BRPI0718010A2 - Uso da timosina alfa 1 para preparação de um medicamento para a prevenção e tratamento de doenças autoimunes. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DA Tl- MOSINA ALFA 1 PARA PREPARAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA A PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE DOENÇAS AUTOIMUNES".

A presente invenção refere-se ao uso da timosina alfa 1 para preparação de um medicamento para a prevenção e tratamento de doenças autoimunes. Em particular, a invenção refere-se ao uso da timosina alfa 1 para preparação de um medicamento para a prevenção e tratamento de do- enças autoimunes, tais como a esclerose múltipla (EM) e de doenças infla- matórias intestinais, tais como a doença de Crohn ou a colite ulcerativa. A luta contra as doenças neurológicas de base inflamatória é um

dos principais objetivos científicos, sociais e econômicos em nível mundial. Nos últimos anos, veio à tona que em um número considerável de patologias do sistema nervoso central (SNC), tais como a EM, a encefalomielite e ence- falite infecciosa e pós-infecciosa, as complicações neurológicas de doenças autoimunes, a encefalite de Rasmussen, a isquemia e o dano cerebral trau- mático se devem a um processo inflamatório intimamente associado aos danos neuronais e axônicos. A neurodegeneração é a principal causa de deficiências neurológicas permanentes. As doenças neuroinflamatórias en- volvem um alto custo econômico para a sociedade, uma vez que estão as- sociadas a graves deficiências, tais como deficiências sensoriomotoras, pio- ra das funções cognitivas, incontinência e problemas de comportamento. A esclerose múltipla (EM) é a principal causa de deficiência neurológica em adultos jovens no mundo ocidental. Ela é uma doença inflamatória crônica do SNC com uma etiologia desconhecida que tem fatores subjacentes tanto de natureza genética quanto de natureza ambiental. Como já mencionado, ela é a principal causa de deficiência neurológica em adultos jovens no mundo ocidental, sendo as maiores taxas encontradas na Europa central e setentrional (> 30 casos para cada 100.000 habitantes). Na maioria dos pa- cientes, a doença surge com episódios de disfunção neurológica seguidos de remissão parcial ou completa (EM remitente-recorrente) e então apresen- ta posteriormente uma tendência progressiva com maior deficiência (EM progressiva secundária). Alguns pacientes apresentam imediatamente uma tendência progressiva (EM progressiva primária) enquanto uma tendência aguda da doença é mais rara. Patologicamente, a EM é caracterizada pela presença de dano na substância branca confirmado por ressonância magné- tica. Infiltrados inflamatórios, perda de mielina (a membrana rica em lipídios que recobre os axônios) e de oligodendrócitos (células produtoras de mieli- na), dano aos axônios e gliose reativa foram todos observados nas lesões ou placas. Recentemente, estudos neuropatológicos mais detalhados e a aplicação de técnicas de ressonância magnética mais avançadas mostraram a existência de danos inflamatórios mais extensos na substância branca e a presença de lesões na substância cinzenta do córtex cerebral associadas aos processos neurodegenerativos e que predominam nas formas progres- sivas da doença. Apesar do número considerável de estudos clínicos e ex- perimentais, os mecanismos imunopatológicos complexos subjacentes ao dano mielínico e neuronal ainda são em grande parte desconhecidos. As doenças autoimunes surgem quando o sistema imune, que normalmente defende o corpo de doenças e infecções, ataca a si mesmo, podendo atacar muitas partes do corpo, tais como os nervos ou os músculos, assim como causar morbidades significativas e crônicas, assim como invalidez. A maior parte do que se sabe sobre essa doença se origina do estudo da encefalite autoimune experimental (EAI), um modelo animal de desmielinização que imita o que ocorre no homem. Na prática, os animais são sensibilizados a certas proteínas da mielina de maneira a causar sintomas como os da escle- rose múltipla e as terapias experimentais são então testadas neles para ava- liar sua eficácia. A terapia celular usa um certo tipo de célula, especificamen- te células dendríticas, que - quando injetadas nos animais infectados por essas doenças - geram células T reguladoras (Tregs) responsáveis pela manutenção da tolerância imunológica. Estudos recentes mostraram que as células dendríticas causam o crescimento de novas células Treg nos animais tratados e que essas células neutralizam especificamente as células imunes que atacam a mielina que recobre os nervos. O tratamento foi eficaz também em células Treg geradas in vitro. Estudos recentes mostraram que a timosi- na alfa 1, um hormônio tímico já amplamente usado na técnica clínica para várias patologias (Goldstein, A. L. Badamchian M. Thymosins: chemistry and biological properties in health and disease. Expert Opin Biol Ther. 2004, 4: 559-73), pode induzir Tregs in vitro a uma ação seletiva sobre as células dendríticas (Romani L, Bistoni F, Petruccio K, Montagnoli C, Gaziano R, Bozza S, Bonifazi P, Bistoni G, Rasi G, Velardi A, Fallarino F, Garaei E, Puc- cetti P. Thymosin alpha 1 activates dentritic cell tryptophan catabolism and establishes a regulatory environment for balance of inflammation and tole- rance. Blood. 2006 Jun 1; [publicação eletrônica antes da publicação propri- amente dita]).

