BRPI1014164B1 - Processos para purificar o vírus da raiva e para fabricar uma vacina contra a raiva - Google Patents

Abstract

PROCESSOS PARA PURIFICAR O VÍRUS DA RAIVA E PARA FABRICAR UMA VACINA CONTRA A RAIVA, BEM COMO VACINA CONTENDO VÍRUS DA RAIVA PURIFICADO E INATIVADO. A invenção refere-se a um processo para a purificação do vírus da raiva, que compreende uma única etapa de cromatografia de troca iônica, a dita etapa sendo a cromatografia de troca catiônica de acordo com a qual: a) o sobrenadante de uma cultura de células infectadas com este vírus é colocado em contato com um substrato de cromatografia de troca catiônica compreendendo uma matriz de polimetacrilato em que os grupos de sulfoisobutila foram enxertados de tal forma que o vírus da raiva se liga a este substrato, e b) o vírus é eluído de seu substrato.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um método para purificar o vírus da raiva que foi obtido a partir de uma cultura de células.

[0002] Em geral, as colheitas de vírus obtidas a partir de culturas de células infectadas contêm não apenas o vírus desejado, mas também as proteínas e o DNA das células, que são impurezas que devem ser removidas. As quantidades de proteínas celulares e DNA liberados são todas as maiores se os vírus forem responsáveis pela considerável lise celular e/ou se as colheitas virais forem realizadas mais tarde. Além das impurezas de natureza celular, as proteínas do meio contendo as células infectadas também são as impurezas que também são destinadas a serem removidas durante a implementação do processo de purificação viral.

[0003] Quando os vírus são usados para a fabricação de vacinas, a intenção é obter preparações que são tão puras quanto possível de modo a prevenir o desenvolvimento de reações alérgicas contra as impurezas da proteína. Em certos países existe legislação que limita a quantidade máxima autorizada de DNA celular nas vacinas compreendendo produtos obtidos a partir de linhagens de células contínuas para 100 pg/dose vacinal ou até menos.

[0004] Vários métodos para a purificação do vírus da raiva já foram descritas na técnica anterior: a US 4.664.912 descreve um método para a purificação do vírus da raiva por centrifugação zonal depois de ter sido inativada com β-propiolactona. Outro método consiste na combinação de cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de troca aniônica quando o volume da colheita de vírus a ser purificado for grande. a US 4.725.547 descreve um método para a purificação do vírus da raiva por cromatografia de afinidade em sulfato de celulofina (uma éster de ácido sulfúrico de celulose).

[0005] A WO 97/06243 descreve um método para a purificação de vírus, em particular o vírus da raiva, a partir de uma cultura de células Vero infectadas. O método compreende a cromatografia de troca aniônica seguido por cromatografia de troca catiônica e é completado pela cromatografia de afinidade de ligação de metal. Usando este método, a quantidade de DNA residual contido em uma dose da vacina é < 30 a 40 pg, usando a técnica de "ensaio de DNA Total Limiar".

[0006] Kumar A.P et al., in Microbes and Infection (2005) 7; 1110 1116, compararam dois métodos para a purificação do vírus da raiva a partir de um sobrenadante de cultura de células Vero infectadas que foram cultivadas em um meio contendo soro fetal bovino. Ele mostra que o método de purificação baseado no uso de uma coluna de cromatografia de troca aniônica (DEAE-sepharose CL-6B) é mais eficaz do que o método de purificação por centrifugação zonal em um gradiente de sacarose, uma vez que, em um grau comparável de pureza em termos da quantidade de proteínas e ácidos nucleicos residuais, o rendimento do vírus da raiva é melhor com o método cromatográfico.

[0007] Frazatti-Gallina N.M., in Vaccine (2004) 23; 511-517, também descreveu um método para purificar o vírus da raiva a partir de um sobrenadante de cultura de células Vero infectadas que foram cultivadas em meio livre de soro fetal bovino. O método de purificação também implementa uma etapa de cromatografia de troca aniônica em um suporte à base de DEAE-celulose, após uma etapa de clarificação e concentração da colheita viral. Usando este método, a quantidade de DNA residual medida pela técnica de hibridização de mancha é < 23 pg por dose de vacina. Assim, quando o método para a purificação do vírus da raiva compreende uma etapa de cromatografia de troca iônica, existe virtualmente de forma sistemática uma etapa de cromatografia de troca aniônica de modo a reter os ácidos nucleicos do meio contendo o vírus a ser purificado, no suporte cromatográfico.

[0008] Um método de purificação de vírus particularmente eficaz tornaria possível remover as impurezas de proteína e o DNA celular de forma ideal enquanto que ao mesmo tempo garante um rendimento máximo de vírus da raiva purificado, e ainda existe a necessidade de encontrar novos métodos que atendam a esses requisitos.

[0009] Um objetivo da invenção é fornecer um novo método de purificação que atenda a esses requisitos.

[00010] Outro objetivo da invenção é fornecer um método para a purificação do vírus da raiva a partir de uma colheita de vírus que é livre de soro animal ou de qualquer proteína de soro e, mais particularmente fornecer um método de purificação em que apenas os produtos de origem não animal são usados.

[00011] Para este efeito, um objeto da presente invenção é: um método para a purificação do vírus da raiva, compreendendo uma única etapa de cromatografia de troca iônica, dita etapa sendo a cromatografia de troca catiônica de acordo com a qual: a. o sobrenadante de uma cultura de células infectadas com este vírus é colocado em contato com um suporte de cromatografia de troca catiônica compreendendo uma matriz de polimetacrilato em que os grupos de sulfoisobutila foram enxertados por ligação covalente de tal forma que o vírus da raiva se liga a este suporte, e, sem segundo lugar; e b. o vírus é eluído de seu apoio.

[00012] De acordo com um aspecto do método de acordo com a invenção, o sobrenadante de cultura de células que está infectado com o vírus da raiva é livre de soro animal ou de qualquer proteína de soro.

[00013] De acordo com outro aspecto, o sobrenadante de cultura de células infectadas com o vírus da raiva é livre de qualquer proteína exógena de origem animal.

[00014] De acordo com outro aspecto, a concentração de proteínas exógenas de origem não animal no sobrenadante de cultura de células infectadas com o vírus da raiva é < 15 mg/L.

[00015] De acordo com mais outro aspecto, o sobrenadante de cultura de células infectadas com o vírus da raiva é livre de qualquer produto exógeno de origem animal.

[00016] De acordo com uma forma de realização do método de acordo com a invenção, o sobrenadante de cultura de células infectadas com o vírus da raiva é clarificado antes de ser colocada em contato com o suporte de cromatografia de troca catiônica.

[00017] O método de purificação de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que a quantidade de vírus medida no eluato corresponde a pelo menos 70% da quantidade de vírus medida no sobrenadante que foi colocado em contato com o suporte cromatográfico.

[00018] Mais particularmente, é caracterizado pelo fato de que a quantidade de proteínas totais medida no eluato corresponde a menos do que 40% da quantidade de proteínas totais medida no sobrenadante que foi colocado em contato com o suporte cromatográfico e pelo fato de que a quantidade de DNA medida no eluato corresponde a menos do que 5%, de preferência a menos do que 2,5%, e ainda mais preferivelmente a menos do que 1% da quantidade de DNA medida no sobrenadante que foi colocado em contato com o suporte cromatográfico.

[00019] De acordo com outra forma de realização do método de acordo com a invenção, após ter eluído o vírus de seu suporte cromatográfico, é opcionalmente concentrado e depois tratado com uma nuclease.

[00020] De acordo com um aspecto do método de acordo com a invenção, a nuclease é uma endonuclease, tal como benzonase.

[00021] Em outra forma de realização da invenção, o eluato é então submetido a uma ultracentrifugação em um gradiente de sacarose e a fração do gradiente que contém o vírus purificado é recuperada.

[00022] Em outro aspecto da invenção, o vírus da raiva purificado é então inativado por meio de um agente de inativação viral.

[00023] Em um aspecto particular, o agente de inativação viral é β- propiolactona.

[00024] De acordo com um aspecto preferido, todas as etapas do método de acordo com a invenção são executadas usando produtos de origem não animal.

[00025] O objeto da invenção também é um método para a fabricação de uma vacina antirrábica, de acordo com a qual: a) uma cultura de células é infectada com o vírus da raiva, b) o vírus da raiva é purificado a partir do sobrenadante de cultura de células infectadas de acordo com um método da invenção, c) a suspensão de vírus purificado obtida em b) é misturada em um tampão de armazenamento, e d) a suspensão de vírus purificado obtida em c) é dividida na forma de vacinas de dose única ou múltiplas doses.

[00026] De acordo com outro aspecto, é um método para a fabricação de uma vacina contra a raiva, de acordo com a qual: a) uma cultura de células é infectada com o vírus da raiva, b) o vírus da raiva é purificado a partir do sobrenadante de cultura de células infectadas de acordo com um método da invenção, c) a suspensão de vírus purificado obtida em b) é misturada em um tampão de liofilização, d) a mistura obtida em c) é dividida na forma de vacinas de dose única ou múltiplas doses, e e) as doses da vacina são liofilizadas.

[00027] Finalmente, um objeto da invenção é uma vacina contendo vírus da raiva purificados e inativados, caracterizada pelo fato de que a quantidade de DNA residual medida por PCR quantitativa e a quantidade de proteínas totais, medida pelo método de Bradford, que estão presentes em uma dose eficaz de vacina (ou em uma dose de vacina que contém 2,5 IU de acordo com o teste NIH) são, respectivamente, menos do que 20 pg e menos do que 40 μg, e de preferência menos do que 10 pg e menos do que 20 μg. De acordo com outro aspecto, pelo menos 70% das proteínas totais que estão contidas em uma dose efetiva da vacina são proteínas do vírus da raiva.

[00028] Finalmente, a vacina de acordo com a invenção é de preferência livre de qualquer produto exógeno de origem animal.

