BRPI0904466A2 - marcadores moleculares radioativos derivados da bombesina para diagnóstico e terapia de tumores que superexpressam receptores para peptìdeo liberador de gastrina e suas aplicações - Google Patents

Abstract

MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DA BOMBESINA PARA DIAGNóSTICO E TERAPIA DE TUMORES QUE SUPEREXPRESSAM RECEPTORES PARA PEPTIDEO LIBERADOR DE GASTRINA E SUAS APLICAçõES A presente invenção refere-se a uma série de compostos radiomarcados para diagnóstico e tratamento de tumores que superexpressam receptores para o peptídeo liberador de gastrina, tais como tumores de próstata, mama e pulmão, dentre outros, e suas metástases. Os compostos são análogos da bombesina, um neuropeptideo derivado de anfibio de 14 aminoácidos, e foram propostos após estudos de modelagem molecular, através dos quais a estrutura original da bombesina foi modificada em seus cinco primeiros aminoácidos. Os marcadores moleculares resultantes das modificações inéditas apresentaram bons resultados nos estudos de radiomarcação e estabilidade in vitro e têm como principal vantagem em relação aos marcadores já existentes o rápido clareamento sangtiíneo, o baixo acúmulo abdominal e a seletividade por células tumorais in vivo, demonstrados em estudos pré-clínicos que envolveram camundongos sadios e modelo animal de tumor humano.

Description

RELATORIO DESCRITIVO DA PATENTE DE INVENÇÃO"MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA PARA DIAGNÓSTICO E TERAPIA DE TUMORES QUESUPEREXPRESSAM RECEPTORES PARA PEPTÍDEO LIBERADOR DEGASTRINA E SUAS APLICAÇÕES"

A presente invenção refere-se a uma série de compostosradiomarcados para diagnóstico e tratamento de tumores que superexpressam receptorespara o peptídeo liberador de gastrina (GRP), tais como tumores de próstata, mama epulmão, dentre outros, e suas metástases. Os compostos são análogos da bombesina eforam desenvolvidos a partir da modificação em seus cinco primeiros aminoácidos.

É conhecida a importância epidemiológica do câncer e também oimpacto dessa doença na sáude e qualidade de vida do paciente, das pessoas que vivemao seu redor e da população como um todo. Os tipos mais incidentes mundialmente, àexceção do câncer de pele do tipo não melanoma, são os cânceres de próstata e depulmão no sexo masculino e os cânceres de mama e de colo do útero no sexo feminino.Diante deste cenário fica clara a necessidade de desenvolvimento, pela indústriafarmacêutica, de fármacos mais seletivos e específicos para diagnóstico e tratamento docâncer, os quais permitam, além do controle eficaz da doença, a melhoria na qualidadede vida dos pacientes durante o tratamento, bem como em seu prognóstico.

Sabe-se que radiofármacos para diagnóstico e/ou terapia dedoenças em medicina nuclear devem levar uma dose de radiação a sítios específicos,como, por exemplo, células tumorais. Na célula alvo, a radiação ionizante permite adetecção e caracterização da lesão primária, o estadiamento e o controle da respostaterapêutica ou ainda, se for do tipo partículas α ou β, danifica componentes celulares eleva à morte celular de forma direta, por quebra do DNA, ou indireta, via radicais livresformados pela interação da radiação com a água no tecido alvo. Diversos estudosclínicos já foram realizados com radiofármacos preparados com radioisótopos paraterapia de tumores. Veja, por exemplo, Bodei e colaboradores, Eur JNucl Med., v. 30, p.207-216, 2003 e Kwekkeboom e colaboradores, J Nucl Med, v. 28, p. 1319-1325, 2001.O desenvolvimento de radiofármacos para diagnóstico e terapia de tumores envolve,além da escolha do radioisótopo, a escolha da substância a ser radiomarcada, a qualdeve carrear seletivamente o radioisótopo às células tumorais.

