BRPI0717475A2 - Vesículas unilamelares de fosfolipídio elipsoidal de formação espontânea - Google Patents

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BRPI0717475A2
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lipid
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BRPI0717475-6A
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Xiaoyang Qi
John Katsaras
Mu-Ping Nieh
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Childrens Hosp Medical Center
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VESÍCULAS UNILAMELARES DE FOSFOLIPÍDIO ELIPSOIDAL DE FORMAÇÃO ES- PONTÂNEA".
Prioridade
Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisó- rio dos Estados Unidos No. de Série 60/862.321, intitulado "Formação Es- pontânea de Vesículas Unilamelares de Fosfolipídios Elipsoidais," deposita- do em 20 de outubro de 2006 e Pedido de Patente dos Estados Unidos No de Série 11/741.323, depositado em 27 de abril de 2007.
Pedidos Relacionados
Este pedido refere-se a Patente dos Estados Unidos N0 6.872.406, publicada em 29 de março de 2005, intitulada "Propriedades Fu- sogênicas de Saposin C e Proteínas e Peptídeos Relacionados para Aplica- ção a Sistemas de Distribuição de Fármaco de Transmembrana"; e Pedido de Patente dos Estados Unidos N0 de Série 10/801.517, publicação No. 2004/0229799, intitulada "Saposin C-DOPS: Um Novo Agente Anti-Tumor", todos dos quais são aqui incorporados em sua totalidade por referência. Campo da Invenção
Esta presente invenção refere-se a uma composição de fosfoli- pídios para distribuição de fármaco alvo e terapêuticos aperfeiçoados. Um agente farmacêutico está contido dentro de uma membrana de fosfolipídios e a distribuição é facilitada por uma proteína de fusão de membrana. Mais especificamente, o agente farmacêutico está contido dentro de um Iiposso- ma, e a distribuição é facilitada usando-se Saposin C, que está em associa- ção com o lipossoma.
Antecedentes
Os Iipossomas são vesículas microscópicas que têm uma cavi- dade aquosa central circundada por uma membrana de lipídio formada por bicamada(s) concêntrica(s). Os Iipossomas podem ser unilamelares (tendo somente uma bicamada de lipídio), oligolamelares ou multilamelares (tendo bicamadas múltiplas). Sua estrutura permite que os mesmos incorporem ou substâncias hidrofílicas no interior aquoso, ou substâncias hidrofóbicas na membrana de lipídio.
Como veículos para a administração de fármacos, os Iipossomas têm, na teoria, numerosas vantagens. Bem como sendo composto de com- ponentes não-tóxicos, geralmente não-imunogênicos, não-irritantes e biode- 5 gradáveis, eles devem ser capazes de encapsular, reter, transportar e liberar uma grande variedade de agentes terapêuticos a órgãos alvos, reduzindo, desse modo, os efeitos colaterais adversos. Os Iipossomas podem formar a base para liberação sustentada de fármaco e distribuição a tipos de célula específicos, ou partes do corpo. O uso terapêutico de Iipossomas também 10 inclui a distribuição de fármacos que são normalmente tóxicos na forma livre.
Geralmente, os Iipossomas são formados por sujeição de uma mistura de fosfolipídios a uma força mecânica. Por exemplo, uma ampla va- riedade de métodos são atualmente usados na preparação de composições de lipossoma. Estes incluem, por exemplo, diálise de solvente, prensa Fran- 15 cesa, extrusão (com ou sem congelamento-descongelamento), evaporação de fase reversa, congelamento-descongelamento simples, sonicação, diálise de quelato, homogeneização, infusão de solvente, microemulsificação, for- mação espontânea, vaporização de solvente, técnica de célula de prensa Francesa, diálise de detergente controlada, e outros. Ver, por exemplo, 20 Madden et al., Chemistry e Physics of Lipídios, 1990. Os Iipossomas podem também serem formados por vários processos que requerem sacudimento ou vórtice.
Problemas associados com Iipossomas incluem instabilidade coloidal, dificuldade na esterilização de escala, e variabilidade entre batela- 25 das na fabricação. A preparação e fabricação de lipossoma envolvem tipi- camente remoção de solventes orgânicos, seguida por extrusão ou homoge- neização. Estes processos podem expor os componentes Iipossomais a condições extremas, tais como pressões elevadas, temperaturas elevadas e altas condições de cisalhamento que podem degradar os lipídios e outras 30 moléculas incorporadas nos lipossomas.