Descrição Detalhada da Invenção

[00029] O método para a purificação do vírus da raiva de acordo com a invenção compreende uma única etapa de cromatografia de troca iônica, dita etapa cromatográfica sendo uma cromatografia de troca catiônica. Fica claro que, para os propósitos da presente invenção, o método para a purificação do vírus da raiva não se limita a uma única etapa de cromatografia, mas pode incluir uma ou mais outras etapas adicionais na medida em que estas etapas não forem cromatografias de troca iônica. Ao contrário do que a técnica anterior leva a imaginar, os inventores têm demonstrado que os níveis de desempenho de uma cromatografia de troca catiônica da qual o suporte compreende uma matriz de polimetacrilato em que os grupos de sulfoisobutila foram enxertados por ligações covalentes são melhores do que aqueles de uma cromatografia de troca aniônica. Sem desejar ser limitado pela teoria, parece que o vírus da raiva possui uma polaridade dupla, positiva e negativa, o que lhe permite se ligar tanto aos suportes de troca aniônica (do tipo DEAE) quanto aos suportes de troca catiônica (do tipo SO3-). Para os propósitos da invenção, os "níveis de desempenho de uma cromatografia" são calculados com base na quantidade de vírus da raiva e de DNA que são encontrados no eluato em comparação com a quantidade inicial de vírus e de DNA que foram colocados em contato com o suporte cromatográfico, dentro dos limites de capacidade de carga do suporte cromatográfico. Em quantidades equivalentes de vírus e de DNA que foram colocados em contato com o suporte cromatográfico, quanto maior a quantidade de vírus encontrada no eluato e menor a quantidade de DNA residual, tanto melhor o nível de desempenho do suporte cromatográfico. Os grupos de sulfoisobutila foram enxertados sobre na matriz de polimetacrilato por meio de cadeias poliméricas flexíveis que facilitam a interação do vírus da raiva com o trocador de cátions. De preferência, a cadeia polimérica compreende uma série de unidades de monômero tendo a fórmula:

[00030] Estas cadeias poliméricas são obtidas pela polimerização de um monômero tendo a fórmula química: CH2=CH-CO-NH-C(CH3)2- CH2-SO3- na presença de um catalisador com base em cério que também permite o enxerto à matriz de polimetacrilato. Elas compreendem, em média, entre 15 e 25 unidades monoméricas. O suporte cromatográfico está convencionalmente na forma de partículas, cujo tamanho geralmente varia entre 20 e 100 μm, de preferência entre 40 e 90 μm. Este tipo de apoio é em particular vendido pela MERCK sob o nome Fractogel ® EMD SO3- (tipo M). Este tipo de suporte é colocado em uma coluna de cromatografia, o comprimento e o diâmetro da qual são selecionados de acordo com o volume de colheita a ser purificado. Os resultados apresentados no exemplo 1 mostram que os bons níveis de desempenho são obtidos apenas com o suporte de Fractogel® EMD SO3- entre todos os suportes cromatográficos de troca de ânion e cátion que foram testados. Rendimentos muito baixos do vírus (menos do que 10% dos vírus introduzido é recuperado na eluato) são obtidos com todos os outros suportes cromatográficos fortes de troca catiônica testados. Os rendimentos de vírus obtidos com os suportes de cromatográficos de troca aniônica são melhores (entre 40 e 70%), mas, todavia, permanecem mais baixos do que o rendimento de vírus que é obtido com o suporte de Fractogel® EMD SO3-, que é geralmente maior do que 70% e o mais comum maior do que 80%.Além do mais, menos DNA é removido com os suportes cromatográficos de troca aniônica. Surpreendentemente, apenas o suporte cromatográfico de troca catiônica que compreende uma matriz de polimetacrilato em que os grupos de sulfoisobutila, que desempenham o papel de ligantes, foram enxertados por ligação covalente, torna possível de purificar, com bons níveis de desempenho, o vírus de um sobrenadante de cultura de células infectadas com o vírus da raiva. Em uma etapa de cromatografia de troca catiônica, tanto mais do que 60% das proteínas totais, quanto pelo menos 2,5 log10 de DNA, de preferência pelo menos 3,0 log10 de DNA e ainda mais preferivelmente pelo menos 3,5 log10 de DNA (que corresponde a uma remoção de mais do que 99% do DNA celular) são removidos, enquanto ao mesmo tempo conserva um rendimento de vírus da raiva de pelo menos 70% (isto é, há no eluato uma quantidade de vírus da raiva que corresponde a pelo menos 70% do que foi inicialmente colocado em contato com o suporte cromatográfico) e preferivelmente pelo menos 80%. Estes níveis de desempenho são observados em particular quando o sobrenadante de cultura de células infectadas com o vírus da raiva não contém soro animal ou proteína de soro tal como a albumina. Assim, as quantidades de proteínas totais e de DNA medidas no eluato cromatográfico contêm, respectivamente, menos do que 40% da quantidade de proteínas totais presentes no volume de sobrenadante de cultura de células infectadas com o vírus da raiva que foi colocado em contato com o suporte cromatográfico e menos do que 5%, de preferência menos do que 2,5%, e ainda mais preferivelmente menos do que 1% da quantidade de DNA também presente no volume de sobrenadante de cultura de células injetadas com vírus da raiva que foi colocado em contato com o suporte cromatográfico. Por outro lado, pelo menos 70% e de preferência pelo menos 80% da quantidade de vírus da raiva presente no volume de sobrenadante que foi colocado em contato com o suporte cromatográfico são encontrados no eluato.

[00031] Para os propósitos da invenção, as "proteínas totais" representam todas as proteínas que estão presentes no material analisado. Isto compreende as proteínas do vírus da raiva, as proteínas celulares, as proteínas do meio de cultura de células e/ou do meio de infecção viral e as proteínas que são introduzidas no decurso da implementação do método para a produção e purificação do vírus da raiva (por exemplo, tripsina e/ou benzonase). As proteínas celulares e as proteínas do meio de cultura e/ou do meio de infecção viral e também as proteínas que foram introduzidas durante a produção e/ou a purificação do vírus da raiva, são as impurezas (impurezas de proteína) que se destinam a serem removidas, enquanto que a intenção é reter as proteínas do vírus da raiva tanto quanto possível. As proteínas do vírus da raiva são a glicoproteína G, a nucleoproteína N, a fosfoproteína P, a proteína da matriz N e o RNA polimerase L.

[00032] A quantidade de vírus da raiva é avaliada na base da medição da glicoproteína G do vírus da raiva. Geralmente é realizado por meio de um método ELISA "sanduíche", mediante o uso de dois anticorpos que preferivelmente reconhecem dois epitopos conformacionais da proteína G como descrito no exemplo 1. Por exemplo, um anticorpo neutralizante que reconhece um epitopo conformacional localizado no local antigênico IIc da glicoproteína G (Journal of Clinical Investigation (1989), vol. 84, pp 971 até 975) pode ser utilizado como anticorpo de captura, e um anticorpo neutralizante que reconhece um epitopo conformacional localizado no local antigênico III da glicoproteína G (Biologicals (2003), vol. 31, pp 9 até 16) pode ser utilizado como anticorpo revelador. Os resultados são expressos em IU na base do uso de um padrão de referência que foi calibrado com relação à referência internacional NIBSC.

[00033] O método de Bradford, que é bem-conhecido para aqueles versados na técnica, é usado para medir a quantidade de proteínas totais.

[00034] Para medir a quantidade de DNA, um método de PCR quantitativo (qPCR) com base na quantificação de um fragmento de DNA do genoma da célula é preferivelmente utilizado (um fragmento de DNA que é repetido muitas vezes no genoma da célula é preferivelmente direcionado). Quando o vírus da raiva for produzido a partir de células Vero, a quantificação do DNA residual durante o processo de purificação de vírus se baseia na quantificação do fragmento de DNA alfa-satélite de macaco verde Africano, após a amplificação por PCR usando um método semelhante àquele que é descrito por Lebron J.A. et al., in Developments in Biologicals (2006), vol 123, pp. 35-44, e cujos detalhes são fornecidos no exemplo 1. Este método é muito vantajoso visto que torna possível medir todos os DNAs celulares que têm mais do que 200 pares de bases.

[00035] O sobrenadante de cultura contendo o vírus da raiva é produzido a partir de uma cultura de células que foram infectadas com o vírus da raiva. Qualquer cultura de células em que o vírus da raiva replica é adequada para o objeto da invenção. Estas culturas podem ser culturas primárias de tecidos animais, tais como as culturas primárias do embrião de galinha (por exemplo, culturas primárias de fibroblasto do embrião de galinha (PCEF)), culturas primárias de cérebros de camundongos bebê, ou culturas primárias do rim de macaco, coelho, hamster ou cão, mas uma cultura de células provenientes de linhagens celulares estabelecidas que derivam das culturas primárias de tecido animal é preferivelmente utilizada. As linhagens estão nas linhagens particulares de células provenientes de primatas, tais como a linhagem VERO, WI-38, MRC5 ou PERC.6 ou a linhagem 293, de cavalos, de vacas (tal como a linhagem MDBK), de ovelha, de cães (tal como a linhagem MDCK), de gatos ou de roedores (tal como a linhagem BHK21, HKCC ou CHO).

[00036] Particularmente preferível, a linhagem celular Vero é usada, dita linhagem tendo muitas vantagens: é uma linhagem contínua que pode ser facilmente cultivada em escala industrial, que possui uma capacidade mutagênica muito fraca e que é muito sensível ao vírus da raiva.

[00037] As células podem ser cultivadas em suspensão ou em um suporte dependendo quer ou não elas tenham propriedades de aderência, em um modo de batelada ou batelada alimentada ou de acordo com um modo contínuo de perfusão cultura. No caso de cultura de linhagem celular na escala industrial ou semi-industrial, biogeradores são geralmente usados, cujo volume é maior do que 10 litros e pode ir até mais do que 2000 litros, compreendendo um sistema de agitação, um dispositivo para injetar uma corrente de gás CO2 e um dispositivo de oxigenação. Eles são equipados com sondas que medem os parâmetros internos do biogerador, tais como o pH, o oxigênio dissolvido, a temperatura, a pressão do tanque, ou certos parâmetros físico-químicos da cultura (tais como o consumo de glicose ou de glutamina ou a produção de lactatos e de íons de amônio). As sondas de pH, oxigênio e temperatura são conectadas a um bioprocessador que continuamente regula estes parâmetros. No caso de linhagens celulares aderentes cultivadas em biogeradores, o meio de cultura contém microportadores que são microesferas em que as células se ligam. Estes microportadores são mantidos em suspensão por agitação mecânica ou por meio de uma corrente de gás. No caso das células da linhagem Vero, é normalmente feito uso de microportadores dos quais a matriz eletrostática adesiva se baseia nos dextranos substituídos com grupos de N,N-dietilaminoetila, que são vendidos em particular pela Amersham Biosciences sob o nome Cytodex 1 ou Cytodex 2. O Cytodex 3, microglóbulos, vendido pela Amersham Biosciences também pode ser usado como microportadores.