Anastaci e colaboradores, Experientia, v. 27, p. 166-167, 1970isolaram da pele do anfíbio Bombina bombina e seqüenciaram a bombesinâ, umneuropeptídeo de 14 aminoácidos análogo dos peptídeos humanos liberador de gastrina(GRP) e neuromedina B (NMB), cuja seqüência é mostrada na figura 1. A bombesinâexerce seus efeitos nas células alvo através da ligação a receptores acoplados à proteínaG. Atualmente, existem três tipos de receptores para bombesinâ descritos emmamíferos, sendo eles o receptor para NMB (NMBr), o receptor para GRP (GRPr) e oreceptor órfão BB3, assim denominado por se desconhecer seu ligante endógeno. Aativação desses receptores desencadeia uma série de funções fisiológicas, dentre elas aliberação de hormônios gastrointestinais, a estimulação da função pancreática e efeitosno sistema nervoso central, tais como termorregulação, inibição do hormônioestimulador da função tireoidiana (TSH) e manutenção do ciclo circadiano. Veja, porexemplo, as publicações de La Bella e colaboradores, Bioconjug Chem, v. 13, p. 599-604, 2002 e Breeman e colaboradores, Int JCâncer, v. 83, p. 657-663, 1999.

O interesse em derivados da bombesinâ radiomarcados paradiagnóstico e/ou terapia de tumores tem crescido consideravelmente a partir daobservação de que os GRPr são superexpressos em alguns tipos de células tumorais,dentre elas as do câncer de próstata, cólon, mama e pulmão, além de glioblastomas eneuroblastomas. Veja Reubi, Endoerine Reviews, v. 24, n. 4, p. 389-427, 2003.

Portanto, derivados da bombesinâ podem ser utilizados para carrear um isótoporadioativo até as células desses tumores, permitindo sua detecção e/ou tratamento, comojá demonstrado por Maina e colaboradores, Câncer Imaging, v. 6, p. 153-157, 2006,Patel e colaboradores, Biochim Biophys Acta, v. 1766, η. 1, p. 23-41, 2006 e Varvarigoue colaboradores, Câncer Biother Radiopharm, v. 19, n. 2, p. 219-229, 2004.

É conhecida a publicação de Faintuch e colaboradores, Nucl MedBiol, v. 35, p. 401-411, 2008, a qual descreve estudos pré-clínicos de conjugados dabombesinâ radiomarcados com tecnécio-99m. Os conjugados consistem na molécula dabombesinâ não modificada ligada a diferentes grupamentos quelantes. Os resultados dasanálises de biodistribuição em camundongos Nude mostram significativa captaçãotumoral dos conjugados pelas céluias PC3 de adenocarcinoma de próstata humano,indicando a presença de receptores para a bombesina nessas células tumorais. Contudo,óbservou-se também alta captação em tecidos sadios que comumente expressamreceptores GRP, especialmente no pâncreas e no intestino delgado, além de altacaptação hepática, a qual é aparentemente influenciada pelo quelante utilizado. Esse altoacúmulo abdominal, evidenciado também pelos estudos de imagem cintilográfica,sugere que a molécula da bombesina não modificada é inadequada para a aplicaçãoclínica. Resultados semelhantes também foram obtidos por Durkan e colaboradores,Bioconjug Chem, v. 18, p. 1516-1520, 2007, para a litorina, um análogo natural dabombesina, não modificada e radiomarcada com tecnécio-99m.

Modificações moleculares na estrutura da bombesina vêm sendopromovidas a fim de melhorar sua afinidade pelos receptores e especificidade pelascélulas tumorais. Essas modificações ocorrem principalmente na porção N-terminal dopeptídeo, uma vez que a porção C-terminal, que compreende a seqüência do aminoácidosete (Gln) ao aminoácido 14 (Met), é responsável pela interação com os receptores eatividade biológica do peptídeo. A porção modificada é comumente denominadaespaçador e os derivados produzidos, agonistas ou antagonistas dos GRPr, já deramorigem a diversas publicações e patentes.

Derivados da bombesina não radiomarcados foram propostos parao tratamento de várias doenças, inclusive do câncer. Nesse caso os análogos utilizadossão antagonistas da bombesina, uma vez que se sabe que os agonistas são estimuladoresda proliferação celular, não sendo adequados para tratamento antitumoral. Veja, porexemplo, Zhu e colaboradores, Biochim Biophys Acta, v. 1773, p. 1087-1094, 2007. Nocontexto dos antagonistas da bombesina são conhecidas, dentre outras, as patentes US5.620.955, US 5.834.433 e US 6.989.371, as quais descrevem derivados da bombesinacom espaçadores orgânicos não peptídicos para o tratamento de tumores e outrasdoenças. Apesar dos bons resultados obtidos nos estudos irt vitro como, por exemplo,significativa atividade citotóxica contra células de diferentes linhagens tumorais, aaplicação dessas moléculas em estudos clínicos é questionável. A administração dosderivados em concentrações terapêuticas, as quais são relativamente altas, podeacarretar sérios efeitos adversos ao paciente devido ao bloqueio do receptor GRP emtecidos sadios e, conseqüentemente, bloqueio das respostas fisiológicas desencadeadaspela sua ativação. Além disso, derivados obtidos a partir da inserção de espaçadoresorgânicos não peptídicos apresentam um caráter lipofílico maior em relação àbombesina nativa, o que dificulta a excreção renal e favorece o acúmulo da molécula noorganismo, especialmente no fígado.

