KR20200143710A - 근위축 측삭 경화증 및 관련 장애의 치료를 위한 조합 요법 - Google Patents

근위축 측삭 경화증 및 관련 장애의 치료를 위한 조합 요법 Download PDF

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KR20200143710A
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데이비드 알. 엘마레
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더 제너럴 하스피탈 코포레이션
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Abstract

치료적 유효량의 크로몰린 또는 크로몰린 유도체 화합물 및 항염증제의 조합물을 투여하는 것을 포함하는 뉴런 염증 상태, 예를 들어, 근위축 측삭 경화증 및 프리온 질병을 치료하는 방법이 본원에 기술된다.

Description

근위축 측삭 경화증 및 관련 장애의 치료를 위한 조합 요법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 4월 9일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/654,772에 대한 우선권을 주장한다; 그 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
배경
루게릭병으로도 알려진 근위축 측삭 경화증(ALS)은 수의근을 조절하는 뉴런의 사멸을 일으키는 특정 질환이다. ALS는 강직 근육, 근육 연축, 및 근육 크기 감소로 인한 쇠약이 점차 악화되는 특징이 있다. 이로 인해 말하기, 삼키기, 호흡의 곤란, 및 궁극적인 사망이 발생한다.
ALS는 미국에서 무려 30,000명이나 되는 사람들에게 영향을 미치는 것으로 추정되며, 매년 5,000건의 새로운 병증이 진단된다. ALS가 발병하는 대부분의 사람들은 40세에서 70세 사이지만, 이 질병은 더 어린 나이에 발생할 수 있다. 전 세계 ALS 유병률은 인종, 민족, 또는 사회경제적 그룹과 관련이 없다. 또한 ALS는 20세 이상 인구의 100,000명 중 5명의 사망 원인으로 추정된다. 발생률은 100,000명 당 약 1-2명이다. 대부분의 ALS 병증은 산발적이며, 병증의 약 5-10%만이 가족성 ALS이다. ALS는 60세 이상의 사람들에게 가장 흔하다. 남성은 여성보다 약 2:1의 비율로 더 발병한다. 대상체의 50%는 3년 이내에 사망한다.
ALS의 발병률은 헌팅톤병보다 5배 더 높으며 다발성 경화증과 거의 같다.
ALS와 관련된 주요 신경병리학은 척수의 운동 뉴런의 손실 및 척수의 미만성 경화증이다. 제안된 병원성 메커니즘은 유전자 돌연변이와 반드시 연관된 것은 아닌 산화 스트레스(예를 들어, SOD1)의 결과로 인한 운동 뉴런 손상, 글루타메이트 매개 흥분독성, 자유 라디칼 생성, 세포내 칼슘 증가, EAAT2 기능 감소, 비정상적인 단백질 응집(부니나체(Bunina body), 및 돌연변이체가 잘못 폴딩되어 다른 분자와 공동-침전될 수 있는 신경잔섬유가 풍부한 유리질 봉입체 포함), 아폽토시스의 징후로 카스파제-1 및 -9 활성화의 증가를 포함한다. 요약하면, ALS는 유전적 감수성과 환경적 요인의 조합으로 인해 발생한다.
ALS 환자를 대상으로 한 많은 연구에서, 항체, 케모카인, T-세포, 및 개폐 칼슘 채널의 수준 증가를 포함하는 면역 반응 이상은 물론 다른 염증 마커도 관찰되었다. ALS 환자는 더 높은 수준의 MCP-1, IL-17 ALS, 및 IL-6과 같은 순환 케모카인 및 사이토카인을 나타내었다.
건강한 중추신경계(CNS)를 가진 대상체에서, 미세아교세포는 면역 감시를 제공한다. 손상에 대한 반응으로, 미세아교세포가 활성화되어 전염증성 사이토카인, 반응성 질화 중간체, 반응성 산소화 중간체, 및 글루타메이트를 생성한다. 이로 인해 염증 부위의 뉴런이 아폽토틱 메커니즘에 의해 퇴화된다. 염증의 보호적 양태는 미세아교세포에 의한 파편 제거를 포함하고, 이는 T 세포의 복구 및 상호작용에 중요하다.
단핵구와 미세아교세포의 조기 활성화는 면역 반응을 조절하여 신경퇴행을 악화시킬 수 있는 전염증성 사이토카인의 분비를 유발하지 않으면서 단핵구 및 미세아교세포의 고유 식세포 능력을 증가시킴으로써 신경퇴행성 진행을 늦출 가능성이 있다.
미세아교세포의 특성의 변화는 미세환경에서의 다른 자극에 대한 반응에 따라 달라지므로(예를 들어, 사이토카인), 다양한 표현형이 생성되는 것으로 알려져 있다. 사이토카인, 수용체, 및 다른 마커의 발현 변화에 기반하여, 단핵구 및 대식세포 상태는 다음과 같이 정의되었다: 고전적 활성화(M1), 대체 활성화(M2a), 타입 II 대체 활성화(M2b), 및 후천적 비활성화(M2c).
미세아교세포는 인터페론-γ(IFNγ), T 세포로부터의 종양 괴사 인자 알파(TNFα), 또는 항원-제시 세포의 존재에 반응하여 활성화된다. M1 활성화된 미세아교세포는 반응성 산소 종을 생성할 수 있으며 TNFα 및 인터루킨(IL)-1β와 같은 전염증성 사이토카인의 생산을 증가시킬 수 있다.
대식세포 M2 활성화는 항염증 작용 및 세포외 기질의 재구성에 기여하는 것으로 알려진 매개체와 관련이 있다. M2a 표현형을 가진 미세아교세포는 식균작용을 증가시키고 인슐린-유사 성장 인자-1과 같은 성장 인자 및 IL-10과 같은 항염증성 사이토카인을 생성한다. IL-4 및/또는 IL-13에 의한 대식세포의 자극은 때때로 상처-치유 대식세포라고 불리는 M2a 상태를 초래하며, 이는 일반적으로 전염증성 사이토카인(IL-1, TNF 및 IL-6)의 낮은 생산을 특징으로 한다. M2a 반응은 주로 알레르기 반응, 세포외 기질 침착, 및 리모델링에서 관찰된다.
M2b 대식세포는 M1 활성화의 특징인 높은 수준의 전염증성 사이토카인을 발현하지만, 또한 높은 수준의 항염증성 사이토카인 IL-10을 발현한다는 점에서 독특하다.
마지막으로, M2c 대식세포 상태는 IL-10에 의해 자극되며 때때로 조절성 대식세포로 지칭된다. M2c 대식세포는 고전적인 전염증성 반응 없이 세포 파편의 식균작용에서 역할을 하는 항염증 활성을 가지고 있다. 이러한 세포는 TGFβ 및 높은 IL-10 뿐만 아니라 기질 단백질을 발현한다. Plunkett 등은 IL-10이 아교세포 활성화 감소 및 전염증성 사이토카인 생성을 포함하는 항염증성 반응을 매개하였다고 보고하였다.
신경퇴행성 과정의 치료를 위한 잠재적인 표적으로서 미세아교세포 활성화를 조절하기 위한 몇 가지 접근법이 제안되었다. 비스테로이드 항염증성 약물(NSAID)과 같은 항염증제를 사용하여 신경퇴행성 과정의 진행을 막는 것은 내인성 분자에 의한 전염증성 및 항염증성 활성화 둘 모두를 억제하여, M2 미세아교세포 기능의 유리한 효과 및 플라크 제거의 내인성 메커니즘을 불활성화시킬 수 있다고 제안되었다.
이전 연구는 주로 두 가지 영역에 초점을 두었다: 전염증성 사이토카인의 독성 효과를 완화시키는 항염증제; 및 미세아교세포를 M1 상태에서 독성 효과가 감소되고 식세포 활성이 향상되는 M2 상태로 전환시키는 것. 여러 항염증제가 시험되었지만 미세아교세포를 M1 상태에서 M2 상태로 전환하는데 효과가 거의 또는 전혀 나타나지 않았다.
따라서, M1 상태에서 M2 상태로 미세아교세포의의 전환을 조절함에 의한 신경 염증 상태의 항염증 치료가 필요하다.
개요
특정 구체예에서, 본 발명은 제1 화합물 및 제2 화합물을 공동-투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하거나 진행을 늦추는 방법에 관한 것이고,
여기서,
질병 또는 질환은 뉴런 염증 상태이고;
제1 화합물 및 제2 화합물은 독립적으로
(a) 하기 화학식 (I)을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이거나:
Figure pct00001
상기 식에서,
X는 할라이드, 하이드록실, 또는 OCO(C1-8알킬)이고;
Y는 CO2R1 또는 CH2OR2이고;
R1은 Li, Na, K, H, C1-4알킬, 또는 -CH2CO2(C1-5알킬)이고;
R2는 H 또는 -C(O)(C1-4알킬)이다;
(b) 비톨테롤(bitolterol), 페노테롤(fenoterol), 이소프레날린(isoprenaline), 레보살부타몰(levosalbutamol), 오르시프레날린(orciprenaline), 피르부테롤(pirbuterol), 프로카테롤(procaterol), 리토드린(ritodrine), 살부타몰(salbutamol), 테르부탈린(terbutaline), 아르포르모테롤(arformoterol), 밤부테롤(bambuterol), 클렌부테롤(clenbuterol), 포르모테롤(formoterol), 살메테롤(salmeterol), 아베디테롤(abediterol), 카르모테롤(carmoterol), 인다카테롤(indacaterol), 올로다테롤(olodaterol), 빌란테롤(vilanterol), 네도크로밀(nedocromil), 케토티펜(ketotifen), 올로파타딘(olopatadine), 오말리주맙(omalizumab), 케르세틴(quercetine), 메폴리주맙(mepolizumab), 아젤라스틴(azelastine), 및 메틸크산틴 페미롤라스트(methylxanthines pemirolast), 올로파타이든(olopataidne), 알파톡신(alfatoxin) G1, 알파톡신 B1, 알파톡신 M1, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol), 제아랄레논(zearalenone), 오크라톡신(ochratoxin) A, 후모니신(fumonisin) B1, 가수분해된 후모니신 B1, 파툴린(patulin), 및 에르고타민(ergotamine)으로부터 선택되거나;
(c) 에다라본(edaravone) 또는 릴루졸(riluzole)이거나;
(d) 다음으로부터 선택되거나:
Figure pct00002
또는 이의 약학적으로 허용되는 염;
(e) 비스테로이드 항염증성 약물(NSAID)이거나;
(f) 항염증성 펩티드이고;
제1 화합물 및 제2 화합물은 함께 취해져 치료적으로 효과적이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 ALS의 치료를 위한 크로몰린 또는 이의 염 또는 에스테르 및 에다라본의 공동-투여에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 ALS의 치료를 위한 크로몰린 또는 이의 염 또는 에스테르 및 릴루졸의 공동-투여에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1A-도 1C는 크로몰린 소듐 치료가 TgSOD1 마우스의 체중을 변경하지 않음을 보여주는 그래프이다. 도 1A는 이원 ANOVA 및 Tukey의 다중 비교 테스트가 P130에서만 TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 체중의 유의한 개선을 보여주었음을 묘사한다. 또한 P100, P110, P120, P130, P140, 및 P150에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 체중의 유의한 감소가 있었다. 또한 P100, P110, P120, P130, P140, 및 P150에서 WtSOD1-크로몰린 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 체중의 유의한 감소가 있었다. TgSOD1-크로몰린 그룹과 WtSOD1-비히클 그룹 사이에 체중의 유의한 차이는 P120, P130, 및 P140에서만 있었다. 도 1B는, 암컷 마우스에서, 이원 ANOVA 및 Tukey의 다중 비교 테스트가 P120 및 P130에서 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 체중의 유의한 감소를 보여주었음을 도시한다(도 1B). 또한 P130, P140, 및 P150에서 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 체중이 현저하게 감소하였다. 도 1C는, 수컷 마우스에서, 이원 ANOVA 및 Tukey의 다중 비교 테스트가 P90, P100, P110, P120, P130, 및 P140에서 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 체중의 유의한 감소를 보여주었음을 도시한다. 또한 P90, P100, P110, P120, 및 P130에서 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 체중이 현저하게 감소하였다. 암컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 19; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 17; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 19; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). 수컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 18; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 21; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 21; 검정색), TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 2A-도 2C는 크로몰린 소듐 치료가 TgSOD1 마우스에서 신경학적 점수를 개선하고 질병 발병을 지연시켰음을 보여주는 그래프이다. 도 2A는 P90, P100, P110, P130, 및 P140에서 TgSOD1-크로몰린 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 치료된 그룹에서 신경학적 점수의 유의한 증가를 이원 AVOVA가 입증하고 Tukey의 사후 분석이 보여주었음을 도시한다. 도 2B는, 암컷 마우스에서, 이원 AVOVA 및 Tukey의 사후 분석이 P90, P100, P120, P130, 및 P140에서 TgSOD1-크로몰린 그룹에 비해 암컷 TgSOD1-비히클 치료된 그룹에서 신경학적 점수의 유의한 증가를 보여주었음을 도시한다. 도 2C는, 수컷 마우스에서, 이원 AVOVA 및 Tukey의 사후 분석이 P90, P100, 및 P110에서 TgSOD1-크로몰린 그룹에 비해 수컷 TgSOD1-비히클 치료된 그룹에서 신경학적 점수의 유의한 증가를 보여주었음을 도시한다. 그룹 당 마우스 수, 암컷들 암컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 19; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 17; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 19; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). 수컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 18; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 21; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 21; 검정색), TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 3A-도 3C는 TgSOD1 마우스에서 PAGE 작업 성능에 대한 크로몰린 소듐 치료의 효과를 보여주는 그래프이다. 도 3A는 이원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석이 P120 및 P140에서 TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린에서 PaGE 성능의 유의한 개선을 보여주었음을 도시한다. P80, P100, P120, 및 P140에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 PaGE가 유의하게 감소하였다. 또한, P100 및 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 PaGE가 크게 감소하였다. 도 3B는, 암컷 마우스에서, 이원 ANOVE 및 Tukey의 사후 분석이 P120 및 P140에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 PaGE의 유의한 감소를 보여주었음을 도시한다. 또한, P100 및 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 PaGE가 크게 감소하였다. 중요한 것은 크로몰린 치료된 암컷 그룹에서의 악화 및 치료된 그룹에서 P140에서 PaGE 성능의 개선과 함께 P100에서 두 트랜스제닉 그룹 사이에 유의한 차이가 있었다는 것이다. 도 3C는, 수컷 마우스에서, 이원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석이 P80, P100, 및 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 PaGE의 유의한 감소를 보여주었음을 도시한다. P100 및 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서도 PaGE가 크게 감소하였다. 중요한 것은 P120에서 두 수컷 트랜스제닉 그룹 사이에 PaGE의 유의한 개선이 있었다는 것이다. 암컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 19; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 17; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 19; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). 수컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 18; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 21; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 21; 검정색), TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다. *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 4A-도 4C는 크로몰린 소듐이 로타로드에 대한 성능을 변경하지 않았음을 보여준다. 도 4A는 이원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석이 TgSOD1-비히클과 TgSOD1-크로몰린 마우스 사이에 로타로드 성능에 있어 차이가 없음을 보여주었음을 도시한다. P70, P90 및 P120에서 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 모두 사이에 유의한 차이가 있었다. 유사하게, 사후 분석은 모든 시점에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 로타로드 성능의 유의한 감소를 보여주었다. 도 4B는, 암컷 마우스에서, 이원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석이 P70, P90 및 P120에서 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 모두 사이에 유의한 차이를 보여주었음을 도시한다. 유사하게, 사후 분석은 681 모든 시점에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 로타로드 성능의 유의한 감소를 보여주었다. 도 4C는, 수컷 마우스에서, 이원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석이 수컷 치료된 마우스에서 P70, P90 및 P120에서 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 모두 사이에 유의한 차이를 보여주었음을 도시한다. 유사하게, 사후 분석은 모든 시점에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린에 비해 수컷 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 로타로드 성능의 유의한 감소를 보여주었다. 암컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 19; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 17; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 19; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). 수컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 18; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 21; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 21; 검정색), TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 5A-도 5C는 크로몰린 소듐이 보행 성능을 변경하지 않았음을 보여준다. 도 5A는 이원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석이 TgSOD1-크로몰린과 TgSOD1-비히클 그룹 사이에 보폭 길이에 있어 유의한 차이를 보이지 않았음을 도시한다. P120에서 두 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클에서 보폭 길이가 현저하게 감소하였다. 유사하게, 사후 분석은 P120에서 야생형 마우스에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 보폭 길이가 크게 감소하였음을 보여주는데, 이는 크로몰린 치료가 보폭 길이에 영향을 미치지 않았음을 시사한다. 도 5B는, 암컷 마우스에서, 이원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석이 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹과 비교하여 TgSOD1-비히클 및 TgSOD1-크로몰린 치료된 암컷 마우스에서 보폭 길이의 현저한 감소를 보여주었음을 도시한다(도 5B). 도 5C는, 수컷 마우스에서, 이원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석이 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹과 비교하여 수컷 TgSOD1-비히클 및 TgSOD1-크로몰린 치료된 마우스에서 보폭 길이의 현저한 감소를 보여주었음을 도시한다.