[00038] O meio que é utilizado para o cultivo das células, também conhecido como meio de cultura celular, pode ou não ser suplementado com soro de origem animal, ou conter uma ou mais proteínas séricas tais como a albumina, ou ser livre de qualquer proteína de origem animal, ou mesmo ser livre de qualquer proteína. De preferência, um meio de cultura celular livre de qualquer soro animal ou de qualquer proteína de soro tal como a albumina que pode ser responsável pelo desenvolvimento de uma reação de hipersensibilidade do indivíduo vacinado é utilizado (Swanson M.C. et al., Journal of Infectious Disease (1987); 155(5):909-913). Particularmente preferível, um meio de cultura livre de qualquer proteína de origem animal, ou mesmo de qualquer produto de origem animal, é usado. A expressão "proteína ou produto de origem animal" pretende significar uma proteína ou um produto no qual o método de produção compreende pelo menos uma etapa na qual um material originário de animais ou de seres humanos é usado. Isto torna possível reduzir os riscos de transmissão de doenças tais como BSE que pode estar associada ao uso de produtos biológicos de origem animal. O meio de cultura geralmente contém quantidades muito baixas de proteínas produzidas, por exemplo, na forma de proteínas recombinantes ou extraídas de plantas (soja, arroz, etc.) ou de leveduras. A concentração de proteína é geralmente < 15 mg/L, medida pelo método de Bradford. Muitas vezes contém essencialmente proteínas de baixo peso molecular (< 10 KDA), que são de fato polipeptídeos. Este é em particular o caso do meio VP SFM vendido pela Invitrogen que é adequado para o método de acordo com a invenção, em particular para a cultura de células Vero. Menção pode ser feita do meio livre de soro Opti Pro ™ (Invitrogen), Episerf (Invitrogen), Ex-cell ® MDCK (Sigma-Aldrich), Ex-Cell ™ Vero (SAFC biosciences), MP-BHK® livre de soro (MP Biomedicals), SFC- 10 BHK expresso livre de soro (Promo cell), SFC-20 BHK expresso livre de proteína (Promo cell), HyQ PF Vero (Hyclone Ref. SH30352.02), Hyclone SFM4 Megavir, meio MDSS2 (Axcell biotechnology), meio DMEM modificado da Iscove (Hyclone), meio de nutriente da Ham (Ham’s -F10, Ham’s -F12) e meio Leibovitz L-15 (Hyclone), que são meios livres de qualquer produto de origem animal e que geralmente contêm baixas quantidades de proteínas (□ 15 mg/L).

[00039] O vírus da raiva pode vir de qualquer origem contanto que se reproduza nas células sensíveis ao vírus da raiva. As cepas de vírus da raiva que foram estabelecidas a partir de isolados primários são geralmente usadas, tais como a cepa Pasteur 2061, a cepa VP-11 ou a cepa Pitman-Moore 1.503-3 M. Estas cepas muito virulentas são destinadas para a fabricação de vacinas antirrábicas inativadas. Uso também pode ser feito de cepas do vírus da raiva que foram atenuadas para o propósito de produzir uma vacina contra a raiva viva atenuada. Elas são, por exemplo, a cepa SAD Bern ou a cepa SAD B19 ou cepas derivadas destas, tais como a cepas SAG1 e SAG2 que derivam da cepa SAD Bern por causa da existência de mutações pontuais na glicoproteína G do vírus da raiva (EP350398, EP583998). A EP1253197 também descreve outras, mais estáveis, cepas atenuadas do vírus da raiva que compreendem uma ou mais mutações pontuais na fosfoproteína P e na glicoproteína G do vírus da raiva.

[00040] O sobrenadante de cultura das células infectadas com o vírus da raiva é obtido utilizando um meio de infecção viral que substitui o meio de cultura celular no momento da infecção das células e que serve para a produção do vírus da raiva pelas células infectadas. A composição química do meio de infecção viral pode ser idêntica ou pode ser diferente da composição do meio de cultura celular. O meio de infecção viral, semelhante ao meio de cultura celular, pode ser suplementado com soro de origem animal ou com uma ou mais proteínas de soro, mas o meio de infecção viral é de preferência livre de qualquer soro animal ou de qualquer proteína de soro pelas razões acima mencionadas. Particularmente preferível, o meio de infecção viral é livre de qualquer proteína de origem animal, ou mesmo de qualquer produto de origem animal, a fim de evitar os riscos de transmissão de doenças tais como a BSE que podem ser ligados ao uso de produtos biológicos de origem animal. Ele geralmente contém quantidades muito baixas de proteínas produzidas, por exemplo, na forma de proteínas recombinantes ou proteínas extraídas de plantas (soja, arroz, etc.) ou de leveduras. A concentração de proteína é geralmente < 15 mg/L, medida pelo método de Bradford. Muitas vezes contém proteínas de baixo peso molecular (< 10 kDa) que são de fato polipeptídeos. Em um aspecto particular, o meio de infecção viral não contém proteína tendo um peso molecular mais elevado do que 10 kDa. Como meio de infecção viral livre de qualquer produto de origem animal e contendo baixas quantidades de proteínas (concentração < 15 mg/L), menção é feita do meio VP SFM (Invitrogen), meio Leibovitz L-15, meio MEM (Sigma- Aldrich), meio Hyclone SFM4Megavir™ (Hyclone) ou, opcionalmente, um dos meios baseados em extratos de plantas conforme descrito no pedido WO 99/4768. Por exemplo, quando o vírus da raiva for produzido a partir de uma cultura de células da linhagem Vero, o sobrenadante de cultura celular infectado é geralmente obtido através de um meio livre de qualquer proteína de soro ou mesmo de qualquer produto de origem animal, tal como aqueles mencionados acima, como meio de infecção viral.

[00041] Dependendo da composição do meio de cultura celular e do meio de infecção viral, o sobrenadante de cultura das células infectadas com o vírus da raiva pode vantajosamente: - ser livre de qualquer proteína de soro ou, - ser livre de qualquer proteína exógena de origem animal, ou mesmo - ser livre de qualquer produto exógeno de origem animal.

[00042] Quando o sobrenadante de cultura das células infectadas com o vírus da raiva estiver livre de qualquer proteína exógena ou está livre de qualquer produto exógeno de origem animal, as proteínas exógenas de origem não animal que são encontradas no sobrenadante estão geralmente em uma concentração muito baixa (< 15 mg/L), medida pelo método de Bradford.

[00043] O termo "proteína ou produto exógeno" destina-se a qualquer produto ou qualquer proteína que não seja um componente do vírus da raiva ou das células que são usadas para produzir o vírus da raiva. As proteínas ou produtos exógenos são componentes que são introduzidos durante a produção e/ou purificação do vírus da raiva. Por exemplo, as proteínas ou os produtos que estão presentes na composição do meio de cultura, as enzimas tais como a tripsina ou benzonase que são introduzidas ou os produtos que são introduzidos durante a produção e/ou purificação do vírus da raiva são proteínas ou produtos exógenos. As proteínas/produtos exógenas são de origem animal quando o método para a sua produção compreende pelo menos uma etapa em que um material originário de animais ou de seres humanos é usado. As proteínas/produtos exógenas são de origem não animal quando elas são produzidas por outros meios, por exemplo, utilizando um material vegetal, pela síntese química ou pela recombinação genética utilizando leveduras, bactérias ou plantas.

[00044] A colheita dos sobrenadantes de cultura contendo o vírus infeccioso geralmente começa 2 a 3 dias depois de ter infectado as células, e continua durante cerca de duas semanas visto que o vírus não é muito lítico. Após cada colheita, as células infectadas são colocadas de volta na cultura com meio novo de infecção viral. As proteínas que são encontradas nos sobrenadantes de cultura são de origem celular ou viral ou se originam do meio de infecção viral e, de uma forma muito ligeira, do meio de cultura celular. É possível armazenar todas as colheitas, ou manter apenas as colheitas que possuem títulos infecciosos muito altos. As colheitas podem ser armazenadas individualmente. Também é possível misturar várias colheitas. As colheitas são normalmente mantidas em uma temperatura ao redor de +5 °C ou na forma congelada.

[00045] Como uma precaução, o sobrenadante de cultura contendo o vírus a ser purificado é clarificado antes da etapa de cromatografia de troca catiônica, de modo a remover os restos celulares não refinados, os agregados eventualmente presentes, e os microportadores residuais quando a cultura de células foi realizada em microcarregadores. Qualquer método de clarificação bem-conhecido por aqueles versados na técnica pode ser usado no método de acordo com a invenção. É possível, por exemplo, centrifugar o sobrenadante ou executar a cromatografia por exclusão de tamanho a fim de clarificar o sobrenadante da cultura. A clarificação é geralmente realizada por filtração de membrana tangencial e/ou frontal e/ou filtração de profundidade usando um ou mais filtros, a porosidade dos quais geralmente varia entre 0,2 e 1,5 μm, de preferência entre 0,4 e 1,0 μm. A clarificação pode ser realizada por meio de uma única filtração do sobrenadante da cultura em casos onde há poucos resíduos e alguns agregados. A clarificação também pode ser realizada através da combinação de pelo menos duas filtrações sucessivas, a primeira filtração sendo realizada, por exemplo, com um filtro relativamente grosso tendo, por exemplo, uma porosidade entre 0,3 e 1,5 μm, enquanto que a segunda filtração é realizada com um filtro relativamente fino tendo, por exemplo, uma porosidade entre 0,2 e 0,5 μm. Também é possível fornecer uma etapa de pré-filtração, de antemão, usando um pré-filtro com uma porosidade grande (entre 2 e 10 μm) a fim de remover os resíduos grandes. Como filtros que são adequados para o objeto da invenção, menção pode ser feita de filtros de celulose, fibras de celulose regeneradas, fibras de celulose combinadas com filtros inorgânicos (por exemplo, com base em diátomos, em perlita ou sílica), filtros de celulose combinados com filtros inorgânicos ou resinas orgânicas ou filtros com base em polímeros, tais como, por exemplo, filtros de náilon, polipropileno, polivinilideno fluorado ou polietersulfona. Estes filtros são, em particular, vendidos sob o nome Durapore®, Millipak® ou Millidisk™ distribuídos pela empresa Millipore ou os filtros distribuídos pela empresa Pall. Como sistema de filtro de profundidade, menção pode ser feita dos filtros de profundidade da série AP (AP01), da série CP (CP10, CP30, CP50, CP60, CP70, CP90), da série HP (HP10, HP30, HP50, HP60, HP70, HP90), da série CA (CA10, CA30, CA50, CA60, CA70, CA90) e da série SP (SP10, SP30, SP50, SP60, SP70, SP90) que são fornecidos pela empresa CUNO, os filtros CUNO Delipid e Delipid Plus, e os filtros de profundidade da série CE (CE15, CE20, CE25, CE30, CE35, CE40, CE45, CE50, CE70, CE75) e da série DE (DE25, DE30, DE35, DE40, DE45, DE50, DE55, DE60, DE65, DE70, DE75), que são fornecidos pela empresa Millipore corp., os filtros da série HC (A1 HC, B1HC, COHC) e os filtros Clarigard e Polygard da empresa Millipore corp. Como outro sistema de filtragem, menção também pode ser feita dos filtros de profundidade distribuídos pela ManCel associates (por exemplo, PR 12 UP, PH12, PR 5 UP) ou os filtros da Pall ou de a empresa SeitzShenk Inc (por exemplo, Bio20, SUPRA EKIP, KS-50P). Vantajosamente, a etapa de clarificação pode ser realizada por meio de uma cápsula de filtro compreendendo duas membranas com diferentes porosidades, que se eleva para a realização de duas filtrações sucessivas em uma única etapa. As cápsulas de filtro Sartopore-2 vendidas pela Sartorius, compreendendo uma membrana de 0,8 μm e uma membrana de 0,45 μm, são muito adequadas para a clarificação do sobrenadante da cultura. A etapa de pré-filtração como indicada acima também pode ser incorporada de antemão, como requerido.