A doença inflamatória intestinal (DII) pode envolver tanto o intes-

tino delgado quanto o intestino grosso. A doença de Crohn e a colite ulcera- tiva são as formas de Dll mais conhecidas e ambas pertencem à categoria das doenças inflamatórias intestinais idiopáticas porque a sua etiologia é desconhecida. Os testes patológicos em geral não são específicos, mesmo que possam sugerir uma forma particular de Dll. A Dll "ativa" é caracterizada por inflamação aguda; a Dll "crônica" é caracterizada por alterações arquite- tônicas como distorções e estriamento das criptas intestinais. Em muitas formas de Dll, pode haver abscessos nas criptas (consistindo em neutrófilos ativados no lúmen das criptas). A colite ulcerativa é predominantemente um problema das mu-

cosas distais. O reto está praticamente sempre envolvido. A etiologia da coli- te ulcerativa é desconhecida. Ela é mais comum em caucasianos, mulheres e adultos jovens (o pico de incidência se dá em torno dos 20-25 anos de i- dade). Os resultados clínicos incluem diarréia, com ou sem tenesmo. Os pa- cientes que sofrem de colite ulcerativa prolongada apresentam grande risco de desenvolvimento de neoplasias malignas. Biópsia do cólon pode ser usa- da para confirmar displasia, uma alteração neoplástica da mucosa que signi- fica uma alta probabilidade de neoplasia maligna. Pacientes com colite ulce- rativa também apresentam risco de desenvolvimento de distúrbios hepáticos, incluindo colangite esclerosante e carcinoma dos dutos biliares.

A doença de Crohn pode afetar qualquer parte dos intestinos. Mais freqüentemente, porém, envolve as partes delgadas e distais. A infla- mação é em geral transmural e pode produzir algo semelhante a uma pe- quena úlcera acima do folículo linfático ou uma úlcera profunda na ferida transmural, assim como inflamação crônica. Um terço dos casos apresenta granulomatose em outras regiões além do cólon, tais como os Iinfonodos e o fígado. A inflamação transmural leva ao desenvolvimento de fístulas entre os intestinos e outras estruturas. A inflamação é em geral segmentar. A etiolo- gia é desconhecida, ainda que mecanismos infecciosos e imunológicos te- nham sido sugeridos. Há uma incidência bimodal e uma maior incidência em mulheres e em caucasianos. As manifestações clínicas podem variar e inclu- ir diarréia, febre e dor, assim como manifestações não ligadas aos intestinos devidas a artrite, uveíte, eritema nodoso e espondilite ancílosante.

