.M., Dent, O.F., Newland, R.C., Barker,

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Claims (41)

1. Método para prever a eficácia de um regime terapêutico em um paciente em risco ou diagnosticado com um ou mais adenocarcinomas, o método caracterizado por compreender: determinação da expressão global de MSH3 em células suspeitas de serem células de adenocarcinoma obtidas do paciente; e previsão da eficácia do regime terapêutico com um agente antineoplásico para tratamento do paciente com base na determinação da expressão global de MSH3 nas células do paciente, em que uma diminuição na expressão global de MSH3 nas células do paciente, quando comparada com a expressão de MSH3 em células normais, indica uma predisposição à responsividade à terapia com agente antineoplásico, em que a terapia compreende a administração de uma quantidade eficaz do agente antineoplásico ao paciente.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os adenocarcinomas compreendem um tumor sólido selecionado do grupo que consiste em câncer cólon-retal (CRC), câncer de pulmão, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer renal, câncer do fígado, câncer testicular, câncer da bexiga, câncer vaginal, câncer de mama, câncer esofagiano, câncer pancreático e câncer de estômago.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o adenocarcinoma é CRC.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de células suspeitas de serem células de adenocarcinoma quanto à expressão de proteína de MSH3, expressão de ácido nucléico de MSH3, ou ambas.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 de ácidos nucléicos de MSH3 ou uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo compreende a realização de uma análise por espectrometria de massa, uma amplificação por círculo rolante, uma análise imunoistoquímica, uma hibridização com uma sonda alelo-específica ou de anticorpo, ou quaisquer combinações ou modificações destas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente antineoplásico é selecionado do grupo que consiste em 1,3-bis(2-cloroetil)- 1-nitrosouréia, bussulfan, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida, dacarbazina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, etoposida, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina, mecloretamina, melfalan, mitomicina C, mitoxantrona, temozolomida, topotecan e radiação ionizante.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente antineoplásico é um agente de ligação cruzada interfilamentar selecionado do grupo que consiste em cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, furocumarinas ou psoraleno.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente antineoplásico é um inibidor de poli(ADP-ribose)polimerase (PARP) selecionado do grupo que consiste em olaparib, derivados de isoindolinona, veliparib, iniparib e derivados de 4-metóxi- carbazol.

9. Método para tratamento de um paciente em risco ou diagnosticado com câncer cólon-retal, o método caracterizado por compreender: determinação da expressão global de MSH3 em células suspeitas de serem células de câncer cólon-retal do paciente; e previsão da eficácia do regime terapêutico com um agente antineoplásico para tratamento do paciente com base na determinação da expressão global de MSH3 nas células do paciente, em que uma diminuição na expressão global de MSH3 nas células do paciente, quando comparada com a expressão de MSH3 em células cólon-retais normais, indica uma 15 predisposição à responsividade â terapia com agente antineoplásico, em que a terapia compreende a administração de uma quantidade eficaz da terapia com agente antineoplásico ao paciente.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de células suspeitas de serem células de adenocarcinoma quanto à expressão de proteína de MSH3, expressão de ácido nucléico de MSH3, ou ambas.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 de ácidos nucléicos de MSH3 ou uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo compreende a realização de uma análise por espectrometria de massa, uma amplificação por círculo rolante, uma análise imunoistoquímica, uma hibridização com uma sonda alelo-específica ou de anticorpo, ou quaisquer combinações ou modificações destas.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agente antineoplásico é selecionado do grupo que consiste em 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosouréia, bussulfan, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida, dacarbazina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, etoposida, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina, mecloretamina, melfalan, mitomicina C, mitoxantrona, temozolomida, topotecan e radiação ionizante.

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agente antineoplásico é um agente de ligação cruzada interfilamentar selecionado do grupo que consiste em cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, furocumarinas ou psoraleno.

14. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agente antineoplásico é um inibidor de poli(ADP-ribose)polimerase (PARP) selecionado do grupo que consiste em olaparib, derivados de isoindolinona, veliparib, iniparib e derivados de 4-metóxi- carbazol.

15. Método para a seleção de uma terapia contra o câncer para um paciente em risco ou diagnosticado com câncer cólon-retal, o método caracterizado por compreender: determinação de um nível global de expressão de MSH3 do paciente e previsão da eficácia da terapia com um agente antineoplásico para tratamento do paciente com um agente antineoplásico, em que uma diminuição no nível global de expressão de MSH3 indica que o agente de ligação cruzada de DNA é uma terapia adequada para o paciente.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de células suspeitas de serem células de adenocarcinoma quanto à expressão de proteína de MSH3, expressão de ácido nucléico de MSH3, ou ambas.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 de ácidos nucléicos de MSH3 ou uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo compreende a realização de uma análise por espectrometria de massa, uma amplificação por círculo rolante, uma análise imunoistoquímica, uma hibridização com uma sonda alelo-específica ou de anticorpo, ou quaisquer combinações ou modificações destas.