도 6A-도 6C는 크로몰린 소듐이 보폭 너비를 변경시키지 않았음을 보여준다. 도 6A는 이원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석이 WtSOD1-비히클에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 P120에서 보폭 너비의 유의한 증가를 보여주었음을 도시한다. 도 6B는, 암컷 마우스에서, 이원 ANOVA가 보폭 너비에 미치는 연령에 대한 유의한 효과를 보여주었음을 도시한다. 도 6C는, 수컷 마우스에서, 이원 ANOVA 및 Tukey의 분석이 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 치료된 마우스에서 보폭 너비의 유의한 증가를 보여주었음을 도시한다. 암컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 19; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 17; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 19; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). 수컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 18; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 21; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 21; 검정색), TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 7A-도 7C는 크로몰린 소듐 치료가 TgSOD1 마우스에서 불완전마비 발병 연령을 지연시켰음을 보여준다. 도 7A는 불완전마비 발병 연령으로 측정했을 때 운동 증상 발병에 대한 크로몰린 치료의 유의한 효과가 있었고(Mantel-Cox 시험), TgSOD1-비히클 그룹의 경우 발병 연령 중앙값은 99일이고 TgSOD1-크로몰린 그룹의 경우 107일이었음을 도시한다. 도 7B는, 암컷 마우스에서, 크로몰린 치료 후 운동 증상 발병에서의 상당한 지연이 있었음을 도시한다(Mantel-Cox 시험). 도 7C는, 수컷 마우스에서, 크로몰린 치료가 운동 증상의 발병을 상당히 지연시켰음을 도시한다(Mantel-Cox 시험). 암컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 19; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 17; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 19; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). 수컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 18; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 21; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 21; 검정색), TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 8A-도 8C는 크로몰린 소듐이 암컷 TgSOD1 마우스의 생존율을 증가시켰음을 보여준다. 도 8A는 크로몰린 치료가 크로몰린 치료된 마우스에서 생존에 유의한 효과를 갖지 않았음을 도시한다(Mantel-Cox). 도 8B는 암컷 마우스에서만 생존에 대한 치료의 유의한 효과가 있었음을 도시한다(Mantel-Cox 시험). 도 8C는 수컷 마우스에 대해 치료 효과가 없었음을 보여준다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다. 암컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 19; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 17; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 19; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). 수컷 마우스: WtSOD1-비히클(n = 18; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 21; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 21; 검정색), TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 9A-도 9B는 크로몰린 치료가 신경보호적이고 TgSOD1 마우스에서 요추 척수 운동 뉴런의 생존을 증가시킨다는 것을 보여준다. 도 9A는 H&E 염색에 의해 시각화된 요추 척수 운동 뉴런의 대표적인 이미지를 보여준다. 도 9B는 일원 ANOVA 및 Dunn의 다중 비교 테스트가 TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 운동 뉴런 생존이 유의하게 증가하였음을 입증하는 것을 도시한다. WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 그룹과 비교하여 TgSOD1-비히클 그룹에서 운동 뉴런 수가 유의하게 감소하였다. 또한 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 운동 뉴런 수가 감소하였다. WtSOD1-비히클(n = 19; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린 755(n = 17; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 19; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 10A-도 10B는 크로몰린 치료가 TgSOD1 마우스의 척수에서 미세아교세포증을 변경하지 않음을 보여준다. 도 10A는 요추 척수의 미세아교세포가 Iba1-특이적 항체 및 DAB 염색을 사용하여 시각화되었음을 도시한다. 도 10B는 Iba1-양성 세포 면적의 백분율을 정량화한 결과 TgSOD1-비히클에 비해 TgSOD1-크로몰린 마우스에서 Iba1-양성 세포 면적의 백분율에 차이가 없는 것으로 나타났음을 보여준다. 일원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석에 의해 입증된 바와 같이 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 비히클 및 TgSOD1-크로몰린 둘 모두의 척수에서 Iba1-양성 세포 면적의 백분율이 유의하게 증가하였다. WtSOD1-비히클(n = 19; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 17; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 19; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 11A-도 11E는 크로몰린 치료가 TgSOD1 마우스의 척수에서 전염증성 사이토카인/케모카인의 수준을 감소시켰음을 보여주는 그래프이다. 도 11A: IL-1β. 도 11B: IL-5. 도 11C: IL-6. 도 11D: CXCL1. 도 11E: TNFα. 일원 ANOVA 및 사후 분석은 크로몰린 치료가 TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 CXCL1(도 11D) 및 TNFα(도 11E) 수준을 유의하게 감소시켰음을 나타내었다. 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 및 TgSOD1-크로몰린 그룹 둘 모두의 척수에서 IL-1β(도 11A), IL-5(도 11B), IL-6(도 11C), CXCL1(도 11D), 및 TNFα(도 11E)의 수준에 유의한 차이가 있었다. Tg와 Wt 그룹 사이에 IL-1β(도 11A), CXCL1(도 11D), 및 TNFα(도 11E)의 유의한 증가가 있었고, IL-5(도 11B) 및 IL-6(도 11C)의 유의한 감소가 있었다. WtSOD1-비히클(n = 15; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 19; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 17; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 12A-도 12G는 크로몰린 치료가 TgSOD1 마우스의 혈장에서 전염증성 사이토카인/c 792 헤모카인의 수준을 감소시켰음을 보여주는 그래프이다. 도 12B, 도 12D, 및 도 12E는 일원 ANOVA 및 사후 분석이 TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 IL-2(도 12B), IL-6(도 12D), 및 IL-10(도 12E) 수준의 유의한 감소를 나타냈음을 보여준다. WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 그룹 둘 모두에 비해 TgSOD1-비히클의 혈장에서 IL-2(도 12B), IL-6(도 12D), 및 IL-10(도 12E), 및 TNFα(도 12G) 수준의 유의한 차이가 있었다. 일원 ANOVA는 WtSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 마우스에서 CXCL1(도 12F) 수준의 증가 경향 그리고 WtSOD1-크로몰린 그룹에 비해 증가 경향을 보여주었다. 그룹 간에 IL-1β(도 12A) 및 IL-5(도 12C) 수준 사이에 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 마지막으로, TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 마우스에서 TNFα 수준(도 12G)이 감소하는 경향이 있었다. WtSOD1-비히클(n = 11; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 11; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 9; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 9; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 13A-도 13E는 크로몰린 치료가 척수에서 GPR35 수준을 증가시켰음을 보여준다. 도 13A는 척수 샘플로부터의 GPR35 및 b-액틴의 대표적인 면역블롯을 보여준다. 도 13B는 척수 웨스턴 블롯의 일원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석이 TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린에서 GPR35 수준의 증가 경향이 있었음을 보여주는 것을 도시한다. WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린과 비교하여 TgSOD1-비히클 그룹에서 GPR35 수준이 유의하게 감소하였다. TgSOD1-크로몰린 그룹과 어느 한 야생형 그룹 사이에 GPR35 수준에는 유의한 차이가 없었다. 도 13C는 GPR35(적색), NeuN(녹색)의 대표적인 면역형광 이미지, 및 요추 척수로부터 병합된 이미지를 보여준다. GPR35는 뉴런 마커인 NeuN과 공동-국소화된다. 도 13D는 일원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석이 TgSOD1-비히클에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 GPR35 수준의 유의한 증가를 보여주었음을 도시한다. 도 13E는 일원 ANOVA 및 사후 분석이 TgSOD1-비히클에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 뉴런 GPR35 수준의 유의한 증가를 보여주었음을 도시한다. 웨스턴 블롯의 경우 WtSOD1-비히클(n = 21; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 19; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 18; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). 면역형광의 경우 WtSOD1-비히클(n = 6; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 6; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 6; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 6; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
도 14A-도 14B는 크로몰린 치료가 TgSOD1 마우스의 척수 또는 혈장에서 MCP-1 수준을 변경하지 않음을 보여준다. 도 14A는 일원 ANOVA 및 사후 분석이 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 그룹 둘 모두에 비해 TgSOD1-비히클 마우스의 척수에서 MCP-1 수준의 유의한 증가를 보여주었음을 도시한다. 그러나, 크로몰린 치료는 TgSOD1-비히클과 비교하여 TgSOD1-크로몰린의 척수에서 MCP-1 수준에 아무런 영향을 미치지 않았다. 도 14B는 일원 ANOVA 및 사후 분석이 MCP-1 수준이 어떤 그룹의 혈장에서도 변경되지 않았음을 보여주는 것을 도시한다. 척수의 경우 WtSOD1-비히클(n = 15; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 19; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 17; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 17; 적색). 혈장의 경우 WtSOD1-비히클(n = 11; 밝은 회색), WtSOD1-크로몰린(n = 11; 진한 회색), TgSOD1-비히클(n = 9; 검정색), 및 TgSOD1-크로몰린(n = 9; 적색). *는 TgSOD1-비히클과 Tg-SOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; ^는 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; #은 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다; @는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클의 차이를 나타낸다; %는 TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-크로몰린의 차이를 나타낸다. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001, 동일한 통계적 유의성이 각 기호와 연관된다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시된다.
상세한 설명
개요
본 개시는 다른 치료제와 함께 천식의 치료에 사용되는 FDA 승인 약물인 크로몰린에 대한 잠재적으로 새로운 작용 메커니즘을 입증한다. 본원에 기재된 바와 같이, 크로몰린은 M1 공격적 상태에서 M2 식세포 상태로 면역 미세아교세포 활성화를 조절하는 상당한 능력을 나타내며 이는 운동 뉴런 퇴화를 늦추거나 중단시킬 것으로 예상된다. M2-상태 미세아교세포는 과도한 염증성 사이토카인을 삼키며, 이렇게 함으로써, 시냅스 및 신경 손상의 확산을 방지한다. 크로몰린은 피하 주사 형태(Iradica-Q)로 이용 가능하여, 개선된 생체이용률을 제공한다. 추가 연구에 따르면 크로몰린은 베타-아밀로이드 및 알파-시누클레인 펩티드에 결합하여, 고차 응집체로의 중합반응을 억제한다. 이러한 펩티드의 응집은 가족성 ALS(FALS) 대상체에서 관찰되었으며, 응집은 SOD1 단백질의 돌연변이에 의해 초래된다. 크로몰린은 SOD1 단량체의 응집에 대한 억제제로 작용할 수 있다. 시험관내 연구에 따르면 크로몰린은 SOD1 유전자를 억제한다. 더욱이, 연구에 따르면 크로몰린은 동물 모델 및 인간 약동학 연구 둘 모두에서 혈액뇌 장벽을 통과한다. 건강한 지원자와 알츠하이머병 환자의 혈장 및 CSF 둘 모두에서 크로몰린의 약동학이 연구되었다.
크로몰린 피하 주사 후 혈장 생체이용률은 SOD1 축적 및 침전을 방해하기에 충분한 사이토카인, 자유 라디칼, 및 뇌의 독소와 관련된 신경 염증을 개선하는 농도로 번역된다.
SOD1 트랜스제닉 마우스(뇌에서 SOD1 부담을 일으키는 마우스)를 사용한 동물 모델에서의 추가 연구는 복강내(IP) 투여된 크로몰린의 이점에 대한 통계적으로 유의한 증거를 제공하였다. 이러한 결과는 Iradica-Q 치료가 ALS의 트랜스제닉 동물 모델에서 뇌 SOD1 부담으로 인한 거동 저하를 늦출 가능성이 있음을 나타낸다.
본원에 기술된 바와 같이, 크로몰린 소듐 치료는 질병 발병 및 진행을 지연시키고, 발 그립 지구력(PaGE) 작업에서 운동 결핍을 감소시켰으며, SOD1 G93A 마우스 모델에서 생존율(암컷 마우스만)을 개선하였다. 또한, 크로몰린 치료는 요추 척수 운동 뉴런을 크게 절약하고 TgSOD1 마우스의 척수 및 혈장에서 전염증성 사이토카인/케모카인 수준을 감소시켰다. 마지막으로, 크로몰린 치료는 뉴런의 GPR35 수준을 증가시켰다. 아울러, 이러한 결과는 크로몰린이 GPR35의 활성화를 통해 TgSOD1 마우스의 면역 반응을 조절할 수 있음을 시사한다.
특정 구체예에서, 크로몰린은 비만 세포 탈과립화를 억제하고 천식, 알레르기 비염, 비만세포증, 및 결막염을 치료하는데 사용된다. 동물 모델에서, 크로몰린 치료는 비만 세포의 활성화 및 탈과립화를 약화시키고, 히스타민 발현 및 대식세포의 침윤을 감소시킨다. 또한, 크로몰린은 IL-1β, IL-6, TNFα, CCL3 및 MCP1과 같은 전염증성 케모카인 및 사이토카인의 발현을 감소시킨다. 특정 구체예에서, 크로몰린은 아밀로이드 침착을 최소화하면서 어린 Tg2576 AD 333 마우스에서 Aβ 응집을 감소시킨다. 크로몰린은 또한 APPSwedish-발현 Tg2576 마우스에서 뇌 Aβ 수준에 상당한 영향을 미친다. 플라크에 미세아교세포의 동원 및 Aβ의 향상된 미세아교세포 흡수에 대한 이러한 관찰된 크로몰린의 효과는 크로몰린이 미세아교세포 활성화 상태를 신경 염증을 선호하는 것에서 포식작용을 촉진하는 것으로 전환할 수 있음을 시사한다.
미세아교세포증은 WtSOD1 마우스에 비해 TgSOD1의 척수에서 유의하게 증가한다; 그러나, 본원에 기재된 바와 같이, 비히클 및 크로몰린 치료된 TgSOD1 마우스 사이에는 차이가 없었다. 그러나, 크로몰린에 대한 반응으로 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 변화는 미세아교세포 활성화 상태를 전염증성에서 항염증성으로 전환하도록 유도할 수 있다. 염증에 대한 크로몰린 치료의 효과를 추가로 설명하기 위해, 척수에서 사이토카인 및 케모카인의 변화를 측정하였다. 전염증성 사이토카인 IL-1β와 TNFα, 및 케모카인 CXCL1은 척수에서 유의하게 증가한 반면, 사이토카인 IL-5 및 IL-6은 WtSOD1 마우스에 비해 TgSOD1 마우스의 척수에서 감소하였다. 중요한 것은 크로몰린 소듐 치료가 TgSOD1 마우스의 척수에서 CXCL1 및 TNFα 수준을 크게 감소시켰다는 것이다.