Comparação da colite ulcerativa e doença de Crohn

Característica Colite ulcerativa Doença de Crohn Distribuição extensa, predominância distai predominância segmentar ou extensa, com freqüên- cia proximal Reto sempre envolvido com freqüência poupado Distribuição microscópica extensa com freqüência focai Extensão da inflamação mucosa transmural Características nos seios e fístula ausentes com freqüência presentes Constrição ausente com freqüência presente Granuloma ausente com freqüência presente

As causas infecciosas da Dll em geral têm um começo mais a-

gudo e duração mais curta. Os organismos bacterianos que podem causar Dll incluem Shigella, Salmonelle, Capylobacter e certo número de E. coli. As bactérias são uma causa comum da colite autolimitante, sem alterações crô- nicas. As etiologias virais incluem o vírus Norwalk e o rotavírus, assim como o citomegalovírus. Outras causas incluem infecção clamidial e amebíase. A Dll ligada ao uso de antibióticos pode ser secundária à terapia com antibióti- cos de amplo espectro que levam a crescimento excessivo da Clostridium difficile ou de outros organismos tais como o Candida albicans. A Dll pode também ser secundária à isquemia.

O tratamento farmacológico é o principal caminho para aliviar os sintomas tanto da colite ulcerativa quanto da doença de Crohn. Houve muito progresso no desenvolvimento de medicamentos para o tratamento da Dll. Eles incluem:

• Fármacos anti-inflamatórios usados para reduzir a inflamação causada pela doença.

• Agentes imunossupressores que impedem que o sistema imu- nológico ataque os tecidos do seu próprio corpo e cause, assim, o círculo vicioso de inflamação.b

Se uma pessoa com Dll não responde a esses medicamentos, então uma cirurgia é necessária. Contudo, os procedimentos cirúrgicos para a colite ulcerativa e para a doença de Crohn são muito diferentes. Na doen- ça de Crohn, o médico deve tentar tanto quanto possível evitar a cirurgia devido à natureza recorrente da doença. Ademais, considera-se que uma abordagem cirúrgica agressiva da doença de Crohn causa complicações adicionais, tais como a síndrome do intestino curto, que cria problemas de crescimento e diminuição da capacidade de absorver nutrientes. No que diz respeito à colite ulcerativa, a remoção do cólon (do intestino grosso) pode ser necessária, juntamente com o procedimento cirúrgico chamado anasto- mose ileoanal (também denominada recuperação do ileoanal), na qual o médico cria uma bolsa no intestino delgado para coletar as fezes na pelve. Isso permite que as fezes passem através do ânus.

Descobertas recentes indicam que a Dll pode ser resultado de uma desregulação imunológica envolvendo efetores inflamatórios e células reguladoras (Tregs). No que diz respeito a isso, em modelos experimentais da Dll, três cenários podem ser identificados que podem ser correlacionados com o resultado da Dll:

a. Respostas efetoras e reguladoras equilibradas = controle da inflamação e nenhum sinal de Dll.

b. Prevalência da resposta efetora sobre a resposta reguladora = inflamação e Dll.

c. Nenhuma regulação = inflamação descontrolada e Dll grave.

O número de produtos para o tratamento da Dll em estudo au- mentou de 3 produtos e 1 alvo em 1993 para 30 produtos e mais de 10 alvos em 2005. A colite devido ao TNBS (ver abaixo) serve como um modelo pré- clínico no teste de tratamentos inovadores da doença de Crohn. Esses tra- tamentos incluem: aplicação de ácido 5-aminossalicílico e antagonista de Ieucotrieno no cólon, tratamentos sistêmicos com derivados da prednisolona Iiberadores de oxido nítrico, antagonistas das quimiocinas e moléculas de antiaderência. Abordagens antiTNF promissoras, de um ponto de vista clíni- co, em subgrupos de pacientes com a doença de Crohn, também mostram efeitos benéficos na colite crônica por TNBS. O número de produtos em de- senvolvimento e em estudo em relação à patogênese da Dll enfatiza a ne- cessidade de aumentar o esforço no sentido de pesquisar a Dll clinicamente. Estudos recentes mostraram que a timosina alfa 1, um hormônio tímico já amplamente usado na técnica clínica para várias patologias, pode induzir Tregs in vitro à ação seletiva sobre as células dendríticas. Até o momento, as doenças autoimunes são tratadas com medi-

camentos imunossupressores ou anti-inflamatórias tais como corticosterói- des. Esses medicamentos, contudo, podem ter efeitos colaterais graves tais como imunossupressão e hiperglicemia.

