KR20190044325A - 호중구 엘라스타제 억제제를 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
호중구 엘라스타제 억제제를 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 호중구 엘라스타제 억제제를 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 호중구 엘라스타제 억제제를 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 조성물은 호중구 엘라스타제 억제제의 Ang-Tie-2 신호전달 경로 관련성을 최초로 파악하여 개발된 것으로, 현재 치료제가 존재하지 않으나 필요성이 매우 높은 척수 손상에 대한 치료제로 활용이 가능하다. 또한 호중구 엘라스타제 억제제는 현재 급성 폐손상을 적응증(indication)으로 하여 의약허가가 진행되어 있으므로 신약 재창출을 통해 쉽게 임상 적용이 가능하고 빠른 제품화가 가능한 장점이 있다.
Description
본 발명은 호중구 엘라스타제 억제제를 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
척수 손상(Spinal cord injury)은 성인에게서 가장 흔하게 발생하는 사고 중 하나이다. 미국 통계에 따르면 전 세계에 2,500,000명의 환자가 있고 매년 130,000명의 환자가 발생하고 있고 매년 환자발생률이 증가하고 있다. 이러한 통계는 한국 또한 예외가 아니며 국민건강보험공단에 따르면 2013부터 2014년까지 건강보험 진료비 지급자료를 분석한 결과 약 800명의 환자가 발생하였고 이는 계속 증가하는 경향을 보였다. 특히 그 질환자가 상대적으로 젊은 환자에게서 외상의 형태로 많이 발생하기 때문에 개인과 사회에 미치는 손실의 정도는 매우 심각하다.
척수의 손상은 기계적 손상과 이에 따라 조직의 진행성 소실을 야기하는 이차적인 퇴행과정이라고 할 수 있다. 척수 손상 후 일어나는 병리학적 현상은 시간에 따라 일차적 손상과 이차적 손상으로 크게 두 가지 단계로 나누어진다. 일차적 손상은 외상 손상 후 수 분 내에 일어나는 현상으로서 주로 상처 부위에 세포가 죽는 괴사가 일어나는데 이러한 반응의 원인은 주로 전구 염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine)에 의해 유도되는 매개 염증 반응이다. 일차적 손상에 이어 나타나는 이차적 손상은 수 시간에서 수 일에 거쳐 천천히 진행되며 상처부위의 세포만 죽는 것이 아니라 주변의 신경세포들도 서서히 세포사멸이 일어나게 된다. 일차적 손상에서 발생하는 염증 반응은 이러한 이차적 손상의 주된 기전이며 만성 척수 손상의 신경병리 현상을 유발하는 데 관여한다. 상기 염증 반응이 지속되면서 세포사멸은 점점 확대되어 척수 내부의 손상부위가 넓어지게 되며 결국에는 영구적인 기능 소실을 초래하게 된다.
현재 척수 손상 치료의 방향은 이차적인 척수의 손상을 최대한으로 줄이고 신경학적 기능을 최대한 회복하는 데 있다. 먼저 척수 손상이 발생하면 수술적인 치료를 통해 척수를 압박하는 골편이나 탈구를 없애고 고용량 스테로이드 약물을 사용하여 신경세포의 염증반응으로 인해 세포 괴사를 막는 방법이 있다. 하지만 스테로이드 약물을 고용량으로 환자에게 투여할 경우 패혈증, 위장 출혈, 그리고 폐렴같은 막대한 부작용을 끼치기 때문에 실제 임상에서는 제한적으로 쓰이고 있다. 상기 이유로 현재 사실상 손상된 척수 신경의 회복을 가져 올 수 있는 안정적인 치료제가 없어 척수 손상 치료제 개발이 매우 시급한 실정이다. 척수 손상은 영구장애를 초래하지만 사용할 수 있는 치료제가 없어 신약 개발의 필요성이 매우 높다. 부작용을 갖지 않으면서 강력한 항염증 활성을 가져, 척수 손상을 치료할 수 있는 치료제에 대한 요구가 존재한다.