CXCL1은 호중구가 염증 부위로 이동하는 것을 매개하는 화학주성 사이토카인이다; ALS 환자에서 CXCL1 수준은 현저하게 증가한다. 특히, CXCL1 수준은 ALS 환자로부터 분리된 단핵구 및 ALS 환자-유래 섬유모세포에서 증가한다. 특정 구체예에서, 본 개시는 CXCL1 수준이 ALS 환자에서 이전에 보고된 것과 유사하게 TgSOD1 마우스의 척수에서 증가한다는 발견에 관한 것이다. CXCL1이 AD 환자의 혈액에서 뇌로의 단핵구의 경내피 이동에 기여하는 것으로 나타났기 때문에, 이것은 ALS 환자에서 대식세포에 의한 말초 신경 침습에 기여할 수 있다. 따라서, 크로몰린을 사용하여 CXCL1 발현을 낮추는 것은 ALS 환자에서의 염증 반응을 감소시키는데 매우 유리할 수 있다.
특정 구체예에서, 크로몰린 소듐 치료는 또한 TgSOD1 마우스의 척수에서 TNFα 수준을 유의하게 감소시켰다. 별아교세포 및 뉴런은 TNFα를 생성할 수 있지만, 미세아교세포는 신경염증 동안 TNFα 방출의 주요 공급원인 것으로 추정된다. TNFα는 GLT-1 발현을 감소시키고 Ca2+ 투과성-AMPAR의 신속한 막 삽입을 유도함으로써 요추 척수 운동 뉴런에 대한 AMPAR 매개 흥분독성을 강화하는 것으로 나타났다. 따라서, 특정 구체예에서, 크로몰린 치료는 AMPA 매개 흥분독성을 감소시킴으로써 이의 신경보호 효과의 일부를 제공할 수 있다. 특정 구체예에서, 크로몰린 소듐에 대한 내인성 표적 수용체인 GPR35의 증가가 치료 후에 관찰되었다.
GPR35는 주로 면역 세포에서 발현되지만 심혈관, 염증성, 및 신경 질환과 관련되어 왔다. GPR35는 아스피린의 항염증 효과 및 크로몰린의 항알레르기 효과에 기여한다. 염증에서의 역할 외에도, 말초 신경계 뉴런에서 GPR35의 활성화는 시냅스 전달과 관련된 메커니즘을 약화시킨다. 구체적으로, 교감 뉴런에서 GPR35의 활성화는 뒤뿌리 신경절에서 전압-개폐 Ca2+ 채널 및 포스콜린-유도 순환-AMP(cAMP) 생성을 억제하였다. 또한, CNS에서, GPR35 활성화는 해마의 CA1 영역에서 뉴런 발화를 억제하였다. 아울러, 이러한 결과는 GPR35 활성이 신경 흥분성 및 시냅스 전달을 변경하므로, 염증 반응을 완화하는 것 외에도, GPR35의 활성화가 또한 ALS에서 흥분독성을 방지함으로써 추가 치료 이익을 제공할 수 있음을 시사한다.
IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-6, 및 IL-8과 같은 전염증성 사이토카인은 ALS 환자의 혈장 또는 혈청 샘플에서 증가하는 것으로 보고되었으며, 질병 진행에 따라 수준이 증가한다. 더욱이, 말초 혈액 염증성 사이토카인은 ALS에 대한 진단 바이오마커로 제안되었다. 따라서, 특정 구체예에서, 본 개시는 치료를 위한 약역학적 바이오마커를 확인하기 위해 주변부에서 크로몰린 소듐 치료의 효과에 관한 것이다. 사이토카인 IL-2, IL-6, 및 IL-10은 WtSOD1 마우스에 비해 TgSOD1 마우스의 혈장에서 증가하였다. 또한, 척수에서의 발견과 유사하게, 야생형 마우스에 비해 TgSOD1 마우스의 혈장에서 TNFα 및 CXCL1 수준의 유의한 증가가 관찰되었다. 크로몰린 치료는 IL-2, IL-6, 및 IL-10의 수준을 현저히 감소시켰을 뿐만 아니라 혈장에서 TNFα 수준을 감소시키는 경향을 가졌는데, 이는 크로몰린 치료가 TgSOD1 마우스의 말초 혈액에서 염증을 감소시킨다는 것을 시사한다. IL-2 및 TNFα는 전염증성 사이토카인으로 간주되지만, IL-6는 전염증 및 항염증 특성을 모두 나타낸다. 흥미롭게도, IL-10은 대식세포의 대사적 재프로그래밍을 통해 염증 반응을 억제하는 것으로 나타났다. 특정 구체예에서, 크로몰린 치료는 ALS에 대한 잠재적인 진단 바이오마커인 말초 혈액 염증성 사이토카인의 수준을 감소시켰다. 비록 척수에서 MCP-1 수준이 증가하였고 TgSOD1 마우스의 혈장과 ALS 환자의 뇌척수액에서는 증가하지 않았지만, 크로몰린 치료는 TgSOD1 마우스의 척수 또는 혈장에서 407 MCP-1 수준에 영향을 미치지 않았다.
특정 구체예에서, 본 개시는 크로몰린 소듐 치료(6.3 mg/kg)가 PaGE 작업의 성능을 상당히 개선시켰고 수컷 및 암컷 마우스 둘 모두에서 질병의 발병을 지연시켰다는 발견에 관한 것이다. 그러나, 개선된 생존에 대해서는 암컷 특이적 효과가 있었다. 연구는 수컷 마우스에 비해 트랜스제닉 암컷 SOD1 G93A 마우스에서 뚜렷한 질병 진행 및 더 큰 치료적 개선을 제안한다. 특히, 암컷 TgSOD1 G93A 마우스는 수컷 코호트에 비해 연장된 생존율을 보이는 것으로 나타났다. 특정 구체예에서, 크로몰린 소듐은 암컷 TgSOD1 마우스에서 더 큰 신경보호 효과를 나타낸다. 임의의 특정 이론에 구속되길 원치 않으며, 이러한 결과에 대한 대안적인 설명은 크로몰린과 여성 성 호르몬 수용체의 상호작용 가능성이다.
아울러, 이러한 결과는 크로몰린 소듐 치료가 SOD1 G93A 마우스 모델에서 질병 발병 및 진행을 지연시키고, 운동 결핍(PaGE)을 감소시키고, 생존율(암컷 마우스만)을 개선시킨다는 것을 나타낸다. 또한, 크로몰린 치료는 요추 척수 운동 뉴런의 생존을 크게 증가시켰다. 크로몰린 치료는 미세아교세포증에 영향을 주지 않았지만, SOD1 G93A 마우스의 척수 및 혈장에서 전염증성 사이토카인 및 케모카인 수준을 감소시켰는데, 이는 크로몰린이 미세아교세포 활성화 상태를 (항염증쪽으로) 변경함을 시사한다. 크로몰린 치료는 또한 GPR35 수준을 증가시켰고, 이는 일부 크로몰린-매개 효과가 GPR35 활성화를 통해 발생할 수 있음을 시사한다. 따라서, 다른 제제와 조합된 크로몰린은 ALS의 치료에 유용하다.
정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 일반적으로, 본원에서 설명된 화학, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 세포 및 암 생물학, 신경생물학, 신경화학, 바이러스학, 면역학, 미생물학, 약리학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 그 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것들이다.
본 개시의 방법 및 기술은 달리 지시되지 않는 한 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Principles of Neural Science", McGraw-Hill Medical, New York, N.Y. (2000); Motulsky, "Intuitive Biostatistics", Oxford University Press, Inc. (1995); Lodish et al., "Molecular Cell Biology, 4th ed.", W. H. Freeman & Co., New York (2000); Griffiths et al., "Introduction to Genetic Analysis, 7th ed.", W. H. Freeman & Co., N.Y. (1999); and Gilbert et al., "Developmental Biology, 6th ed.", Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (2000)] 참조.
본원에서 사용되는 화학 용어는, 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 문헌["The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms", Parker S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco, C.A. (1985)]에 예시된 바와 같이 당업계에서 통상적인 사용법에 따라 사용된다.
"알킬" 기 또는 "알칸"은 완전히 포화된 직쇄 또는 분지된 비방향족 탄화수소이다. 통상적으로, 직쇄 또는 분지된 알킬 기는 달리 정의되지 않는 한 1 내지 약 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는다. 직쇄 및 분지된 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 2차-부틸, 3차-부틸, 펜틸, 헥실, 펜틸 및 옥틸을 포함하다. C1-6 직쇄 또는 분지된 알킬 기는 "저급 알킬" 기라고도 지칭된다.
더욱이, 명세서, 실시예, 및 청구 범위 전체에서 사용되는 용어 "알킬"(또는 "저급 알킬")은 "비치환된 알킬" 및 "치환된 알킬"을 모두 포함하는 것으로 의도되며, 후자는 탄화수소 백본의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환기를 갖는 알킬 모이어티를 지칭한다. 그러한 치환기는, 달리 명시되지 않는 경우, 예를 들어, 할로겐(예를 들어, 플루오로), 하이드록실, 카르보닐(예를 들어, 카르복실, 알콕시카르보닐, 포르밀, 또는 아실), 티오카르보닐(예를 들어, 티오에스테르, 티오아세테이트, 또는 티오포르메이트), 알콕시, 포스포릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프하이드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 치환된 알킬 상의 치환기는 C1-6 알킬, C3-6 사이클로알킬, 할로겐, 카르보닐, 시아노, 또는 하이드록실로부터 선택된다. 보다 바람직한 구체예에서, 치환된 알킬 상의 치환기는 플루오로, 카르보닐, 시아노, 또는 하이드록실로부터 선택된다. 당업자는 탄화수소 사슬 상에 치환된 모이어티가, 적절한 경우, 그 자체로 치환될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 치환된 알킬의 치환기는 아미노, 아지도, 이미노, 아미도, 포스포릴(포스포네이트 및 포스피네이트 포함), 설포닐(설페이트, 설폰아미도, 설파모일 및 설포네이트 포함), 및 실릴 기의 치환 및 비치환된 형태 뿐만 아니라 에테르, 알킬티오, 카르보닐(케톤, 알데하이드, 카르복실레이트, 및 에스테르 포함), -CF3, -CN 등을 포함할 수 있다. 예시적인 치환된 알킬은 아래에 기술된다. 사이클로알킬은 알킬, 알케닐, 알콕시, 알킬티오, 아미노알킬, 카르보닐-치환된 알킬, -CF3, -CN 등으로 추가로 치환될 수 있다.
용어 "Cx-y"는 아실, 아실옥시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 또는 알콕시와 같은 화학적 모이어티와 함께 사용될 때, 사슬에 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 기를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "Cx-y 알킬"은 할로알킬 기를 포함하여, 사슬에 x 내지 y개의 탄소를 함유하는 직쇄 알킬 및 분지쇄 알킬 기를 포함하는 치환 또는 비치환된 포화된 탄화수소 기를 지칭한다. 바람직한 할로알킬 기는 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 및 펜타플루오로에틸을 포함한다. 용어 "C2-y 알케닐" 및 "C2-y 알키닐"은 상기 기재된 알킬과 길이 및 가능한 치환에 있어 유사하지만, 적어도 하나의 이중 또는 삼중 결합을 각각 포함하는 치환 또는 비치환된 불포화된 지방족 기를 지칭한다.
상기 모든 것, 그리고 본 출원에서 언급된 임의의 다른 간행물, 특허 및 공개된 특허 출원은 본원에 참조로서 구체적으로 포함된다. 상충되는 경우, 구체적인 정의를 포함하는 본 발명의 명세서가 우선할 것이다.
용어 "환자" 또는 "대상체"는 특정 치료를 필요로 하는 포유동물을 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 환자는 영장류, 개, 고양이, 또는 말이다. 다른 바람직한 구체예에서, 환자는 인간이다.
질환 또는 환자를 "치료하는" 것은 임상 결과를 포함하여, 유리하거나 요망되는 결과를 획득하기 위한 단계를 수행하는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되고 당업계에서 잘 이해되는 바와 같이, "치료"는 임상 결과를 포함하여, 유리하거나 요망되는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 유리하거나 요망되는 임상 결과는, 검출 가능하든 불가능하든, 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않음) 상태, 질병 확산 방지, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 개선, 및 관해(부분적이든 전체적이든)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우의 예상 생존에 비해 연장된 평균 생존을 의미할 수 있다. 또한, 이 용어는 지지적 치료, 즉, 관련 질병, 병리학적 상태, 또는 장애의 개선을 위한 또 다른 특정 요법을 보충하기 위해 사용되는 치료를 포함한다.
화합물의 투여와 관련하여, 용어 "투여하는"은 조성물 및/또는 이의 약학적 조성물을 대상체에게 제공하는 임의의 방법을 지칭한다. 그러한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 경구 투여, 경피 투여, 흡입에 의한 투여, 코 투여, 국소 투여, 질내 투여, 안과 투여, 귀내 투여, 뇌내 투여, 직장 투여, 및 주사 가능한 예를 들어 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 유리체내 투여 등을 포함하는 비경구 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 투여는 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 다양한 양태에서, 제조물은 치료적으로 투여될 수 있고; 즉, 기존 질병 또는 질환을 치료하기 위해 투여된다. 추가의 다양한 양태에서, 제조물은 예방적으로 투여될 수 있고; 즉, 질병 또는 질환의 예방을 위해 투여된다.
용어 "공동-투여" 및 "공동-투여하는"은 치료제가 환자에서 동시에 어느 정도 존재하는 한, 동시 투여(동시에 2개 이상의 치료제의 투여) 및 시간 변경 투여(추가 치료제 또는 치료제들의 투여와 상이한 시간에 하나 이상의 치료제의 투여)를 모두 지칭한다.
용어 "유효량"은 요망되는 결과를 달성하거나 요망되지 않는 상태에 영향을 미치기에 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, "치료적 유효량"은 요망되는 치료 결과를 달성하거나 요망되지 않는 증상에 영향을 미치기에 충분하지만, 일반적으로 부작용을 유발하기에는 불충분한 양을 지칭한다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 치료적 유효 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용된 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로; 사용된 특정 화합물의 배출 속도; 치료 지속기간; 사용된 특정 화합물과 조합하여 또는 동시에 사용되는 약물 및 의학 분야에 널리 공지된 유사 인자를 포함하는 다양한 인자에 의존적일 것이다. 예를 들어, 요망되는 치료 효과를 달성하는데 필요한 수준보다 낮은 수준으로 화합물의 용량을 시작해서 요망되는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 충분히 당업계의 기술 내에 있다. 요망되는 경우, 효과적인 일일 용량은 투여 목적을 위해 다중 용량으로 분할될 수 있다. 결과적으로, 단일 용량 조성물은 일일 용량을 구성하기 위해 그러한 양 또는 이의 약수가 되는 양을 함유할 수 있다. 투여량은 임의의 금기사항이 있는 경우 개별 의사에 의해 조정될 수 있다. 투여량은 다양할 수 있고, 일일 또는 며칠 동안, 매일 1회 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 주어진 부류의 의약품에 대한 적절한 투여량에 대한 지침은 문헌에서 찾을 수 있다. 추가의 다양한 양태에서, 제조물은 "예방적 유효량"; 즉, 질병 또는 질환의 예방에 효과적인 양으로 투여될 수 있다.
조합 요법
본 발명의 한 양태는 조합 요법에 관한 것이다. 이러한 유형의 요법은 활성 성분의 공동-투여가 단일 치료제만을 투여함으로써 달성되는 치료 효과보다 더 큰 치료 효과를 달성하기 때문에 유리하다.
특정 구체예에서, 2개 이상의 치료제의 공동-투여는 단일 치료제만의 투여에 의해 달성되는 치료 효과보다 더 큰 치료 효과를 달성한다. 이와 관련하여, 조합 요법은 효과적이다. 한 치료제의 치료 효과는 다른 치료제의 공동-투여에 의해 증가된다.
