BRPI1000870B1 - formulações farmacêuticas vacinais e seus usos - Google Patents

Abstract

formulações farmacêuticas vacinais e seus usos. a presente invenção destina-se a formulações farmacêuticas vacinais contendo vetores recombinantes plasmidiais construidos a partir da sequência de dna do peptideo p1o e/ou combinados a outros vetores. ainda, o presente pedido trata do uso desses vetores recombinantes no preparo de formulações farmacêuticas aplicadas em doenças infecciosas, particularmente, paracoccidioidomicose (pcm).

Description

“FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS VACINAIS E SEUS USOS”

Campo da Invenção [001] A presente invenção destina-se a formulações farmacêuticas vacinais contendo vetores recombinantes plasmidiais construídos a partir da sequência de DNA do peptídeo P10 e/ou combinados a outros vetores. Ainda, o presente pedido trata do uso desses vetores recombinantes no preparo de formulações farmacêuticas aplicadas em doenças infecciosas, particularmente, paracoccidioidomicose (PCM).

Antecedentes da Invenção [002] A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose profunda de caráter granulomatoso crônico, que compromete especialmente o tecido pulmonar, o sistema linfático, o tecido mucocutâneo e por extensão qualquer outro órgão. Seu agente etiológico, Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico, que se apresenta na forma de levedura quando cultivado a 37°C ou em vida parasitária e sob a forma de bolor, quando cultivado à temperatura ambiente (RESTREPO, A; MONCADA, L. H. & QUINTERO, M. Effect of hydrogen ion concentration and temperature on the growth of Paracoccidioides brasiliensis in soil extracts. Sabouraudia, 7:207-215, 1969; RESTREPO, A. Paracoccidioidomicosis. Acta de Medicina Colombiana, 3:33-66, 1978).

[003] A fase leveduriforme de P. brasiliensis caracteriza-se por células esféricas ou ovais de 5-25 pm de diâmetro, com paredes bem definidas, refringentes, aparentemente duplas, que podem apresentar brotamento multipolar característico. A fase filamentosa apresenta hifas delgadas, e como formas reprodutivas aleurioconídias, artroconídias, artroaleurioconídias e clamidosporos intercalares, dependendo das condições de cultivo empregadas. Entretanto, nenhuma das estruturas reprodutivas da fase filamentosa revelou-se especialmente útil como critério para a sua identificação (LACAZ, C. S. Historical evolution of the

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2/51 knowledge on paracoccidioidomycosis and its ethiologic agent. in Paracoccidioidomycosis. pp. 1-11 FRANCO, M.; LACAZ, C. S.; RESTREPOMORENO, A.; DEL NEGRO, G. eds. CRC Press EUA, 1994).

[004] A doença foi inicialmente descrita por Lutz no início do século XX.

[005] A posição taxonômica do P. brasiliensis é assim definida: Eukaryotae; eucarioto com mitocôndrias, Fungi; Ascomycota; Euascomycetes; Plectomycetes; Ascophaerales; Ascophaeraceae; Paracoccidioides.

[006] No final dos anos 80, estudos de Cano (CANO, L. E.; SINGERVERMES, L. M.; VAZ, C. A. C.; RUSSO, M.; CALICH, V. L. G. Pulmonary paracoccidioidomycosis in resistant and susceptible mice: relationship among progression of infection, bronchoalveolar cell activation, cellular immune response, and specific isotype patterns. Infect. Immun. 63: 17771783, 1995) utilizando microscopia confocal, mostraram que o genoma de P. brasiliensis possui tamanho aproximado entre 45,7 e 60,9 Mpb dependendo do isolado. Por outro lado, resultados de PFGE revelam um genoma de 23,0 a 27,6 Mpb. Estes dados sugerem que o P. brasiliensis seja diplóide.

[007] Há evidências de que o fungo penetre no hospedeiro pelas vias aéreas superiores através da inalação de propágulos da sua fase filamentosa, provocando complexo primário pulmonar, podendo, então, ocorrer disseminação hematogênica e/ou linfática para outros órgãos (FRANCO, M. Host parasite relationships to paracoccidioidomycosis. J. Med. Vet. Mycol., 25:5-18, 1986). No hospedeiro imunocompetente este foco inicial desaparece ou pode permanecer quiescente como infecção latente. Se o equilíbrio entre o hospedeiro e o parasita for rompido, ocorrerá doença (MONTENEGRO, M. R. G. Formas clínicas de paracoccidioidomicose. Rev. Inst. Med. Trop., São Paulo, 28: 203-204,

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1986).

[008] A doença geralmente apresenta-se sob duas formas: aguda ou subaguda (tipo juvenil) e forma crônica (tipo adulto). A primeira delas é responsável por 3 a 4% dos casos e caracteriza-se por rápida disseminação para o sistema retículo-endotelial. A forma crônica pode ser subdividida em unifocal e multifocal. A doença progride lentamente e pode levar de meses a anos para se manifestar e as manifestações pulmonares estão presentes em até 90% dos casos (BRUMMER, E.; CASTANEDA, E.; RESTREPO, A. 1993. Paracoccidioidomycosis un Update. Clin. Microbiol. Rev., 6:89-117, 1993). Na unifocal, em 25% dos casos, os pulmões e, raramente outros locais são os únicos órgãos envolvidos (LONDERO, A. T. & RAMOS, C. D. Paracoccidioidomicose: estudo clínico-micológico de 260 casos observados no interior do estado do Rio Grande do Sul. J. Peneum. (Brasil), 16:129-132, 1990). Na forma multifocal, além dos pulmões, os principais sítios envolvidos são mucosa oral e pele, linfonodos e glândulas adrenais e, em menor grau de freqüência, sistema nervoso central, ossos, órgãos genitais e vasos sanguíneos.

[009] A enfermidade é restrita aos países da América Latina, especialmente Brasil, Argentina, Venezuela e Colômbia (RESTREPO, A. The ecology of Paracoccidioides brasiliensis: a puzzle still unsolved. Sabouraudia, 23:232-334, 1985). Casos descritos em outros continentes referem-se a pessoas que adquiriram o fungo na América Latina e posteriormente, desenvolveram a doença em seus países de origem (FERGUSON, R.; UPTON, M. F. The isolation of Paracoccidioides brasiliensis from a case of South-american blastomycosis. J. Bacteriol., 53:376-381, 1974; FOUNTAIN, F. F.; SUTHIEFF, W. D.

Paracoccidioidomycosis in the United States. Am. Rev. Resp. Dis., 99:8993, 1969; CHICAMORI, T.; SAKA, S.; NAGANO, H.; SAEKI, S.; LACAZ, C.

S.; RODRIGUES, M. C.; CASSAGUERRA, C. M.; BRACCIALLI, M. L.

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Paracoccidioidomycosis in Japan, report a case. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 26:267-271, 1984; AJELLO, L.; POLONELLI, L. Imported paracoccidioidomycosis, a public health problem in non-endemic areas. Eur. J. Epidemiol., 1:160-165, 1985).

[010] P. brasiliensis expressa numerosas substâncias (polissacarídeos, lipídeos, glicoproteínas) que reúnem condições físicoquímicas e biológicas necessárias para atuarem como antígenos. Extratos antigênicos do fungo podem ser preparados por diferentes métodos, tais como filtrado bruto de cultura, tanto da fase leveduriforme, como da micelial, extratos obtidos por tratamento de filtrado de cultura com álcool etílico, antígenos hidrossolúveis de natureza polissacarídica e antígenos somáticos obtidos por rompimento das células por processos físicos.

[011] Os antígenos liberados são capazes de induzir no indivíduo tanto resposta imune humoral quanto celular. Os pacientes de PCM apresentam, entretanto, um desequilíbrio entre essas duas respostas: formas agudas e graves da doença ocorrem em pacientes apresentando altos títulos de anticorpos e depressão da resposta imune celular, enquanto que indivíduos com formas localizadas e benignas desenvolvem resposta humoral com baixos títulos de anticorpos e resposta celular preservada (MUSATI, C. C.; REZKALLAH, M. T.; MENDES, E.; MENDES, N. F. “In vivo” and “in vitro” evaluation of cell-mediated immunity in patients with paracoccidioidomycosis. Cell Immunol., 24:365-378, 1976).

[012] Existem evidências diretas de que o granuloma na PCM está relacionado com a resposta imunológica do hospedeiro. Tal correlação indica que a PCM deve ser classificada como uma doença polar, no qual o pólo benigno ou hiperérgico é caracterizado por resposta imune celular intacta e granulomas compactos, com células epitelióides, contendo poucos fungos e baixos níveis de anticorpos. O pólo maligno ou anérgico apresenta granulomas frouxos com áreas de necrose, muitos fungos em

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5/51 processo de gemulação e pacientes com resposta celular comprometida e altos níveis de anticorpos. As formas intermediárias variam entre esses dois pólos. A reprodução destes quadros em hamsters permitiu estabelecer-se clara correlação entre doença localizada ou circunscrita, integridade da resposta imune celular e presença de granulomas compactos contendo poucos fungos. A imunocompetência seria perdida no curso da infecção (MONTENEGRO, M. R. & FRANCO, M. F. Pathology. in Paracoccidioidomycosis. pp. 131-150 FRANCO, M.; LACAZ, C. S.; RESTREPO-MORENO, A.; DEL NEGRO, G. Eds., 1994).

[013] Fatores genéticos podem influenciar mecanismos de resistência natural e adquirida, em diferentes estágios da infecção e níveis de expressão. A associação entre PCM e marcadores genéticos conhecidos como grupos sanguíneos e produtos determinados por genes do complexo principal de histocompatibilidade tem sido estudada em diferentes áreas endêmicas.

[014] Sabe-se que os fenótipos HLA-9 e HLA-B13 foram altos em pacientes com PCM (RESTREPO, F. M.; RESTREPO, M. & RESTREPO, A. Blood groups and HLA antigens in Paracoccidioidomycosis. Sabouraudia, 21:35-39, 1983). Outros estudos realizados sugerem a associação da PCM com a presença do antígeno HLA-B12 (GONZÁLEZ, N. M.; ALBORNOZ, M.; RIOS, R.; PRADO, L. Paracoccidioidomicosis y su relación com el sistema HLA. In Proc. Enc. Paracoccidioidomicose, Botucatu, p. 31, 1983) e em áreas endêmicas do sul e sudeste do Brasil verificou-se freqüência elevada de HLA-B40 (LACERDA, G. B.; ARCE-GOMES, B.; TELLES FILHO, F. Q. Increased frequency of HLA-B40 in patients with paracoccidioidomycosis.

J. Med. Vet. Mycol., 26:253-256, 1988) e HLA-Cw1 (GOLDANI, L. Z.;

MONTEIRO, C. M. C.; DONALDI, E. A.; MARTINEZ, R.; VOLTARELLI, J. C. HLA antigens in Brazilian patients with paracoccidioidomycosis. Mycopathol., 114:89-91, 1991).

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6/51 [015] Ainda, estudos de Dias e seus colaboradores (DIAS, M. F.; PEREIRA, A. C.; PEREIRA, A. ALVES, M. S. The role of HLA antigens in the development of paracoccidioidomycosis J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol., May; 14(3):166-71, 2000) utilizando teste de linfotoxicidade de Terasaky modificado por Amos não encontraram evidências entre um antígeno HLA específico e PCM.

[016] As características observadas em pacientes quanto às formas da doença e sua relação com estado de imunodepressão puderam ser reproduzidas em animais de experimentação, como hamster, por inoculação intratesticular e camundongo, por via intranasal. Através de modelo murino, (CALICH, V. L. G.; SINGER-VERMES, L. M.; SIQUEIRA, A.

M.; BURGER, E. Susceptibility and resistance of inbred mice to Paracoccidioides brasiliensis. 1 British. J. Exp. Pathol., 66:585-594, 1985) constataram a importância da imunidade celular na PCM. Camundongos atímicos, do tipo ”nude”, por exemplo, desenvolvem infecção muito mais severa e generalizada do que os animais controle, com imunidade celular intacta. Animais infectados com P. brasiliensis, previamente imunizados, desenvolvem granulomas maduros que se transformam em epitelióides, ao contrário da inflamação não específica observada em animais controle não imunizados.

