BRPI0919373B1 - composição para aplicação em solo, e, método para intensificar condições de crescimento de plantas - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA AUMENTAR A DISPONIBILIDADE DE FÓSFORO DO SOLO PARA ABSORÇÃO DE PLANTAS, E PARA INTENSIFICAR CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO DE PLANTAS, COMPOSIÇÃO PARA APLICAÇÃO EM SOLO, E, SEMENTO DE PLANTA. A presente invenção se refere a um método de intensificar condições de crescimento para plantas cultivando as plantas em solo contendo, em proximidade às raízes vegetais, tanto um fonte de fósforo como pelo menos duas linhagens do fungo Penicillium; particularmente P. bilaiae, mais particularmente linhagens NRRL 50162 e NRRL 50169.

Description

Referência a um depósito de material biológico

[001] Este pedido contém uma referência a depósitos de material biológico cujos depósitos são incorporados neste lugar por referência. Para informação completa veja últimas 2 páginas da descrição.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere a um método de aumentar a disponibilidade de fósforo do solo para absorção de plantas, a uma composição para aplicação em solo e a uma semente de planta.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] A fim de manter crescimento saudável, plantas devem extrair uma variedade de elementos do solo no qual elas crescem. Estes elementos incluem fósforo e os assim chamados micronutrientes (e.g. cobre, ferro e zinco), mas muitos solos são deficientes em tais elementos ou eles contêm estes apenas em formas que não podem ser prontamente absorvidas por plantas (geralmente se acredita que elementos essenciais não possam ser prontamente absorvidos por plantas a menos que eles estejam presentes em forma dissolvida no solo).

[004] Para neutralizar tais deficiências, fontes dos elementos deficientes são comumente aplicadas a solos a fim de melhorar taxas de crescimento e produtividades obtidas a partir de plantas cultiváveis. Por exemplo, fosfatos freqüentemente são adicionados ao solo para neutralizar uma carência de fósforo disponível. Fosfato adicionado ao solo como um fertilizante comercial (e.g., monofosfato de amónio ou superfosfato triplo) é prontamente disponível para plantas, mas no solo é rapidamente convertido em formas relativamente indisponíveis. Foi estimado que apenas 10 a 30% de fertilizante de fosfato é usado pela planta no ano que ele é aplicado, e um terço a metade do fertilizante de fosfato aplicado pode nunca ser recuperado pela planta.

[005] No passado foram feitas tentativas de usar microorganismos para melhorar a disponibilidade de elementos essenciais em sistemas de solo. Em particular espécies do fungo Penicillium foram usadas para este propósito. Patente Norte-Americana 5.026.417 descreve uma linhagem isolada de P. bilaiae que é capaz de melhorar a absorção de fósforo por plantas quando aplicada ao solo.

[006] Entretanto, existe uma necessidade de sistemas para melhorar condições de crescimento para plantas, particularmente aumentando os níveis de fósforo disponível em sistemas de solo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A presente invenção é baseada no descobrimento de que espécies diferentes de Penicillium, que quando aplicadas sozinhas podem ter capacidade variada de melhorar a disponibilidade de fósforo tanto a partir de fosfatos insolúveis como a partir de fertilizantes fabricados, quando combinadas podem gerar um efeito sinergístico que ultrapassa o que seria esperado de resultados individuais.

[008] Em particular, isto é válido para espécies de Penicillium pertencendo a P. bilaiae.

[009] A invenção fornece em um primeiro aspecto um método de aumentar a disponibilidade de fósforo do solo para absorção de plantas, cujo método compreende introduzir no solo inóculos de pelo menos duas linhagens diferentes do fungo Penicillium.

[0010] Em um segundo aspecto a invenção se refere a um método de melhorar condições de crescimento de plantas, que compreende cultivar as plantas em solo contendo em proximidade às raízes vegetais, tanto uma fonte de fósforo como pelo menos duas linhagens identificadas pelos números de depósito NRRL 50169 e NRRL 50162.

[0011] Em um terceiro aspecto a invenção se refere a uma composição para aplicação ao solo, que compreende r) inóculos de pelo menos duas linhagens do fungo Penicillium, particularmente P. bilaiae e/ou P. gaestrivorus e u) um carreador compatível com o solo para o fungo.

[0012] Em um quarto aspecto a invenção se refere a uma semente de planta tendo um revestimento compreendendo inóculos de pelo menos duas linhagens do fungo Penicillium, em particular P. bilaiae e/ou P. gaestrivorus, e um carreador sólido compatível com o solo, portanto.

BREVE DESCRIÇÃO DE ILUSTRAÇÕES

[0013] Fig 1 mostra o efeito de inoculação com microorganismos solubilizadores de fosfato em produção de milho. P. bilaiae (Novozymes P- 201) corresponde a linhagem NRRL 50169, e P. bilaiae (Australia, P-208) corresponde a NRRL 50162.

