BRPI0813823B1 - Métodos para concentração de uma solução de imunoglobulina por filtração de fluxo tangencial, e para produção de uma imunoglobulina - Google Patents

Métodos para concentração de uma solução de imunoglobulina por filtração de fluxo tangencial, e para produção de uma imunoglobulina Download PDF

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BRPI0813823B1
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Hepbildikler Stefan
Kuhne Wolfgang
Rosenberg Eva
Winter Gerhard
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F. Hoffmann-La Roche Ag
Ludwig Maximilians Universität
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Description

(54) Título: MÉTODOS PARA CONCENTRAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE IMUNOGLOBULINA POR FILTRAÇÃO DE FLUXO TANGENCIAL, E PARA PRODUÇÃO DE UMA IMUNOGLOBULINA (51) Int.CI.: C07K 16/00; C07K 1/34 (30) Prioridade Unionista: 17/07/2007 EP 07 013948.0 (73) Titular(es): F. HOFFMANN-LA ROCHE AG. LUDWIG MAXIMILIANS UNIVERSITÃT (72) Inventor(es): STEFAN HEPBILDIKLER; WOLFGANG KUHNE; EVA ROSENBERG; GERHARD WINTER (85) Data do Início da Fase Nacional: 18/01/2010
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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS PARA CONCENTRAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO DE IMUNOGLOBULINA POR FILTRAÇÃO DE FLUXO TANGENCIAL, E PARA PRODUÇÃO DE UMA IMUNOGLOBULINA [001] A presente invenção se refere ao campo de concentração de proteína, para ser mais preciso ela se refere ao uso de filtração de fluxo tangencial (TFF) para concentração de imunoglobulina.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Proteínas e especialmente imunoglobulinas desempenham um papel importante no portifólio médico de hoje. Sistemas de expressão para a produção de polipeptídeos recombinantes são bem conhecidos no estado da técnica e são descritos por, por exemplo, Marino, M.H., Biopharm. 2 (1989) 18-33; Goeddel, D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; Wurm, F., e Bernard, A., Curr. Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-159. Os polipeptídeos para uso em aplicações farmacêuticas são principalmente produzidos em células de mamífero tais como células CHO, células NS0, células Sp2/0, células COS, células HEK, células BHK, células PER.C6®, e similares.
[003] Para aplicação humana, todas as substâncias farmacêuticas têm que encontrar critérios distintos. Para assegurar a segurança de agentes biofarmacêuticos em seres humanos, por exemplo, ácidos nucleicos, vírus, e proteínas de célula hospedeira, que causariam danos severos, têm que ser removidos. Para encontrar as especificações regulatórias, uma ou mais etapas de purificação têm que seguir o processo de fabricação. Entre outros, pureza, produção e rendimento desempenham um papel importante na determinação de um processo de purificação apropriado.
[004] Devido a suas propriedades físicas e químicas, tais como peso molecular e arquitetura de domínio incluindo modificações secundárias, o processamento a jusante de imunoglobulinas é muito
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2/27 complicado. Por exemplo, não são somente para fármacos formulados, mas também para intermediários em soluções concentradas de processamento a jusante (DSP) requeridas para alcançar baixos volumes para manuseio econômico e aplicação de armazenamento. Além disso, tempos de concentração são favorecidos para assegurar processos suaves e tempos de operação curtos. Neste contexto, processo de TFF imperfeitos especialmente após etapas de purificação finais podem causar dano sustentado mesmo afetando o produto de fármaco. A correlação entre tensão de cisalhamento e agregação em processos de concentração de fluxo tangencial para soluções intermediárias de anticorpo monoclonal (mAb) foi investigado por Ahrer,
K., et al. (J. Membr. Sci. 274 (2006) 108-115). A influência do tempo de concentração e fluxo e pressão selecionados no desempenho do processo e estado de agregação foi monitorada (ver, por exemplo, Dosmar, M., et al., Bioprocess Int. 3 (2005) 40-50; Luo, R., et al., Bioprocess Int. 4 (2006) 44-46).
[005] Mahler, H.-C., et al. (Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 59 (2005) 407-417) reportaram a indução e análise de agregados em uma formulação de anticorpo-IgG1 líquida formada por métodos de tensão de agitação diferentes. Na US 6.252.055, uma preparação de anticorpo monoclonal concentrada é reportada. Um método para produção de uma preparação de anticorpo concentrada é reportado na US 2006/0182740. Um processo combinado incluindo uma ultrafiltração, uma diafiltração, e uma segunda sequência de ultrafiltração é reportado na US 2006/0051347. Na EP 0 907 378 é reportado um processo para concentração de uma preparação de anticorpo usando uma ultrafiltração de fluxo cruzado com uma taxa de recirculação fixa de 250 mL/min Métodos para filtração de fluxo tangencial e um aparelho, portanto é reportado na US 2004/0167320. No WO 97/45140, uma solução de anticorpo concentrada é reportada.
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SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] A presente invenção proporciona um método para a concentração de soluções contendo imunoglobulinas recombinantemente produzidas.
[007] Em maiores detalhes, um aspecto da presente invenção é um método para concentração de uma solução de imunoglobulina por filtração de fluxo tangencial no qual a pressão da transmembrana e o fluxo cruzado, que são aplicados, são variáveis com
a) uma pressão da transmembrana de 0,14 MPa a 0,16 MPa (1,4 bar a 1,6 bar) e um fluxo cruzado de 75 mL/min a 90 mL/min em uma faixa de concentração até 30 mg de imunoglobulina por mL de solução a ser concentrada,
b) uma pressão da transmembrana de 0,08 a 0,09 MPa(0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 140 mL/min a 160 mL/min em uma faixa de concentração de 15 mg/mL até 55 mg/mL, e
c) uma pressão da transmembrana de 0,08 a 0,09MPa(0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 120 mL/min a 140 mL/min em uma faixa de concentração de mais do que 45 mg/mL.
[008] Em uma concretização a faixa de concentração na etapa c) é de 50 mg/mL até 275 mg/mL. Em uma concretização preferida, a faixa de concentração na etapa c) é de 50 mg/mL até 180 mg/mL. Em uma concretização mais preferida, a faixa de concentração na etapa c) é de 50 mg/mL até 130 mg/mL. Em outra concretização, a pressão da transmembrana e fluxo cruzado são 0,15MPa(1,5 bar) e 80 mL/min na etapa a),0,085 MPa (0,85 bar) e 150 mL/min na etapa b), e/ou 0,085 MPa (0,85 bar) e 130 mL/min na etapa c). Em outra concretização, a solução de imunoglobulina é uma solução aquosa tamponada de imunoglobulina.
[009] Outro aspecto da presente invenção é um método para produção de uma imunoglobulina heteróloga compreendendo as
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4/27 seguintes etapas nesta ordem:
a) provisão de uma célula de mamífero recombinante compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma imunoglobulina heteróloga,
b) cultivo da célula da etapa a) sob condições adequadas para a expressão da imunoglobulina heteróloga,
c) recuperação da imunoglobulina heteróloga a partir da célula de mamífero recombinante ou do meio de cultura,
d) concentração da solução tamponada aquosa obtida compreendendo a imunoglobulina heteróloga usando uma filtração de fluxo tangencial com pressão da transmembrana e fluxo cruzado variáveis.