[017] O diagnóstico da PCM pode ser feito por observação direta do fungo em sua fase leveduriforme nas secreções biológicas, por biópsia, e também, por seu isolamento em cultura. Entretanto, quando estes procedimentos não são possíveis, a detecção de anticorpos contra antígenos do fungo é muito útil para a elucidação do diagnóstico, principalmente através da técnica de imunodifusão (RESTREPO, A.; MONCADA, L. H. Characterization of the precipitin bands detected in the immunodifusion test for paracoccidioidomycosis. Appl. Microbiol., 28:138144, 1974; CAMARGO, Z. P.; UNTEKIRCHER, C.; CAMPOY, S. P.;

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TRAVASSOS, L. R. Production of Paracoccidioides brasiliensis exoantigens for immunodiffusion tests. J. Clin.. Microbiol., 26:2147-2151, 1988).

[018] A primeira prova imunodiagnóstica para a PCM surgiu em 1916, quando Moses (MOSES, A. Fixação de Complemento na Blastomicose. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 8:68-70, 1916) descreveu a reação de fixação de complemento (RFC). Em 1955, Fava Netto padronizou a RFC na PCM, utilizando como antígeno, uma mistura antigênica rica em polissacarídeo de P. brasiliensis, encontrando sensibilidade de 90%.

[019] Na publicação de Ferri e seus colaboradores (FERRI, R. G. Estudo imunoquímico de antígenos intracelulares. Hospital (Rio de Janeiro), 59:917-924, 1961) foi verificada a presença de anticorpos precipitantes em pacientes com PCM, aplicando-se a técnica de precipitação em gel de agarose, e utilizando como antígeno o sobrenadante de lisado de leveduras de P. brasiliensis. O uso rotineiro desta técnica foi introduzido por Restrepo (RESTREPO, A. La puebra de inmunodifusión en el diagnóstico de la paracoccidioidomicosis. Sabouraudia, 4:223-230,

1966), que observou sensibilidade de 90%. Valores de 89 a 91% de sensibilidade e 100% de especificidade foram obtidos por Cano & Restrepo (CANO, L. E.; RESTREO, A. Predictive value of serologic tests in the diagnosis and follow-up of patients with paracoccidioidomycosis. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 29(5):276-283, 1987) e por Del Negro (DEL NEGRO,

G. M. B.; GARCIA, N. M.; RODRIGUES, E. G.; CANO, M. I. N.; DE AGUIAR, M. S. M.; LÍRIO, V. V. S.; LACAZ, C. S. The sensitivity, specificity and efficiency values of some serological tests used in the diagnosis of paracoccidioidomycosis. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 33:277-280, 1991).

[020] Em 1986, estudos de Puccia e colaboradores (PUCCIA, R.; SCHENKMAN, S.; GORIN, P. A. J.; TRAVASSOS, L. R. Exocellular components of Paracoccidioides brasiliensis. identification of a specific

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8/51 antigen. Infect. Immun., 53:199-206, 1986) identificou uma glicoproteína de 43.000 Da (gp43) a partir de sobrenadante de cultura da fase leveduriforme de P. brasiliensis. Esta glicoproteína foi purificada por gel filtração em coluna cromatográfica e por cromatografia de afinidade. A gp43 reagiu com soros de pacientes com PCM e com soro de coelho hiperimune (PUCCIA, R.; TAKAOKA, D.; TRAVASSOS, R. L. Purification of the 43 kDa glycoprotein from exocellular components excreted by Paracoccidioides brasiliensis. J. Med. Vet. Mycol., 29:57-60, 1991).

[021] Comparações da gp43 nativa e sua forma desglicosilada através de estudos imunoquímicos, sugerem que as reações cruzadas se devem principalmente aos epítopos constituídos de carboidratos com resíduos de galactose. Estes epítopos são responsáveis por até 45% da reatividade total do teste de ELISA e estão mais expostos quando a molécula está fixada em substrato plástico. Esta exposição de epítopos não ocorre com antígeno em solução.

[022] Camargo e seus colaboradores (CAMARGO, Z. P.; TABORDA, C. P.; RODRIGUES, E. G.; TRAVASSOS, L. R. The use of cell free antigens of Paraco)ex:idioides brasiliensis in serological tests. J. Med. Vet. Mycol., 29:31-38, 1991) estudaram a curva de crescimento de P. brasiliensis visando o estudo da secreção/excreção de gp43 em meio de cultura. Verificaram que durante o crescimento exponencial (2 a 7 dias), a liberação extracelular de gp43 era alta e depois decrescia com o envelhecimento da cultura, sendo praticamente indetectável a partir de 30 dias. A partir desta observação padronizou-se uma preparação antigênica bruta rica em gp43, através de cultura de células leveduriformes do fungo em meio líquido, por 7 dias, mantidas sob agitação constante a 37°C. Este antígeno tornou-se referência internacional e tem sido utilizado com sucesso no diagnóstico da PCM, através do uso da técnica de imunodifusão.

[023] A descoberta de que a gp43 é o antígeno imunodominante

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9/51 também para reações de hipersensibilidade tardia foi feita por Rodrigues e Travassos (RODRIGUES, E. G.; TRAVASSOS, L. R. Nature of the reactive epitopes in Paracoccidioides brasiliensis polysaccharide antigen. J. Med. Vet. Mycol., 32: 77-81,1994) investigando o antígeno de Fava Neto.

Reações intradérmicas em humanos utilizando a gp43 purificada confirmaram esses dados (SARAIVA, E. C. O.; ALTEMANI, A.; FRANCO, M. F.; UNTERKIRCHER, C. S.; and CAMARGO, Z. P. Paracoccidioides brasiliensis-gp43 used paracoccidioidin. J. Med. Vet. Mycol.,34:155161,1996).

[024] Em face desses resultados que associavam a gp43 a uma resposta imune celular do tipo T-CD4+ além da humoral, Taborda e colaboradores (TABORDA, C. P.; JULIANO, M. A.; PUCCIA, R.; FRANCO, M.; TRAVASSOS, L. R. Mapping of the T-cell epitope in the major 43Kilodalton glycoprotein of Paracoccidioides brasiliensis which induces a Th-1 response protective against fungal infection in BALB/c mice. Infect. immun.,66: 786-793, 1998) mapearam os epitopos que medeiam esta resposta imune. Os autores demonstraram que um peptídeo de 15 aminoácidos, denominado P10 (resíduos 181-195 do gene da gp43) é responsável pela ativação de linfócitos T e proteção de camundongos BALB/c contra PCM. Neste trabalho, camundongos BALB/c foram imunizados com gp43 ou P10, em três doses, a primeira em uma das patas de cada animal. Outras imunizações se seguiram por vias sub-cutânea e intra-peritoneal. Quinze dias após a total imunização, os animais foram infectados, por via intratraqueal, com leveduras da cepa virulenta Pb18 de P. brasiliensis. Após 1 e 3,5 meses os animais foram sacrificados e realizouse a contagem de CFUs em pulmão, baço e fígado. Os resultados obtidos com o grupo sacrificado após 3,5 meses mostraram que o grupo controle (não imunizado) apresentou pelo menos 200 vezes mais CFUs no pulmão. A disseminação no baço e no fígado observado nos camundongos controles

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10/51 foi abolida nos animais imunizados com P10 e muito reduzida nos animais imunizados com gp43.

[025] A sequência do peptídeo P10 mostrou-se bem conservada conforme estudo da análise do polimorfismo da gp43 feito por Morais e colaboradores (MORAIS, F. V.; BARROS, T. F.; FUKADA, M. K.; CISALPINO, P. S.; PUCCIA, R. Polymorphism in the gene coding for the immunodominant antigen gp43 from the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis. J. Clin. Microbiol., 38: 3960-3966, 2000). As sequências mais polimórficas foram encontradas nos isolados Pb2 Pb3 e Pb4, as quais codificam uma gp43 básica, com pI em torno de 8,0. As mesmas sequências foram filogeneticamente distantes das demais e, todos estes isolados foram de pacientes com paracoccidioidomicose pulmonar. Nenhuma das substituições no gene da gp43 ocorreu no epítopo P10 para células T-CD4+.

[026] Segundo Taborda e colaboradores (referência supra) proteínas nativas ou recombinantes, ou fragmentos de ambas, podem induzir proliferação por linfócitos T em animais sensibilizados com as mesmas, mas esta propriedade pode ou não resultar em proteção durante a infecção. Em P. brasiliensis o peptídeo P10 provocou uma forte proteção mediada por imunidade celular, pois verificou-se a liberação de IFN-γ por população de linfócitos Th-1. O IFN-γ é ativador de macrófagos em infecções fúngicas proporcionando atividade fungicida em P. brasiliensis e B. dermatitidis (BRUMMER, E.; HANSON, L. H.; RESTREPO, A.; STEVENS, D. A. In vivo and in vitro activation of pulmonary macrophages by IFN-γ for enhanced killing of Paracoccidioides brasiliensis or Blastomyces dermatidis. J. Immunol., 140: 2786-2789,1988; BRUMMER, E.; HANSON, L. H.;

STEVENS, D. A. IFN-γ activation of macrophages for killing Paracoccidioides brasiliensis: evidence for nonoxidative mechanisms. Int.

J. Immunopharmacol 10: 945-952, 1988).

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11/51 [027] Camundongos com mutação no gene para receptor de IFN-γ (HUANG, S.; HENDRICKS, W.; ALTHAGE, A.; HEMMI, S.; BLUETHMANN,

H.; KAMIJO, R.; VILCEK, J.; ZINKERNAGEL, R. M.; AGUET, M. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science, 259:1742-1745, 1993) são altamente susceptíveis a infecção pelo P.

brasiliensis comparados com animais nativos (TRAVASSOS, L. R.; TABORDA, C. P.; IWAI, L. K.; CUNHA-NETO, E. C.; PUCCIA, R. The gp43 from Paracoccidioides brasiliensis: A major diagnostic antigen and vaccine candidate. In: DOMER, J.E.; KOBAYASHI, G.S. (Ed.). The Mycota XVII, Human Fungal Pathogens. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, 2004. p. 279-296). Considerando estes resultados, pode-se considerar o fragmento P10 da gp43 como um ótimo candidato à terapia gênica para a paracoccidioidomicose.

[028] A gp43 é importante na virulência do fungo, pois é uma molécula ligante de laminina, colaborando na adesão do fungo à célula hospedeira (VICENTINI, A. P.; GESZTESI, J-L.; FRANCO, M. F.; SOUZA, W.; MARAES, J. Z.; TRAVASSOS, L. R.; LOPES, J. D. Binding of Paracoccidioides brasiliensis to laminin throught surface glycoprotein gp43 leads to enhancement of fungal pathogenesis. Infection and Immunity, 62:1465-1469, 1994). Por outro lado, também, verificou-se que o P.

brasiliensis utiliza a gp43 no processo de fagocitose, através de receptor manose-fucose em macrófagos (ALMEIDA, S. R.; UNTERKIRCHER, C. S.; CAMARGO, Z. P. Involvement of the major glycoprotein (gp43) of lairacoccidioides brasiliensis in attachment to macrophages. Med. Mycol., 36:405-411, 1998).

[029] A gp43 apresenta-se através de 4 perfis de isoformas, classificadas como A, B, C e D, os quais diferem quanto aos seus pontos isoelétricos (pIs), sendo o perfil A caracterizado através dos pIs 6,0; 6,3;

6,6 e 7,0, perfil B, pIs 6,4; 6,8 e 7,2, perfil C, pI > 8,5 e perfil D, pIs 5,8;

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6,2 e 6,6. Cada isoforma tem um componente majoritário que é específico para cada perfil (MOURA CAMPOS, M. C.; GESZTESI, J-L.; VICENTINI, A.; LOPES, J. D.; CAMARGO, Z. P. Expression and isoforms of gp43 in different strains of Paracoccidioides brasiliensis. J. Med. Vet. Mycol., 33:223-228, 1995).

