BRPI0909566B1 - linhagem de h. polymorpha recombinante, e processo de elaboração de etanol - Google Patents

Description

(54) Título: LINHAGEM DE H. POLYMORPHA RECOMBINANTE, E PROCESSO DE ELABORAÇÃO DE ETANOL (73) Titular: ARCHER DANIELS MIDLAND COMPANY. Endereço: 4666 FARIES PARKWAY, DECATUR IL 62526, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: CHARLES ABBAS; KOSTYANTYAN DMYTRUCK; OLENA DMYTRUCK; ANDRIY A. SIBIRNY; ANDRIY Y. VORONOVSKY.

Código de Controle: E66B3897309B5D7B 667148011FBABDF0

Prazo de Validade: 20 (vinte) anos contados a partir de 01/06/2009, observadas as condições legais

Expedida em: 04/12/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

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LINHAGEM DE H. POLYMORPHA RECOMBINANTE, E PROCESSO DE ELABORAÇÃO DE ETANOL

Prioridade e Incorporação por Referência O presente pedido reivindica prioridade do Pedido

Provisório Norte-Americano n° 61/057.515 depositado em trinta de maio de 2008, que é integralmente incorporado ao presente como referência, incluindo todas as referências ali mencionadas (repetidas no presente) até o ponto em que essas referências auxiliem na compreensão da presente invenção ou na obtenção dos materiais e métodos que facilitariam a prática da presente invenção. Caso o conteúdo de uma referência mencionada entre em conflito com o ensinamento do presente pedido, o presente pedido deverá ser considerado a compreensão em vigor.

Campo da Técnica

O presente pedido refere-se ao campo de produção de etanol celulósico por meio de fermentação, particularmente fermentação de fontes que contêm xilose, mais especificamente linhagens de H. polymorpha recombinantes úteis para a produção de etanol por meio de fermentação de xilose e, ainda mais especificamente, a linhagens de H. polymorpha que expressam uma xilose redutase de H. polymorpha mutante que possui afinidade alterada para NADPH em conjunto com xilose desidrogenase e xiluloquinase endógena ou recombinante e que atingem maior produção de etanol por meio de fermentação sobre meios que contêm xilose.

Antecedentes

Etanol produzido a partir de lignocelulósicos é uma alternativa favorável para o meio ambiente para os combustíveis fósseis. Como uma fração substancial de material de lignocelulose consiste de xilose, é necessário fermentar eficientemente xilose em etanol para tornar o processo eficaz

Petição 870180039369, de 11/05/2018, pág. 8/14

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LINHAGEM DE H. POLYMORPHA RECOMBINANTE, PROCESSO DE ELABORAÇÃO DE ETANOL QUE COMPREENDE O CULTIVO DA LINHAGEM DE H. POLYMORPHA RECOMBINANTE E ÁCIDO NUCLÉICO RECOMBINANTE

Prioridade e Incorporação por Referência

O presente pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/057.515 depositado em trinta de maio de 2008, que é integralmente incorporado ao presente como referência, incluindo todas as referências ali mencionadas (repetidas no presente) até o ponto em que essas referências auxiliem na compreensão da presente invenção ou na obtenção dos materiais e métodos que facilitariam a prática da presente invenção. Caso o conteúdo de uma referência mencionada entre em conflito com o ensinamento do presente pedido, o presente pedido deverá ser considerado a compreensão em vigor.

Campo da Técnica

O presente pedido refere-se ao campo de produção de etanol celulósico por meio de fermentação, particularmente fermentação de fontes que contêm xilose, mais especificamente linhagens de H. polymorpha recombinantes úteis para a produção de etanol por meio de fermentação de xilose e, ainda mais especificamente, a linhagens de H. polymorpha. que expressam uma xilose redutase de H. polymorpha mutante que possui afinidade alterada para NADPH em conjunto com xilose desidrogenase e xiluloquinase endógena ou recombinante e que atingem maior produção de etanol por meio de fermentação sobre meios que contêm xilose.

Antecedentes

Etanol produzido a partir de lignocelulósicos é uma alternativa favorável para o meio ambiente para os combustíveis fósseis. Como uma fração substancial de material de lignocelulose consiste de xilose, é necessário fermentar eficientemente xilose em etanol para tórnar o processo eficaz

2/22 para o seu custo (1).

