BRPI0807737A2 - Tecnologia de plataforma farmacêutica para o desenvolvimento de produtos naturais - Google Patents

Description

UMA. TECNOLOGIA DE PLATAFORMA. FARMACÊUTICA PARA O DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS NATURAIS

Este pedido reivindica o beneficio de prioridade da patente dos EUA com número de série 60/909,018, depositada em 30 de março de 2007. Todo conteúdo e as descobertas do pedido precedente estão incorporados por referência dentro deste pedido.

Por todo este pedido, várias referências são remetidas e as descobertas destas publicações, na sua íntegra, estão, por meio deste, incorporadas por referência dentro deste pedido para descrever mais integralmente o estado da arte ao qual a invenção pertence.

ESTADO DA TÉCNICA DA INVENÇÃO

Produtos naturais têm sido usados pela civilização humana por milhares de anos. Seus valores medicinais têm sido registrados através da história. Desde o avanço da farmacologia, farmacologia clinica, farmacognosia e química analítica, os componentes ativos em uma substância natural começaram a ser revelados. Um bom exemplo é a descoberta do ácido acetilsalicíIico na casca de salgueiro (willow bark). Bayer celebrou recentemente o centésimo aniversário da Aspirina, uma forma purificada do ácido acetilsalicílico.

Há duas correntes de pesquisas de produtos naturais. Desde o começo das ciências farmacêuticas modernas, tem havido uma demanda insaciável para o isolamento e purificação de um único componente ativo numa substância natural. De fato, mais de 60% dos farmacêuticos que foram desenvolvidos para o tratamento do câncer, hipertensão e enxaqueca, ou são naturais na origem, ou são imitações de produtos naturais (Newman e outros, 2003). Apesar de que as técnicas combinatórias tenham sido bem sucedidas, como métodos de otimização das estruturas, nenhum composto combinatório aprovado como uma droga foi identificada antes de 2002. Isto não é surpreendente, porque candidatos líderes de origem natural estão tornando-se limitados.

Remédios naturais são muitas vezes compostos de uma ou mais ervas. Cada erva possui múltiplos componentes ativos. A identificação, purificação e determinação de atividade, usando modelos farmacológicos conhecidos, para uma mistura complexa, têm sido tarefas monumentais. A complexidade desta área de pesquisa tem sido o maior obstáculo no desenvolvimento da medicina natural (Williamson, 2001) . Em sua revisão, Liu e Yang (2006) comentaram que a identificação dos componentes ativos na Medicina Chinesa tradicional (TCM) é a questão mais importante no desenvolvimento da TCM. Os componentes ativos poderiam ser metabólitos ativos dos componentes principais da preparação. Por exemplo, ginsenosídeos são componentes principais responsáveis pela eficácia do ginseng. Contudo, a atividade destes ginsenosídeos é baixa e sua biodisponibilidade após administração oral é minúscula. Os produtos metabólicos, protopanaxadiol e protopanaxatriol, são facilmente absorvidos e farmacologicamente ativos (Hasegawa, 2004). Embora seja importante entender a natureza farmacocinética e farmacodinâmica dos componentes ativos na TCM, não houve sugestões para classificar as inter-relações complicadas entre as interações potenciais da farmacocinética e farmacodinâmica.

0 estudo dos ingredientes ativos nas substâncias naturais tem sido particularmente primitivo em termos de ciências farmacêuticas. A abordagem está estagnada no estágio de descobrimento do desenvolvimento farmacêutico. A abordagem geral é empregar a atividade de extração guiada para identificar propósitos que possuam atividades in vitro. Esta abordagem é extremamente inadequada para o desenvolvimento de produtos naturais. Por muito tempo, ginseng Panax foi tido como um "lixo" caro, porque não possui ingredientes ativos aparentes. Não foi até que Hasegawa (2004) relatou que os ginsenosídeos inativos do Panax ginseng estavam atuando como pró-drogas, quando metabolizados pela flora intestinal libera as agliconas, que possuem atividade fisiológica. Rutina, um glicosídeo flavonóide, que está presente no ginkgo e em um número de outras ervas, tem sido demonstrado como sendo um antioxidante potente in vitro. Contudo, é difícil para substanciar a atividade atual in vivo da rutina, simplesmente porque esta substância não é detectada na corrente sanguínea (Hollman e outros, 1997). Um

componente principal de Chuanxiong, z-ligustilide, tem demonstrado ser um principal componente ativo da erva; contudo, a biodisponibilidade desse componente é menos do que 3% (Yan e outros, 2008) . É bem óbvio que não haverá ligustilide suficiente, alcançando o local da ação, para exercer sua atividade. Esses exemplos mostram claramente a deficiência da utilização da abordagem farmacêutica clássica de identificar ativos em uma preparação herbal. As pró-drogas naturais, como aquelas dos ginsenosídeos, estarão faltando, e ativos como rutina serão buscados. Em termos de ciência farmacêutica, compostos como ligustilide carecem de propriedades ervomedicinais para administração oral. Propriedades como drogas são propriedades basicamente farmacocinéticas de uma substância, que, após a administração, possuem a habilidade para ser absorvida em uma quantidade substancial, sem ser metabolizada, e para ser distribuída através da corrente sanguínea para o local da ação, em quantidade suficiente antes de ser eliminada do corpo. Não é surpresa que as propriedades ervomedicinais não têm sido os componentes principais da pesquisa do produto natural, porque são novas para o desenvolvimento farmacêutico. Desde que há permutações na chegada nas atividades de um extrato herbal, a complexidade de delinear perfis farmacocinéticos para multi-componentes parece ser proibitiva.

Em anos recentes, interesses em realizar estudos farmacológicos e farmacocinéticos em substâncias naturais tais como Wort do St. John (Schulz e outros, 2005) e Ginkgo (Kwak e outros, 2002; Ahlemeyer e Krieglstein, 2003) estão aumentando. Não há falta de publicações na área de interações ervas-drogas(Brazier e Levine, 2003; Hu e outros, 2005; Williamson, 2005), efeitos herbais nas enzimas metabolizantes das drogas (Venkataramanan e outros, 2000; Mathews e outros, 2002; Komoroski e outros, 2004; Yim e outros, 2004; Chang e outros, 2006) e farmacocinéticos dos ingredientes ativos de ervas (Mathews e outros, 2005; Zhou e outros, 2005; Yan e outros, 2007) . 0 mais recente é limitado a um único componente. Existem estudos que tentaram prever a interação in vivo de ervas-drogas usando metodologias in vitro (Williamson, 2001; Mohutsky e outros, 2006; Venkataramanan e outros, 2006). Estes estudos tiveram sucesso parcial e a conclusão geral é que um estudo in vivo é necessário para confirmar os resultados.

Tem sido freqüentemente postulado que a vantagem da terapia alternativa é a dosagem relativamente baixa necessária para o tratamento de uma doença (Williamson, 2001). Componentes ativos podem atuar aditivamente ou sinergeticamente ou antagonicamente. Na ausência de um entendimento do número de componentes envolvidos e suas respectivas propriedades do tipo de droga, seria quase impossível determinar estas interações complexas no corpo humano.

Tecnologias farmacêuticas para a descoberta de drogas não têm sido empregadas extensivamente no desenvolvimento de produtos naturais. Existem vários estudos do microssômico in vitro ou hepatócito, relatados para avaliar as interações ervas-drogas (Hu e outros, 2005; Williamson, 2005; Venkataramanan e outros, 2006) e metabolismo dos componentes ativos (Komoroski e outros, 2005) . Contudo, não há estudos de modelos

farmacocinéticos e/ou farmacodinâmicos usando

fisiologicamente bases, para prever o tempo dos ingredientes ativos de um extrato herbal no corpo humano, também não há qualquer estudo usando a mesma abordagem para quantificar o tempo de uma resposta. Nenhum método in silico foi usado até a presente data para a descoberta de droga foi aplicado para prever a interação farmacocinética e farmacodinâmica dos componentes ativos e seus metabolitos após a administração de um extrato herbal.

Existem várias patentes depositadas nos últimos anos esboçando métodos para padronizar produtos naturais. As mais avançadas são aquelas do BioFit® da Paracelsian (Blumenthal e Milot, 2004), ChemBioPrint® da CV Technologies (Pang e outros, 2000) e as tecnologias PharmaPrint®, da PharmaPrint Inc. (Khwaja e Friedman, 2000; Khwaja e Friedman, 2002) . As últimas duas utilizam bioensaios envolvendo frações concentradas, que são farmacologicamente ativas e um ou mais marcadores são padronizados junto com as atividades desejadas. Quando ambas as condições são satisfeitas, o lote é aceito. A PharmaPrint® avalia estes graus farmacêuticos dos extratos. Eles têm usado esta tecnologia para produzir ervas padronizadas tais como Wort do St. John (Khwaja e Friedman, 2000). ChemBioPrint® parece estar um pouco mais envolvida em que além dos ensaios in vitro. Ensaios in vivo também são incorporados nos procedimentos de padronização. Nenhum destes dois procedimentos de padronização liga diretamente a atividade com os ingredientes padronizados putativos. Portanto, não é conhecido se os ingredientes padronizados são de quantidade certa ou proporções apropriadas. Também não há informações nos ingredientes ativos que não estão identificados. É bem conhecido que alguns destes ingredientes são inativos in vitro, porém eles têm atividades biológicas in vivo (Hasegawa, 2004). A razão é que alguns destes ingredientes não são realmente absorvidos; então faltando propriedades das ervas-drogas. A tecnologia do BioFit® da Paracelsian reivindicou que uma avaliação da absorção usando células Caco-2 foram realizados nos componentes ativos. Contudo, Caco-2 possui a deficiência na previsão da absorção de grandes moléculas, porque estas moléculas não são permeáveis através da membrana da Caco-2. Uma porcentagem significante de ingredientes naturais possui grandes pesos moleculares. A absorção destas moléculas tais como polissacarídeos, glicosídeos, etc. é difícil para estimar usando células Caco-2.

A tecnologia SimBioDAS® da Kinetana (Tam e Anderson, 2000) parece superar os problemas que a tecnologia Caco-2 enfrenta (Blumenthal e Milot, 2004). Essa tecnologia tem sido empregada para medir componentes absorvíveis que são ativos in vitro. Contudo, esta tecnologia possui dois problemas: 1. ela não fornece uma estimativa dos farmacocinéticos dos ingredientes e portanto, o perfil do tempo de concentração no local da ação; e 2. as membranas celulares são suscetíveis para romper quando elas são incubadas com certos extratos herbais tais como Wort do St. John.

Houve uma notícia divulgada em janeiro de 2008 por uma empresa Indiana, Avesthagen, anunciando uma nova tecnologia, MetaGrid, para a padronização de extratos baseados em plantas multiconstituinte. Esta tecnologia é baseada na combinação de tempos de retenção de componentes ativos analisados usando um método analítico. A tecnologia pode ser útil para a padronização dos componentes ativos, contudo, estes assim chamados componentes ativos não foram sujeitos a testes vigorosos para testes in vivo. Em outras palavras esta tecnologia não fornece informações das propriedades do "tipo droga" destes componentes.

Em resumo, não há método disponível para explorar adequadamente os componentes fisiologicamente ativos de uma substância herbal. Geralmente acredita-se que a atividade de fitomedicina é mediada por um grande número de ingredientes ativos, cada uma que constitui uma quantidade relativamente baixa comparada a aquelas usadas nas medicinas ocidentais. Além do mais, cada ingrediente, se fornecido individualmente, exigiria uma dose muito maior para alcançar o mesmo efeito fisiológico. Contudo, acredita-se (enquanto raramente demonstrado diretamente por experimento) que estes ingredientes individuais, quando pegos juntos, podem reforçar mutuamente um ao outro sinergisticamente. Por exemplo, num dado extrato herbal (p.ex.: Echinacea ou Ginkgo biloba), poderia haver diversas centenas de entidades químicas, dúzias que são compostos ativos e um subconjunto destes podem interagir fortemente um com o outro sinergisticamente ou pela inibição mútua. Contudo, a tecnologia existente não permite o controle de qualidade rigoroso porque não houve sucesso na elucidação da atividade destes ingredientes como um grupo. Nesta invenção é descrita uma plataforma

de tecnologia, baseada na formulação de um procedimento matematicamente rigoroso, de descrever estas interações através de uma combinação da modelagem in vitro e in silico e da análise de dados, resultando na engenharia reversa do processo e então projetando uma composição

otimizada a fim de render a formulação multicomponente mais eficaz. A vantagem desta abordagem é que não há exigência para estudar os componentes individualmente. Como um resultado, separação, isolamento e purificação dos componentes ativos não são necessários; portanto há

economia de tempo e de recursos. A figura 1 ilustra um modelo que é usado para descrever a concentração e tempo do efeito de um componente único e este mesmo modelo pode ser usado para descrever o tempo dos componentes múltiplos após a incorporação dos procedimentos

matemáticos descritos aqui.

RESTJMO DA invenção Modelos matemáticos para resolver múltiplos desconhecidos que são linearmente independentes e/ou interagindo entre si foram incorporados dentro de um

conjunto de metodologias in vitro e in silico para prever farmacocinéticas in vivo e farmacodinâmicas de componentes múltiplos. Este método é aplicado para desenvolver fitomedicinas que contém múltiplos 30 ingredientes ativos sem identificação anterior, isolamento e purificação destes componentes.

As técnicas in vitro incluem, mas não estão limitadas a: incubação com suco intestinal e gástrico artificial, flora intestinal, microssomas intestinais, membrana da célula, tecido intestinal, hepatócitos, plasma, e sangue. Nas técnicas in silico incluem um aumento fisiologicamente baseado num modelo

farmacocinético/farmacodinâmico, predição de registro P, registro D, volume de distribuição e excreção renal.

Numa forma de execução, a presente invenção fornece um método de predizer a farmacocinética in vivo e farmacodinâmica de uma mistura com múltiplos componentes, compreendendo os passos de: determinar a taxa de

metabolismo do indivíduo e dos componentes de interação na mistura no trato gastrointestinal e fígado; determinando a distribuição dos componentes no sangue ou plasma; determinando a taxa da eliminação renal dos componentes; e determinando a potência de um componente

individual e sinergismo ou inibição entre os componentes, onde as determinações acima compreendem modelos matemáticos que irão predizer as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas da mistura in vivo.

Em outra forma de execução, também é fornecida

uma composição compreendendo múltiplos componentes, como os identificados pelo método descrito aqui, no qual os componentes possuem propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas in vivo desejáveis como determinado pelo método descrito neste.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS A figura 1 mostra um esquema descrevendo o destino de um componente após administração oral. A transferência de inter-compartimentos é assumida como a primeira ordem, conforme indicada pelas setas.

A figura 2A mostra um relacionamento típico dose-resposta que segue a cinética de Michaelis-Menton. A figura 2B mostra o mesmo relacionamento graficamente transformado para descrever a dose do registro versus resposta. A resposta é aproximadamente linear em relação à dose de registro na faixa entre 20 - 80 % do máximo.

A figura 3 mostra um gráfico de fluxo geral do procedimento de otimização; ilustração do procedimento.

A figura 4 mostra um relacionamento dose- resposta do tipo Michaelis-Menton, onde r é uma transformação linear da resposta no relacionamento para a dose. r = resposta/(1-resposta).

A figura 5 mostra um relacionamento do registro dose-resposta de 25 misturas contendo 15 componentes hipotéticos. O erro de cada medição de resposta foi assumido como sendo ± 10%.

A figura 6 mostra o previsto (barras abertas) versus potências (I/EC50) atuais (barras inferiores). A figura 6A: Potências relativas dos 15 compostos hipotéticos. Compostos 2, 9, 10, 12 e 13 são

predefinidos a serem ativos (>10 % barulho). A figura 6B: Composto 16 (compostos 4 e 10) e 17 (compostos 7 e 8) mostram as atividades maiores que os indivíduos

combinados. Os compostos 18 e 19 são emparelhamentos fictícios dos compostos 1 e 2; e 3 e 4, respectivamente.

A figura 7 mostra a resposta para cada formulação individual (para a amostra hipotética). As curvas na plotagem representam, em ordem da curva mais inferior, amostras 25, 15, 14, 10, 9, 18, 20, 7, 24, 22, 6, 5, 3, 23, 11, 2, 17, 12, 13, 19, 4, 1, 21, 16, e 8.

A figura 8 mostra uma ilustração esquemática da análise do componente principal aplicada a um conjunto de dados de duas dimensões.

A figura 9 mostra os resultados da aplicação do PCA para um conjunto de dados sintéticos. Observar que 10 variáveis de 5 (variáveis transformadas) cobrem 80% da variação nos dados. Isto sugere muito pouca correlação/ dependência/ interação e as informações estão espalhadas sobre todas as variáveis.

A figura 10 mostra uma elaboração analítica da 5 localização do pico X*.

A figura 11 mostra uma ilustração de várias funções dependentes da dose no exemplo. Dados originais, repostas do modelo, e diferenças entre o original e os modelos. Localizações usadas na montagem do modelo estão 10 marcadas com círculos. Plotagens de (a) dos dados originais, (b) do modelo de oito termos, (c) a diferença de oito termos, (d) o modelo de seis termos, (e) a diferença de seis termos, (f) o modelo de quatro termos, e (g) a diferença de quatro termos.

A figura 12 mostra um esquema demonstrando o

trânsito de um componente e seus produtos de decomposição e/ou metabólitos ao longo do trato gastrointestinal. A decomposição é química e o metabolismo pode originar-se das enzimas do pâncreas no duodeno ou flora intestinal no cólon. Xi, Zi, e Mi representam substratos, produtos de

decomposição, e metabólitos, respectivamente.

A figura 13 mostra um esquema demonstrando o transporte de um componente e seus metabólitos através de um enterócito. Dentro do enterócito, o metabolismo do componente e seu metabólito também pode ocorrer. A taxa

na qual estas espécies atravessam é medida pela sua permeabilidade, que pode ser usada para estimar a taxa de absorção. Xi e Mi representam substratos e metabólitos, respectivamente.

