BRPI0813744B1

BRPI0813744B1 - Método para rechear uma primeira coluna com uma suspensão espessa de um meio cromatográfico para obter uma altura de leito desejada de meio recheado dentro da coluna

Info

Publication number: BRPI0813744B1
Application number: BRPI0813744-7A
Authority: BR
Inventors: Sven Marcus Joakim Lundkvist; Esfir Lovman; Hanno Ehring
Original assignee: Ge Healthcare Bio-Sciences Ab
Priority date: 2007-07-06
Filing date: 2008-07-04
Publication date: 2021-01-05
Also published as: EP2167952A1; CA2691189A1; CA2691189C; US20090007643A1; BRPI0813744B8; BRPI0813744A2; KR101513750B1; KR20100065140A; WO2009007321A1; CN101688853A; CN101688853B; JP5734649B2; JP2010532470A; US8117901B2; EP2167952B1

Abstract

métodos para determinar a concentrração de um meio cromatográfico em uma suspensão espessa líquida, e para rechear uma primeira coluna com uma suspensão espessa de um meio cromatográfico para obter uma altura de leito desejada de meio recheado dentro da coluna, e, dispositivo para determinar a concentração de um meio cromatográfico em uma suspensão espessa líquida um método para determinar a concentração de um meio cromatográfico em uma suspensão espessa líquida compreende as etapas de prover uma coluna (1) tendo uma extremidade de topo (3) e uma extremidade de base (2) e adaptada para reter um meio cromatográfico nela, introduzir um volume definido da suspensão espessa (15) dentro da coluna (1), prover um fluxo de líquido através da coluna (1) a partir da extremidade de topo até a extremidade de base da coluna, para precipitar o meio cromatográfico na coluna, medir a altura do leito do meio cromatográfico consolidado ou um valor relacionado com ele e determinar pela altura de leito medida ou valor relacionado com ela a concentração ou um valor relacionado com a concentração do meio cromatográfico na suspensão espessa. um dispositivo para realizar o método, bem como o uso do método no recheio de colunas especialmente de grande proporção são também descritos.

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

O presente pedido relaciona-se com um método e um dispositivo para determinar a concentração de um meio cromatográfico em uma suspensão espessa ou suspensão líquida, bem como ao uso do método em recheio de coluna cromatográfica.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A cromatografia é uma técnica bem estabelecida e valiosa em trabalho tanto preparativo como analítico, bem como em genericamente em purificação. O aparelho de cromatografia industrial típico tem um recinto, ou coluna, ereto, em que um leito de material de recheio, usualmente um meio particulado, repousa contra uma camada de retenção permeável. A fase móvel fluida entra através de uma entrada, p. ex., no topo da coluna, usualmente através de uma malha porosa, perfurada ou outra camada de permeabilidade restringida, move-se através do leito recheado e é levado para fora por uma saída, tipicamente embaixo de uma camada de permeabilidade restringida.

O leito de material de recheio é usualmente colocado na coluna pela aplicação de uma quantidade definida de uma suspensão espessa do meio na coluna e assentando-se o meio na coluna por um fluxo de líquido através da coluna. O conhecimento da concentração de suspensão espessa é muito vital quando recheando-se colunas em qualquer proporção mas em primeiro lugar em piloto para processar a proporção de modo que a correta quantidade de meio possa ser transferida para a coluna. Isto é necessário para obter-se a correta altura de leito na correta compressão em uma maneira reprodutível. Este é atualmente um dos aspectos mais fracamente controlados de recheio de coluna e provoca muitas tentativas fracassadas.

Hoje em dia, a concentração de suspensão espessa é com frequência medida por precipitação por gravidade em um cilindro graduado durante a noite. Isto requer planejamento e precisão, que está com frequência faltando. Além disso, muitos meios não se sedimentam totalmente após a precipitação noturna que é padrão, mas requer tempo mais longo. Isto é com frequência negligenciado e a concentração de suspensão espessa medida com frequência desvia-se muito do valor correto.

Há, portanto, uma necessidade de meios que possam simplificar a determinação da concentração, bem como aumentar a qualidade da determinação que introduz menos variação no processo, variando-se a compressão do leito, altura do leito ou ambas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da invenção é prover um método aperfeiçoado para determinar a concentração de suspensão espessa. Com este método é possível medirem-se as concentrações de suspensão espessa precisamente dentro de um curto tempo, p. ex., dentro de 1 hora. A aplicabilidade geral do método torna-o adequado para todos os tipos de meios de cromatografia.