특정 구체예에서, 2개 이상의 치료제의 공동-투여는 각각의 단일 치료제의 투여에 의해 달성된 치료 효과의 합과 대략 동일한 치료 효과를 달성한다. 이러한 구체예에서, 조합 요법은 "부가적"이라고 한다.
특정 구체예에서, 2개 이상의 치료제의 공동-투여는 상승 효과, 즉, 조합물의 개별 성분의 치료 효과의 합보다 더 큰 치료 효과를 달성한다.
조합 요법에 포함되는 활성 성분은 단일 투여 형태를 통해 또는 각각의 활성제의 개별 투여에 의해 함께 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 치료제는 단일 투여 형태로 투여된다. 특정 구체예에서, 제1, 제2, 및 제3 치료제는 단일 투여 형태로 투여된다. 제제는 비경구 투여 등을 위한 단일 정제, 알약, 캡슐, 또는 용액으로 제형화될 수 있다.
특정 구체예에서, 치료제는 단일 투여 형태로 투여되며, 여기서 각각의 개별 치료제는 다른 치료제(들)와 분리된다. 그러한 방식으로 투여 형태를 제형화하면 투여될 때까지 잠재적으로 반응성인 치료제의 구조적 완전성을 유지하는데 도움이 된다. 이러한 유형의 제형은 투여 형태의 제조 및 장기간 저장 동안 유용할 수 있다. 특정 구체예에서, 치료제는 캡슐 내에 수용된 구분된 영역 또는 별개의 캐플릿 등을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 치료제는 정제에 의해 포함된 분리된 층으로 제공된다.
대안적으로, 치료제는 별도의 조성물, 예를 들어, 별도의 정제 또는 용액으로 투여될 수 있다. 하나 이상의 활성제는 다른 활성제(들)와 동시에 투여될 수 있거나 활성제는 간헐적으로 투여될 수 있다. 치료제의 투여 사이의 시간 간격은 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해 조정될 수 있다. 특정 예에서, 하나 이상의 치료제(들)는 다른 치료제(들)를 투여한지 단 몇 분(예를 들어, 약 1, 2, 5, 10, 30, 또는 60분) 후에 투여될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 치료제(들)는 다른 치료제(들)를 투여한지 수 시간(예를 들어, 약 2, 4, 6, 10, 12, 24, 또는 36시간) 후에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 나머지 치료제(들)의 투여 사이에 하나 이상의 치료제(들)의 1회 초과의 투여량을 투여하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 하나의 치료제는 다른 치료제(들)를 투여한지 2시간 후에 그리고 다시 10시간 후에 투여될 수 있다. 중요하게는, 조합 요법의 전체적인 치료 효과가 조합 요법의 조합 또는 상승 효과에 부분적으로 기인하도록 각 활성 성분의 치료 효과가 각 치료제의 지속기간의 적어도 일부 동안 겹치는 것이 필요하다.
활성제의 투여량은 일반적으로 조합물의 각 제제의 약역학적 특성, 활성제(들)의 투여 방식 및 경로, 치료되는 환자의 건강, 요망되는 치료 정도, 있는 경우, 동시 요법의 특성 및 종류, 및 치료 빈도 및 요망되는 효과의 특성을 포함하는 다수의 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 활성제의 투여량 범위는 종종 하루에 약 0.001 내지 약 250 mg/체중 kg 범위이다. 체중이 약 70 kg인 보통 성인의 경우, 약 0.1 내지 약 25 mg/체중 kg 범위의 투여량이 통상적으로 바람직하다. 그러나, 이러한 일반적인 투여량 범위에서의 약간의 가변성은 치료되는 대상체의 연령 및 체중, 의도된 투여 경로, 투여되는 특정 제제 등에 따라 필요할 수 있다. 2개 이상의 다른 활성제가 조합 요법에서 함께 사용되기 때문에, 각 제제의 효능 및 이들을 함께 사용하여 달성되는 상호작용 효과를 고려해야 한다. 중요하게도, 특정 포유동물에 대한 투여량 범위 및 최적 투여량의 결정은 또한 본 개시의 이점을 갖는 당업자의 능력 내에 있다.
특정 구체예에서, 약학적 조합물이 제2 성분에 비해 비교적 많은 양의 제1 성분을 갖는 것이 유리할 수 있다. 특정 예에서, 제1 활성제 대 제2 활성제의 비는 약 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 15:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 또는 5:1이다. 특정 구체예에서, 약학적 제제의 보다 동등한 분포를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 특정 예에서, 제1 활성제 대 제2 활성제의 비는 약 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 또는 1:4이다. 특정 구체예에서, 약학적 조합물이 제1 성분에 비해 비교적 많은 양의 제2 성분을 갖는 것이 유리할 수 있다. 특정 예에서, 제2 활성제 대 제1 활성제의 비는 약 30:1, 20:1, 15:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 또는 5:1이다. 특정 예에서, 제2 활성제 대 제1 활성제의 비는 약 100:1, 90:1, 80:1, 70:1, 60:1, 50:1, 또는 40:1이다. 중요하게는, 제1 치료제 및 제2 치료제의 상기 확인된 조합 중 임의의 것을 포함하는 조성물은 하루에 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6회 이상의 분할된 용량으로 투여될 수 있거나 요망되는 결과를 얻기 위해 효과적인 방출 속도를 제공하는 형태로 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 투여 형태는 제1 및 제2 활성제를 모두 함유한다. 한 구체예에서, 투여 형태는 하루에 한 번만 투여되어야 하며 투여 형태는 제1 및 제2 활성제를 모두 함유한다.
예를 들어, 인간에게 정맥내 투여하기 위한 제형은 약 0.1 mg 내지 약 5 g의 제1 치료제 및 약 0.1 mg 내지 약 5 g의 제2 치료제를 함유할 수 있으며, 이들 둘 모두는 총 조성물의 약 5 내지 약 95% 범위의 적절하고 편리한 양의 담체 물질과 화합된다. 단위 투여량은 일반적으로 약 0.5 mg 내지 약 1500 mg의 제1 치료제 및 0.5 mg 내지 약 1500 mg의 제2 치료제를 함유할 것이다. 바람직한 구체예에서, 투여량은 약 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 800 mg, 또는 1000 mg 등등, 최대 약 1500 mg의 제1 치료제이다. 바람직한 구체예에서, 투여량은 약 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 800 mg, 또는 1000 mg 등등, 최대 약 1500 mg의 제2 치료제이다.
투여량 및 간격은 조절 효과 또는 이들 각각의 최소 유효 농도(MEC)를 유지하기에 충분한 특정 활성 모이어티 또는 모이어티들의 혈장 수준을 제공하기 위해 개인 또는 그룹 기준으로 조정될 수 있다. MEC는 각 화합물 및 개인에 따라 다르지만, 시험관내 데이터로부터 추정될 수 있다. MEC를 달성하는데 필요한 투여량은 개인의 특성 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 그러나, HPLC 검정 또는 생물검정을 사용하여 혈장 농도를 결정할 수 있다. 특정 구체예에서, 용량은 감소될 수 있다. 특정 구체예에서, 용량은 증가될 수 있다. 더욱이, 장기간 치료 요법은 특정 화합물 또는 화합물들에 관한 투여량을 증가 및 감소시키는 교대 기간을 포함할 수 있다.
상승작용 및 증강
용어 "상승적"은 임의의 2개 이상의 단일 제제의 부가 효과보다 더 효과적인 조합을 지칭한다. 상승 효과는 더 적은 양(용량)의 개별 요법을 사용하여 질병을 효과적으로 치료할 수 있게 한다. 더 낮은 용량은 효능 감소 없이 독성을 낮춘다. 또한, 상승 효과는 효능을 개선시킬 수 있다. 마지막으로, 상승 효과는 임의의 단일 요법에 비해 질병의 예방 또는 감소를 개선할 수 있다.
조합 요법은 어느 한 약물이 단독으로 사용될 때 일반적으로 요구되는 것보다 더 낮은 용량의 제1 치료제 또는 제2 치료제(본원에서 "명백한 일원 상승작용"으로 지칭됨), 또는 더 낮은 용량의 둘 모두의 치료제(본원에서 "이원 상승작용"으로 지칭됨)의 생성물을 허용할 수 있다.
조합 요법은 임의의 약물이 단독으로 사용될 때 일반적으로 요구되는 것보다 더 낮은 용량의 어느 하나의 치료제(본원에서 "명백한 일원 상승작용"으로 지칭됨) 또는 더 낮은 용량의 모든 치료제의 생성물을 허용할 수 있다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 치료제(들)와 나머지 치료제(들) 사이에 나타나는 상승작용은, 다른 치료제의 투여량 없이 투여되는 경우 치료제 중 하나의 투여량이 치료용량 이하의 용량(sub-therapeutic)이 되게 한다.
용어 "증강" 또는 "증강시키다"는 화합물 중 하나가 환자에게 투여되는 다른 화합물 또는 화합물들의 치료 효과를 증가시키거나 향상시키는 조합을 지칭한다. 일부 예에서, 증강은 특정 요법의 효능, 내약성, 또는 안전성, 또는 이들의 임의의 조합을 개선할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효 용량의 하나 이상의 치료제(들)와 함께 상기 하나 이상의 치료제(들)의 치료 효과를 증강시키는데 효과적인 또 다른 치료제의 용량을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 환자에게 다른 치료제를 투여함으로써 환자에서 하나 이상의 치료제(들)의 치료 효과를 증강시키는 방법에 관한 것이다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 발명은 부분적으로 나머지 치료제(들)와 함께 치료 효과를 제공하기에 충분한 양의 하나 이상의 치료제(들)의 상승적 조합물에 관한 것이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 하나 이상의 치료제(들) 단독의 용량으로 수득된 것보다 적어도 약 2배(또는 적어도 약 4, 6, 8, 또는 10배) 더 큰 치료 효과가 달성된다. 특정 구체예에서, 상승적 조합물은 하나 이상의 치료제(들) 단독의 용량으로 수득된 것보다 최대 약 20, 30 또는 40배 더 큰 치료 효과를 제공한다. 그러한 구체예에서, 상승적 조합물은 본원에서 "명백한 일원 상승작용"으로 지칭되는 것을 나타내며, 이는 나머지 치료제(들)의 용량이 하나 이상의 치료제(들)의 효과를 상승적으로 강화시키지만, 하나 이상의 치료제(들)의 용량이 나머지 치료제(들)의 효과를 크게 강화시키는 것으로는 보이지 않는 것을 의미한다.
특정 구체예에서, 활성제의 조합물은 이원 상승작용을 나타내며, 이는 제2 치료제가 제1 치료제의 효과를 강화시키고, 제1 치료제가 제2 치료제의 효과를 강화시키는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 다른 구체예는 제2 치료제 및 제1 치료제의 조합물에 관한 것이며, 여기서 각 약물의 용량은 약물 간의 상승작용으로 인해 감소되고, 감소된 용량의 약물 조합물로부터 유래된 치료 효과는 향상된다. 이원 상승작용은 제1 치료제 대 제2 치료제의 효능 비율로 인해 실제 투여량에서 항상 쉽게 명백한 것은 아니다. 예를 들어, 이원 상승작용은 한 치료제가 다른 치료제에 비해 훨씬 더 큰 치료 효능을 나타낼 때 검출하기 어려울 수 있다.
조합 요법의 상승 효과는 생물학적 활성 검정으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 치료제는 EC90 값에 기반하여 대략적으로 등역가 치료 효과를 제공하도록 설계된 몰비로 혼합된다. 이후, 각 조합에 대해 3개의 다른 몰비를 사용하여 상대적 효능 추정치의 변동성을 허용한다. 이러한 몰비는 희석 시리즈 내내 유지된다. 상응하는 단일요법은 또한 표준 1차 검정 포맷을 사용하여 조합 치료와 병행하여 평가된다. 조합 치료의 치료 효과와 단일요법의 치료 효과의 비교는 상승 효과의 측정값을 제공한다. 조합 분석 설계에 대한 자세한 내용은 문헌[B E Korba (1996) Antiviral Res. 29:49. Analysis of synergism, additivity, or antagonism can be determined by analysis of the aforementioned data using the CalcuSyn™ program (Biosoft, Inc.)]에서 찾아볼 수 있다. 이 프로그램은 Monte Carlo 통계 패키지를 사용한 통계적 평가와 조합된 Chou 및 Talalay의 널리 인정된 방법을 사용하여 약물 상호작용을 평가한다. 데이터는 중앙값-효과 및 용량-효과 플롯, 아이소볼로그램, 및 표준 편차와 함께 조합 지수[CI] 플롯을 포함하는 여러 상이한 포맷으로 표시된다. 후자 분석의 경우, CI가 1.0보다 크면 길항작용을 나타내고 CI가 1.0보다 작으면 상승작용을 나타낸다.
본 발명의 조성물은 중등도 내지 중증도의 질병 사례를 완화시킬 수 있는 기회를 제공한다. 제1 및 제2 치료제의 본 발명의 조합물에 의해 제공되는 상승적 또는 부가적 또는 증강 효과로 인해, 각각의 치료제의 감소된 투여량을 사용하는 것이 가능할 수 있다. 제1, 제2, 및 제3 치료제의 본 발명의 조합물에 의해 제공되는 상승적 또는 부가적 또는 증강 효과로 인해, 각각의 치료제의 감소된 투여량을 사용하는 것이 가능할 수 있다. 더 적은 양의 약물을 사용하면, 각각에 관련된 부작용이 수와 정도에 있어 감소할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 조합물은 일부 환자가 특히 민감한 부작용을 회피한다.
약학적 조성물 및 제형
특정 구체예에서, 본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체와 함께 본원에 기재된 하나 이상의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는 이러한 조성물은 경구, 비경구, 비내, 설하 또는 직장 투여용, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여용 정제, 알약, 캡슐, 분말, 과립, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 계량된 에어로졸 또는 액체 스프레이, 점적제, 앰풀, 자동-주사기 장치 또는 좌제와 같은 단위 투여 형태이다. 또한 화합물은 적절한 양의 약물을 연속적인 방식으로 전달하도록 설계된 경피 패치에 통합될 수 있는 것으로 생각된다.
분말 및 정제와 같은 고체 조성물을 제조하기 위해, 주요 활성 성분을 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 통상적인 정제 성분, 예를 들어, 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 디칼슘 포스페이트 또는 검, 및 균질한 혼합물을 함유하는 고체 예비제형 조성물을 형성하기 위한 다른 약학적 희석제, 예를 들어, 물과 혼합한다. 이러한 예비제형 조성물이 균질한 것으로 언급될 때, 이는 활성 성분이 조성물 전체에 고르게 분산되어 조성물이 동등하게 효과적인 단위 투여 형태로 용이하게 세분될 수 있음을 의미한다.
일부 구체예에서, 건조 분말 조성물은 폐로의 흡입을 위해 미분화된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 2016/0263257을 참조하고, 그 전문은 특히 여기에 기술된 건조 분말 크로몰린 제형에 대해 본원에 참조로서 명백하게 포함된다. 다른 구체예에서, 건조 분말 조성물은 적어도 하나의 부형제를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 부형제는 락토스 모노하이드레이트 및/또는 마그네슘 스테아레이트를 포함한다.