Os incovenientes associados à aplicação de antagonistas dabombesina no tratamento de tumores despertaram o interesse em utilizar esse peptídeocomo um carreador de um agente citotóxico às células tumorais. Dentre os agentesdisponíveis, os mais estudados são os isótopos radioativos que, dependendo de suascaracterísticas físicas, podem ser aplicados para terapia antitumoral e/ou paradiagnóstico por tomo grafia por emissão de fóton único (SPECT) ou tomografia poremissão de pósitron (PET). As vantagens da utilização de derivados bombesina comocarreador de um isótopo radioativo são a possibilidade de utilização não só deantagonistas, mas também de agonistas da bombesina, tendo em vista a baixaconcentração do derivado administrada ao paciente em relação às concentrações dosantagonistas utilizados em terapia.

São conhecidas a patente US 7.060.247 e as publicações de Hu ecolaboradores, Nucl Med Biol, v. 29, p. 423-430, 2002, Hoffinan e colaboradores, JNucl Med, v. 44, p. 823-831, 2003 e Johnson e colaboradores, Câncer BiotherRadiopharm, v. 21, n. 2, p. 155-166, 2006, as quais descrevem derivados da bombesinaque são constituídos pelo quelante l,4,7,10-tetraazaciclododecano-l,4,7,10-ácidotetraacético (DOTA), diferentes espaçadores orgânicos, de caráter aminoacídico(aminoácido β-Ala) e não peptídico (5-Ava, 8-Aoc e 11-Aun). Esses derivados forammarcados com radioisótopos para diagnóstico e terapia e sua biodistribuição foianalisada em camundongos sadios e injetados com células de tumor de próstata (PC3) emama (MDA-MB-231) humanos. Os resultados das análises mostraram que abiodistribuição dos derivados é diretamente influenciada pelo tipo de tumor, peloradioisótopo utilizado e também pelo grupamento espaçador. Nesse caso, o análogocom grupamento espaçador aminoacídico, representado pelo β-Ala, apresentouvantagens em relação aos demais considerando-se a captação abdominal, a qual foisignificativamente menor no pâncreas e no intestino. Além disso, os dados indicam queo aumento no tamanho da cadeia carbônica do espaçador favorece o acúmulo abdominale apontam que o caminho para a obtenção de derivados mais seletivos é odesenvolvimento de derivados com espaçadores aminoacídicos.

Nesse contexto, é conhecida a publicação de Lantry ecolaboradores, JNucl Med, v. 47, n. 7, ρ. 1144-1152, 2006, a qual descreve a síntese e acaracterização do derivado agonista da bombesina AMBA radiomarcado com Lu, umisótopo com aplicações em diagnóstico por SPECT e terapia, especialmente depequenos tumores e micrometástases. O espaçador desse análogo é misto, constituído deuma cadeia carbônica que reúne aminoácidos e grupamentos orgânicos não peptídicos.Esse derivado apresentou boas propriedades de ligação e internalização pelos receptoresGRP nos estudos com células PC3 de adenocarcinoma de próstata humano in vitro ealta captação tumoral nos estudos in vivo. No entanto, também apresentou alta captaçãopelo pâncreas e demais órgãos do sistema gastrointestinal. Esse resultado conduziu aoestudo de Waser e colaboradores, Eur JNucl Med Mol Imaging, v. 34, p. 95-100, 2007,e, mais recentemente, de Thomas e colaboradores, Clin Exp Metastasis, doi10.1007/s 10585-008-9229-0, 2008, que avaliaram a ligação do AMBA-177Lu areceptores GRP e NMB em diferentes cortes de tecidos e tumores humanos in vitro. Asanálises evidenciaram a ausência de receptores GRP no pâncreas humano, ao contráriodo observado em camundongos, e a presença desses receptores em carcinomas depróstata, mama, rins e cólon e também em células sadias do músculo liso e plexomesentérico do trato gastrointestinal. Esses provavelmente serão os órgãos críticos paradosimetria. Esses resultados mostram a necessidade de se obter um análogo maisseletivo, uma vez que a irradiação das células do trato gastrointestinal, principalmentedas do intestino, conhecidamente radiossensíveis, pode acarretar efeitos adversosirreversíveis ao paciente. O AMBA foi incluído, juntamente com outros derivados dabombesina com espaçadores da mesma natureza, na patente de US 2008/0008649, eencontra-se atualmente em estudos clínicos de fase I.