일 양상은 호중구 엘라스타제 억제제를 유효성분으로 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 호중구 엘라스타제 억제제를 유효성분으로 포함하는 척수 손상 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
일 양상은 호중구 엘라스타제 억제제를 유효성분으로 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 '호중구 엘라스타제'는 백혈구 엘라스타제(leukocyte elastase), ELANE, ELA2, 엘라스타제 2, 세린 엘라스타제 (serine elastase) 아형 인간 백혈구 엘라스타제(subtype human leukocyte elastase (HLE)) 등의 용어로 표현되는 효소를 의미할 수 있으며, 특히 키모트립신과 같은 계열의 세린 프로테나제 (serine proteinase)이며 넓은 기질 특이성을 가지는 효소를 의미할 수 있다. 생체 내에서, 염증반응이 있는 동안 호중구와 대식세포에 의하여 분비되어 박테리아나 숙주조직을 파괴할 수 있다. 또한 세린 프로테아제로서는 특이하게도, 호중구 세포 외막 트랩 (Neutrophil extra cellular traps: NETs)에 위치할 수 있다. 척수 손상 후 발생하는 2차 손상의 주요 대사자(key mediator)일 수 있으며, 척수 손상 초기에 호중구 엘라스타제를 차단하는 것이 2차 손상을 방지하는 데 있어 매우 중요할 수 있다. 인간은 구조적으로 유사한 단백질인 엘라스타제 1, 2, 2A, 2B, 3A 및 3B를 코딩하는 6개의 엘라스타제 유전자를 가지고 있다. 호중구 엘라스타제는 활성화된 호중구에서 단백질이 방출된 후 세포 외 기질의 단백질 뿐만 아니라 아즈로필 과립(azurophil granules)이라고 불리는 특화된 호중구 리소좀 내에서 단백질을 가수분해할 수 있으며, 세포 외 기질의 콜라겐-IV 및 엘라스틴의 단백질 분해에 의하여 퇴행성 및 염증성 질환에 관여할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 '호중구 엘라스타제 억제제'는 호중구 엘라스타제의 활성을 저해할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 호중구 엘라스타제 억제제는 세르핀(Serine Protease Inhibitors: Serpins)계열이 알려져있다. 특히 세르핀 계열의 단백질 중 알파 2-안티플라스민 (Alpha 2-antiplasmin) 등을 예로 들 수 있다. 또한 삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai)에서 분리되어 구조 분석된 물질로, N-벤조일인다졸 유도체(N-benzoylindazole derivative) 역시 호중구 엘라스타제를 저해하는 활성을 보일 수 있다. 다만 본 발명의 호중구 엘라스타제 억제제는 위 예시에 한정되는 것은 아니며, 저해 활성을 보이는 물질을 모두 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 호중구 엘라스타제 억제제는 시벨레스타트(Sivelestat)일 수 있다. 시벨레스타트(Sivelestat, Sivelestat Sodium Hydrate)는 약명은 엘라스폴(Elaspol®)이고, 아래 화학식 1로 나타낼 수 있으며, 화학식명은 소듐 N-{2-[ 4-(2,2-디메틸프로리오닐옥시) 페닐술포닐아미노]벤조일} 아미노아세테이트 테트라하이드레이트 (Sodium N-{2-[ 4-(2,2-dimethylpropionyloxy) phenylsulfonylamino]benzoyl} aminoacetate tetrahydrate)이다. 시벨레스타트의 합성 방법은 유럽특허 EP0529223A1 등을 참고할 수 있다. 허가받은 적용 병증은 급성 폐손상 (Acute Lung Injury; Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS))으로, 일본에서 판매 허가를 받은 의약품이며, 현재 IV(intravenous) 형태로 시판되고 있다. 개발사는 오노(Ono)사 이다.