본원에서 사용되는 "치료적 유효량"이라는 용어는 모든 의학적 치료에 적용될 수 있는 합리적인 이익/위험 비로 동물에서 세포의 적어도 하위-집단에서 일부 요망되는 치료 효과를 생성하는데 효과적인 본 발명의 조성물 중 치료제의 양을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용되는"은 올바른 의학적 판단의 범위 내에서 합리적인 이익/위험 비에 상응하게 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제(예를 들어, 윤활제, 탈크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트, 또는 스테아르산), 또는 대상 화합물을 한 기관 또는 신체 일부로부터 다른 기관 또는 신체의 일부로 운반 또는 수송하는데 관여하는 용매 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각 담체는 제형의 다른 성분과 양립되고 환자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용"될 수 있어야 한다. 약학적으로 허용되는 담체로 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 (1) 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당류; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 아가; (14) 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드와 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열원 비함유 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드; 및 (22) 약학적 제형에 사용되는 다른 무독성 상용성 물질을 포함한다.
상기 개시된 바와 같이, 본 조성물에서 발견되는 화합물의 특정 구체예는 아미노 또는 알킬아미노와 같은 염기성 작용기를 함유할 수 있고, 따라서 약학적으로 허용되는 산과 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이와 관련하여 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 조성물에 포함된 화합물의 비교적 무독성인 무기산 및 유기산 부가염을 지칭한다. 이러한 염은 투여 비히클 또는 투여 형태 제조 공정에서 현장에서 제조될 수 있거나, 유리 염기 형태의 본 발명의 정제된 화합물을 적합한 유기산 또는 무기산과 개별적으로 반응시키고, 후속 정제 중에 이렇게 형성된 염을 분리함으로써 제조될 수 있다. 대표적인 염은 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 설페이트, 바이설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 아세테이트, 발레레이트, 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 나프틸레이트, 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토비오네이트, 및 라우릴설포네이트 염 등을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조).
본 조성물이 포함하는 화합물의 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 무독성 유기산 또는 무기산으로부터의 화합물의 통상적인 무독성 염 또는 4차 암모늄 염을 포함한다. 예를 들어, 그러한 통상적인 무독성 염은 하이드로클로라이드, 브롬화수소산, 황산, 설팜산, 인산, 질산 등과 같은 무기산으로부터 유래된 염; 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 팔미트산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 이소티온산 등과 같은 유기산으로부터 유래된 염을 포함한다.
다른 경우에, 본 발명의 조성물에 포함된 화합물은 하나 이상의 산성 작용기를 함유할 수 있으며, 따라서 약학적으로 허용되는 염기와 함께 약학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이러한 경우에 "약학적으로 허용되는 염"이라는 용어는 본 발명의 화합물의 비교적 무독성인 무기산 및 유기산 부가염을 지칭한다. 이러한 염은 유사하게 투여 비히클 또는 투여 형태 제조 공정에서 현장에서 제조될 수 있거나, 유리산 형태의 정제된 화합물을 적합한 염기, 예를 들어, 약학적으로 허용되는 금속 양이온의 하이드록사이드, 카르보네이트 또는 바이카르보네이트, 암모니아, 또는 약학적으로 허용되는 유기 1차, 2차 또는 3차 아민과 별도로 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토염은 리튬, 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 및 알루미늄 염 등을 포함한다. 염기 부가염의 형성에 유용한 대표적인 유기 아민은 에틸아민, 디에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진 등을 포함한다. (예를 들어, 상기 문헌[Berge et al.] 참조)
소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 습윤제, 에멀젼화제 및 윤활제 뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 착향제 및 방향제, 보존제 및 항산화제가 또한 조성물에 존재할 수 있다.
약학적으로 허용되는 항산화제의 예는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트 등; (2) 유용성 항산화제, 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예를 들어, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 발명의 제형은 경구, 코, 국소(협측 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적합한 것들을 포함한다. 제형은 편리하게 단위 투여 형태로 제공될 수 있고 약학 분야에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 것이다. 일반적으로, 이 양은 100% 중 약 0.1% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 5% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 10% 내지 약 30%의 활성 성분의 범위일 것이다.
이러한 제형 또는 조성물을 제조하는 방법은 2개 이상의 활성 화합물을 담체 및 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 하나 이상의 활성 화합물을 액체 담체 또는 미세하게 나누어진 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 밀접하게 회합시킨 후, 필요시, 생성물을 성형시킴으로써 제조된다.
현탁액은, 활성 화합물에 더하여, 예를 들어, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트, 및 이들의 혼합물과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 조합된 2개 이상의 치료제를 포함하며, 이는 당, 알콜, 항산화제, 완충제, 박테리오스탯, 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁 또는 증점제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅 물질의 생성물, 예를 들어, 레시틴에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 생성물에 의해 유지될 수 있다.
이러한 조성물은 또한 애주번트, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 에멀젼화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 대상 화합물에 대한 미생물 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시킴으로써 보장될 수 있다. 또한 등장제, 예를 들어, 당, 소듐 클로라이드 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사용 약학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제의 포함에 의해 발생될 수 있다.
2개 이상의 치료제를 포함하는 조성물은, 단독으로 또는 다른 치료제와 함께, 통상적인 부형제, 즉, 당업계에 공지된 경구, 비경구, 코, 정맥내, 피하, 장용, 또는 임의의 다른 적합한 투여 방식에 적합한 약학적으로 허용되는 유기 또는 무기 담체 물질과의 혼합물로 사용될 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 물, 염 용액, 알콜, 아라비아 검, 식물성 오일, 벤질 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤레이트, 탄수화물, 예를 들어, 락토스, 아밀로스 또는 전분, 마그네슘 스테아레이트 탈크, 규산, 점성 파라핀, 향유, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 약학적 제조물은 멸균될 수 있고, 요망되는 경우, 보조제, 예를 들어, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 에멀젼화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 착향제 및/또는 방향족 물질 등과 혼합될 수 있다. 이들은 또한 요망되는 경우 다른 활성제, 예를 들어, 다른 진통제와 조합될 수 있다. 비경구 적용을 위해, 특히 적합한 것은 유성 또는 수용액 뿐만 아니라 현탁제, 에멀젼, 또는 좌약을 포함하는 임플란트이다. 앰풀은 편리한 단위 투여량이다. 경구 적용을 위해, 특히 적합한 것은 정제, 당의정, 액체, 점적, 좌약, 또는 캡슐, 캐플릿 및 젤캡이다. 경구용으로 의도된 조성물은 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그러한 조성물은 정제의 제조에 적합한 불활성, 무독성 약학적 부형제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다. 그러한 부형제는, 예를 들어, 락토스와 같은 불활성 희석제; 옥수수 전분과 같은 과립화제 및 붕해제; 전분과 같은 결합제; 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 포함한다. 정제는 코팅되지 않거나 구미에 맞거나 활성 성분의 방출을 지연시키기 위해 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 경구용 제형은 또한 활성 성분을 불활성 희석제와 혼합한 경질 젤라틴 캡슐로 제공될 수 있다.
수성 현탁액은 약물의 상기 확인된 조합을 함유하고 그 혼합물은 현탁제로서 적합한 하나 이상의 부형제, 예를 들어, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 또는 천연 검과 같은 약학적으로 허용되는 합성 검을 갖는다. 유성 현탁액은 식물성 오일 또는 광유에 상기 확인된 약물의 조합을 현탁시킴으로써 제형화될 수 있다. 유성 현탁액은 비스왁스 또는 세틸 알콜과 같은 증점제를 함유할 수 있다. 시럽, 엘릭서 등이 사용될 수 있고 여기에 감미된 비히클이 사용된다. 주사용 현탁액이 또한 제조될 수 있으며, 이 경우 적절한 액체 담체, 현탁제 등이 사용될 수 있다. 또한, 활성 화합물을 냉동-건조하고 수득된 동결건조된 화합물을, 예를 들어, 주사용 제품의 제조에 사용할 수 있다.
조합 요법의 한 양태는 유효량 또는 치료용량 이하 용량의 하나 이상의 치료제(들)를 투여하는 단계 및 상기 하나 이상의 치료제(들)에 의해 제공되는 치료 효과를 증가시키는데 효과적인 양으로 나머지 치료제(들)를 투여하는 단계를 포함하는 인간에서 효과적인 치료적 치료를 제공하는 방법에 관한 것이다. 치료제는 치료제의 투여 간격(또는 치료 효과)이 겹치는 한, 동시에 또는 다른 시간에 투여될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법에 따르면, 특정 바람직한 구체예에서, 치료제는 동일한 투여 형태로 또는 심지어 서로 동일한 투여 경로에 의해 투여될 필요가 없다. 오히려, 상기 방법은 하나 이상의 치료제(들)의 치료적 유효 수준이 인간에게 투여되었을 때, 인간에서 수득되는 놀라운 상승적 및/또는 부가적 이익에 관한 것이고, 치료제(들)에 대한 투여 간격 전 또는 동안에 또는 인간이 치료 효과를 경험하는 동안에, 원래의 하나 이상의 치료제(들)의 치료 효과를 증가시키기 위한 유효량의 다른 치료제(들)가 투여된다.
주사용 데포 형태는 생물분해성 중합체, 예를 들어, 폴리락티드-폴리글리콜리드에서 대상 화합물의 미세캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비율 및 사용된 특정 중합체의 특성에 따라, 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생물분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(안하이드라이드)를 포함한다. 데포 주사용 제형은 또한 약물을 신체 조직과 상용성인 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 포획함으로써 제조된다.
본 발명의 제조물은 경구, 비경구, 국소, 또는 직장으로 제공될 수 있다. 이들은 물론 각각의 투여 경로에 적합한 형태로 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"은 일반적으로 주사에 의한 장용 및 국소 투여가 아닌 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관, 피하, 표피밑, 관절내, 피막하, 거미막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 피하 투여가 선호된다.
본원에서 사용되는 용어 "전신 투여", "전신 투여되는", "말초 투여" 및 "말초 투여되는"은 중추신경계로 직접 투여되는 것 이외의 화합물, 약물 또는 다른 물질의 투여를 의미하며, 이것은 환자의 시스템에 들어가므로 대사 및 다른 유사 과정, 예를 들어, 피하 투여의 지배를 받는다.
본 발명의 약학적 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 유독하지 않으면서, 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 요망되는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 획득하도록 변할 수 있다.
선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 화합물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 또는 대사 속도, 흡수율 및 정도, 치료 지속기간, 사용되는 특정 화합물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 이전의 병력, 및 의학 분야에서 널리 공지된 유사 요인을 포함하는 다양한 요인에 좌우될 것이다.
당업계의 숙련된 기술을 갖는 의사 또는 수의사는 필요한 약학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 수준보다 낮은 수준으로 약학적 조성물에 사용되는 활성 화합물의 투여를 시작하고 요망되는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다.
본 발명의 화합물은 단독으로 투여되는 것이 가능하나, 화합물을 약학적 제형(조성물)으로 투여하는 것이 바람직하다.
이 치료를 받는 환자는 영장류, 특히 인간, 및 말, 소, 돼지 및 양과 같은 다른 포유동물; 및 일반적으로 가금류 및 애완동물을 포함하는 치료를 필요로 하는 임의의 동물이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 제1 화합물을 포함하는 치료적 유효량의 약학적 조성물 및 제2 화합물을 포함하는 치료적 유효량의 약학적 조성물을 공동-투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 질병 또는 질환은 뉴런 염증 상태이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 제1 화합물을 포함하는 치료적 유효량의 제1 약학적 조성물 및 제2 화합물을 포함하는 치료적 유효량의 제2 약학적 조성물을 공동-투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 질환의 진행을 늦추는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 질병 또는 질환은 뉴런 염증 상태이다.
특정 구체예에서, 제1 화합물은 하기 화학식 (I)을 갖는다:
Figure pct00003
상기 식에서,
X는 할라이드, 하이드록실, 또는 OCO(C1-8알킬)이고;
Y는 CO2R1 또는 CH2OR2이고;
R1은 Li, Na, K, H, C1-3알킬, 또는 -CH2CO2(C1-5알킬)이고;
R2는 H 또는 -C(O)(C1-3알킬)이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다.
특정한 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 다음으로부터 선택된다:
Figure pct00004
Figure pct00005
,
또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
특정 구체예에서, 제1 화합물은 비톨테롤, 페노테롤, 이소프레날린, 레보살부타몰, 오르시프레날린, 피르부테롤, 프로카테롤, 리토드린, 살부타몰, 테르부탈린, 아르포르모테롤, 밤부테롤, 클렌부테롤, 포르모테롤, 살메테롤, 아베디테롤, 카르모테롤, 인다카테롤, 올로다테롤, 빌란테롤, 네도크로밀, 케토티펜, 올로파타딘, 오말리주맙, 케르세틴, 메폴리주맙, 아젤라스틴, 메틸크산틴, 페미롤라스트, 올로파타이든, 알파톡신 G1, 알파톡신 B1, 알파톡신 M1, 데옥시니발레놀, 제아랄레논, 오크라톡신 A, 후모니신 B1, 가수분해된 후모니신 B1, 파툴린, 및 에르고타민으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 제1 화합물은 하기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로부터 선택된다:
Figure pct00006
특정 구체예에서, 제1 화합물은 에다라본 및 릴루졸로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 제2 화합물은 비스테로이드 항염증성 약물(NSAID)로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 제2 화합물은 아세틸살리실산(acetylsalicylic acid), 디플루니살(diflunisal), 살사레이트(salsalate), 이부프로펜(ibuprofen), 덱시부프로펜(dexibuprofen), 나프록센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 케토프로펜(ketoprofen), 덱스케토프로펜(dexketoprofen), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 옥사프로진(oxaprozin), 록소프로펜(loxoprofen), 인도메타신(indomethacin), 톨메틴(tolmetin), 설린닥(sulindac), 에토돌락(etodolac), 케토롤락(ketorolac), 디클로페낙(diclofenac), 나부메톤(nabumetone), 피록시캄(piroxicam), 멜록시캄(meloxicam), 테녹시캄(tenoxicam), 드록시캄(droxicam), 로르녹시캄(lornoxicam), 이속시캄(isoxicam), 메페남산(mefenamic acid), 메클로페남산(meclofenamic acid), 플루페남산(flufenamic acid), 톨페남산(tolfenamic acid), 셀레콕시브(celecoxib), 리코펠론(licofelone), 하이퍼포린(hyperforin), 및 피그워트(figwort)로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 제2 화합물은 TREM2와 같은 항염증성 유전자 단백질로부터 트렁케이션된 항염증성 소분자 펩티드로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 "제1 화합물"로 지정된 화합물의 복수의 약학적 조성물 및, 선택적으로, "제2 화합물"로 지정된 화합물의 복수의 약학적 조성물을 공동-투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 조성물은 에다라본을 포함하는 조성물과 공동-투여될 수 있다. 대안적으로, 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 조성물은 릴루졸을 포함하는 조성물과 공동-투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 조성물은 릴루졸을 포함하는 조성물 및 이부프로펜 또는 멜록시캄과 같은 NSAID를 포함하는 조성물과 공동-투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 조성물은 에다라본을 포함하는 조성물 및 이부프로펜 또는 멜록시캄과 같은 NSAID를 포함하는 조성물과 공동-투여될 수 있다.
특정 구체예에서, 뉴런 염증 상태는 ALS, 자폐 스펙트럼 장애(ASD), 허혈성 뇌졸중, 또는 프리온 질병이다. 예를 들어, 뉴런 염증 상태는 ALS이다. 대안적으로, 뉴런 염증 상태는 프리온 질병이다.
특정 구체예에서, 청구된 방법은 뇌줄기 및/또는 척수에 위치한 뉴런, 뉴런, 또는 수의성 신체 근육에 영향을 미치는 운동 뉴런에 대한 뉴런 손상을 늦추는 결과를 가져온다.
특정 구체예에서, 청구된 방법은 뇌줄기 및/또는 척수에 위치한 뉴런, 뉴런, 또는 수의성 신체 근육에 영향을 미치는 운동 뉴런에 대한 손상을 중지시킨다.
특정 구체예에서, 화합물 또는 조성물은 피하, 정맥내, 복강내, 흡입에 의해, 경구, 또는 경피로 투여된다. 예를 들어, 조성물은 피하 투여된다. 대안적으로, 조성물은 정맥내 투여된다.