[0010] Em uma concretização, a etapa d) do método compreende concentração da solução tamponada aquosa obtida usando uma filtração de fluxo tangencial com pressão da transmembrana e fluxo cruzado variáveis com
i) uma pressão da transmembrana de 0,14 a 0,16 MPa(1,4 bar a 1,6 bar) e um fluxo cruzado de 75 mL/min a 90 mL/min em uma faixa de concentração até 30 mg de imunoglobulina per mL de solução a ser concentrada, ii) uma pressão da transmembrana de 0,08 a 0,09MPa(0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 140 mL/min a 160 mL/min em uma faixa de concentração de 15 mg/mL até 55 mg/mL, e iii) uma pressão da transmembrana de 0,08 a 0,09MPa (0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 120 mL/min a 140 mL/min em uma faixa de concentração de mais do que 45 mg/mL.
[0011] Em outra concretização, o método compreende antes da etapa d) ou após a etapa d) a seguinte etapa:
e) purificação da solução tamponada aquosa contendo a imunoglobulina heteróloga.
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5/27 [0012] Em outra concretização, a imunoglobulina heteróloga é uma imunoglobulina completa, ou um fragmento de imunoglobulina, ou um conjugado de imunoglobulina. Em uma concretização, a célula de mamífero é uma célula CHO, uma célula BHK, uma célula NS0, uma célula Sp2/0, uma célula COS, uma célula HEK, ou uma célula PER.C6®.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0013] A presente invenção reporta um método para concentração de soluções de imunoglobulina a uma concentração de mais do que 100 mg/mL. Verificou-se surpreendentemente que com um método de acordo com a invenção isto pode ser alcançado com baixa formação de agregado e em curto tempo.
[0014] Os termos filtração de fluxo tangencial ou TFF, que são usados permutavelmente dentro da presente invenção, denotem um processo de filtração no qual uma solução contendo um polipeptídeo a ser concentrada escoa ao longo, isto é, tangencial à superfície de uma membrana de filtração. A membrana de filtração tem um tamanho de poro com um certo valor de corte. Em uma concretização o valor de corte está na faixa de 20 kDa a 50 kDa, preferivelmente de 30 kDa. Este processo de filtração é um tipo de um processo de ultrafiltração. O termo fluxo cruzado denota o fluxo da solução a ser concentrada tangencial à membrana (fluxo de retenção). O termo fluxo ou fluxo de permeio, que podem ser usados permutavelmente dentro da presente invenção, denota o fluxo de fluido através da membrana, isto é, através dos poros da membrana. Isto é, ele denota a taxa volumétrica de fluxo do permeio através da membrana. Um fluxo é usualmente dado em termos de volume por unidade de área de membrana por tempo unitário como litros/m2/h (LMH). Em uma concretização, o fluxo cruzado é caracterizado em que o fluxo cruzado está em mL/min para uma área de membrana de 0,02 m2. Em outra concretização, o fluxo cruzado está
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6/27 nas etapas individuais de 240 l/m2/h, 450 l/m2/h, e 390 l/m2/h. O permeio compreende o solvente da solução a ser concentrada, bem como moléculas com um peso molecular abaixo do valor de corte da membrana empregada, mas não a imunoglobulina heteróloga. Os termos pressão da transmembrana ou TMP, que podem ser usados permutavelmente dentro da presente invenção, denotam a pressão que é aplicada para acionar o solvente e componentes menores do que o valor de corte da membrana de filtração através de poros da membrana de filtração. A pressão da transmembrana é uma pressão média da admissão, descarga e permeio, e pode ser calculada como:
TMP _ (Pin + Pont )_ „
HVir — 2 ípermeate [0015] O termo imunoglobulina se refere a uma proteína consistindo de um ou mais polipeptídeo(s) substancialmente codificados por genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante diferentes, bem como o genes de região variável de imunoglobulina miríade. As imunoglobulinas podem existir em uma variedade de formatos, incluindo, por exemplo, Fv, Fab, e F(ab)2, bem como cadeias simples (scFv) ou diacorpos (por exemplo, Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; em geral, Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2a edição (1984); e Hunkapiller, T. e Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16).
[0016] O termo imunoglobulina completa denota uma imunoglobulina que compreende dois assim denominados polipeptídeos de cadeia de imunoglobulina leve (cadeia leve) e dois assim denominados polipeptídeos de cadeia de imunoglobulina pesada (cadeia pesada). Cada um dos polipeptídeos de cadeia de imunoglobulina pesada e leve de uma imunoglobulina completa contém um domínio variável (região variável) (geralmente a porção amino terminal da cadeia de polipeptídeo) compreendendo regiões de ligação
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7/27 que são capazes de interagirem com um antígeno. Cada um dos polipeptídeos de cadeia de imunoglobulina pesada e leve de uma imunoglobulina completa também compreende uma região constante (geralmente a porção carboxil terminal). A região constante da cadeia pesada media a ligação do anticorpo anticorpo i) para células suportando um receptor Fc gama (FcyR), tais como células fagocíticas, ou ii) para células suportando o receptor neonatal Fc (FcRn) também conhecido como receptor Brambell. Ela também media a ligação a alguns fatores incluindo fatores do sistema de complemento clássico tal como componente (C1q). O domínio variável de uma cadeia de imunoglobulina leve ou pesada por sua vez compreende segmentos diferentes, isto é, quatro regiões de estrutura (FR) e três regiões hipervariáveis (CDR).
[0017] O termo fragmento de imunoglobulina denota um polipeptídeo compreendendo pelo menos um domínio do domínio variável, o domínio CH1, a região de articulação, o domínio CH2, o domínio Ch3, o domínio Ch4 de uma cadeia pesada, o domínio de variável ou o domínio CL de uma cadeia leve. Também compreendido estão derivados e variantes destes. Por exemplo, um domínio variável, em que um ou mais aminoácidos ou regiões de aminoácido são anulados, pode estar presente.
[0018] O termo conjugado de imunoglobulina denota um polipeptídeo compreendendo pelo menos um domínio de uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina conjugada via uma ligação de peptídeo a um polipeptídeo adicional. O polipeptídeo adicional é um peptídeo de não-imunoglobulina, tal como um hormônio, ou receptor de crescimento, ou peptídeo antifusogênico, ou fator de complemento, ou similares.
[0019] Métodos cromatográficos gerais e seu uso são conhecidos a um técnico no assunto. Ver, por exemplo, Chromatography, 5a edição,
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Parte A: Fundamentais and Techniques, Heftmann, E. (ed.), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; ou Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York.
[0020] Para a purificação de imunoglobulinas heterólogas recombinantemente produzidas frequentemente uma combinação de etapas de cromatografia de coluna diferente é empregada. Geralmente, uma cromatografia de afinidade A de proteína é seguida por uma ou duas etapas de separação adicionais. A etapa de purificação final é uma etapa assim denominada etapa de polimento para a remoção de impurezas de traço e contaminantes similares a imunoglobulinas agregadas, HCP residual (proteína de célula hospedeira), DNA (ácido nucleico de célula hospedeira), vírus, ou endotoxinas. Para esta etapa de polimento frequentemente um material de troca de ânion em um modo de fluxo é usado.