[00046] Independentemente de haver ou não clarificado o sobrenadante da cultura, é, se necessário, ajustado para um pH entre 7 e 8, de preferência entre 7,0 e 7,6. Também verificou-se que a condutividade do sobrenadante clarificado é < 20 mS/cm, de preferência entre 10 e 20 mS/cm, e em particular de preferência entre 14 e 18 mS/cm. O sobrenadante da cultura é depois introduzido em uma coluna de cromatografia de troca catiônica contendo as partículas de Fractogel ® EMD SO3- (tipo M) e cujas dimensões são adequadas para o volume de sobrenadante a ser purificado. A coluna é pré- equilibrada em um tampão de equilíbrio de baixa força iônica (< 200 mM). A coluna é depois lavada com um tampão de lavagem que geralmente possui a mesma composição que o tampão de equilíbrio. O que sai da coluna é principalmente as impurezas de proteína e os ácidos nucleicos. O vírus que foi retido na coluna é então eluído usando um tampão de eluição, a força iônica do qual é pelo menos 400 mm. Por meio de exemplo de soluções tampão adequadas para o objeto da invenção, menção pode ser feita de tampão 20 mM Tris contendo 150 mM NaCl, pH = 7,5, para equilíbrio e lavagem da coluna, e tampão 20 mM Tris contendo 600 mM NaCl, pH = 7,5, como tampão de eluição de vírus, mas qualquer outra solução tampão equivalente também pode ser adequada. Com as capacidades de carga da coluna sendo respeitadas, mais do que 70% da quantidade de vírus que foi inicialmente introduzido na coluna são recuperadas no eluato, enquanto que as quantidades de DNA e das proteínas totais presentes no eluato representam, respectivamente, menos do que 5% e menos do que 40% das quantidades iniciais de DNA e de proteínas totais que foram introduzidas na coluna. Estes resultados são obtidos, em particular, quando os sobrenadantes de cultura infecciosa estão livres de soro de origem animal ou não contêm proteínas séricas ou contêm apenas proteínas exógenas de origem não animal em baixas concentrações (< 15 mg/L).

[00047] Os inventores também têm demonstrado que, ao combinar uma etapa de cromatografia de troca catiônica em um suporte compreendendo uma matriz de polimetacrilato em que grupos de sulfoisobutila foram enxertados por ligação covalente, com uma etapa de digestão enzimática de ácido nucleico, também é possível reduzir o nível de DNA residual em aproximadamente mais de 1,5 a 2 log10, a tal ponto que, ao combinar essas duas etapas, pelo menos 4,0 log10 de DNA são removidos com sucesso. A título de comparação, usando um método para a remoção de ácidos nucleicos com base em uma digestão enzimática de ácido nucleico que é repetida duas vezes, um nível de remoção de DNA que não excede a 3,5 log10 é obtido, a segunda digestão não permitindo que o nível residual de DNA seja reduzido além de mais de 0,5 a 1 Log10 (ver exemplo 2). Como agente enzimático para a digestão de ácido nucleico, uso pode ser feito de uma ou mais enzimas, de preferência uma RNAse e/ou uma DNAse, ou uma mistura de endonucleases conhecidas por aqueles versados na técnica, por exemplo, Pulmozyme™. No contexto do método de acordo com a invenção, Benzonase™, preferivelmente obtida pela recombinação genética, geralmente é usada em uma faixa de concentração de geralmente entre 1 e 50 U/mL. Ela é uma endonuclease que atua pela rápida clivagem de DNA e RNA celular na forma de pequenos fragmentos e que reduz a viscosidade do meio. A temperatura e a duração do tratamento enzimático são parâmetros que podem ser facilmente controlados por aqueles versados na técnica e que dependem da concentração inicial da endonuclease no meio de reação. A fim de prevenir qualquer fenômeno de agregação, uma quantidade muito pequena de um tensoativo, que é preferivelmente não iônico, tal como poloxâmero 188 (PLURONIC F 68), pode ser adicionada, em uma concentração muito baixa, ao eluato cromatográfico. Antes da etapa de tratamento enzimático, o eluato pode opcionalmente ser concentrado quando o volume for grande. A etapa de concentração é geralmente realizada por ultrafiltração tendo um limite de corte entre 100 kDa e 300 kDa, de preferência entre 100 kDa e 200 kDa. A ultrafiltração é caracterizada por um fluxo tangencial sobre a membrana que induz uma força que permite que as moléculas se difundam através da membrana porosa. O fluxo imposto por uma bomba de recirculação é dividido em dois componentes: o fluxo de recirculação que executa a varredura (ou fluxo de retentado) e o fluxo de filtrado (permeado) que passa através da membrana. A composição da membrana pode, de uma forma não limitativa, ser produzida de celulose regenerada, de polietersulfona, de polissulfona ou de derivados destes produtos. Pode estar na forma de folhas planas dentro de cassetes (em particular para ultrafiltração tangencial) ou de fibras ocas. As membranas são em particular vendidas pela Pall sob o nome Omega™, pela Millipore sob o nome membranas Biomax™, e pela Sartorius sob o nome Sartocon®. A contrapressão também pode ser aplicada sobre o lado filtrado (permeado) a fim de reduzir a pressão da transmembrana, como é descrito na WO 2006/108707. Quando o eluato passa através da membrana, o volume do eluato diminui e o vírus que não passa através da membrana é concentrado. Quando o eluato for ultrafiltrado, o seu volume pode ser diminuído por um fator que pode variar de 1 a 100, ou mesmo 150, tornando assim possível obter o volume final desejado. Esta etapa de concentração pode ser concluída com uma etapa de diafiltração o que torna possível modificar a composição do tampão sem, no entanto, modificar o volume do retentado. Isto é recomendado quando a composição do tampão no retentado, devido à diminuição em volume do eluato, não for mais compatível com a boa atividade enzimática da endonuclease. Um tampão, cuja composição é compatível com a boa atividade enzimática da endonuclease, é depois adicionado ao fluxo de recirculação do retentado. A título de exemplo, e sem ser restritivo por natureza, menção é feita de composições de tampão compatíveis com a boa atividade enzimática de uma endonuclease como Benzonase™: elas contêm um tampão Tris em uma faixa de concentração por molaridade de 10 a 50 mM, MgCl2 em uma faixa de concentração de geralmente 1 a 10 mM e, opcionalmente, um outro sal, tal como NaCl, em uma faixa de concentração de 100 mM a 600 mM, o pH destas soluções tampão estando em uma faixa de pH de 7,0 a 8,0. Como indicado acima, o eluato recuperado após a etapa cromatográfica também pode ser tratado diretamente pela adição de MgCl2 em uma faixa de concentração de geralmente 1 a 10 mM e depois uma endonuclease, tal como Benzonase™, na concentração desejada.

[00048] De modo a completar a remoção das impurezas de proteína remover benzonase, em particular, o eluato que foi tratado com endonuclease é submetido a uma etapa de ultracentrifugação gradiente de sacarose, sendo possível para esta etapa de ultracentrifugação ser repetida uma ou mais vezes. A ultracentrifugação permite que o vírus da raiva seja isolado mediante o ajuste da diferença no coeficiente de sedimentação entre as várias entidades presentes no eluato: as impurezas de proteína migram para as densidades baixas de sacarose (< 35% de sacarose), enquanto que o vírus da raiva dica nas densidades de sacarose mais elevadas (> 35% de sacarose). A etapa de ultracentrifugação gradiente de sacarose é geralmente realizada de acordo com o método de "fluxo contínuo" quando os volumes a serem tratados forem grandes, ou em um rotor quando os volumes forem relativamente pequenos. A ultracentrifugação gradiente de sacarose é geralmente realizada em "almofadas de sacarose" a uma temperatura de cerca de 5 °C. O eluato que foi tratado com uma endonuclease pode estar em uma forma não concentrada ou em uma forma concentrada 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, ou até mais. A relação entre o volume total do eluato a ser ultracentrifugado e o volume total do gradiente de sacarose está geralmente entre 0,5 e 2,0, e de preferência entre 0,5 e 1,5. A densidade da "almofada" de sacarose de baixa densidade está geralmente dentro de uma faixa de 10% a 35% p/p, enquanto que a densidade da "almofada" de sacarose de alta densidade está geralmente dentro de uma faixa de 40% a 60% p/p. O volume de sacarose de baixa densidade é geralmente maior do que o volume de sacarose de alta densidade, ainda mais se o volume do eluato submetido à etapa de ultracentrifugação for grande. A relação entre o volume de sacarose de alta densidade e o volume de sacarose de baixa densidade está geralmente entre 0,3 e 0,7. A duração da ultracentrifugação depende da velocidade de ultracentrifugação, que é em geral > 30000 g. Um tempo de ultracentrifugação de 2 horas é geralmente suficiente quando a velocidade de ultracentrifugação for > 65000 g. Após a ultracentrifugação, o produto distribuído dentro do gradiente é retirado usando uma bomba peristáltica e fracionado. A quantidade de sacarose contida em cada fração é medida usando um refratômetro. A quantidade de vírus da raiva em cada fração também é medida, com base na dosagem da glicoproteína gpG por ELISA, como é a quantidade de proteínas totais em cada fração, pelo método de Bradford. O perfil de separação é assim estabelecido. No final destas análises, as frações do gradiente contendo essencialmente o vírus da raiva são selecionadas e combinadas. Durante esta etapa, mais do que 85% e de preferência mais do que 90% das proteínas totais são removidas, isto sendo essencialmente impurezas de proteína visto que o rendimento do vírus da raiva é > 70% e preferivelmente > 80%.