특정 구체예에서, 화합물 또는 조성물은 약물이 M1-에서-M2 변형제로서 작용할 수 있도록 하는 혈액, 뇌, 및 CSF 농도를 유도하도록 특별히 맞춤화된 용량으로 투여된다.
특정 구체예에서, 청구된 방법은 운동 뉴런을 조절하고 ALS 발현에 영향을 미치는 뇌 영역과 관련된 증상의 감소 또는 신체 기능의 개선을 초래한다. 특정 구체예에서, 청구된 방법은 ALS로 고통받는 환자의 기분 및 사회적 거동의 개선을 초래한다.
실시예
방법
화학물질
크로몰린 소듐은 AZTherapies에서 제공되었고 이를 PBS에 용해하였다. 생체내 실험에 100 mM 용액을 사용하였다. 둘베코의 PBS를 사용하여 이전에 설명한 대로 6.3 mg/kg의 최종 용량으로 복강내 주사용 용액을 희석하였다.
동물
이 연구에 149마리의 마우스를 사용하였다. 모든 동물 관리, 사육 및 실험은 Massachusetts General Hospital Subcommittee on Research Animal Care에서 정한 지침에 따라 수행되었다. 이러한 실험은 Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee(2014N000018)의 승인을 받았다. 모든 마우스는 사료와 물을 마음대로 사용할 수 있었다. 마우스를 정기적으로 운동 장애에 대해 평가하고 주요 마비가 시작되면(신경학적 점수 = 4, 하기 신경학적 점수 참조) 안락사하여 이전에 설명한 대로 고통을 최소화하였다. 경미한 마비(신경학적 점수 = 2)를 나타내는 마우스에게는 긴 시퍼 튜브 및 하이드로겔이 있는 물병이 제공되었다. 이 연구에 사용된 종말점은 ALS TDI가 이전에 보고한 기준인 15초 이내에 자기-교정 능력의 상실(신경학적 점수 = 4) 또는 케이지 바닥에 있는 사료에 도달하기 위해 이동할 수 없음을 기반으로 한다. 인도적 종말점에 도달한 마우스를 3시간 이내에 안락사하였다.
SOD1 G93A 마우스:
B6SJL-Tg(SOD1 G93A)1Gur/J 트랜스제닉 수컷 마우스를 Jackson Laboratory에서 확보하고 C57BL/6 암컷 마우스와 번식시켜 야생형(Wt) SOD1 및 돌연변이 트랜스제닉(Tg) SOD1 G93A -발현 마우스를 얻었다. 마우스 유전자형을 결정하기 위해, RNA 추출 및 상보성 DNA(cDNA) 합성을 출생 후 28-40일에 획득한 꼬리 생검으로부터 수행한 다음 돌연변이체 G93A SOD1 유전자(GGGAAGCTGTTGTCCCAAG 및 CAAGGGGAGGTAAAAGAGAGC)용 프라이머를 사용하여 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 수행하였다. 연령- 및 한배새끼-둘 모두가 일치하는 WtSOD1 및 TgSOD1 수컷 및 암컷 마우스를 아래에 설명된 바와 같이 모든 연구에 사용하였다.
거동
모든 거동 평가, 데이터 수집, 및 분석은 실험 조건(즉, 유전자형 및 치료)에 대한 맹검 조사자가 수행하였다.
보행 분석
이전 연구와 유사한 사지 페인팅 절차를 사용하여 수동 보행 분석을 수행하였다. 간단히 말해서, 마우스를 먼저 적절한 방향으로 부드럽게 몰아서 집 케이지로 직접 이어지는 수평 복도를 가로지르도록 훈련시켰다. 시험 당일 무독성 식용 염료(Fisher Scientific)를 사용하여 뒷다리의 발바닥에 칠하고, 마우스가 종이 위에서 집 케이지로 가는 길을 걷도록 하였다. 각 실험 시점(P70, P90, P110, P130, P150)에 3회 시험을 수행하였다. 보폭 길이 및 너비는 2개의 연속 발자국에서, 발자국의 볼 마운트 영역에서 동일한 지점 사이의 거리를 측정하여 결정되었고 2-3개의 뒷발 보폭으로부터 계산되었다. 3회 시도에 걸쳐 4-6개의 보폭으로부터의 평균 데이터를 계산하였다.
로타로드
이전에 기술된 바와 같이 마우스를 고정 속도(16 rpm) 회전 막대(3.0cm)(Rotamex, Columbus Instruments)에 놓았다. 마우스는 P40에서 180초 동안 로타로드에 한 번 머무르도록 훈련되었다. 각 실험 시점(P70, P90, P110, P130, P150)에 대해, 마우스가 회전하는 막대에서 보낸 시간을 최대 180초까지 계산하였다. 각 시점에 대해 3회 시도가 수행되었으며 각 세션의 가장 큰 값을 분석에 사용하였다.
발 그립 지구력 시험(PaGE)
PaGE 시험은 이전에 설명한 대로 수행되었다. 간단히 말해서, 마우스를 거꾸로 된 통상적인 하우징 케이지의 와이어 뚜껑 위에 놓고 열린 케이지 바닥에서 약 45cm 위에 유지시켰다. 실험 시점(P70, P90, P110, P130, P150)에 대해, 그리드에서 보낸 시간(낙하 전)을 최대 값인 90초까지 기록하였다. 3회 개별 시도에서 가장 큰 값을 분석에 사용하였다.
체중 및 신경학적 점수
P50에서 시작하여, 체중 및 신경학적 점수(ALS TDI 기준 사용)(Hatzipetros, T., et al. (2015). "A Quick Phenotypic Neurological Scoring System for Evaluating Disease Progression in the SOD1-G93A Mouse Model of ALS." J Vis Exp(104); Leitner M., et. al. (2009). "Working with ALS mice: Guidelines for preclinical testing & colony management." The Jackson Laboratory.)을 사망 또는 안락사까지 5일마다 각 마우스에 대해 기록하였다. ALS TDI 기준은 다음과 같다:
0점: 마우스가 꼬리로 매달려 있을 때 뒷다리가 측면 중앙선으로부터 완전히 확장, 및 마우스는 2 내지 3회 중단하며 이것을 2초 동안 유지할 수 있다.
1점: 꼬리 매달기 동안 측면 중앙선을 향한 다리 확장의 붕괴 또는 부분적인 붕괴(약화) 또는 뒷다리의 떨림.
2점: 12인치를 걷는 동안 발가락이 적어도 두 번 아래로 말리거나, 발의 임의의 일부가 케이지 바닥/테이블을 따라 끌림.
3점: 경직 마비 또는 최소한의 관절 움직임, 전진 동작을 할 때 발이 사용되지 않음.
4점: 어느 한쪽에 놓은 후 마우스는 15초 이내에 스스로 바로 설 수 없다.
*4점을 받으면 마우스는 안락사되었다.
조직 해부
신경학적 점수 4에 도달하면 TgSOD1 G93A 마우스로부터 조직을 절개하였다. 느린 흐름의 CO2(챔버 부피의 10-30%/분)를 투여한 후 즉시 단두술로 마우스를 희생시켰다. 뇌, 비복근, 및 앞정강골 조직을 제거하고 드라이 아이스에서 냉동하였다. 척수를 제거하고, 액체 질소의 가스 부산물로 부드럽게 낮추어 동결시키고, 요추 및 비요추 부위로 절개하였다. 모든 조직은 사용하기 전에 -80℃에서 저장되었다. 또한, 꼬리 샘플을 추출하여 마우스 유전형분석을 위한 제2 라운드의 확증적 qRT-PCR을 수행하였다. 꼬리 샘플은 사용될 때까지 -20℃에서 저장되었다.
운동 뉴런 정량화
요추 척수의 세로 섹션(10 μm)을 신선한 냉동 조직으로부터 절단하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 이전에 설명한 바와 같이 조직 섹션에서 수행하였다. 전각(ventral horn)을 함유하는 영역 내에서, 모든 운동 뉴런은 전각 내에서 가장 높은 운동 뉴런 밀도 영역을 포함하기 위해 동물 당 3개의 개별 섹션(각각 20-30 μm만큼 분리됨)에 대해 계수된다. 모든 계수는 유전자형에 맹검인 개인에 의해 수행되었다. Zeiss 현미경 20x 대물렌즈(0.8 NA)를 사용하여 이미지를 획득하고 Metamorph 이미지 분석 소프트웨어(Molecular Devices)로 처리하였다.
Iba1 면역조직화학 516 분석
냉동 척수 섹션을 4% PFA/PBS에 72시간 동안 고정시키고 PBS에서 30% 수크로스로 탈수시켰다. 섹션을 PBS로 3회(각각 5분) 세척하고 PBS 중 3% H2O2와 함께 15분 동안 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제를 켄칭시켰다. 이어서 섹션을 PBS로 3회 세척하고 5%(v/v) 정상 염소 혈청(Vector Laboratories), PBS 중 0.3% Triton X-100을 사용하여 차단하였다. Iba1에 대한 1차 항체(토끼 폴리클로날, 1:400, Wako, #019-19741)를 2.5%(v/v) 정상 염소 혈청, 0.3% Triton X-100을 포함하는 완충제에 희석하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 샘플을 PBS로 3회(각각 10분) 세척하였다. 1차 항체는 비오티닐화된 2차 항체(1:200) 및 VECTASTAIN Elite ABC HRP 키트(Vector Laboratories)를 사용하여 검출되었으며, 제공업체의 지침에 따라 DAB(Vector Laboratories)로 현상되었다. 섹션을 일련의 등급화된 에탄올에서 탈수하고, 자일렌에서 제거하고, Cytoseal-XYL 자일렌-기반 마운팅 매질(Thermo Fisher Scientific)로 커버-슬립하였다. 광학현미경(TE360 Eclipse; Nikon, Japan)을 사용하여 섹션을 10× 배율로 이미징하였다. Iba1-양성 세포 면적(Iba1-양성 세포가 차지하는 면적을 총 면적으로 나눈 값)을 ImageJ 소프트웨어(Voxel counter plugin, NIH, USA)를 사용하여 각 척수 섹션에 대해 정량화하였다. 마우스 당 2 내지 3개의 섹션을 분석하였다. 각 섹션의 값을 평균하여 각 동물에 대한 평균 값을 얻었다.
중규모 디스커버리 다중-지점 사이토카인 검정
척수 냉동 조직을 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Fisher Scientific, #78430)이 보충된 빙냉 RIPA 완충제(Thermo Fisher Scientific, #8990)에서 균질화하였다. Optima TL 초원심분리기 및 TLA 120.2 로터(Beckman Coulter)를 사용하여 45,000 g에서 30분 동안 4℃에서 샘플을 원심분리하였다. 10개의 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 발현 수준은 전기화학발광-기반 다중-어레이 방법 및 MESO Quickplex SQ 120 시스템(MSD, Rockville, MD, USA)을 사용하여 척수 조직에서 유래된 상청액 또는 혈장에서 평가되었다. IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, CXCL1/KC/GRO, IL-10, IL-12, p70, 및 TNFα를 동시에 측정하기 위해 96-웰 V-PLEX 전염증성 마우스 1 키트(Meso Scale Discovery, #K15048D)를 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 간단히 말해서, 샘플을 교정기에서 희석하고 사이토카인 포획 항체의 어레이로 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 샘플을 실온에서 진탕시키면서 플레이트에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 키트에 제공된 세척 완충제로 세척하였다. 검출 항체 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 세척하고 2× 판독 완충제 T를 첨가하였다. 신호는 MESO QuickPlex SQ 120 기기에서 즉시 측정되었으며 DISCOVERY WORKBENCH 4.0 소프트웨어(Meso Scale Diagnostics, LLC., Rockville, MD, USA)를 사용하여 분석되었다. 상청액 또는 혈장 샘플에서의 단백질 농도는 Pierce BCA 단백질 검정 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 측정되었다. 그래프의 값은 상응하는 단백질 농도로 표준화된 사이토카인의 수준을 나타낸다.
CCL2/MCP-1 ELISA 검정
척수 조직을 균질화하고, 상청액을 중규모 디스커버리 사이토카인 검정과 관련된 섹션에 설명한 대로 유도하였다. MCP-1 수준은 96-웰 마우스 CCL2/JE/MCP-1 Quantikine ELISA 키트(R&D systems, #MJE00B)를 사용하여 척수 조직에서 생성된 상청액 또는 혈장에서 제조업체의 지침에 따라 측정되었다. 간단히 말해서, 샘플과 희석된 표준물질을 MCP-1-특이적 항체로 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 샘플을 실온에서 진탕기 상에서 2시간 동안 플레이트에서 인큐베이션한 후, 키트에 제공된 세척 완충제로 세척하였다. 이어서, MCP-1에 대한 양고추냉이 퍼옥시다제 컨쥬게이션된 항체를 각 웰에 첨가하고 진탕기 상에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충제로 세척하고 기질 용액과 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, Stop 용액을 첨가하고 신호를 Microplate 판독기(Synergy 2, Biotek Instruments)에서 판독하였다. 광학 밀도는 405 nm에서 측정되었고 540 nm에서 측정된 광학 밀도로 보정되었다. 샘플의 MCP-1 수준은 MCP-1 표준 곡선에 기반하여 계산되었다. 상청액의 단백질 농도는 Pierce BCA 단백질 검정 키트(Thermo Scientific)에 의해 측정되었다. 그래프의 값은 상응하는 단백질 농도로 표준화된 MCP-1의 수준을 나타낸다.
GPR35 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯은 이전에 설명한 대로 수행되었다(Mueller et al., 2018). 간단히 말해서, 75 μg의 마우스 척수 단백질을 샘플 완충제에 재현탁하고, 95℃에서 5분 동안 비등시키고, 10-20% Tricine 겔(Life Technologies)에서 분획화한 다음, Tween 20(TBST)과 함께 트리스-완충된 염수 중 5% 밀크로 막을 차단한 후 GPR35(Novus Biologicals, Littleton, CO; NBP2-24640), 및 베타-액틴(Cell Signaling Technology, Danvers, MA; 4967S)에 특이적인 항체로 면역검출하였다. 밤새 1차 항체 인큐베이션 후 TBST에서 4회 세척(15분, RT)한 다음 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다(HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA; and HRP-conjugated goat anti-mouse Bio-Rad Laboratories Hercules, CA). TBST에서 4회 세척(15분, RT)한 후 ECL 검출 시스템(NEN, Boston, MA)을 사용하여 단백질을 시각화하였다. GPR35 통합 밀도 값(IDV)을 베타-액틴에 대해 표준화하였다.
GPR35 면역형광
냉동 마우스 요추 척수를 10 μm으로 섹션화하고 이전에 설명한 방법을 사용하여 염색하였다. 조직 섹션을 4% 파라포름알데히드로 고정하고 인산염-완충된 염수(PBS), 5% BSA, 및 정상 염소 혈청의 혼합물로 차단하였다. 공동-염색은 GPR35(Novus Biologicals, Littleton, CO; NBP2-24640) 및 NeuN(Millipore Sigma, Temecula, CA; MAB377)에 특이적인 항체를 사용하여 4℃에서 밤새 수행되었다. PBS로 3회 세척한 후, 섹션을 Cy3-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 및 FITC-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 항체(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)와 함께 인큐베이션하였다. 각 섹션으로부터 10개의 20X 필드를 이미징하고 National Institutes of Health(ImageJ)로부터의 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
통계
본문의 데이터는 중앙값으로 표시된다. 박스 플롯은 중앙값을 나타내는 중앙선, 사분위수 범위를 나타내는 엣지, 및 10-90번째 백분위수를 나타내는 수염을 사용하여 집단 데이터를 그래픽으로 표현하는데 사용된다. 데이터는 중앙값 ± 사분위수 범위 또는 퍼센트 값으로도 표시된다. 샘플 크기는 도면 범례에 포함되어 있다. 관련이 없는 샘플에 대한 비교는 이원 ANOVA에 이어 Tukey 또는 Sidak의 다중 비교 테스트 또는 일원 ANOVA 테스트에 이어 Tukey의 다중 비교 사후-테스트를 사용하여 0.05의 유의 수준(α)으로 수행되었다. p<0.05 및 >0.00001의 경우, 정확한 P 값(양측)이 보고된다.