[0021] Métodos diferentes são bem estabelecidos e usados para recuperação de proteína e purificação, tais como cromatografia de afinidade com proteínas microbiais (por exemplo, cromatografia de afinidade de proteína A ou proteína G), cromatografia de troca de ânion (por exemplo, resinas de troca de cátion (resinas de carboximetila), troca de ânion (resinas de amino etila) e troca de modo misturado), adsorção tiofílica (por exemplo, com beta-mercaptoetanol e outros ligantes de SH), interação hidrofóbica ou cromatografia de adsorção
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9/27 aromática (por exemplo, com fenil-sefarose, resinas de aza-arenofílicas, ou ácido m-aminofenilborônico), cromatografia de afinidade de quelato de metal (por exemplo, com material de afinidade de Ni(II)- e Cu(II)), cromatografia de exclusão de tamanho, e métodos eletroforéticos (tais como eletroforese se gel, eletroforese capilar) (Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).
[0022] O termo imunoglobulina heteróloga denota uma imunoglobulina que não é naturalmente produzida por uma célula de mamífero. A imunoglobulina produzida de acordo com o método da invenção é produzida por meios recombinantes. Tais métodos são amplamente conhecidos no estado da técnica e compreendem expressão de proteína em células eucarióticas com recuperação subsequente e isolamento da imunoglobulina heteróloga, e usualmente purificação a uma pureza farmaceuticamente aceitável. Para a produção, isto é, expressão de uma imunoglobulina, um ácido nucleico que codifica a cadeia leve e um ácido nucleico que codifica a cadeia pesada são inseridos cada em um cassete de expressão por métodos padrões. Os ácidos nucleicos que codificam cadeias leve e pesada de imunoglobulina são prontamente isolados e sequenciados usando procedimentos convencionais. As células de hibridoma servem como uma fonte de tais ácidos nucleicos. Os cassetes de expressão podem ser inseridos em plasmídeo(s) de expressão(ões), que é (são) então transfectado(s) na célula hospedeira, que não produz, de outro modo, imunoglobulinas. A expressão é realizada em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas apropriadas e a imunoglobulina é recuperada a partir das células após lise ou a partir do sobrenadante de cultura.
[0023] O termo solução de imunoglobulina conforme usado dentro do presente pedido denota uma solução tamponada aquosa contendo uma imunoglobulina completa, um fragmento de imunoglobulina, ou um
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10/27 conjugado de imunoglobulina. Esta solução pode ser, por exemplo, um sobrenadante de cultura, ou eluído de cromatografia de coluna, ou uma solução polida de imunoglobulina.
[0024] DNA heterólogo ou polipeptídeo heterólogo se refere a uma molécula de DNA ou um polipeptídeo, ou uma população de moléculas de DNA ou uma população de polipeptídeos, que não existem naturalmente dentro de uma dada célula hospedeira. As moléculas de DNA heterólogas para uma célula hospedeira particular pode conter DNA derivado das espécies de célula hospedeira (isto é, DNA endógeno) considerando-se que DNA hospedeiro é combinado com DNA não-hospedeiro (isto é, DNA exógeno). Por exemplo, uma molécula de DNA contendo um segmento de DNA não-hospedeiro que codificam um polipeptídeo operavelmente ligado a um segmento de DNA hospedeiro compreendendo um promotor é considerado para ser uma molécula de DNA heteróloga. Inversamente, uma molécula de DNA heteróloga pode compreender um gene estrutural endógeno operavelmente ligado com um promotor exógeno. Um peptídeo ou polipeptídeo codificado por uma molécula de DNA não-hospedeira é um peptídeo ou polipeptídeo heterólogo.
[0025] O termo sob condições adequadas para a expressão da imunoglobulina heteróloga denota condições que são usadas para o cultivo de uma célula de mamífero que expressa uma imunoglobulina, e que são conhecidas a, ou podem facilmente ser determinadas por um técnico no assunto. É também conhecido a um técnico no assunto que estas condições podem variar dependendo do tipo de célula de mamífero cultivada e tipo de imunoglobulina expressa. Em geral a célula de mamífero é cultivada a uma temperatura de 20°C a 40°C, e por um período de tempo suficiente para permitir produção de proteína eficaz para produção da imunoglobulina, por exemplo, de 4 a 28 dias.
[0026] O termo célula de mamífero recombinante se refere a uma
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11/27 célula em que um ácido nucleico, por exemplo, que codifica um polipeptídeo heterólogo, pode ser ou é introduzida/transfectada. O termo célula inclui células que são usadas para a expressão de ácidos nucleicos. Em uma concretização, a célula de mamífero é uma célula CHO (por exemplo, CHO K1, CHO DG44), ou uma célula BHK, ou uma célula NS0, ou uma célula SP2/0, ou uma célula HEK 293, ou uma célula HEK 293 EBNA, ou uma célula PER.C6®, ou uma célula COS. Em uma concretização preferida, a célula de mamífero é uma célula CHO, ou uma célula BHK, ou célula HEK, ou célula Sp2/0, ou uma célula PER.C6®. Conforme aqui usado, a expressão célula inclui a célula objeto e sua progenia. Desse modo, o termo célula recombinante inclui a célula transfectada primária e culturas incluindo as células de progenia derivadas ali sem relação ao número de transferências. É também compreendido que toda a progenia pode mão ser precisamente idêntica em teor de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertentes. A progenia variante que tem a mesma função ou atividade biológica como a célula originalmente transformada é incluída.
[0027] O termo tamponado conforme usado dentro deste pedido denota uma solução em que mudanças de pH devido à adição ou liberação de substâncias acídicas ou básicas são niveladas por uma substância tampão. Qualquer substância tampão resultante de tal efeito pode ser usada. Em uma concretização, substâncias tampão farmaceuticamente aceitáveis são usadas, tais como, por exemplo, ácido fosfórico ou sais deste, ácido acético ou sais deste, ácido cítrico ou sais deste, morfolina ou sais desta, 2-(N-morfolino) ácido etanossulfônico ou sais deste, Histidina ou sais desta, Glicina ou sais desta, ou tris (hidroximetil) aminometano (TRIS) ou sais deste. Em uma concretização preferida à substância tampão é ácido fosfórico ou sais deste, ácido acético ou sais deste, ou ácido cítrico ou ais deste, ou histidina ou sais desta. Opcionalmente a solução tamponada
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12/27 compreende um sal adicional, tal como, por exemplo, cloreto de sódio, e/ou sulfato de ódio, e/ou cloreto de potássio, e/ou sulfato de potássio, e/ou citrato de sódio, e/ou citrato de potássio. Em uma concretização da invenção o valor de pH da solução aquosa tamponada é de pH 3,0 a pH 10,0, preferivelmente de pH 3,0 a pH 7.0, mais preferido de pH 4,0 a pH 6.0, e, mais preferido de pH 4,5 a pH 5,5.