[화학식 1]
상기 호중구 엘라스타제 억제제는 부작용 없이 손상된 척수를 효과적으로 치료할 수 있음을 본 발명으로서 확인하였으므로, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 외상에 의한 척수 손상뿐만 아니라 척수 손상 관련 질환인 급성 횡단성 척수염, 급성 파종성 척수염, 척수병증, 비호지킨 림프종, 수두증, 유전성 실조증, 신경매독, 미나마타병, 루게릭병, 다발성 결화증 등의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있다. 척수 손상이 발생한 이후 나타나는 염증반응(inflammation), 국소빈혈(ischemia), 혈관파열(vascular disruption) 등 이차 손상은 환자의 예후를 결정하는 매우 중요한 요소일 수 있으며, 척수 손상에서 이차 손상을 최소화하고 신경보호(neuroprotction)을 달성하기 위한 최선의 전략은 혈관신생성(angiogenesis)유도와 손상된 혈관-척수 장벽(Blood Spinal cord Barrier)를 회복하는 것일 수 있다. 이와 같은 점에서, 본 발명에 따른 호중구 엘라스타제 억제제는 상기 혈관신생성 유도 및 손상된 혈관-척수 장벽을 회복하기 위한 것일 수 있다.
상기 호중구 엘라스타제 억제제는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염으로 조성물에 포함될 수 있다. 상기 염은 산부가염 또는 염기부가염일 수 있다. 상기 산부가염은 무기산 또는 유기산과의 염을 포함한다. 상기 무기산염으로는, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 인산 또는 황산과의 염이 있으며, 상기 유기산염으로는 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 말레산, 푸마르산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 벤조산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산 또는 나프탈렌디술폰산 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 염기부가염으로는 알칼리금속염 (예, 나트륨 또는 칼륨 염), 알칼리토금속염 (예, 칼슘 또는 마그네슘 염), 또는 암모니아염 또는 유기 아민염, 예를 들면, 디에틸아민, 트리에틸아민, 에틸디이소프로필아민, 프로카인, 디벤질아민, N-메틸모르폴린, 또는 디히드로아비에틸아민과의 염 등이 있다.
본 명세서에서 호중구 엘라스타제 억제제 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염은 이의 임의의 결정형 및 무정형, 그리고 이의 수화물, 용매화물, 및 공결정으로 구성된 군에서 선택된 임의의 형태로 존재할 수 있는 것으로 해석된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형일 수 있다. 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다. 또한 약학적 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제 등과 같은 비경구 투여용 제제로 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 시럽제, 기타 액제로 제형화될 수 있다.
정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀롤로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택할 수 있다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 담즙산 또는 이들의 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.
본 명세서에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 염증성 질환, 또는 척수 손상의 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 명세서의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1㎎ 내지 10g, 또는, 10 mg 내지 5g의 용량으로 투여될 수 있다. 또한, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 호중구 엘라스타제 억제제는 척수 손상된 개체의 운동기능을 향상시키거나, 손상된 척수의 조직의 복구를 촉진하는 것일 수 있다.
따라서, 일 구체예에 따른 호중구 엘라스타제 억제제 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 척수 손상의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
다른 양상은 호중구 엘라스타제 억제제 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 척수 손상 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
식품은 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 환자식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 화합물을 첨가하는 것도 포함된다.
본 발명에 따른 식품 조성물은, 상기 본 발명의 호중구 엘라스타제 억제제 또는 그의 염을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.001 내지 99.99 중량부, 바람직하게는 0.001 내지 30 중량부 첨가될 수 있다. 상기 호중구 엘라스타제 억제제 또는 그의 염의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 상기 성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
또한, 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 호중구 엘라스타제 억제제를 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 조성물은 호중구 엘라스타제 억제제의 Ang-Tie-2 신호전달 경로 관련성을 최초로 파악하여 개발된 것으로, 현재 치료제가 존재하지 않으나 필요성이 매우 높은 척수 손상에 대한 치료제로 활용이 가능하다. 또한 호중구 엘라스타제 억제제는 현재 급성 폐손상 용(indication)으로 의약허가가 진행되어 있으므로 신약 재창출을 통해 쉽게 임상 적용이 가능하고 빠른 제품화가 가능한 장점이 있다.