A figura 14 mostra eventos que ocorrem para um

hepatócito representativo. A captação de um componente e/ou seus produtos de decomposição e metabólitos é potencialmente governada por processos ativos e passivos. Dentro do hepatócito, todas as espécies podem potencialmente ser ligados ou metabolizados. A saída destas espécies também é governada por processos passivos e/ou ativos. Xi, Mi, e Me representam substratos, metabólito 1, e e h são metabólitos formados no lúmen

intestinal, os enterócitos e o fígado, respectivamente. Estes metabólitos são do lúmen intestinal e enterócitos.

A figura 15 é um esquema demonstrando a distribuição de um componente no sangue. Geralmente, a livre concentração no plasma, Xi, é o alvo para a

medição.

A figura 16 mostra a concentração versus perfis de tempo de 15 componentes depois que 50 unidades da mistura 1 foram administradas oralmente. Os componentes 15 2, 9, 10, 12 e 13 são mostrados em negrito. Nota: A concentração do composto 2 estava muito baixa para ser mostrada.

A figura 17 mostra o efeito combinado versus perfis de tempo depois que 50 unidades da mistura 1 foram administrada oralmente. A resposta é principalmente

contribuída pelos componentes 2, 9, 10, 12 e 13.

A figura 18 mostra um sistema de 50 componentes, cada um com uma resposta linear e dois pares com interações adicionais. Com um limite de estilo de 25 Michaelis-Menton para as interações totais e ±5 % barulho, foi observado que as curvas acima são típicas dos dados de resposta total para misturas com componentes distribuídos aleatoriamente entre Oel unidade em cada mistura.

A figura 19 mostra 150 misturas e respostas

totais do ponto 1.0 da dose assumindo uma resposta linear de cada um dos 50 componentes.

A figura 20 mostra uma plotagem das correlações entre o residual e cada um dos termos de pares multiplicativos. As correlações maiores estão mais escuras.

A figura 21 mostra uma estimativa nova e melhorada, produzida pela adição de quatro termos de

pares como pseudocomponentes 51 a 54.

A figura 22 mostra uma estimativa obtida pela repetição dos mesmos sistemas, mas agora usando dados de três pontos de dosagem (1.0, 0.3, e 0.1); fornecem um ajuste mais preciso e apertado na primeira estimativa.

A figura 23 usa os mesmos quatro pseudo- componentes e fornece uma segunda estimativa com um ajuste melhor do que no caso de ponto de dosagem única.

A figura 24 mostra as curvas de tempo para as dosagens de 4 e 0 unidades no intestino e compartimentos

do corpo humano respectivamente, no tempo 0 para o sistema descrito na Tabela 9.

A figura 25 mostra a Área Sob a Curva (AUC) para a quantidade nas curvas do corpo-tempo. Estes dados foram fornecidos na Tabela 9. Observar a ampla faixa da

absorção efetiva e eliminação (aproximadamente 2 ordens de magnitude na variação).

A figura 26 mostra o mesmo conjunto de 150 misturas, dimensionadas pela AUC de cada composto (tomando os valores da AUC para serem a exposição do

corpo para cada composto).

A figura 27 mostra os resíduos, que variam dramaticamente das plotagens anteriores. A parte escura em cada uma destas plotagens é dimensionada para os pontos mais correlacionados na plotagem, desta forma a

aparência dos pontos individuais somente podem ser comparadas dentro de cada uma destas figuras e não entre eles. As correlações mais fortes são na verdade mais fracos nesta plotagem do que nas anteriores.

A figura 28 mostra uma segunda estimativa com quatro pseudocomponentes adicionados. Não é muito diferente da primeira estimativa, e os pseudocomponentes possuem respostas muito pequenas conforme os componentes

compondo eles não estão presentes significativamente.

A figura 29 mostra as curvas de tempo fornecidas pelo Segundo conjunto de parâmetros farmacocinéticos.

A figura 30 mostra as AUCs correspondendo às

quantidades na plotagem anterior.

A figura 31 mostra como a primeira estimativa agora revela dois componentes importantes, e dois moderados.

A figura 32 mostra como, novamente, adicionando

quatro pseudocomponentes, possui pouco efeito no sistema, como os termos sinérgicos são amplamente suprimidos.

A figura 33 são cromatogramas de ultra violeta (UV) e Espectrométrica de Massa (MS) representativos obtidos de um extrato de Red clover (Trifolium pratense).

Está claro que os precursores da genistein e daidzein são os principais componentes no extrato.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve um processo para: a) identificar um grupo de compostos ativos de uma mistura tal como, mas não limitada a, um extrato herbal;

b) identificar grupos de ingredientes, sejam eles ativos ou inativos, que interagem entre si para produzir um efeito observável; c) estimar as características 30 farmacocinéticas e farmacodinâmicas dos ingredientes ativos; d) estimar os perfis do tempo de concentração dos ingredientes ativos no local da ação in vivo; e) estimar o perfil de tempo de resposta total; e f) calcular a melhor dosagem para fornecer o perfil de resposta desej ado.

Farmacocinéticos de um componente único

Um entendimento dos farmacocinéticos de um composto é importante para a ilustração do conceito por trás desta invenção. Farmacocinéticos é uma disciplina que trata com absorção, distribuição, metabolismo e excreção de um composto no corpo. Basicamente, é uma descrição matemática do tempo de um composto no corpo humano. 0 nome, farmacocinético, foi primeiramente criado por Dietrich em 1952. Esta área tornou-se um ramo importante do desenvolvimento farmacêutico após a pesquisa estelar realizada pelos Professores Gerhard Levy, Milo Gilbaldi e Leslie Benet, juntamente com outros farmacocinéticos proeminentes do nosso tempo. À parte do nosso entendimento atual, estes pesquisadores também tinham que convencer os cientistas farmacêuticos de que na hora que um químico potente não é efetivo e não pode ser desenvolvido dentro de um medicamento a menos que esta possa ser absorvida e entregue para o local da ação em quantidades adequadas. O ingrediente não deve somente ser entregue para o local da ação em quantidades adequadas, o componente também tem que ser retido no local da ação por um período adequado de tempo; antes que uma resposta clínica adequada possa ser medida. Este conceito fundamental levou ao entendimento que, a fim de que um químico seja desenvolvido dentro de um medicamento, este tem que ter uma potência adequada e também tem que ter propriedades adequadas do "tipo droga". Propriedades do "tipo droga" são quantificadas pelas propriedades farmacocinéticas. A potência é uma medida da atividade inerente de um químico, por exemplo, a concentração que poderia inibir uma enzima (tal como colinesterase) em 50%.

Tradicionalmente, parâmetros farmacocinéticos, tais como clearance, meia-vida e volume de distribuição, são medidos in vivo. Nas últimas duas décadas, muitos métodos in vitro e in silico foram relatados na

literatura. Estas metodologias estão sendo refinadas constantemente e seu poder preditivo melhora ao longo dos anos (Brightman e outros, 2006a). Atualmente, existem programas comerciais disponíveis para estimar as características farmacocinéticas e farmacodinâmicas de um

composto(http://www.simulations- plus.com/products/gastro_plus.html).

Desde que um objetivo desta invenção seja o de desenvolver produtos naturais, sendo a maioria dos quais 15 fornecidos oralmente, os farmacocinéticos de um composto, após administração oral, são descritos em detalhes nesta invenção. Deve ser observado que este conceito pode ser facilmente estendido para componentes que são administrados parenteralmente e não-parenteralmente.

Absorção: Depois que um composto é ingerido

oralmente, um número de eventos poderia ocorrer antes que este seja absorvido dentro da circulação sistêmica (Figura 1) . Se o composto não fosse ingerido como uma solução, este teria que ser dissolvido antes que possa entrar nos enterócitos. Antes que o composto seja

absorvido, este deve sobreviver ao meio severo no lúmen gastrointestinal. A alta acidez no estômago, as enzimas produzidas no pâncreas, células intestinais e bactérias intestinais possuem a habilidade de quebrar ou 30 metabolizar o composto. Exemplos são z-ligustilide do Chuanxiong, ginsenosídeos da Panax ginseng e polissacarídeos do Ganoderma lucidum. Às vezes, o colapso ou produtos metabólicos são ativos; portanto, a resposta geralmente no corpo poderia incluir aquela do colapso ou produtos metabólicos. Há casos em que o componente, que possui atividade in vitro, não é a espécie ativa atual no corpo humano, porque este não é absorvido e é incapaz de alcançar o local da ação. Em vez disto, os produtos de colapso ou metabólitos são ativos e são estas espécies que são responsáveis pela atividade in vivo do componente "ativo". Um bom exemplo são os ginsenosídeos do Panax ginseng. Os oligossacarídeos conectados ao aglicone são clivadas pela bactéria colônica numa maneira gradativa, para formar os metabólicos principais 20S-protopanaxadiol 20-0-beta-D-glucopiranosídeo e 20S-protopanaxatriol (Hasegawa, 2004) . As aglicones são as moléculas ativas do ginseng e os ginsenosídeos atuam como pró-drogas.

A taxa e extensão da permeação de um componente dentro dos enterócitos é dependente de suas propriedades fisicoquímicas, tais como solubilidade, pKa,

lipofilicidade, coeficiente de partição, etc. Dentro dos enterócitos, o componente é exposto às enzimas metabólicas, que poderiam converter potencialmente esse para metabólitos. Novamente, estes metabólitos podem estar ativos. Z-Iigustilide, ácido glicirrético, etc. são bons exemplos de metabolismo intestinal.

Depois que o componente é absorvido, este é transportado pelo sangue na circulação mesentérica, que drena dentro do fígado através da veia portal. Este componente é então comparado com uma abundância de enzimas metabólicas do fígado, que poderiam metabolizá-lo dentro de mais metabólitos polar.

A perda de um componente, através da degradação metabólica ou química durante o processo de absorção, é chamada de efeito de primeiro passe. Uma Biodisponibilidade, F, do componente é determinada por: F = I-FgFi (I)

onde Fg é a fração que sobrevive o intestino, e Fi é a fração que passa através do figado intacto. Fg é estimado usando a seguinte equação:

Fg - I-Fd-Fml-Fna -Fmini (2)

onde Fd é a fração da dose decomposta no lúmen intestinal e gástrico; Fmi é a fração que é metabolizada pelas enzimas no lúmen intestinal; Fna é a fração que não é absorvida e Fmiint é a fração que é metabolizada pelos enterócitos.

Distribuição: O componente, que sobrevive o primeiro passo, é carregado pelo sangue ao coração, através da veia cava superior. Depois de ser bombeado através da circulação pulmonar, o componente é transportado para o resto do corpo através da circulação

do sangue. Durante este processo, o componente é distribuído para os vários órgãos e tecidos tais como pulmões, coração, cérebro, rins, tecidos adiposos, células dos glóbulos vermelhos e músculos. O componente também poderia ligar para membranas da célula, plasma e

proteínas celulares. A extensão a qual um componente distribui no corpo é dependente de suas propriedades fisicoquímicas. Um parâmetro farmacocinético, descrevendo a extensão da distribuição de um componente é chamado de volume da distribuição (Vd) .

Eliminação: Enquanto o componente estiver sendo circulado e distribuído no corpo, este poderia ser degradado quimicamente ou metabolizado pelas enzimas no sangue, fígado, rins e nos pulmões. O componente e seus produtos de degradação podem ser secretados dentro da

bílis e/ou excretados através dos rins. O componente ou seus produtos de degradação, que são eliminados através da bílis, podem ser absorvidos do intestino novamente. O último processo é denominado ciclagem entero-hepática.

0 tempo de um componente no plasma ou no sangue pode ser descrito usando um modelo farmacocinético. Os parâmetros farmacocinéticos que são usados para descrever 5 um componente são: absorção, F, volume de distribuição, Vd, e clearance total do corpo, C1T. CIt é um termo que inclui todos os processos de eliminação no corpo. Este termo está descrito pela equação 3:

Clr =Clh+Clr+Clother (3)

onde Clh é a clerance hepática, Clr é a clearance renal,

e Clother é a eliminação por outros órgãos.

Farmacodinâmicas de um único componente

Enquanto o componente está sendo distribuído para várias partes do corpo, ele poderia também reagir 15 com vários componentes celulares, incluindo receptores, para ativar uma série de respostas bioquímicas. Estas reações podem ser traduzidas dentro de uma resposta clínica mensurável. Por exemplo, ginkgolide B tem demonstrado ser antagonista do receptor do fator de 20 ativação da plaqueta e possui um potencial de ser usado

para tratar a asma, quando usado em combinação com carotenóide astaxantina (Mahmoud e outros, 2004).

Para uma resposta típica, há um relacionamento dose- ou resposta da concentração. Este tipo de 25 relacionamento é geralmente descrito usando cinética de Michaelis-Menton (Figura 2). Embora existam outros tipos de relacionamentos concentração-reação, a questão importante nesta invenção é a capacidade de descrever matematicamente este tipo de relacionamento.

Farmacocinéticas de componentes múltiplos

Quando uma mistura de componentes, como aquela de uma substância natural, é administrada oralmente, eles serão submetidos por processos farmacocinéticos, como absorção, distribuição e eliminação, que são similares a aqueles do componente único. A complicação com uma mistura é que os componentes administrados podem interagir entre si em vários níveis. Por exemplo, um componente pode aumentar a absorção de outros componentes. Rutin tem demonstrado o aumento da biodisponibilidade de uma substância natural. Um componente pode ser estabilizado pela presença de outros componentes. Por exemplo, z-ligustilide é estável num extrato alcoólico Chuanxiong; ao passo que o próprio composto puro é instável. A interação no nível da enzima está bem documentada na literatura. Por exemplo,

hiperforin, erva de St. John tem demonstrado induzir isozimas P450, particularmente, CYP 3A4. Esta indução levou a uma série interações sérias ervas-drogas (Venkataramanan e outros, 2006). Um componente pode desempenhar um papel importante na mudança das funções transportadoras,levando a uma troca na permeabilidade de outros componentes que são substratos para estes transportadores. Por isso, a taxa de absorção e eliminação de um componente pode ser alterada significativamente.

Componentes poderiam competir para proteína do plasma ligando sítios. Esta competição poderia levar a uma mudança no Vd, levando a uma mudança na distribuição e eliminação dos componentes afetados. Componentes também podem competir para excreção renal onde um processo ativo está envolvido.

Além das interações farmacocinéticas, os componentes e seus produtos de decomposição possuem o potencial para interagir no nível do receptor; desta forma mudando a potência de outro componente.

Desafios do desenvolvimento de um produto de componente múltiplo

Está muito claro que o desenvolvimento de um produto de componente múltiplo é extremamente complicado, particularmente quando a abordagem convencional é usada. Imagine tentando isolar todas as substâncias ativas de uma mistura e estudá-las individualmente, antes que as ativas sejam estudadas novamente em combinação. Não é surpresa que essa não é uma rota preferida para o desenvolvimento de novos farmacêuticos ou nutracêuticos (Williamson, 2001). A pergunta óbvia é: Há uma maneira mais simples? Para ser mais preciso: Podem os farmacocinéticos e farmacodinâmicos dos componentes individuais e suas interações mútuas serem avaliadas e quantificadas sem perturbar a mistura?

Nesta invenção, é descrita uma abordagem detalhada na obtenção dos parâmetros farmacocinéticos e farmacodinâmicos dos componentes individuais numa mistura. Figura 3 é um fluxograma do procedimento de otimização; que ilustra os passos tomados no procedimento. Estes exemplos destacam os aspectos teóricos desta invenção. Através de simulações, é demonstrado que os componentes ativos numa mistura podem ser precisamente identificados sem a purificação dos componentes individuais, um processo que criou uma barreira para a pesquisa do produto natural. Além disto, o método descrito aqui é empregado para desenvolver uma erva, Red clover (Trifolium pratense) , que é rica em fitoestrógenos, para o tratamento da osteoporose pós- menopausa.

Numa forma de execução, a presente invenção fornece um método de predizer a farmacodinâmica e a farmacocinética in vivo de uma mistura com múltiplos componentes, compreendendo os passos de: (a) determinar a taxa do metabolismo do indivíduo e os componentes interagindo na mistura no trato gastrointestinal e fígado; (b) determinar a distribuição dos componentes no sangue ou plasma; (c) determinar a taxa de eliminação renal dos componentes; e (d) determinar a potência de um componente individual e sinergismo ou inibição entre os componentes, onde as determinações acima compreendem modelos matemáticos que irão predizer as propriedade farmacocinéticas e farmacodinâmicas da mistura in vivo.

Numa forma de execução, a taxa de metabolismo compreende a taxa de degradação e a taxa de absorção. Para a taxa de metabolismo v, cinética de Michaelis- Menten ou outras formas de cinética saturável podem ser usadas. Por exemplo, a cinética de Michaelis-Menten é

V *C

iniciada conforme segue: v = —222-, onde Vmax é a taxa

EC50 +C

metabolócia máxima, C é a concentração do substrato e

EC50 é a concentração na qual ocorre 50% da taxa máxima.

Numa forma de execução, a taxa de degradação

(dc/dt) é geralmente assumida como sendo de primeira

ordem. 0 que isto significa é que a taxa de decomposição

é dependente de concentração:

dc _ ã=c°e

onde c é a concentração no tempo t, Co é a concentração no tempo zero e K é a constante de taxa de degradação de primeira ordem. Esta equação da taxa pode ser integrada e transformada para:

C = C0e~Kt

A meia-vida de uma substância é determinada como tempo para 50% da concentração original desaparecer.

Da equação acima, meia-vida, íy2 , é definida como: 0.693 I,η- κ

Numa forma de execução, as setas mostradas na Figura 1 são os processos de primeira ordem que fornecem descrição para a decomposição.