Algumas leveduras, fungos filamentosos e bactérias são capazes de converter xilose em etanol. Leveduras e a maior parte dos outros fungos reduzem em primeiro lugar xilose em xilitol utilizando xilose redutase, que apresenta forte preferência por NADPH como coenzima, EC 1.1.1.21 (XR) . Em seguida, eles oxidam xilitol em xilulose com xilitol desidrogenase estritamente dependente de NAD, EC 1.1.1.9 (XDH) (2). A diferença da especificidade de co-fator resulta em desequilíbrio de redox que gera redução da produção de etanol e acúmulo de xilitol (3, 4, 5, 6, 7, 8). A produção de xilitol foi reduzida por meio de elaboração metabólica dirigida para otimizar os níveis de expressão de XR e XDH (9, 10, 11, 12), alterar a especificidade de co-fator de XR de NADPH em NADH (13, 13a) ou modificar o metabolismo de redox da célula hospedeira (14, 15, 16) . A outra abordagem utilizada para superar o desequilíbrio de redox durante a _fermentação de xilose foi baseada na expressão de xilose isomerase fúngica ou bacteriana, EC 5.3.1.5 (XI) que converte xilose diretamente em xilulose e não requer co-fatores redox (17, 18) .

Demonstrou-se que a expressão adicional de xiluloquinase, EC 2.7.1.17 (XK) (a terceira enzima no metabolismo de xilose) que converte xilulose em 5-fosfato de xilulose, que entra no processo de fosfato de pentose e, em seguida, no metabolismo central, aprimora o uso de xilose aeróbica ou anaeróbica em linhagens que conduzem XI bem como XR-XDH (12, 19) . A expressão de XK é necessária para superar o nível de expressão naturalmente baixo dessa enzima (3, 5) . A expressão resultou em conversão mais eficiente de xilose em etanol (5, 20).

A levedura metilotrófica termotolerante Hansenula polymorpha é capaz de fermentação alcoólica de xilose sob

3/22 temperaturas elevadas (45 a 48 °C) (21, 22, 23). Esta propriedade de H. polymorpha torna-a um bom candidato para uso em um processo eficiente de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). SSF combina hidrólise enzimática de material lignocelulósico com fermentação subseqüente de açúcares liberados no mesmo veículo. As vantagens principais da exploração da utilidade de H. polymorpha. para a produção de etanol a partir de material celulósico utilizando essa levedura são (i) métodos bem desenvolvidos de genética molecular e (ii) disponibilidade de uma sequência de genoma completa para uma linhagem modelo CBS4732 (24, 25) .

Resumo da Invenção

O presente relatório descritivo descreve a construção de linhagens de H. polymorpha recombinantes que expressam um XR modificado (K341R N343D) junto com XDH nativo e XK sobre o fundo Axyll. O consumo de xilose e a produção de etanol e xilitol da linhagem em comparação com as linhagens que expressam XR, XDH e XK nativos são apresentados para comparação, para demonstrar que a expressão da enzima XR alterada aumenta o rendimento de etanol quando a linhagem de H. polymorpha estiver crescendo sobre meios que contêm xilose. Ácidos nucleicos recombinantes relacionados, a enzima mutante e métodos de sua utilização para a fermentação de etanol sobre xilose também são descritos no presente.

Descrição das Figuras

Figura 1: esquemas lineares dos plasmídeos utilizados no presente relatório descritivo: pXIM-Z, pXIN-Z, ρΧ1Μ-Ζ-Χ2, pXlN-Z-X2 e pGLG61/HpXYL3. Os conjuntos de expressão prGAP-XYLl-trAOX, prGAP-XYL1 -trXYL2 e prGAP-XYL3 trAOX são exibidos em caixas brancas, cinza e pontilhadas, respectivamente. A versão modificada de XYL1 ORF é exibida como uma caixa preta. O gene de resistência a zeocina (Zeo^r) e o gene de resistência a geneticina (APH) , ligados a um

4/22 promotor de gene constitutivo impedido que codifica gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAP), são designados com as linhas hachuradas. O gene LEU2 de H. polymorpha e a região telomérica (TEL188) (29) como sequência de reprodução autônoma são exibidos còmo linhas reticuladas. Origem de reprodução ORI e o gene de resistência à ampicilina (Jbla) setas. Locais de restrição: P, PstI; H, Hindlll; S, Saci; SI, Sall; B, BamHI; ScII, BacII; Xb, Xbal; RI, EcoRl; Ndl, Ndel; N, Notl.

Figura 2: alinhamento de sequências de local de ligação de co-fator XRs de diversas leveduras que utilizam xilose contra a sequência XYL1 de H. polymorpha. As sequências conservadas encontram-se em negrito. Os aminoácidos sublinhados foram alterados (K -> R e N -» D) .

Figura 3: comparação de fermentações de xilose a 48 °C por CBS4732 (A) , XRn/XDH/XK (B) e XRm/XDH/XK (C) . Símbolos: etanol () , xilitol (·), biomassa (A) e xilose (♦) .

Figura 4: a Tabela 1 exibe linhagens e plasmídeos utilizados no presente relatório descritivo.