18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o agente antineoplásico é selecionado do grupo que consiste em 1,3-bis(2-cloroetil)- 1-nitrosouréia, bussulfan, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida, dacarbazina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, etoposida, idarrubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina, mecloretamina, melfalan, mitomicina C, mitoxantrona, temozolomida, topotecan e radiação ionizante.

19. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o agente antineoplásico é um agente de ligação cruzada interfilamentar selecionado do grupo que consiste em cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, furocumarinas ou psoraleno.

20. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o agente antineoplásico é um inibidor de poli(ADP-ribose)polimerase (PARP) selecionado do grupo que consiste em olaparib, derivados de isoindolinona, veliparib, iniparib e derivados de 4-metóxi- carbazol.

21. Método para estratificação de um paciente em um subgrupo de um experimento clínico de uma terapia contra o câncer, o método caracterizado por compreender: determinação da expressão global de MSH3 em células suspeitas de serem células de câncer do paciente; e previsão da eficácia da terapia com um fármaco- candidato para tratamento do paciente, em que uma diminuição na expressão global de MSH3 nas células do paciente, quando comparada com a expressão de MSH3 em células normais, indica uma predisposição à responsividade à terapia com o fármaco-candidato, em que a terapia compreende a administração de uma quantidade eficaz do fármaco-candidato aos pacientes e o nível de expressão de MSH3 permite a estratificação do paciente em um subgrupo para o experimento clínico.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que as células de câncer estão em um tumor sólido e são selecionadas do grupo que consiste em câncer cólon-retal (CRC), câncer de pulmão, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de próstata, câncer renal, câncer do fígado, câncer testicular, câncer da bexiga, câncer vaginal, câncer de mama, câncer esofagiano, câncer pancreático e câncer de estômago.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que as células de câncer são células de câncer cólon-retal.

24. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de células suspeitas de serem células de adenocarcinoma quanto à expressão de proteína de MSH3, expressão de ácido nucléico de MSH3, ou ambas.

25. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 de ácidos nucléicos de MSH3 ou uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo compreende a realização de uma análise por espectrometria de massa, uma amplificação por círculo rolante, uma análise imunoistoquímica, uma hibridização com uma sonda alelo-específica ou de anticorpo, ou quaisquer combinações ou modificações destas.

26. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o agente candidato é um agente genotóxico.

27. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o agente candidato é um inibidor de poli(ADP-ribose)polimerase (PARP).

28. Método para estratificação de um paciente em um subgrupo de câncer cólon-retal, o método caracterizado por compreender: determinação da expressão global de MSH3 em células suspeitas de serem células de câncer cólon-retal do paciente; e previsão do estágio do câncer cólon-retal com base em uma alteração na expressão global de MSH3 nas células do paciente, quando comparada com a expressão de MSH3 em células cólon-retais normais.

29. Método para tratamento de um paciente em risco ou diagnosticado com câncer cólon-retal, o método caracterizado por compreender: determinação da expressão global de MSH3 em células suspeitas de serem células de câncer cólon-retal do paciente, em que uma alteração na expressão global de MSH3 indica uma predisposição à responsividade à terapia com um ou mais agentes de ligação cruzada de DNA; administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação cruzada de DNA em uma quantidade suficiente para diminuir a expressão de MSH3 nas células de câncer cólon-retal; e determinação de uma diminuição continuada na expressão global de MSH3 no paciente.

30. Método de realização de um experimento clinico para avaliar um fármaco-candidato que supostamente é útil no tratamento de um estado de doença associado à expressão do gene de MSH3, o método caracterizado por compreender: a) medição do nível de expressão de MSH3 pelo tecido suspeito de ter câncer cólon-retal de um conjunto de pacientes; b) administração de um fármaco-candidato a um primeiro subconjunto dos pacientes e de um placebo a um segundo subconjunto dos pacientes; c) repetição da etapa (a) após a administração do fármaco-candidato ou do placebo; e d) determinação de se o fármaco-candidato reduz o número de células cólon-retais que possuem uma diminuição na expressão de MSH3 que é estatisticamente significante, quando comparada com qualquer redução que ocorre no segundo subconjunto de pacientes, em que uma redução estatisticamente significante indica que o fármaco- candidato é útil no tratamento do referido estado de doença.