[0028] Verificou-se agora surpreendentemente que com um método de filtração de fluxo tangencial (TFF), de acordo com a presente invenção, em que a pressão da transmembrana e fluxo cruzado são variáveis durante o processo de filtração e são adaptados dependendo da concentração real da imunoglobulina na solução a ser concentrada, uma solução de imunoglobulina concentrada com baixa formação de agregado pode ser obtida em um curto tempo. Isto é, verificou-se surpreendentemente que a formação de agregado durante filtrações de fluxo tangenciais baixa se um método de TFF de acordo com a invenção é aplicado, isto é, um método em que durante o processo de filtração, a pressão da transmembrana é mudada e adaptada de acordo com a concentração real da solução de anticorpo. O método de acordo com a invenção é um método variável comparado aos métodos constantes conforme conhecidos da técnica, isto é, métodos em que a pressão da transmembrana é adotada antes do processo de filtração, e é mantido constante durante o processo de filtração de fluxo tangencial total. [0029] A presente invenção compreende um método para concentração de uma solução de imunoglobulina por filtração de fluxo tangencial no qual a pressão da transmembrana e do fluxo cruzado, que são aplicados, são variáveis e mudadas durante o processo de filtração dependendo da concentração de imunoglobulina na solução de imunoglobulina concentrada, pelo que
a) uma pressão da transmembrana de 0,14 a 0,16 MPa(1,4 bar a 1,6 bar) e um fluxo cruzado de 75 mL/min a 90 mL/min é aplicada
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13/27 em uma faixa de concentração até 30 mg de imunoglobulina por mL da solução a ser concentrada,
b) uma pressão da transmembrana de 0,08 a 0,09MPa(0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 140 mL/min a 160 mL/min é aplicada em uma faixa de concentração de 15 mg/mL até 55 mg/mL, e
c) uma pressão da transmembrana de 0,08 a 0,09MPa (0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 120 mL/min a 140 mL/min é aplicada em uma faixa de concentração de mais do que 45 mg/mL. [0030] Uma correlação entre tensão de cisalhamento em TFF e formação de agregado existe. Para avaliar o efeito da tensão de cisalhamento de fluxo induzido Tw na superfície da membrana usada foi calculada com a seguinte fórmula t = (D) no qual dH é d [0031] baseado em Gerhart, et al. (Fundamentals of Fluid Mechanics, Addison-Wesley Publishing Company (1993)) e on Cheryan, et al. (Ultrafiltration e Microfiltration Handbook, segunda edição CRC Press LLC (1998)). Nesta fórmula, dH é o diâmetro hidráulico, a a largura, b a altura, e L o comprimento do canal de fluxo. Adicionalmente, Ap=pi - po, com pi é a admissão pressão aplicada, e po é a pressão de descarga. Em um exemplo a membrana Hydrosart® (Sartocon Slice 200 Hydrosart® of Sartorius AG, Gottingen, Germany) consistindo de celulose regenerada, com um corte de peso molecular nominal de 30 kDa e uma área de membrana de 0,02 m2 foi empregada. Para o cassete de membrana usado, um diâmetro hidráulico de 1,08 mm foi calculado. A membrana foi primeiramente operada com um método de TFF padrão, isto é, sem uma mudança de pressão da transmembrana e fluxo cruzado durante o processo de concentração. Três métodos constantes diferentes com pré-ajuste, constante Ap e um pré-ajuste, pressão da transmembrana constante (TMP) de 0,6 bar foram analisados.
TABELA 1: Resumo de diferenças de pressão aplicadas e a tensão
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de cisalhamento correspondente.
Dp[bar ] t [pa]
1,2 216
1,8 324
3,0 541
[0032] Pela observação do fluxo versus concentração de proteína ascendente não existe diferença significante nas curvas para processos em Ap diferente. Mas para o modo de 0,3MPa(3 bar) uma concentração final mais baixa devido a uma alta admissão pressão foi observada. Comparado a um modo de concentração realizado sob um fluxo cruzado constante inferior (CF; 90 mL/min) e um Ap médio inferior (cerca de 0,09 MPa(0,9 bar)) um Ap mais alto de 0,12 a 0,18MPa(1,2 - 1,8 bar) contribui para um desempenho de fluxo aperfeiçoado sobre o tempo uma concentração final m ais alta (TMP sempre 0,06MPa(0,6 bar)). [0033] Comparando a turbidez, leve obscuramento (LO), e dados de difusão leve dinâmico (DLS) antes e após o processo de concentração mostrou que formação de agregado aumentada foi verificada com tensão de cisalhamento aumentada (figura 2).
[0034] Um método de TFF foi desenvolvido com tempo de processo total comparável comparado ao modo de pressão de admissão de altatensão (Ap = 0,3 MPa (3 bar)), baseado nos experimentos de TMP/CFobservação (ver, por exemplo, Luo, R., et al., Bioprocess Int. 4 (2006) 44-54). O método de acordo com a invenção foi desenvolvido para aperfeiçoar desempenho de fluxo sobre o tempo com formação de agregado de imunoglobulina reduzido, isto é, para combinar uma formação de agregado baixa e um tempo de concentração total curto. Durante o desenvolvimento do método de acordo com a invenção, uma observação de TMP e CF foi realizada dependendo da concentração de imunoglobulina prevalecente na solução de imunoglobulina a ser concentrada. Um método com TMP e CF adaptada dependendo do
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15/27 melhor perfil de fluxo a uma dada concentração foi encontrado. Sem a desvantagem de alta pressão de admissão no estágio final da concentração (ver, por exemplo, Dosmar, M., et al., Bioprocess Int. 3 (2005) 40-50), o método de acordo com a invenção mostrou uma baixa carga de agregação em turbidez, dados de LO, e DLS para os concentrados produzidos (ver figuras 3 e 4). Em adição, uma concentração terminal mais alta foi alcançada com o método de acordo com a invenção.
[0035] No método de acordo com a invenção, a pressão da transmembrana e fluxo cruzado são variados com relação à concentração real da solução de imunoglobulina concentrada. Em uma concretização, o método de acordo com a invenção é um método de filtração de fluxo tangencial variável no qual a concentração real da imunoglobulina na solução a ser concentrada determina a pressão da transmembrana e fluxo cruzado aplicados. Desse modo, a pressão da transmembrana e fluxo cruzado são ajustados dependendo da concentração real da imunoglobulina de modo a reduzir a tensão aplicada e, desse modo, reduzir a formação de moléculas de imunoglobulina agregadas e proporcionar um curto tempo de concentração total.
[0036] No método de acordo com a invenção três faixas de concentração são definidas. A primeira faixa de concentração real da solução a ser concentrada é de 0 mg/mL a 30 mg/mL, a segunda faixa de concentração real é de 15 mg/mL a 55 mg/mL, e terceira faixa de concentração real é de 45 mg/mL a 180 mg/mL. Conforme pode ser visto estas faixas de concentração são faixas de sobreposição. Verificou-se que nas faixas de concentração de sobreposição de 15 mg/mL a 30 mg/mL e de 45 mg/mL a 55 mg/mL, valores diferentes para a pressão da transmembrana e o fluxo cruzado podem ser usados no método de acordo com a invenção. Nestas faixas de concentração de
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16/27 sobreposição qualquer dos dois ajustes de TMP e CF podem ser aplicados sem efeito na formação de agregado ou tempo de processo. [0037] Desse modo, em uma concretização do método de acordo com a invenção, as condições de a) a b) e de b) a c) podem ser mudadas em qualquer valor de concentração nas faixas de concentração de sobreposição.