Figura 5: a Tabela 2 exibe atividades de XR, XDH e XK, bem como a produtividade de etanol e xilitol de transformantes de H. polymorpha descritos no presente em comparação com uma linhagem controle.

Figura 6: a Tabela 3 exibe uma comparação de fermentações de xilose a 48 °C por 2Et-/2xPDCl e 2Et/2xPDCl/XRm/XDH.

Figura 7: a Figura 7A exibe a sequência de DNA para o gene xyli de H. polymorpha clonado que codifica xilose redutase com os códons de início e parada destacados. A Figura 7B exibe a sequência de proteínas para a proteína xilose redutase de H. polymorpha clonada com o local de ligação de NADPH antes da mutagênese destacado.

Descrição Detalhada de Métodos, Linhagens e

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Resultados

Linhagens e meios:

As linhagens de levedura H. polymorpha CBS4732s (leu2-2) (26) , Axyll (22) e transformadores (Tabela 1) foram cultivadas sobre YPD (0,5% extrato de levedura, 1% peptona, 2% glicose) ou meio mínimo (0,67% YNB sem aminoácidos, 4% xilose ou 2% glicose) a 37 °C. Para a linhagem CBS4732s, leucina (40 mg/Γ¹) foi suplementada no meio. Para seleção de transformadores de levedura sobre YPD, foram adicionados 130 a 150 mg/1'¹ de zeocina ou 0,5 a 0,6 mg/1*¹ de G418.

A linhagem DH5a de E. coli (Φ80d/acZAM15, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdRll (r_K*, m_K ⁺) , supE44, relAl, deoR, Δ(lacZYA-argF) U169) foi utilizada como hospedeiro para a propagação de plasmídeos. A linhagem DH5oí foi cultivada a 37 °C em meio LB conforme descrito anteriormente (27) . Células de E. coli transformadas foram mantidas sobre um meio contendo 100 mg/1*¹ de ampicilina.

Métodos de biologia molecular:

Foram aplicados métodos de clonagem padrão (27) .

0 DNA genômico de H. polymorpha foi isolado utilizando o Kit de Purificação de DNA Genômico Wizard® (Promega, Madison WI, Estados Unidos). Endonucleases de restrição e DNA ligase (Fermentas, Vilna, Lituânia) foram utilizadas conforme especificações do fabricante. Isolamento de plasmídeo de E.

coli foi realizado com o Sistema de Purificação de DNA Minipreps Wizard® Plus SV (Promega, Madison WI, Estados Unidos). Amplificação por PCR dos fragmentos de interesse foi realizada com Tag DNA Polimerase de Alta Fidelidade Platinum® (Invitrogen, Carlsbad CA, Estados Unidos) de acordo com as especificações do fabricante. Foram realizados PCRs em um termociclizador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City CA, Estados Unidos). A transformação da levedura H. polymorpha por meio de eletroporação foi conduzida

6/22 conforme descrito anteriormente (28) .

Construção de plasmídeos:

Plasmídeos recombinantes pXIN-Z e pXIM-Z que contêm uma versão nativa e modificada de XR, respectivamente, foram construídos com base no plasmídeo pUC57 (Fermentas, Vilna, Lituânia). Fragmento de BamHl/SacI com o promotor HpGAP e o terminal HpAOX do plasmídeo pKO8-GAPpr (22) foi clonado no plasmídeo digerido por BamHI-SacI pUC57 com locais de restrição eliminados preliminares Ndel e BindIII. Nos locais de restrição de plasmídeos resultantes Ndel e Notl localizados entre o promotor HpGAP e o terminal HpAOX foram removidos e surgiu o local Hindlll exclusivo. O ORF de XYL1 foi amplificado por meio de PCR a partir do DNA genômico de CBS4732 utilizando o par de primers HpXl para (CCC AAG CTT ATG CAC ACG CAG ATT AGC AAA AAT CTT G) e HpXlrev (CGC AAG CTT TTA GAT AAA GGT TGG AAT TTC GTT CCA GGT CC) e clonado no local Hindlll para criar o conjunto de expressão -prGAP-XYLltrAOX (os locais de restrição encontram-se sublinhados em todos os primers) . A modificação do gene XR foi realizada por meio de PCR sobreposto. Os pares de primers HpXIMfor (CAT CTT GGT CAT TCC AAG GTC CGA CCA AAA GGA GAG ACT G) e HpXIMrev (CAG TCT CTC CTT TTG GTC GGA CCT TGG AAT GAC CAA GAT G) foram utilizados para produzir as substituições K341 -> R e N343 -» D em XR modificado resultante (as bases não coincidentes para a mutação são exibidas em negrito). Os primers HpXlfor e HpXlrev foram utilizados para clonagem de uma versão modificada do gene XR conforme descrito acima para o gene nativo. O marcador seletivo de levedura que confere resistência a zeocina foi amplificado por meio de PCR a partir do plasmídeo pPICZB (Invitrogen) utilizando o par de primers Ko5 8 (CGG GGT ACC TG CAG ATA ACT TCG TAT AGC ATA C) e Ko5 9 (CGG GGT ACC TG CAG TAA TTC GCT TCG GAT AAC) e clonado nos vetores linearizados de PstI, criando pXIN-Z ou pXIM-Z