[0014] Fig 2. mostra solubilização de hidroxiapatita em cultura líquida por linhagens de P. bilaiae separadamente e em combinação. Números em parênteses indicam taxa de incubação (esporos por frasco).

[0015] Fig 3 mostra o efeito de inoculação com microorganismos solubilizadores de fosfato no peso seco de partes aéreas de soja cultivada em condições de sala de crescimento. P. bilaiae (Novozymes) corresponde a linhagem NRRL 50169, P. bilaiae (Australia) corresponde a NRRL 50162, e mistura de P. bilaiae corresponde a uma mistura 1:1 das duas linhagens.

[0016] Fig 4 mostra o efeito de inoculação com microorganismos solubilizadores de fosfato no peso seco de partes aéreas de milho cultivado em condições de sala de crescimento. P. bilaiae (Novozymes) corresponde a linhagem NRRL 50169, P. bilaiae (Australia) corresponde a NRRL 50162, e mistura de P. bilaiae corresponde a uma mistura 1:1 das duas linhagens.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0017] O fungo Penicillium bilaiae é um microorganismo conhecido que foi previamente depositado na American Type Culture Collection em Rockville, Md, Estados Unidos da América sob o número de depósito ATCC 22348 (edição de 1974 do catálogo de ATCC). No catálogo de 1984, o mesmo número de depósito é usado para P. bilaii e uma linhagem adicional é identificada pelo número de depósito 18309.

[0018] Isolados adicionais deste fungo foram descobertos no solo de uma localização (latitude 49 grau 48' N, longitude 113 grau 6 W) em Southern Alberta, Canadá. Foi demonstrado previamente que esta linhagem melhorou atividade de solubilização de P comparada com as linhagens anteriores depositadas na ATCC. Um depósito desta linhagem melhorada foi feito na ATCC sob o número de depósito 20851 em conformidade com os termos do Tratado de Budapeste. Neste depósito o fungo foi nomeado P. bilaji e os detalhes taxonômicos e seu uso foram descritos em Patente Norte-Americana 5.026.417. Esta linhagem foi agora re-depositada como NRRL 50169. Para informação completa do depósito veja última página da descrição.

[0019] O nome desta espécie subseqüentemente foi mudado novamente e agora é reconhecido como P. bilaiae. Este nome será conseqüentemente usado ao longo do relatório.

[0020] Um novo isolado de P. bilaiae foi descoberto na Austrália. Ele foi originalmente isolado em 2002 de raízes de trigo e cultivado em amostras de solo coletadas de Coonalpyn no sul da Austrália (Wakelin et al, 2004 Biol Fértil Soils 40 36-43). Um depósito desta linhagem melhorada foi feito como número de depósito NRRL 50162. Para informação completa do depósito veja última página da descrição e os detalhes taxonômicos deste isolado e seu uso proposto são descritos em pedido provisório de Patente Norte-Americana depositado em 01 10 2008 no nome de CSIRO.

[0021] Outro Penicillium spp encontrado sendo particularmente útil de acordo com a presente invenção são linhagens de P. gaestrivorus. Uma tal linhagem foi isolada em 2002 de raízes de trigo cultivadas em amostras de solo coletadas de New South Wales, Austrália (Wakelin et al, 2004 Biol Fértil Soils 40 36-43), e depositada como NRRL 50170. Para informação completa do depósito veja última página da descrição.

[0022] De acordo com um aspecto a invenção se refere a um método de intensificar condições de crescimento de plantas compreendendo cultivar as plantas em solo contendo, próximo às raízes de plantas, tanto uma fonte de fósforo como pelo menos duas linhagens do fungo Penicillium. Particularmente o fungo Penicillium é selecionado a partir de P. bilaiae e/ou P. gaestrivorus. Em particular o crescimento melhorado é fornecido aumentando a disponibilidade de fósforo do solo para absorção de plantas.

[0023] Em uma forma de realização particular as linhagens de Penicillium são selecionadas a partir da linhagem depositada como NRRL 50169 e NRRL 50162.

[0024] O uso de uma combinação de pelo menos duas linhagens diferentes de Penicillium tem as seguintes vantagens. Quando aplicado a solo já contendo fosfatos insolúveis (ou moderadamente solúveis), o uso das linhagens fúngicas combinadas irá resultar em um aumento na quantidade de fósforo disponível para absorção de plantas comparado com o uso de apenas uma linhagem de Penicillium. Por sua vez, isto pode resultar em um aumento em absorção de fosfato e/ou um aumento em produtividade de plantas cultivadas no solo comparado com uso de linhagens individuais apenas. Se e.g. fósforo não é um fator limitante um aumento de produtividade não necessariamente precisa seguir como um resultado da maior disponibilidade. A combinação de linhagens também possibilita que fosfatos de rocha insolúveis sejam usados como um fertilizante efetivo para solos que têm quantidades inadequadas de fósforo disponível.