É conhecida a patente de número US 6.866.837, a qual descreveanálogos da bombesina produzidos a partir da inserção de espaçadores baseados emuma seqüência de aminoácidos cíclicos modificados e de grupamentos quelantes paramarcação com alguns radioisótopos. Os derivados foram sintetizados utilizandométodos convencionais e radiomarcados com 111In e permaneceram estáveis por atéduas horas após a radiomarcação. No entanto, a análise da biodistribuição em ratostambém mostrou uma alta captação nos tecidos que comumente expressam receptoresGRP em roedores, tais como pâncreas e tecidos do trato gastrointestinal, indicandopossível acúmulo nesses tecidos até 48 horas após a administração, o que invibializa aaplicação clínica dos derivados devido à dose de radiação absorvida pelos tecidossadios.

É conhecida também a publicação de Parry e colaboradores,Bioconjug Chem, v. 18, p. 1110-1117, 2007, na qual são descritos diferentes derivadosagonistas da bombesina ligados ao quelante DOTA, com espaçadores compostos deaminoácidos não modificados e a seqüência da bombesina do aminoácido sete aoaminoácido 14. A análise da biodistribuição dos derivados radiomarcados com 64Cu emcamundongos Nude implantados com células PC3 de adenocarcinoma de próstatahumano mostrou importante captação tumoral, mas também acúmulo abdominal,especialmente no pâncreas e intestino. Apesar desse acúmulo ser menor em relação aosdemais derivados com espaçadores de outra natureza, ele ainda representa uma barreiraà aplicação clínica dos derivados.

Um estudo clínico com o derivado da bombesina RP527radiomarcado com tecnécio-99m envolvendo homens e mulheres sadios foi realizadopor de Wiele e colaboradores, J Nucl Med, v. 42, p. 1722-1727, 2001. Apesar denenhum efeito adverso, alteração das funções vitais ou dos parâmetros bioquímicos dospacientes terem sido reportados durante todos os experimentos, observou-se, pelasanálises das imagens, uma alta captação no fígado e intestinos, justificada pelos autorespela excreção hepatobiliar do RP527-"mTc. Essa alta captação, detectada até 24 horasapós a administração intravenosa do derivado, resultou em uma alta dose de radiaçãoabsorvida pelo fígado e intestino e provavelmente impossibilitou os estudos envolvendopacientes com tumor. Além disso, é importante ressaltar que o derivado também foisignificativamente captado pela mama das pacientes normais, não sendo adequado paraaplicação no diagnóstico de câncer de mama.É conhecida a recente publicação de Santos-Cuevas ecolaboradores, Nucl Med Comm, v. 29, p. 741-747, 2008, a qual descreve um estudoclínico com os derivados da bombesina EDDA/HYNIC-[Lys3]-bombesinaradiomarcado com tecnécio-99m em mulheres sadias e portadoras de câncer de mama.

Os resultados mostraram que nenhuma das 11 mulheres estudadas apresentaram efeitosadversos após a administração do radiofármaco e também acúmulo abdominal reduzidoem relação ao RP527-99niTc. Porém, não houve diferença significativa entre a captaçãomamária nas mulheres sadias e portadoras do câncer de mama, indicando que essesderivados não são adequados para imagem tumoral.