7/22 (Fig. 1) .

gene XYL2 de H. polymorpha com o seu próprio terminal e o promotor HpGAP foram amplificados a partir do ₅ DNA genômico de CBS4732 utilizando os pares de primers correspondentes LI (CTC GGA TCC CAA TTA TCA TTA ATA í ATC)/Kol35 (CAG CAG AAG GAT TGT TCA TTT TGT TTC TAT ATT ATC) e KO134 (GAT AAT ATA GAA ACA AAA TGA ACA ATC CTT CTG CTG)/Kol33 (ACA GGA TCC ATC CAT GAG AAA CG) . Os primers LI e Kol33 foram utilizados para a obtenção do fragmento que contém o gene XYL2 com o seu próprio terminal dirigido com o promotor HpGAP pelo PCR de sobreposição. Este fragmento foi clonado nos plasmídeos linearizados BamHI pXIN-Z i pXIM-Z, resultando nas construções recombinantes pXlN-Z-X2 e pXlM-ZX2, respectivamente (Fig. 1).

O conjunto de expressão que contém prGAP-XYL3-trAOX foi obtido na forma de fragmento de restrição de Sacll do plasmideo pKO8/GAP/HpXYL3 (23) e clonado nos plasmídeos linearizados SacII pGLG61 (29). O plasmideo resultante foi denominado pGLG61/HpXYL3 (Fig. 1). A precisão dos plasmídeos

0 construídos foi verificada por meio de sequenciamento. Os plasmídeos construídos são apresentados na Tabela 1.

Métodos bioquímicos:

A atividade de XR em extratos celulares foi determinada espectrofotometricamente a 37 °C. A mistura de teste de XR continha: 100 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,0), 0,15 mM de NADPH e 350 mM de xilose. A reação foi iniciada com adição de extrato celular (3) . Para avaliar K_M com relação a NADPH ou NADH, as atividades de XR foram medidas com quatro concentrações diferentes de co-fatores 20, 50, 100 e 150 μΜ (cada um em três cópias).

A atividade de XDH em extratos celulares foi determinada espectrofotometricamente a 37 °C. A mistura de teste de XDH continha: 100 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,8), 10

I

I

8/22 mM de MgCl₂, 3 mM de NAD 3 e 300 mM de xilitol. A reação foi iniciada com adição de extrato celular (3).

A atividade de XK em extratos celulares foi determinada espectrofotometricamente a 37 °C conforme descrito anteriormente (30), com algumas modificações. A mistura de teste XK continha: 50 mM de tampão Tris-HCl (pH

7,8) , 5 mM de MgCl₂, 0,2 mM de NADH, 1 mM de fosfoenolpiruvato, 8,5 mM de D-xilulose, 10 U de lactato desidrogenase (EC 1.1.1.27) (Fluka, St. Louis MO, Estados Unidos), 0,05 U de piruvato quinase (EC 2.7.1.40) (Fluka, St. Louis MO, Estados Unidos) e 2 mM de ATP. A reação foi iniciada com a adição de extrato celular. Para o teste de XK, um outro modelo sem piruvato quinase e lactato desidrogenase foi utilizado para minimizar a interferência da atividade de XDH em H. polymorpha.

Todos os experimentos de teste foram repetidos pelo menos duas vezes.

Análises:

As células de transformadores foram cultivadas no meio YPX rico (1% extrato de levedura, 2% peptona, 4% xilose) durante dois dias e inoculadas no meio YNB com 12% xilose. A fermentação foi conduzida â temperatura de 48 °C com aeração limitada (140 revoluções x min*¹) . As concentrações de etanol no meio foram determinadas utilizando o kit enzimático com base em álcool oxidase/peroxidase Alcotest (31) . As concentrações de xilitol em meio foram determinadas enzimaticamente conforme descrito anteriormente (Enzymatic Determination of D-Sorbitol and Xylitol, R-Biopharm GmbH, Darmstadt, Alemanha) com leves modificações. Foram utilizados 12 mM de azul de nitrotetrazólio (NTB) e 15 mM de metossulfato de fenazina no lugar de cloreto de iodonitrotetrazólio e diaforase, respectivamente. A absorção do NTB reduzido foi medida a 5 70 nm. As concentrações de

9/22 xilose a partir de fermentação de meio mineral foram analisadas por meio de método químico conforme descrito anteriormente (32).