도 1은 척수 손상 후, 각 호중구 엘라스타제(Neutrophil elastase: N.E.), 안지오포이에틴-2 (Angiopoietin-2: Ang-2) 발현은 증가하고, 안지오포이에틴-1 (Angiopoietin-1: Ang-1), 쥐 내피 세포 항원(rat endothelial cell antigen: RECA-1)발현은 감소한다는 결과를 확인할 수 있는 RT-PCR 실험 결과이다. 척수를 3시간, 1일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일, 28일 째 채취하여 검사한 결과이다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
도 1a는 면역조직염색 사진이고, 도 1b는 호중구 엘라스타제 발현양을 나타낸 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 1c는 Ang-1 발현양을 나타낸 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 1d는 Ang-2 발현양을 나타낸 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 2는 시벨레스타트를 투여하여 Ang-1, 2와 N.E.의 조절을 확인한 면역조직염색 사진 및 RT-PCR 결과 그래프이다(그룹당 3마리,###p<0.001 vs. sham group, ***p < 0.001 vs. Injury group)
도 2a는 척수 손상 후 1일째 Angiopoietin-1 (Ang-1), Angiopoietin-2 (Ang-2), Neutrophil elastase (N.E) 발현을 확인한 사진이다.
도 2b 내지 2d는 손상 후 1일 째 RT-PCR 결과로, 각 Ang-1 (도 2b), Ang-2 (도 2c) 및 N.E (도 2d)에 관한 결과이다.
도 3은 시벨레스타트 주입 후 척수 손상 후 1일 째 염증인자 TNF-알파(tumor necrosis factor-alpha: TNF-a) 및 인터루킨-6(Interleukin: IL-6) 등의 발현을 확인한 면역조직염색 사진 및 RT-PCR 결과 그래프이다(###p<0.001 vs. sham group. **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. Injury group)
도 3a는 염증인자 TNF-알파의 면역조직염색 사진이다.
도 3b는 염증인자 인터루킨-6의 면역조직염색 사진이다.
도 3c는 염증인자 TNF-알파의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3d는 염증인자 IL-6의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3e는 염증인자 iNOS의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3f는 염증인자 IL-1의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3g는 염증인자 IL-10의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3h는 CCL-2의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3i는 CCL-3의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 4는 시벨레스타트가 타이트 정션 단백질(조눌라 오크루덴-1(zonula occludens-1: ZO-1) 및 오크루딘(Occludin))의 파괴를 억제하는 것을 확인한 결과이다(척수 손상 후 1일 째 사진 및 RT-PCR 결과,***p < 0.001 vs. Injury group)
도 4a는 ZO-1 및 오크루딘의 면역조직염색 사진이다.
도 4b는 오크루딘의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 4c는 ZO-1의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 5는 시벨레스타트가 억제성 글라이얼/피브로틱 흉터 형성을 억제하는 것을 확인한 결과로, 척수 손상 28일째 조직 염색 사진 및 RT-PCR 결과이다(***p < 0.001 vs. Injury group).
도 5a는 Iba-1, GFAP, Fibronectin의 면역조직염색 사진이다.
도 5b는 GFAP, 도 5c는 Iba-1, 도 5d는 Mac-1, 도 5e는 피브로넥틴의 각 RT-PCR 결과이다.
도 6은 시벨레스타트 투여 후 치료 후 신경학적 기능이 호전된 것을 확인할 수 있는 염색 결과 사진 및 운동평가 결과 그래프이다.
도 6a의 좌측 forepaw footprints; 파랑: 우측 forepaw footprints; 보라: 좌측 hind paw footprints; 적색: 우측 hind paw footprints 로 나타내었고, 신경학적 기능 호전이 확인된다.
도 6b는 BBB 실험(21-point Basso, Beattie, and Bresnahan (BBB) locomotor test) 결과 그래프로, 각 척수 손상 후 1, 7, 14, 21, 28일차의 결과이다.
도 6c는 Von Frey-filament를 이용한 신경병증성 통증 평가로, 각 척수 손상 후 1, 7, 14, 21, 28일차의 결과이다.