Tendo-se em vista a conhecida relação entre a superexpressão doreceptor para o peptídeo liberador de gastrina e alguns tumores humanos e aimportância epidemiológica desses tumores no Brasil e no mundo, o desenvolvimentode radioligantes específicos para esses receptores não só contribui para o diagnóstico,estadiamento, avaliação da resposta terapêutica e/ou tratamento do câncer comotambém provém informações a respeito das características bioquímicas das célulasenvolvidas no processo patológico, antecipando a determinação da conduta médica a seradotada. Apesar do grande número de agonistas e antagonistas da bombesinaradiomarcados desenvolvidos, um radioligante com características adequadas paraaplicação in vivo, ou seja, que apresenta o máximo de captação tumoral com o mínimode acúmulo nos tecidos sadios, ainda não foi descrito e seu desenvolvimento constitui-se em contribuição de suma importância. Salienta-se que os estudos clínicos comderivados da bombesina radiomarcados para diagnóstico de doenças não apresentarambons resultados e que se desconhece resultados de estudos clínicos com derivadosradiomarcados para terapia de doenças e que ainda nenhum radiotraçador específicopara ligação a receptores GRP encontra-se comercialmente disponível no mundo.

É, pois, objetivo da presente invenção obter um marcadormolecular com características adequadas para realização de diagnóstico utilizandotécnicas tomográficas como SPECT e PET e/ou terapia in vivo de tumores quesuperexpressam receptores para o peptídeo liberador de gastrina (GRP).

Esse e outros objetivos e vantagens da presente invenção sãoalcançados através do desenvolvimento radioquímico dos derivados da bombesina eensaios de biodistribuição dos marcadores moleculares radioativos em camundongosBalb-c e Nude injetados com células tumorais, verificando-se assim a concentração dosradioligantes no tumor, bem como a distribuição nos outros tecidos de interesse e acinética sangüínea.

Os marcadores moleculares da presente invenção, apropriadamenteradiomarcados com radioisótopos emissores de radiação gama ou pósitron, podem serutilizados clinicamente em técnicas tomográficas como SPECT e PET, respectivamente,para detecção de tumores que superexpressam receptores GRP, tais como tumores depróstata, mama, pulmão, rins e cólon, ou ainda, quando apropriadamente radiomarcadoscom alfa ou beta emissores, podem ser utilizados para tratamento desses tumores.

Os marcadores moleculares compreendidos nesta invençãoapresentam vantagens em relação aos demais derivados até então descritos pelaliteratura, entre elas o processo de radiomarcação simples e eficiente, a alta atividadeespecífica do produto obtido, a alta estabilidade dos radioligantes a 4o C, a importantecaptação tumoral, especialmente na primeira hora após a administração endovenosa,indicando excelente nível de radioatividade para a geração de imagens e/ou tratamentopor endoradioterapia (também conhecida como radioterapia sistêmica ou terapiaradionuclídea). Além disso, a cinética sangüínea desses marcadores é adequada paraaplicação em diagnóstico e terapia e é rápida suficiente para evitar sua degradação pelasenzimas do soro e a captação em órgãos como pâncreas, intestino e fígado não ésignificativa.

Os marcadores moleculares compreendidos na presente invençãosão inéditos e representam peptídeos sintéticos derivados da bombesina planejados porestudos de modelagem molecular, apresentando a seguinte composição

R-Q-(AA)„i-(Gly)„2-BBN(6-14)

ou um sal do mesmo em que:

R é um radioisótopo para fins de diagnóstico ou terapia emmedicina nuclear;

Q é um grupamento quelante de metais;

AA é o aminoácido fenilalanina (Phe) ou tirosina (Try), ilustradosnas figuras 2 e 3, respectivamente;n1 é o número de repetições do aminoácido fenilalanina (Phe) outirosina (Try);

n2 é o número de repetições do aminoácido glicina (Gly), ilustradona figura 4 e;

BBN(6-14) é a estrutura original da bombesina do aminoácido seisao aminoácido 14, que pode ser visualizada na figura 5.

Os peptídeos citados acima podem ser sintetizados de acordo comprocedimentos bem conhecidos por técnicos versados nessa ciência e que são descritos,por exemplo, na patente US 6.989.371 e nas publicações de Zhang e colaboradores, EurJNucl Med Mol Imaging, v. 34, ρ. 1198-1208, 2007, e Prasanphanich e colaboradores,PNAS1 v. 104, n. 30, p. 12462-12467, 2007.

Os seguintes exemplos ilustram a presente invenção e suasvantagens e, como tais, não devem ser considerados como limitando a invenção descritanas reinvidicações aqui apensas.