[0038] Em uma concretização, a faixa de concentração na etapa c) é de 50 mg/mL até 275 mg/mL. Em outra concretização, a pressão da transmembrana e fluxo cruzado é 0,15 MPa(1,5 bar) e 80 mL/min na etapa a), 0,085MPa(0,85 bar) e 150 mL/min na etapa b), e/ou 0,085MPa (0,85 bar) e 130 mL/min na etapa c). Em outra concretização é a solução de imunoglobulina uma solução aquosa tamponada de imunoglobulina. Em uma concretização, a faixa de concentração é na etapa a) de 5 a 25 mg/mL, na etapa b) de 25 a 50 mg/mL, e na etapa c) de 50 a 140 mg/mL. [0039] Outro aspecto da presente invenção é um método para produção de uma imunoglobulina heteróloga compreendendo as seguintes etapas na seguinte ordem:
a) provisão de uma célula de mamífero recombinante compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma imunoglobulina heteróloga,
b) cultivo da célula de mamífero sob condições adequadas para a expressão da imunoglobulina heteróloga,
c) recuperação da imunoglobulina heteróloga a partir da célula de mamífero recombinante ou do meio de cultura como solução tamponada aquosa,
d) concentração da solução tamponada aquosa obtida compreendendo a imunoglobulina heteróloga usando uma filtração de fluxo tangencial com variáveis, concentração de imunoglobulina dependente da pressão da transmembrana e fluxo cruzado.
[0040] Em uma concretização do método de produção de acordo
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17/27 com a invenção compreende etapa d) concentração da solução tamponada aquosa obtida usando uma filtração de fluxo tangencial com variáveis, concentração de imunoglobulina dependente da pressão da transmembrana e fluxo cruzado com
i) uma pressão da transmembrana de 0,14 a 0,16 MPa(1,4 bar a 1,6 bar) e um fluxo cruzado de 75 mL/min a 90 mL/min em uma faixa de concentração até 30 mg de imunoglobulina por mL de solução a ser concentrada, ii) uma pressão da transmembrana de 0,08 a 0,09MPa(0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 140 mL/min a 160 mL/min em uma faixa de concentração de 15 mg/mL até 55 mg/mL, e iii) uma pressão da transmembrana de 0,08 a 0,09MPa (0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 120 mL/min a 140 mL/min em uma faixa de concentração de mais do que 45 mg/mL.
[0041] Em outra concretização, o método compreende antes de, isto é, antes ou após a etapa d) a seguinte etapa:
e) purificação da solução tamponada aquosa contendo a imunoglobulina heteróloga.
[0042] A purificação na etapa e) pode ser por métodos e técnicas diferentes, tais como uma etapa de cromatografia, ou uma combinação de etapas cromatográficas diferentes ou similares, ou precipitação, ou ultrafiltração, ou diafiltração, ou liofilização, ou mudança de tampão, ou combinações destes, ou similares.
[0043] Em outra concretização a imunoglobulina heteróloga é uma imunoglobulina completa, ou um fragmento de imunoglobulina, ou um conjugado de imunoglobulina. Em uma concretização a célula de mamífero é uma célula CHO, uma célula BHK, uma célula NS0, uma célula Sp2/0, uma célula COS, uma célula HEK, ou uma célula PER.C6®. Em uma concretização preferida, a célula de mamífero é uma célula CHO, ou uma célula BHK, ou uma célula HEK, ou uma célula
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Sp2/0, ou uma célula PER.C6®.
[0044] Os seguintes exemplos e figuras são providos para auxiliar a compreensão da presente invenção, o escopo verdadeiro da qual é colocado nas reivindicações em anexo. É compreendido que modificações podem ser feitas nos procedimentos colocados sem fugir do espírito da invenção.
[0045] Um anticorpo anti-IL-IR (ver, por exemplo, WO 2005/023872) e um anticorpo anti-P-selectina (ver, por exemplo, WO 2005/100402) foram disponíveis em quantidades suficientes em nossos laboratórios no momento da invenção e, portanto, a presente invenção é exemplificada com estas duas imunoglobulinas. Do mesmo modo a invenção é, em geral, praticável com qualquer imunoglobulina. Esta descrição exemplificada é feita somente por meio de exemplo e não por meio de limitação da invenção.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0046] Figura 1 Fluxo versus concentração de proteína de uma solução de anticorpo anti-IL-IR antes do inundamento da membrana para modos Ap constantes diferentes e um método de concentração sob CF constante de 90 mL/min 1: método constante Ap = 0,12MPa(1,2 bar), 2: método constante Ap = 0,18 MPa (1,8 bar), 3: método constante Ap = (0,3 MPa (3,0 bar)), 4: método constante CF 90 mL/min.
[0047] Figura 2 Número de partículas antes e após concentração de uma solução de anticorpo anti-IL-IR com método constante. 1: antes da concentração, 2: Tw=216, 3: Tw=324, 4: Tw=541.
[0048] Figura 3 Comparação do número de partículas de uma solução de anticorpo anti-IL-IR ante e após concentração com métodos diferentes.1: antes da concentração, 2: método variável de acordo com a invenção, 3: método constante CF 90 mL/min, 4: Tw=541.
[0049] Figura 4 Fluxo versus concentração de proteína de uma solução de anticorpo anti-IL-IR. 1: método constante CF = 90 mL/min,
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2: Tw=541,3: método variável de acordo com a invenção.
[0050] Figura 5 Fluxo de transmembrana versus pressão da transmembrana de uma solução de anticorpo anti-IL-IR a uma concentração de proteína de 5,3 mg/mL para fluxos cruzados de 50 mL/min (círculos cheios), 80 mL/min (triângulos cheios), e 130 mL/min (quadrados cheios).
[0051] Figura 6 Fluxo de transmembrana versus pressão da transmembrana de uma solução de anticorpo anti-IL-IR a uma concentração de proteína de 45 mg/mL para fluxos cruzados de 80 mL/min (círculos cheios), 130 mL/min (triângulos cheios), e 150 mL/min (quadrados cheios).
[0052] Figura 7 Fluxo de transmembrana versus pressão da transmembrana de uma solução de anticorpo a uma concentração de proteína de 90 mg/mL para fluxos cruzados de 50 mL/min (círculos cheios), 80 mL/min (triângulos cheios), e 130 mL/min (quadrados cheios).
[0053] Figura 8 Fluxo de transmembrana versus pressão da transmembrana de uma solução de anticorpo anti-IL-IR a uma concentração de proteína de 180 mg/mL para fluxos cruzados de 50 mL/min (círculos cheios), 80 mL/min (triângulos cheios), e 130 mL/min (quadrados cheios).
[0054] Figura 9 Análise de particular do concentrado de uma solução de anticorpo anti-IL-IR anticorpo em tampão de citrato obtido por métodos diferentes. 1: antes da concentração, 2: método variável de acordo com a invenção, 3: método constante CF 90 mL/min, 4: método constante Ap = 0,18MPa (1,8 bar), 5: método constante Ap = (0,3 MPa (3,0 bar)).