Tudo isso considerado, existe, assim, uma necessidade evidente de novos fármacos para o tratamento e a prevenção de doenças autoimunes que não apresentem as desvantagens dos tratamentos conhecidos.

Os autores da presente invenção descobriram agora que a timo- sina alfa 1 é capaz de prevenir e tratar eficientemente doenças autoimunes sem causar efeitos tóxicos no corpo. A timosina alfa 1 (Ta1), um peptídeo tímico encontrado na natu-

reza, é bastante reconhecida no tratamento de certas infecções virais tanto como monoterapia quanto em associação com o IFN-α e como adjuvante imunológico (Goldstein A. et al., 2004 Expert Opin, Biol. Ther. 4:559-573). Outras indicações terapêuticas da timosina 1 alfa são conhecidas, tal como no tratamento da imunodeficiência, tumores e AIDS. Foi demonstrado recen- temente que a Τα1 modula o funcionamento das células dendríticas (CD) via TLR9, agindo assim como um regulador endógeno dos sistemas imunes ina- to e adaptativo (Romani L. et al., 2004, Blood 103:4232-4239).

A timosina alfa 1 também é conhecida como um modulador da resposta biológica no tratamento de certas infecções virais em combinação com o INF-α e como um adjuvante imunológico (Goldstein A. et al., 2004 Expert Opin, Biol. Ther. 4:559-573).

O objetivo específico da presente invenção é assim o uso da ti- mosina alfa 1 na preparação de um medicamento para a prevenção e o tra- tamento de doenças autoimunes, preferivelmente a esclerose múltipla e do- enças envolvendo inflamação das vísceras, tais como doenças inflamatórias intestinais, por exemplo, a colite ulcerativa e a doença de Crohn.

A presente invenção será agora descrita para fins ilustrativos, sem se limitar a esses exemplos, de acordo com suas modalidades preferi- das e com referência particular às figuras das gravuras anexas, nas quais:

a figura 1 mostra o escore clínico médio de camundongos (n = 5) com relação ao tempo (dias) no que diz respeito à imunização com o peptí- deo MOG;

a figura 2 mostra a análise histológica de cortes semifinos da medula espinhal coloridos com tetróxido de ósmio e destaca áreas de des- mielinização nos camundongos tratados com MOG, enquanto não existe sinal de desmielinização significativa nos camundongos tratados com timosi- na alfa 1. A seta preta indica a integridade da bainha de mielina;

a figura 3 mostra o efeito da timosina alfa 1 sobre a gravidade da colite induzida, medida em termos de EAD, EAM e MPO. Os resultados mos- tram uma redução drástica de todos os parâmetros associados e associáveis à presença de colite manifesta pela timosina alfa 1. Os camundongos de controle não receberam qualquer tratamento;

a figura 4 mostra a produção de citocinas de CD4+CD25+ isola- dos da lâmina dos animais de controle, com a colite (por TNBS) tratada com timosina alfa 1 (TNBS+Ta1). Exemplo 1: avaliação da eficácia da timosina alfa 1 na EAE

Para este fim, um modelo de EAE foi usado com o objetivo de induzir a doença mediante a administração de um peptídeo derivado da mie- Iina em animais suscetíveis. Os animais foram tratados com timosina alfa 1, cuja eficácia foi avaliada de acordo com parâmetros clínicos e histológicos. Metodologia Indução da EAE