Numa outra forma de execução, o método da presente invenção ainda compreende o passo de determinar os parâmetros para os metabólicos ativos dos componentes de acordo com os passos (a) até (d) descritos acima, onde os resultados dos modelos matemáticos irão predizer as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas da mistura e seus metabólitos in vivo. Geralmente, as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas compreendem perfis de tempo de concentração e perfis de tempo de resposta para os componentes e seus metabólitos.

Numa forma de execução, o método da presente invenção compreende modelos matemáticos que são capazes de resolver múltiplos desconhecidos, que são linearmente independentes ou interagem entre si. Por exemplo, os modelos incluem um modelo de funções lineares pesadas e o mesmo modelo com termos polinominais de ordem superior adicionados em doses de um componente único e termos nos produtos dos pares das doses. Numa outra forma de execução, os modelos matemáticos da presente invenção compreendem equações (7), (13) e/ou (14) como descrito aqui.

Numa forma de execução, determinar a taxa de metabolismo no trato gastrointestinal, compreende ensaios in vitro. Por exemplo, tais ensaios compreendem suco intestinal ou gástrico artificial, flora intestinal, microssoma intestinal, ou estudos de permeabilidade, usando células de cultura ou tecidos intestinais (p.ex.: células Caco-2 ou células MDCK). Numa forma de execução, determinar a taxa de metabolismo no figado, compreende ensaios usando hepatócitos recentemente coletados, hepatócitos

criopreservados, microssomas hepáticos, citosol hepático ou frações S-9.

Numa forma de execução, a determinação da distribuição no sangue ou plasma compreende na determinação da ligação à proteína do plasma, ligando à proteína do sangue, pKa, Iog P, Iog D, e volume da distribuição de um componente.

Numa forma de execução, a determinação da eliminação renal é baseada na estrutura química dos componentes.

Numa forma de execução, a determinação da potência compreende um receptor ligando o ensaio, um ensaio enzimático, um ensaio de resposta bioquímica, e ensaios com órgãos ou tecidos isolados.

Em outra forma de execução, a presente invenção também fornece uma composição compreendendo múltiplos componentes como os identificados pelo método revelado aqui, onde os componentes possuem propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas in vivo desejáveis, conforme determinado pelo método revelado aqui. Por exemplo, a composição pode compreender Red clover (Trifolium pratense). Numa forma de execução, a Red clover compreende formononetina, biochanin A e seus glicosídeos em quantidades determinadas pelo método revelado aqui.

EXEMPLO 1

Aproximação para o Desenvolvimento do Modelo para Estimar a Contribuição de Cada Componente para a Resposta de uma Mistura

O objetivo deste exemplo é o de estabelecer uma estrutura matemática, na qual um modelo matemático é desenvolvido para descrever e quantificar as atividades dos componentes individuais numa mistura. 0 problema matemático que surge pode ser formulado como segue. Suponha que uma tinha um número de amostras da mesma preparação herbal (por exemplo, Panax ginseng), vindo de deferentes fontes, cada qual possui uma composição potencialmente diferente em termos de quantidade de componentes ativos. Suponha que as amostras estejam rotuladas por um índice "i" que vai de 1 a M. Suponha também que cada amostra contém ingredientes ativos N rotulados pelo índice "j" que vai de 1 a N. A concentração de cada ingrediente pode ser determinada e é denotada como c(i,j), tal que ao somar c(i,j) de I a N sobre j dá 1 (ou 100% como eles todos adicionam à quantidade total em cada amostra) para todas as amostras (denotada por i's). Deve ser assumido que é conhecido que o efeito fisiológico (atividade) de cada amostra para ser A(i) conforme determinado por algum dado empírico disponível. Geralmente deve ser assumido que a atividade A é a priori uma função não-linear desconhecida das concentrações c(i,j). Isto em alguns casos podem ser estabelecidos via experimentação, pelo qual a função A versus ou as concentrações do componente individual ou a dose total pode ser medida experimentalmente. A única outra coisa a ser observada é que deve-se assumir aqui que quando as simulações são realizadas, um certo tipo de relacionamento não-linear deve ser assumido para obter ajustes para os dados empíricos. O problema é determinar a forma da função A(c(i,j)), usando o tamanho limitado dos conjuntos dos dados disponíveis. Observar que a forma de A não é única, mas esta depende da escolha do conjunto básico de funções usadas na representação a dependência de A nas concentrações individuais. Podem haver várias funções usadas para esta finalidade; polinomial, exponencial ou trigonométrica, por exemplo. Pode ser assumido ingenuamente que A era para ser uma combinação linear das concentrações individuais, mas isto eliminaria imediatamente a possibilidade dos efeitos de saturação ou das interações entre os ingredientes (ambos inibitivos e sinérgicos).

Consequentemente, uma abordagem muito mais razoável é esperar que A seja representado como uma série de polinomiais de c(i,j), iniciando com funções lineares de c, seguida pelas combinações bilineares, então as funções quadráticas de c, então as combinações trilineares, junções cúbicas de c, etc. Neste caso, a primeira tarefa é determinar a maior ordem dos polinomial na expansão que será consistente com a quantidade de dados disponíveis. Por outro lado, geralmente é esperado que a atividade em altas concentrações deveriam demonstrar efeitos de saturação que são mais consistente com dependência sigmoide e por isso uma série exponencial. Estes feitos de saturação podem ser prontamente tratados com um Michaelis-Menton, ou outro tipo de limite, pela inclusão de uma correção apropriada de compensação antes de outros cálculos. Uma vez que a função A(c(i,j)) seja encontrada, será necessário encontrar o seu máximo no espaço multidimensional de todas as concentrações individuais (N-dimensional em geral) para propor uma formulação otimizada do extrato medicinal. Além disso, se a farmacocinética individual de cada ingrediente for conhecida pelo seu trânsito através do sistema gastro-intestinal e os órgãos de eliminação tais como fígado e rins, os metabólitos resultantes deste processo devem ser adicionados ao espaço dos componentes (por exemplo, poderia haver novos metabólitos K) aumentando efetivamente o espaço de simulações multidimensionais de N a N'=N+K (Figura 1) . A princípio, estes aspectos não adicionam qualquer complexidade conceituai ao problema, se forem conhecidas quantitativamente as reações metabólicas para cada um dos componentes da droga. Portanto, este aspecto não será mais discutido neste documento. Uma camada adicional da complexidade pode ser adicionada pela colocação de barras de erros nos valores de atividade, desde que eles venham de múltiplos ensaios experimentais de, possivelmente, uma pureza diferente. A complicação final envolve as propriedades farmacocinéticas de cada ingrediente individual. Em outras palavras cada composto constituinte mostra um tempo diferente c(i,j; t) após a administração. Então, surge a pergunta: Como compor a combinação de ingredientes para chegar em uma melhor dosagem entregue ao órgão, no qual os ingredientes sejam supostamente ativos.

0 que é a importância chave, contudo, é a determinação do subconjunto de ingredientes ativos, (que serão realizados usando uma análise do componente principal, por exemplo) e, segundamente, a natureza das interações entre os ingredientes ativos que serão realizados pelos métodos de ajuste dos dados não- lineares.

Se as curvas de resposta da dose, para um suficientemente grande conjunto de misturas linearmente independentes, estiverem disponíveis, modelos podem ser produzidos para descrever a resposta para uma ampla distribuição de componentes.

EXEMPLO 2

Construção do Modelo A para Descrever a Atividade dos Componentes Individuais em uma Mistura

0 objetivo deste exemplo é o de empregar a abordagem descrita no Exemplo 1, para construir um modelo para descrever a atividade do componente individual numa 5 mistura. Este modelo será usado para estimar a atividade dos componentes individuais de uma mistura hipotética com atividades pré-determinadas.

A realidade fisiológica de um relacionamento da resposta da dose é que, em baixas doses, as respostas são proporcionais à dose. Contudo, a resposta alcança um

limite nas doses maiores. Nesse exemplo, a equação de Michaelis-Menton:

R C1

R=S^--(4)

EC50+C

onde R é a resposta, Rmax é a resposta máxima, C é a dose ou concentração, e EC50 é C que produz 50% de Rmax, que é usado para modelar este tipo de comportamento de resposta da dose (Figura 2) . Para facilitar a modelagem, R é linearizado usando a seguinte equação (Figura 4):

r=-^- (5)

I-R

Na construção do modelo, é conveniente mudar de

considerar a dose de uma mistura, para considerar as doses dos componentes individuais. 0 primeiro passo na construção do modelo inicial é escolher um ponto de referência central. A dose média de cada componente através de todas as misturas é obtida para fornecer um

conjunto de médias. Enquanto qualquer ponto poderia servir com esta referência, os melhores resultados são provavelmente obtidos, se a referência estiver perto da região de interesse. Os modelos são construídos usando a diferença entre as doses no ponto de interesse, di, e as

doses de referência correspondentes, dt. A resposta transformada nesta dose, r, é esperada como sendo a média das doses.

Como um modelo inicial, as respostas são assumidas como sendo proporcionais à dose, para doses próximas a uma dose de referência. Isto é equivalente a um modelo das funções lineares avaliadas:

N

rtar+ YiWi(Jdi-It) (6)

i

Um minimo de misturas, independente linearmente de N, é necessário para assegurar que o sistema seja linearmente solúvel. Com dados de mais amostras, o sistema terá múltiplas determinações, e a melhor solução é obtida usando mínimos quadrados.

Uma vez que o primeiro modelo de uma reação fisiológica seja gerado, este pode ser comparado aos dados experimentais. Particularmente, os residuais, e as diferenças entre o modelo e os dados são examinados. Nesse estágio, as tendências que não foram contabilizadas pelo modelo são identificadas. O modelo pode ser aperfeiçoado pela adição de termos polinomiais de ordem superior, em doses de compostos únicos e termos nos produtos de pares de doses. Graus de correlação entre os residuais e as funções destes termos adicionais são calculados. Um coeficiente da correlação de Pearson é calculado entre cada um dos possíveis termos adicionais e os residuais. As tendências nos dados não contabilizadas pelo modelo devem causar correlações mais fortes, indicando que esses termos devem ser adicionados ao modelo. Na prática é esperado que muitos termos terão pouca ou nenhuma correlação. Pela exclusão deste do modelo, problemas de ajuste de pesos muito perto de zero para o barulho nos dados são evitados. Ultimamente o modelo pode tomar a forma: r * r + ΣWi(d, - d,·) + Σ wí(di ~ di)2 + Σ wU(di ~ di)(dj ~dj) (7 )

I I IJ

onde a primeira soma é somente as contribuições lineares, como na equação anterior, a segunda soma adiciona comportamentos não-lineares do componente único, e a terceira soma adiciona duas interações (por pares) de dois componentes ao modelo. Enquanto esta expressão assume que todos termos de pares e quadrados possíveis são adicionados, espera-se que somente poucos serão de real interesse, e muitos podem ser ignorados ou omitidos, ou equivalentemente, aos pesos respectivos tomados como zero. Se aplicável, componentes polinomiais de alta ordem e não-polimoniais também podem ser usados.

Conforme o modelo é melhorado através do processo de adição dos termos ao modelo, os residuais devem diminuir em magnitude e tornar-se menos ordenados. Em última análise, um modelo que descreva adequadamente os dados deve ser obtido. Como o modelo é desenvolvido, pode ser desejável usá-lo para sugerir locais para os dados de amostra que possam auxiliar a reduzir as incertezas dos pesos no modelo ou para estudar melhor qualquer padrão interessante nos dados.

Neste exemplo, uma mistura hipotética contendo componentes com interações e atividades predefinidas é examinada (Figura 6) . Os compostos 2, 9, 10, 12 e 13 são ativos e os compostos 4 e 10 (composto virtual 16) e compostos 7 e 8 (composto virtual 17) são sinérgicos. Para simplicidade, uma potência relativa foi atribuída um conjunto de valores variando de 0 a 1, zero indicando sem atividade e 1 indicando potência máxima.

Vinte e cinco misturas foram geradas aleatoriamente e suas quantidades relativas são listadas na Tabela I. Uma curva de resposta da dose completa é gerada para cada mistura (Figura 5). As respostas estão listadas na Tabela 2.

Usando a abordagem de construção de modelo descrita acima, a potência individual de cada componente foi estimada (Figura 6) . Estes valores foram comparados

a aqueles valores predeterminados. 0 modelo estabelecido foi capaz de identificar corretamente os cinco componentes ativos (Figura 6A) , e o modelo pode também identificar pares de componentes que estão interagindo entre si (Figura 6B).

Esta simulação mostra que os componentes ativos e suas espécies de interação podem ser identificados sem a necessidade de usar os componentes purificados para obter as informações desejadas. Esta abordagem irá encurtar tremendamente o tempo para estudar uma mistura

complicada.

Esta metodologia pode ser usada para identificar componentes ativos e suas espécies interativas nas misturas mais complicadas que possuem características diferentes. Esta metodologia também pode

ser usada para estimar a permeabilidade e a taxa de metabolismo dos componentes individuais numa mistura. Os processos saturáveis podem ser descritos usando ou o tipo Michaelis-Menton do relacionamento ou as formas modificadas desta. Nesta invenção, esta abordagem também

será usada para produzir parâmetros farmacocinéticos para os componentes individuais.

TABELA 1

A Quantidade de 15 Componentes em cada uma das 25

30

Misturas Mistura 1 2 3 4 5 6 Componente 10 11 12 13 14 15 7 8 9 1 0,73 0,06 0,76 0,35 0,61 0,75 0,25 0,67 1,00 0,02 0,39 0,24 0,81 0,94 0,96 2 0,31 0,20 0,24 0,03 0,20 0,46 0,10 0,32 0,49 0,97 0,64 0,49 0,36 0,84 0,36 3 0,67 0,07 0,62 0,43 0,43 0,70 0,45 0,72 0,67 0,12 0,22 0,09 0,44 0,45 0,86 4 0,73 0,53 0,63 0,90 0,32 0,01 0,28 0,53 0,84 0,61 0,52 0,32 0,90 0,93 0,13 5 0,10 0,81 0,84 0,51 0,51 0,34 0,50 0,37 0,57 0,58 0,36 0,28 0,61 0,72 0,29 6 0,78 0,59 1,00 0,79 0,48 0,67 0,21 0,56 0,52 0,55 0,89 0,14 0,51 0,36 0,79 7 0,52 0,30 0,26 0,82 0,81 1,00 0,54 0,51 0,33 0,20 0,50 0,03 0,49 0,89 0,25 8 0,80 0,42 0,95 0,68 0,22 0,51 0,49 0,19 0,94 0,32 0,57 0,36 0,11 0,66 0,51 9 0,12 0,58 0,79 0,55 0,78 0,26 0,85 0,63 0,68 0,20 0,39 0,65 0,44 0,40 0,91 10 0,95 0,87 0,97 0,66 0,13 0,49 0,87 0,44 0,62 0,81 0,93 0,58 0,71 0,46 0,76 11 0,99 0,79 0,98 0,45 0,01 0,07 0,48 0,59 0,96 0,25 0,46 0,26 0,68 0,41 0,21 12 0,23 0,83 0,22 0,55 0,60 0,91 0,05 0,03 0,17 0,41 0,21 0,39 0,26 0,12 0,38 13 0,90 0,88 0,26 0,16 0,90 0,55 0,07 0,43 0,56 0,78 0,53 0,91 0,11 0,96 0,42 14 0,62 0,68 0,20 0,53 0,69 0,57 0,23 0,64 0,01 0,35 0,64 0,87 0,82 0,94 0,96 15 0,39 0,87 0,34 0,67 0,38 0,27 0,59 0,45 0,83 0,79 0,08 0,22 0,45 0,05 0,93 16 0,46 0,66 0,13 0,38 0,36 0,47 0,34 0,92 0,53 0,43 0,82 0,07 0,51 0,65 0,27 17 0,93 0,14 0,28 0,41 0,33 0,20 0,84 0,90 0,64 0,07 0,29 0,71 0,22 0,09 0,56 18 0,74 0,44 0,09 0,85 0,87 0,20 0,20 0,61 0,88 0,40 0,66 0,37 0,89 0,64 0,16 19 0,85 1,00 0,91 0,83 0,23 0,18 0,90 0,65 0,93 0,85 0,23 0,22 0,07 0,27 0,56 20 0,19 0,32 0,77 0,27 0,12 0,03 0,34 0,30 0,98 0,21 0,04 0,98 0,32 0,92 0,94 21 0,25 0,52 0,82 0,25 0,12 0,92 0,06 0,68 0,30 0,19 0,96 0,13 0,52 0,97 0,99 22 0,16 0,12 0,87 0,39 0,71 0,01 0,23 0,62 0,34 0,12 0,83 0,89 0,90 0,15 0,37 23 0,57 0,01 0,58 0,51 0,61 0,83 0,20 0,84 0,07 0,27 0,13 0,52 0,98 0,71 0,48 24 0,58 0,04 0,28 0,75 0,89 0,68 0,40 0,33 0,91 0,73 0,35 0,37 0,96 0,20 0,14 25 0,06 0,95 0,11 0,57 0,80 0,37 0,38 0,40 0,41 0,23 0,49 0,09 0,38 0,34 0,12 TABELA 2

Relacionamento Resposta-Dose das 25 Misturas

Miatura 0,01 0,03 0,1 Dose Relativa 1 3 10 30 0,3 1 0,01 0,03 0,08 0,23 0,48 0,76 0,91 0,96 2 0,01 0,03 0,10 0,24 0,50 0,73 0,79 1,02 3 0,01 0,02 0,06 0,16 0,38 0,66 0,89 0,99 4 0,02 0,05 0,13 0,33 0,60 0,82 0,93 0,98 5 0,02 0,05 0,14 0,33 0,62 0,85 0,92 0,96 6 0,01 0,04 0,11 0,28 0,54 0,78 0,94 0,96 7 0,01 0,02 0,07 0,19 0,42 0,67 0,75 1,05 8 0,01 0,03 0,10 0,26 0,52 0,79 0,92 0,94 9 0,02 0,05 0,13 0,33 0,62 0,82 0,97 0,99 10 0,02 0,06 0,17 0,39 0,65 0,88 0,95 0,99 11 0,02 0,05 0,14 0,33 0,61 0,83 0,94 0,99 12 0,01 0,04 0,12 0,31 0,59 0,84 0,96 0,97 13 0,02 0,06 0,16 0,38 0,65 0,87 0,93 0,96 14 0,02 0,05 0,15 0,37 0,64 0,86 0,95 0,98 15 0,02 0,05 0,14 0,34 0,61 0,84 0,94 0,96 16 0,01 0,04 0,10 0,27 0,52 0,78 0,91 0,63 17 0,01 0,03 0,10 0,25 0,54 0,82 0,94 0,97 18 0,01 0,05 0,13 0,31 0,57 0,80 0,94 0,90 19 0,02 0,05 0,14 0,35 0,65 0,88 0,97 0,99 20 0,02 0,05 0,13 0,33 0,63 0,83 0,95 1,00 21 0,01 0,03 0,09 0,24 0,50 0,74 0,88 0,95 22 0,01 0,04 0,12 0,30 0,57 0,79 0,94 0,98 23 0,01 0,03 0,09 0,23 0,47 0,71 0,78 1,03 24 0,01 0,04 0,11 0,27 0,55 0,79 0,93 0,99 25 0,01 0,04 0,12 0,30 0,57 0,82 0,92 0,97 EXEMPLO 3

Abordagem Detalhada na Identificação dos Componentes Ativos e as Espécies de Interação

0 objetivo deste exemplo é esboçar uma abordagem para explorar todos os componentes de interação e ativos numa mistura. Em um extrato herbal, podem existir incógnitas escondidas que não foram identificadas anteriormente. Isto pode ocorrer quando os componentes são transparentes para análise quantitativa ou qualitativa; por exemplo, componentes podem ter muito pouca absorção UV quando um detector de UV é usado para identificar os componentes individuais. Este aspecto torna o problema sem limites do ponto de vista do desenvolvimento do modelo e do refinamento no transcorrer da experimentação.