[0055] Figura 10 Análise de difusão de luz dinâmica do concentrado de uma solução de anticorpo anti-IL-IR em tampão de citrato por métodos diferentes. Rombos cheios: antes da concentração, quadrado
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20/27 cheio: método variável de acordo com a invenção, triângulo cheio: método constante CF 90 mL/min, círculos cheios: método constante AP = 0,18MPa(1,8 bar).
[0056] Figura 11 Medição de turbidez de concentrado de uma solução de anticorpo anti-IL-IR em tampão de citrato obtido por métodos diferentes. 1: antes da concentração, 2: método variável de acordo com a invenção, 3: método constante CF = 90 mL/min, 4: método constante Ap = 0,18MPa (1,8 bar), 5: método constante Ap = (0,3 MPa (3,0 bar)). [0057] Figura 12 Medição de turbidez de concentrado de uma solução de anticorpo anti-IL-IR obtida com o método de acordo com a invenção e um método constante empregando tampões diferente. 1: antes da concentração em tampão de citrato, 2: método variável de acordo com a invenção com tampão de citrato, 3: método constante Ap = (0,3 MPa (3,0 bar)) com tampão de citrato, 4: antes da concentração em tampão de histidina, 5: método variável de acordo com a invenção com tampão de histidina, 6: método constante Ap = (0,3 MPa (3,0 bar)) com tampão de histidina.
[0058] Figura 13 Análise de difusão de luz dinâmica do concentrado obtido por métodos diferentes e obtido em tampão diferente: a) anticorpo anti-IL-IR em tampão de citrato (rombo cheio: antes da concentração, quadrado cheio: após a concentração com método variável de acordo com a invenção, triângulo cheio: método constante Ap = 0,18MPa(1,8 bar), b) anticorpo anti-IL-IR em tampão de histidina (rombo cheio: antes da concentração, quadrado cheio: após concentração com método variável de acordo com a invenção, triângulo cheio: método constante Ap = (0,3 MPa (3,0 bar)).
[0059] Figura 14 Medição de turbidez (a) e resultados de difusão de luz dinâmica (b) da concentração de um anticorpo anti-P-selectin em tampão de histidina. 1: antes da concentração (rombo cheio), 2: método variável de acordo com a invenção (quadrado cheio), 3: método
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21/27 constante Δρ = (0,3 MPa (3,0 bar)) (triângulo cheio).
[0060] Figura 15 Efeito de modo de concentração na filtrabilidade de soluções de imunoglobulina concentradas.
EXEMPLO 1
MÉTODOS ANALÍTICOS
a) Medição de turbidez.
[0061] A absorvência fotométrica foi determinada a 350 nm e 550 nm, onde não havia cromóforos intrínsecos na absorção de solução de anticorpo (UV-VIS spectrophotometer Evolution 500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). As amostras foram medidas não-diluídas. Como um meio de referência, a solução tampão apropriada foi usada. Toda medição foi conduzida três vezes.
b) HPLC de exclusão de tamanho.
[0062] A cromatografia foi conduzida com uma coluna Tosoh Haas TSK 3000 SWXL em um sistema ASI-100 HPLC (Dionex, Idstein, Germany). Os picos de eluição foram monitorados a 280 nm por um detector de arranjo de UV (Dionex). Após dissolução das amostras concentradas a 1 mg/mL, a coluna foi lavada com um tampão consistindo de 200 mM de potássio dihidrogênio fosfato e 250 mM de cloreto de potássio pH 7,0 até que uma linha de base estável foi alcançada. Os cursos de análise foram realizados sob condições isocráticas usando uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min por 30 minutos à temperatura ambiente. Os cromatogramas foram integrados manualmente com Chromeleon (Dionex, Idstein, Germany). A agregação em % foi determinada por comparação da área sob a curva (AUC) de formas de alto peso molecular com a AUC do pico de monômero.
c) Obscuramento de luz.
[0063] Para monitorar a carga da particular em uma faixa de 1-200 pm, um analisador de partícula SVSS-C foi usado (PAMAS
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Partikelmess- und Analysesysteme, Rutesheim, Germany). O sistema foi calibrado de acordo com os requerimentos de US Pharmacopeia Vol. 24, <788>, com esferas de poliestireno perto de monosiza. Três medições de um volume de 0,5 mL com um volume de pré-inundamento de 0,5 mL foram realizados. Os resultados foram calculados como valor médio e referidos a um volume de amostra de 1,0 mL. O número de partículas contado estava dentro do limite de concentração do sensor.
d) Difusão de luz dinâmica (DLS).
[0064] DLS é uma técnica não-invasiva para medição de tamanho de partícula, tipicamente na faixa de tamanho de submícron. Na presente invenção, o aparelho Zetasizer Nano S (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) com uma cubeta de quartzo controlada por temperatura (25 °C) foi usada para monitoramento de uma faixa de tamanho entre 1 nm e 6 pm. A intensidade da luz de laser difundida posterior foi detectada em um ângulo de 173°. A intensidade flutua a uma taxa que é dependente da velocidade de difusão de partícula, que, por sua vez, é governada pelo tamanho de partícula. Os dados de tamanho de partícula podem, portanto, ser gerados de uma análise da flutuação na intensidade de luz difundida (Dahneke, B.E. (ed), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983); Pecora, R., Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press (1985)). A distribuição de tamanho por intensidade foi calculada usando o modo estreito múltiplo do software DTS (Malvern). Os experimentos foram conduzidos com amostras não-diluídas.
e) Espectroscopia de infra vermelho de transformada de Fourier. [0065] Os espectros de FT-IR das soluções de proteína nãodiluídas foram registrados pelo uso de um espectrômetro Tensor 27 (Bruker Optik, Ettlingen, Germany) com uma célula de transmissão de fluxo (AquaSpec) conectada a um termostato. Para cada espectro, um
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23/27 interferograma de varredura 120 foi coletado em um modo de feixe simples com uma redução de 4 cm-1. Como meio de referência, o aparelho de permeio apropriado foi usado. O interferograma coletado da proteína e o sistema de tampão foram transformada de Fourier. Adicionalmente, o espectro da proteína foi corrigido para o espectro do sistema de tampão correspondente.
EXEMPLO 2
DETERMINAÇÃO DE CONDIÇÕES DE TMP E CF [0066] Uma solução aquosa tamponada de citrato condicionada e filtrada (pH 5,5) do anticorpo anti-IL-IR foi concentrada vinte vezes até 100 mg/mL pelo uso de um sistema automático de TFF AKTAcrossflow® (GE Healthcare, Amersham Bioscience AB, Uppsala, Sweden) pelo emprego de um cassete de chapa plana escalável (Sartorius, Gottingen, Germany) com uma membrana Hydrosart® de celulose regenerada, com um corte de peso molecular nominal de 30 kDa e uma área de membrana de 0,02 m2. Programas de concentração diferentes gerados com o software UNICORN de controle AKTAcrossflow® foram realizados. O carregamento de membrana total foi cerca de 400 g/m2. [0067] Os perfis de fluxo e pressão em quatro pressões de transmembrana pré-ajustadas são determinados em concentrações diferentes de imunoglobulina na solução de imunoglobulina a ser concentrada com relação a fluxos cruzados diferentes. O TMP foi ajustado para 0,03MPa(0,3 bar),0,05 MPa (0,5 bar), 0,09 MPa (0,9 bar), ou (0,2 MPa (2,0 bar)). Os fluxos cruzados para cada TMP e concentração de proteína foram 50 mL/min, 80 mL/min, 130 mL/min (não em 45 mg/mL de concentração de proteína), e 150 mL/min (somente em 45 mg/mL de concentração de proteína). As concentrações de proteína diferentes foram 5,3 mg/mL, 45 mg/mL, 90 mg/mL, e 180 mg/mL. Os resultados são mostrados nas figuras 5 a 8. [0068] Verificou-se durante os processos de concentração que um
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24/27 alto fluxo de alimentação e uma alta pressão de alimentação resulta em um bom fluxo de transmembrana. Mas durante o processo de concentração, especialmente no final, uma camada de polarização é estabelecida resultando em uma sobre expressão de membrana e também em um fluxo reduzido (permeio). Verificou-se que uma pressão de alimentação aumentada resulta em um fluxo mais altos e, portanto, um processo de concentração rápido, mas esta aceleração é acompanhada por uma formação de agregado aumentada (figuras 9 a 11).