도 1a는 면역조직염색 사진이고, 도 1b는 호중구 엘라스타제 발현양을 나타낸 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 1c는 Ang-1 발현양을 나타낸 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 1d는 Ang-2 발현양을 나타낸 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 2는 시벨레스타트를 투여하여 Ang-1, 2와 N.E.의 조절을 확인한 면역조직염색 사진 및 RT-PCR 결과 그래프이다(그룹당 3마리,###p<0.001 vs. sham group, ***p < 0.001 vs. Injury group)
도 2a는 척수 손상 후 1일째 Angiopoietin-1 (Ang-1), Angiopoietin-2 (Ang-2), Neutrophil elastase (N.E) 발현을 확인한 사진이다.
도 2b 내지 2d는 손상 후 1일 째 RT-PCR 결과로, 각 Ang-1 (도 2b), Ang-2 (도 2c) 및 N.E (도 2d)에 관한 결과이다.
도 3은 시벨레스타트 주입 후 척수 손상 후 1일 째 염증인자 TNF-알파(tumor necrosis factor-alpha: TNF-a) 및 인터루킨-6(Interleukin: IL-6) 등의 발현을 확인한 면역조직염색 사진 및 RT-PCR 결과 그래프이다(###p<0.001 vs. sham group. **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. Injury group)
도 3a는 염증인자 TNF-알파의 면역조직염색 사진이다.
도 3b는 염증인자 인터루킨-6의 면역조직염색 사진이다.
도 3c는 염증인자 TNF-알파의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3d는 염증인자 IL-6의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3e는 염증인자 iNOS의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3f는 염증인자 IL-1의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3g는 염증인자 IL-10의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3h는 CCL-2의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 3i는 CCL-3의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 4는 시벨레스타트가 타이트 정션 단백질(조눌라 오크루덴-1(zonula occludens-1: ZO-1) 및 오크루딘(Occludin))의 파괴를 억제하는 것을 확인한 결과이다(척수 손상 후 1일 째 사진 및 RT-PCR 결과,***p < 0.001 vs. Injury group)
도 4a는 ZO-1 및 오크루딘의 면역조직염색 사진이다.
도 4b는 오크루딘의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 4c는 ZO-1의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 5는 시벨레스타트가 억제성 글라이얼/피브로틱 흉터 형성을 억제하는 것을 확인한 결과로, 척수 손상 28일째 조직 염색 사진 및 RT-PCR 결과이다(***p < 0.001 vs. Injury group).
도 5a는 Iba-1, GFAP, Fibronectin의 면역조직염색 사진이다.
도 5b는 GFAP, 도 5c는 Iba-1, 도 5d는 Mac-1, 도 5e는 피브로넥틴의 각 RT-PCR 결과이다.
도 6은 시벨레스타트 투여 후 치료 후 신경학적 기능이 호전된 것을 확인할 수 있는 염색 결과 사진 및 운동평가 결과 그래프이다.
도 6a의 좌측 forepaw footprints; 파랑: 우측 forepaw footprints; 보라: 좌측 hind paw footprints; 적색: 우측 hind paw footprints 로 나타내었고, 신경학적 기능 호전이 확인된다.
도 6b는 BBB 실험(21-point Basso, Beattie, and Bresnahan (BBB) locomotor test) 결과 그래프로, 각 척수 손상 후 1, 7, 14, 21, 28일차의 결과이다.
도 6c는 Von Frey-filament를 이용한 신경병증성 통증 평가로, 각 척수 손상 후 1, 7, 14, 21, 28일차의 결과이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 호중구
엘라스타제
저해제를 유효성분으로 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제조
시벨레스타트를 동아ST 사에서 구매하여 증류수에 혼합하여 농도를 30mg/kg으로 제조함으로써 본 발명에 따른 조성물을 제조하였다.
이로써 본 발명에 따른 호중구 엘라스타제 저해제를 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 조성물을 제조하였으며, 실시예 1에서 제조한 약학적 조성물을 이용하여 척수 손상 치료 효과를 아래 실험예들에서 확인하였다.