Os experimentos foram realizados pelo menos duas vezes.

Resultados:

Elaboração de XR:

Para aumentar a fermentação alcoólica de xilose e reduzir a formação de xilitol, XR de H. polymorpha foi submetido a mutagênese específica de local para reduzir a sua afinidade para NADPH. A sequência de aminoácidos do local de ligação de co-fator de XR de H. polymorpha. (SEQ ID N° 1) exibe homologia estrita ao local correspondente de outras leveduras que utilizam xilose (Fig. 2). No presente trabalho, os inventores substituem lisina e asparagina por arginina e ácido aspártico nas posições de aminoácidos 341 e 343, respectivamente, para obter uma proteína XR de H. polymorpha que sofreu mutação e possui o local de ligação de co-fatores de SEQ ID N° 2. Estas substituições relembram as desenvolvidas para modificação bem sucedida da especificidade de co-fator XR em Candida tenuis (33).

Construção de linhagens:

Para gerar linhagens com expressão de versões nativas ou modificadas de XR ou linhagens com expressão simultânea de XR nativo ou modificado junto com XDH, a linhagem Axyll de H. polymorpha (22) foi transformada com plasmídeos linearizados por Saci pXIN-z e pXIM-Z ou pXlN-Z-X2 e pXlM-Z-X2, respectivamente. Os transformadores foram cultivados sobre meio YPD suplementado com zeocina. A presença de conjuntos de expressão nos transformadores foi examinada por meio de PCR utilizando os primers correspondentes. Para expressar o XK, o recombinante pGLG61/HpXYL3 foi transformado plasmídeo linhagem na

10/22 receptora de H. polymorpha. que expressa versões nativas ou modificadas de XR e XDH. Os transformadores foram cultivados sobre meio YPD na presença de concentrações crescentes de G418. A concentração mais alta de G418, que permite o crescimento de transformadores, foi de 0,4 mg x ml'¹. As colônias capazes de crescer sobre o meio seletivo apareceram após três dias de incubação com frequência de até vinte transformadores x mg¹ de DNA. Os transformadores foram estabilizados por meio de cultivo em meio não seletivo por dez a doze gerações com alteração adicional para o meio seletivo com G418. A presença de gene XYL3 recombinante dirigido pelo promotor HpGAP em DNA genômico de tranformadores estáveis foi comprovada por meio de PCR. Como os plasmídeos com base em pGLG61 promovem integração múltipla no genoma de linhagens receptoras (29), linhagens construídas foram examinadas por meio de hibridização Southern para selecionar linhagens recombinantes com quantidade igual de conjunto de expressão de XK. Foram selecionadas as linhagens que contêm três cópias de conjunto de expressão XK (dados não exibidos). As linhagens de levedura construídas são representadas na Tabela 1.

Análise bioquímica de linhagens construídas:

Foram estudadas as propriedades bioquímicas de XR em uma das linhagens recombinantes construídas (denominadas XRm) . Foram medidas as atividades específicas de XR (com os dois co-fatores NADPH e NADH) , XDH e XK bem como afinidades de XR nativo (XRn) e XRm elaborado (Tabela 2) . XRm foi caracterizado por K_M de 152 pM para NADPH utilizando xilose como substrato, que é dezessete vezes mais alto que o K_M para NADPH do XR nativo (9 pM) . O K_M de XRm elaborado para NADH permaneceu quase inalterado (112 pM) . A atividade específica de XR com NADPH na linhagem XRm caiu 4,8 vezes em comparação com a linhagem que expressa XR nativo. A atividade específica

11/22 de XR com NADH nas duas linhagens permaneceu inalterada. As linhagens XRn/XDH e XRm/XDH com expressão adicional de XDH apresentaram aumento de duas vezes da atividade específica de XDH em comparação com a linhagem do tipo selvagem. A expressão de XK nas linhagens XRn/XDH/XK e XRm/XDH/XK resultou em aumento de até 2,4 vezes da atividade específica de XK em comparação com CBS4732 (Tabela 2).

Fermentação de xilose:

A fermentação de xilose pelas linhagens construídas foi comparada em cultivos de bateladas com aeração limitada.