Este problema foi observado a partir de alguns ângulos diferentes descritos abaixo. I) Pode ser determinado que pela contagem de todas as variáveis conhecidas; ainda não é possivel descrever a atividade apropriadamente que irá garantir estudos empíricos adicionais da composição. 2) É possível assumir que incógnitas sempre existem e elas podem ser agrupadas como um grupo sem nosso conhecimento explícito de suas identidades.

Um critério para a existência dos componentes escondidos ativos pode ser introduzido de acordo com uma variabilidade de mais que o barulho de um ensaio (por exemplo, 15%) dentro de um dado conjunto de dados experimentais indicam a presença de componentes ativos adicionais.

Além disso, uma única extensão da presente metodologia de modelagem pode ser realizada de tal forma, que diversos tipos diferentes de atividades podem ser acessadas simultaneamente e a função de atividade: Ajc (ci, Cj) torna-se um vetor num espaço multidimensional ao invés de um escalar. Isto pode ser otimizado para uma atividade específica usando os mesmos procedimentos conforme aqueles delineados acima.

Abaixo temos ilustrações de algumas abordagens matemáticas pertinentes que permitem que seja resolvido o problema matemático disponível, usando um conjunto de dados sintéticos típicos (mostrados nas Tabelas 3 e 4). Primeiro, endereçar a questão do ajuste dos dados usando um modelo não-linear foi endereçado. Neste caso, o número de componentes pode ser ou o atual identificado empiricamente ou reduzido para somente o componente ativo, usando a abordagem de análise do componente principal ou qualquer outro método de redução de dimensionalidade.

ABORDAGEM #1: Ajuste de Curva Usando Análise de Regressão Não-linear

Aqui, por exemplo, 15 componentes que representam a composição da amostra hipotética da medicação herbal foram arbitrariamente escolhidas. Em resumo, haviam 1+N+(N*(N+l) )/2 = 121; N=15, representando o número de parâmetros a serem determinados pelo procedimento de ajuste, e 200 pontos de dados fornecidos do experimento. A tabela 3 mostra um valor de resposta dose para 25 amostras hipotéticas cuja atividade é medida em 8 valores de doses diferentes.

A tarefa principal é encontrar os coeficientes de sensibilidade que minimizam a expressão

Minap {Di(F(a, P;c)-R)2 } ; i = l, 2,..., 200, (8)

Usando uma análise de regressão não-linear. As tabelas 3 e 4 demonstraram os dados sintéticos para 15 componentes em uma mistura com 25 amostras diferentes estudadas. TABELA 3

A Quantidade dos 15 Componentes em cada tuna das 25 Misturas (Amostra Hipotética)

Amostras Componentes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 6.440 3.415 0.014 0.000 0.003 0.173 0.000 0.000 0.676 0.002 0.009 0.000 0.030 0.000 0.183 2 0.000 1.371 0.119 3.847 0.003 0.000 0.208 0.002 0.551 0.000 0.063 0.000 0.000 0.005 0.017 3 0 .000 0.607 0.000 0.004 0.000 2.500 2 .758 0.001 0.016 0.047 0.008 0.023 0.000 0.144 0.001 4 0.000 0.004 0.024 0.253 0.000 0.002 0.290 0.034 0.001 0.899 0.000 4.407 0.015 0.000 0.800 5 5.041 0.546 0.013 0.000 1.473 0.013 0.401 0. 049 0.000 0.083 0.000 0.002 0.000 0.001 0.000 6 0.002 0.000 0.000 0.006 0.221 0.009 0.000 0.168 0.030 0.000 0.000 0.010 2.388 2 .014 1.219 7 0.000 0.015 0.001 0.000 7.508 3.342 0.000 0.004 0.129 0.000 0.055 0.362 0.000 0.006 0.263 8 2.130 0.003 0.079 0.000 0.000 0.014 0.000 0.025 0.002 0.002 0.000 9.245 0.283 0.000 0.983 9 0.029 0.037 0.001 0.000 0.054 2.614 0.001 0.000 0.000 1.659 0.156 0.000 0.008 0.288 0.003 10 0.001 0.000 0.000 0.000 0.034 0.130 0.000 0.010 0. 695 0.022 7.537 0.000 0.002 0.210 2.018 11 0.189 1.072 0.010 0.064 2. 656 0.002 0.000 0.291 0.000 0.000 0.000 0.046 0.000 0.011 0.006 12 0.000 0.000 5.867 0.137 0.004 0.005 0.001 0.001 0.258 1.011 0.000 3.242 0.000 0.021 0.017 13 0.002 0.584 0.026 0.006 0.000 0.000 0.085 0.011 0.001 0.000 0. 018 0.000 9.246 1.547 3.552 14 0.009 0.000 1.680 0.574 0.000 3.393 0.252 0.028 0.201 0.003 0.001 0.000 0.105 0.000 0.000 15 1.914 0.012 0.006 0.001 0.000 0.465 2.587 0.197 0.000 0.033 0.000 0.001 0.000 0.025 0.339 16 0.000 0.001 0.000 0.035 0.000 0.303 0.004 0.068 0.000 0.190 0.018 6.994 0.000 0.013 0.689 17 0.002 0.000 1.407 0.000 0.147 0.008 0.004 3.911 0.000 0.030 0.038 2.370 0.000 0.197 0.001 18 0.027 0.002 0.017 0.000 0.021 2.568 2.243 0.000 0.399 0.073 0.001 0.000 0.381 0.002 0.000 19 0.402 2.792 0.144 0.000 0.000 0.002 0.000 0.000 0.001 0.109 0.040 0.006 0.003 0.019 4.075 20 0.569 0.000 0.000 0.085 0.002 0.001 0.005 0.000 0.028 1. 659 0.000 0.000 0.710 2.857 0.025 21 0.001 0.694 0.005 0.000 0.000 0.000 0.966 0.069 0.556 0.053 0.000 4.968 0.001 0.005 0.008 22 0.002 0.000 0.000 0.014 0.202 0.001 0.084 0.004 0.342 0.076 0.008 0.000 2.123 0.000 2.591 23 0.266 0. 665 0.091 0.011 0.002 3.356 1.331 0.002 0.000 0.001 0.000 0.008 0.000 0.000 0.113 24 0.000 0.018 0.000 0.021 0.025 0.296 0.315 0.683 0.000 4.185 0.002 0.001 0.216 0.001 0.000 25 0.000 0.000 0.001 0.171 2.108 0.019 0.006 0 .000 0.007 0.000 3.230 0.010 0.000 0.133 1.144 TABELA 4

Relacionamento Reposta-Dose das 25 Misturas (Amostra Hipotética)

Amostras Doses 0.01 0.03 0.1 0.3 1 3 10 30 1 0.031 0.091 0.241 0.501 0.761 0. 909 0 . 969 0. 990 2 0.013 0.041 0.119 0.299 0.575 0.810 0. 931 0. 977 3 0.006 0.018 0. 055 0.155 0.367 0. 647 0.853 0. 948 4 0.029 0.086 0.230 0.486 0.749 0. 904 0. 968 0. 990 5 0.005 0.016 0. 048 0.138 0.335 0. 615 0.834 0. 941 6 0.005 0.016 0.048 0.137 0.335 0. 614 0.834 0. 941 7 0.003 0. 008 0. 026 0.078 0.212 0.460 0.729 0. 895 8 0.058 0.164 0.383 0. 662 0.861 0. 951 0. 984 0. 995 9 0.001 0. 004 0. 012 0.038 0.110 0.282 0.553 0. 797 10 0.001 0. 002 0. 007 0.022 0 . 066 0.182 0 . 413 0. 690 11 0 . 010 0.031 0.091 0.241 0.502 0.761 0.910 0. 970 12 0.022 0.066 0.182 0.414 0.691 0.876 0 . 957 0. 986 13 0.024 0.071 0.195 0. 433 0.707 0.884 0. 960 0. 987 14 0.001 0.002 0. 005 0.016 0.049 0.140 0.340 0. 620 15 0.000 0.001 0.002 0.007 0.021 0.064 0.178 0.407 16 0.044 0.128 0. 318 0.596 0.823 0. 936 0 . 979 0. 993 17 0.016 0.048 0.136 0.333 0. 612 0.833 0. 940 0. 980 18 0.001 0.004 0.013 0.039 0.115 0.291 0.564 0.804 19 0.025 0.075 0.203 0.446 0.718 0.890 0. 962 0. 988 20 0.002 0.008 0. 024 0.072 0.198 0.439 0.712 0.886 21 0.038 0.112 0.285 0.558 0.800 0. 927 0. 976 0. 992 22 0.005 0.015 0. 045 0.129 0.319 0.598 0.824 0. 937 23 0.006 0.019 0. 058 0.163 0.381 0. 661 0.860 0. 951 24 0.003 0.009 0. 027 0.081 0.219 0.470 0.737 0. 899 25 0.000 0.000 0. 001 0.004 0. 011 0. 034 0.100 0.260 A Tabela 4 é um resumo das informações de

concentração para cada uma das 25 amostras hipotéticas, cada uma contém 15 ingredientes independentes. A Figura 7 é uma ilustração esquemática da dependência de atividade da dose para um conjunto de combinações diferentes dos compostos envolvendo os mesmos ingredientes básicos. Cada curva representa um conjunto diferente de coeficientes de atividade. Mostra-se como a escolha destes coeficientes afeta a atividade geral do composto e como a curva superior seria escolhida para 5 representar a combinação mais eficaz.

Os dados disponíveis para estudo é um conjunto de doses administradas dos compostos (misturados) e uma resposta correspondente. Num caso real, essas doses são provavelmente conhecidas de forma imprecisa e a resposta 10 é propensa para alguma (esperançosamente de forma insignificante) incerteza na medição.

O método proposto é uma generalização de uma abordagem anterior, na qual a mesma mistura em diversas concentrações foi administrada. Os dados foram tratados 15 nas diferentes concentrações separadamente e então foram combinados num processamento de acompanhamento. Pelo tratamento de cada caso de concentração como uma dose separada, o processo foi simplificado. Há um efeito positivo na precisão de alguns casos.

Além de uma contribuição linear direta da dose

de cada componente, o modelo considerado inclui componentes de pseudo-compostos adicionais. Uma função desse é permitir a consideração das interações sinérgicas entre os componentes, outro poderia ser 25 antagônico. Dosagens de pseudocompostos adicionais são construídos como os produtos das doses de dois outros compostos. Para prevenir que tais pseudocompostos interfiram com os compostos-matriz, eles são construídos usando um polinomial ortogonal. Observar que se for 30 desejado, pseudocompostos de ordem superior podem ser construídos de outro pseudocomposto.

Um segundo tipo de pseudocompostos é necessário para trabalhar com grandes números de compostos, sem demandar grandes quantidades de dados de resposta da dose. Neste caso, técnicas de análise do cluster identificam diversos compostos com padrões similares de dosagem. Observar que na Figura 7, diversas áreas foram 5 vistas nas quais as curvas de resposta da dose para componentes diferentes são muito similares. Os padrões similares de dosagem são quase co-lineares, são mais comuns em tais grandes conjuntos e necessitam de um grande número de pares de resposta da dose para resolver 10 precisamente para os componentes individuais.

Substituindo os membros desses clusters ou com um membro representativo ou sintético, um pseudocomposto representando o cluster é considerado. Se o cluster provar ser importante, pode ser necessário obter pares 15 de resposta da dose adicionais para resolver apropriadamente as contribuições dos membros individuais.

A criação dos resultados dos pseudocompostos em um sistema puramente linear foi discutida. O vetor das 20 respostas, R, e matriz da dose, D, levam a uma equação de matriz simples R=DS, onde o vetor desconhecido S é uma sensitividade para cada composto. Os produtos de sensibilidade da dose, ou atividades, resultando de cada composto (e pseudo-composto) adicionam para produzir a 25 resposta observada. Observar que a sensibilidade, especialmente de pseudo-compostos, pode ser positiva ou negativa.

O problema essencial é o de resolver um sistema sub-determinado. Geralmente, isto não é possivel, 30 contudo aqui isto é alcançado ao assumir que muitos dos termos são insignificantes. No tratamento destes valores como zeros, o problema é simplificado para um sistema super-determinado. Este sistema reduzido é então resolvido. Pelo bootstrapping, estimativas das incertezas na solução podem ser obtidas. 0 nível de barulho esperado nas respostas de qualquer conjunto de dados realísticos é tal que o sistema deve ser reduzido a um ponto no qual este é significativamente super- determinado antes de uma solução precisa possa ser obtida. Se a redução resulta num sistema de equações que é somente levemente super-determinado, então o barulho presente nos dados leva a grandes incertezas no resultado. Desta forma, o número de pontos de dados disponíveis deve ser significativamente maior do que o número de desconhecidos para serem resolvidos. Infelizmente, esse número não é conhecido no início.

Conforme o número de pares de resposta da dose aumenta, o efeito do barulho na resposta é diminuído. Matematicamente, isto é equivalente a fazer a média de um número de medições repetidas, obtendo um valor mais preciso. Nos conjuntos de dados simulados, as atividades mais fortes são consistentemente e precisamente obtidas. Contudo, qualquer erro associado com um grande componente "contamina" o resto dos dados como a diferença será atribuída ao outro, componentes de atividade inferiores onde o erro representa uma contribuição proporcional muito maior.

O primeiro passo é calcular correlações (linear) entre as doses e respostas observadas. Componentes com correlações fracas (ou não) são assumidas como sendo inativas. Na prática, nos dados simulados, esta assunção é verificada. Correlações fortes tendem a ser de ambos componentes fortemente ativos e de componentes não-ativos ou pouco. Uma vez que um pequeno número dos componentes do sistema foi identificado como relevante, por sua forte correlação com a resposta, o sistema simplificado com somente aqueles componentes pode então ser resolvidos. Os sistemas super-determinados não possuem soluções verdadeiras, contudo a solução que resolve otimamente o 5 sistema, enquanto minimiza a diferença |D S - Rj2 (solução de minimo quadrados), pode ser obtida.

Para estimar a incerteza dos resultados, um processo de bootstrapping é usado. Cem mil conjuntos de resposta dose são construídos pela seleção de pares (com 10 substituição) do conjunto de pares observados. Cada conjunto construído é então resolvido, e as estatísticas da distribuição destas soluções são então obtidas como estimativas para a solução do conjunto de pares observados. A solução resultante pode então ser 15 subtraída dos dados observados para obter um residual. Calculando as correlações contra o residual pode revelar componentes adicionais com atividades significantes não resolvidas para o sistema reduzido. Outros componentes, resolvidos no sistema reduzido, podem ser encontrados 20 como tendo somente uma atividade fraca. O conjunto dos componentes incluídos no sistema reduzido pode ser ajustado e uma nova solução obtida. Pela repetição, um conjunto final de sensitividade que descreve os dados pode ser obtido.

2 5 ABORDAGEM #2: Análise do Componente Principal

Análise do Componente Principal (PCA) da Seleção do Subconjunto é usada para redução dimensional em um conjunto de dados pela retenção das características do conjunto de dados que contribuem mais 30 para sua variação. Os resultados da amostra estão demonstrados na Figura 8.

Observar que os dados sintéticos estudados (Figura 9), 10 variáveis transformadas das 15 originais cobrem 80% da variação nos dados. Isto sugere muito pouca correlação/dependência/interação e as informações são espalhadas sobre todas as variáveis. A Tabela 5 fornece os resultados da aplicação do método PCA para o 5 conjunto de dados sintéticos nas Tabelas 3 e 4. Essa mostra os coeficientes lineares Di na fileira superior (i=l,...,15) seguida pelas 15 fileiras de coeficientes pares Di, j onde i=l,...,15 e j=l,...,15, rendendo uma matriz 15x16. Os coeficientes realçados são aqueles 10 retidos pelo PCA para a função da resposta que cobre todo o conjunto de dados.