[0025] Portanto, de acordo com um aspecto a invenção se refere a um método de aumentar a disponibilidade de fósforo do solo para absorção de plantas cujo método compreende introduzir no solo inóculos de pelo menos duas linhagens diferentes do fungo Penicillium. A presença das duas linhagens de Penicillium irá intensificar a disponibilidade de fósforo para absorção de plantas.

[0026] O dito fósforo pode ser fornecido a partir de uma fonte selecionada a partir do grupo consistindo de fontes originalmente presentes no solo, fontes adicionadas ao solo como corretivos e combinações destes.

[0027] O termo “inoculo" como usado neste relatório é pretendido para significar qualquer forma de células fúngicas, micélio ou esporos, que é capaz de se propagar sobre ou dentro do solo quando as condições de temperatura, umidade, etc, são favoráveis para crescimento fúngico.

[0028] Por "fonte" de um elemento particular os requerentes querem dizer um composto daquele elemento que, pelo menos nas condições do solo em consideração, não torna o elemento completamente disponível para absorção de plantas.

[0029] Em particular o fungo Penicillium é selecionado a partir do grupo consistindo de P. bilaiae, P. albidum, P. aurantiognseum, P. chrysogenum, P. citreonigrum, P. citrinum, P. digitatum, P. frequentas, P. fuscum, P. gaestrivorus, P. glabrum, P. griseofulvum, P. implication, P. janthinellum, P. lilacinum, P. minioluteum, P. montanense, P. nigricans, P. oxalicum, P. pinetorum, P. pinophilum, P. purpurogenum, P. radicans, P. radicum, P. raistrickn, P. rugulosum, P. simplicissimum, P. solitum, P. vanabile, P. velutmum, P. vindicatum, P. glaucum, P. fussiporus, e P. expansum.

[0030] Em uma forma de realização particular a espécie de Penicillium é P. bilaiae. Em outra forma de realização particular a espécie de Penicillium é P. gaestnvorus. Em uma forma de realização adicional particular as pelo menos duas linhagens são uma linhagem de P. bilaiae e uma linhagem de P. gaestnvorus.

[0031] Em outra forma de realização particular as linhagens de P. bilaiae são selecionadas a partir do grupo consistindo de ATCC 20851 NRRL 50169, ATCC 22348 ATCC 18309, NRRL 50162.

[0032] Em uma forma de realização ainda adicional as pelo menos duas linhagens são NRRL 50169 e NRRL 50162.

[0033] Em uma forma de realização ainda adicional as pelo menos duas linhagens são NRRL 50169 e NRRL 50170.

[0034] Em uma forma de realização ainda adicional as pelo menos duas linhagens são NRRL 50162 e NRRL 50170.

[0035] O fungo Penicillium de acordo com a invenção e em particular as linhagens específicas, ATCC20851, NRRL 50169, NRRL 50170 e NRRL 50162 pode ser cultivado usando fermentação em estado sólido ou líquida e uma fonte de carbono adequada. Isolados de Pencillium podem ser cultivados usando qualquer método adequado conhecido pela pessoa versada na arte. Por exemplo, o fungo pode ser cultivado em um meio de crescimento sólido tal como batata dextrose ágar ou extrato de malte ágar ou em frascos contendo meios líquidos adequados tal como meio Czapek-Dox ou caldo batata dextrose. Estes métodos de cultura podem ser usados na preparação de um inoculo de Penicillium spp para revestir sementes e/ou aplicação o carreador a ser aplicado ao solo.

[0036] Produção em estado sólido de esporos de Penicillium pode ser atingida inoculando um meio sólido tal como um substrato baseado em turfa ou vermiculita, ou grãos incluindo, mas não limitado a, aveia, trigo, cevada, ou arroz. O meio esterilizado (atingido através de autoclavagem ou radiação) é inoculado com uma suspensão de esporos (lx 102-lxl07cfu / ml) do Penicillium spp apropriado e a umidade ajustada para 20 a 50 %, dependendo do substrato. O material é incubado por 2 a 8 semanas em temperatura ambiente. Os esporos também podem ser produzidos por fermentação líquida (Cunningham et al, 1990 Can J Bot 68 2270-2274). Produção de líquido pode ser atingida cultivando o fungo em qualquer meio adequado, tal como caldo batata dextrose ou meio de sacarose e extrato de levedura, em condições apropriadas de pH e temperatura (conforme pode ser realizado por alguém versado na arte).

[0037] O material resultante pode ser usado diretamente como um tratamento de semente, ou os esporos podem ser coletados, concentrados por centrifugação, formulados, e então secos usando técnicas de secagem ao ar, liofilização, ou secagem em leito fluidizado (Friesen T, Hill G, Pugsley T, Holloway G, e Zimmerman D 2005 Experimental determination of viability loss of Penicillium bilaiae conidia during convective air-drying Appl Microbiol Biotechnol 68 397-404) para produzir um pó molhável. O pó molhável é então suspenso em água, aplicado à superfície de sementes, e deixado para secar antes de plantio. O pó molhável pode ser usado em conjunção com outros tratamentos de sementes tal como, mas não limitado a, tratamentos químicos de sementes, carreadores (e.g., talco, argila, caulim, sílica gel, caulinita) ou polímeros (e g, metilcelulose, polivinilpirrolidona). Altemativamente, uma suspensão de esporos do Penicillium spp apropriado pode ser aplicada a um carreador compatível com o solo adequado (e.g., pó ou grânulo baseado em turfa) para teor final de umidade apropriado. O material é incubado em temperatura ambiente por 2 a 8 semanas, e então pode ser aplicado ao solo no sulco junto com a semente.