Foi utilizado um meio mineral contendo xilose (12%) e concentração inicial de biomassa de 2 g (peso_seco)x l'¹. Os__ resultados da produção de etanol e xilitol pelas linhagens construídas são exibidas na Tabela 2. A produtividade de etanol da linhagem de XRm foi de 9,8 mg x (Lxh)*¹, que é 1,5 e 1,3 vezes mais alta que a produtividade do XRn e da linhagem CBS4732 do tipo selvagem, respectivamente. A produção de xilitol dessas linhagens apresentou variações não significativas. A produtividade de etanol da linhagem XRm/XDH (18,4 mg x (Lxh)^_1) aumentou 1,5 e 2,4 vezes em comparação com XRn/XDH e CBS4732, respectivamente. A linhagem XRm/XDH apresentou redução de 1,3 e 2,6 vezes da produção de xilitol em comparação com as linhagens XRn/XDH e CBS4732. A produtividade de etanol da linhagem XRm/XDH/XK (54,7 mg x(Lxh)¹ foi 4 e 7,4 vezes mais alta em comparação com as da linhagem XRn/XDH/XK (13,8 mg x(Lxh)'¹). A produção de xilitol da linhagem XRm/XDH/XK foi significativamente reduzida para 0,9 mg x(Lxh)'¹, que é 4,7 e 3 vezes mais baixa que as de

XRn/XDH/XK e linhagem controle, respectivamente. Perfis de fermentação representativos para as linhagens XRn/XDH/XK, XRm/XDH/XK e CBS4732 são exibidos na Figura 3. Deve-se mencionar que o consumo de xilose por linhagens de H. polymorpha durante a fermentação é baixo. O etanol produzido

12/22 na etapa inicial da fermentação de xilose é reutilizado em um a dois dias após a fermentação.

Expressão dos genes XK, XD e XR mutante em uma linhagem de H. polymorpha que expressa piruvato descarboxilase para aumento da fermentação alcoólica de xilose sob temperatura elevada (48 °C):

Para aumentar a fermentação alcoólica de xilose, a versão elaborada de xilose redutase (XR) junto com xilitol desidrogenase (XDH) nativa foi expressa em uma linhagem de H. polymorpha recombinante com um nível elevado de atividade de piruvato descarboxilase. A construção e as características bioquímicas da linhagem inicial 2Et'/2xPDCl foram descritas anteriormente (35, 36) .

Para gerar linhagens com expressão simultânea de versões modificadas de XR em conjunto com XDH, a linhagem 2Et'/2xPDCl de H. polymorpha foi transformada com plasmídeo pXlM-Z-X2 linearizada por Saci (Fig. 1) (37) . Os transformadores foram cultivados sobre meio YPD suplementado com zeocina (150 mgxl'¹) . As colônias capazes de crescer sobre o meio seletivo surgiram após três dias de incubação com frequência de até 4 0 transformadores x mg'¹ de DNA. Os transformadores foram estabilizados por meio de cultivo em meio não seletivo por dez a doze gerações com alteração adicional para o meio seletivo com zeocina. A presença de conjuntos de expressão nos transformadores foi examinada por meio de PCR utilizando os primers Ll/HpXlrev para o conjunto de expressão que contém gene XYLl modificado sob o controle do promotor constitutivo forte HpGAP e os primers Ll/Kol33 para o conjunto de expressão que contém o gene XYL2 sob o mesmo promotor. As sequências de primers usados, bem como as modificações de gene XYLl, são descritas no artigo de Dmytruk O. et al (37).

A fermentação de xilose pela linhagem construída

13/22 foi examinada em cultivos de bateladas com aeração limitada a 48 °C. Foi utilizado um meio mineral que contém xilose (12%) e concentração de biomassa inicial de 2 g (peso seco) x Γ¹. Os resultados da produção de etanol pelas linhagens construídas são exibidos na Tabela 3. A produtividade de etanol da linhagem 2Et'/2xPDCl/XRm/XDH foi de 0,11 g x (Lxh) ' \ que é 2,7 vezes mais alta que a produtividade da linhagem inicial 2Et/2xPDC. Perfis de fermentação representativos para as linhagens 2Et'/2xPDCl e 2Et/2xPDCl e 2Et' /2xPDCl/XRm/XDH são exibidos na Figura 5.

A expressão de XR elaborado em conjunto com XDH nativo obviamente neutraliza o desequilíbrio de redox em linhagem recombinante construída de H. polymorpha, gerando o aumento significativo da produtividade de etanol durante a fermentação de xilose.

Discussão:

Conforme descrito anteriormente (6), leveduras naturais que utilizam xilose exibem fermentação alcoólica apenas quando o seu XR possui atividade ligada a NADH. O XR de H. polymorpha pertence a enzimas com especificidade de cofator duplo, mas NADPH é fortemente preferido (> dez vezes). No presente caso, concentramos nossos esforços na elaboração do XR com aumento de K_M para NADPH. Os resíduos de lisina e asparagina foram substituídos por arginina e ácido aspártico, respectivamente, nas posições 341 e 343 no quadro de local de ligação de co-fatores utilizando a mutagênese específica de local, conforme dados para o gene XR de C. tenuis (33) . A versão modificada do gene XR sob o controle do promotor de HpGAP constitutivo forte foi expressa sobre o fundo Axyll. Resultou em aumento significativo de K_M para NADPH, enquanto K_M para NADH permaneceu quase inalterado. Os resultados obtidos encontram-se em boa concordância com as características relatadas de XR modificado de C. tenuis (33).