Outro objetivo da invenção é prover um método aperfeiçoado de recheio de coluna que compreende o uso no recheio da coluna do método acima mencionado para determinar a concentração de suspensão espessa.

Isto é conseguido com um dispositivo que pode ser tornado simples e pode opcionalmente ser de tipo descartável.

Em uma forma de realização preferida do método para determinar concentração de suspensão espessa, o método inclui uma etapa de lavar o volume do meio transformado em suspensão espessa usado para determinação da concentração, antes da concentração ser medida.

Outras formas de realização adequadas são descritas nas reivindicações pendentes.

A seguir, a invenção será descrita mais detalhadamente, como exemplo somente e não limitação, pela seguinte descrição, em que é feita referência aos desenhos anexos. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma vista esquemática de um dispositivo de acordo com a invenção para determinar a concentração de suspensão espessa, onde a coluna foi enchida com um volume definido de uma suspensão espessa cuja concentração é para ser determinada. A Figura 2 é uma vista similar à Figura 2, onde a extremidade de topo da coluna foi fechada por uma tampa. A Figura 3 é uma vista similar à da Figura 2, onde lavagem da suspensão espessa foi iniciada com um contrafluxo de líquido da base para o topo da coluna. A Figura 4 é uma vista similar à da Figura 3, onde líquido de lavagem com meio misturado nele estende-se ate o topo da coluna (e o meio começa a rechear contra o topo). A Figura 5 é uma vista similar às das Figuras 3 e 4, em que a consolidação do meio foi iniciada introduzindo-se um fluxo de líquido do topo até a base da coluna. A Figura 6 é uma vista similar à da Figura 5, onde o recheio é completado e a altura do leito/concentração de suspensão espessa podem ser lidas na coluna.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como mencionado acima, a presente invenção provê um método e dispositivo para medir a concentração de um meio cromatográfico em uma suspensão espessa líquida (suspensão). O conhecimento da concentração de suspensão espessa então torna possível utilizar a suspensão espessa para rechear especialmente uma coluna de grande proporção com a correta quantidade de meio, para obter-se a correta altura de leito na correta compressão. Em resumo, o método compreende sedimentar a suspensão espessa em uma coluna pela utilização de um fluxo (isto é, similar ao recheio de meio na coluna de grande proporção, porém não necessariamente com a mesma taxa de fluxo) e então medir a altura do meio consolidado, para obter- se a concentração de suspensão espessa ou um valor ou medida relacionado com a concentração de suspensão espessa. Embora o método da invenção possa ser usado com relação recheio de colunas em qualquer proporção, é contemplado ser do máximo benefício rechear as colunas no piloto em escala de processo. Uma forma de realização do dispositivo será agora descrita com referência às Figuras 1 a 6. Partes correspondentes têm as mesmas designações de referência por todas as Figuras.

O dispositivo ilustrado nas Figuras 1 a 6 compreende uma coluna cromatográfica 1, tendo peças extremas na forma de uma tampa de base 2 e uma tampa de topo 3, ambas incluindo filtros ou similar e para reter um meio cromático na coluna (na Figura 1, a tampa de topo 3 é removida da extremidade de topo da coluna). A tampa de base 2 tem uma entrada/saída 4 que, via um conduto 5, é conectada à válvula seletora 6. Similarmente, a tampa de topo tem uma entrada/saída 7 que, via um conduto 8, é conectada à válvula 6. A válvula 6 é também um conduto 9 conectado a uma bomba 10 que, por sua vez, via um conduto 11 é conectada a um vaso 12 com líquido (tampão) 13, p. ex., água. O líquido 13 é preferivelmente o mesmo que ou pelo menos representativo para o líquido que será usado para rechear a coluna de larga proporção (usualmente a suspensão espessa está em uma solução de armazenagem, p. ex., 20% de etanol, que serão substituídos quando recheando-se a coluna de grande proporção). Um conduto 14 conecta a bomba 10 via a válvula seletora 6 ao refugo (não mostrado). A coluna é, no caso ilustrado, provida com uma escala 15 (pode, entretanto, ser substituída por outro meio, tal como uma régua transparente ou similar). A medição da concentração de suspensão espessa na coluna 1 pode ser realizada como segue.

Com referência primeiro à Figura 1, com a tampa de topo 3 removida do topo da coluna, um volume definido de suspensão espessa 16, cuja concentração (ou um valor relacionado com a concentração) é para ser medida, é colocado na coluna 1 através do topo de coluna aberto, como indicado pela seta 17, p. ex., adicionado até um nível predeterminado, p. ex., 100 mm de altura. Quando a coluna não está completamente enchida com suspensão espessa 16, água 18 é adicionada para completamente encher a coluna. A tampa de topo 3 é então fixada sobre o topo da coluna, como mostrado na Figura 2.