A EAE foi induzida em camundongos C57BL6 mediante injeção

de 100 microlitros de emulsão contendo 100 microgramas de MOG35-55 (um fragmento de peptídeo de uma glicoproteína mielínica) em adjuvante completo de Freund (ACF, 4 microgramas/ml) na base da cauda. A indução da EAE é favorecida pela administração intraperitoneal da toxina pertóxica a uma dose de 200ng/camundongo no dia da imunização e três dias mais tar- de. O tratamento com timosina alfa 1 (200 ng/kg) é realizado através de inje- ção intraperitoneal de acordo com dois desenhos experimentais. No primeiro caso, a timosina é administrada começando no dia da administração do MOG e por três dias consecutivos a partir daí (Ta1 + MOG). No segundo caso, a timosina é administrada começando no décimo dia após a adminis- tração do MOG e por três dias consecutivos depois disso (MOG + Ta1). Avaliação da EAE

Os camundongos foram submetidos diariamente a avaliação clí- nica de acordo com os seguintes parâmetros: 0 - normal; 1 - cauda flácida ou fraqueza das patas traseiras; 2 - cauda flácida associada à fraqueza das patas traseiras; 3 - paralisia parcial das patas traseiras; 4 - paralisia total das patas traseiras; 5 - estado moribundo. A análise histológica das seções semifinas da medula espinhal foi realizada mediante coloração com tetróxido de ósmio. Resultados

Os resultados (figura 1) mostram que a timosina alfa 1 é capaz de reduzir significativamente tanto o registro quanto a incidência da EAE em camundongos tratados com MOG. O efeito é particularmente evidente quan- do a timosina é administrada tanto concomitantemente com sensibilização ao MOG quanto posteriormente.

A figura 2 mostra a análise histológica das seções semifinas da medula espinhal coloridas com tetróxido de ósmio e destaca áreas de des- mielinização nos camundongos tratados com MOG, enquanto nenhum sinal significativo de desmielinização foi encontrado nos camundongos tratados com timosina alfa 1. A seta preta indica a integridade da bainha de mielina. Esses resultados indicam que a timosina alfa 1 tem um efeito protetor sobre a incidência da EAE assim como sobre a sua gravidade neuropatológica. Exemplo 2: avaliação da eficácia da timosina alfa 1 em um modelo experi- mental de Dll (Fiorucci S1 Antonelli E, Distrutti E1 Del Soldato P, Flower RJ, Clark MJ, Morelli A, Peretti M, Ignarro LJ1 NCX-1015, um derivado de óxido nítrico da prednisolona, aumenta o regulador das células T na própria lâmina e protege contra a colite induzida por ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico em camundongos. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:15770-5).

Com este objetivo, um modelo de Dll foi usado visando a indu- ção da doença mediante administração intracolônica de um derivado hapte- nizado do ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS). Os animais foram tratados com timosina alfa 1, cuja eficácia foi avaliada de acordo com parâmetros clínicos, histológicos e imunológicos. Metodologia Modelos de colite

A aplicação do hapteno TNBS no cólon causa colite aguda e crônica em roedores (Fiorucci S, Antonelli E, Disrutti E, Del Soldato P, Flo- wer RJ, Clark MJ, Morelli A, Peretti M, Ignarro LJ1 NCX-1015, um derivado de óxido nítrico da prednisolona, aumenta o regulador das células T na pró- pria lâmina e protege contra a colite induzida por ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico em camundongos. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:15770-5). A inflamação da mucosa na colite por TNBS tem um infiltrado

neutrofílico, mas também inclui a afluência de macrófagos e monócitos as- sim como a ativação dos linfócitos T (Th1). As características histopatológi- cas são similares às da doença de Crohn no homem, à inflamação transmu- ral, ao granuloma e às lesões do tipo fragmentadas (áreas de ulceração se- paradas por áreas de mucosa normal) (Morris GP, Beck PL, Herridge MS, Depew WT, Szewezuk MR, Wallace JL, Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 1989, 96:795- 803).