[00049] Assim, no método de purificação de acordo com a invenção, quando a etapa de clarificação do sobrenadante de cultura de células infectadas com o vírus da raiva, a etapa de cromatografia de troca catiônica em um suporte constituído de uma matriz de polimetacrilato na qual grupos de sulfoisobutila são enxertados mediante a ligação covalente, opcionalmente seguido por uma concentração e/ou diafiltração por ultrafiltração do eluato, a etapa de tratamento do eluato com uma endonuclease e a etapa de ultracentrifugação gradiente de sacarose são combinadas, uma composição de vírus da raiva purificado é obtida, que, para uma quantidade de vírus da raiva correspondente a 4,5 IU (na base na medição de gpG por ELISA) ou em uma dose eficaz de vacina, contém menos do que 50 pg de DNA residual, de preferência menos do que 20 pg de DNA residual e ainda mais preferivelmente menos do que 10 pg de DNA residual (medido pela qPCR) e contém menos do que 40 μm de proteínas totais, de preferência menos do que 20 μm de proteínas totais (medidos pelo método de Bradford). Pelo menos 70% das proteínas totais são geralmente proteínas virais. O rendimento global do vírus purificado é pelo menos 45%, de preferência pelo menos 50%, e em particular de preferência pelo menos 60%. O rendimento total do vírus purificado é calculado com base na relação da quantidade de vírus presente na fração gradiente recuperada após ultracentrifugação para a quantidade de vírus inicialmente presente no volume de sobrenadante viral que foi tratado. Em paralelo, mais do que 4 log10 de DNA e mais do que 95% das proteínas totais são removidas (ver Tabela I). De preferência, o sobrenadante de cultura das células infectadas com o vírus da raiva está livre de qualquer proteína de soro ou livre de qualquer proteína exógena de origem animal, ou mesmo livre de qualquer produto exógeno de origem animal a fim de garantir em particular uma maior segurança biológica da composição de vacina.

[00050] A título de exemplo, a tabela I abaixo indica, para cada etapa do método para a purificação do vírus da raiva a partir de um sobrenadante de cultura de células Vero infectadas, as quantidades de vírus recuperadas e também as quantidades de DNA e de proteínas removidas. Tabela I: Tabela que resume as várias etapas do método para a purificação do vírus da raiva com os rendimentos de vírus associados e as quantidades de DNA e de proteínas removidas.

*: a quantidade de vírus da raiva é determinada na base da avaliação da glicoproteína G do vírus da raiva por ELISA de acordo com o método descrito no exemplo 1. **: a quantidade de proteínas totais é medida pela técnica de Bradford. ***: a quantidade de DNA é medida por qPCR de acordo com o método descrito no exemplo 1. ND: Não determinado

[00051] O vírus da raiva purificado recuperado após a etapa de ultracentrifugação está geralmente em uma forma que é muito altamente concentrado e que muitas vezes é diluído de modo a prevenir a formação de agregados virais durante o armazenamento. Um tampão de fosfato em um pH de aproximadamente 8, opcionalmente suplementado com uma solução salina, por exemplo, uma solução de cloreto de sódio, é normalmente usado como tampão de diluição. Em virtude do método de acordo com a invenção, a suspensão do vírus da raiva purificado obtida pode ser usada como uma vacina de vírus vivo ou atenuado ou como uma vacina de vírus inativado. Quando a vacina for destinada para a medicina humana, a suspensão de vírus purificado é geralmente inativada. Etapa de Inativação Viral

[00052] O método para a purificação do vírus da raiva como descrito na invenção termina com uma etapa de inativação viral quando o vírus for destinado para a fabricação de uma vacina inativada. A inativação viral pode ser realizada por meio de agentes químicos bem-conhecidos para aqueles versados na técnica, tais como formaldeído, glutaraldeído ou β-propiolactona. Também é possível usar o método de inativação conforme descrito na WO 2005/093049, que consiste em levar a solução viral purificada em contato com um composto hidrofóbico fotoativável e em expor esta mistura à luz. Entre os compostos hidrofóbicos fotoativáveis, menção é feita de azidobenzeno, 1-azidonaftaleno, 4-azido-2-nitro-1-benzeno (feniltio), 1-azido-4-iodobenzeno, 1-azido-5-iodonaftaleno, 3-fenil-3H- diazireno, 3-fenil-3-(trifluorometil)-3H-diazireno, 3-(3-iodofenil)-3- (trifluorometil)-3H-diazireno, 1-azidopireno, diazireno de adamantina, ácido 12-(4-azido-2-nitrofenóxi)esteárico, ácido graxo w-(m- diazirinofenóxi), ácido 12-[(azidocarbonil)óxi]esteárico, ácido 12- azidoesteárico, ácido 11-(3-azidofenóxi)undecanoico ou ácido w-(m- diazirinofenóxi)undecanoico ou azido de1,5-iodonaftila. De preferência, β-propiolactona (BPL) é usado porque ele é tanto um agente de inativação viral quanto um agente alquilante resultando em clivagens no DNA. Ele pode, portanto, também contribuir para reduzir o nível de DNA residual e inibir a sua atividade biológica. A inativação do vírus da raiva é realizada por meio de uma solução de β-propiolactona diluída entre 1/3500 e 1/4000 (concentração de volume final da solução contendo o vírus purificado) a uma temperatura de aproximadamente 12 °C. Quanto mais baixa a concentração de β-propiolactona, tanto maior o tempo necessário para a inativação do vírus. Geralmente, a inativação do vírus é realizada em um período de tempo que varia de 12 h a 48 h. A atividade da β-propiolactona é neutralizada pelo simples aquecimento da solução a uma temperatura de aproximadamente 37 °C durante aproximadamente 2 h. Em seguida é verificado que o pH da solução é > 7,0. O pH é retificado, se necessário, por meio de uma solução diluída de hidróxido de sódio ou, alternativamente, antes do tratamento com β-propiolactona, a solução contendo o vírus purificado é tamponada com uma solução baseada em um tampão de fosfato, pH ~ 8, evitando assim qualquer acidificação da solução durante a hidrólise do β-propiolactona.

[00053] A suspensão viral purificada de acordo com o método da invenção é em geral armazenada em um tampão de armazenamento tal como, por exemplo, um tampão Tris ou um tampão de fosfato. Embora a suspensão viral purificada possa ser misturada diretamente com o tampão de armazenamento, uma etapa de diafiltração por ultrafiltração em um tampão de armazenamento é geralmente realizada, com uma etapa de concentração adicionada a este, se necessária, se o vírus purificado não for suficientemente concentrado. Quando uma etapa de ultrafiltração é realizada, uma membrana é usada, o limiar de corte que é geralmente entre 5 kDa e 100 kDa, preferivelmente entre 8 kDa e 50 kDa. O estoque de vírus purificado assim preparado é finalmente esterilizado por filtração através de uma membrana tendo uma porosidade < 0,2 μm, e depois armazenado em aproximadamente 5 °C, de preferência em uma forma congelada antes de ser dividido na forma de vacinas de dose única ou múltiplas doses. Uma etapa adicional de liofilização das preparações vacinais também pode ser incluída. Neste caso, a composição tampão de armazenamento é selecionada de tal forma que ela pode ser liofilizada. O rendimento global do vírus purificado inativado, aqui calculado com base na relação da quantidade de vírus presentes no estoque de vírus purificado obtido após a última etapa de filtração de esterilização para a quantidade de vírus inicialmente presente no volume de sobrenadante viral (antes da clarificação) que foi tratado é ainda pelo menos 40%, o que atesta à vantagem industrial de um tal método de purificação.

[00054] Finalmente, uma vacina contendo o vírus da raiva purificado pode ser produzida com um rendimento muito bom e com uma pureza muito boa usando um método de acordo com as etapas: - de produção de uma batelada de células de um banco de células, geralmente a partir de um banco de células de trabalho, - de produção do vírus da raiva após a infecção da batelada de células, e - de purificação do vírus da raiva a partir do sobrenadante de cultura de células infectadas, são todas realizadas usando produtos exógenos de origem não animal.

[00055] Em virtude deste método, a vacina obtida é livre de qualquer produto exógeno de origem animal.

[00056] Consequentemente, um objeto da invenção também é um método para a fabricação de uma vacina antirrábica, de acordo com o qual: a) uma batelada de células é produzida, b) a batelada de células é infectada com o vírus da raiva, c) o vírus da raiva é purificado a partir do sobrenadante de cultura de células infectadas de acordo com o método da invenção, d) a suspensão de vírus purificado é misturada em um tampão de armazenamento, e e) a mistura é dividida na forma de vacinas de dose única ou múltiplas doses.

[00057] De acordo com uma variante do método para a fabricação da vacina, o tampão de armazenagem é um tampão de liofilização. Neste caso, a suspensão do vírus purificado é misturada com o tampão de liofilização, a mistura é dividida na forma de vacinas de dose única ou múltiplas doses e em seguida as doses de vacina são liofilizadas.

[00058] De acordo com uma variante preferida do método para a fabricação da vacina, todas as etapas do método são realizadas utilizando produtos de origem não animal. Neste caso, a vacina obtida é livre de qualquer produto exógeno de origem animal e assim oferece maior segurança biológica.