As preparações de lipossoma são frequentemente caracteriza- das por distribuições muito homogêneas de tamanhos e número de bicama- das. As condições otimizadas em uma pequena escala normalmente não operam bem, e a preparação de bateladas de grande escala é problemática e de trabalho intensivo.
Outro problema para aplicações de lipossoma é estabilidade co- 5 loidal. Os Iipossomas em suspensão podem se agregar e fundirem-se sob armazenagem, aquecimento e adição de vários aditivos. Devido a estes pro- blemas de estabilidade, os Iipossomas são frequentemente liofilizados. A liofilização é custosa e consome tempo. Após reconstituição, as distribuições de tamanho frequentemente aumentam, e materiais encapsulados podem 10 vazar dos lipossomas.
Muitas, se não poucas, suspensões de lipossoma conhecidas não são termodinamicamente estáveis. Ao invés, os lipossomas em suspen- sões conhecidos são cineticamente presos nos estados de energia mais al- tos pela energia usada em sua formação. A energia pode ser provida como 15 calor, sonicação, extrusão, ou homogeneização. Desde que estado de ener- gia muito alto tente diminuir sua energia livre, as formulações de lipossomas conhecidas experimentam problemas com agregação, fusão, sedimentação e vazamento de material associado à lipossoma. Uma formulação de lipos- soma termodinamicamente estável que pode evitar algum destes problemas 20 é, portanto, desejável.
É, portanto, desejável desenvolver novos métodos e materiais que solucionem estes problemas com as formulações de lipossomas atuais. Breve Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se geralmente a uma composição 25 para formação de uma população de lipossomas úteis para tratamento de doença ou distribuição de agentes ativos a um indivíduo compreendendo a) pelo menos um fosfolipídio aniônico de cadeia longa, b) pelo menos um fos- folipídio aniônico de cadeia curta; c) e uma proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo; no qual o lipossoma é espontaneamente formado sob adi- 30 ção de uma solução aquosa.
Em uma concretização, o fosfolipídio aniônico pode ser selecio- nado a partir do grupo consistindo em dioleilfosfatidilserina (DOPS), dioleil- fosfatidilglicerol (DOPG), dioleoilfosfatidilinositol (DOPI) e dioleoilácido fosfa- tídico (DOPA).
Em uma concretização adicional, o fosfolipídio de cadeia curta pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em uma fosfatidilserina, a fosfatidilcolina, um fosfatidilglicerol, a fosfatidilinositol, um ácido fosfatídico, e uma fosfatidiletanolamina.
As composições podem adicionalmente compreender uma popu- lação de lipossomas que tem uma distribuição de tamanho de vesículas mo- nomodais, bimodais, ou trimodais, ou compreendem vesículas achatadas nos pólos e tri-axiais elipsoidais unilamelares.
Em uma outra concretização, a composição da proteína derivada de prosaposin é uma ou mais selecionadas a partir do grupo consistindo em saposin C, H1, H2, H3, H4, H5 ou misturas destes.
Em uma ainda outra concretização, a composição para formação de um lipossoma compreende DOPS, DPPC, DHPC e uma proteína deriva- da de prosaposin ou polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em saposin C, H1 peptídeo, H2 peptídeo, H3 peptídeo, H4 peptídeo, H5 pep- tídeo, ou misturas destes.
Em uma ainda outra concretização, a composição para formação de um lipossoma compreende DOPS, DHPS e uma proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo em sa- posin C, H1 peptídeo, H2 peptídeo, H3 peptídeo, H4 peptídeo, H5 peptídeo, ou misturas destes.
Em uma ainda outra concretização, a composição para formação de um lipossoma compreende DOPS, DHPS, DPPC, DHPC e uma proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo selecionado a partir do grupo consis- tindo em saposin C, H1 peptídeo, H2 peptídeo, H3 peptídeo, H4 peptídeo, H5 peptídeo, ou misturas destes.
Em uma ainda outra concretização, a composição compreende adicionalmente um agente farmaceuticamente ativo.
Breve Descrição dos Desenhos
Os desenhos acompanhantes, que são incorporados em e cons- tituem uma parte deste relatório descritivo, ilustram uma ou mais concretiza- ções da presente invenção e, juntos com a descrição detalhada, servem pa- ra explanar os princípios e implementações da invenção.
Figura 1: Seqüência de aminoácido de Saposin C humana e seus domí- nios funcionais.
Figura 2: dados SANS de 0,1 % de DOPS/DPPC/DHPC.
Figura 3: Gráfico de Guinier modificado para 0,1 peso% de mistura de DOPS/DPPC/DHPC.