[030] Souza e seus colaboradores (SOUZA, M. C.; GESZTESI, J. L.; SOUZA, A. R.; MORAES, J. Z.; LOPES, J. D.; CAMARGO, Z. P. Differences in reactivity of paracoccidioidomycosis sera with gp43 isoforms. J. Med. Vet. Mycol., 35:13-18, 1997) utilizaram ELISA de captura para estudar reação de diferentes isoformas de gp43 com soros de pacientes com PCM. Os resultados obtidos mostram que as isoformas com pIs similares (perfis A e D) não apresentaram diferença significativa quanto a reatividade usando como padrão o perfil de isoforma A. O perfil de isoforma C, mostrou uma redução significativa na reatividade e B mostrou-se mais reativo.

[031] O gene da gp43 foi clonado por Cisalpino e seus colaboradores (CISALPINO, P. S.; PUCCIA, R.; YAMAGUCHI, L. M.; CANO, M. L.; SILVEIRA, J. F.; TRAVASSOS, L. R. Cloning, characterization and epitope expression of the major diagnostic antigen of Paracoccidioides brasiliensis. J. Biol. Chem., 271:4553-4560, 1996), sendo caracterizado por um fragmento de 1,329Kb, dois exons e um íntron. Este foi o primeiro gene de P. brasiliensis a ser seqüenciado e expresso em bactéria como proteínas recombinantes de fusão. Estas proteínas que representavam diferentes regiões da gp43 reagiram positivamente com antisoro policlonal de coelho, monoespecífico anti-gp43 e com soros de pacientes com PCM. O antisoro gerado em coelho contra a proteína recombinante de fusão reconheceu especificamente a proteína nativa em “imunoblotting” do filtrado de cultura de P. brasiliensis.

[032] A publicação de Souza e seus colaboradores (SOUZA, M. C.; CORRÊA, M.; ALMEIDA, S. R.; LOPES, J. D.; CAMARGO, Z. P.

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Immunostimulatory DNA from Paracoccidioides brasiliensis acts as THelper l promoter in susceptible mice. Scand. J. Immunol., 54: 348-356, 2001) demonstra um modelo de proteção utilizando sequência CpG (dinucleotídeo não metilado) também conhecida como sequência imunoestimulatória (ISS), descrito como sequência bacteriana com propriedade imunomoduladora e estimuladora de Th-1. Foram observadas várias sequências CpG não metiladas em P. brasiliensis, uma delas foi sintetizada e utilizada na imunização de camundongos e para testes de fagocitose “in vitro”.

[033] Já de acordo com Cunha e seus colaboradores (CUNHA, D. A.; ZANCOPÉ-OLIVEIRA, R. M.; SOARES FELIPE, M. S.; SALEM-IZAAC, S. M.; DEEP JR., G. S.; SOARES, C. M. A. Heterologous expression, purification, and immunological reactivity of a recombinant HSP60 from Paracoccidioides brasiliensis. Clin. And Diag. Lab. Immunol., Mar; 9(2):374377, 2002) fatores conhecidos como HSP (heat shock protein) também desempenham papel protetor contra doenças infecciosas (MACCHIA, E. A.; MASSONE, A.; BURRONI, D.; COVACCI, A.; CENSINI, S.; RAPPUOLI, R. The HSP60 protein of Helicobacter pylori struture and immune response in patients with gastroduodenal diseases. Mol. Microbiol., 9:645-652, 1993; QUIJADA, L.; REQUENA, J. M.; SOTO, M.; ALONSO, C. During caninecutaneous leishmaniosis the anti HSP70 antibodies are specifically elicited by the parasite protein. Parasitology, 112: 277-284, 1996) e também membros da família das HSP participam em vários processos celulares incluindo atividade como chaperonas (FEDER, M. E.; HOFFMAN, G. E. Heat shock proteins, molecular chaperones and the stress response evolutionary and ecological physiology. Annu. Ver. Physiol. 61:243-282, 1999; HARTL, F. U. Molecular chaperines in cellular protein folding. Nature, 381:571-579, 1996). Em adição a este papel central na transferência de peptídeos através da membrana celular, as HSPs são

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14/51 reconhecidas como importantes moléculas na modulação do sistema imune (DE MAIO, A. Heat shock proteins: facts, thoughts, and dreams. Shock, Jan; 11(1):1-12, 1999). Um dos membros da família das HSPs, a HSP 60 tem demonstrado ser o maior antígeno imunodominante em parasitas e um alvo das respostas humoral e mediadas por células durante infecções (GARBLE, T. R. Heat shock proteins and infection interations of pathogen and host. Experientia 48:635-639, 1992). Respostas imunes para HSP têm sido observadas em infecções causadas por bactérias, protozoários e em modelos experimentais de infecção por fungos (COHEN, L. R.; YOUNG, D. B. Autoimmunity, microbial immunity and the immunological homusculus. Immunol Today 12:105-110, 1991; SCHOEL, B.; KAUFMANN, S. H. E. The unique role of heat shock protein in infections, p. 27-53. In Stress proteins in medicine. W. van EDEN e YOUNG D. B. eds. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996; SHINNICK, T. M. Heat shock proteins as antigens of bacterial and parasitic pathogens. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 167:145-160, 1991; YOUNG, R. A. Stress proteins and immunology. Annu. Ver. Immunol., 8:401-420, 1990).

[034] Segundo Eck e seus colaboradores (ECK, S. L.; WILSON, J. M. Terapia Gênica. In Goodman & Gilman - As Bases Farmacológicas da terapêutica. pp. 55-73 HARDMAN, J. G.; LIMBIRD, L. E.; MOLINOFF, P. B.; RUDDON, R. W.; GOODMAN GILMAN, A. eds. McGraw Hill Interamericana, Mexico-DF, 1996), graças aos avanços na biologia molecular e celular, foram descritas as proteínas mediadoras de muitos processos patológicos enquanto a tecnologia de DNA permite um acesso rápido aos genes que controlam estes eventos. O tamanho, a complexidade e a inacessibilidade celular destas proteínas tornam impossível à transferência ou a modificação por meios farmacológicos.

[035] A terapia gênica supera estas barreiras pela introdução seletiva de DNA recombinante nos tecidos, de modo que, as proteínas

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15/51 biologicamente ativas podem ser sintetizadas dentro das células cuja função deve ser alterada. Como tal, a transferência do DNA recombinante tornou-se fundamental em todas as estratégias de terapia gênica. Inúmeros sistemas de transferência de DNA foram desenvolvidos com base em vias de ciclo de vida dos vírus, encapsulamento de lipossomos, injeção direta e formação de complexos com proteínas carreadoras. Embora originalmente planejado como um tratamento para defeitos monogênicos hereditários constatou-se que a terapia gênica tem aplicações em doenças adquiridas como câncer, doenças cardiovasculares e moléstias infecciosas.

[036] A aplicação de terapia gênica em distúrbios adquiridos ocorreu mais rapidamente do que em defeitos monogênicos, por vários motivos e, dentre as razões importantes está o fato de ter sido difícil obter-se a expressão, em longo prazo, do gene (meses ou anos), que é provavelmente necessária para tratar doenças genéticas. A disponibilidade de um grande número de pacientes candidatos com distúrbios adquiridos possivelmente fatais (sobretudo câncer e AIDS) fornece um cenário clínico para o desenvolvimento de novas estratégias de transferência de DNA que poderão ser aplicadas, mais tarde, aos distúrbios hereditários.

[037] Em oposição às doenças hereditárias, nas quais um defeito genético já foi bem caracterizado, a maioria das aplicações de terapia gênica em doenças adquiridas, a base molecular da doença é menos compreendida. Em vez de corrigir um defeito subjacente conhecido, o enfoque tem sido adicionar novas funções moleculares que consigam mudar o curso da doença, ou bloquear uma função existente.

[038] Devido às limitações potenciais dos vetores virais, foram desenvolvidos agentes não-virais para mediar à captação celular de DNA exógeno. Estes sistemas de transferência de DNA que incluem DNA de plasmídeo não-associado, complexos DNA lipossomo, complexos DNAproteína e partículas de ouro revestidas com DNA são construídas a partir

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16/51 de componentes conhecidos. Portanto, sua composição, ao contrário de virions complexos, é bem definida. Além do mais, sua formação é tecnicamente mais fácil do que a dos vírus e, em muitos casos, esses sistemas de endereçamento de DNA podem ser produzidos sem a necessidade de cultura de células.

[039] Diferentes rotas de administração podem ser utilizadas, como a intramuscular ou intradérmica, com uso de equipamentos sofisticados ou simples injeção. A rota ideal dependerá de vários fatores como tamanho do animal, antígeno a ser expresso e proteção adquirida contra a doença. A melhor escolha pode ser determinada empiricamente (DAVIS, H. L. Intramuscular and intradermal injection of DNA vaccines in mice and primates. In Methods in molecular medicine, vol. 29, DNA vaccines: methods and protocols. pp. 71-77 LOWRIE, D. B.; WHALEN, R.G. eds. Humana Press Inc. Totowa, N.J, 2000).

[040] Vacinas de DNA, utilizando plasmídeos como vetores, têm demonstrado ótimos resultados na proteção contra doenças infecciosas, quando testadas em modelos experimentais. Segundo, Rogers e seus colaboradores (ROGERS, W. O.; GOWDA, K.; HOFFMAN, S. L. Construction and immunogenicity of DNA vaccine plasmids encoding four Plasmodium vivax candidate vaccine antigens. Vaccine, Aug; 6, 17(23-

24):3136-44, 1999) construíram vacinas baseadas em sequência de quatro antígenos de Plasmodium vivax, as construções induziram altos níveis na expressão de anticorpos específicos em camundongos imunizados. Outros exemplos experimentais podem ser citados como a proteção obtida em camundongos BALB/c, contra Plasmodium yoelli, imunizados com plasmídeos contendo o gene da HSP60 (SANCHEZ, G. I.; SEDEGAH, M.; ROGERS, W. O.; JONES, T. R.; SACCI, J.; WITNEY, A.; CARUCCI, D. J.; KUMAR, N.; HOFFMAN, S. Immunogeneticy and protective efficacy of a Plasmodium yoelii HSP60 DNA vaccine in BALB/c mice. Infection and

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Immunity, jun, 69 (6):3897-3905, 2001), neste caso, a proteção foi conseguida com a conjunta administração de GM-CSF murino. Proteção parcial contra Leishmania mexicana pode ser obtida em camundongos BALB/c após a imunização com plasmídeos contendo genes para os antígenos de Cpb, gp63 de Leishmania mexicana e gp46 de Leishmania amazonensis (DUMONTEIL, E.; RAMIREZ-SIERRA, M. J.; ESCOBEDOORTEGON, J.; GARCIA-MISS, M. R. DNA vaccines induce partial protection against Leishmania mexicana. Vaccine, May; 21(17-18): 21612168, 2003).

[041] Estudos de tolerância, segurança e resposta imune em humanos têm sido realizados para verificar a viabilidade do uso de vacinas de DNA.

[042] De acordo com Le e seus colaboradores (LE, T. P.; COONAN, K. M.; HEDSTROM, R. C.; CHAROENVIT, Y.; SEDEGAH, M.; EPSTEIN, J. E.; KUMAR, S.; WANG, R.; DOOLAN, D. L.; MAGUINE, J. D.; PARKER, S. E. HOBART, P.; NORMAN, J.; HOFFMAN, S. L. Safely, tolerability and humoral immune responses after intramuscular administration of malaria DNA vaccine to healthy adult volunteers. Vaccine, Mar; 17;18 (18):1893901, 2000) foram realizadas imunizações em voluntários adultos, saudáveis. Os voluntários receberam vacinação de diferentes dosagens de plasmídeo contendo a sequência para expressão de uma proteína de Plasmodium falciparum (PfCSP) e foram acompanhados por 12 meses, recebendo três injeções por via intramuscular. Nenhum dos voluntários apresentou significante alteração quanto a sintomas sistêmicos ou de reação local. Todos tiveram ótima resposta imune celular e apresentaram anticorpos específicos ao antígeno administrado.