[0038] Como descrito acima, foi encontrado que a combinação de pelo menos duas linhagens de Penicillium aumenta a quantidade de fósforo disponível para absorção de plantas a partir de fertilizantes comerciais de fósforo comparado com o uso de apenas uma linhagem de forma que fertilizantes comerciais podem ser adicionados ao solo ao invés de (ou mesmo assim como) fosfato de rocha natural.

[0039] De acordo com formas de realização adicionais da invenção a fonte de fósforo compreende uma fonte de fósforo nativa do solo ou em outra forma de realização a fonte de fósforo é adicionada ao solo.

[0040] Em uma forma de realização dita fonte é fosfato de rocha. Em outra forma de realização dita fonte é um fertilizante fabricado.

[0041] Fertilizantes fosfatados fabricados comercialmente disponíveis são de muitos tipos. Alguns comuns são aqueles contendo monofosfato de amónio (MAP), superfosfato triplo (TSP) fosfato diamônico, superfosfato simples e polifosfato de amónio. Todos estes fertilizantes são produzidos por processamento químico de fosfatos naturais de rocha insolúveis em aparelhos de fabricar fertilizantes em larga escala e o produto é caro. Por meio da presente invenção é possível reduzir a quantidade destes fertilizantes aplicada ao solo enquanto mantendo ainda a mesma quantidade de absorção de fósforo do solo.

[0042] Em uma forma de realização adicional particular a fonte ou fósforo é orgânica(o). Um fertilizante orgânico se refere a um corretivo de solo derivado de fontes naturais que garante, pelo menos, as porcentagens mínimas de nitrogênio, fosfato, e carbonato de potássio. Exemplos incluem subprodutos de origem vegetal e animal, pós de rocha, ervas marinhas, inoculantes, e condicionadores. Estes freqüentemente estão disponíveis em centros de jardinagem e através de companhias de abastecimento hortícola. Em particular dita fonte orgânica de fósforo é de farinha de ossos, farinha de carne, esterco, composto, lodo de esgoto, ou guano.

[0043] Outros fertilizantes, tal como fontes de nitrogênio, ou outros corretivos de solo certamente também podem ser adicionados ao solo aproximadamente ao mesmo tempo que o fungo Penicillium ou em outros momentos, contanto que os outros materiais não sejam tóxicos para o fungo.

[0044] Uma vez que o fungo tem o efeito de solubilizar fosfatos que já podem estar presentes no solo (i.e., aqueles que são nativos do solo) e também aqueles que são adicionados ao solo, o fungo pode ser aplicado sozinho a solos que contêm fontes nativas de fósforo, ou pode ser aplicado a quaisquer solos em conjunção com fontes adicionadas de fósforo. Os inóculos compreendendo as linhagens fúngicas de acordo com a invenção podem ser fornecidos como descrito acima usando fermentação em estado sólido ou líquida e uma fonte de carbono adequada.

[0045] A quantidade do inoculo a ser aplicada ao solo não é limitada em nenhum aspecto particular. Claramente, se uma quantidade insuficiente é usada, não será obtido um efeito visível. Por outro lado, o uso de grandes quantidades do inoculo será ineficaz, pois as quantidades de fósforo e/ou micronutrientes tornadas disponíveis no solo atingem um máximo em uma certa taxa de aplicação e outras adições além desta taxa não geram benefícios adicionais. As taxas de aplicação adequadas variam de acordo com o tipo de solo, o tipo de plantas cultiváveis, as quantidades da fonte de fósforo e/ou micronutrientes presentes no solo ou adicionados a este, etc. e uma taxa adequada pode ser encontrada sem dificuldade por experimentos simples de tentativas e erros para cada caso particular. Normalmente, a taxa de aplicação cai no intervalo de 0,001-1,0 Kg esporos fúngicos e micélio (peso fresco) por hectare, ou 102-106 unidades formadoras de colônia (cfu) por semente (quando sementes revestidas são usadas), ou em um carreador granular aplicando entre 1 x 106e 1 x 1011 unidades formadoras de colônia por hectare. Mesmo que os inóculos usados de acordo com a presente invenção sejam compreendidos de uma mistura/combinação de inóculos de pelo menos duas linhagens diferentes de Penicillium é a quantidade total de esporos ou unidades formadoras de colônia na mistura combinada que é referida ao longo do relatório.