[00059] Finalmente, um objeto da invenção é uma vacina contendo o vírus da raiva purificado de acordo com a qual a quantidade de DNA residual medido por PCR quantitativa e a quantidade de proteínas totais que estão presentes em uma dose efetiva de vacina são menores do que 20 pg de DNA residual e menores do que 40 μm de proteínas. De preferência, uma dose eficaz contém menos do que 10 pg de DNA residual e menos do que 20 μm de proteínas totais. Muito preferivelmente, pelo menos 70% das proteínas totais contidas em uma dose eficaz são proteínas do vírus da raiva. Vantajosamente, a composição de vacina também pode ser livre de qualquer produto exógeno de origem animal. O vírus da raiva contido na vacina pode ser inativado ou atenuado. A análise densitométrica do perfil eletroforético de uma amostra de vacina, obtida após a eletroforese em gel de poliacrilamida e visualização com azul coomassie, de fato mostra que mais do que 70% das proteínas são de origem viral. Essencialmente as 5 proteínas do vírus da raiva (isto é, glicoproteína G, nucleoproteína N, fosfoproteína P, matriz proteica M, RNA polimerase L) são encontradas em um gel de poliacrilamida (SDS- PAGE) preparado na presença de 2-mercaptoetanol.

[00060] Além disso, a análise do tamanho de partícula de uma amostra da vacina por meio da máquina zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments), que mede o movimento browniano das partículas na base da dispersão luminosa "quasielástica" (Dispersão da Luz Dinâmica), mostra a existência de uma única população de partículas entre 100 e 300 nm com um valor médio de 180 nm, que corresponde ao tamanho médio do vírus da raiva. A análise de uma amostra da vacina por microscopia eletrônica também revela a presença de partículas virais tendo a forma convencional de uma concha. A vacina de acordo com a invenção está, portanto, na forma de uma suspensão homogênea de vírus da raiva inteiros purificados em que a análise de tamanho de partícula por meio da máquina Zetasizer Nano ZS mostra a existência de um único pico entre 100 e 300 nm aproximadamente. Esta suspensão homogênea de vírus da raiva purificados com as características de pureza como descrito pode ser obtida através da execução do método de purificação como descrito na invenção.

[00061] O teste oficial aceito pela WHO para avaliar a eficácia de uma vacina antirrábica é o teste NIH (descrito em particular na monografia da European Pharmacopeia No: 216 em relação às vacinas da raiva preparadas a partir de uma cultura de células e destinadas para a medicina humana). Para ser eficaz, uma dose de vacina deve conter pelo menos 2,5 IU de acordo com o teste NIH. A administração de uma dose eficaz de uma vacina antirrábica (isto é, pelo menos 2,5 IU de acordo com o teste NIH) por via intramuscular aos seres humanos de acordo com os protocolos de vacinação ou soro-vacinação normalmente recomendados induz o desenvolvimento de imunidade protetora. Além disso, foi demonstrado que, quando a quantidade de vírus da raiva contida em uma dose da vacina obtida em conformidade com o método da invenção for pelo menos 4,5 IU com base na medição da glicoproteína G por ELISA, esta quantidade corresponde a pelo menos uma dose eficaz da vacina (isto é, contém pelo menos 2,5 IU de acordo com o teste NIH).

[00062] O teste NIH é um teste desafiador realizado em camundongos, de acordo com o qual é determinada a quantidade de uma vacina de teste necessária para obter a mesma proteção dos camundongos contra os efeitos letais de uma preparação de vírus da raiva pré-titulada administrada por via intracerebral como aquilo que é observado com uma quantidade de uma preparação de vacina da raiva de referência. A preparação da vacina antirrábica de referência é calibrada em unidades internacionais (IU). A unidade internacional (IU) é a atividade contida em uma determinada quantidade de um padrão internacional. A equivalência em IU do padrão internacional é estabelecida pela WHO. Após ter verificado que os parâmetros de controle do teste de eficácia são corretamente observados, o número de IUs contidas na vacina de teste é então determinado com base nos valores da dose de proteção de 50% da vacina testada e da preparação de referência (calibrado em IUs). Deve ser pelo menos 2,5 IU por dose de modo a ser eficaz na vacinação.

[00063] A dose eficaz da vacina que é injetada por via intramuscular em seres humanos é geralmente contida em um volume de 0,5 a 1 mL de uma suspensão líquida que está pronta para usar ou obtida por simples descongelamento ou então obtida de forma extemporânea pela reconstituição de um liofilizado com um solvente.

[00064] Os protocolos de vacinação usados para proteger os seres humanos contra a raiva são bem-conhecidos e diferem dependendo se uma vacinação preventiva ou curativa está envolvida. Geralmente, no caso de uma vacinação preventiva, o protocolo de vacinação principal compreende duas ou três injeções intramusculares de uma dose eficaz de vacina. Os reforços de vacinação são depois dados, em intervalos regulares, através da administração de uma dose eficaz única de vacina. No caso de uma vacinação curativa, os protocolos de vacinação diferem dependendo se ou não o indivíduo exposto ao vírus da raiva já foi vacinado e dependendo do país. O protocolo de vacinação normalmente recomendado em indivíduos não imunizados ou mal imunizados, em paralelo com a administração de um soro antirrábico, compreende 5 injeções intramusculares sucessivas de uma dose eficaz de vacina durante um período de 1 mês, seguido por um reforço aos 3 meses. O número de injeções é reduzido para 3, ou até mesmo para um, quando os indivíduos expostos ao vírus tiverem recebido previamente uma vacinação preventiva completa. Outros protocolos de vacinação no contexto da vacinação curativa em indivíduos não imunizados ou mal imunizados que tornam possível reduzir o número de injeções e/ou quantidade de antígeno da vacina administrado podem ser usados no contexto da presente invenção. Estes são em particular o protocolo "Zagreb", que compreende 4 injeções intramusculares de uma dose eficaz de vacina (com 2 injeções em diferentes locais sendo dadas no dia D0, seguido por uma injeção em D7 e depois em D21), ou protocolos de vacinação intradérmica.

[00065] A presente invenção será compreendida mais claramente tendo em conta os seguintes exemplos que servem para ilustrar a invenção sem, entretanto, limitar o seu conteúdo. Exemplo 1: Comparação de vários suportes cromatográficos no método para a purificação do vírus da raiva 1-1) Produção do vírus da raiva em células VERO no meio livre de soro

[00066] Células da linhagem VERO, após terem sido adaptadas às condições da cultura em meio livre de soro conforme descrito na WO 01/40443, foram transferidas para dentro de um biogerador de 10 a 20 litros contendo microportadores cytodex 1 em meio VP SFM (Invitrogen). Depois de um período de cultura de 3 a 4 dias a 37 °C com o pH sendo mantido em aproximadamente 7,2 ± 0,2, com a saturação de oxigênio sendo mantida em 25% ± 10% e com o meio sendo submetido à agitação ligeira, as células foram infectadas com vírus da raiva em uma multiplicidade de infecção de 0,01 em um meio de infecção viral contendo meio VP SFM (Invitrogen). No caso dos testes que foram realizados com o suporte cromatográfico Fractogel EMD-SO3-, a produção do vírus da raiva foi realizada em uma escala de 150 litros, usando biogeradores de 150 litros. Os sobrenadantes de cultura de células infectadas foram colhidos nos dias D7 (H1), D11 (H2) e D15 (H3). Após cada colheita, novo meio de infecção viral foi reintroduzido. 1-2) Clarificação e análise de colheitas

[00067] A etapa de clarificação foi realizada utilizando duas filtrações frontais sucessivas, a primeira usando um pré-filtro de polipropileno 8 μm (Sartopure PP2, SARTORIUS) que remove os poucos microportadores dispostos durante a colheita, as células Vero separadas dos suportes e dos grandes resíduos de célula; a segunda usando um filtro PES, composto da combinação de dois filtros, 0,8 μm e 0,45 μm (Sartopore 2, SARTORIUS), que remove os agregados.

[00068] A quantidade de vírus da raiva presente nas colheitas clarificadas foi determinada mediante a medição da quantidade de glicoproteína G (gpG) medida pelo método ELISA a seguir:

[00069] Aproximadamente 0,12 μg/100 μL de uma solução de um anticorpo monoclonal anti-gpG 1112-1 (cujas características são descritas no Journal of Clinical Investigation (1989), volume 84, páginas 971 até 975), pré-diluída em um tampão de revestimento (0,2 M tampão de carbonato/bicarbonato, pH 9,6), foi dispensada nos reservatórios de uma microplaca de ELISA. Após a incubação durante a noite em um ambiente frio, seguido de várias lavagens em um tampão de lavagem (tampão de fosfato suplementado com 0,05% Tween 20), 100 μL de um tampão de saturação (tampão de fosfato suplementado com 1% albumina de soro bovino) foram dispensados em cada reservatório. Após a incubação durante uma hora a 37 °C, seguido de várias lavagens, uma faixa de diluição de cada amostra de teste foi preparada em um tampão de diluição (tampão de fosfato suplementado com 0,05% Tween 20 e 0,1% albumina de soro). Em paralelo, uma faixa de diluição de um padrão de referência, que foi calibrado com relação à referência internacional do NIBSC (por exemplo, PISRAV), foi preparada em cada microplaca. Após uma outra incubação durante uma hora a 37 °C, seguido de várias lavagens, 100 μL de uma solução de um anticorpo monoclonal de camundongo anti-GPG D1 (cujas características são descritas em Biologicals (2003), volume 31, páginas 9 a 16), que foi biotinilada e utilizada após a diluição em 1/5000 no tampão de diluição, foram dispensados em cada poço. As placas foram deixadas durante 1 hora a 37 °C e depois lavadas várias vezes antes de dispensar 100 μL de uma solução de estreptavidina acoplada à peroxidase (Southern Biotechnology Associates), pré-diluída em 1/15000 no tampão de diluição, em cada um dos poços. Após mais uma incubação durante uma hora a 37 °C, seguido de várias lavagens, 100 μL de uma solução de 0,05 M tampão de citrato, pH 5, contendo o substrato revelador (O-fenilenodiamina), foram dispensados em cada reservatório. Depois de um tempo de incubação de 30 minutos na temperatura ambiente no escuro, a reação de revelação foi interrompida pela adição de 50 μL/reservat0rio de uma solução 2N de H2SO4. A leitura espectrofotométrica das microplacas foi realizada em dois comprimentos de onda (492 nm e 620 nm). A densidade óptica medida é a diferença entre as duas leituras de modo a levar em conta a absorção pelo plástico. A atividade relativa foi calculada pelo método de linhas paralelas de acordo com as recomendações da European Pharmacopea. O título do vírus da raiva da amostra se baseia na determinação da concentração de glicoproteína G do vírus da raiva, que é expressa em IU/mL em relação à referência.