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A linhagem de XRm construída exibiu um leve aumento da produtividade de etanol em comparação com a linhagem do tipo selvagem, enquanto a expressão de XR nativo não apresentou efeito positivo. A produção de xilitol dessas linhagens apresentou variações não significativas. É necessário enfatizar que XR que sofreu mutação revela atividade específica significativamente mais baixa com NADPH que resultou em aumento da produtividade de etanol do XRm. Para aumento adicional da produção de etanol, XDH foi expresso junto com o XR modificado. A expressão de enzimas para duas etapas iniciais do processo de utilização de xilose resultou no aumento de 2,4 vezes da produtividade de etanol. acompanhado pela redução de 2,6 vezes da produção de xilitol.

Em nosso trabalho anterior, desenvolvemos linhagens de H. polymorpha que expressam em conjunto E. coli XI e o próprio XK. As linhagens foram caracterizadas por aumento significativo da produção de etanol durante a fermentação de xilose (23). No presente estudo, a linhagem construída XRm/XDH/XK que expressa o XR modificado junto com XDH e XK é caracterizada por aumento significativo da produtividade de etanol (até 7,4 vezes) em comparação com a linhagem do tipo selvagem. De forma importante, a produção de xilitol por esta linhagem é consideravelmente reduzida: 0,9 mg x (Lxh)'¹ em comparação com 4,2 mg x (Lxh)'¹ pela linhagem de tipo selvagem. A expressão adicional de XDH e XDH junto com XK gerou um aumento gradual da produtividade de etanol e, simultaneamente, redução da produção de xilitol. Pode-se considerar que os estágios iniciais da utilização de xilose são limitadores da fermentação alcoólica de xilose em H. polymorpha. Na Figura 3, são representados os perfis de fermentação de XRm/XDH/XK e XRn/XDH/XK. O consumo de xilose por linhagens de H. polymorpha construída e pela linhagem do tipo selvagem durante a fermentação foi um tanto baixo (Fig.

15/22

3) . Isso pode sugerir que a absorção de xilose em H. polymorpha ê muito ineficiente e os genes correspondentes que codificam supostos transportadores de xilose deverão ser clonados e sobre-expressos. Além disso, gargalos de garrafa abaixo no fluxo de XR não podem ser excluídos e necessitam de investigação adicional. O perfil de fermentação revelou a reutilização de etanol sintetizado. A razão deste fenômeno não é compreendida. Em um outro estudo, os inventores do presente isolaram um H. polymorpha 2EtOH- mutante que é caracterizado pela redução significativa do consumo de etanol sintetizado (Ishchuk et al, não publicado) . A natureza molecular da mutação correspondente, entretanto, permanece___ desconhecida.

Linhagens recombinantes de H. polymorpha construídas neste estudo demonstraram aumento significativo da produtividade de etanol durante a fermentação de xilose sob alta temperatura. Por outro lado, a produção de etanol a partir de xilose ainda é muito baixa em comparação com as melhores linhagens de fermentação de xilose atuais (13a, 17,

34). Esforços adicionais necessitam ser aplicados, portanto, para aumentar a fermentação alcoólica de xilose na levedura termotolerante H. polymorpha.

Conclusão:	uma
No	presente trabalho, a	expressão conjunta de
forma de	XR	que sofreu mutação	(K341 R N343 -> D)	em
conjunto	com	XDH e XR nativo em	uma linhagem que conduz a
exclusão	de	Axyl resultou em aumento significativo	(7,4

vezes) da produtividade de etanol com redução simultânea da produção de xilitol durante a fermentação de xilose em alta temperatura. A mesma construção integrada ao cromossomo de uma linhagem de H. polymorpha que expressa o gene PDC1 de piruvato descarboxilase de H. polymorpha, mas não contém a exclusão de Axyl, também aumenta a fermentação de etanol a

16/22 partir de xilose em um fator de cerca de três. Espera-se, portanto, que a combinação da expressão do gene PDC1 e do gene XR que sofreu mutação em uma linhagem de H. polymorpha. também conduza à exclusão de Axyl aumentará ainda mais a produção de etanol a partir de xilose.

Incorporação como referência:

Cada uma das referências a seguir é mencionada no presente para fornecer uma melhor compreensão das invenções descritas no presente e para fornecer descrições de métodos, fontes e materiais que permitirão adicionalmente aos técnicos comuns no assunto elaborar e utilizar os materiais e processos descritos no presente. Consequentemente, cada uma, das referências a seguir é integralmente incorporada ao presente como referência, a menos que qualquer revelação d5“ fornecida rio presente entre em conflito com a referência incorporada, caso em que o objeto conflitante descrito no presente tem validade sobre a referência mencionada.