[043] A publicação de Martin e seus colaboradores (MARTIN, E.; KAMATH, A. T.; BRISCOE, H.; BRITTON, W. J. The combination of plasmid interleukin-12 with a single DNA vaccine is more effective than

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Mycobacterium bovis (bacille Calmette-Guerin) in protecting against systemic Mycobacterium avium infection. Immunology, Jun; 109(2): 308314, 2003) demonstra a construção de um plasmídeo contendo o gene de uma proteína de 35.000 MW comum a Mycobacterium avium e Mycobacterium leprae (ausente em Mycobacterium tuberculosis). Camundongos imunizados com este vetor apresentaram significante proteção quando infectados com M. avium e M. leprae, porém, o nível de proteção foi equivalente ao obtido com a vacina convencional (BCG).

[044] Estudos de Jiang e seus colaboradores (JIANG, C.; MAGEE, D. M.; COX, R. A. Coadministration of interleukin 12 expression vector with antigen 2 cDNA enhances induction of protective immunity against Coccidioides immitis. Infect Immun. 67(11):5848-53, 1999), também testaram co-imunização com um antígeno de Coccidioides immitis conhecido como Ag2 e IL-12. A proteção obtida com a co-imunização foi superior, quando comparada com a oferecida pelos dois fatores, separadamente administrados em camundongos BALB/c.

[045] A imunização contra PCM utilizando vacinas plasmidiais foi realizada por Pinto e seus colaboradores (PINTO, A. R.; PUCCIA, R; DINIZ,

S. N.; FRANCO, M. F.; TRAVASSOS, L. R. DNA-based vaccination against murine paracoccidioidomycosis using the gp43 gene from Paracoccidioides brasiliensis. Vaccine, Jul 1; 18(26):3050-3058, 2000). Camundongos

BALB/c foram imunizados por via intradérmica e intramuscular com o plasmídeo pVR1012 contendo o gene da gp43. O protocolo seguido incluiu quatro imunizações em intervalos de duas semanas, e posterior infecção com P. brasiliensis. A rota intramuscular apresentou os melhores resultados. Nos camundongos imunizados observou-se resposta imune celular via linfócitos T e B, altos títulos de anticorpos, e não foram encontradas células fúngicas em órgãos como pulmão, fígado e baço. Células linfóides destes camundongos imunizados foram re-estimuladas

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19/51 “in vitro” com gp43 e produziram quantidades substanciais de IL-2 e IFNγ, porém IL-4, IL-5, IL-10 e IL-12 não foram detectadas. A alta concentração IFN-γ manteve-se “in vivo” e “in vitro” por um longo período, sinalizando a grande proteção obtida com a imunização realizada. Os altos títulos só decresceram a partir do 6° mês pós-imunização.

[046] A alta incidência de reação de sensibilidade epidérmica (6075%) em população adulta de áreas endêmicas (RESTREPO, A. Ecology of Paracoccidioides brasiliensis. In Paracoccidioidomycosis. pp. 121-130 FRANCO, M.; LACAZ, C. S.; RESTREPO-MORENO, A.; DEL NEGRO, A. eds. Paracoccidioidomycosis. CRC Press, Flórida-USA, 1994) aponta para a relevância da Paracoccidioidomicose na América do Sul, onde se considera que aproximadamente 10 milhões de pessoas estejam infectadas e até 2% delas possa desenvolver a doença (McEWEN, J. G.; GARCIA, A. M.; ORTIZ, B. L.; BOTERO, S.; RESTREPO, A. In search of the natural habitat of Paracoccidioides brasiliensis. Arch. Med. Res. 26:305-306, 1995).

[047] O sistema ideal de transferência de DNA seria aquele que aceitasse uma grande variação de tamanho de DNA inserido, fosse disponível em forma concentrada, fosse facilmente produzido e pudesse ser dirigido para tipos específicos de células, não permitindo a replicação do DNA, dando uma expressão em longo prazo do gene, e não fosse tóxico nem imunogênico.

[048] Nenhuma das tecnologias de transferência é perfeita com relação a nenhum destes tópicos. Entre as tecnologias aplicadas destacam-se as de transferência de DNA através de vetores virais como, por exemplo, os vetores retrovirais que são os mais aplicados e oferecem potencial de expressão em longo prazo, porém, sua aplicação é limitada a células em divisão e sua purificação e concentração são complicadas devido à instabilidade do vírus.

[049] Os vetores de adenovírus são capazes de transduzir em amplo

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20/51 espectro de tecidos humanos, mas são limitados por sua duração de expressão do transgene relativamente curta. O vírus adeno-associado tem muitas das características desejáveis dos retrovírus e adenovírus, ele é capaz de se integrar eficientemente ao genoma de células que não se dividem e é estável a uma variedade de manipulações químicas e físicas, a limitação do seu uso está na dificuldade de produzi-lo em grandes quantidades.

[050] Diante de todo o exposto, a Depositante desenvolveu uma nova formulação vacinal construída a partir de vetores plasmidiais contendo a sequência de DNA do peptídeo P10.

Descrição das Figuras [051] A figura 1 mostra a dosagem de citocina IFN-γ através do método de ELISA utilizando-se sobrenadante de cultura de células do baço estimuladas com 20 gg/ml de P10. Foram utilizados como controles: somente meio de cultura (controle 1), sobrenadante de células de baço de animais não vacinados (controle 2), sobrenadante de células de baço de animais vacinados somente com o vetor pCDNA3 sem inserto ou vacinados com ambos pCDNA3 sozinho e vetor contendo inserto do P10, onde, * indica diferença estatística, sendo p<0.05 em comparação ao grupo controle 2.

[052] A figura 2 demonstra UFCs de pulmão (P), baço (B) e fígado (F) de camundongos BALB/c vacinados com os vetores contendo os insertos do P10, da IL-12 ou da HSP60 e infectados intratraquealmente com 5 x 10⁵ leveduras de Pb18. Foram utilizados, como controles animais, somente infectados (infectado) ou vacinados com vetor sem inserto (pCDNA3 ou Porf).

[053] A figura 3 apresenta a dosagem de citocina IL-12 p70 (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e

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21/51 vacinados com vetores contendo P10, IL-12 ou HSP60. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não vacinados, animais vacinados com pCDNA3 ou Porf sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle), sendo, □ 30 dias e 60 dias.

[054] A figura 4 refere-se a dosagem de IFN-gama (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e vacinados com vetores contendo P10, IL-12 ou HSP60. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não vacinados, animais vacinados com pCDNA3 ou Porf sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle), sendo, □ 30 dias e 60 dias.

[055] A figura 5 apresenta a dosagem de citocina IL-4 (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e vacinados com vetores contendo P10, IL-12 ou HSP60. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não vacinados, animais vacinados com pCDNA3 ou Porf sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle), sendo, □ 30 dias e 60 dias.

[056] A figura 6 representa a dosagem de citocina IL-10 (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e vacinados com vetores contendo P10, IL-12 ou HSP60. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não vacinados, animais vacinados com pCDNA3 ou Porf sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle), sendo, □ 30 dias e 60 dias.

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22/51 [057] A figura 7 mostra os UFCs de pulmão (P), baço (B) e fígado (F) de camundongos BALB/c infectados intratraquealmente com 5 x 10⁵ leveduras de Pb18 e tratados com os vetores contendo os inserto do P10 e da IL-12 Foram utilizados, como controles animais, somente infectados(infectado) ou tratados com vetor sem inserto (pCDNA3), sendo, □ 30 dias e 60 dias.

[058] A figura 8 revela a dosagem de citocina IL-12 p70 (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e tratados com vetores contendo P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle).

[059] A figura 9 apresenta a dosagem de IFN-γ (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e tratados com vetores contendo P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle).

[060] A figura 10 trata da dosagem de citocina IL-4 (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e tratados com vetores contendo P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não tratados, animais tratados com PcDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle).

[061] A figura 11 trata da dosagem de citocina IL-10 (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de

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23/51 camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e tratados com vetores contendo P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle).

[062] A figura 12 refere-se às UFCs de pulmão (P), baço (B) e fígado (F) de camundongos B10.A infectados intratraquealmente com 5 x 10⁵ leveduras de Pb18 e tratados com os vetores contendo os inserto do P10 e da IL-12 Foram utilizados, como controles animais, somente infectados(infectado) ou tratados com vetor sem inserto (pCDNA3).

[063] A figura 13 apresenta a dosagem de citocina IFN-gama (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de camundongos B10.A, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e tratados com vetores contendo P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle).

[064] A figura 14 mostra a dosagem de citocina IL-12 (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de camundongos B10.A, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e tratados com vetores contendo P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle).

[065] A figura 15 revela a dosagem de citocina IL-10 (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e tratados com vetores contendo P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não tratados, animais

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24/51 tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle).

[066] A figura 16 mostra a dosagem de citocina IL-4 (pg/g de tecido) através do método ELISA com homogeneizado dos pulmões de camundongos B10.A, infectados intratraquealmente com P. brasilensis e tratados com vetores contendo P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle).

[067] A figura 17 apresenta as análises, por ELISA, dos diferentes isotipos presentes no soro de camundongos BALB/c imunizados com os vetores de interesse e posteriormente infectados com Pb18, após 30 e 60 dias de infecção, onde, as figuras A-E apresentam na coluna da esquerda os grupos de 30 dias e a da direita, os grupos de 60 dias.

[068] A figura 18 apresenta as análises, por ELISA, dos diferentes isotipos presentes no soro de camundongos BALB/c e B10.A infectados com Pb18 e tratados com os vetores de interesse, após 30 de tratamento, onde, as figuras A-E apresentam na coluna da esquerda os grupos de BALB/c e a da direita, os grupos B10.A.

[069] A figura 19 representa o desenho da clonagem de um gene em vetor de DNA constituído por uma sequência que codifica um peptídeo com 15 aminoácidos (QTLIAIHTLAIRYAN), nomeado P10. Tal sequência clonada foi obtida a partir de extração de RNA total de P. brasiliensis, RT-PCR e PCR com iniciadores específicos retirados do gene da gp43, sendo, a sequência clonada em vetor plasmidial pCDNA3 na ordem de leitura 5'CAA ACC CTG ATC GCC ATC CAT ACT CTC GCA ATC CGT TAC GCC AAT - 3'.

Descrição da Invenção [070] A presente invenção destina-se a formulações farmacêuticas

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25/51 vacinais contendo vetores recombinantes plasmidiais construídos a partir da sequência de DNA do peptídeo P10 e/ou combinados a outros vetores. Ainda, o presente pedido trata do uso desses vetores recombinantes no preparo de formulações farmacêuticas aplicadas em doenças infecciosas, particularmente, paracoccidioidomicose (PCM).

[071] Em uma primeira realização a presente invenção trata de formulações farmacêuticas vacinais com um vetor recombinante construído por um mini gene de DNA constituído por pelo menos uma sequência que codifica um peptídeo com 15 aminoácidos (QTLIAIHTLAIRYAN), nomeado P10, na qual estão incluidos os resíduos 181 a 195 do gene da gp43.

[072] A sequência clonada corresponde aos aminoácidos obtidos a partir de extração de RNA total de P. brasiliensis, RT-PCR e PCR com iniciadores específicos retirados do gene da gp43.

[073] A presente sequência ainda pode ser obtida, de forma particular, pela clonagem em vetor plasmidial pCDNA3 na ordem de leitura 5'- CAA ACC CTG ATC GCC ATC CAT ACT CTC GCA ATC CGT TAC GCC AAT.

[074] De forma adicional, o presente pedido de patente apresenta formulações farmacêuticas vacinais contendo a combinação de vetores plasmidais recombinantes, tais como, vetores para expressão de P10 a partir de extração de RNA total de Paracoccidioides brasiliensis, IL-12 e/ou HSP60. Foram utilizados os vetores de forma combinatória, ou seja, as coimmunizações utilizando P10 com IL-12, P10 com HSP-60, IL-12 com HSP60 e co-imunização utilizando os três vetores, P10 com IL-12 e com HSP60.