Os animais foram monitorados diariamente em busca de quais- quer inícios de diarréia, perda de peso corporal, sangue nas fezes e para checar sua sobrevivência (correlacionada ao grau de atividade da doença, EAD). Ao final do experimento, os ratos sobreviventes foram sacrificados, seus cólons dissecados e os danos microscópicos (denominados escore de atividade da mucosa - EAM) foram avaliados. Os segmentos de tecido fo- ram então usados para medir a atividade da mieloperoxidase (MPO, um ín- dice de inflamação). Grau microscópico de colite

Os cólons seccionados foram examinados ao microscópio (x5) e classificados de acordo com suas lesões microscópicas em uma escala de 0 a 10 com base em critérios que refletiam a inflamação, tais como hiperemia, espessamento do intestino e extensão das úlceras. Análises da MPO. A infiltração de neutrófilos no cólon foi monitorada pela medida da atividade da MPO por meio de análise espectrofotométrica com tetrametilbenzidina (TMB) como substrato de acordo com um método previ- amente publicado (Fiorucci S, Antonelli E, Disrutti E, Del Soldato P, Flower RJ, Clark MJ, Morelli A, Peretti M, Ignarro LJ, NCX-1015, a nitric-oxide deri- vative of prednisolone, enhances regulatory T cells in the lamina própria and protects against 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in mice. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:15770-5). A atividade é expressada como U por mg de proteína.

Tratamento com timosina alfa 1. A Τα1 (obtida da Sigma, St. Louis, MO, USA; produto no. T3410; fórmula molecular C129H215N33O55) e o peptídeo "s- crambled" foram fornecidos sob a forma de pós estéreis secos. Os pós fo- ram reconstituídos em água estéril (os níveis de endotoxina foram <0,03 pg/ml, por análise padrão do Iisado do Limulus). A timosina alfa 1 foi admi- nistrada a uma dosagem de 200 microgramas/Kg por injeção intraperitoneal por 6 dias consecutivos começando no dia da indução da colite por TNBS. Determinação das citocinas. Isso foi realizado por meio de testes ELISA es- pecíficos (kit ELISA, R & D Systems lnc, Minneapolis, MN) dos sobrenadan- tes das culturas celulares de linfócitos de fenótipos CD4+ CD25+ isolados da lâmina própria e estimulados in vitro por 48 h com anticorpos direcionados contra moléculas CD3 e CD28 expressadas nos linfócitos (PharMingen, BD1 Palo Alto, Califórnia).

Todas as análises de inflamação e de citocinas foram realizadas no dia seguinte ao final do tratamento com timosina alfa 1.

A figura 3 mostra o efeito da timosina alfa 1 sobre a gravidade da colite induzida, medida em termos de EAD, EAM e MPO. Os resultados mostram uma redução drástica de todos os parâmetros associados e asso- ciáveis em presença de colite manifesta pela timosina alfa 1. Os camundon- gos de controle não receberam nenhum tratamento de qualquer tipo.

A figura 4 mostra a produção de citocinas de CD4+ CD25+ isola- das da lâmina própria dos animais de controle, animais com colite (TNBS) ou daqueles tratados com timosina alfa 1 (TNBS+Ta1). Os resultados mostram um claro aumento das citocinas pró-inflamatórias, tais como IFN-γ e IL-17, e uma produção não significativa de IL-10 anti-inflamatória nos animais com colite. O padrão de produção de citocinas inflamatórias/anti-inflamatórias foi significativamente rompido pelo tratamento com timosina, havendo uma cla- ra prevalência da produção de IL-10.

Esses resultados mostram que a timosina alfa 1 tem um efeito protetor sobre a gravidade da Dll em modelos experimentais de colite.

Claims (4)

1. Uso da timosina alfa 1 para a preparação de um medicamento para a prevenção e o tratamento de doenças autoimunes.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que as doenças au- toimunes são esclerose múltipla ou doenças inflamatórias das vísceras.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, em que as doenças in- flamatórias das vísceras são especificamente doenças inflamatórias intesti- nais.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, em que as doenças in- flamatórias intestinais são colite ulcerativa ou doença de Crohn.