연구 승인
모든 동물 연구는 Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee(2014N000018)의 승인을 받았다.
결과
149마리의 수컷 및 암컷 연령- 및 한배새끼-일치 트랜스제닉(Tg) SOD1 G93A 및 야생형(Wt) SOD1 G93A 마우스를 다음 명세로 사용하였다: 암컷(19 WtSOD1-비히클, 17 WtSOD1-크로몰린, 19 TgSOD1-비히클, 및 17 TgSOD1-크로몰린) 및 수컷(18 WtSOD1-비히클, 21 WtSOD1-크로몰린, 21 TgSOD1-비히클, 17 TgSOD1-크로몰린). P60에서 시작하여 안락사까지 일주일에 5일 동안 비히클 또는 크로몰린 소듐(6.3 mg/kg, 96 i.p.)을 1일 1회 마우스에 주사하였다.
크로몰린 소듐 치료는 TgSOD1 마우스의 체중을 변화시키지 않는다
먼저, 체중에 대한 크로몰린 소듐 치료의 효과를 각 그룹에서 평가하였다. 이원 ANOVA는 체중에 대한 연령[F(9, 1143) = 10.58, p < 0.0001], 치료[F(3, 1143) = 47.99, p < 0.0001], 및 연령 X 치료 상호작용 효과[F(27, 1143) = 4.578, p < 0.0001]를 나타내었다. Tukey의 다중 비교 테스트는 P100, P110, P120, P130, P140, 및 P150에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 둘 모두에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 체중이 크게 감소하였음을 보여주었다(도 1A-도 1C). 또한 P100, P110, P120, P130, P140, 및 P150에서 WtSOD1-크로몰린 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 체중의 유의한 감소가 있었다. TgSOD1-크로몰린 그룹과 WtSOD1-비히클 그룹 사이에 체중의 유의한 차이는 P120, P130, 및 P140에서만 있었다. 중요한 것은 P130에서 TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 체중이 크게 개선되었다는 것인데, 이는 크로몰린 치료가 이 시점에 치료된 마우스의 체중 감소를 지연시켰음을 시사한다(도 1A). 본 발명자는 또한 암컷과 수컷 마우스의 체중에 대한 치료 효과를 별도로 평가하였다. 이원 ANOVA는 암컷 마우스의 체중에 대한 연령[F(9, 524) = 5.686, p < 0.0001], 치료[F(3, 524) = 13.76, p < 0.0001], 및 연령 X 치료 상호작용 효과[F(27, 524) = 4.578, p < 0.0001]를 나타내었다. Tukey의 다중 비교 테스트는 P120 및 P130에서 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 체중이 유의하게 감소하였음을 보여주었다(도 1B). 또한 P130, P140, 및 P150에서 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 체중이 현저하게 감소하였다. 수컷 마우스에서의 이원 ANOVA는 수컷 마우스의 체중에 대한 연령[F(8, 549) = 7.11, p < 0.0001], 치료[F(3, 549) = 58.48, p < 0.0001], 및 연령 X 치료 상호작용 효과[F(24, 549) = 3.623, p < 0.0001]를 나타내었다. Tukey의 다중 비교 테스트는 P90, P100, P110, P120, P130, 및 P140에서 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 체중이 유의하게 감소하였음을 보여주었다(도 1C). 또한 P90, P100, P110, P120, 및 P130에서 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 체중이 현저하게 감소하였다(도 1C). 따라서, 크로몰린 치료는 상당한 개선이 관찰된 P130을 제외하고는 TgSOD1 마우스의 체중에 영향을 미치지 않았다.
크로몰린 소듐 치료는 TgSOD1 마우스에서 신경학적 점수를 개선하고 질병 발병을 지연시켰다
다음으로, 본 발명자는 크로몰린 소듐 치료 후 신경학적 점수의 변화를 평가하였다. 이원 ANOVA는 신경학적 점수에 대한 연령[F(9, 548) = 172.3, p < 0.0001], 치료[F(1, 548) = 35.32, p < 0.0001]의 유의한 효과, 및 유의한 연령 X 치료 상호작용[F(9, 548) = 4.739, p < 0.0001]을 나타내었다. Tukey의 사후 분석은 P90, P100, P110, P130, 및 P140에서 TgSOD1-크로몰린 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 치료된 그룹에서 신경학적 점수가 유의하게 증가하였음을 보여주며, 이는 크로몰린 치료가 질병 발병 및 진행을 상당히 지연시켰음을 시사한다(도 2A). 이원 ANOVA는 암컷 마우스의 신경학적 점수에 대한 연령[F(9, 269) = 91.83, p < 0.0001], 치료[F(1, 269) = 31.99, p < 0.0001]의 유의한 효과, 및 유의한 연령 X 치료 상호작용[F(9, 269) = 3.175, p < 0.0012]을 나타내었다. Tukey의 사후 분석은 P90, P100, P120, P130, 및 P140에서 TgSOD1-크로몰린 그룹에 비해 암컷 TgSOD1-비히클 치료된 그룹에서 신경학적 점수가 유의하게 증가하였음을 보여주었다(도 2B). 암컷 마우스와 유사하게, 이원 ANOVA는 수컷 마우스의 신경학적 점수에 대한 연령[F(8, 260) = 96.81, p < 0.0001], 치료[F(1, 260) = 15.99, p < 0.0001]의 유의한 효과, 및 유의한 연령 X 치료 상호작용[F(8, 260) = 3.801, p = 0.0003]을 나타내었다. Tukey의 사후 분석은 P90, P100, 및 P110에서 TgSOD1-크로몰린 그룹에 비해 수컷 TgSOD1-비히클 치료된 그룹에서 신경학적 점수가 유의하게 증가하였음을 보여주었다(도 2C). 이러한 결과는 크로몰린 치료가 TgSOD1 마우스에서 질병 발병 및 진행을 지연시켰음을 시사한다.
크로몰린 소듐 치료는 PAGE 작업에 대한 성능을 개선시켰지만 로타로드 또는 보행 성능을 변경하지 않았다.
크로몰린 소듐 치료의 효과는 또한 발 그립 지구력(PaGE) 작업을 사용하여 근력 변화에 대해 평가되었다. 이원 ANOVA는 PaGE에 대한 연령[F(4, 492) = 31.73, p < 0.0001], 치료[F(3, 492) = 48.49, p < 0.0001]의 유의한 효과, 및 유의한 연령 X 치료 상호작용[F(12, 492) = 10.89, p < 0.0001]을 나타내었다(도 3A). Tukey의 사후 분석은 P80, P100, P120, 및 P140에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 PaGE가 유의하게 감소하였음을 보여주었다(도 3A). 또한, P100 및 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 PaGE 성능이 크게 감소하였다. 중요한 것은 P120 및 P140에서 TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린에서 PaGE 성능이 크게 개선되었다는 것이다(도 3A). 유사하게, 이원 ANOVA는 암컷 마우스의 PaGE 성능에 대한 연령[F(4, 274) = 41.14, p < 0.0001], 치료[F(3, 274) = 53.41, p < 0.0001]의 유의한 효과 및 유의한 연령 X 치료 상호작용[F(12, 274) = 16.2, p < 0.0001]을 나타내었다(도 3B). Tukey의 사후 분석은 P120 및 P140에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 PaGE 성능이 유의하게 감소하였음을 보여주었다(도 3B). 또한, P100 및 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 PaGE 성능이 크게 감소하였다. 중요한 것은 크로몰린 치료된 그룹이 PaGE 성능에서 더 큰 결손을 보인 P100에서 TgSOD1-비히클과 TgSOD1-크로몰린 사이에 통계적으로 유의한 차이가 있었고, P140에서 치료된 그룹에서 유의한 개선이 있었다는 것이다(도 3B). 수컷 마우스에서, 이원 ANOVA는 PaGE에 대한 연령[F(3, 208) = 13.34, p < 0.0001], 치료[F(3, 208) = 48, p < 0.0001]의 유의한 효과 및 유의한 연령 X 치료 상호작용[F(9, 208) = 5.828, p < 0.0001]을 나타내었다(도 3C). Tukey의 사후 분석은 P80, P100, 및 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 PaGE가 크게 감소하였음을 보여주었다. P100 및 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 PaGE가 또한 크게 감소하였다. 중요한 것은 P120에서 두 수컷 트랜스제닉 그룹 사이에 PaGE의 유의한 개선이 있었다는 것이다(도 3C). 따라서, 크로몰린 치료는 비히클 처리된 TgSOD1 그룹과 비교하여 치료된 TgSOD1 마우스에서 PaGE 성능을 개선시켰다.
운동 협응은 로타로드 시험을 사용하여 평가되었다. 이원 ANOVA는 연령[F(2, 361) = 34.49, p < 0.0001] 및 치료[F(3, 361) = 42.25, p < 0.0001]의 유의한 효과를 나타내었다. 그러나, 로타로드 성능에 대한 유의한 연령 X 치료 상호작용은 없었다[F(6, 361) = 0.704, p=0.646]. Tukey의 사후 분석은 P70, P90 및 P120에서 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 둘 모두 사이에 유의한 차이를 보여주었다(도 4A). 유사하게, 사후 분석은 모든 시점에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 로타로드 성능이 유의하게 감소하였음을 보여주었다(도 4A). 그러나, TgSOD1-비히클 및 TgSOD1-크로몰린 마우스 사이에 로타로드 성능에는 차이가 없었다. 암컷 마우스에서, 이원 ANOVA는 연령[F(2, 176) = 19.04, p < 0.0001] 및 치료[F(3, 176) = 14.48, p < 0.0001]의 유의한 효과를 나타내었다. 그러나, 로타로드 성능에 대한 유의한 연령 X 치료 상호작용은 없었다[F(6, 176) = 0.498, p=0.8086]. Tukey의 사후 분석은 P70, P90 및 P120에서 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 둘 모두 사이에 유의한 차이를 보여주었다(도 4B). 유사하게, 사후 분석은 모든 시점에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 로타로드 성능이 유의하게 감소하였음을 보여주었다(도 4B). 수컷 마우스에서, 이원 ANOVA는 연령[F(2, 169) = 9.97, p < 0.0001] 및 치료[F(3, 169) = 28.15, p < 0.0001]의 유의한 효과를 나타내었다. 그러나, 로타로드 성능에 대한 유의한 연령 X 치료 상호작용은 없었다[F(6, 169) = 0.561, p=0.7604]. Tukey의 사후 분석은 수컷 치료된 마우스에서 P70, P90 및 P120에서 TgSOD1-비히클과 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 둘 모두 사이에 유의한 차이를 보여주었다(도 4C). 유사하게, 사후 분석은 모든 시점에서 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린에 비해 수컷 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 로타로드 성능이 유의하게 감소하였음을 보여주었다(도 4C). 이러한 데이터는 크로몰린 치료가 TgSOD1 마우스에서 로타로드 성능을 변경하지 않았음을 나타낸다.
크로몰린 치료의 효과는 보폭 길이와 너비를 측정하여 보행 성능에 대해서도 평가되었다. 이원 ANOVA는 모든 그룹에서 보폭 길이에 대한 연령[F(2, 403) = 62.78, p < 0.0001], 치료[F(3, 403) = 18.96, p < 0.0001], 및 연령 X 치료 상호작용[F(6, 403) = 16.99, p < 0.0001]의 유의한 효과를 나타내었다. Tukey의 사후 분석은 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클에서 보폭 길이가 크게 감소하였음을 보여주었다(도 5A). 유사하게, 사후 분석은 P120에서 야생형 마우스에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 보폭 길이가 크게 감소하였음을 보여주는데(도 5A), 이는 크로몰린 치료가 보폭 길이에 영향을 미치지 않았음을 시사한다. 암컷 마우스에서, 이원 ANOVA는 보폭 길이에 대한 연령[F(2, 190) = 27.85, p < 0.0001], 치료[F(3, 190) = 8.389, p < 0.0001], 및 연령 X 치료 상호작용[F(6, 190) = 6.278, p < 0.0001]의 유의한 효과를 보여주었다. Tukey의 사후 분석은 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 및 TgSOD1-크로몰린 치료된 암컷 마우스에서 보폭 길이가 현저하게 감소하였음을 보여주었다(도 5B). 유사하게, 수컷 마우스에서, 이원 ANOVA는 보폭 길이에 대한 연령[F(2, 205) = 37.9, p < 0.0001], 치료[F(3, 205) = 10.84, p < 0.0001], 및 연령 X 치료 상호작용[F(6, 205) = 10.86, p < 0.0001]의 유의한 효과를 보여주었다. Tukey의 사후 분석은 P120에서 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 수컷 TgSOD1-비히클 및 TgSOD1-크로몰린 치료된 마우스에서 보폭 길이가 현저하게 감소하였음을 보여주었다(도 5C). 또한, 보폭 너비의 변화도 치료 후 평가되었다. 모든 그룹에서, 이원 ANOVA는 치료 효과는 없었지만, 보폭 너비에 대한 연령[F(2, 397) = 18.3, p < 0.0001] 및 연령 X 치료[F(6, 397) = 3.159, p = 0.0049]의 유의한 효과가 있었음을 보여주었다. Tukey의 사후 분석은 P120에서 WtSOD1-비히클에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 보폭 너비가 크게 증가하였음을 보여주었다(도 6A). 암컷 마우스 단독의 이원 ANOVA 분석은 연령[F(2, 1935) = 5.837, p = 0.0035]에만 유의한 효과를 나타내었다(도 6B). 또한, 수컷 마우스에서의 이원 ANOVA는 치료 효과는 없었지만, 보폭 너비에 대한 연령[F(2, 189) = 14.84, p < 0.0001] 및 연령 X 치료[F(6, 189) = 3.978, p = 0.0009]의 유의한 효과가 있었음을 보여주었다. 사후 분석은 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 치료된 마우스에서 보폭 너비가 크게 증가하였음을 보여주었다(도 6C). 따라서, 크로몰린 치료는 TgSOD1 마우스에서 보행 성능(예를 들어, 보폭 길이 또는 너비)을 변경하지 않았다.
불완전마비 발병 연령 및 생존에 대한 크로몰린 소듐 치료의 효과
불완전마비 발병 연령으로 측정했을 때 운동 증상 발병에 대한 크로몰린 치료의 유의한 효과가 또한 있었고(Mantel-Cox 시험, p < 0.0001), TgSOD1-비히클 그룹의 경우 발병 연령 중앙값은 99일이고 TgSOD1-크로몰린 그룹의 경우 107일이었다(도 7A). 암컷 마우스(Mantel-Cox 시험, p = 0.0009)(도 7B) 및 수컷 마우스(Mantel-Cox 시험, p = 0.0193)(도 7C) 둘 모두는 크로몰린 치료 후 운동 증상의 발병에 있어 상당한 지연을 나타내었다. 크로몰린 치료는 모든 치료된 마우스(Mantel-Cox 시험, p = 0.1096) 또는 수컷 마우스 단독(Mantel-Cox 시험, p < 0.8831)에서 생존에 유의한 효과를 미치지 않았지만(도 8A, 도 8C), 암컷 생존에 대해서는 치료의 유의한 효과가 있었다(Mantel-Cox 시험, p = 0.01)(도 8B). 이러한 결과는 크로몰린 치료가 모든 TgSOD1 마우스에서 불완전마비 연령을 지연시키지만 암컷 TgSOD1 마우스에서만 생존을 증가시킨다는 것을 시사한다.