Exemplo 1:

Para a obtenção de marcadores moleculares de lutécio-177, osderivados da presente invenção foram radiomarcados com cloreto de lutécio-177adicionando-se a 20^g de cada derivado 92,5 MBq de 177LuCl3 e ajustando-se o volumepara 200 μl com tampão acetato de sódio 0,4 M pH 4,5. A mistura de reação foi entãoincubada por 30 minutos, a 90° C e agitação de 350 rpm e, ao final da incubação, apureza radioquímica foi analisada por dois sistemas cromatográficos para pesquisar apresença do radiolantanídeo não ligado (177LuCIb): a cromatografia em camada delgadaem suporte de sílica gel 60 (ITLC-SG) e a cromatografia líquida de alta eficiência(CLAE). Para a análise em ITLC-SG, aplicou-se uma alíquota da mistura deradiomarcação sobre o suporte de ITLC-SG e procedeu-se à cromatografia utilizandocomo fase móvel tampão citrato/ácido cítrico 0,1 M pH 5,0. Em seguida, cortou-se asfitas de ITLC-SG em 10 fragmentos de 1 cm e a radioatividade em cada fragmento foideterminada em contador automático tipo poço. Nesse sistema, o derivadoradiomarcado migra com fator de retenção (Rf) 0,1 - 0,3, enquanto o 177Lu não ligadomigra com Rf 0,9 - 1,0. A análise da pureza radioquímica dos derivados radiomarcadospor CLAE foi realizada utilizando-se uma coluna de fase reversa Cis (150 mm χ 4,0mm, 5 μηι) e detector de radiação gama, a um fluxo de 1,5 mL/minuto e gradiente linearde 10 a 90% (v/v) de TFA:acetonitrila (0,1% v/v) em TFAiH2O (0,1% v/v) por 15minutos.

Na figura 6 e 7 encontram-se respectivamente as estrutura linear e3 D protótipo do marcador molecular 177Lu-DOTA Phe-Gly-BBN(6-14) radiomarcadocom lutécio-177, obtidas através do programa Marvin Sketch. Na tabela 1 apresenta-seos resultados da radiomarcação de alguns dos derivados da bombesina da presenteinvenção com lutécio-177, a fim de se obter marcadores moleculares de lutécio-177.

Nas condições descritas anteriormente, marcadores moleculares são obtidos com altapureza radioquímica (> 95%), não sendo necessário procedimento de purificação pararealização dos demais estudos. Os resultados da análise da radiomarcação porcromatografia em ITLC-SG foram confirmados pela cromatografia líquida de altaeficiência (CLAE). Nesse sistema, o lutécio não ligado pode ser facilmente separadodos derivados radiomarcados pela diferença nos tempos de retenção, conformemostrado na tabela 2. Os cromatogramas mostraram apenas uma pequena fração de177LuCl3 nas misturas de reação (< 2%), resultado da alta pureza radioquímica dasmarcações.

TABELA 1

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TABELA 2

<table>table see original document page 11</column></row><table><table>table see original document page 12</column></row><table>

Exemplo 2:

A análise da estabilidade dos marcadores moleculares de lutécio-177 foi realizada incubando-se as misturas de radiomarcação (92,5 MBq do derivadoradiomarcado em 200 μΣ de tampão acetato de sódio 0,4 M pH 4,5) a 4o C por até 7dias (168 horas), retirando-se uma alíquota após 1, 2, 3, 4 e 7 dias para análise da purezaradioquímica por cromatografia em ITLC-SG, utilizando o sistema descritoanteriormente no exemplo 1. Os resultados da análise de estabilidade de alguns dosmarcadores moleculares de lutécio-177 da presente invenção a 4o C são mostrados natabela 3 e estão expressos em porcentagem de pureza radioquímica ± desvio padrão.

Todos os marcadores analisados apresentaram alta estabilidade nessa temperatura, naqual a pureza radioquímica foi maior ou igual a 95% por até 4 dias.