[00070] A quantidade de proteínas totais presentes nas colheitas clarificadas foi medida usando o método de Bradford convencional vendido na forma de um kit pela Biorad (ref: 500-0006).

[00071] A quantidade de DNA presente nas colheitas clarificadas foi medida por qPCR. O protocolo de trabalho é semelhante àquele que é descrito por Lebron J.A. et al., in Developments in Biologicals (2006), vol 123, pp. 35-44. Após ter extraído o DNA residual das colheitas clarificadas por meio do kit comercial Extractor da Wako Pure Chemicals, uma quantidade fixa de um DNA exógeno, que serve como um controle interno para a amplificação por PCR,foi introduzida em cada amostra. Em paralelo, uma amostra de DNA genômico proveniente de células Vero submetidas à lise por sucessivos congelamentos/descongelamentos, subsequentemente tratadas com RNase A, em uma proporção de 2 mg de RNase A por 2,5 x 105 células, foi preparada e depois, finalmente, subsequentemente purificada utilizando o kit QIAamp Virus BioRobot 9604 (QIAGEN). O DNA purificado foi quantificado por espectrofotometria em 260 nm. Usando este DNA purificado (DNA padrão), uma faixa de calibração foi preparada através da execução de 10 diluições. As amostras provenientes das colheitas clarificadas e também das amostras da faixa de calibração foram subsequentemente submetidas a um ciclo de amplificação por PCR, depois de ter adicionado, para cada teste, a sonda fluorescente Alpha-MPH3, as duas bases e a pré-mistura 2X QuantiTect Probe Master Mix (Qiagen) em um volume de água completamente livre de nuclease (qs 50 μL). O ciclo de amplificação foi realizado utilizando a máquina Light Cycler 480 (Roche Applied Science) usando o programa: 95 °C, 15 min, 40 ciclos compreendendo duas etapas 95 °C, 15 seg; 60 °C, 60 seg. A quantidade de DNA residual extraído das colheitas clarificadas foi então calculada, por interpolação, com base na medição da fluorescência observada em comparação com a faixa de calibração estabelecida com o DNA padrão. A quantidade de DNA residual foi ajustada por um fator de correção correspondente à eficiência de carga medida para a amostra por meio da quantificação do DNA exógeno. Em geral, as concentrações de glicoproteína G (correspondente ao título de vírus da raiva), das proteínas totais e do DNA nas colheitas clarificadas foram nas faixas de 1 a 3 IU/mL para a glicoproteína G, de 50 a 100 μg/mL para as proteínas totais e de 5 a 50 ng/mL para o DNA. 1-3) Medição dos níveis de desempenho dos vários suportes cromatográficos em termos de sua capacidade em remover os ácidos nucleicos e reter o vírus da raiva

[00072] A eliminação do DNA celular nas colheitas clarificadas foi avaliada nos seguintes suportes cromatográficos: Suportes Aniônicos - Fractogel ® EMD TMAE (Merck) (trocador aniônico forte) - Fractogel ® EMD DEAE (Merck) (trocador aniônico fraco) - Sartobind ® Q membrana positivamente carregada (Sartorius) - Mustang ® Q membrana positivamente carregada (Pall) Suporte Catiônico - Fractogel ® EMD SO3 (Merck) (trocador catiônico forte).

[00073] Os testes preliminares foram realizados na membrana positivamente carregada Sartobind®, de modo a identificar a melhor concentração de sal para a eluição do vírus através da cromatografia de troca aniônica. Estes testes mostraram que o vírus foi eluído através do gradiente de sal, incluindo em 1M. Isto também foi verdadeiro para os outros suportes aniônicos que foram testados. Os perfis de eluição obtidos levaram a escolher uma forte concentração de NaCl para a eluição do máximo de vírus. Visto que o DNA estava começando a ser eluído partindo de 350 a 400 mM, o compromisso foi selecionar uma concentração de NaCl de 450 mM.

[00074] Os suportes aniônicos foram subsequentemente equilibrados em tampão 20 mM Tris contendo 150 mM NaCl, pH 7,5. As colheitas clarificadas foram depois colocadas em contato com os vários suportes estudados. Os suportes aniônicos foram subsequentemente lavados em tampão 20 mM Tris contendo 150 mM NaCl, pH 7,5. O vírus foi subsequentemente separado do suporte por meio de um tampão de eluição 20 mM Tris contendo 450 mM NaCl, pH 7,5.

[00075] Os testes em uma coluna Fractogel® foram realizados usando a colheita clarificada H1. Entre 35 e 50 IU de vírus da raiva e entre 13 e 25 μg de DNA foram injetados por mL de gel.

[00076] Os testes na membrana foram realizados usando a colheita clarificada H2. 13 IU de vírus da raiva e entre 350 e 450 ng de DNA foram injetados por cm2 de membrana.

[00077] As condições de trabalho utilizadas para a cromatografia de troca catiônica em Fractogel® EMD SO3- Support também foram otimizadas. O suporte de Fractogel® EMD SO3- foi equilibrado usando um tampão 20 mM Tris contendo 150 mM NaCl, pH = 7,5. Os testes em suporte Fractogel® EMD SO3- foram realizados usando a colheita clarificada H1. A condutividade do meio (entre 14 mS/cm e 18 mS/cm) e o pH (entre 7,5 e 7,7) foram verificados. Aproximadamente 50 IU (na base da dosagem de glicoproteína G) do vírus da raiva foram injetados por mL de gel. Após a colheita do filtrado de modo a medir a quantidade de vírus que se ligou à coluna, o suporte foi subsequentemente lavado em tampão 20 mM Tris contendo 150 mM NaCl, pH = 7,5. Depois o vírus foi eluído em tampão 20 mM Tris contendo 600 mM NaCl, pH = 7,5, com recuperação do pico viral em uma fração independente. O suporte foi finalmente regenerado em tampão 20 mM Tris contendo 1M NaCl, pH = 7,5. Os resultados obtidos são fornecidos na tabela II abaixo. Tabela II: Níveis de desempenho dos vários suportes cromatográficos

*: o título do vírus da raiva foi determinado com base na medição de glicoproteína G por ELISA **: o título de DNA residual foi medido pela qPCR diretamente sobre o produto recuperado ***: o título de DNA residual foi medido pela qPCR após a concentração do eluato por um fator de 6 pela ultrafiltração.

[00078] Os suportes de membrana positivamente carregados (Sartobind® (Sartorius) ou Mustang® Q (Pall)) facilitam a remoção do DNA (mais do que 90% do DNA é removido na fração coletada), mas por outro lado, os rendimentos de vírus colhido são relativamente baixos (< 50%). Com relação aos suportes com base em géis de carga positiva (Fractogel® EMD TMAE (Merck), Fractogel® EMD DEAE (Merck)), é bastante a tendência oposta que é observada, isto é, um melhor rendimento do vírus colhido (> 50%), mas em detrimento da remoção do DNA (73% do DNA são removidos no melhor dos casos). Por outro lado, quando o suporte Fractogel® EMD SO3- catiônico é utilizado, tanto uma remoção de DNA muito boa (mais do que 95% do DNA é removido na fração coletada) quanto um rendimento de vírus colhido muito bom (> 70%) são observados. Os níveis de desempenho cromatográfico do suporte Fractogel® EMD SO3- catiônico são, portanto, melhores do que aqueles que são observados com os suportes cromatográficos aniônicos. 1-4) Medição dos níveis de desempenho cromatográfico de vários suportes cromatográficos catiônicos

[00079] Visto que os testes anteriores mostraram que o suporte cromatográfico de troca catiônica forte tinha melhores níveis de desempenho do que os suportes aniônicos, buscou-se determinar as características do suporte cromatográfico de troca catiônica forte que fornece os melhores níveis de desempenho mediante o teste de vários suportes cromatográficos fortes de troca catiônica que diferem em particular em virtude de sua matriz e seus grupos (ligantes). As características dos vários suportes que foram testados são descritas abaixo: - Sartobind® S membrana negativamente carregada (Sartorius): uma membrana celulósica na qual os grupos de ácido sulfônico (ligandos) foram enxertados; - Mustang™ S membrana negativamente carregada (Pall): polietersulfona membrana na qual os grupos de ácido sulfônico (ligandos) foram enxertados; - Capto™ S Gel (GE Healthcare): gel do qual a matriz se baseia em agarose, em que os grupos de sulfoetila (ligantes) foram enxertados por meio de ramos espaçadores com base em dextrano; - SP Sepharose XL Gel (GE Healthcare): gel do qual a matriz se baseia em agarose em que os grupos de sulfopropila (ligandos) foram enxertados por meio de ramos espaçadores com base em dextrano; - Toyopearl® SP-650 C (Tosoh): resina da qual a matriz se baseia em polimetacrilato, em que os grupos de sulfopropila (ligandos) foram enxertados; - Fractogel® EMD SO3- (Merck): gel do qual a matriz se baseia em polimetacrilato, em que os grupos de sulfoisobutila foram enxertados por meio de ramos espaçadores consistindo em cadeias poliméricas obtidas pela polimerização do monômero tendo a fórmula química: CH2=CH-CO-NH-C(CH3)2-CH2-SO3-.

[00080] Os géis dos quais os ligantes foram enxertados na matriz por meio de ramos espaçadores geralmente possuem uma estrutura "tentacular" que em geral facilita a interação ligante/proteína.

[00081] Vários parâmetros foram avaliados pela cromatografia na membrana Sartobind® S (Sartorius) (volume de suporte: 7 mL): o pH da colheita clarificada injetada, que estava em uma faixa de 7,5 a 8,0, a condutividade da colheita clarificada injetada, que estava em uma faixa de 4,5 mS/cm a 17,9 mS/cm, e a carga viral injetada, que estava em uma faixa de 4 IU/mL a 11 IU/mL de suporte. Seja quais forem os parâmetros estudados, os rendimentos de vírus obtidos foram sempre < 35%.

[00082] No caso da cromatografia na membrana Mustang™ S (Pall) (volume de suporte: 10 mL), o pH e a condutividade da colheita clarificada foram, respectivamente, 7,5 e 14 mS/cm, enquanto que a carga viral injetada foi 32 IU/mL de suporte. O rendimento de vírus obtido foi muito baixo (< 10%).