[0069] Levando-se em consideração o acima, as faixas e condições para um método aperfeiçoado para concentração de imunoglobulina foram verificadas serem:
- uma pressão da transmembrana de 0,14 a 0,16MPa(1,4 bar a 1,6 bar) e um fluxo cruzado de 75 mL/min a 90 mL/min em uma faixa de concentração até 30 mg de imunoglobulina por mL de solução a ser concentrada,
- uma pressão da transmembrana de 0,08 a 0,09MPa(0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 140 mL/min a 160 mL/min em uma faixa de concentração de 15 mg/mL até 55 mg/mL, e
- uma pressão da transmembrana de 0,08 a 0,09MPa (0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 120 mL/min a 140 mL/min em uma faixa de concentração de mais do que 45 mg/mL.
[0070] Estes parâmetros resultam em um método com uma formação de agregado reduzida e um curto tempo de concentração. EXEMPLO 3
COMPARAÇÃO DO MÉTODO VARIÁVEL DE ACORDO COM A
INVENÇÃO A CONSTANTES DE MÉTODO.
[0071] O método de acordo com a invenção foi comparado a métodos de parâmetro constantes diferentes para a produção de uma solução de imunoglobulina concentrada. A concentração alvo foi
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25/27 ajustada para 90 mg/mL. A filtração de fluxo tangencial foi realizada com os dispositivos de acordo com Exemplo 2. os parâmetros diferentes dos métodos comparados (métodos 1 a 4 são constantes de método, método 5 é o método variável de acordo com a invenção) foram os seguintes:
Método 1: pressão da transmembrana = 0,06MPa(0,6 bar)
Fluxo cruzado = 90 mL/min Ap = 0,07MPa(0,7 bar)
Método 2: pressão da transmembrana = 0,06MPa(0,6 bar)
Ap = 0,12MPa(1,2 bar)
Método 3: pressão da transmembrana = 0,06MPa (0,6 bar)
Ap = 0,18MPa(1,8 bar)
Método 4: pressão da transmembrana = 0,06MPa (0,6 bar)
Ap = 0,3 MPa(3,0 bar)
Método 5: a) pressão da transmembrana = 0,15MPa(1,5 bar), Ap = 0,05MPa(0,5 bar),
b) pressão da transmembrana = 0,085MPa(0,85 bar), Ap =
0,12MPa(1,2 bar),
c) pressão da transmembrana = 0,085MPa(0,85 bar).
[0072] Os parâmetros diferentes e o tempo requerido para alcançar uma concentração da solução de imunoglobulina para uma concentração de imunoglobulina de 90 mg/mL são mostrados na Tabela
2.
TABELA 2: Comparação dos parâmetros para métodos de concentração diferentes.
Método AP TMP Pressão de alimentação Pressão de ret Fluxo de alimentação Fluxo de rete Partículas >pm/mL Tempo
1 0,07 MPa(0, 7 bar) 0,06 MPa (0,6 bar) 0,12 MPa (1,2 bar) 0,05 MPa (0,5 bar) 100 mL/min 90 mL/min 7321820 149 min.
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Método AP TMP Pressão de alimentação Pressão Fluxo de alimentação Fluxo Partículas Tempo
de ret de rete >pm/mL
0,12
2 MPa 0,06 MPa 0,14 MPa 0,02 MPa 170 mL/min 160 15403850 126
(1,2 (0,6 bar) (1,4 bar) (0,2 bar) mL/min min.
bar)
3 0,18 MPa 0,06 MPa 0,21 MPa 0,03 MPa 230 mL/min 215 16989540 125
(1,8 (0,6 bar) (2,1 bar) (0,3 bar) mL/min min.
bar)
0,3
4 MPa 0,06 (0,6 0,28 MPa 0,02 MPa 300 mL/min 280 19415180 116
(3,0 bar) (2,8 bar) (0,2 bar) mL/min min.
bar)
0,05 MPa 0,015 MPa 0,15 MPa 80 118
5 0,2 (2,0 bar) 100 mL/min 12182240
(0,5 (1,5 bar) (1,5 bar) mL/min min.
bar)
0,12
MPa 0,085 MPa 0,17 MPa 0,05 MPa 165 mL/min 150
(1,2 (0,85 bar) (1,7 bar) (0,5 bar) mL/min
bar) 0,085 MPa 0,05 MPa 130
__ __ 135 mL/min
(0,85 bar) (0,5 bar) mL/min
[0073] A partir dos resultados dos métodos diferentes, pode ser visto que com o método 5, isto é, com um método variável, comparado a métodos 2 a 4, uma formação de agregado dramaticamente reduzida pode ser obtida e, desse modo, um concentrado de imunoglobulina com características aperfeiçoadas. Comparado ao método 1, um processo de concentração mais rápido pode ser alcançado.
EXEMPLO 4
CONCENTRAÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-IL-IR EM SISTEMAS DE
TAMPÃO DIFERENTES [0074] Uma concentração comparativa de um tampão de solução aquosa anti-IL-IR com tampão de citrato ou tampão de histidina foi realizada com o dispositivo do Exemplo 2 e o método de acordo com a invenção (método 5 do Exemplo 3). Os resultados são mostrados nas figuras 12 e 13. A partir da figura 12 e figura 13, respectivamente, pode
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27/27 ser visto que o tampão empregado não tem efeito no processo de concentração de acordo com a invenção.
EXEMPLO 5
CONCENTRAÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-P-SELECTIN [0075] A concentração de um anticorpo anti-P-selectin foi realizada de acordo com o método do Exemplo 2 e os resultados são mostrados na figura 14.
EXEMPLO 6
FILTRAÇÃO DE SOLUÇÃO CONCENTRADA [0076] A solução concentrada obtida de acordo com o método do Exemplo 2 foi filtrada após a filtração de fluxo tangencial com uma pressão de (0,75 bar) através de uma membrana Durapore (PVDF, Millipore GmbH, Schwalbach, Germany) (área de filtro de 4,52 cm2). [0077] Verificou-se que a filtrabilidade de soluções de imunoglobulina altamente concentradas depende do método de concentração empregado. Verificou-se adicionalmente que a solução de imunoglobulina concentrada obtida com o método variável de acordo com a invenção mostra um declínio reduzido no fluxo de filtração quando comparada com outros métodos fixos (figura 15).