TABELA 3

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Exemplo 3:

O coeficiente de partição dos marcadores moleculares de lutécio-177 foi determinado adicionando-se 50 μΙ, dos marcadores a um tubo contendo 3 mL den-octanol e 3 mL de água destilada. Agitou-se o tubo por uma hora e, após a separaçãodas fases aquosa e oleosa, coletou-se 10 μί da fase aquosa e 10 μΐ, da fase oleosa paracontagem em contador automático tipo poço. O coeficiente de partição (CP) foi entãodeterminado pela equação:

<formula>formula see original document page 13</formula>

Os coeficientes de partição experimentais de alguns dosmarcadores moleculares de lutécio-177 são mostrados na tabela 4 em CP ± desviopadrão. Os marcadores apresentam baixa lipossolubilidade e o aumento do espaçadorreduz, ainda que discretamente, a lipossolubilidade, apesar do aumento na cadeiacarbônica. Essa baixa lipossolubilidade é uma característica desejável a marcadoresmoleculares radioativos, uma vez que favorece a excreção renal e evita seu acúmulo emtecidos sadios.

TABELA 4

<table>table see original document page 13</column></row><table>

Exemplo 4:

Os estudos de biodistribuição dos marcadores moleculares delutécio-177 foram realizados em camundongos Balb-c machos, de 4 a 8 semanas deidade e 25 a 30 g de peso médio, utilizando o método invasivo. Injetou-se por viaendovenosa caudal 0,185 MBq (50 μΟί) dos derivados radiomarcados diluídos em 100de solução salina 0,9%. Após 1, 4 ou 24 horas os animais foram sacrificados, osprincipais órgãos foram retirados e pesados e avaliou-se a radioatividade em umcontador gama tipo poço. Calculou-se as porcentagens da atividade injetada por órgão epor grama de órgão utilizando um padrão da dose administrada, de acordo com asequações 2 e 3, definidas adiante. Os resultados de biodistribuição encontrados para osmarcadores moleculares 177Lu-DOTA-Phe-Gly-BBN(6-14) e 177Lu-DOTA-Phe-(Gly)5-BBN(6-14) encontram-se na tabela 5 e 6, respectivamente. Estes resultados foramsubmetidos à análise de variância (ANOYA).

<table>table see original document page 14</column></row><table>

Em que,

Cpm: contagens por minuto;

<table>table see original document page 14</column></row><table>

TABELA 5

<table>table see original document page 14</column></row><table>TABELA 6

<table>table see original document page 15</column></row><table>

Exemplo 5:

A análise da farmacocinética dos marcadores moleculares delutécio-177 foi realizada em camundongos Balb-c machos, de 4 a 8 semanas de idade e25 a 30 g de peso médio, por método não invasivo. Injetou-se por via endovenosacaudal 0,185 MBq (50 μΟί) dos marcadores moleculares diluídos em 100 μι de soluçãosalina 0,9% e após diferentes tempos (1 minuto a 24 horas) coletou-se 60 μί, de sanguepelo plexo orbital dos camundongos utilizando um tubo capilar heparinizado. Aradioatividade do sangue foi analisada conforme descrito anteriormente no exemplo 4.Calculou-se as porcentagens da atividade injetada por mililitro de sangue utilizando umpadrão da dose administrada, de acordo com a equação 4, definida adiante. Os

resultados da cinética sangüínea dos marcadores moleculares Lu-DOTA-Phe-Gly-BBN(6-14) e ,77Lu-DOTA-Phe-(Gly)5-BBN(6-14) encontram-se na figura 8.

% AI/mL = (cpm 60 μΐ, de sangue / cpm Padrão) χ 1000 / 60 equação 4

Exemplo 6:

Para análise da ligação dos marcadores moleculares da presenteinvenção às células tumorais que superexpressam receptores GRP, fez-se necessário odesenvolvimento de um modelo animal de algum desses tumores. Para tal, utilizou-secélulas PC3, derivadas de adenocarcinoma de próstata humano, tumor queconhecidamente apresenta receptores GRP em maior densidade do que os tecidoshumanos normais. Injetou-se 2 χ IO6 células PC3, ressuspendidas em 100 μί de soluçãosalina 0,9%:Matrigel (2:1) por via subcutânea no dorso dos camundongos Nude de oitoa dez semanas de idade e 20 a 25 gramas de peso. Os estudos de biodistribuição foramrealizados conforme descrito anteriormente no exemplo 4, três semanas após a injeçãodas células, quando a massa tumoral atingiu cerca 0,5 g. Os resultados da captação dosmarcadores l77Lu-DOTA-Phe-Gly-BBN(6-14) e 177Lu-DOTA-Phe-(Gly)5-BBN(6-14)no tumor são mostrados na figura 9 e razões entre captação tumoral e os tecidos alvopara cada um desses marcadores, calculadas de acordo com a equação 5, definida aseguir, encontram-se na tabela 7.