O conjunto de dados discutidos neste exemplo podem ser representados adequadamente pela seguinte função de resposta usando o método PCA, onde houve uma 15 redução substancial do espaço do parâmetro para incluir somente quatro coeficientes: dois para efeitos lineares (componentes X6 e X12) , bem como dois para interações (sinérgica para componentes X13 e X15, antagonista para componentes Xi e X15) . As variáveis remanescentes são 20 insignificantes e podem ser ignoradas. Obtendo somente os coeficientes realçados da Tabela 5, foi construída uma função de resposta correspondente:

Resposta = 0.5248jc6-0.4893jc12 +0.4745JC13X15-O-STOSjc1X15 TABELA 5 Dados da Análise de Resposta (conjunto 16 x 15)

0.0574 0.0183 0.0051 0.0130 0.0613 0.5248 0.2546 -0.0303 -0.0001 0.0486 -0.0657 -0.4893 -0.1484 -0.0475 -0.2019 0.4271 0.0919 0.0553 0.0077 0.1988 0.4830 0.3410 0.0038 -0.0039 -0.1258 -0.2323 0.2944 -0.6736 -0.2971 -0.5703 0.0919 0.0137 0.0220 0.0020 0.0384 0.2253 0.1337 -0.0021 -0.0014 -0.0132 -0.0786 0.0288 -0.1948 -0.0826 -0.1832 0.0553 0.0220 -0.0094 0.0008 0.0339 -0.1229 -0.0486 0.0043 0.0004 -0.0372 0.0157 0.0793 -0.0072 -0.0081 0.0216 0.0077 0.0020 0.0008 0.0007 0.0053 0.0288 0.0152 -0.0014 0.0000 0.0007 -0.0054 -0.0193 -0.0142 -0.0055 -0.0154 0.1988 0.0384 0.0339 0.0053 0.0929 0.3798 0.2335 -0.0042 -0.0022 -0.0393 -0.1361 0.0469 -0.3621 -0.1548 -0.3307 0.4830 0.2253 -0.1229 0.0288 0.3798 -0.6096 -0.2332 -0.0121 0.0066 -0.2461 0.1736 -0.2226 0.0049 -0.0180 0.1625 0.3410 0.1337 -0.0486 0.0152 0.2335 -0.2332 -0.0559 -0.0026 0.0024 -0.1581 0.0362 0.0017 -0.1484 -0.0771 -0.0397 0.0038 -0.0021 0.0043 -0.0014 -0.0042 -0.0121 -0.0026 0.0030 -0.0003 -0.0047 -0.0077 0.0587 -0.0162 -0.0083 -0.0103 -0.0039 -0.0014 0.0004 0.0000 -0.0022 0.0066 0.0024 -0.0003 0.0000 0.0024 -0.0005 -0.0056 0.0015 0.0010 -0.0004 -0.1258 -0.0132 -0.0372 0.0007 -0.0393 -0.2461 -0.1581 -0.0047 0.0024 0.0291 0.1153 -0.1782 0.2810 0.1227 0.2514 -0.2323 -0.0786 0.0157 -0.0054 - 0.1361 0.1736 0.0362 -0.0077 -0.0005 0.1153 0.0059 -0.1886 0.1555 0.0794 0.0677 0.2944 0.0288 0.0793 -0.0193 0.0469 -0.2226 0.0017 0.0587 -0.0056 -0.1782 -0.1886 1.2199 -0.5192 -0.2556 -0.3407 -0.6736 -0.1948 -0.0072 -0.0142 -0.3621 0.0049 -0.1484 -0.0162 0.0015 0.2810 0.1555 -0.5192 0.6934 0.3248 0.4745 -0.2971 -0.0826 -0.0081 -0.0055 -0.1548 -0.0180 -0.0771 -0.0083 0.0010 0.1227 0.0794 -0.2556 0.3248 0.1515 0.2278 -0.5703 -0.1832 0.0216 -0.0154 -0.3307 0.1625 -0.0397 -0.0103 -0.0004 0.2514 0.0677 -0.3407 0.4745 0.2278 0.2850 Agora serão feitos alguns comentários gerais sobre a seleção do subconjunto na análise de regressão. A escolha de um modelo para um dado conjunto de dados com muitas variáveis pode propor um desafio. Quando há 5 muitas previsões (com muitas interações possíveis), pode ser difícil encontrar um bom modelo. 0 questionamento que surge é; quais são os principais efeitos que devem ser incluídos; e uma pergunta associada é; quais são as interações que devem ser incluídas? A seleção do modelo 10 tenta simplificar esta tarefa. Este é um problema "sem solução" na estatística: não há procedimentos mágicos para obter o "melhor modelo". A mineração de dados pode ser usada para a seleção do modelo. Para implementar isto, houve uma necessidade por um critério ou benchmark 15 para comparar os dois modelos, e uma estratégia de busca. Com um número limitado de previsores, é possível buscar todos os modelos possíveis.

Possíveis critérios são agora examinados. R2 não é um bom critério, como este sempre aumenta com o 20 tamanho do modelo, e portanto sugere erroneamente que um resultado ótimo seria obtido ao tomar o maior modelo (Usando R2 ajustado é melhor, desde que estes penalizados modelos maiores.) Cp do Mallows (chamado para Colin Mallows) é mais amplamente usado como uma 25 regra de parada na regressão stepwise. É similar ao critério de informações do Akaike, e depende menos no número de efeitos num modele do que R2. É definido, para um subconjunto de regressores P de um conjunto total de regressores K, como

,--N + 2P (9)

S2

onde Σ(γι ~Yip) é a soma de erros dos quadrados para o

/'=IJV modelo, Yip é o ith valor previsto de Y fora dos regressores P, S2 é o quadrado do meio residual após a regressão no conjunto completo de regressores, e N é o tamanho da amostra. Os critérios de Informações de Akaike 5 (AIC) e BIC de Schwarz também são considerados. Uma estratégia de busca é a busca do "melhor subconjunto", que envolve a busca de todos modelos possíveis e obtendo aquele com o R2 ajustado mais alto ou Cp mais baixo. Uma busca stepwise (para frente, para trás ou ambas) envolve 10 a escolha de um modelo inicial e a obtenção de um maior salto (para cima ou para baixo) dentro do critério selecionado. A implementação no Pacote de Software R inclui uma busca do "Melhor Subconjunto" que usa R2, Cp ou BIC ajustados e realiza buscas exaustivas com o 15 algorítimo branch-and-bound, e uma busca stepwise, que trabalha pela minimização do Critério de Informações de Akaike (AIC).

Ajuste de Modelo: Outras Possibilidades

Regressão Linear Múltipla pode não ser 20 suficiente. Usando a otimização para conseguir uma função de ajuste melhor, pode resultar na obtenção da função não-côncava após a interpolação. Uma função côncava pode ser necessária para encontrar facilmente a resposta máxima.

Nf I V

miny A-a-rTx--xTOx

2 5 <x,r,2 J (10)

sl. -Q> 0

Onde x é uma representação do vetor dos compostos do ingrediente, xT é seu transporte, A a atividade, Q é um parâmetro de otimização, e α é um vetor de coeficientes lineares na função de atividade. 30 Agora deve ser decidido se deve ser usado a regressão generalizada ou a regressão de logística. Seleção do Subconjunto: Resultados

As variáveis selecionadas (componentes) são escolhidas como x2, xu, x13, X1X15, X10X12 · 0 modelo resultante é:

A = CC0 + CC2X2 + Qr12X12 + Cr13X13 + βχ I5XiXi5 + Ao i2xioxi2 (11)

O modelo ajustado é:

A = 0.16 + 0.25x2 +0.10x12 +0.05x13 -O-ISx1X15 +0.04x10x12 (12 )

Onde o termo final representa sinergismo e o termo segundo-para-último representa inibição. Os resultados da regressão linear resultam num R2 ajustado de 0.9. Encontrando a Resposta Máxima

Uma função possivelmente interpolada não- côncava foi considerada:

η η n

a=«o+Σ+Σ Σ βι jxtxj <13 >

i=l I=1 j=1

Uma otimização global foi usada para encontrar a resposta máxima sobre a faixa de todas as concentrações possiveis (ou de interesse):

η η n

max a0 + Σα,Χ,+ΣΣΛ^ (14)

x 1=1 1=1 M

SJ. V" Xl=h

Jt, Ϊ0, V1

Todas as outras variáveis foram consertadas, exceto para as duas e analisados os gráficos das respostas.

A fim de determinar quais componentes interagem significativamente (critério de 25%), valores estimados foram comparados para suas atividades com aqueles observados. Se os valores observados diferirem em muito (>25%), isto indica a presença das interações. Uma perturbação de primeira ordem para a função inteiramente não-linear usando coeficientes lineares conforme a aproximação foi usada.

A função de resposta no (11) é baseada na otimização da função não-linear (12) geralmente para o mesmo conjunto de dados como antes. Isto resulta (12) 5 como o melhor ajuste com o coeficiente de correlação de 0.9. Observe que conforme declarado antes, não há um método estatístico mágico, assim é necessário tentar o maior número possível e selecionar aquele que fornece o melhor resultado (isto é, a maior correlação com o 10 conjunto de dados) . Aqui, obviamente, o PCA e a otimização da função (12) usando regressão linear múltipla não fornece um acordo perfeito, contudo eles identificam os termos X12 e XiXi5. 0 PCA sugere Χ13Χ15 enquanto o outro método sugere X10X12 é um termo 15 interativo. Se os métodos estatísticos diferentes produzem resultados divergentes, então na ausência de evidência empírica contra um ou outro resultado, ambos resultados devem ser mantidos.

Em conclusão, pode ser visto do exemplo acima 20 que é possível identificar os componentes ativos usando ferramentas estatísticas e PCA. Também pode ser criado um modelo de atividade usando regressão multi-linear. Resposta da droga otimizada pode ser encontrada com uma atividade fornecida dos compostos. O número mínimo de 25 medições necessárias para uma solução única com componentes N é:

1 + N + N2/2 (15)

Desta forma um número de médicos pode ser reduzido pela seleção do subconjunto.

Para encontrar uma composição ótima do

composto, equações (13) e (14) foram usadas no caso geral. Especificamente, para o exemplo mais simples possível onde dois ingredientes foram isolados, mas sua concentração relativa ainda não foi otimizada, o exemplo a seguir foi considerado. Suponha que a função de atividade depende destes dois componentes x e y de acordo com:

Activity =0.3x + Q Ay+ OJxy (16)

Onde o último termo descreve a ação sinérgica dos dois ingredientes. Desde que toda mistura somente contém componentes x e y, a condição: x+y=1 existe. A função da atividade foi então transformada em:

Aetivity = OA +0.6x-OJx2 (17)

tal que esta é efetivamente uma função de somente uma variável, chamada de x. Atividade foi minimizada com respeito a x para obter: d(Activity) Λ

—--- = 0 resultando x = 0A3 (18)

dt

Conseqüentemente a formulação otimizada é:

x=0.43 e y =0.57. Este exemplo é ilustrado na Figura 10.

A mesma abordagem pode ser aplicada para uma combinação de muitos ingredientes mas necessitará uma análise multi-dimensional.

Na Figura 11 uma ilustração tridimensional é

fornecida com diversos exemplos de dependência de dose para dois ingredientes afetando a resposta geral (o painel do lado esquerdo) e como os residuais emergem em cada caso (o painel do lado direito).

EXEMPLO 4

Usar Técnicas in vitro para Gerar Dados Cinéticos no Trato Gastrointestinal para o Modelo Farmacocinético/Farmacodinâmico Esboçado na Figura 1

Uma descrição mais detalhada do modelo está apresentada na Figura 12. A cinética da decomposição, metabolismo e absorção serão medidas usando: a) suco intestinal e gástrico artificial; b) flora intestinal; c) microssomos intestinais; e d) membrana da célula Caco-2 ou MDCK ou tecido intestinal.

Estabilidade no suco intestinal e gástrico artificial: Uma mistura dos componentes é incubado com suco intestinal e gástrico artificial. Um procedimento padrão para preparar o suco intestinal e gástrico artificial é descrito na Farmacopéia dos Estados Unidos. A cinética da degradação é uma medida da estabilidade dos componentes individuais na mistura. Usando a abordagem similar a aquela descrita no Exemplo 1, (com a modificação que r é substituído pela taxa de degradação constantes nas equações 4 e 5) , a estabilidade dos componentes individuais e interações potenciais em termos de alteração da estabilidade ou decomposição por outros componentes poderiam ser identificados.

Metabolismo pela flora intestinal:

Procedimentos padrões para estudar o metabolismo das misturas herbais pela flora intestinal são bem estabelecidas (Hasegawa e outros, 1996; Hasegawa e 20 Uchiyama, 1998; Hasegawa e outros, 2000; Hasegawa, 2004). Os Ginsenosídeos são componentes ativos conhecidos de vários tipos de ginseng incluindo Panax ginseng, rotoginseng, American ginseng, etc. Interessantemente, estes componentes possuem pouca 25 atividade farmacológica. As agliconas produzidas pela remoção stepwise dos glicosídeos pelas enzimas bacterianas intestinal estão ativas. Estas agliconas possuem uma biodisponibilidade muito melhor do que os ginsenosídeos correspondentes. A taxa de metabolismo dos 30 componentes individuais e as potenciais interações entre eles pela flora intestinal serão quantificadas usando a abordagem descrita no Exemplo 1.

Permeabilidade: Células do MDCK, Caco-2, intestino do rato e PAMPA são comumente empregadas para a medição da permeabilidade intestinal. Camadas da célula Caco-2 são modelos comuns empregados para a estimativa da permeabilidade das potenciais direções, 5 embora não seja um bom modelo para predizer químicos que são absorvidos via transporte paracelular. As células MDCK cultivadas com um processo proprietário in-house fornecem uma estimativa muito melhor. Contudo, as culturas das células não são muitas vezes adequadas para 10 estudar a permeabilidade das formas de dosagem, extratos naturais ou formulações. A experiência nos diz que a integridade destas preparações não é sempre garantida. PAMPA não foi usada para a avaliação da absorção da substância natural. Não está claro se este modelo será 15 aplicável para pesquisa de produtos naturais. Tecidos do intestino do rato foram usados extensivamente para estudar a absorção das substâncias sintéticas e naturais (Ruan e outros, 2006). Geralmente, a biodisponibilidade estimada usando este modelo corresponde bem com aquele 20 dos ratos e humanos (Chiou, 1995; Chiou e Barve, 1998; Chiou e outros, 2000). Usando estes métodos e a abordagem descrita no exemplo 1, a permeabilidade dos componentes individuais e seus efeitos na permeabilidade de outros componentes numa mistura pode ser medida.

Microssomos Intestinais: os componentes que são

permeáveis são selecionados para incubação com microssomos intestinais. Esses componentes poderiam ser produtos de decomposição no lúmen gastrointestinal, metabólitos formados da flora intestinal, ou enzimas 30 intestinais. A razão para isto é o fato de que componentes que não serem absorvíveis não possuem acesso a estas enzimas (Figura 13).

A taxa de metabolismo dos componentes individuais em uma mistura pode ser estimada usando a abordagem esboçada no Exemplo I. Os componentes de interação também podem ser identificados. A taxa de metabolismo, indução ou inibição da enzima poderia ser medida e dimensionada usando um modelo farmacocinético similar à Figura 1.

Os dados gerados desta série de estudos fornecerão todos os parâmetros para descrever a estabilidade, metabolismo e taxa de absorção intestinal, após a administração oral de uma mistura (parâmetros para as Figuras 1, 12 e 13) . As interações potenciais também podem ser identificadas na absorção e no nivel de metabolismo.

EXEMPLO 5

Geração dos Dados Metabólicos Hepáticos para o Compartimento do Figado no Modelo Farmacocinético

Foi demonstrado na literatura recente que os dados metabólicos gerados usando hepatócitos humanos crio-preservados fornecem melhor predição de clearance hepática no humano do que nos microssomas do fígado humano (Lam e Benet, 2004; Hallifax e outros, 2005). A vantagem de usar hepatócitos é que as absorções da membrana dos componentes dentro da célula são contabilizadas para (Figura 14).

Somente os componentes e seus metabólitos que são absorvidos do intestino são estudados. Estas substâncias serão concentradas dos microssomos intestinais. Os componentes absorviveis são coletados do compartimento basal do aparelho depois de um estudo de permeabilidade.

A abordagem descrita no Exemplo 1 pode ser usada para avaliar a taxa de metabolismo de um componente numa mistura. Ao invés de usar o relacionamento efeito da concentração, a taxa do metabolismo é usada no lugar do efeito. Dados coletados destes estudos também permitirão as interações componente-componente e componente-metabólito.

Clearance Hepática pode ser prevista usando

métodos publicados (Lau e outros, 2002; Hallifax e outsos, 2005). Estes dados irão incorporar-se dentro do modelo farmacocinético/ farmacodinâmico para a previsão do perfil.

EXEMPLO 6

Estimativa da Ligação da Proteina do Plasma e Volume da

Distribuição Todos os componentes absorviveis são esperados para estarem presentes no sistema circulatório. Na teoria, o número de componentes gerados de uma mistura, após a administração oral, será pelo menos uma ordem de magnitude maior do que o número de espécies absorviveis. Contudo, muitos destes componentes estão presentes em quantidades extremamente insignificantes e seria dificil medi-las precisamente. Esses componentes minutos são da mesma forma contribuidores insignificantes para a farmacocinética e farmacodinâmica da mistura. Contudo, se eles tiverem contribuições significantes, análises matemáticas serão capazes de detectá-los. A menos que haja razões para segui-los, eles serão tratados como inativos.

Neste exemplo, a proteína do plasma fazendo a ligação de um componente numa mistura é medida usando plasma humano. Métodos tais como diálise de equilíbrio 30 são comumente empregados para medir a ligação dos químicos no plasma. Um esquema da distribuição de um componente no sangue é mostrado na Figura 15. A interação potencial entre os componentes será avaliada usando a abordagem esboçada no Exemplo I. A única diferença é que a equação de ligação é usada para descrever a interação do potencial.