[075] Em uma segunda realização o presente pedido pleiteia o uso das sequências de DNA e/ou seus vetores recombinantes no preparo das composições vacinais com atividades em doenças infecciosas,

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26/51 particularmente, paracoccidioidomicose (PCM).

Exemplos

Obtenção de RNA de P. Brasiliensis [076] Células leveduriformes do isolado Pb18 de P. brasiliensis foram cultivadas em meio líquido UBA (tabela 1) por 5 dias, sob agitação a 150 rpm, a 37°C. Aproximadamente 20 g de células foram maceradas em nitrogênio líquido. Após a lise das células, foram adicionados 5 mls de TRIZOL (Invitrogen). Seguiu-se incubação por 5 minutos, à temperatura ambiente e foram adicionados 0,2 mls de clorofórmio. Após agitação do material, por 15 segundos, o mesmo foi incubado por 3 minutos, à temperatura ambiente. O macerado foi centrifugado por 15 minutos, a 12.000 g, a 5°C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e a este foi acrescentado 0,5 ml de isopropanol (Merck). O material foi incubado por 10 minutos, à temperatura ambiente e centrifugado por 10 minutos, a 12.000 g, a 5°C. O sobrenadante foi descartado e ao “pellet” acrescentouse 1 ml de etanol (Merck) a 70%. Após agitação, o material foi centrifugado por 5 minutos, a 7.500 g, a 5°C. O sobrenadante foi descartado e o “pellet” ressuspenso em 50 μl de água pura estéril. O produto obtido foi incubado por 10 minutos, a 60°C e armazenado em freezer -70°C.

Tabela 1 - Meio UBA

Extrato de Levedura	6,1 g
Dextrose	16,1 g
Peptona	15 g
K2HPO4	0,31 g
MgSO47H2O	0,12 g
MnSO4H2O	0,006 g
NaCl	0,006 g
FeSO4	0,006 g

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H2O destilada q.s.p. 1 L

Obtenção de cDNA de P. Brasiliensis por Transcrição Reversa [077] A uma alíquota de 3 μΐ de RNA total, foram adicionados 1 pg de “primer” oligo(dT)18 e 8,5 pl de água pura estéril. A solução foi incubada por 10 minutos, a 70°C, colocada em gelo para resfriar, centrifugada por 3 segundos e novamente colocada em gelo. A reação foi concluída após a adição dos seguintes reagentes, em concentrações finais: Tampão de reação 1X para a transcriptase reversa Revertaid M-MuLV, 10 mM DTT (Sigma-Aldrich), 2,5 mM dNTP Mix, 100 unidades de RNAguard (Amersham) e 1 pl de água pura estéril. O material foi incubado por 2 minutos, a 42°C e a ele foram adicionadas 200 unidades de Revertaid MMuLV. A solução foi incubada por 2 horas, a 42°C e posteriormente, a enzima foi inativada por incubação durante 15 minutos, a 70°C.

[078] Para a purificação do material, foi realizada uma precipitação onde foi adicionado, ao cDNA obtido, 2,5 pl de 3M NaAc (Sigma) e 62,5 pl de etanol (Merck) absoluto. O material foi incubado por 15 minutos, a 80°C, centrifugado por 10 minutos, a 15.000 g. O sobrenadante foi descartado e o “pellet” foi lavado com 1 ml de etanol (Merck) a 75%, centrifugado por 10 minutos, a 15.000 g, secado e ressuspenso em 40 pl de água pura estéril.

Amplificação da Sequência de DNA que Expressa o Peptídeo 10 (P10) por PCR [079] Foi construído um par de “primers” para amplificar a sequência P10, com 15 aminoácidos, anteriormente descrita por TABORDA (1998). O “primer forward” (P10A) contém um sítio de restrição para a enzima HIND III, em sua porção 5' e o “primer reverse” (P10B), contém em sua porção 5', um sítio de restrição para Eco RI. Desta forma, a reação de PCR produziu um produto amplificado de 63 bp (pares de bases). As sequências dos “primers” foram as seguintes:

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P10A - 5'- AAT AAG CTT CAA ACC CTG ATC GCC - 3'

P10B - 5'- AAT GAA TTC ATT GGC GTA ACG GAT TGC - 3' [080] Para a PCR foi preparada uma mistura de reação de 25 pL contendo 100 ng de cDNA, tampão 1X para Taq DNA polimerase, 0,8 mM dNTP Mix, 2 mM MgCl2, 100 ng P10A, 100 ng P10B e 1 unidade de Taq DNA polimerase.

[081] A ampilficação foi realizada com denaturação inicial por 2 minutos, a 94°C, 40 ciclos com denaturação por 30 segundos, a 94°C, anelamento por 1 minuto, a 55°C e extensão por 1 minuto, a 72°C. A extensão final foi de 7 minutos, a 72°C.

[082] A visualização do produto obtido foi feita através de eletroforese em gel de agarose (Invitrogen) a 2%, em tampão TAE (tabela 2). A coloração foi feita com brometo de etídeo (Bio-Rad) acrescentado ao gel (0,5 p/ml de gel).

Tabela 2 - Eletroforese de amostras de DNA

Tampão de corrida - TAE 50X		0,8 g
Tris base		121g
Ácido acético		28,55 ml
0,5M EDTA		50 ml
H2O	q.s.p.	500 ml
Ajustar pH para 8,0		16 ml
Solução de uso 1X

Tampão de amostra
Azul de bromofenol		0,0125 g
Glicerol		1,19 ml
H2O	q.s.p.	5 ml

Amplificação Da Sequência De DNA que Expressa A HSP60 por PCR

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29/51 [083] Foi construído um par de “primers” para amplificar a sequência HSP60, com 1.926 bp (incluindo “íntron”), descrita por IZACC et al. (2001). O “primer forward” (HSP60A) contém um sítio de restrição para a enzima HIND III, em sua porção 5' e o “primer reverse” (HSP60B), contém em sua porção 5', um sítio de restrição para Eco RI. As sequências dos “primers” foram as seguintes:

HSP60A - 5'- AAT AAG CTT ATG CAG CGA GCT TTT ACT - 3' HSP60B - 5'- AAT GAA TTC CTA GAA CAT ACC CCC G - 3' [084] Para a PCR foi preparada uma mistura de reação de 25 pL contendo 100 ng de cDNA, tampão 1X para Taq DNA polimerase, 0,8 mM dNTP Mix, 2 mM MgCl2, 100 ng HSP60A, 100 ng HSP60B e 1 unidade de Taq DNA polimerase.

[085] A amplificação foi realizada com desnaturação inicial por 2 minutos, a 94°C, 40 ciclos com desnaturação por 30 segundos, a 94°C, anelamento por 1 minuto, a 47°C e extensão por 2 minutos, a 72°C. A extensão final foi de 7 minutos, a 72°C.

[086] A visualização do produto obtido foi feita através de eletroforese em gel de agarose (Invitrogen) a 2%, em tampão TAE (Apêndice C). A coloração foi feita com brometo de etídeo acrescentado ao gel (0,5 p/ml de gel).

Isolamento dos Produtos de PCR para Tratamento com Enzima de

Restrição [087] Através de transiluminador de luz UV, as bandas específicas de DNA de P10 e HSP60 foram visualizadas e retiradas com auxílio de uma pequena espátula. Os fragmentos foram transferidos para microtubos e seguiu-se o procedimento de purificação do DNA de acordo com o “kit” comercial “Gel Extraction Systems” (Marligen).

[088] Para 400 mg de gel foram adicionados 1,2 ml de tampão de solubilização. A solução foi incubada por 15 minutos, a 50°C, com agitação

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30/51 a cada 5 minutos Após a dissolução completa do gel, incubou-se por mais 5 minutos, na mesma temperatura. A solução foi transferida para um microtubo contendo fibra de retenção de ácidos nucléicos, encaixado em um tubo de descarte. O conjunto foi centrifugado por 1 minuto, a 12.000 g. O líquido filtrado foi descartado e, ao microtubo com fibra, foram acrescentados 700 pl do tampão de lavagem. O material foi incubado por 5 minutos, à temperatura ambiente e centrifugado por 1 minuto, a 12.000 g. O filtrado foi descartado e, ao mesmo microtubo, foram acrescentados 50 pl de tampão TE a 70°C. O material foi incubado por 1 minuto, à temperatura ambiente, para eluição do DNA. Para a coleta do material, o microtubo com fibra, encaixado a um tubo coletor, foi centrifugado por 2 minutos, a 12.000 g.

Tratamento das Amostras com Enzima de Restrição [089] Os fragmentos isolados de gel de agarose e o plasmídeo pCDNA3 (Invitrogen) foram tratados com HIND III e Eco RI, onde, em um microtubo, preparou-se uma solução contendo 500 ng de DNA, tampão para HIND III 1X e 10 unidades de HIND III. A solução foi incubada por 2 horas, a 37°C e inativada por 20 minutos, a 65°C.

[090] A precipitação do material foi realizada para o posterior tratamento com Eco RI. Acrescentou-se 1/10 do volume da reação acima com 3M NaAc e 2,5 vezes o volume de etanol. O material foi agitado e centrifugado por 10 minutos, a 12.000 g. O sobrenadante foi descartado e o “pellet” lavado com 500 pl de etanol a 70%. O material foi centrifugado por 15 minutos, a 12.000 g, secado e ressuspenso em 44 pl de água pura estéril. Acrescentou-se 5 pl de tampão para Eco RI e 10 unidades de Eco RI. A solução foi incubada por 2 horas, a 37°C e inativada por 20 minutos, a 65°C.

Ligação dos Fragmentos de PCR ao Vetor PCDNA3 [091] Foram utilizadas diferentes concentrações de vetor, insertos e

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31/51 enzima T4 DNA ligase. Particularmente, a combinação que mostrou maior eficiência para a ligação de pCDNA3 a PIO consiste de 200 ng do vetor incubado com 300 ng de inserto PIO, na presença de tampão da enzima T4 DNA ligase e 3 unidades da enzima T4 DNA ligase. A solução com volume total de 20 μΐ, foi incubada por 12 horas, a 16°C e inativada por 10 minutos, a 65°C.

[092] A ligação de pCDNA3 ao inserto HSP60 seguiu o mesmo procedimento, com resultados positivos para o fragmento HSP60 nas concentrações de 300 ng e 750 ng.

Preparo das Amostras Bacterianas Eletrocompetentes [093] Foi realizado o esgotamento de uma amostra de E. coli da linhagem XL 1 Blue (recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac [F'proAB lacHZMIS TnlO (Tet^r)]) (Stratagene), e uma de E. coli da linhagem DH5-O. (F“ Φ80άΖαοΖΔΜ15 A(ZacZYA-nrgrF) U169 recAl endAl hsdR17(rk~ ,mk⁺)phoAsupE44X-thi-lgyrA96relAl) (Invitrogen) em placa de Petri contendo meio LB (Sigma) a 20g/L, 1,5% de ágar (Difco), na presença de 20 μg/ml de tetraciclina (Sigma). Após incubação em estufa a 37°C, um clone foi selecionado e adicionado a um tubo contendo 5 ml de meio líquido LB, na presença de tetraciclina. Após incubação O.N., a 37°C, sob agitação a 150 rpm, frações de 1 ml foram acrescentadas a 99 ml de meio líquido novo e crescidas, sob agitação até atingirem a leitura de 0,5-0,6 para DOõoo.

[094] Alíquotas de 15 ml foram centrifugadas por 20 minutos, a 5.000 g, a 4°C. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em 15 ml de água estéril e gelada. As amostras foram centrifugadas por 40 minutos, a 5.000 g, a 4°C e o sobrenadante foi, novamente descartado. As células foram ressuspensas em 8 ml de água estéril e gelada, centrifugadas por 10 minutos, a 5.000 g e a 4°C. Descartou-se o sobrenadante e às células, foi adicionado 1 ml de glicerol a

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10% em água. Centrifugou-se o material por 10 minutos, a 5.000 g e a 4°C, descartou-se o sobrenadante. As células foram ressuspensas em 100 μl de glicerol a 10% e congeladas, em alíquotas de 50 pl, em freezer a -70°C.