31. Método para determinar se um câncer cólon-retal de mamífero tem probabilidade de ser resistente ou responsivo a um agente que danifica o DNA para o tratamento de câncer cólon-retal, o método caracterizado por compreender a(s) etapa(s) de: exame de uma amostra biológica do câncer quanto a uma diminuição na expressão global de MSH3; e identificação do câncer cólon-retal como responsivo ou tendo uma suscetibilidade aumentada ao agente que danifica o DNA, em que a expressão ou atividade diminuída de MSH3 na amostra biológica é indicativa ou responsividade ao agente que danifica o DNA.

32. Biomarcador para a progressão da doença de câncer cólon-retal, caracterizado pelo fato de que o biomarcador é MSH3, e uma diminuição na expressão global de MSH3 em células de câncer cólon-retal obtida de um paciente é indicativa de progressão da doença de câncer cólon-retal, quando comparada com a expressão de MSH3 em células normais de câncer cólon-retal ou células de câncer cólon-retal obtidas em um ponto do tempo anterior do mesmo paciente.

33. Biomarcador, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de células suspeitas de serem células de adenocarcinoma quanto à expressão de proteína de MSH3, expressão de ácido nucléico de MSH3, ou ambas.

34. Biomarcador, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 de ácidos nucléicos de MSH3 ou uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo compreende a realização de uma análise por /"esptectrometria de massa, uma amplificação por círculo rolante, uma análise imunoistoquímica, uma hibridização com uma sonda alelo-específica ou de anticorpo, ou quaisquer combinações ou modificações destas.

35. Kit para um diagnóstico de câncer cólon-retal, caracterizado por compreender reagentes de detecção de biomarcador para determinação de um nível diferencial de expressão de MSH3 e instruções para seu uso no diagnóstico do risco para câncer cólon-retal.

36. Kit, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que os níveis de expressão tanto de mRNA quanto de proteína de MSH3 em uma amostra de um paciente em risco para cólon-retal estão significativamente diminuídos, comparados com aqueles de um indivíduo normal.

37. Método para o diagnóstico ou detecção de progressão de câncer cólon-retal em um ser humano, caracterizado por compreender as etapas de: identificação do ser humano suspeito de sofrer de câncer cólon-retal; obtenção de uma ou mais amostras biológicas do indivíduo, em que as amostras biológicas são selecionadas do grupo que consiste em uma amostra de tecido, uma amostra fecal, um homogeneizado de células e um ou mais fluidos biológicos, que compreende: - medição de um padrão de expressão global de MSH3 em uma ou mais células obtidas das amostras biológicas do indivíduo; e comparação do padrão de expressão global do MSH3 da amostra biológica do indivíduo suspeito de sofrer de câncer cólon-retal com o padrão de expressão global de MSH3 de uma amostra biológica de um indivíduo normal, em que o indivíduo normal é um indivíduo saudável que não sofre de câncer cólon-retal, em que uma diminuição no padrão de expressão global do MSH3 na amostra biológica do indivíduo é indicativa da presença, risco para o desenvolvimento, ou ambos, de câncer cólon-retal.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 compreende a análise de células suspeitas de serem células de adenocarcinoma quanto à expressão de proteína de MSH3, expressão de ácido nucléico de mRNA de MSH3, ou ambas.

39. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que uma diminuição significante nos níveis de expressão de mRNA de MSH3, proteína de MSH3, ou ambos, é indicativa da presença, risco para o desenvolvimento, ou ambos, de câncer cólon-retal invasivo.

40. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do nível global de expressão de MSH3 de ácidos nucléicos de MSH3 ou uma porção de um ácido nucléico de MSH3 obtido do indivíduo compreende a realização de uma análise por espectrometria de massa, uma amplificação por círculo rolante, uma análise imunoistoquímica, uma hibridização com uma sonda alelo-específica ou de anticorpo, ou quaisquer combinações ou modificações destas.

41. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o método é usado para tratamento de um paciente em risco ou que sofre de câncer cólon-retal, seleção de uma terapia com agente de ligação cruzada de DNA para um paciente em risco ou que sofre de câncer cólon-retal, estratificação de um paciente em um subgrupo de câncer cólon-retal ou para um experimento clínico de terapia de câncer cólon-retal, determinação da resistividade ou responsividade a um regime terapêutico para câncer cólon-retal, desenvolvimento de um kit para o diagnóstico de câncer cólon-retal, ou quaisquer combinações destes.