As frações gratuitas dos componentes no plasma serão obtidas destes tipos de estudos in vitro. Os dados podem ser usados de duas formas: 1) a fração gratuita é introduzida dentro do modelo

farmacocinético/farmacodinâmico no compartimento do sangue; e 2) 0 volume da distribuição pode ser previsto 10 usando a ligação da proteína do plasma e registra os valores P dos componentes (Lobell e Sivarajah, 2003). Novamente, esse parâmetro pode ser introduzido dentro do modelo farmacocinético/ farmacodinânamico.

EXEMPLO 7

Predigão da Taxa de Excreção Renal dos Componentes e seus

Metabólitos

A taxa da excreção renal dos componentes e seus metabólitos pode ser prevista usando um método publicado (Brightman e outros, 2006a). Novamente, as interações 20 potenciais entre os componentes podem ser previstas usando a abordagem descrita no Exemplo I. A única diferença é que o relacionamento concentração-efeito é substituído com as constantes da taxa de excreção.

EXEMPLO 8 Uso de um Modelo Farmacocinético e Farmacodinâmico

Fisiologicamente Baseado, para Descrever a Concentração e o Curso do Tempo de Efeito dos Componentes em uma Mistura depois da Administração Oral

Este modelo farmacocinético e farmacodinâmico fisiologicamente baseado está graficamente representado nas Figuras 1, e 12-15. Os parâmetros para este modelo podem ser gerados pelos estudos esboçados nos exemplos 4 a 7. As interações farmacocinéticas potenciais podem ser previstas usando os dados. Se o(s) modelo(s) farmacológico(s) apropriado(s) for(em) escolhido(s) para medir tais atividades multicomponentes, como aquelas esboçadas no exemplo 1, a resposta do composto por estes componentes pode ser descrita. Nesse exemplo, são descritos os aspectos teóricos do modelo farmacocinético /farmacodinâmico (Figura 1).

0 Modelo da Dissolução Segmentai, Trânsito e Absorção (SDTA) contabilizam para a dissolução e fluxo de trânsito no estômago, duodeno, jejuno, e íleo e a absorção no duodeno, jejuno e íleo. 0 trato gastrointestinal é dividido dentro de três compartimentos: estômago, intestino pequeno e cólon. 0 intestino pequeno humano pode ser descrito por sete sub- compartimentos, onde uma transferência da droga de um sub-compartimento para o próximo am uma maneira de primeira ordem (Yu e outros, 1996). 0 modelo SDTA inclui as seguintes duas suposições: Primeiro, que a absorção do estômago é insignificante quando comparada com aquela do intestino pequeno; e a segunda é que a droga movendo através do pequeno intestino pode ser considerada como um processo fluindo através de uma série de segmentos, cada um descrito por um sub-compartimento com cinética de transferência linear de um para o outro, e todos os compartimentos podem ter volumes diferentes de taxas de fluxo, mas o mesmo tempo de residência.

Nas equações que seguem, o subscrito i refere- se aos grupos do tamanho de partícula que formam a distribuição de massa do tamanho da partícula total. Dentro de qualquer grupo de tamanho de partícula, todas as partículas são do mesmo tamanho e seus tamanhos não irão alterar conforme ocorra a dissolução ou precipitação. Ao invés disto, ocorrerá dissolução e precipitação pela alteração do número de partículas. Desta forma, para uma droga não-degradável dosada em uma forma de dosagem de liberação imediata, a dissolução, absorção, e trânsito no trato gastrointestinal podem ser descritas como segue:

Estômago

dJf-KMrKdM,, (19)

^f=-KM+KdM (20)

Intestino pequeno

^f=KMr-KMt+KiM,, 2' ~7 (2i)

= Κ.ΜΪ-K,M],+ KdM',r KaM'„ n-i- 2, ...7 (22)

Cólon

dMcsi

dt

KMlrKMl + Kd M'„ 123

^γ=κ,μ]γΚΜ«+κλχ,-κλμ:. (24)

onde t é o tempo, jyj 1 M M1 s^° as quantidades da

droga sólida no estômago, segmento nth do intestino pequeno e cólon respectivamente. Ks, Kt, Kc, e Ka são as constantes da taxa do esvaziamento gástrico, trânsito do 20 intestino pequeno, trânsito do cólon e absorção intrínseca, respectivamente. Na Eq. (3,4), onde n=l, o termo KtM0 é substituído por KsMs.

A taxa geral da absorção da droga pode ser calculada por:

dM. 2/¾/

~ΊΓ = Ml+-R--Mt <25)

I Vcolon

Onde Ma é a quantidade de droga absorvida no tempo t, Peff é a permeabilidade efetiva da membrana intestinal para a droga, R é o raio do intestino n

pequeno, Ml=EMl, n=l,2, ...,7, Peff(coion) é a permeabilidade efetiva da membrana do cólon para a droga e Rcoion é o raio do cólon. A fração da dose absorvida pode então ser calculada por

F- = MaJ M„=·M Μ\Υ> <26>

IV-L 0 J\colon

As equações 25 e 26 podem ser usadas para estimar a dose da fração absorvida e a taxa da absorção da droga que por sua vez pode ser relacionada aos modelos farmacocinéticos comportamentais convencionais.

A absorção pode ser limitada pela taxa de dissolução e pela taxa de permeação, onde a taxa de permeação refere-se ao fluxo da droga através da membrana intestinal. A taxa de fornecimento da dissolução e a taxa de compreensão de permeação determinam a concentração de drogas no trato GI. Contudo, a concentração no trato de GI também é limitada pela solubilidade da droga. Quando a taxa de fornecimento for muito maior que a taxa de compreensão, a concentração da droga no fluído gastrointestinal aproxima-se a seu limite de solubilidade. Matematicamente, a taxa de dissolução é expressada por:

(27)

dhr

Onde D é o coeficiente de difusão, h é a

espessura da camada de difusão, d é a densidade da droga sólida, Cs é a solubilidade, e V é o volume. Desta forma pode ser causada uma dissolução pobre ou pelo tamanho da partícula (r) ou pela solubilidade.

Este modelo simula o transporte, a dissolução, e a absorção dos compostos através do intestino humano e computa o fluxo dentro da veia portal, a fração total absorvida e (se parâmetros farmacocinéticos do corpo estiverem disponíveis) a curva do tempo de concentração 5 no plasma. 0 transporte intestinal é modelado como comportamentos seriais, que demonstraram reproduzir a distribuição do tempo de trânsito do intestino pequeno com precisão suficiente fornecida na variabilidade in vivo (Lartigue e outros, 1991) . As dinâmicas da 10 dissolução ou são interpoladas de uma curva de dissolução in vitro ou são simuladas d usando a equação Noyes-Whitney, por conta do tamanho da partícula, da solubilidade conforme ajustada para pH, usando a equação Henderson-Hasselbach, e da saturação local. A taxa de 15 absorção local é proporcional à concentração da droga dissolvida; isto é, a membrana apical é assumida como sendo a taxa limitando a barreira para absorção, com a droga suficiente absorvida e rapidamente misturada com o compartimento do corpo como para manter as condições de 20 baixa, e transporte para ser ou passivo ou num regime linear. 0 coeficiente da taxa de absorção é determinado pelo experimento in vitro, usando células Caco-2 ou MDCK ou tecido intestinal, pelas propriedades anatômicas do intestino pequeno, e por um fator de correção 25 determinado por um ajuste de parâmetro único, para um conjunto diverso de drogas. A finalidade primária do fator de correção é para contabilizar a área da superfície aumentada disponível pela absorção in vivo, conforme comparado com as monocamadas in vitro planas, 30 mas também há um componente fenomenológico para a correção, como evidenciado pela diferença substancial entre a correção necessária para as monocamadas MDCK e Caco-2. 0 fluxo absorvido entra no compartimento do corpo central para distribuição e clearance usando um modelo fisiológico conforme descrito na Figura 1 (Brightman e outros, 2006a; Brightman e outros, 2006b).

A finalidade primária do modelo do intestino 5 virtual é transformar as informações locais sobre a permeabilidade coletada dos experimentos in vitro dentro de uma predição do nível geral e tempo de absorção da droga. 0 intestino é essencialmente de certa forma um tubo flexível com paredes semipermeáveis. Os alimentos e 10 a água passam através do intestino, enquanto os nutrientes e fluídos são absorvidos dentro do sistema do portal.

A taxa de trânsito no intestino é baixa, com um tempo médio de trânsito do intestino pequeno em torno de 15 três horas, e em torno de 24 horas para todo o trato GI. Desta forma, a moção do fluído no lúmen do intestino pode ser assumida como sendo altamente laminar e mal misturada na direção radial. As propriedades de um modelo de fluxo laminar cilíndrico, com absorção da 20 parede foram estudadas no contexto de comutadores de calor e também foram aplicadas à absorção intestinal (Amidon e outros 1980 e Elliot, 1979) . O principal problema com esta abordagem é que os detalhes precisos do fluxo do fluído e do transporte da droga 25 provavelmente são refletivos da situação fisiológica, dadas as variações na forma do tubo, a natureza peristáltica do transporte do fluído, as moções do indivíduo, e assim por diante. Modelos muito mais simples, tais como mistura radial completa acoplada com 30 a dispersão longitudinal, são justamente como refletivo das características de trânsito do intestino, e são mais fáceis de trabalhar. O modelo mais popular, a absorção comportamental e o modelo de trânsito, de fato incluem dispersão somente de forma implícita através do uso de um pequeno número de compartimentos longitudinais.

Um modelo de difusão da advecção de uma- dimensão para transporte no intestino seria da seguinte forma:

^=D#c_vK+nC) (2e)

õtÕx2Õx

Onde x é a localização ao longo do intestino, C(x,t) é a concentração da substância, assumida uniforme, através da seção de cruzamento do intestino, 10 em um lugar e tempo particulares, v é a velocidade de transporte através do intestino, D é a constante da dispersão, e F é uma função de captura das características de sem-trânsito como absorção, metabolismo, etc.

Discretização o termo de advecção para uso num

modelo de diferença finita, demonstrou

— » .C(x + -C(*> = iüÍ + LgÊl£ + Q(S2) <29,

õx δ õx 2 õx

Que demonstra que há um componente difuso da equação discretizada, chamada de difusão numérica, que é 20 geralmente vista como uma contrariedade. A absorção comportamental e o modelo de trânsito têm vantagem disto através do uso desse para o modelar a natureza difusa do sistema fundamental, e ajustado o tamanho da discretização δ apropriadamente para capturar a 25 dispersão observada in vivo.

A função F(C), incluída acima, é selecionada para capturar a absorção, o metabolismo e outras características. 0 fator mais simples e mais importante, absorção passiva, é fornecido por F(C) = -KaC (30)

usando 2 Weff

K»=—f~ <31>

Onde Peff é a permeabilidade efetiva, R é o raio do intestino, e λ é um fator de correção superfície para o volume selecionado, para permitir as diferenças da 5 área da superfície entre as foliações da parede do intestino atual e a superfície relativamente plana de uma monocamada da célula.

O fluxo da droga dentro da veia portal Je a fração absorvida Fa são computadas como

/(/)= Y1Kfix(I) (32)

OO

Fa = \j(t)dt (33)

o

0 transporte ativo pode ser modelado pela substituição de Peff com uma concentração dependente da permeabilidade

= (34)

m

Onde a taxa máxima de permeação Pmax e a constante de ligação efetiva Km podem ser estimadas dos experimentos in vitro e são potencialmente dependentes da região.

O metabolismo é modelado pelo registro das

concentrações da matriz e do metabólito separadamente, e incluindo um termo no modelo local que converte a matriz para metabólito. Embora seja possível estender para qualquer número de metabólitos, o modelo atual está

ilustrado usando um metabólito único. Os termos de transformação são da seguinte forma: 10

15

20

25

Γ v max 0 d Km+Cp dt Cm. V 0 max Km +Cd m p :35)

Onde Vmax e Km podem ser dependentes da região e cada componente (matriz e metabólito) seguindo o transporte similar e dinâmica de absorção.

A dissolução é modelada similarmente pela consideração da transformação da fase sólida para a fase dissolvida. A dissolução é limitada pela difusão das espécies dissolvidas longe da partícula sólida. Para o caso de partículas esféricas uniformes se dissolvendo dentro de um meio infinito, a equação da difusão pode ser resolvida na forma da lei da Raiz Cúbica de Hixson- Crowell,

x_ *

M

'3

κι

(36;

Onde K é a constante da dissolução da raiz cúbica. Desde que a entrada do fluxo é baseada na quantidade de material não dissolvido original, um termo para entrada dos sólidos de dissolvimento da forma era -f^h- tX 2

Ii-'/

dt

(37)

Onde Cs, a concentração das partículas não dissolvidas, é alterada somente através do transporte e Td, o tempo de dissolução, é definido como: dp

Td=-

:38)

2 CsDIh

Onde d é o diâmetro da partícula, p é a densidade das partículas, Cs é a solubilidade, D é a constante da difusão, e h é a profundidade efetiva da camada não agitada. Essa entrada é ajustada em zero quando t > Td.

0 número de compartimentos, o tempo total de trânsito, a taxa luminosa superfície para volume 2/R e a taxa de esvaziamento gástrico são todos relativamente independentes da droga, mas dependentes das espécies sob consideração (Tabela 4).

TABELA 4

Parâmetros Específicos das Espécies

Humano Rato Cachorro Número de I1 7 7 compartimentos Tempo total de trânsito do intestino 199 min1 180 min 8 3 min2 pequeno Raio do intestino 1.75 cm1 0.2 cm 0.75 cm efetivo Tempo de esvaziamento 15 min 15 min 15 min gástrico 1Yu e outros, 1996, 2: [wanaga e outros, 1998 0 número de compartimentos é uma indicação da dispersão, e leva em conta o grau de mistura longitudinal durante o transporte de material, ao longo do intestino pequeno. 0 tempo de trânsito é a quantidade média de tempo que o material leva no intestino pequeno. 0 tempo de esvaziamento gástrico é a quantidade de tempo necessária para metade do conteúdo gástrico para entrar no duodeno, através da válvula pilórica. Enquanto o esvaziamento gástrico é bastante variável, a dinâmica do esvaziamento gástrico não possui um grande efeito na fração absorvida, devido ao princípio da superposição. 0 esvaziamento gástrico, contudo, irá afetar as dinâmicas detalhadas das drogas, alterando os parâmetros farmacocinéticos, tais como Cmax e Tmax.

Enquanto sistemas computacionais podem geralmente somente ser validados através de design e implementação cuidadosos, existem diversos testes específicos aplicáveis ao atual sistema, que atuam para assegurar que ambas as integrações numéricas possuam um grau suficiente de precisão e que certos tipos de erros grosseiros estejam ausentes.

Toda molécula da droga colocada dentro de um sistema deve ir a algum lugar: deve ser excretado, distribuído para alguma parte do corpo, ou transformado dentro de algum metabólito. Balanço da massa é muitas vezes usado no farmacocinético experimental, e possui valor aqui também.

Para o caso especial das drogas que exibem difusão puramente passiva, alta solubilidade, e nenhuma permeabilidade regional, o sistema das equações pode ser resolvido exatamente para Fa, dando

+ (39)

Onde Kt é a constante do transporte entre cada compartimento e N é o número de compartimentos.

Dentro do modelo farmacocinético, o corpo é representado com diversos compartimentos. Cada um possui um volume e os parâmetros estão listados na Tabela 7.

De interesse particular é o "Compartimento do Tecido" que representa os tecidos do corpo não contabilizados de outra forma no modelo. As concentrações do composto neste compartimento determinam a intensidade do efeito fisiológico. Isto é mostrado pela conexão listrada para a caixa "Reposta" adjacente.

0 movimento dos materiais entre os compartimentos é mostrado com flechas. Doses iniciais entram no estômago, enquanto o cólon, fígado e rins são locais de potencial eliminação do sistema. 0 movimento dos compostos entre os compartimentos é proporcional ao volume do fluxo do fluído entre os compartimentos e a concentração do composto no compartimento de origem, e inversamente proporcional ao volume do compartimento original.

0 modelo assume uma abordagem "massa-balanço",

com igualdade entre as quantidades de material que deixa um compartimento e as quantidades que entram em outro.

Dada uma distribuição inicial dos compostos nos vários compartimentos, o modelo é integrado avançando no tempo, usando um algoritmo Runge-Kutta de 4 a ordem, com passos de tempo variáveis.

O compartimento do tecido é medido para que a soma dos compartimentos, excluindo o interior do trato do GI, seja igual ao volume de distribuição para um homem de 7 0 kg.

Usando a mistura dos 15 componentes descritos no exemplo 2, uma lista de parâmetros farmacocinéticos é gerada e é detalhada na Tabela 5. Os parâmetros que são inerentes ao modelo farmacocinético estão listados nas 20 Tabelas 6 e 7. Estes dados são extraídos dos dados publicados (Bernareggi e Rowland, 1991; Davies e Morris, 1993; Brown e outros, 1997).

Os exemplos acima esboçam os métodos in vitro e in silico integrados, que são usados para identificar as espécies ativas e de interação de uma mistura, similar a aquelas de uma substância natural. Usando o modelo farmacodinâmico e farmacocinético baseado

fisiologicamente, o tempo de concentração de cada um dos 15 componentes é estimado (Figura 16) . Similarmente, o 30 tempo para a resposta do composto também é calculado (Figura 17) . Uma vez que os dados tais como aqueles da Figura 17, sejam gerados, uma dosagem ótima para produzir uma resposta desejada pode ser reconstruída. Essa dosagem consiste de um perfil de ingrediente, que é essencial para o desenvolvimento de um novo produto e/ou forma de dosagem.