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Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para concentração de uma solução de imunoglobulina por filtração de fluxo tangencial, caracterizado pelo fato de que a pressão da transmembrana e o fluxo cruzado são variáveis e alteráveis durante o processo de filtração dependendo da concentração de imunoglobulina com;
    (a) uma pressão da transmembrana de 0,14 MPa a 0,16 MPa (1,4 bar a 1,6 bar) e um fluxo cruzado de 75 mL/min a 90 mL/min em uma faixa de concentração até 30 mg de imunoglobulina por mL de solução a ser concentrada, (b) uma pressão da transmembrana de 0,08 MPa a 0,09 MPa (0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 140 mL/min a 160 mL/min em uma faixa de concentração de 15 mg/mL até 55 mg/mL, (c) uma pressão da transmembrana de 0,08 MPa a 0,09 MPa (0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 120 mL/min a 140 mL/min em uma faixa de concentração de 50 mg/mL a 275 mg/mL;
    sendo que a concentração real de imunoglobulina na solução a ser concentrada determina a pressão da transmembrana aplicada e o fluxo cruzado são ajustados dependendo da concentração real da imunoglobulina
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pressão da transmembrana e fluxo cruzado são;
    - 0,15 MPa (1,5 bar) e 80 mL/min na etapa a),
    - 0,085 MPa (0,85 bar) e 150 mL/min na etapa b), e/ou
    - 0,085 MPa (0,85 bar) e 130 mL/min na etapa c).
  3. 3. Método para produção de uma imunoglobulina, que não é naturalmente produzida por uma célula de mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
    (a) provisão de uma célula de mamífero recombinante compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam uma
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    2/3 imunoglobulina que não é naturalmente produzida por uma célula de mamífero, (b) cultivo de referida célula sob condições adequadas para a expressão da imunoglobulina que não é naturalmente produzida por uma célula de mamífero, (c) recuperação da imunoglobulina que não é naturalmente produzida por uma célula de mamífero da célula de mamífero recombinante ou do meio de cultura, (d) concentração da solução tamponada aquosa obtida que compreende a imunoglobulina que não é naturalmente produzida por uma célula de mamífero usando uma filtração de fluxo tangencial com pressão da transmembrana e fluxo cruzado variáveis, como definidos na reivindicação 1.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende, antes ou após a etapa (d), a seguinte etapa:
    (e) purificação da solução tamponada aquosa contendo a imunoglobulina que não é naturalmente produzida por uma célula de mamífero.
  5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a imunoglobulina que não é naturalmente produzida por uma célula de mamífero é uma imunoglobulina completa, ou um fragmento de imunoglobulina, ou um conjugado de imunoglobulina.
  6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que a célula de mamífero é uma célula CHO, uma célula BHK, uma célula HEK, uma célula Sp2/0, ou uma célula PER.C6®.
  7. 7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que referida filtração de fluxo tangencial
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    3/3 emprega uma membrana com um valor de corte na faixa de 20 a 50 kDa de peso molecular.
  8. 8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que referida solução de imunoglobulina apresenta um valor de pH de pH 3,0 a pH 10,0.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que referido valor de pH está na faixa de pH 3,0 a pH 7,0.
  10. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a pressão da transmembrana e fluxo cruzado podem ser mudados;
    (a) uma pressão da transmembrana de 0,14 MPa a 0,16 MPa (1,4 bar a 1,6 bar) a uma pressão transmembrana de 0,08 MPa a 0,09 MPa (0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 75 mL/min a 90 mL/min a um fluxo cruzado de 140 mL/min a 160 mL/min em uma faixa de concentração de 15mg/mL a 50 mg/mL e;
    (b) uma pressão da transmembrana de 0,08 MPa a 0,09 MPa (0,8 bar a 0,9 bar) a uma pressão transmembrana de 0,08 MPa a 0,09 MPa (0,8 bar a 0,9 bar) e um fluxo cruzado de 140 mL/min a 160 mL/min a um fluxo cruzado de 120 mL/min a 140 mL/min em uma faixa de concentração de 50 mg/mL a 55 mg/mL.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que a faixa de concentração é na etapa (a) de 5 a 25 mg/mL, na etapa (b) de 25 a 50 mg/mL, e na etapa (c) de 50 a 140 mg/mL.
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    W)
    O
    O
    CN
    O
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    Ό
    O
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    O
    CN
    Concentração de proteína [mg/ml] [hpíII °xnH
    O
    2/15 cq
    ΟΧ)
    Ε
    Tensão de cisalhamento pu / seinojpea
    3/15 γό do
    Ξ pu / seinoiyed
    Amostra
    4/15
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    Concentração de proteína [mg/ml] [hwtlI °xnH
    5/15 ir>
    6JD
    E [ΗΙΛΙΊ] oxn|j
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    TMP [ bar]
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    OJD
    E [ΗΙΛΙΊ] χημ
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    9/15 ©\
    ΟΧ)
    Ξ (Ν
    Amostra ο
    m
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    ιη |UJ / sBinoi^Bd
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5697268B2 (ja) * 2009-09-29 2015-04-08 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ バッファー溶質のろ過前調整方法
AU2010302662B2 (en) 2009-10-01 2015-11-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Multistep final filtration
EP2727643A1 (en) 2012-10-31 2014-05-07 Takeda GmbH Cross-flow ultrafiltration device and method for concentration of pharmaceutical compositions
US9439864B2 (en) * 2014-07-07 2016-09-13 Antriabio, Inc. Solvent extraction from biodegradable microparticles
GB201600287D0 (en) 2016-01-07 2016-02-24 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Process
WO2024012364A1 (en) * 2022-07-12 2024-01-18 Beigene Switzerland Gmbh Preparation methods for a highly concentrated pd1 antibody solution by ultrafiltration/diafiltration (uf/df)

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5256294A (en) * 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
GB9610992D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Glaxo Group Ltd Concentrated antibody preparation
US6365395B1 (en) * 2000-11-03 2002-04-02 Millipore Corporation Process for removing protein aggregates and virus from a protein solution
WO2004001007A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Idec Pharmaceuticals Corporation Buffered formulations for concentrating antibodies and methods of use thereof
CN1226418C (zh) * 2002-07-12 2005-11-09 广东欧瑞卡生物工程有限公司 天然活性蛋白质和肽的分离纯化方法
CN1759189A (zh) * 2003-02-24 2006-04-12 Gtc生物治疗学公司 切向流过滤方法及其装置
AR045614A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el recepctor de la interleuquina- 1 y los usos de los mismos
US20050197496A1 (en) 2004-03-04 2005-09-08 Gtc Biotherapeutics, Inc. Methods of protein fractionation using high performance tangential flow filtration
ES2403055T3 (es) 2004-04-13 2013-05-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-P-selectina
US20060051347A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Winter Charles M Process for concentration of antibodies and therapeutic products thereof
TW200640443A (en) 2005-02-23 2006-12-01 Alcon Inc Methods for treating ocular angiogenesis, retinal edema, retinal ischemia, and diabetic retinopathy using selective RTK inhibitors

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