Eletroporação [095] A uma cubeta de eletroporação de 2 mm (Thermo Hybaid), foi adicionada uma alíquota de 50 pl de XL1Blue ou DH5-a eletrocompetentes, e 2 pl (20 ng) de pCDNA3 contendo P10 ou HSP60. As amostras foram mantidas em gelo por 1 minuto e a cubeta foi inserida no eletroporador (Thermo Hybaid). A eletroporação seguiu os parâmetros do equipamento determinadas para E. coli (2.500 V, capacitância de 25 pF e resistor de 201 R). Imediatamente, as células foram ressuspensas em 1 ml de meio SOC (tabela 3) à temperatura ambiente e submetidas à agitação por 2 hs, a 100 rpm. As células foram semeadas em placas LB/ágar contendo 50 pg/ml de ampicilina (Sigma) (para seleção de clones contendo o vetor de interesse) e crescidas O.N., em estufa a 37°C.

Tabela 3 - Meio SOC

Triptona		20 g
Extrato de levedura		5 g
NaCl		0,5 g
H2O	q.s.p.	950 ml
Após dissolver acrescentar:
250mM KCl		10 ml
Ajustar pH para 7,0
H2O	q.s.p.	1 L
2M MgCl2		5 ml
1M Glucose		20 ml

Mini-Prep e Identificação de Clones Positivos [096] Todos os clones crescidos em meio seletivo, foram adicionados

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33/51 em 5 ml de meio líquido LB na presença de 50 μg/ml de ampicilina e submetidas a crescimento O.N. Os vetores de interesse foram extraídos da seguinte forma, 1,5 ml de cultura foi centrifugado por 5 minutos, a 5.000 g. Parte do sobrenadante foi descartado e aos 100 μl restantes, junto ao “pellet”, foram adicionados 300 μl de meio TENS (tabela 5). Misturou-se por inversão e foi acrescentado, à mistura, 150 μl de 3M NaAc, pH 5,5. Após agitação, o material foi centrifugado por 5 minutos, a 10.000 g. Ao sobrenadante, adicionou-se 1 ml de etanol e a solução foi agitada. Centrifugou-se por 5 minutos, a 10.000 g, o sobrenadante foi descartado e o “pellet” submetido à secagem. O material foi ressuspenso em 30 μl de tampão TE (tabela 4) contendo10 μg/ml de RNAse A (Amersham).

Tabela 4 - Tampão TE

Tris base		0,12 g
0,5M EDTA		0,2 ml
H2O	q.s.p.	90 ml
Ajustar pH para 7,5
H2O	q.s.p.	100 ml

Tabela 5 - Meio TENS

Tampão TE	4,5 ml
10% SDS	250 μL
2NaOH	250 μL

[097] Os resultados obtidos com as diferentes linhagens de E. coli mostraram diferença na estabilidade para o vetor contendo o inserto HSP60, sendo a linhagem DH5-a a mais adequada para este inserto.

[098] Alíquotas das culturas bacterianas originárias de cada clone foram congeladas em 20% de glicerol, em freezer a -70°C.

[099] O clone de IL-12 murina obtido da InvivoGen, pORF-mIL-12, foi crescido em meio LB na presença de 50 μg/ml de ampicilina.

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34/51 [100] A identificação dos clones positivos foi obtida por meio de eletroforese em gel de agarose, tanto dos produtos da mini-prep, quanto de amostras da mini-prep tratadas com enzimas de restrição. Para o pCDNA3 contendo inserto P10, a forma de identificação foi por PCR dado o pequeno tamanho do inserto, que tornou difícil a discriminação entre o pCDNA3 puro e o com inserto P10.

[101] Os procedimentos para tratamento com enzimas de restrição e o de PCR seguiram os protocolos já descritos anteriormente.

Seqüenciamento das Amostras [102] Os “primers” utilizados na construção dos produtos amplificados foram para detecção do clone de IL-12 - PCRIL12F (“forward”) - 5’-CGG GTT TGC CGC CAG AAC ACA - 3' e PCRIL12R (“reverse”) - 5’GGC CAC CAG CAT GCC CTT GT - 3’, com obtenção de um produto amplificado de 900pb. Para detecção de P10 - SEQDNA3F (“forward”) - 5’GGG CGG TAG GCG TGT ACG GTG - 3’ e PCRDNA3R (“reverse”) - 5”- GGC ACC TTC CAG GGT CAA GG -3’, sendo o produto amplificado obtido de 300pb. Para detecção de HSP60 - SEQDNA3F (“forward”) - 5’- GGG CGG TAG GCG TGT ACG GTG - 3’ e pCDNA3R3 (“reverse”) - 5’- GGC GTC GGA GAC TTG - 3’, para um produto de 1,2 Kb; primer HSP60A - 5’- AAT AAG CTT ATG CAG CGA GCT TTT ACT - 3’ e PCRDNA3R (“reverse”) - 5”- GGC ACC TTC CAG GGT CAA GG -3’, sendo o produto amplificado de 2 Kb. A mistura para reação de PCR foi à mesma citada anteriormente e os programas de amplificação foram para P10 e HSP60, denaturação inicial por 2 minutos, a 94°C, 40 ciclos com denaturação por 30 segundos, a 94°C, anelamento por 1 minuto, a 47°C e extensão por 2 minutos, a 72° C. A extensão final foi de 7 minutos, a 72°C. Para IL12, denaturação inicial por 2 minutos, a 94°C, 30 ciclos com denaturação por 30 segundos, a 94°C, anelamento por 1 minuto, a 45°C e extensão por 2 minutos, a 72°C. A extensão final foi de 7 minutos, a 72°C.

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35/51 [103] Após amplificação, as amostras foram purificadas em colunas seguindo-se o protocolo para produtos de PCR do kit comercial “Gel Extraction Systems” (Marligen), e foram quantificadas em gel de agarose através do padrão de quantificação “High DNA Mass Ladder” (Invitrogen).

[104] A reação de seqüenciamento foi composta de 300 ng de DNA, 10 pmol de “primer”, Big Dye (Applied Biosystems) e tampão específico. A mistura final de 10 ql foi submetida a protocolo específico para obtenção de fitas marcadas, sendo a desnaturação inicial por 1 minuto, a 96°C, 25 ciclos com desnaturação por 10 segundos, a 96°C, anelamento por 10 segundos, a 50°C e extensão por 4 minutos, a 60°C. O material obtido foi precipitado, através do acréscimo de 30 ql de água estéril, 60 ql de álcool isoamílico (Merck), permanecendo, por 15 minutos à temperatura ambiente, centrifugado por 25 minutos, a 10.000 g. O sobrenadante foi retirado e o precipitado foi lavado com álcool isopropilico a 75%, centrifugado por 10 minutos, a 10.000 g. O sobrenadante foi retirado e o precipitado submetido à secagem a vácuo, por 20 minutos, a 60°C.

[105] Posteriormente, as amostras foram submetidas ao seqüenciamento automático (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer - Applied Biosystems) e os resultados analisados através dos programas BioEdit e Blast.

Transfecção Transients de Células de Mamíferos [106] Células Hela, na concentração final de 2x10⁵/orifício, foram cultivadas em placas de 35 mm na presença de RPMI acrescido de 10% de soro fetal bovino e mantidas em estufa com 5% de CO2 a 37°C por 24 horas.

[107] Após o período inicial de adaptação e estabilização das células Hela, os vetores foram adicionados (2 ql de DNA/orifício de cada vetor contendo o seu respectivo inserto) na presença de lipofectina (Invitrogen) diluídos em meio RPMI (na ausência de soro fetal bovino e antibióticos) e incubados em estufa com 5% de CO2 a 37°C por 6 horas e depois

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36/51 substituído por meio RPMI contendo 10% de soro fetal bovino e antibióticos.

[108] Dezoito horas após a incubação, o sobrenadante de cada placa foi removido e analisado quanto a presença de IL-12 (ELISA) e HSP-60 (Western blot). As células foram então submetidas à extração com Trizol (Invitrogen) e o RNA utilizado para análise.

Extração com Trizol [109] Em cada orifício da placa, depois de retirado do sobrenadante, foi adicionado 2 ml de Trizol (Invitrogen) e posteriormente transferido para um tubo tipo eppendorf contendo 200 pl de clorofórmio (Merck). Após agitação em vórtex, o material foi centrifugado a 10.000 g por 15 minutos, a fase superior foi transferida para outro tubo contendo 500 pl de isopropanol (Merck), homogeneizado e novamente centrifugado a 12.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e 1 ml de etanol (Merck) a 75% foi adicionado e novamente centrifugado a 7.500 g por 5 minutos sendo descartado ao final do procedimento.

[110] O sedimento foi seco em fluxo laminar por 15 minutos e ressuspendido em 40 pl de água MilliQ estéril e armazenado em freezer 70° C até o momento de ser submetido a transcrição reversa e PCR conforme descrito anteriormente.

Determinação da HSP60 por Western Blot

Extrato Celular de Hela [111] Para a extração das proteínas de HeLa, as células foram lisadas com tampão de lise contendo NP-40 e uma solução de inibidores proteolíticos (10mM 1,10 - fenantrolina, 10mM E64, 10 mM PMSF e 10 mM EDTA, (Sigma). Após a adição desta solução, seguiram-se cinco ciclos no vórtex (2 minutos) intercalados com banhos de gelo (2 minutos). O extrato citoplasmático foi obtido após centrifugação a 10.000 g por 10 minutos. Uma segunda extração foi realizada utilizando Triton X-114 a

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2%, para extração das proteínas de superfície como descrito por Pinto e seus colaboradores (2004) e Bordier (1981).

Determinação do Perfil de Proteínas Totais [112] Para a análise das proteínas totais expressas nas células HeLa e no sobrenadante de cultura foi realizado SDS-PAGE a 10 %, contendo 4% de gel de empacotamento, de acordo com o sistema descrito por Laemmli (1970). Aos extratos foram adicionados tampão de amostra contendo 5% de 2-mercaptoetanol. O sistema foi aquecido por 5 minutos, a 100°C. Os géis foram carregados com 20pl de amostra e a eletroforese processada a 100 V. As proteínas foram reveladas através da coloração com Coomassie Blue.

Western Blotting [113] Os extratos protéicos de HeLa e o sobrenadante de cultura, separados através de SDS-PAGE 10%, foram transferidos para membrana de nitrocelulose segundo o método descrito por Towbin, Staehelin & Gordon (1979).

[114] Após a transferência, a membrana foi incubada por 18 horas a 4°C em tampão de bloqueio (TBS pH 7,2; Tween 20 0,1%; BSA 5%). Em seguida, a membrana foi lavada 3 vezes, 10 minutos cada, com TBS-0,1% Tween 20. A membrana foi incubada por 2 horas, sob agitação, com o anticorpo monoclonal contra Hsp60 (gentilmente cedido pelo Dr Josh Nosanchuk, AECOM-EUA), a 25°C, na concentração de 20 pg/ml. A membrana foi novamente lavada com TBS 0,1% Tween 20 e incubada com um anti-IgG de camundongo conjugado à peroxidase (1:3000). Após 2 horas, a membrana foi lavada e incubada com o substrato para peroxidase (7,5 mg diaminobenzidina (DAB) em solução de revelação contendo TrisHCl 1,5M, pH 7,4; 20 pl de H2O2 e 14 ml de água destilada) até o desenvolvimento de cor.

Determinação da Atividade do Vetor contendo o Inserto do P10

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38/51 [115] Camundongos BALB/c machos, com a média de idade entre 6 a 8 semanas, foram imunizados no quadríceps da coxa, por três semanas (uma dose por semana), com os vetores construídos, segundo os grupos (a) contendo somente pCDNA3 (100gg), (b) somente vetor contendo P10 (100gg) e combinação pCDNA3 (50 gg) com vetor contendo P10 (50 gg).