Com referência agora à Figura 3, a válvula seletora 6 é colocada para conectar a bomba 10 na entrada de base de coluna 4 e a saída de coluna 7 ao refugo, e a bomba é acionada para realizar um fluxo de tampão de lavagem 13 do vaso 12 através da coluna 1, na direção da base para o topo da coluna, como indicado pela seta 19. Neste processo, o meio será misturado com líquido por todo o volume de coluna como mostrado na Fig. 4. Após uma apropriada quantidade de líquido de lavagem ter passado através da coluna, p. ex., cinco volumes de coluna, a suspensão espessa 16 é liberada por lavagem da solução de armazenagem.

O fluxo de líquido através da entrada de base de coluna 4 é então parado e a válvula 6 é colocada para conectar a bomba 10 à entrada de topo 7 da coluna e a entrada de base 4 ao refugo. Opcionalmente, o conteúdo dentro da coluna é agora misturado ou ressuspenso manualmente (após remoção da tampa de topo 3). A bomba 10 é então acionada para bombear o tampão 13 do vaso 12 através da entrada de topo 7, para provocar um fluxo descendente através da coluna 1, como indicado pela seta 19 da Figura 5. O fluxo através da coluna é continuado até o meio ter sido sedimentado na parte inferior da coluna e o líquido 13 através do leito de meio consolidado estar livre de partículas de meio visíveis, como indicado na Figura 6. Quando o fluxo foi parado, o leito de meio é permitido estabilizar por algum tempo, digamos, p. ex., 30 minutos. Em seguida o valor para o nível de topo do leito de meio é lido na escala 15 da coluna 1, como indicado na Figura 6 pela seta 20. Como mencionado acima, este valor pode ser a altura de leito ou um valor relacionado com ela. Este valor pode então ser usado para calcular a quantidade de suspensão espessa que é para ser adicionada à coluna de larga proporção, para obterem-se as corretas altura de leito e compressão de leito. Adequadamente, uma tabela, diagrama, gráfico ou similar é provido, pelo qual a quantidade de suspensão espessa pode ser lida para diferentes valores lidos na escala e, preferivelmente também para diferentes meios cromatográficos.

Ótimas taxas e tempos de fluxo para lavar e sedimentar (consolidar) o meio podem variar, dependendo do meio particular usado. Tal otimização pode, entretanto, prontamente ser realizada por uma pessoa hábil na arte.

Opcionalmente, a direção do fluxo pode ser revertida uma ou mais vezes (fluxo pulsante) durante o procedimento de lavagem.

Para altas concentrações de suspensão espessa (p. ex., acima de 60 % em vol.) podem surgir problemas devidos a sedimentação menos densa do meio. Isto pode facilmente ser corrigido pela adição de um volume definido de líquido, p. ex., água, na coluna antes de adicionar suspensão espessa ao nível predefinido e realizar um cálculo simples.

É prontamente visto que o método e dispositivo acima descritos podem convenientemente ser automatizados.

No seguinte Exemplo específico, uma forma de realização do método da presente invenção é descrito que, embora possa ser usado com o dispositivo descrito acima e mostrado nas Figuras 1 a 6, utiliza uma seringa em vez de uma bomba, válvula e condutos associados.