크로몰린 치료는 신경보호적이며 요추 척수 224 운동 뉴런의 생존을 증가시킨다
다음으로, 본 발명자는 요추 척수 운동 뉴런 수에 대한 크로몰린 치료의 효과를 평가하였다. 요추 척수의 운동 뉴런은 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 사용하여 시각화되었고 일원 ANOVA는 그룹 간에 유의한 차이를 보여주었다[F(4, 83) = 60.31, p < 0.0001]. Dunn의 다중 비교 테스트는 WtSOD1-비히클(p < 0.0001) 및 WtSOD1-크로몰린(p < 0.0001) 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 운동 뉴런 수가 현저하게 감소하였음을 나타내었다. 또한, TgSOD1-크로몰린과 WtSOD1-비히클(p = 0.0077) 및 WtSOD1-크로몰린(p = 0.0081) 그룹 사이에 운동 뉴런 수의 유의한 감소가 있었다. 중요한 것은 운동 뉴런 생존이 TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린에서 유의하게 증가하였다는 것인데(p = 0.0033)(도 9B), 이는 크로몰린 치료가 신경보호적임을 시사한다.
크로몰린 치료는 TgSOD1 마우스의 척수에서 미세아교세포증을 변경하지 않는다
1주일 동안 크로몰린을 사용한 급성 치료는 이전에 β-아밀로이드 플라크 주변에 미세아교세포의 수를 증가시키는 것으로 나타났지만, 만성 치료는 미세아교세포 흡수 및 Aβ의 제거를 상당히 촉진하였다. 따라서, 본 발명자는 요추 척수 면적 당 미세아교세포의 백분율을 정량화하여 미세아교세포증에 대한 크로몰린 치료의 효과를 평가하였다. 미세아교세포 마커 Iba1을 사용하여 TgSOD1 마우스에서 만성 치료 후 유사한 효과가 관찰될 수 있는지 확인하였다. 이전에 보고된 바와 같이, 본 발명자는 WtSOD1에 비해 비히클 치료된 TgSOD1 마우스의 요추 척수에서 Iba1-양성 세포 면적의 백분율이 유의하게 증가하는 것을 발견하였다(도 10A & 도 10B). 또한, 비히클 및 크로몰린-치료된 TgSOD1 둘 모두의 척수에서 Iba1-양성 세포 면적의 백분율이 일원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석에 의해 입증된 바와 같이 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 유의하게 증가하였다[F(4, 82) = 53.12, p < 0.0001](도 10B). 그러나, TgSOD1-크로몰린의 요추 척수에서 Iba1-양성 세포 면적의 백분율은 TgSOD1-비히클에 비해 유의한 변화가 없었다(도 10B). 이러한 데이터는 크로몰린 치료가 TgSOD1 마우스의 요추 척수에서 미세아교세포증을 변경하지 않음을 나타낸다.
크로몰린 치료는 TgSOD1 마우스의 척수에서 전염증성 사이토카인/케모카인의 수준을 감소시켰다
염증에 대한 크로몰린 치료의 효과를 평가하기 위해, 중규모 디스커버리의 다중-지점 검정 시스템을 사용하여 마우스의 척수 용해물에서 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 수준을 측정하였다. 이 검정을 통해 신경염증성 반응에 중요한 것으로 알려진 IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, CXCL1, IL-10, IL-12, 및 TNFα를 포함하는 10개의 사이토카인 및 케모카인을 동시에 측정할 수 있다. 이러한 10개의 사이토카인 및 케모카인 중에서, IL-1β, IL-5, IL-6, CXCL1, 및 TNFα를 포함하는 5개만이 성공적으로 검출될 수 있었다. 일원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석은 둘 모두의 야생형 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 및 TgSOD1-크로몰린 그룹 둘 모두의 척수에서, CXCL1[F(3, 64) = 18.15, p < 0.0001], IL-1β[F(3, 130) = 66.31, p < 0.0001], IL-5[F(3, 129) = 129.9, p < 0.0001], IL-6[F(3, 135) = 43.41, p < 0.0001], 및 TNFα[F(3, 64) = 27.94, p < 0.0001]의 수준에서 유의한 차이를 보여주었다(도 11). Tg와 Wt 그룹 사이에 IL-6(p < 0.0001) 및 IL-5(p < 0.0001) 수준의 현저한 감소가 있었다(도 11B & 도 11C). 중요한 것은 TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 CXCL1(p = 0.0273) 및 TNFα(p = 0.0273) 수준이 유의하게 감소하였다는 것인데(도 11D & 도 11E), 이는 크로몰린 치료가 치료된 트랜스제닉 마우스의 척수에서 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 발현을 감소시켰음을 시사한다.
크로몰린 치료는 TgSOD1 마우스의 혈장에서 전염증성 사이토카인/케모카인의 수준을 감소시켰다
중규모 디스커버리의 동일한 전염증성 패널을 사용하여 마우스 서브세트(암컷: 13 WtSOD1-비히클, 15 WtSOD1-크로몰린, 6 TgSOD1-비히클, 및 6 TgSOD1-크로몰린; 및 수컷: 14 WtSOD1-비히클, 10 WtSOD1-크로몰린, 6 TgSOD1-비히클, 3 TgSOD1-크로몰린)의 혈장에서 사이토카인 및 케모카인의 수준을 평가하였다. 본 발명자는 IL-1β, IL-2, IL-5, IL-6, CXCL1, IL-10, 및 TNFα를 포함하는 혈장에서 10개의 전염증성 사이토카인 중 7개를 측정할 수 있었다. 일원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석은 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 그룹 둘 모두에 비해 TgSOD1-비히클의 혈장에서 IL-2[F(3, 65) = 7.731, p < 0.0002], IL-6[F(3, 63) = 6.332, p < 0.0008], 및 IL-10[F(3, 65) = 7.195, p < 0.0003]의 수준이 크게 증가하였음을 보여주었다(도 12B, 도 12D & 도 12E). 일원 ANOVA는 CXCL1 수준의 유의한 증가를 나타내었고[F(4, 69) = 9.377, p < 0.0247], Tukey의 사후 분석은 WtSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-비히클 마우스에서 CXCL1 수준의 유의한 증가(p = 0.0318) 및 WtSOD1-크로몰린 그룹에 비해 증가 경향(p = 0.0847)을 나타내었다(도 12F). TNFα 수준도 크게 증가하였고[F(4, 67) = 12.46, p < 0.006], 사후 분석은 WtSOD1-크로몰린에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 TNFα가 크게 증가하였음을 보여주었다(p = 0.0043)(도 12G). 그룹 간에 IL-1β와 IL-5 수준에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다(도 12A & 도 12C). 중요한 것은 TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 IL-2(p =0.0211), IL-6(p = 0.0273), 및 IL-10(p = 0.0095)의 수준이 크게 감소하였다는 것이다(도 12B, 도 12D & 도 12E). 마지막으로, TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 마우스에서 TNFα 수준이 감소하는 경향이 있었다(p = 0.110)(도 12G). 이러한 결과는 크로몰린 치료가 TgSOD1 마우스의 혈장에서 사이토카인의 수준을 감소시켰음을 입증한다.
이전 연구는 CCL2/MCP-1 수준이 ALS에서 크게 증가한다는 것을 입증하였다. 그러나 본 발명자가 분석에 사용한 특정 패널에는 나타나지 않았기 때문에, 중규모 디스커버리 검정을 사용하여 MCP-1 수준을 측정할 수 없었다. 따라서, 본 발명자는 동일한 척수 및 혈장 샘플에서 ELISA 검정을 사용하여 MCP-1 수준에 대한 크로몰린 치료의 효과를 평가하였다. 일원 ANOVA 및 Tukey의 사후 분석은 WtSOD1-비히클 및 WtSOD1-크로몰린 그룹 둘 모두에 비해 TgSOD1-크로몰린 마우스의 척수에서 MCP-1의 수준이 크게 증가하였음을 보여주었다[F(3, 92) = 46.24, p < 0.0001](도 14A). 그러나, 크로몰린 치료는 TgSOD1-비히클과 비교하여 TgSOD1-크로몰린의 척수에서 MCP-1 수준에 아무런 영향을 미치지 않았다. 더욱이, MCP-1 수준은 임의의 그룹의 혈장에서 변경되지 않았다[F(3, 32) = 2.357, p < 0.0902](도 14B). 따라서, 크로몰린 치료는 TgSOD1 마우스의 척수 또는 혈장에서 MCP-1 수준에 아무런 영향을 미치지 않았다.
크로몰린 치료는 TgSOD1 마우스의 척수에서 GPR35 수준을 증가시켰다
크로몰린 소듐은 비만 세포 생물학에서 중요한 역할을 하고 천식 치료를 위한 잠재적 표적인 것으로 제안된 수용체인 G-단백질-커플링된 수용체 35(GPR35)의 강력한 효능제이다. 여기서, 본 발명자는 척수의 비요추 영역에서 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 GPR35 발현에 대한 크로몰린의 효과를 평가하였다. 일원 ANOVA는 웨스턴 블롯으로 측정시 GRP35 수준의 유의한 차이를 나타내었고[F(3, 70) = 1.486, p < 0.007] Tukey의 사후 분석은 WtSOD1-비히클(p =0.0047) 및 WtSOD1-크로몰린 그룹(p = 0.0459)에 비해 TgSOD1-비히클 그룹에서 GPR35 수준이 크게 감소하였음을 보여주었다(도 13A & 도 13B). 또한, TgSOD1-크로몰린 그룹과 어느 한 WtSOD1 그룹 사이에 유의한 차이는 없었다. 그러나, TgSOD1-비히클 그룹에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 GPR35가 증가하는 경향이 있었다(p =0.167)(도 13B). 다음으로, 본 발명자는 요추 척수에서 면역형광을 사용하여 이러한 결과를 확인하였다. 일원 ANOVA는 요추 척수에서 GRP35 강도의 유의한 차이를 나타내었다[F(3, 19) = 1.174, p < 0.0348](도 13C & 도 13D). 또한, Tukey의 사후 분석은 TgSOD1-비히클에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 GPR35 수준이 유의하게 증가하였음을 보여주었다(p =0.0449)(도 13D). GPR35는 뉴런 마커인 NeuN과 공동-국소화되었고(도 13C) 일원 ANOVA[F(3, 8) = 0.375, p < 0.0333] 및 사후 분석(p =0.0411)으로 측정시 TgSOD1-비히클에 비해 TgSOD1-크로몰린 그룹에서 뉴런의 GPR35 수준이 크게 증가하였다(p =0.0411) (도 13E). 이러한 발견들은 함께 크로몰린이 TgSOD1 마우스에서 GPR35 발현을 조절하고/하거나 GPR35를 뉴런 발현 패턴쪽으로 이동시킴으로써 신경보호 효과를 제공할 수 있음을 시사한다.

Claims (15)

  1. 제1 화합물 및 제2 화합물을 공동-투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하거나 진행을 늦추는 방법으로서,
    여기서,
    질병 또는 질환은 뉴런 염증 상태이고;
    제1 화합물 및 제2 화합물은 독립적으로
    (a) 하기 화학식 (I)을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이거나:
    Figure pct00007

    상기 식에서,
    X는 할라이드, 하이드록실, 또는 OCO(C1-8알킬)이고;
    Y는 CO2R1 또는 CH2OR2이고;
    R1은 Li, Na, K, H, C1-4알킬, 또는 -CH2CO2(C1-5알킬)이고;
    R2는 H 또는 -C(O)(C1-4알킬)이다;
    (b) 비톨테롤(bitolterol), 페노테롤(fenoterol), 이소프레날린(isoprenaline), 레보살부타몰(levosalbutamol), 오르시프레날린(orciprenaline), 피르부테롤(pirbuterol), 프로카테롤(procaterol), 리토드린(ritodrine), 살부타몰(salbutamol), 테르부탈린(terbutaline), 아르포르모테롤(arformoterol), 밤부테롤(bambuterol), 클렌부테롤(clenbuterol), 포르모테롤(formoterol), 살메테롤(salmeterol), 아베디테롤(abediterol), 카르모테롤(carmoterol), 인다카테롤(indacaterol), 올로다테롤(olodaterol), 빌란테롤(vilanterol), 네도크로밀(nedocromil), 케토티펜(ketotifen), 올로파타딘(olopatadine), 오말리주맙(omalizumab), 케르세틴(quercetine), 메폴리주맙(mepolizumab), 아젤라스틴(azelastine), 및 메틸크산틴 페미롤라스트(methylxanthines pemirolast), 올로파타이든(olopataidne), 알파톡신(alfatoxin) G1, 알파톡신 B1, 알파톡신 M1, 데옥시니발레놀(deoxynivalenol), 제아랄레논(zearalenone), 오크라톡신(ochratoxin) A, 후모니신(fumonisin) B1, 가수분해된 후모니신 B1, 파툴린(patulin), 및 에르고타민(ergotamine)으로부터 선택되거나;
    (c) 에다라본(edaravone) 또는 릴루졸(riluzole)이거나;
    (d) 다음으로부터 선택되거나:
    Figure pct00008

    또는 이의 약학적으로 허용되는 염;
    (e) 비스테로이드 항염증성 약물(NSAID)이거나;
    (f) 항염증성 펩티드이고;
    제1 화합물 및 제2 화합물은 함께 취해져 치료적으로 효과적인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 다음으로부터 선택되는 방법:
    Figure pct00009

    Figure pct00010

    또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 화합물이 크로몰린 소듐인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 화합물이 비스테로이드 항염증성 약물(NSAID)인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 화합물이 아세틸살리실산(acetylsalicylic acid), 디플루니살(diflunisal), 살사레이트(salsalate), 이부프로펜(ibuprofen), 덱시부프로펜(dexibuprofen), 나프록센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 케토프로펜(ketoprofen), 덱스케토프로펜(dexketoprofen), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 옥사프로진(oxaprozin), 록소프로펜(loxoprofen), 인도메타신(indomethacin), 톨메틴(tolmetin), 설린닥(sulindac), 에토돌락(etodolac), 케토롤락(ketorolac), 디클로페낙(diclofenac), 나부메톤(nabumetone), 피록시캄(piroxicam), 멜록시캄(meloxicam), 테녹시캄(tenoxicam), 드록시캄(droxicam), 로르녹시캄(lornoxicam), 이속시캄(isoxicam), 메페남산(mefenamic acid), 메클로페남산(meclofenamic acid), 플루페남산(flufenamic acid), 톨페남산(tolfenamic acid), 셀레콕시브(celecoxib), 리코펠론(licofelone), 하이퍼포린(hyperforin), 및 피그워트(figwort)로부터 선택되는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 화합물이 TREM2와 같은 항염증성 유전자 단백질로부터 트렁케이션된 항염증성 소분자 펩티드인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴런 염증 상태가 ALS, 자폐 스펙트럼 장애(ASD), 허혈성 뇌졸중, 및 프리온 질병인 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴런 염증 상태가 ALS인 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴런 염증 상태가 프리온 질병인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-투여가 뇌줄기 및/또는 척수에 위치한 뉴런, 뉴런, 또는 수의성 신체 근육에 영향을 미치는 운동 뉴런에 대한 뉴런 손상을 늦추거나 중지시키는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 화합물 또는 제2 화합물이 피하, 정맥내, 복강내, 경구 또는 경피 투여되는 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 화합물 또는 제2 화합물이 피하 투여되는 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 화합물 또는 제2 화합물이 정맥내 투여되는 방법.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 화합물 또는 제2 화합물이 복강내 투여되는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 화합물 또는 제2 화합물이, 약물이 M1-에서-M2 변형제로서 작용할 수 있도록 하는 혈액, 뇌, 및 CSF 농도를 유도하도록 특별히 맞춤화된 용량으로 투여되는 방법.
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