[0046] As células fúngicas na forma de e g esporos e opcionalmente um carreador pode ser adicionado a uma fileira de sementes do solo no nível de raízes ou pode ser usado para revestir sementes antes de plantio. Quando esporos são adicionados ao solo uma formulação granular será preferível. Formulações como líquido, turfa, ou pó molhável serão adequadas para revestimento de sementes. Quando usado para revestir sementes, o material pode ser misturado com água, aplicado às sementes e deixado para secar.

[0047] Outros carreadores para os esporos podem ser usados para revestir sementes. Por exemplo, os esporos podem ser cultivados em farelo úmido, secos, peneirados e aplicados a sementes anteriormente revestidas com um adesivo, e.g. goma arábica.

[0048] O carreador preferivelmente deve ser um carreador compatível com o solo. O termo “compatível com o solo" significa qualquer material que pode ser adicionado ao solo sem ter um efeito adverso em crescimento vegetal, estrutura do solo, drenagem do solo ou os semelhantes. Veículos adequados compreendem, mas não são limitados a, debulho do trigo, farelo de trigo, palha de trigo moída, pós ou grânulos baseados em turfa, grânulos baseados em gesso, e argilas (e.g., caulim, bentonita, montmorilonita).

[0049] Em um aspecto adicional a presente invenção se refere a uma composição compreendendo pelo menos duas linhagens do fungo Penicilium de acordo com a invenção, e um carreador. Veículos adequados incluem água, soluções aquosas, suspensões, sólidos (e g. turfa, trigo, farelo de trigo, vermiculita, e solo pasteurizado) ou pós secos.

[0050] A composição de acordo com a invenção pode ser adequadamente aplicada no método da invenção para aumentar a disponibilidade de fósforo do solo para absorção de plantas.

[0051] Em uma forma de realização particular as pelo menos duas linhagens de Penicilium compreendidas na composição são selecionadas a partir do grupo consistindo de Penicilium bilaiae e Penicilium gaestrivorus. Mais particularmente as linhagens de Penicilium são selecionadas a partir do grupo consistindo de NRRL 50169, NRRL 50162, NRRL 50170. Em uma forma de realização específica adicional as duas linhagens são NRRL 50169 e NRRL 50162. Em outra forma de realização as duas linhagens são NRRL 50162 e NRRL 50170.

[0052] Particularmente, em uma forma de realização o carreador pode compreender um líquido contendo um nutriente para o fungo.

[0053] Em uma forma de realização ainda adicional a presente invenção se refere a uma semente de planta tendo um revestimento compreendendo inóculos de pelo menos duas linhagens do fungo Penicillium, em particular P. bilaiae e/ou P. gaestrivorus, e um carreador sólido compatível com o solo, portanto. Mais particularmente as linhagens de Penicillium são selecionadas a partir do grupo consistindo de NRRL 50169, NRRL 50162, NRRL 50170 Em uma forma de realização específica adicional as duas linhagens são NRRL 50169 e NRRL 50162. Em outra forma de realização as duas linhagens são NRRL 50162 e NRRL 50170.

[0054] A composição pode conter aditivos adicionais incluindo agentes tamponantes, agentes umectantes, agentes de revestimento, e agentes abrasivos.

[0055] Os métodos de acordo com a invenção são potencialmente úteis para melhorar condições de crescimento resultando em maior absorção de fósforo e/ou produtividade para qualquer tipo de planta. Em uma forma de realização particular a planta é selecionada a partir do grupo consistindo de cereais, legumes, Brassica spp, frutos, hortaliças, nozes, flores, e turfa. Particularmente os cereais são trigo, milho, arroz, aveia, centeio, cevada. Particularmente legumes são lentilha, grão-de-bico, feijão, soja, ervilha, e alfafa.

[0056] Em outra forma de realização particular as plantas são selecionadas a partir do grupo consistindo de alfafa, arroz, trigo, cevada, centeio, aveia, algodão, girassol, amendoim, milho, batata, batata doce, feijão, ervilha, grão-de-bico, lentilha, chicória, alface, endívia, repolho, couve de Bruxelas, beterraba, pastinaca, nabo, couve-flor, brócolis, nabo, rabanete, espinafre, cebola, alho, berinjela, pimenta, aipo, cenoura, abóbora, moranga, abobrinha, pepino, maça, pêra, melão, citrus, morango, uva, framboesa, abacaxi, soja, tabaco, tomate, sorgo, e cana-de-açúcar.

EXEMPLOS Exemplo 1. Caracterização de isolados

[0057] Análise genética da região D2 de 28S rDNA confirmou as duas linhagens ATCC 20851 (linhagem P-201; mesmo que NRRL 50169) e NRRL 50162 (linhagem P-208) como sendo P. bilaiae, com trabalho adicional em CSIRO (Austrália) provando que elas são linhagens diferentes. Linhagens de P. bilaiae foram seqüenciadas por MIDI Labs em Newark, DE usando iniciadores universais para a região D2 do gene de 28S rDNA. Cálculos de comparação filogenética foram feitos usando o programa CLUSTAX para alinhar a seqüência com outras espécies intimamente relacionadas indicadas por uma análise BLAST inicial da seqüência. Uma vez que o arquivo de alinhamento múltiplo foi criado, uma árvore de agrupamento de vizinhos foi construída, e uma matriz de distância foi calculada como a base para identificar o gênero e espécie da linhagem. Todas as operações relacionadas a alinhamento e filogenética foram feitas em Mega 4.0. Seqüências foram importadas no Alignment Explorer em Mega, e então alinhadas usando ClustalW. Uma árvore filogenética foi construída usando “bootstrapping” para testar a robustez.