TABELA 5 Parâmetros Farmacocinéticos dos 15 Compostos

Número Permeabilidade Clearance Clearance Volume da do Intestinal, Hepática Hepática, Distribuição Composto min'1 Intrinsica, L/min L/kg min-1 1 0.17 632 0.59 0.53 2 0.86 6633 1. 31 1.16 3 4 . 02 1104 0.79 0.36 4 4 .43 2011 1.01 0.66 5 1.89 183 0.24 0.52 6 0.52 810 1.34 1.64 7 2.40 555 0.54 0.95 8 6.88 8929 1.35 0.58 9 0.14 15406 1. 41 0 . 90 10 0.19 1428 0.89 1. 57 11 0.12 792 1.33 2.28 12 0.20 294 0.35 0.35 13 0.80 915 0.72 0.79 14 2.99 223 0.28 0.80 15 0.38 443 0.46 0.95 5

TABELA 6

Taxa do Fluxo de Sangue Para e De Vários Órgãos

Fluxo Clearance, mL/min Ao longo trato do GI 2 sangue -*· intestino/cólon 235 intestino/cólon -♦ fígado 235 sangue fígado 239 fígado -*· sangue 1180 sangue «-> tecido 3110 TABELA 7 Voltunes Fisiológicos dos Vários Órgãos

Compartimento Volume, L interior do 0.155 estômago/intestino/cólon segmentos intestinais 0.212 cólon 0.371 rins 0.280 fígado 1. 69 sangue 5.20 EXEMPLO 9

Um Exemplo Integrativo Mostrando a Contribuição das Propriedades "Tipo Droga" para os Ingredientes Efetivos

O objetivo desta amostra é fornecer um meio de estimar os ingredientes ativos em uma mistura simulada 10 dos 50 componentes. Na Tabela 8 é mostrada a resposta in vitro para cada um dos cinqüenta componentes no sistema. Adicionalmente dois pares de componentes (3, 23) e (20, 50) possuem interações sinergística com atividades de

0.800 e 1.00, respectivamente. Uns ±5 % foram 15 adicionados aleatoriamente aos dados e a resposta geral de cada mistura mostra um limite do estilo Michaelis- Menton para as interações totais. A Figura 18 mostra os dados típicos de resposta geral, para as misturas com componentes distribuídos aleatoriamente entre Oel 20 unidade em cada mistura.

Usando parâmetros farmacocinéticos gerados aleatoriamente para estes ingredientes, esse exemplo também ilustra a importância das propriedades do tipo droga na determinação do perfil terapeuticamente do ingrediente relevante. TABELA 8

Resposta In vitro para Componentes no Sistema

No. Atividade No. Atividade No. Atividade No. Atividade No. Atividade 1 3 . 34 χ 10”1 11 1. 36χ 10~2 21 9. 68 χ IO"3 31 1. 05χIO"2 41 7 . 58xIO"3 2 9. IlxlO-3 12 6.19χ 10‘3 22 9. 43χ10“3 32 2 .51x1o"1 42 7 . 37 x IO"3 3 6.71x1o'1 13 2.88xl0'2 23 6 . 84 x 10”1 33 4 . 55χ10_1 43 9.08χ IO"3 4 6. 40χ10'3 14 2 . 57x IO'1 24 4 . 63xIO"3 34 5. 88 xlO"3 44 1. 03χ 10“2 6.15χ10-1 15 5. 81xl0~3 25 6 .14 x IO"3 35 2. 05χ IO"2 45 5 . 56χ IO"3 6 5. 48*10"3 16 8 .7 5xl0_1 26 3.48xl0"3 36 1.34xlO"2 46 6.03χ10"3 7 6 . 62 x IO-3 17 1. 90χ10'2 27 3. 85χ IO"3 37 2 . 58x IO"2 47 1. 61χ10~2 8 2 . 08x IO-2 18 CN 28 7 .18x IO"3 38 6. 80χ IO"3 48 1.18χ10"2 O i---I X CT O CN 9 1.41xl0-2 19 7 . 43xl0'3 29 5. 03χ IO"3 39 1. 43χIO"2 49 1. 83χIO"2 4 .53χ10"3 20 5.81 x IO'1 30 3.71xl0_1 40 2 . 25x1o-1 50 10.OxlO"1 Com 150 misturas e respostas gerais do ponto da

dose 1.0 (Figura 18) e assumindo uma reposta linear de cada uma das respostas estimadas dos 50 componentes (x com ±1 barras de erro de desvio padrão). Estes comparam geralmente com as respostas atuais (o), mas algumas grandes diferenças estão presentes (Figura 19).

Usando a abordagem descrita no Exemplo 3, as 10 correlações entre o residual e cada um dos termos dos pares multiplicativos são plotadas. Correlações maiores estão mais escuras, particularmente surpreendente é o par (20,50), um dos pares de interação nas atividades de entrada (Figura 20).

Adicionando quatro termos de pares como

pseudocomponentes, 51 até 54 resultam em uma nova e melhorada estimativa. Particularmente, nota-se que 51 e 54 estão ativos, enquanto 52 e 53 não estão. Geralmente o componente pode ser classificado como ativo ou inativo (Figura 21) .

Repetindo os mesmos sistemas, mas agora usando dados de três pontos de doses (1.0, 0.3, e 0.1), se dá um ajuste mais preciso e mais apertado na primeira estimativa (Figura 22). A plotagem da correlação residual parece muito similar ao caso do ponto da dose única e é omitida para brevidade. A utilização dos mesmos quatro pseudocomponentes resulta nem uma segunda estimativa, com um ajuste melhor do que no caso do ponto da dose única. Observações similares são vistas com os quatro pseudocomponentes. Os componentes 51 e 54 estão mostrados para interagirem e 52 e 53 foram encontrados como sendo inativos (Figura 23) . Esse exemplo mostra claramente que a atividade dos componentes individuais e suas interações podem ser previstas precisamente usando a abordagem descrita nesta invenção.

Na segunda parte deste estudo, foi usado um sistema farmacocinético de dois compartimentos com cinética de primeira ordem para a simulação. 0 primeiro compartimento é intestinal com um volume de 0.4 para todos os cinqüenta componentes. Do compartimento intestinal, há uma eliminação direta do primeiro compartimento e absorção dentro de um segundo compartimento com clearances diferentes para cada componente. 0 segundo compartimento representa o corpo, para o qual cada componente possui um volume diferente e clearance do sistema. Todos estes estão listados na Tabela 9, ao longo com meias-vidas r área sob as curvas da quantidade de tempo no compartimento do corpo. Os volumes e constantes da taxa foram gerados com valores pseudo-aleatórios distribuídos uniformemente sobre os intervalos apropriados e todos os outros números foram calculados a partir destes.

TABELA 9

Intestinal Clearances

Compartimento do corpo I 2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

68/91

Eliminação Absorção Volume Clearance Meia-vida AUC 8 . 3* 10~2 4 8 χ IO'4 137 8 .10 11.7 0.39 7. 6χ10“2 1 3χ IO'3 97 5.71 11.7 1.15 8 . 2χIO"2 6 3χ IO'4 130 4.79 18. 9 0.82 7 . 7 χIO"2 5 IxlO'4 134 6. 33 14 . 6 0.55 7 . 6χ10"2 4 9x IO'4 104 2 . 60 27 . 7 1.01 7 . 6χ IO"2 3 6x IO'4 110 5 . 56 13.8 0.37 7 . 5χ10"2 2 6χ IO"4 149 13.84 7 . 4 0.15 8 . 6χ IO"2 3 8 χ IO"3 132 8 . 69 10.5 2.54 8 . 4χ10“2 1 9χ IO"3 141 10. 63 9.2 1.19 8 . 4 χ IO'2 1 3χ IO'3 84 0.52 112.2 10.06 8 . 3χ10'2 7 8χ10'4 77 2.39 22.2 1.19 7 . 4χ10"2 3 3x IO'3 87 6.10 9.9 2.45 7 . 3χ IO"2 4 OxlO'4 118 2 . 84 28.8 0. 90 7. 9χ10"2 2 2χ IO'4 59 0 . 67 61.3 1.00 8 . 3χIO'2 1 O 110 7 .13 10. 7 0.75 X O 8 . 7χ10"2 3 7 χ IO'4 120 8.26 10.0 0.24 7 . 4χ10'2 4 4 xlO'4 83 7 . 01 8.2 0.28 7 . 8χ10"2 3 O 45 3.44 9.1 0.20 \---l X O 8 .IxlO'2 3 5χ IO'3 88 5.09 11.9 2 . 84 8 . 6χ IO"2 1 4 χ IO'3 131 7.72 11.8 1. 07 7 . 5χIO"2 5 8 χ IO'4 70 1. 80 27 .1 1.20 7 . 9χ IO"2 1 8χ IO'3 85 1.86 31.8 4 .08 8. 4xlO'2 2 IxlO'4 115 7 . 28 11.0 0.16 8 . 4χ10'2 2 O 124 2 . 87 30.0 0. 60 \---\ X <T\ 8 . IxlO'2 2 6χ IO'4 91 7 . 06 8.9 0.16 7 . 8χ IO'2 2 OxlO'3 125 9.49 9.1 1.32 8 . 8χ IO'2 1 2χ IO'3 67 3.15 14 . 8 1.20 8. 3χIO"2 2 IxlO'4 130 1. 96 45.8 0. 67 8 . OxlO'2 3 4 χ IO"4 61 2 . 43 17 . 4 0.42 8 . OxlO"2 8 3x IO'4 133 6.54 14 .1 0.84 8 . 7χ10'2 1 9x IO"3 62 1.35 32.0 3.89 7 . 5χ IO'2 1 3χ10"3 37 0.77 33.0 3.33 7 . 5χ IO"2 3 5χ10’3 122 2.41 35.2 8 . 99 7 . 9χ IO'2 1 2χ10'3 134 9. 91 9.4 0.80 8 . 4χ10'2 1 OxlO"3 56 1. 75 22.3 1.51 8 . 4χ10'2 3 2χ10"4 78 5. 67 9.5 0.21 8 . 8χ10"2 2 9χ IO'4 129 5 . 69 15.7 0.30 7 . 5χ10"2 7 5χ IO"4 133 6.75 13. 6 0.77 39 7 9*10~2 1 IxlO-3 43 1 15 25 9 2.13 40 7 5χ10“2 3 7 χ IO"3 129 10 22 8 8 2.35 41 7 6χ10“2 1 5χ10"3 118 8 79 9 3 1. 04 42 8 3χ IO"2 9 OxlO"4 73 2 40 21 0 1.30 43 7 9χ10'2 1 4 χ IO'3 38 0 32 82 1 8.51 44 7 7 χ IO"2 2 2χ10"4 114 3 16 24 9 0.42 45 7 5 χ IO-2 3 5χ IO"4 82 4 79 11 9 0.32 46 8 IxlO'2 9 4 χ IO"4 41 0 23 124 3 8.23 47 7 6xl0“2 3 2χ IO"4 93 2 83 22 8 0.55 48 8 4xl0“2 2 7 χ IO'4 59 3 95 10 3 0.19 49 8 7 χ IO-2 3 8 xlO'3 55 3 94 9 7 2.33 50 7 5χ10'2 8 4 χ 10“4 109 7 87 9 6 0. 61 Usando os dados farmacocinéticos gerados e uma dose oral de 4 unidades para cada um dos 50 componentes (Tabela 9), uma familia de curvas de tempo de concentração é produzida (Figura 24).

A área Sob Curva (AUC) para a concentração nas

curvas do tempo é um indicador da exposição, um resultado líquido da absorção e eliminação. Estes dados foram fornecidos na Tabela 9. 0 que surpreende é que a faixa dos valores AUC podem transpor até 2 ordens de magnitude (Figura 25) .

Tomando os valores AUC sendo a exposição do corpo para cada composto, o mesmo conjunto de 150 misturas pode ser escalonado pela AUC de cada composto. Isso corresponde à diferença entre os experimentos in 15 vitro e in vivo quando a atividade do composto é modulada pelas propriedades farmacocinéticas variadas. 0 caso anterior é idêntico aquele no qual todo componente possui as mesmas propriedades. Observe que o era um componente ativo moderadamente no sistema anterior é agora de forma 20 preponderante o mais ativo devido às propriedades farmacocinéticas favoráveis. Com menos atividades permanecendo no sistema, as estimativas usando as mesmas três doses são muito boas (Figura 26). Os residuais, depois da incorporação dos parâmetros farmacocinéticos, variam dramaticamente das plotagens anteriores (Figura 27 versus Figura 20). A escuridão em cada uma destas plotagens é escalonada para 5 os pontos mais correlatados na plotagem, desta forma a aparência dos pontos individuais somente pode ser comparada dentro de cada uma destas figuras e não entre elas. As correlações mais fortes são, na verdade, mais fracas nesta plotagem do que na anterior.

Uma segunda estimativa com quatro

pseudocomponentes adicionados a estes não é muito diferente da primeira estimativa, e os pseudocomponentes possuem respostas muito pequenas conforme a composição destes não está significativamente presente (Figura 28).

Um segundo sistema farmacocinético, com um

conjunto diferente dos parâmetros farmacocinéticos, foi considerado, mas escolhido das mesmas faixas de valores. Os resultados deste sistema estão mostrados na Tabela 10.

TABELA. 10

Intestinal Clearances Compartimento do corpos AUC Eliminação Absorção Volume Clearance Meia -vida 1 8 3χ IO"2 2. OxlO"3 41 3. 47 8 . 2 1.14 2 8 2 χ IO"2 2. 2χ IO"4 110 7 . 44 10 . 2 0.16 3 8 3χ IO"2 6. IxlO"4 38 0. 52 51 . 3 2.16 4 7 9χ IO"2 8. 8χ IO'4 148 8. 12 12 . 6 0.81 8 2χ IO"2 2 9χ IO"3 42 2. 39 12 .2 2 .40 6 8 OxlO"2 1. 9χ IO"3 116 5. 91 13 . 7 1.83 7 8 5χ10"2 8. 2 χ IO"4 147 13. 33 7 . 6 0.42 8 8 3χ IO"2 3. OxlO"4 86 2. 81 21 .2 0.45 9 8 3χ IO"2 2. 5χ IO"4 145 4 . 59 21 . 9 0.37 8 3χ IO"2 2. 8 χ IO"4 55 4 . 61 8 .3 0.16 11 8 6χ IO"2 1. 8χ10"3 129 4 . 76 18 .8 2.22 12 8 3χ IO"2 2 . 2χ 10“3 133 5. 46 16 . 8 2.51 13 8 . 6χ IO"2 2 6x IO"3 91 3. 27 19 .3 3.27 14 7 . 6χIO"2 2 6χ IO"4 69 4 . 42 10 . 9 0.21 “ 16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

71/91

8 . OxlO-2 3. 4 χ IO'4 49 0.46 74 . 2 1. 82 7 . 6χ IO-2 7 . 3χ10-4 83 7.36 7 . 9 0.43 8 . 6χIO-2 2 . 4 xlO-3 119 9. 07 9.1 1. 45 8 . 7χIO"2 3. 5 χ IO'3 139 1.03 93.4 20. 97 8.3χ10-2 1. 3χ10'3 137 4 . 75 20.0 1. 77 8 . 2χ IO-2 3. 2 χ IO'3 118 2 . 37 34 . 5 7.41 7 .2xlO-2 3. 9χ IO-3 131 10.39 8.7 2.60 CN 2. 9x IO'4 146 2.09 48 . 5 0. 98 O «-Η X 00 00 7 . 7χ IO-2 2. 3χ IO'3 93 1. 68 38 . 3 6. 50 8 . IxlO-2 3. OxlO'4 109 3. 68 20.5 0.44 8 . 5χIO"2 5. 6χ IO'4 128 6.77 13.1 0.50 7 . 7χ10"2 6. 8χ IO'4 96 7 .54 8 . 8 0.45 7 . 6χIO-2 7 . 4 xlO-4 61 5.35 7 . 9 0.44 8 . 7χ10-2 2. 2 χ IO-3 44 1. 66 18 . 5 2 . 64 8 . IxlO-2 6. IxlO'4 77 2 .15 24 . 9 1.09 8 .OxlO-2 3. 9χ IO"4 101 2.74 25.5 0.72 8 . 2χ10-2 3. 2 χ IO-4 52 3.56 10.2 0.23 7 . 8χ10-2 1. OxlO-3 71 5.28 9.4 0.71 8 . 6χ IO"2 1 4 χ IO-3 108 7 .74 9.7 0. 91 7 . 7χ10"2 1. IxlO-3 47 2. 92 11.1 0. 94 7 . 8χ10-2 3. 5χ IO-4 141 9. 72 10.1 0.26 7 . 9χIO"2 9. 9χ IO-4 106 5.86 12. 6 0. 90 7 . 2χ IO-2 1. 5χ IO-3 120 6.59 12.7 1.49 8 . OxlO"2 5. IxlO"4 80 5 . 37 10.3 0. 37 8 . 7χ IO-2 3. 4 χ IO'4 37 3.12 8.1 0.18 7 . 9χ IO"2 4 8χ10-4 70 6.25 7 . 7 0.27 8 . 5χ IO"2 2 O 76 5.11 10.3 1.37 X I-1 O I OJ 8 . 2χ IO"2 2. 3x 10'3 107 2 . 65 28 . 0 4.49 7 . 4χ10-2 2. 5χ10'4 50 1.83 18 . 9 0.38 7 . 7xlO-2 2 7χ10-3 149 9.33 11.1 2 .14 8 . 4 χ IO'2 3. 4 χ IO-3 47 1.08 30.2 6.86 7 . 9χ IO-2 7 9χ IO'4 67 5.74 8.1 0.46 8 . OxlO-2 3 5χ IO'4 54 3.91 9.6 0.24 7. 4 xlO-2 3. IxlO'4 87 2.36 25. 6 0. 63 8 . 3χ10"2 4 5χ IO'4 88 4.86 12 . 5 0.39 7 . 6χIO"2 2 OxlO'4 115 6. 91 11.5 0 .18 O segundo conjunto de parâmetros

éticos fornece as curvas do tempo de concentração, conforme mostrado na Figura 29. As AUCs correspondentes às concentrações na plotagem anterior são mostradas na Figura 30. A primeira estimativa agora revela dois componentes importantes e dois moderados 5 (Figura 31) . Novamente, a adição de quatro pseudocomponentes possue um pequeno efeito no sistema, conforme os termos sinergéticos são amplamente suprimidos devido à exposição de sobreposição insignificante dos componentes de interação (Figura 32).