실험예
1: 척수 손상 동물 모델의 제작 및 약물의 투여
1.1. 척수 외상 압착 모델 동물 품종 및 공급
9-11 주령 250-300g Sprague Dawley female rat으로, 동물들의 검수과정 품종 및 외관은 오리엔트 바이오를 통해 검증된 동물을 구입하였다. 이후 차의과학대학교 동물윤리위원회 규정 범위내에서 사육을 실시하였다.
1.2. 동물 마취 및 희생
SD Rat (8-10 주령)을 졸레틸(50 mg/kg, Virbac Laboratories, France)과 럼푼(10 mg/kg, Bayer, Korea)을 1:1 비율로 g 당 1ul 주사하여 마취한다. 실험이 끝난 후에는 GUIDE FOR THE CARE AND USE OF LABORATORY ANIMALS Eighth Edition 안락사 가이드라인을 참조하여 안락사시킨다.
1.3. 척수 압착 모델(Compression Model)
척수 손상을 유발하기 위한 장치는 추 낙하법을 응용한 것으로 20g, 35g, 50g 의 무게의 추와 지지봉이 구성되어 있어 T10 부위에 후궁 절제술을 시행하여 척추뼈고리판(lamina)을 제거한 후 직경 1mm 인 지지봉과 추가 결합되어 있는 임펙터로 척수 손상을 유발한다. 추는 각 다른 무게를 사용하여도 무방하며, 이에 관한 모식도는 도 1에 나타난 바와 같다.
구체적으로는 우선 체중을 측정하고 제모기를 사용하여 Rat의 흉추 10 번 부위를 중심으로 반경 4cm 정도의 원형으로 제모하였다. 제모 부위를 70% 알코올로 소독하였다. 수술부위를 포비돈과 70% 알코올로 소독하였다. 흉추 10번(T10) 위치를 확인한 후 수술부위만 노출된 멸균 수술포로 덮은 후 외피를 수술용 칼을 이용하여 5cm 정도 절개하였다. 외피 절개 후 노출되는 근육층도 수술용 칼을 이용하여 제10흉추 부위를 2cm 가량 절개하였다. 제10흉추 극돌기(spinous process)가 노출이 되면 극돌기를 Offset Bone Nipper(FST, Germany)을 이용해 제거하고 척추뼈고리판(척추 후궁, lamina)를 경막(dura meter)의 손상이 없이 후방의 척수를 노출시켰다. 제8흉추 및 제11흉추 극돌기를 Allis Forceps으로 고정하여 경막의 손상 없이 후방의 척수를 노출시켰다. 이후 추(20g, 35g, 50g)를 이용하여 5분간 제10흉추 위치에서 척수를 압박하여 척수 압착 모델을 제작하였다.
1.4. 약학적 조성물의 투여
위 실시예 1에서 제조한 조성물을 30mg/kg 로 하여 위 1.3.의 수술 1시간 후에 14일 동안 하루에 2회 복강 내 주사하여 투여하였다.
1.5. 전체
실험군
전체 실험은 30마리의 쥐(Rat)를 사용하였으며, 각 상세 실험군은 아래와 같다.
대조군 1: Positive control [sham](경막의 손상없이 척수노출) = 10마리
실험군 1: Negative control (no treatment, only injury) = 10마리
실험군 2: Injury + 실시예 1 투여군 = 10마리
실험예
2: 행동분석
2.1
비비비
스코어 테스트(BBB Open field score test)
상기 약물을 투여한 척수 외상 마우스의 운동기능을 측정하기 위하여 BBB 스코어 테스트((Basso, Bresnahan, and Beattie Score Test)를 실시하였다.
BBB 스코어 테스트란 다양한 운동기능을 복합적으로 평가할 수 있는 실험방법으로서 21가지 항목에 따라 뒷다리를 전혀 사용하지 못하는 경우 최소 0점부터 정상적인 행동을 하는 경우의 21점까지 점수를 나누고 상기 점수가 높아질수록 운동기능이 향상되었음을 의미한다.