[0058] Identificações das duas linhagens foram confirmadas como Penicillium bilaiae de acordo com a seguinte classificação. Reino Fungi Sub-reino Dikarya Filo Ascomycota Subfilo Pezizomycotina Classe Eurotiomycetes Subclasse Eurotiomycetidae Ordem Eurotiales Família Trichocomaceae Subfamília mitospórica (anamórfica) Trichocomaceae Gênero Penicillium Espécie bilaiae

Exemplo 2. Experimentos de campo de tratamento de combinação

[0059] Experimentos de campo foram estabelecidos em 2007 em quatro localizações nos Estados Unidos da América para verificar o efeito de inoculação com linhagens solubilizadoras de fosfato de P. bilaiae na produção colhida de milho. Tratamentos incluíram duas linhagens de P. bilaiae separadamente e em combinação assim como um controle não inoculado.

[0060] Os experimentos foram estabelecidos em quatro localizações nos Estados Unidos da América como blocos casualizados completos com 6 réplicas por experimento. Os experimentos dos Estados Unidos da América foram conduzidos por quatro firmas de pesquisa independentes cobrindo quatro Estados dos Estados Unidos da América. Os fornecedores e localizações de pesquisa foram Viger Ag Research (Fergus Falls, MN) Benson Research (York NE), Northern Plains Ag (Gardner, ND), e South Dakota Ag Research (Centerville, SD).

[0061] O experimento foi composto de quatro tratamentos que incluíram dois tratamentos com uma única linhagem de Penicillium NRRL 50169 (linhagem P-201 de Novozymes) e NRRL 50162 (linhagem australiana P-208) um tratamento com duas linhagens e um controle não inoculado. Todas as linhagens de Penicillium foram formuladas como grânulos de turfa.

[0062] Produção de grânulos de turfa foi atingida inoculando o substrato com uma suspensão líquida de esporos. Culturas de Penicillium foram tiradas de armazenamento a -80 C e cultivadas em batata dextrose ágar. Esporos foram coletados usando um bastão de vidro para raspar a superfície de uma cultura esporulante (obtida depois de duas semanas de incubação em temperatura ambiente) em água estéril corrigida com 0,1 % v/v de Tween 80. A suspensão de esporos do Penicillium spp apropriado foi adicionado a grânulos de turfa, que foram então cuidadosamente misturados para atingir uma inoculação uniforme, armazenados em sacos de papel forrados com plástico, e incubados por 2 a 8 semanas em temperatura ambiente (aproximadamente 22 a 27 C). Sacos foram aleatoriamente amostrados e analisados para aproximar as unidades formadoras de colônia fúngica para cada lote de grânulos inoculados. Resumidamente, uma diluição em série foi feita usando água estéril corrigida com 0,1 % v/v de Tween 80. Alíquotas das diluições foram emplacadas em batata dextrose ágar suplementado com Rosa Bengala e clorotetraciclina. Colônias fúngicas foram contadas depois de incubação por 3 a 5 dias a aproximadamente 25 °C. Para tratamentos de combinação, grânulos inoculados foram misturados para atingir uma mistura 1:1 dos isolados de P. bilaiae por título.

[0063] Estabelecimento de parcelas no campo foi específica para cada sítio (veja Tabela 1). Espaçamento de fileiras de sementes foi de 30 polegadas, com 2 fileiras de milho por parcela mais duas fileiras de bordadura. Fertilização incluiu um programa padrão de fertilidade de nitrogênio (sítio específico), mais 0,001 kg nUPtChapl içado com a semente. Linhagens de Penicillium foram formuladas como grânulos de turfa e aplicadas em sulco em uma taxa de 0,00045 kg nr2 (2,07 a 2,17E+10 unidades formadoras de colônia ha1).

[0064] Tabela 1 Detalhes de estabelecimento de parcelas no campo em quatro localizações dos Estados Unidos da América

[0065] Análise combinada de experimento mostra produtividade significativamente maior de milho no tratamento de combinação de P. bilaiae comparado com o controle não inoculado (Figura 1). A combinação de P. bilaiae superou qualquer das linhagens de P. bilaiae quando usadas como um tratamento separado. A combinação de linhagens de P. bilaiae foi o tratamento mais impactante em produtividade de milho nestes estudos.