[116] Uma semana após o processo de imunização, os camundongos foram sacrificados, o baço extirpado e macerado na presença de 1 ml de meio ACK (tabela 6). As células foram centrifugadas a 1.000 g, por 6 minutos a 4°C. O sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspendidas em 3 ml de meio ACK. Foram adicionados 5 ml de RPMI, acrescido de 1% de soro fetal bovino. Centrifugou-se o material novamente, nas mesmas condições anteriores. Desprezou-se o sobrenadante e o pellet foi ressuspendido em 3 ml de RPMI acrescido de 10% de soro fetal bovino. As células foram mantidas em estufa com 5% de CO2 a 37°C por 24, 48 e 72 horas na presença ou ausência de 20 gg/ml de P10. O sobrenadante foi coletado e armazenado em freezer a -70° C até o momento da detecção de IFN-γ.

Tabela 6 - Meio ACK para Lise de Hemácias

NH4Cl	1,65g
KHCO3	0,20g
EDTA	0,0074g
RPMI	q.s.p.	250ml

Esquema de Imunização e Infecção

Animais [117] Foram utilizados camundongos machos da linhagem BALB/c e B10.A com a média de idade entre 6 a 8 semanas. Os animais foram criados em condições de SPF (Specific Pathogen Free).

Imunização [118] As injeções com os vetores foram realizadas por via

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39/51 intramuscular. Cada grupo de animal recebeu 4 doses de 100 pg do vetor (50 pg no músculo quadriceps de cada coxa) com o intervalo de 1 semana.

[119] Os grupos foram imunizados com combinações de vetores em dois esquemas, tais como, esquema A, onde os camundongos da linhagem Balb/c foram imunizados e uma semana após a última imunização, foram infectados por via intratraqueal seguindo a combinação de vetores, como, somente pCDNA3 (50pg), pCDNA3 (50 pg) + vetor contendo P10 (50 pg), pCDNA3 (50 pg) + vetor contendo IL-12 (50 pg), pCDNA3 (50 pg) + vetor contendo HSP60 (50 pg), vetor contendo P10 (50 pg) + IL-12 (50 pg), vetor contendo P10 (50 pg) + HSP60 (50 pg), vetor contendo HSP60 (50 pg) + IL12 (50 pg) e vetor contendo P10 (33 pg) + HSP60 (33 pg) + IL-12 (33 pg). Quanto ao esquema B, os camundongos da linhagem Balb/c e B10.A foram infectados e 30 dias após a infecção foi iniciado o tratamento com vetores por quatro semanas, sendo uma imunização por semana, seguindo a combinação de vetores, tais como, somente pCDNA3 (50pg), pCDNA3 (50 pg) + vetor contendo P10 (50 pg), pCDNA3 (50 pg) + vetor contendo IL-12 (50 pg) e vetor contendo P10 (50 pg) + IL-12 (50 pg).

Preparo do Inóculo [120] O fungo, isolado Pb18, foi coletado e lavado 3 vezes com solução salina tamponada com fosfatos (PBS, pH 7,2). Depois da última lavagem, o sedimento foi ressuspendido em volume de 5 mL de PBS, onde por alguns minutos, as maiores particulas foram decantadas. A suspensão de células com menores brotamentos, mais leve, foi coletada e a contagem de células foi realizada em câmara de Neubauer.

Determinação da Viabilidade das Leveduras [121] A viabilidade das leveduras foi determinada através do corante azul de Evans (Sigma). Todos os procedimentos cirúrgicos executados no experimento foram realizados com suspensão fúngica, com viabilidade entre 90 e 95%.

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Infecção Intratraqueal (I.T.) [122] A concentração da suspensão de leveduras foi ajustada para 3 x 10⁵ células/50 pl^-1. Os animais foram anestesiados por via intraperitonial com 200 μΐ de solução contendo 80 mg kg^-1 de ketamina (União Química) e 10 mg kg^-1 de xilazina (União Química). Quando os animais se apresentavam insensíveis à dor (após dez minutos), uma pequena incisão longitudinal na pele do pescoço foi realizada, e a traquéia foi exposta, e, com o auxilio de uma seringa (Becton Dickinson) de 1 ml, 50 pl da suspensão de leveduras foi injetada. Imediatamente após a infecção, a incisão foi suturada e os camundongos foram mantidos aquecidos até acordarem da anestesia.

Determinação da Carga Fúngica nos Pulmões dos Camundongos

BALB/C E B10.A [123] O grau de infecção foi caracterizado em animais vacinados, com os diversos vetores e seus respectivos controles, através da recuperação de fungos viáveis do pulmão, fígado e baço em meio Brain Heart Infusion (BHI) (Difco) suplementado com 4% (vol/vol) de soro fetal bovino (Gibco) e 5% de filtrado de cultura do isolado 192 do P. brasiliensis, streptomicina/penicillina 10 IU/ml (Cultilab) e cicloheximida 500mg/ml (Sigma).

[124] Após a morte dos animais em câmara de CO2, os órgãos (pulmão, baço e fígado) foram extirpados, divididos ao meio, e pesados imediatamente. Com o auxílio de um homogeneizador manual as células foram rompidas em 1ml de PBS, desta solução 100 pL foram plaqueadas e incubadas a 37°C e as colônias observadas diariamente até que nenhum aumento em UFC fosse observado e então determinado o número final de colônias.

Caracterização das Citocinas: ELISA para a Quantificação de IL-

4, IL-10, IL-12 e IFN-gama

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41/51 [125] As dosagens de citocinas foram feitas quantitativamente por ELISA de captura (BD- Pharmingen). Os poços foram sensibilizados com 50 μΐ de anticorpos monoclonais (captura) durante 12 horas entre 4 e 8°C. As placas foram então lavadas com PBS-Tween 20 (0,05%) (PBS - T) e bloqueadas com 200 μΐ de PBS-BSA 1% por 1h à temperatura ambiente. Após serem novamente lavadas, foram adicionados 100 μL das amostras (sobrenadante de macerado de pulmão) e os padrões (citocinas recombinantes de camundongos - BD Pharmingen) e em seguida, foram incubadas por 2 hs à temperatura ambiente. Após este período de incubação as placas foram novamente lavadas com PBS - Tween 20 (0,05%) e adicionado 50 μΐ do conjugado “Working detector (detection Ab + avidin-HRP)” em cada orifício, e incubado por 1 hora à temperatura ambiente. Após este período de incubação as placas foram novamente lavadas 10x com PBS-Tween 20 (0,05%), adicionados 50 μl do substrato (TMB substrate reagent set Pharmingen) e incubadas à temperatura ambiente, no escuro por 30 minutos, sendo que a reação foi parada com 25 μΐ de H2SO4 2N, e as leituras foram feitas em comprimento de onda de 450 nm (Multskan EX).

Detecção por ELISA de Anticorpos Totais IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 de Camundongos BALB/C e B10.A [126] Foram utilizadas placas de microtitulação de 96 poços, que foram sensibilizados com 250 ng de anticorpo de captura específico, durante 1h, a 37°C. O material das placas foi descartado, e posteriormente as mesmas foram bloqueadas com BSA 1%, a 37°C, por 1h. Em seguida, foram lavadas com PBS Tween 20 (0,05%) (PBS-T). Foi adicionado 1 gl de soro de camundongos e 1 gl de anticorpo controle, diluídos, inicialmente, a 1/100, seguindo-se titulações com diluições subseqüentes na razão 2, e incubação, por 2 horas, a 37°C. Após nova lavagem, um anticorpo específico para cada isotipo marcado com biotina (IgG1, IgG2a, IgG2b,

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IgG3, IgM - BD Pharmingen, San Diego) foi adicionado, seguindo-se incubação, por 1hora, a 37°C. As placas foram novamente lavadas com PBS-T e os conjugados enzimáticos adicionados (streptoavidina-fosfatase alcalina). A reação foi desenvolvida pela adição de substrato para fosfatase (Sigma, St. Louis). A leitura foi realizada em microleitor de ELISA (Labsystems iEMS Analyser, Helsinki), com filtro de 405 nm.

Histopatologia [127] Uma fração do pulmão foi acondicionada em um tubo contendo formalina 10% (Merck) e enviada para realização da análise histológica.

Análise Estatística [128] Os animais tratados e controles foram analisados pelo teste T do Student e/ou pelo Kruskal-wallis statistic (Primer; McGraw-Hill, New York, NY).

Transfecção Transiente

Análise do RNA [129] As amostras de RNA, coletadas das células transfectadas com os vetores contendo os insertos P10, IL-12, HSP-60 ou pCDNA3, tratadas para a produção do cDNA foram submetidas à técnica de PCR obtendo-se fragmentos de PCR semelhantes à aqueles obtidos nos procedimentos anteriores (dados não demonstrados).

Análise da Atividade do P10 [130] Para confirmar a atividade do vetor contendo o inserto do P10, camundongos foram imunizados conforme descrito anteriormente.

[131] No final do processo de imunização, os camundongos foram sacrificados, o baço extirpado e as células cultivadas em meio RPMI acrescido de 10% de soro fetal bovino e mantidas em estufa com 5% de CO2 a 37°C por 24 e 48 horas na presença ou ausência de 20 pg/ml de P10.

[132] A figura 1 demonstra a capacidade dos animais vacinados, com

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43/51 o vetor contendo o inserto do P10 em produzir IFN-γ quando estimulados, ou seja, depois de sacrificados as células do baço do animal foram estimuladas com o peptídeo (P10). Para confirmar que o vetor pCDNA3 não é inibitório, um grupo de animais foi vacinado com o vetor pCDNA3 e o mesmo vetor contendo o inserto do P10. O P10 não é detectável por métodos convencionais devido ao seu tamanho e por não ser capaz de induzir resposta humoral.

Ensaios de Proteção em Camundongos BALB/C Imunizados com Vetores de Interesse e Posteriormente Infectados com P. brasiliensis Contagem de Unidades Formadoras de Colônias a partir de Macerados de Pulmão, Fígado e Baço [133] Foi avaliada a eficácia da vacinação intramuscular com os vetores contendo os insertos do P10, HSP60 e da IL-12 após 60 dias da infecção intratraqueal com o isolado Pb18 e os resultados estão apresentados na figura 2.

[134] Após 60 dias de infecção, foi observada expressiva diminuição de UFC nos pulmões e na disseminação para outros órgãos nos camundongos BALB/c vacinados com os vetores contendo P10 e IL-12, sendo esta a melhor formulação testada para controle da PCM murina.

Quantificação de Citocinas após 30 e 60 Dias de Infecção Quantificação de IL-12 [135] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e vacinados com os vetores contendo os insertos para P10, IL-12 e HSP60. Foram também utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não vacinados, animais vacinados com pCDNA3 ou P-ORF sem inserto e animal somente manipulado, porém, não infectado ou vacinado (controle).

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44/51 [136] Como mostra a figura 3, a maior produção de IL-12 ocorreu principalmente nos grupos de animais vacinados com vetor contendo o inserto do P10 ou IL-12, para infecção de 60 dias. Estes resultados estão de acordo com as demais detecções de citocinas e com os resultados de UFC.

Quantificação de IFN-Gama [137] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e vacinados com os vetores contendo os insertos para P10, IL-12 e HSP60. Foram utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não vacinados, animais vacinados com pCDNA3 ou P-ORF sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle).

[138] Como mostra a figura 4, a maior produção de IFN-γ ocorreu principalmente nos grupos de animais vacinados com vetor contendo o inserto da HSP 60 e IL-12, e IL-12 e P10, para infecção de 60 dias. Estes resultados estão de acordo com as demais detecções de citocinas e com os resultados de UFC.

Quantificação de IL-4 [139] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e vacinados com os vetores contendo os insertos para P10, IL-12 e HSP60. Foram utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não vacinados, animais vacinados com pCDNA3 ou P-ORF sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle).

[140] Como mostra a figura 5, o grupo de animais vacinados com o vetor contendo o inserto do P10, HSP e IL-12 apresentou grande redução em relação ao controle infectado, para 60 dias de infecção.