Nestes três exemplos, a resposta devida a cada

componente e pseudocomponente é recuperada do conhecimento das composições da mistura, da curva de resposta geral da dose e de um conjunto de dados da resposta geral da mistura da dose. Enquanto estes valores 15 forem conhecidos antecipadamente nestas simulações, a geração das estimativas de outros dados sugere que as estimativas razoáveis desses valores poderiam ser obtidas dos dados experimentais, para os quais as estimativas da atividade não estão disponíveis. As fortes diferenças 20 entre os três casos servem para enfatizar as diferenças entre as atividades in vivo e in vitro.

Esses exemplos também ilustram um aspecto importante da potencial interação. A interação In vitro nem semper implica que haverá interação in vivo. Neste 25 exemplo, os componentes 51 e 54 são pares interativos in vitro, mas as interações não ocorrem in vivo. Portanto, é importante levar em conta as diferenças farmacocinéticas, quando as potenciais interações forem descobertas in vitro. Se a sobreposição do perfil de concentração entre 30 as espécies de interação for insignificante, significando que as características da farmacocinética desses potenciais componentes de interação forem muito diferentes, a probabilidade de interação é provavelmente mínima .

EXEMPLO 10 Aplicações desta Invenção

0 objetivo deste exemplo é ilustrar alguns dos 5 usos desta invenção. É comum que ingredientes podem ter múltiplas atividades envolvendo um número de processos bioquímicos. Dependendo das condições, uma quantidade de métodos de teste de atividade pode ser empregada antes da resposta do melhor compósito seja decidida. Por outro 10 lado, esta invenção pode ser usada para estimar a eficácia e toxicidade, quando modelos in vitro estiverem disponíveis. Ambos componentes ativos e tóxicos podem ser identificados. Com esta informação, um perfil de um ótimo ingrediente pode ser projetado.

Depois que o perfil ótimo do ingrediente ser

obtido, as quantidades desejadas destes ingredientes podem ser obtidas usando uma ou outra combinação das seguintes formas: a) misturar lotes apropriados de materiais brutos; b) desenvolver um método customizado 20 para extrair os ingredientes de interesse; c) projetar condições de crescimento para resultar em ingredientes desejados; d) desenvolver um grupo de condições de crescimento sob meios controlados como aqueles da casa verde; e) modificar geneticamente uma espécie para 25 produzir os ingredientes desejados; e f) purificar as substâncias de interesse e misturá-las de acordo com a lista de ingredientes.

Para o projeto do produto, uma formulação pode ser preparada para entregar estas substâncias em uma ótima maneira de tal forma, que a ótima resposta seja alcançada.

Projetos de produtos usando esta abordagem terão todos os ingredientes ativos identificados; seus componentes de interação revelados e a qualidade do produto terão qualidade equivalente a um único componente farmacêutico, exceto que este contenha componentes múltiplos.

A vantagem de desenvolver produtos desta

maneira é que os valores terapêuticos das substâncias naturais são conhecidos antes do tempo e as potenciais toxicidades também podem ser identificadas antes do tempo.

Este tipo de produto pode facilmente ser

adaptado a um programa de desenvolvimento de droga, para que esse possa ser tratado como um que conduz para ser movido para frente para os testes pré-clínicos e clínicos. A mesma abordagem, como aquela esboçada nos 15 exemplos 1 a 8, pode ser usada para examinar a fonte de toxicidade e também os componentes que são responsáveis para o rebaixamento da toxicidade.

EXEMPLO 11

Desenvolvimento do Red Clover para o Tratamento da

2 0 Osteoporose

O objetivo deste exemplo é empregar esta invenção para desenvolver uma erva popular para o tratamento osteoporose pós-menopausa. Como a maioria das ervas bem estudadas no mercado, a eficiência clínica da 25 Red clover (Trifolium pratense) está na melhor hipótese equivocada (Beck e outros, 2005; Wuttke e outros, 2007). A Tabela 11 mostra que a dosagem total dos fitoestrogêneos é aproximadamente a mesma entre os produtos comerciais (Beck e outros, 2003). Contudo, a 30 quantidade de componentes individuais pode variar entre 2 a 12 vezes. Não há surpresa que a performance destes produtos não é consistente. Existem quantidades de minuto de outros fitoestrogêneos, tais como coumestans (coumestrol) e sua contribuição para a eficácia geral da erva não é conhecida. Interessantemente, os principais components ativos, genisteina e daidzeina, estão presentes em quantidades de minuto na Red clover; contudo, seus precursores, biochanin A e formononetin e seus glicosídeos estão presentes em quantidades muito maiores. As perguntas são: I) Como estes ingredientes trabalham juntos? 2) Onde ocorrem as conversões metabólicas? 3) Há alguma interação entre os componentes ambos farmacocineticamente e farmacodinamicamente? 4) Há outros metabólitos que provavelmente contribuiriam para a eficácia geral da Red clover? 5) Qual é o melhor perfil dos ingredientes que podem ser estimados usando a presente invenção? 6) Há outras formas para melhorar a performance da Red clover? TABELA 11 Composição do Fitoestrogênio em Produtos Comerciais Diferentes

Nome

Promensil

Rimostil

Trinovin

Rotklee Activ

tablets

Red clover tablets Red clover Isoflavones Boots Menoflavon

Dosagem diária (total de isoflavones, mg)

40

57 40 N. D.

N.D.

40

40

40-80

Biochanin A % peso

4 .13 2.28 4.35 2.37

2.39

4.6

4.62

1.97

Formononetin % peso

2.6

20.65

2.5 4 . 8

4.64

2.5 2 .67 5.46

Genistein % peso

0 .17 0.03 0 .16 0 .17

0 .36 0 .13 0 .16 0 .11

Daidzein % peso

0.1 0 .11 0 .1 0.36

0.82 0 .13 0 .15 0.43 Há muitos estudos realizados sobre a Red clover e soja que contém alto conteúdo de fitoestrogênios. 0 componente unico que recebeu a maior atenção é o genistein. Foi demonstrado que o genistein, 54 mg/dia, 5 administrado oralmente por um ano, é tão efetivo como a terapia de substituição do hormônio (Morabito e outros, 2002). Contudo, não é conhecido porque não há mais estudos confirmatórios publicados.

Estudos de permeabilidade In vitro em cinco fitoestrogênios, genistein, daidzein, glycitein,

formononetin, biochanin A e prumetin foram realizados usando monocamadas da célula Caco-2 ou lisados de célula Caco-2 (Chen e outros, 2005a). Foi descoberto que estes compostos são rapidamente transportados e metabolizados. 15 Contudo, não há informações relacionadas às suas interações potenciais entre estas espécies. Parâmetros de Michaelis-Menten para as conjugações glucuronido e sulfato para estas cinco espécies foram medidos.

Na Red clover, os fitoestrogênios mais abundantes são formononetin, biochanin A e os glicosédeos destes fitoestrogênios (Figura 33). Os components mais ativos são genistein e daidzein, os metabólitos do formononetin e biochanin A, respectivamente (Beck e outros, 2003). A conversão do formononetin e biochanin A para daidzein e genistein, respectivamente, ocorre no cólon via flora intestinal (Bowey e outros, 2003). Também é descoberto que um metabólito do daidzein, equol, formados na microflora do cólon, é a mais potente (Bowey e outros, 2003; Setchell e outros, 2005). Genistein e daidzein estão presentes nas quantidades minutos nos extratos da Red clover; geralmente é de menos de 10% (Tabela 11).

0 metabolismo dos glicosédeos da genistein e daidzein foi medido usando tecidos do fígado e intestino humano (Day e outros, 1998). A taxa do metabolismo destes dois precursores do genistein e daidzein foi medida individualmente.

0 metabolismo de primeira passagem e ciclos

entero-hepáticos do genistein, daidzein, formononetin, biochanin A e prunetin foram avaliados usando um modelo de intestino de rato perfundido e microssomas preparados do fígado de rato, duodeno, jejuno, íleo e cólon (Chen e 10 outros, 2005b). A taxa do metabolismo e absorção ao longo do intestino foi elucidada. Além disso, a significância do metabolismo do fígado e dos ciclos entero-hepáticos também foi relatada. Novamente, não houve a tentativa de estudar uma mistura.

Estudos farmacocinéticas da biochanin A foram

realizados nos ratos (Moon e outros, 2006) e Red clover nos humanos (Howes e outros, 2002) . Fitoestrogênios do plasma e seus metabólitos foram relatados. Embora estes dados sejam importantes, não há estimativa da 20 concentração livre nas porções ativas no plasma; desta forma, a concentração das porções ativas no local da ação. É difícil deduzir se há qualquer interação significante entre estas espécies.

As principais isoflavonas de soja são 25 genistein, daidzein e glycitein (Ewies, 2002). Desde que a Red clover possua um conteúdo maior de fitoestrogênio, esse possui um potencial melhor para tratar doenças relacionadas à menopausa (Beck e outros, 2005). Diferente do estradiol, o fitoestrogênio mostra uma afinidade de 30 ligação maior em direção ao Receptor beta de Estrogênio (ERB) do que Receptor alfa de Estrogênio (ERa) e correguladores do recrutamento necessários para transcrição dos genes alvos seletivamente para ERB (Kuiper e outros, 1998). A afinidade diferencial para estes receptores, que são especificos dos tecidos, podem explicar a especificidade destes fitoestrogênios (Enmark e outros, 1997; Kuiper e outros, 1997; Onoe e outros, 1997; Wiik e outros, 2003) . A afinidade para ERB pode explicar o efeito benéfico do fitoestrogênio para osteoporose na menopausa e falta da toxicidade carcinogênica no seio e em outros órgãos. Foi descoberto que Genistein possui a maior afinidade para ERB. Esta é a razão porque este composto é o mais estudado e também o composto que é empregado em um teste clinico (Morabito e outros, 2002). Estudos recentes mostraram que daidzein é mais potente na formação do osteoblasto in vitro (Li e outros, 2005; Ge e outros, 2006) do que o genistein. Estes resultados recentes mostram claramente que mais de um componente na Red clover são responsáveis pelos seus efeitos estrogênicos. Uma abordagem inovadora é necessária para identificar os ingredients ativos ao invés de estudá-los individualmente.

Apesar do conteúdo maior do fitoestrogênio na Red clover, a proporção de genistein e daidzein é superior na soja. 0 motivo porque a Red clover é preferida, explica-se por haver um conteúdo muito maior de precursores de genistein e daidzein, biochanin A e formononetin, respectivamente. A Biodisponibilidade das agliconas de genistein e daidzein é de menos que 5%; isto é principalmente devido ao metabolismo do fígado e/ou alto primeiro passo. Presumidamente, a aglicona liberada no cólon pelas enzimas da flora intestinal melhoraria a biodisponibilidade das agliconas porque a absorção do cólon pode ultrapassar parcialmente o metabolismo de primeiro passo (Setchell e outros, 2001).

A conversão destes precursores para suas respectivas agliconas é dependente no metabolismo pela flora intestinal. A variabilidade no conteúdo da flora intestinal é alta entre indivíduos; há uma hipótese de que a conversão da biochanin A e formononetin para suas respectivas agliconas é altamente inconsistente. Esta variabilidade poderia ter contribuição significante para os resultados instáveis observados clinicamente.

A importância da flora intestinal no metabolismo do fitoestrogênio e biodisponibilidade foi demonstrada recentemente (Ohta e outros, 2002; Nielsen e Williamson, 2007). A flora intestinal imatura tem demonstrado que afeta a biodisponibilidade das isoflavonas na soja (Nielsen e Williamson, 2007). Os frutooligossacarideos (FOS) estimulam o crescimento da bifidobacteria, que decompõe a isoflavona conjugada para resultar nas agliconas e metabólitos correspondentes (Ohta e outros, 2002) . Este estudo mostrou que a biodisponibilidade das isoflavonas foi aumentada e ocorreu devido a um aumento da atividade na β- glucosidase, que é responsável pelo metabolismo dos glicosídeos das isoflavonas para suas respectivas agliconas, que são prontamente absorvidas. Há uma hipótese de que a flora intestinal saudável não irá somente promover isoflavona na absorção da Red clover, mas também reduzirá a flutuação inter-subjetiva dos níveis de sangue da isoflavona. Para otimizar a função da Red clover, um prebiótico deve ser incluído.

O corpo das informações na literatura pode ser usado para validar parte da presente invenção. Isto irá proporcionar suporte à precisão da estimativa ótima do perfil do ingrediente obtida da presente invenção.

Dos estudos publicados, está claro que as ferramentas in vitro usadas são similares a aquelas propostas nesta invenção. 0 que é necessário é repetir os mesmos estudos usando um grupo de extratos da Red clover, que contenham uma composição diversa do fitoestrógeno individual. Os resultados destes estudos fornecerão 5 informações metabólicas e perfis de atividade dos componentes individuais e suas potenciais interações.

0 metabolismo pela flora intestinal parece ser o fator mais importante na determinação da atividade clínica da Red clover. Desta forma, os prebióticos, tais 10 como oligosacarídeos e β-glucano, e os probióticos serão importantes no melhoramento da consistência da produção da porção ativa.

Usando o conceito da presente invenção, é altamente provável obter um ótimo perfil do ingrediente para Red clover, para o tratamento da osteoporose. É previsto que a formononetin, biochanin A e seus glicosídeos são o alvo para padronização. Também é previsto que a quantidade total de formononetin (aglicona + glicosídeos) seja maior do que o total de biochanin A (aglicona + glicosídeos). A incorporação de um prebiótico ou probiótico, para promover o crescimento benéfico da flora intestinal, é necessária para aumentar a atividade deste novo extrato da Red clover. A dosagem diária deste novo produto Red clover será entre 50 a 100 mg do total de fitoestrógeno por dia.

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simulação.

Claims (15)

1."Uma tecnologia de plataforma farmacêutica para o desenvolvimento de produtos naturais" caracterizada por um método de predizer a farmacocinética e a farmacodinâmica in vivo de uma mistura com múltiplos componentes, compreendendo os passos de: a) Determinar a taxa de metabolismo do indivíduo e componentes de interação na mistura no trato gastrointestinal e fígado; b) determinar distribuições dos componentes no sangue ou plasma; c) determinar a taxa de eliminação renal do componente; e d) determinar a potência de um componente individual e sinergismo ou inibição entre os componentes, onde as determinações acima compreendem modelos matemáticos que irão predizer as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas da mistura in vivo.

2.0 método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ainda compreender os passos de determinar parâmetros para metabólitos ativos dos componentes de acordo com os passos (a) através (d) , onde os resultados dos modelos matemáticos irão predizer as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas da mistura e seus metabólitos in vivo.

3.0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, caracterizado por onde as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas compreendem perfis do tempo de concentração e perfis do tempo de resposta para os componentes e seus metabólitos.

4.0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado por onde os modelos matemáticos são capazes de resolver múltiplos desconhecidos que são linearmente independentes ou interagem entre si.

5.0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado por onde os modelos matemáticos compreendem <formula>formula see original document page 94</formula>, onde r é a resposta linearizada, ré a resposta média linearizada; wi é o peso do componente i (relacionado à potência), dj é a dose do componente i e dt e dj são doses médias do componente ith e jth, Wij é o peso do par de interação.

6.0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado por onde os modelos matemáticos compreendem <formula>formula see original document page 94</formula>, onde a0 e at são as atividades de linha de base e coeficiente da atividade do componente i respectivamente, Xi e Xj são componentes i e j respectivamente, fiiJ é o coeficiente da atividade do par de interações, Xi e Xj , onde a equação mencionada é capaz de predizer uma composição otimizada da mistura para alcançar a potência máxima possível.

7.0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado por onde a taxa de metabolismo compreende a taxa de degradação e a taxa de absorção.

8. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado por onde a determinação da taxa de metabolismo no trato gastrointestinal compreende ensaios usando suco intestinal ou gástrico artificial, flora intestinal, microssomos intestinais, ou estudos de permeabilidade, usando culturas de células ou tecidos intestinais.

9. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado por onde a determinação da taxa de metabolismo no fígado compreende ensaios, usando hepatócitos recém coletados, hepatócitos criopreservados, microssomas hepáticos, citosol hepática ou frações S-9.

10. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado por onde a determinação da distribuição no sangue ou plasma compreendem a determinação da ligação para a proteína do plasma, ligando à proteína do sangue, pKa, Iog P, Iog D, e volume da distribuição de um componente.

11. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado por onde a determinação da eliminação renal baseia-se na estrutura química dos componentes.

12. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado por onde a determinação da potência compreende ensaio da ligação do receptor, ensaio enzimático, ensaio da resposta bioquímica, e ensaios com órgãos ou tecidos isolados.

13. "Uma tecnologia de plataforma farmacêutica para o desenvolvimento de produtos naturais" caracterizado por onde uma composição compreendendo múltiplos componentes, conforme identificados por qualquer um dos métodos de acordo com as reivindicações 1-12, onde os componentes possuem propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas in vivo desejáveis, conforme determinadas por qualquer um dos métodos de acordo com as reivindicações 1-12.

14. A composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por compreender Red clover (Trifolium pratense).

15. A composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por onde a Red clover compreende formononetin, biochanin A e seus glicosídeos em quantidades determinadas por qualquer um dos métodos de acordo com as reivindicações 1-12.