Exemplo 3. Solubilização de fosfatos insolúveis

[0066] Linhagens solubilizadoras de fosfato de P. bilaiae foram incluídas em experimentos de laboratório avaliando a capacidade destes organismos de solubilizar fosfatos de cálcio insolúveis. O experimento consistiu de duas linhagens de P. bilaiae separadamente e em combinação em duas concentrações diferentes, assim como um controle não inoculado.

[0067] Hidroxiapatita foi pesada em frascos Erlenmeyer de 300 mL em uma taxa de 100 mg P por frasco. Meio mínimo de sais foi preparado como segue (g L !): 0,1 de NaCI, 0,4 de NH4CI, 0,78 de KNO3, 0,1 de CaCL 2H2O, 1,0 de MgSC^fLO, 10,0 de sacarose. 100 mL de meio foi adicionado a cada frasco e frascos foram tapados com uma tampa de espuma e autoclavados (121 C e 1,2 atm por 30 mm). Frascos em triplicata foram inoculados com estoques líquidos de esporos para uma taxa de inoculação alvo de 4,00E+06 esporos por frasco. Para os tratamentos de combinação de P. bilaiae, os frascos foram inoculados ou com 4 00E+06 esporos de cada linhagem por frasco, ou a uma concentração total de esporos de 4,00E+06 esporos por frasco (i.e. 2,00E+06 esporos por frasco de cada linhagem). Frascos foram incubados em temperatura ambiente em um agitador rotatório ajustado para 175 rpm. Subamostras foram assepticamente coletadas em 3, 5, 7, e 10 dias depois de inoculação e analisadas para fosfato solúvel usando um método com verde malaquita.

[0068] A combinação de linhagens de P. bilaiae foi capaz de solubilizar significativamente mais hidroxiapatita do que qualquer linhagem sozinha, conforme indicado por maiores níveis de fosfato solúvel, com taxa de inoculação tendo de pouco a nenhum efeito (Figura 2).

Exemplo 4. Experimentos de sala de crescimento de tratamento de combinação

[0069] Experimentos de sala de crescimento foram estabelecidos em 2009 para verificar o efeito de inoculação com linhagens solubilizadoras de fosfato de P. bilaiae na acumulação de matéria seca de soja e milho. Tratamentos incluíram duas linhagens de P. bilaiae separadamente e em combinação assim como um controle não inoculado.

[0070] Os experimentos foram estabelecidos como fatoriais aleatorizados com 8 réplicas por experimento. Os dois fatores foram fertilizante de fosfato e inoculante. Níveis de fertilizante foram equivalentes a 0, 0,0022, 0,0044 e 0,0088 Kg P2O5 nr2 para soja, e 0, 0,0044, 0,0088, e 0,017 Kg P2O5 nr2 para milho. Tratamentos com inoculantes foram compostos de um controle não inoculado, dois tratamentos com uma única linhagem de Penicillium [NRRL 50169 (linhagem P-201 de Novozymes) e NRRL 50162 (linhagem australiana P-208)], e um tratamento com duas linhagens envolvendo quantidades iguais de ambas as linhagens de Penicillium.

[0071] Potes de plástico foram marcados de acordo com tratamento e um quadrado estéril de tela de cobertura preta foi colocado no fundo de cada um para prevenir a mistura de substrato de vazar através dos buracos de drenagem. Potes foram preenchidos com uma mistura 1:1 de areia quartzítica industrial e vermiculita moída fina. Cada pote foi tratado com a taxa apropriada de suspensão de fosfato preparada usando hidroxiapatita, fechado dentro de um saco Ziploc, e deixado para equilibrar por 7 dias antes de semeadura.

[0072] Tratamentos com inoculantes foram aplicados como um tratamento líquido de semente. Culturas de Penicillium foram tiradas de armazenamento a -80 C e cultivadas em batata dextrose ágar. Esporos foram coletados usando um bastão de vidro para raspar a superfície de uma cultura esporulante (obtida depois de duas semanas de incubação em temperatura ambiente) em água estéril corrigida com 0,1 % v/v de Tween 80. As suspensões de esporos foram tituladas, cuidadosamente misturadas, e adicionadas a lotes de sementes pré-pesados em sacos plásticos em uma taxa de l,50E+05 unidades formadoras de colônia por semente. Para tratamentos de combinação, uma mistura de 1:1 de isolados de P. bilaiae foi atingida dividindo em dois o volume de suspensão de esporos requerido para atingir a taxa de inoculação alvo para cada linhagem (i.e, taxa de inoculação final permaneceu l,50E+05). Tratamentos com controle não inoculado foram tratados com água estéril. Os sacos plásticos foram fechados e agitados vigorosamente por 1 a 2 mm para revestir uniformemente as sementes. Sacos foram re-abertos, e as sementes foram deixadas para secar por 20 a 30 min antes de plantio.