[00083] O mesmo protocolo de operação com aquele que foi usado para a cromatografia em suporte de Fractogel® EMD SO3- foi aplicado para a realização das outras cromatografias de gel (ver a seção de 1-3). A única distinção diz respeito à regeneração do gel Toyopearl® SP-650 C, que é realizada em um tampão 20 mM Tris contendo 2M NaCl, pH 7,5. O mesmo pH e condições de condutividade como aquelas da cromatografia em Fractogel® EMD SO3- foram utilizados. Os limites da capacidade de carga dos vários suportes cromatográficos também foram cumpridos quando se injeta a carga viral contida no sobrenadante clarificado.

[00084] Diferente do suporte Fractogel® EMD SO3-, onde aproximadamente 5% da quantidade total de vírus injetado são encontradas no filtrado, as quantidades de vírus que foram encontradas nos filtrados das cromatografias realizadas nos três outros tipos de suporte (Capto™ S Gel, SP Sepharose XL Gel e Toyopearl® SP-650 C gel) representam entre 80 e 99% da quantidade total de vírus injetado. Os rendimentos de vírus obtidos nos eluatos são consequentemente muito baixos (< 10%).

[00085] A estrutura dos ligantes e da matriz nos suportes cromatográficos fortes de troca catiônica, portanto, desempenha um papel importante, uma vez que apenas um suporte compreendendo uma matriz de polimetacrilato em que os grupos de sulfoisobutila foram enxertados, torna possível a obtenção de um eluato em que pelo menos 70% do vírus da raiva são recuperados. Em conclusão, sem todos os suportes cromatográficos aniônicos e catiônicos testados, o suporte Fractogel® EMD SO3- (Merck) é o único que apresenta níveis de desempenho que são realmente explorados a partir de um do ponto de vista industrial, uma vez que o rendimento do vírus da raiva é > 70%, enquanto que mais do que 95% do DNA é removido. Exemplo 2: Vantagem da combinação de uma etapa de cromatografia em suporte de Fractogel® EMD SO3- com uma etapa de tratamento de benzonase no método para a purificação do vírus da raiva.

[00086] De modo a avaliar a vantagem desta combinação, este método foi comparado com um método para a purificação do vírus da raiva pelo tratamento duplo de benzonase. O tratamento de benzonase é convencionalmente usado para remover os ácidos nucleicos que estão contidos em um produto biológico. Quando este tratamento enzimático é repetido, a remoção do DNA é ainda maior.

[00087] Um método para purificar o vírus da raiva que utiliza um "tratamento duplo de benzonase" foi comparado com o protocolo da invenção, de acordo com o qual uma etapa de cromatografia de troca catiônica em suporte Fractogel® EMD SO3- foi combinada com um tratamento de benzonase.

[00088] No caso do tratamento duplo de benzonase (UF-Bz-UF-Bz), o protocolo de purificação que foi utilizado corresponde àquele que é descrito na Tabela III abaixo: Tabela III: Purificação do vírus da raiva pelo tratamento duplo de benzonase (UF-Bz-UF-Bz).

[00089] No caso do tratamento que combina a cromatografia de troca catiônica em suporte Fractogel® EMD SO3- e um tratamento de benzonase (CEX-UF-Bz), o método de purificação que foi utilizado corresponde àquele que é descrito na Tabela IV abaixo: Tabela IV

[00090] Purificação do vírus da raiva mediante a combinação de cromatografia de troca catiônica em suporte Fractogel® EMD SO3- e tratamento de benzonase (CEX-UF-Bz).

[00091] Em ambos os casos, o método de purificação foi realizado partindo da mesma colheita clarificada H1 tendo um volume de aproximadamente 20 litros que foi dividido em duas partes iguais.

[00092] No caso do método UF-Bz-UF-Bz, as duas concentrações foram realizadas na membrana PES Medium Screen 100KDA (PALL) combinada com uma diafiltração em tampão 20 mM Tris contendo 150 mM NaCl, pH = 7,5 por ultrafiltração, a primeira etapa de ultrafiltração resultando na redução do volume da colheita clarificada por um fator de aproximadamente 20, enquanto que a segunda ultrafiltração levou à redução do volume da colheita clarificada em um fator global de aproximadamente 100. Antes de cada tratamento de benzonase, uma solução de MgCl2 foi adicionada de tal forma que a concentração no retentado foi de 2 mM. O tratamento de benzonase foi realizado pela adição de 15 U/mL de colheita bruta ao meio de reação e que sai do meio de reação durante 2 horas na temperatura de laboratório.

[00093] No caso do método CEX-UF-Bz, a etapa de cromatografia foi realizada de acordo com os métodos descritos nos parágrafos 1-3. O eluato contendo o vírus purificado foi subsequentemente concentrado em um fator de aproximadamente 5 e diafiltrado, e depois tratado com benzonase usando o mesmo protocolo como aquele que foi usado no método UF-Bz-UF-Bz.

[00094] Em ambos os métodos, a etapa ultracentrifugação foi realizada em almofadas de sacarose 34 a 60% com um rotor tipo 45 Ti a 21000 rpm durante 2 h a +5 °C. As frações do gradiente contendo o vírus purificado foram recuperadas, combinadas, e em seguida analisadas em termos do seu teor de DNA, vírus e proteína total.

[00095] A Tabela V abaixo indica, nos vários estágios de purificação, o DNA, gpG e títulos de proteína totais obtidos como uma função do método utilizado. Tabela V: Avaliação dos dois métodos de purificação

UF/Bz/UF: corresponde ao retentado obtido após a segunda ultrafiltração e pouco antes do segundo tratamento de benzonase no protocolo UF-Bz-UF-Bz. CEX/UF: corresponde ao retentado obtido após a etapa de ultrafiltração e pouco antes do tratamento de benzonase no protocolo CEX-UF-Bz.

[00096] Após UC: corresponde ao estágio onde as frações do gradiente contendo o vírus purificado foram combinadas após a ultracentrifugação e após o volume total ter sido ajustado de tal forma que fique 12,5 vezes mais concentrado do que o volume da colheita clarificada. *: a produção de vírus é calculada na base dos títulos gpG ELISA.

[00097] Os resultados na tabela V mostram que a combinação de cromatografia no suporte Fractogel® EMD SO3- seguido pelo tratamento de benzonase (método CEX-UF-Bz) é muito mais eficaz na remoção do DNA do que um tratamento duplo de benzonase (método UF-Bz-UF-Bz). É possível reduzir a quantidade de DNA residual em pelo menos mais 1 Log10 usando o método CEX-UF-Bz. Estes resultados também foram confirmados em diferentes escalas de volume.Também foi observado que o método CEX-UF-Bz também remove as proteínas contaminadas de forma mais eficaz do que o método UF-Bz-UF-Bz, visto que não havia quase metade das proteínas totais por unidade de vírus (expressas na forma de IU de gpG) (5,4 μg no método CEX-UF-Bz em vez de 8 μg por IU de gpG no método UF-Bz-UF-Bz. Isto resulta do fato de que mais do que 65% das proteínas são removidas durante a etapa de cromatografia sobre o suporte Fractogel® EMD SO3-. Estes resultados mostram que a combinação de uma etapa de cromatografia no suporte Fractogel® EMD SO3- com uma etapa de tratamento de benzonase no método de purificação do vírus da raiva exerce uma ação combinada na remoção de DNA nas colheitas clarificadas de vírus da raiva, que é muito maior do que o efeito observado durante um tratamento duplo de benzonase.

Claims (16)

1. Processo para purificar o vírus da raiva, caracterizado pelo fato de que compreende uma única etapa de cromatografia por troca iônica, a dita etapa sendo uma cromatografia por troca catiônica de acordo com a qual: a) o sobrenadante de uma cultura de células infectadas com este vírus é colocado em contato com um suporte de cromatografia de troca catiônica compreendendo uma matriz de polimetacrilato sobre a qual grupos de sulfoisobutila foram enxertados por ligação covalente de tal forma que o vírus da raiva se liga a este suporte, e b) o vírus é eluído de seu suporte.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sobrenadante de cultura das células infectadas com o vírus da raiva é desprovido de soro animal ou de qualquer proteína de soro.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o sobrenadante de cultura das células infectadas com o vírus da raiva é desprovido de qualquer proteína exógena de origem animal.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a concentração de proteínas exógenas de origem não animal no sobrenadante de cultura das células infectadas com o vírus da raiva é < 15 mg/L.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o sobrenadante de cultura das células infectadas com o vírus da raiva é desprovido de qualquer produto exógeno de origem animal.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o sobrenadante de cultura de células infectadas com o vírus da raiva é previamente clarificado antes de ser colocado em contato com o suporte de cromatografia de troca catiônica.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a quantidade de vírus medida no eluato corresponde a pelo menos 70% da quantidade de vírus medida no sobrenadante que foi colocado em contato com o suporte cromatográfico.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a quantidade de proteínas totais medida no eluato corresponde a menos do que 40% da quantidade de proteínas totais medida no sobrenadante que foi colocado em contato com o suporte cromatográfico e de que a quantidade de DNA medida no eluato corresponde a menos do que 5%, de preferência a menos do que 2,5%, e ainda mais preferivelmente a menos do que 1% da quantidade de DNA medida no sobrenadante que foi colocado em contato com o suporte cromatográfico.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o eluato é opcionalmente concentrado e depois tratado com uma nuclease.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a nuclease é uma endonuclease tal como benzonase.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o eluato é depois submetido a uma ultracentrifugação em um gradiente de sacarose e se recupera(m) a(s) fração(frações) do gradiente que contém o vírus purificado.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o vírus da raiva purificado é então inativado por meio de um agente de inativação viral.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o agente de inativação viral é β- propiolactona.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que todas as etapas do processo são realizadas utilizando produtos de origem não animal.

15. Processo para fabricar uma vacina contra a raiva, caracterizado pelo fato de que: a) uma cultura de células é infectada com o vírus da raiva, b) o vírus da raiva é purificado a partir do sobrenadante de cultura de células infectadas de acordo com um processo como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, c) a suspensão de vírus purificado obtida em b) é misturada em um tampão de armazenamento, e d) a suspensão de vírus purificado obtida em c) é dividida na forma de vacinas de dose única ou de múltiplas doses.

16. Processo para fabricar uma vacina contra a raiva, caracterizado pelo fato de que: a) uma cultura de células é infectada com o vírus da raiva, b) o vírus da raiva é purificado a partir do sobrenadante de cultura de células infectadas de acordo com um processo como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, c) a suspensão de vírus purificado obtida em b) é misturada em um tampão de liofilização, d) a mistura obtida em c) é dividida na forma de vacinas de dose única ou de múltiplas doses, e e) as doses da vacina são liofilizadas.