Termos das reivindicações:

Nas reivindicações seguintes ao capítulo de

Referência a seguir, o termo gene é uma expressão abreviada que indica qualquer polinucleotídeo que codifica a enzima identificada pelo gene indicado. A menos que indicado expressamente no contexto das reivindicações, gene pode incluir, mas não necessariamente, sequências sem codificação.

A menos que indicado em contrário, o polinucleotídeo pode possuir a mesma estrutura primária do gene indicado que é endógena no genoma de um organismo ou ser uma forma recombinante do gene indicado ligado a outros elementos de polinucleotídeos, ser uma forma sintética do gene indicado ou ser uma forma que sofreu mutação em que diversos elementos no gene indicado foram alterados, mas o gene ainda codifica uma forma operativa da enzima identificada. A expressão que sofreu mutação indica qualquer alteração do gene indicado

17/22 que o torna diferente da forma endógena do gene. Nativo indica a estrutura endógena do gene que existe no genoma do organismo.

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22/22

Thermotolerant Yeast Hansenula polymorpha, Microbial Factories (em preparação).

Cell

1/2

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. LINHAGEM DE H. POLYMORPHA RECOMBINANTE, caracterizada por compreender um ácido nucleico recombinante que, isoladamente ou em combinação, inclui um gene que

   5 codifica uma enzima xilitol desidrogenase, um gene que codifica uma enzima xilose redutase, e um gene que codifica uma enzima xiluloquinase, em que cada um dos mencionados genes é ligado operativamente a um promotor que expressa os mencionados

   10 genes na mencionada linhagem de H. polymorpha e em que a mencionada linhagem de H. polymorpha recombinante produz 4,0 a 7,4 vezes mais etanol quando fermentada em um meio que contém xilose do que uma linhagem de H. polymorpha parental que não contém os mencionados genes;

   15 em que o dito gene que codifica uma enzima xilose redutase compreende SEQ ID N° 4 com duas substituições na posição 341 e 343;

   em que as ditas substituições são uma reposição de um resíduo de lisina na posição correspondente à posição 341
2. 2 0 da SEQ ID NO: 4 por uma arginina e a substituição de uma arginina numa posição correspondente à posição 343 da SEQ ID NO: 4 com um ácido aspártico;

   compreendendo ainda um ácido nucleico que codifica uma enzima piruvato descarboxilase endógena à cepa parental

   25 de H. polymorpha operativamente ligada a um promotor que sobre-expressa a dita enzima piruvato descarboxilase na cepa recombinante de H. polymorpha quando comparada à dita cepa mãe de H. polymorpha.

   2. LINHAGEM DE H. POLYMORPHA RECOMBINANTE, de

   30 acordo com a reivindicação 1, caracterizada por cada um dos mencionados genes do ácido nucleico recombinante ser integrado ao cromossomo de H. polymorpha.
3. 3. LINHAGEM DE H. POLYMORPHA RECOMBINANTE, de

   Petição 870180127056, de 05/09/2018, pág. 5/9

   2/2 acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela linhagem de H. polymorpha possuir um fundo Axyll fazendo o gene nativo que codifica uma xilose redutase inoperável.
4. 4. LINHAGEM DE H. POLYMORPHA RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por cada um dos mencionados genes ser sobre-expresso na linhagem de H. polymorpha com relação à linhagem de H. polymorpha parental.
5. 5. LINHAGEM DE H. POLYMORPHA RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender adicionalmente pelo menos uma sequência que codifica uma enzima piruvato descarboxilase ligada operativamente a um promotor que expressa a mencionada enzima de piruvato descarboxilase na linhagem de H. polymorpha recombinante.
6. 6. LINHAGEM DE H. POLYMORPHA RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por pelo menos um promotor compreender um promotor de HpGAP obtido a partir de H. polymorpha.
7. 7. PROCESSO DE ELABORAÇÃO DE ETANOL, caracterizado por compreender o cultivo da linhagem de H. polymorpha recombinante, conforme definida em qualquer das reivindicações 1 a 6, em meios que compreendem xilose sob condições que fazem com que o H. polymorpha recombinante fabrique etanol.

   Petição 870180127056, de 05/09/2018, pág. 6/9

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   Pichia guilliermondii- 256-TQRGLAVIPKSNNPDRLL

   Candàda parápsilosls-- 259-TQRGIAVtPKSmNPDRIA

   Pichia stípítis—----- 260-SQRGIAIIPKSNTVPRÜ

   Candicfa tenuis---------- 264-AQRGIAVTPKSNLPERL<V

   K.p rautanC XR----------- 332-TQRDII.VIPRSDQKERLV (SEQ.ID NO: 2)