[0073] Sementes de soja e milho foram plantadas 5 por pote. Solução de nutrientes livre de fosfato foi adicionada a potes no momento de semeadura, e a cada duas semanas pela duração do experimento. Potes foram colocados na sala de crescimento com configurações dia/ noite de 16/8 h e 20/15 °C, e irrigados conforme requerido. Potes foram diminuídos para três plântulas uma a duas semanas depois de plantio. Plantas foram coletadas aproximadamente 7 e 6 semanas depois de plantio para soja e milho respectivamente. Partes aéreas foram removidas acima da linha do solo, colocadas dentro de sacos de papel pré-pesados, e secas por 10 d a 72 C para determinar o peso seco de partes aéreas.

[0074] Ao longo de todos os níveis de fertilizante, soja mostrou maior acumulação de matéria seca de partes aéreas no tratamento com mistura de P. bilaiae comparado com o controle não inoculado (Figura 3). O tratamento com mistura de P. bilaiae também funcionou melhor do que qualquer das linhagens de P. bilaiae sozinha.

[0075] Milho mostrou maior acumulação de matéria seca de partes aéreas no tratamento com mistura de P. bilaiae do que o controle não inoculado para todos os níveis de fertilizante (Figura 4). O tratamento de combinação de P. bilaiae também funcionou melhor do que qualquer das linhagens de P. bilaiae nas taxas de fertilizante 0,0044 e 0,0088 Kg P20sm2.

Depósito de Material Biológico

[0076] O material biológico seguinte foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste com a Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 N University Street, Peoria, Illinois, 61604, Estados Unidos da América, e recebeu o seguinte número de acesso:

[0077] O material biológico seguinte foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste com a Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 N University Street, Peoria, Illinois, 61604, Estados Unidos da América, e recebeu o seguinte número de acesso:

[0078] O material biológico seguinte foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste com Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 N University Street, Peoria, Illinois, 61604, Estados Unidos da América e recebeu o seguinte número de acesso:

[0079] As linhagens foram depositadas em condições que asseguram que acesso à cultura será disponível durante a pendência deste pedido de patente para alguém determinado por leis de patentes estrangeiras para ser intitulado a isto. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da linhagem depositada. O depósito está disponível conforme requerido por leis de patentes estrangeiras em países caracterizado pelo fato de que contrapartes do pedido sob exame, ou sua progénie são depositadas. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a invenção sob exame em derrogação de direitos de patente concedidos por ação governamental.

Claims (19)

1. Composição para aplicação em solo, caracterizada pelo fato de compreender Penicillium bilaiae NRRL 50162 e Penicillium bilaiae NRRL 50169 em um pó ou grânulo baseado em turfa tratado por esterilização.

2. Método para intensificar condições de crescimento de plantas, caracterizado pelo fato de introduzir a composição como definida na reivindicação 1 no solo.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de introduzir a composição como definida na reivindicação 1 no solo em uma taxa de 0,001 a 1,0 kg por hectare (0,0000001 kg nr2 a 0,0001 kg nr2).

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de introduzir a composição como definida na reivindicação 1 no solo em uma taxa de 4,5 kg por hectare (0,00045 kg nr2).

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de introduzir a composição como definida na reivindicação 1 em uma taxa de 106 a 1011 unidades formadoras de colônia de Penicillium bilaiae por hectare.

6. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de introduzir a composição como definida na reivindicação 1 no solo em uma taxa de 2,07 x 1010 a 2,17 x 1010 unidades formadoras de colônias de Penicillium bilaiae por hectare.

7. Método para intensificar condições de crescimento de plantas, caracterizado pelo fato de aplicar a composição como definida na reivindicação 1 à semente de planta.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de aplicar a composição como definida na reivindicação 1 à semente de milho.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de aplicar a composição como definida na reivindicação 1 à semente de soja.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de aplicar a composição como definida na reivindicação 1 a uma taxa de 102 a 106 unidades formadoras de colônia de Penicillium bilaiae por semente.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de aplicar a composição como definida na reivindicação 1 a uma taxa de 1,5 x 105 unidades formadoras de colônia de Penicillium bilaiae por semente.

12. Método para intensificar condições de crescimento de plantas de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de introduzir uma semente de planta revestida com a composição como definida na reivindicação 1 no solo.

13. Método para intensificar condições de crescimento de plantas de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de introduzir uma semente de milho revestida com a composição como definida na reivindicação 1 no solo.

14. Método para intensificar condições de crescimento de plantas de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de introduzir uma semente de soja revestida com a composição como definida na reivindicação 1 no solo.

15. Método para intensificar condições de crescimento de plantas de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de crescer plantas no solo compreendendo a composição como definida na reivindicação 1.

16. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de crescer plantas de milho no solo compreendendo a composição como definida na reivindicação 1.

17. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de crescer plantas de soja no solo compreendendo a composição como definida na reivindicação 1.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de crescer plantas no solo compreendendo a composição como definida na reivindicação 1 em uma taxa de 0,001 a 1,0 kg por hectare (0,0000001 kg nr2 a 0,0001 kg nr2).

19. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de crescer plantas no solo compreendendo a composição como definida na reivindicação 1 em uma taxa de 4,5 kg por hectare (0,00045 kg nr2).

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