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Quantificação de IL-10 [141] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e vacinados com os vetores contendo os insertos para P10, IL-12 e HSP60. Foram utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não vacinados, animais vacinados com pCDNA3 ou P-ORF sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle).

[142] Como mostra a figura 6, não foram observadas diferenças, quanto a diminuição na dosagem de IL-10, para os grupos de interesse, para 60 dias de infecção.

Ensaios de Infecção com P. brasiliensis e posterior Tratamento com Vetores de Interesse em Camundongos BALB/c Contagem de Unidades Formadoras de Colônias a partir de Macerados de Pulmão, Fígado e Baço [143] Foram realizados ensaios de tratamento após infecção. Camundongos BALB/c foram infectados, conforme descrito anteriormente. Após 30 dias de infecção, foram tratados por via intramuscular com os vetores contendo os insertos do P10 e da IL-12, nas concentrações e número de doses descritas anteriormente.

[144] Após quatro semanas de tratamento, os camundongos foram sacrificados. Como mostra a figura 7, foi observada diminuição de UFC nos pulmões e na disseminação para outros órgãos A melhor formulação observada foi o tratamento utilizando os vetores com os insertos da IL-12 e do P10, com diminuição significativa de UFC em relação ao controle infectado e não tratado.

Quantificação de Citocinas após 30 e 60 Dias de Infecção

Quantificação de IL-12 [145] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a

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46/51 partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e tratados com os vetores contendo os insertos para P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém, não infectado ou vacinado (controle). Como mostra a figura 8, foi observado um aumento no nível de IL-12 para o grupo tratado com inserto contendo P10 e IL-12, correspondendo aos resultados de UFC.

Quantificação de IFN-gama [146] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e tratados com os vetores contendo os insertos para P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado. Como mostra a figura 9, foi observado um aumento no nível de IFN-gama para o grupo tratado com inserto contendo P10, correspondendo aos resultados de UFC.

Quantificação de IL-4 [147] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e tratados com os vetores contendo os insertos para P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado. Como mostra a figura 10, não foi observada diminuição na dosagem de IL-4 para os grupois tratados em relação ao grupo controle.

Quantificação de IL-10

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47/51 [148] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos BALB/c, infectados intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e tratados com os vetores contendo os insertos para P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado. Como mostra a figura 11, não foi observada diminuição na dosagem de IL-4 para os grupos tratados em relação ao grupo controle.

Ensaios de Infecção com P. brasiliensis e posterior Tratamento com Vetores de Interesse em Camundongos B10.A Contagem de Unidades Formadoras de Colônias a partir de Macerados de Pulmão, Fígado e Baço [149] Foram realizados ensaios de tratamento após infecção. Camundongos B10.A foram infectados, conforme descrito anteriormente. Após 30 dias de infecção, foram tratados por via intramuscular com os vetores contendo os insertos do P10 e da IL-12, nas concentrações e número de doses descritas anteriormente.

[150] Após quatro semanas de tratamento, os camundongos foram sacrificados. Como mostra a figura 12, foi observada diminuição de UFC nos pulmões e na disseminação para outros órgãos A melhor formulação observada foi o tratamento utilizando os vetores com os insertos da IL-12 e do P10, com diminuição significativa de UFC em relação ao controle infectado e não tratado.

Quantificação de Citocinas após 30 e 60 Dias de Infecção Quantificação de IFN-gama [151] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos B10.A, infectados intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e tratados

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48/51 com os vetores contendo os insertos para P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle). Como mostra a figura 13, foi observado um aumento no nível de IFN-gama para o grupo tratado com inserto contendo P10 e IL-12, correspondendo aos resultados de UFC.

Quantificação de IL-12 [152] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos B10.A, infectados intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e tratados com os vetores contendo os insertos para P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle). Como mostra a figura 14, foi observado um aumento no nível de IL-12 para o grupo tratado com inserto contendo P10 e IL-12, correspondendo aos resultados de UFC.

Quantificação de IL-10 [153] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos B10.A, infectados intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e tratados com os vetores contendo os insertos para P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle). Como, mostra a figura 15, não foi observada uma diminuição no nível de IL-10 para o grupo tratado com inserto contendo P10 e IL-12.

Quantificação de IL-4 [154] O método de ELISA foi empregado para detecção de citocinas a partir do homogeneizado dos pulmões de camundongos B10.A, infectados

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49/51 intratraquealmente com 3 x 10⁵ células leveduriformes de Pb18 e tratados com os vetores contendo os insertos para P10 e ou IL-12. Foram utilizados como controles de infecção, animais somente infectados e não tratados, animais tratados com pCDNA3 sem inserto e animal somente manipulado, porém não infectado ou vacinado (controle). Como mostra a figura 16, não foi observada uma diminuição no nível de IL-4 para o grupo tratado com inserto contendo P10 e IL-12.

Detecção por ELISA de Anticorpos IgM, IgG1, IgG2a , IgG2b e IgG3 em Camundongos BALB/c Tratados e Infectados com P. BRASILIENSIS [155] Camundongos imunizados com vetores contendo P10, IL-12 e ou HSP60, e posteriormente infectados com P. brasiliensis apresentaram o seguinte perfil de imunoglobulinas, após 30 e 60 dias de infecção. De acordo com a figura 17, os resultados obtidos demonstram uma clara diferença entre os tratamentos com vetor contendo P10 e ou IL-12 e ou HSP60. O grupo tratado com plasmídeo contendo P10 apresentou, em relação ao grupo infectado, um aumento nos níveis de IgG2a e diminuição de IgG3 no grupo de 60 dias, caracterizando uma resposta do tipo Th1. Os grupos tratados unicamente com vetor contendo HSP60 tiveram uma diminuição nos níveis de IgG2a no grupo de 60 dias em relação ao grupo de 30 dias, sugerindo uma resposta balanceada similar a dos grupos tratados com a combinação dos vetores P10, Il-12 e HSP60, onde ocorreu uma diminuição relativa de IgG2a e aumento de IgG1. Os grupos tratados com a combinação vetor P10 e vetor IL-12 apresentaram níveis altos e constantes de IgG2a, sugerindo uma resposta imune celular ativa, dependente de interferon-gama, o que corresponde aos resultados obtidos nos testes de detecção de interleucinas, no sobrenadante de pulmão dos camundongos tratados.

Detecção por ELISA de Anticorpos IgM, IgG1, IgG2a , IgG2b e

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IgG3 de Camundongos BALB/c e B10.A Infectados e Tratados Posteriormente [156] Camundongos infectados com P. brasiliensis e tratados, após 30 dias de infecção, com vetores contendo P10 e ou IL-12, apresentaram o seguinte perfil de imunoglobulinas, após 30 dias de tratamento.

[157] Os grupos de camundongos BALB/c e B10.A foram (ao contrário do grupo anterior acima), inicialmente infectados e após trinta dias de infecção, tratados por quatro semanas com vetores P10 e ou IL-12. Conforme mostrado na figura 18, as duas linhagens apresentaram resposta do padrão Th1 bem definida quando tratadas com a combinação vetor P10 e vetor IL-12. No grupo BALB/c pode ser observada uma diminuição dos níveis de IgG1 e IgG2b do grupo tratado, em relação ao grupo infectado e não tratado, e uma manutenção do nível de IgG2a. No grupo B10.A, ocorreu um aumento de IgG3 e diminuição de IgG2b, sugerindo uma resposta imune celular ativa com conversão pelo interferon gama.

Histologia do Pulmão de Camundongos BALB/c e B10.A Infectados e Tratados com Vetores de Interesse por Quatro Semanas [158] Nos camundongos infectados e não tratados o parênquima pulmonar está inflamado, comprometido, e ocorre a presença de muitas células fúngicas. Os camundongos tratados apenas com pCDNA3 também apresentam células fúngicas e parênquima inflamado. Nos camundongos BALB/c tratados com vetor P10 não ocorre a presença de células fúngicas, porém, ainda percebe-se inflamação. O grupo com melhor recuperação foi o da linhagem B10.A tratado com a combinação de vetores P10 e IL-12, neste grupo pode-se observar a ausência de células fúngicas e recuperação do tecido pulmonar.

Ensaios [159] A vacina construída foi testada, quanto a sua eficácia, em

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51/51 camundongos da linhagem BALB/c e B10.A infectados com P. brasiliensis, isoladamente e em conjunto com vetor contendo inserto para HSP60 e vetor contendo IL-12. Os resultados obtidos mostraram que a vacina com inserto P10 é protetora, tanto em ensaios profiláticos quanto em terapêuticos, sendo que os animais tratados após infecção mostraram ótima recuperação do tecido pulmonar.

[160] A presente invenção demonstrou que o peptídeo de 15 aminoácidos, denominado P10, é responsável pela ativação de linfócitos T e proteção de camundongos BALB/c contra PCM. Os camundongos BALB/c foram imunizados com gp43 ou P10, em três doses, a primeira em uma das patas de cada animal. Quinze dias depois, a dosagem foi repetida, por via subcutânea, na cauda dos animais. Quinze dias após a primeira imunização foi realizada a segunda, por via intraperitoneal. Quinze dias após a total imunização, os animais foram infectados, por via intratraqueal, com leveduras da cepa virulenta Pb18 de P. brasiliensis. Após 1 e 3,5 meses os animais foram sacrificados e realizou-se a contagem de CFUs em pulmão, baço e fígado. Os resultados obtidos com o grupo sacrificado após 3,5 meses mostraram que o grupo controle (não imunizado) apresentou pelo menos 200 vezes mais CFUs no pulmão. A disseminação no baço e no fígado observado nos camundongos controles foi abolida nos animais imunizados com P10 e muito reduzida nos animais imunizados com gp43.

[161] Em P. brasiliensis o peptídeo P10 provocou uma forte proteção mediada por imunidade celular, evidenciando-se a liberação de IFN-γ por população de linfócitos Th-1.

[162] Preferencialmente, a presente invenção também pode utilizar a combinação das sequências de DNA do peptídeo P10 e/ou da HSP60 como ferramentas em terapia gênica contra paracoccidioidomicose.

Claims (6)

1. Reivindicações

   1. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS VACINAIS, caracterizadas pelo fato de conter vetores recombinantes plasmidiais construídos a partir da sequência de DNA do peptídeo P10, definido pela SEQ. ID N° 1, que consiste em um minigene de DNA construído por uma sequência que codifica um peptídeo com 15 aminoácidos (QTLIAIHTLAIRYAN) representando os resíduos 181 a 195 do gene da glicoproteína de 43.000 Da (gp43) e clonagem em vetor plasmidial pCDNA3 (Invitrogen), definido pela SEQ. ID N° 2.
2. 2. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS VACINAIS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de a sequência de DNA consistir em uma sequência clonada a partir de extração de RNA total de P. brasiliensis, através de RT-PCR e/ou PCR com iniciadores específicos do gene da gp43.
3. 3. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS VACINAIS, de acordo com as reivindicações 1 a 2, caracterizadas pelo fato de a sequência ainda compreender a obtenção pela clonagem de pCDNA3 (Invitrogen) na ordem de leitura 5'- CAA ACC CTG ATC GCC ATC CAT ACT CTC GCA ATC CGT TAC GCC AAT.
4. 4. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS VACINAIS, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de os vetores consistirem em vetores para expressão de P10 a partir de extração de RNA total de Paracoccidioides brasiliensis, IL-12 e/ou HSP60 (heat shock protein).
5. 5. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS VACINAIS, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de, opcionalmente, nas formulações farmacêuticas vacinais serem utilizados os vetores de forma combinatória pelas co-immunizações utilizando P10 com IL-12, P10 com HSP-60 definido pela SEQ. ID N° 3, IL-12 com HSP-60 e co-

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   2/2 imunização utilizando os três vetores, P10 com IL-12 e com HSP-60.
6. 6. USO das sequências de DNA e/ou seus vetores recombinantes, conforme definidas nas reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser no preparo de formulações farmacêuticas indicadas em doenças infecciosas, particularmente, paracoccidioidomicose (PCM).