21가지 항목에 따라 뒷다리를 전혀 사용하지 못하는 경우 최소 0점부터 정상적인 행동을 하는 경우의 21점까지 점수를 나누고 상기 점수가 높아질수록 운동기능이 향상되었음을 의미한다. 척수 외상을 준 후 1, 7, 14, 21, 28일 차에 숙련된 3명의 실험자가 각 마우스의 뒷다리 움직임을 관찰하여 BBB 점수를 결정하였고, 그 결과를 도 6b에 나타내었다.
도 6b에 나타난 바와 같이, 척수 외상을 받은 직후 모든 마우스는 뒷다리의 움직임이 전혀 없는 0 점을 나타내었고, 7일 차, 14일 차, 21일 차, 28일 차에 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여한 척수 손상 개체의 경우 각 13, 15, 16, 17점으로 대조군에 비해 현저한 운동기능 회복효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
2.2
Von
Frey
-filament를 이용한 신경병증성 통증 평가
시벨레스타트가 척수 손상 후 발생하는 이질통에 대한 진통 효과를 확인하기 위하여 본프레이 실험을 진행하였다. 본프레이 실험은 흰쥐의 발바닥에 약한 기계적 자극을 주는 본프레이를 갖다 내었을 때 흰쥐의 반응을 평가하여 척수손상 후 흰쥐의 이질통을 평가하여 진행하였다.
그 결과, 도 6c에 나타난 바와 같이, 각 척수 손상 후 1, 7, 14, 21, 28일차의 결과를 보았을 때 실험군은 대조군에 비하여 진통 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.
실험예
3: 헤마톡실린 에오신 염색(H&E staining)
척수 손상 후 1, 7, 14, 21, 28일 차에 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여한 척수 손상 개체군과 Injury 그룹(대조군)의 척추를 4% PFA에 넣어 일주일간 고정 후 척수 손상 부위를 기점으로 1cm를 잘라 종단면으로 파라핀 블록을 만들었다. 만든 블록을 5um 두께로 자른 뒤 탈파라핀 과정을 거쳐 헤마톡실린 에오신 염색을 실시하였다.
도 6a에 나타난 바와 같이, 척수 손상 후 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여한 군과 대조군의 손상 부위 1cm 를 잘라 조직학적 분석을 하면, 약학적 조성물을 투여한 군에서 확연하게 손상회복이 빠른 것을 확인할 수 있었다.
실험예
4: 면역조직 염색(
Immunohistochemistry:IHC
)
척수 손상 후 1 또는 28일 차에 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여한 척수 손상 개체군과 Injury 군(대조군)의 척추를 4% PFA에 넣어 일주일간 고정 후 척수 손상 부위를 기점으로 1cm를 잘라 종단면으로 파라핀 블록을 만들었다. 만든 블록을 5um 두께로 자른 뒤 탈 파라핀 과정을 거쳐 각 면역 염색을 하였다.
도 1a는 면역조직염색 사진으로 각 호중구 엘라스타제(Neutrophil elastase: N.E.), 안지오포이에틴-2 (Angiopoietin-2: Ang-2) 발현은 증가하고, 안지오포이에틴-1 (Angiopoietin-1: Ang-1), 쥐 내피 세포 항원(rat endothelial cell antigen: RECA-1)발현은 감소한다는 결과를 확인할 수 있다.
도 2a는 척수 손상 후 1일째 Angiopoietin-1 (Ang-1), Angiopoietin-2 (Ang-2), Neutrophil elastase (N.E) 발현을 확인한 사진이다. 시벨레스타트를 투여한 군은 척수 손상 후 안지오포이에틴을 조절하고, N.E를 억제하는 결과를 확인할 수 있다.
도 3a는 시벨레스타트 주입 후 척수 손상 후 1일 째 염증인자 TNF-알파(tumor necrosis factor-alpha: TNF-α) 및 인터루킨-6(Interleukin: IL-6) 등의 발현을 확인한 면역조직염색 사진이다. 시벨레스타트 주입한 실험군은 염증인자 발현이 억제되고 있음을 확인할 수 있었다.