TABELA 7

<table>table see original document page 16</column></row><table>Apesar de ter sido descrito e ilustrado neste trabalho procedimentopara obtenção dos marcadores moleculares radioativos baseados na marcação dederivados da bombesina com lutécio-177, cabe salientar que a obtenção de marcadoresbaseados na marcação dos mesmos derivados com outros radioisótopos utilizando-seprocedimentos e reagentes alternativos em relação aos exemplos anteriores éperfeitamente adaptável, sem que se fuja do escopo da presente invenção.

Claims (15)

1.- "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA", caracterizado pelo fato de que o marcador molecular apresenta aestrutura R-Q-(AA)n i-(Gly)n2-BBN(6-14), na qual BBN(6-14) representa a seqüênciaoriginal de aminoácidos da bombesina do aminoácido 6 ao aminoácido 14 e R-Q-(AA)n i-(Gly)n2 representa a porção modificada da molécula, produto da presenteatividade inventiva.

2.- "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Rrepresenta um isótopo radioativo para fins de diagnóstico, incluindo 133mIn, 111In, 99mTc,-67Ga, 52Fe, 18F, 68Ga, 72As, 97Ru, 203Pb, 62Cu, 64Cu, 51Cr, 52mMn, 157Gd, 123I, 124I, 125I,,-75Br 76Br, 77Br e 82Br.

3.- "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Rrepresenta um isótopo radioativo para fins terapêuticos, incluindo 100Re, yuY, 00Y, °'Cu,-131I, 169Eu, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 188Re, 77As, 166Dy, 166Ho,-149Pm, 151Pm, 153Sm, 159Gd, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, 111Ag e 177mSn.

4.- "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Qrepresenta um quelante de metais, podendo um quelante conhecido pela ciência paracomplexação com um metal ou radioisótopo útil para aplicações médicas,preferencialmente DTPA, DOTA, D03A, EDTA, TETA, NOTA e PDTA.

5.- "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Q énulo ou inexistente.

6.- "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que AArepresenta um aminoácido, preferencialmente fenilalanina (Phe) e tirosina (Try).

7. - "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que mrepresenta o número de repetições dos aminoácidos constantes na reivindicação 6,preferencialmente um, dois ou três.

8. - "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que 112representa o número de repetições do aminoácido glicina, preferencialmente um, dois,três, quatro ou cinco.

9. - "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA E SUA APLICAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VIVO", caracterizadopelo fato de que o derivado radiomarcado pode ser aplicado como agente paraimageamento de tumores que superexpressam receptores para o peptídeo liberador degastrina (GRP).

10. - "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA E SUA APLICAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VIVO" de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o derivado radiomarcado pode seraplicado como agente para imageamento de tumores que superexpressam receptorespara o peptídeo liberador de gastrina (GRP) utilizando técnicas tomográficas de SPECT.

11. - "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA E SUA APLICAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VIVO" de acordo com areivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o derivado radiomarcado pode seraplicado como agente para imageamento de tumores que superexpressam receptorespara o peptídeo liberador de gastrina (GRP) utilizando técnicas tomográficas de PET.

12. - "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA E SUA APLICAÇÃO EM TERAPIA IN VIVO", caracterizado pelo fatode que o derivado radiomarcado pode ser aplicado como agente para tratamento detumores que superexpressam receptores para o peptídeo liberador de gastrina (GRP).

13. - "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA E SUA APLICAÇÃO EM TERAPIA IN VIVO", de acordo com areivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o derivado radiomarcado pode seraplicado como agente para tratamento de tumores que superexpressam receptores para opeptídeo liberador de gastrina (GRP) utilizando a técnica de radioterapia sistêmica.

14. - "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA E SUA APLICAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VITRO", caracterizadopelo fato de que o derivado radiomarcado pode ser aplicado como agente paracaracterização de tumores e tecidos frente à receptores para o peptídeo liberador degastrina (GRP).

15. - "MARCADORES MOLECULARES RADIOATIVOS DERIVADOS DABOMBESINA E SUA APLICAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VITRO", de acordo coma reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o derivado radiomarcado pode seraplicado como agente para caracterização de tumores e tecidos frente à receptores parao peptídeo liberador de gastrina (GRP) utilizando técnicas de autoradiografía.