EXEMPLO Medição da concentração de suspensão espessa

Este método é realizado com uma coluna TricornTM 10. Uma seringa é usada no método descrito a baixo, porém uma bom ba pode também ser usada. A suspensão espessa é adicionada à coluna, em seguida lavada, ressuspensa e permitida sedimentar-se por 30 min antes de a concentração ser medida. O método é preciso para concentrações de suspensão espessa abaixo de 60% (vol.). Para concentrações mais elevadas, diluir a suspensão espessa pela adição de exatamente 4 ml de água à coluna TricornTM antes da adição do meio da etapa 5. Calcular a concentração do tambor ou tanque (de que o volume de amostra de suspensão espessa é tirado) dividindo-se a concentração medida pelo fator de diluição 0,6. Enchimento de coluna 1. Fixação da peça extrema da base com um filtro na coluna TricornTM 10. 2. Cuidadosamente colocar uma fita na régua transparente sobre o lado da coluna, a fim de que o ponto zero sobre a régua coincida com a superfície do filtro de base. 3. Colocar um tampão na saída da base. 4. Colocar a coluna em uma posição vertical. 5. Adicionar suspensão espessa totalmente misturada na coluna com uma pipeta Pasteur embaixo da marca de 10 cm, para evitar meio sobre a parede da coluna. Encher até 10 cm serem alcançados. 6. Adicionar água até o corpo de vidro da coluna ser enchido. 7. Fixar uma peça extrema com filtro sobre o topo da coluna. Etapa de lavagem 1. Fixar uma seringa de 20 ml enchida com água destilada no topo da coluna. 2. Remover o tampão da saída de base da coluna 3. Lavar pressionando a seringa em um fluxo aproximado de 6 - 10 ml/min. 4. Lavar com um total de 50 - 60 ml de água destilada e evitar comprimir ar para dentro da coluna. 5. Substituir o tampão. Ressuspender e sedimentar 1. Remover a peça extrema superior 2. Mistura o meio da coluna completamente agitando com uma apropriada ferramenta. 3. Substituir a peça extrema superior. Evitar ar. 4. Fixar uma seringa de 20 ml enchida com água destilada na peça extrema superior. 5. Remover o tampão da saída da base da coluna. 6. Pressionar a seringa a 6 - 10 ml/min até o líquido sobre o leito de meios estar livre de partículas. 7. Parar o fluxo. 8. Substituir o tampão. Determinação da concentração de suspensão espessa 1. Permitir que o leito estabilize por 30 min sem fluxo. 2. Ler a altura do leito.

A altura após 30 min corresponde à concentração de suspensão espessa na amostra.

O método foi validado para CaptoTM S (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Suécia), um meio que se sedimenta muito frouxamente em sua solução de armazenagem; por exemplo, o mesmo volume de meio fornece 59% (vol.) em solução de armazenagem e 53% (vol.) em água. Se este meio não for lavado completamente livre de seu tampão de armazenagem, a medição da concentração será muito errônea. Qualquer condutividade do tampão resulta nestes efeitos.

Pelo precedente, observamos que, embora formas de realização específicas desta invenção tenham sido descritas aqui para fins de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem desvio do espírito e escopo da invenção. Portanto, a invenção não é limitada, exceto pelas 5 reivindicações anexas.

Claims

1. Método para rechear uma primeira coluna com uma suspensão espessa de um meio cromatográfico para obter uma altura de leito desejada de meio recheado dentro da coluna, dito método, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: determinar a concentração de um meio cromatográfico em uma suspensão espessa líquida usando uma segunda coluna (1), compreendendo as etapas de: prover uma coluna (1) tendo uma extremidade de topo (3) e uma extremidade de base (2) e adaptada para reter nela um meio cromatográfico, introduzir um volume definido de suspensão espessa (15) dentro da coluna (1), prover um fluxo de líquido através da coluna (1) da extremidade de topo até a extremidade de base da coluna, para sedimentar o meio cromatográfico na coluna, medir a altura do leito do meio cromatográfico consolidado ou um valor relacionado com ela, e determinar pela altura de leito medida a concentração do meio cromatográfico na suspensão espessa, determinar pela concentração de suspensão espessa determinada, a quantidade de suspensão espessa a ser introduzida dentro da coluna, para obter-se a altura de leito desejada ali, e encher a coluna com a quantidade de suspensão espessa determinada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de, antes da sedimentação do meio cromatográfico, o meio ser submetido a uma etapa de lavagem dentro da coluna (1).

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a etapa de lavagem compreender escoar um líquido através da coluna (1) da extremidade de base (2) em direção à extremidade de topo (3) da coluna.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a etapa de lavagem compreender escoar um líquido através da coluna (1), da extremidade de topo (3) em direção à extremidade de base (2) da coluna (1) e misturar o meio da coluna antes de sedimentar o meio na coluna.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a etapa de lavagem compreender escoar um líquido através da coluna (1) alternativamente da extremidade de base (2) em direção à extremidade de topo (3) e da extremidade de topo (3) em direção à extremidade de base (2) da coluna.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de o líquido da etapa de lavagem ser outro que não o líquido da suspensão espessa.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de o meio sedimentado ser permitido estabilizar por um tempo definido antes de medir a altura do leito ou um valor relacionado com ela.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de a segunda coluna (1) ser substancialmente menor do que a primeira coluna.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de a primeira coluna ser uma coluna tipo piloto ou uma coluna tipo de processo e a segunda coluna (1) ser uma coluna tipo laboratório.