도 4a는 시벨레스타트가 타이트 정션 단백질(조눌라 오크루덴-1(zonula occludens-1: ZO-1) 및 오크루딘(Occludin))의 파괴를 억제하는 것을 확인한 결과이다(척수 손상 후 1일 째 사진).
도 5a는 시벨레스타트가 억제성 글라이얼/피브로틱 흉터 형성을 억제하는 것을 확인한 결과로, 척수 손상 28일째 조직 염색 사진이다.
실험예
5: RT-
PCR
실험
척수 손상 후 시간별 척수 손상 부위를 기점으로 1cm를 잘라 내고 Trizol로 RNA를 추출 한 후 RT PCR을 실시하였다.
도 1b는 호중구 엘라스타제 발현양을 나타낸 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 1c는 Ang-1 발현양을 나타낸 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 1d는 Ang-2 발현양을 나타낸 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 2b 내지 2d는 손상 후 1일 째 RT-PCR 결과로, 각 Ang-1 (도 2b), Ang-2 (도 2c) 및 N.E (도 2d)에 관한 결과이다.
도 3c는 염증인자 TNF-알파의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 3d는 염증인자 IL-6의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 3e는 염증인자 iNOS의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 3f는 염증인자 IL-1의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 3g는 염증인자 IL-10의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 3h는 CCL-2의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 3i는 CCL-3의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 4b는 오크루딘의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다. 도 4c는 ZO-1의 발현량을 확인한 RT-PCR 결과 그래프이다.
도 5b는 GFAP, 도 5c는 Iba-1, 도 5d는 Mac-1, 도 5e는 피브로넥틴의 각 RT-PCR 결과이다.
이로써, 시벨레스타트를 투여한 군은 척수 손상 후 안지오포이에틴을 조절하고, N.E를 억제하고, 염증인자를 억제하며, 타이트 정션 단백질 파괴를 억제하고 억제성 글라이얼/피브로틱 흉터 형성을 억제하는 것을 확인하였다.
Claims (5)
- 호중구 엘라스타제 억제제(Neutrophil elastase inhibitor)를 유효성분으로 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 척수 손상은 외상, 급성 횡단성 척수염, 급성 파종성 척수염, 척수병증, 비호지킨 림프종, 수두증, 유전성 실조증, 신경매독, 미나마타병, 루게릭병, 다발성 결화증에 의한 척수 손상인 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 호중구 엘라스타제 억제제는 안지오포이에틴을 조절하여 Ang-Tie-2 신호전달 경로를 통하여 혈관-척수 장벽을 보호하고 혈관신생성을 유도하여 척수 손상을 예방 또는 치료하는 것인 약학적 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 호중구 엘라스타제 억제제는 시벨레스타트(Sivelestat), 알파 2-안티플라스민 (Alpha 2-antiplasmin), 그의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 그 혼합물인 것인 약학적 조성물.
- 호중구 엘라스타제 억제제(Neutrophil elastase inhibitor)를 유효성분으로 포함하는 척수 손상 예방 또는 개선용 건강기능식품.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170136605A KR20190044325A (ko) | 2017-10-20 | 2017-10-20 | 호중구 엘라스타제 억제제를 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170136605A KR20190044325A (ko) | 2017-10-20 | 2017-10-20 | 호중구 엘라스타제 억제제를 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190044325A true KR20190044325A (ko) | 2019-04-30 |
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ID=66285688
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| KR1020170136605A KR20190044325A (ko) | 2017-10-20 | 2017-10-20 | 호중구 엘라스타제 억제제를 포함하는 척수 손상 예방 또는 치료용 조성물 |
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|---|---|
| KR (1) | KR20190044325A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024008131A1 (zh) * | 2022-07-07 | 2024-01-11 | 上海汇伦医药股份有限公司 | 西维来司他的新用途 |
-
2017
- 2017-10-20 KR KR1020170136605A patent/KR20190044325A/ko unknown
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