Figura 4: Imagens de TEM representativas de uma mistura de DOPS/DPPC/DHPC (A e B), e misturas dopadas com Hl (C e D) e dopadas com H2 (E e F).
Figura 5: O modelo proposto para uma vesícula de bicamada unilamelar, triancial elipsoidal.
Descrição Detalhada da Invenção Abreviações
Sap C1 Saposin C; DOPG, Dioleilfosfatidilglicerol; DOPS, Dioleilfosfatidilseri- na; PC, Fosfoatidiecolinas; PG, Fosfatidilglicerol; PS,
Fosfatidilserina; DMPC, Dimiristilfosfatidilcolina
Definições
Antes das presentes composições e métodos serem descritos, é
para ser compreendido que esta invenção não é limitada à metodologia es- pecífica, dispositivos, e formulações, como tais, podem, naturalmente, variar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui usada é para a proposta de descrever concretizações particulares somente, e não é preten- 25 dida limitar o escopo da presente invenção que será limitada somente pelas reivindicações em anexo, e equivalentes destas.
Conforme aqui usado e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "e", e "o" incluem referentes plurais, a menos que o contex- to indique claramente de outro modo. A menos que definido de outro modo, 30 todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado conforme comumente compreendidos a um versado na técnica ao qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais si- milares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na práti- ca e teste da invenção, métodos exemplares, dispositivos e materiais, são agora descritos.
Os termos "administrado" e "administração" referem-se geral- 5 mente a administração a um paciente de um material biocompatível, incluin- do, por exemplo, composições de lipídio e/ou vesícula e agentes de fluxo. Consequentemente, "administrado" e "administração" refere-sem, por exem- plo, a injeção em um vaso sanguíneo de composições de lipídio e/ou vesícu- la e/ou agentes de fluxo. Os termos "administrado" e "administração" podem 10 também se referirem a distribuição de composições de lipídio e/ou vesícula e/ou agentes de fluxo a uma região de interesse.
Os termos "aminoácido" ou "seqüência de aminoácido," confor- me aqui usados, referem-se a um oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo, ou seqüência de proteína, ou um fragmento de qualquer destes, e a moléculas 15 que ocorrem naturalmente ou sintéticas. Onde "seqüência de aminoácido" é aqui relatada para se referir a uma seqüência de aminoácido de uma molé- cula de proteína que ocorre naturalmente, "seqüência de aminoácido" e ter- mos similares não são significativos para limitar a seqüência de aminoácido à seqüência de aminoácido nativa completa associada com a molécula de 20 proteína relatada.
O termo "lipídio anfipático" significa uma molécula que tem um grupo "principal" hidrofílico e grupo de "cauda" hidrofóbico, e tem capacidade de formação de membrana.
Por "análogos" é significativo substituições ou alterações nas 25 seqüências de aminoácido dos peptídeos da invenção, cujas substituições ou alterações não afetam adversamente as propriedades fusogênicas dos peptídeos. Desse modo, um análogo pode compreender um peptídeo tendo uma seqüência de aminoácido substancialmente idêntica a um peptídeo aqui provido, e em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram conservati- 30 vãmente substituídos com aminoácidos quimicamente similares. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo não- polar (hidrofóbico), tais como isoleucina, valina, Ieucina ou metionina, por outro. Do mesmo modo, a presente invenção contempla a substituição de um resíduo polar (hidrofílico), tais como entre arginina e lisina, entre glutami- na e asparagina, e entre glicina e serina. Adicionalmente, a substituição de um resíduo básico, tais como lisina, arginina ou histidina por outro, ou a 5 substituição de um resíduo ácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmi- co por outro, é também contemplado.
Conforme aqui usado, os termos "membrana fosfolipídia aniôni- ca" e "lipossoma aniônico" referem-se a uma membrana de fosfolipídio ou lipossoma que contêm componentes de lipídio, e tem uma carga total nega- tiva em pH fisiológico.
"Fosfolipídios aniônicos" significam fosfolipídios tendo carga ne- gativa, incluindo fosfato, sulfato e lipídios baseados em glicerol.
"Agente bioativo" refere-se a uma substância que pode ser usa- da em conjunto com uma aplicação que é terapêutica ou diagnostica na na- 15 tureza, tal como em métodos para diagnose da presença ou ausência de uma doença em um paciente, e/ou em métodos para o tratamento de doen- ça em um paciente. Conforme aqui usado, "agente bioativo" refere-se tam- bém a substâncias que são capazes de exercer um efeito biológico in vitro e/ou in vivo. Os agentes bioativos podem ser neutros ou positivamente ou 20 negativamente carregados. Exemplos de agentes bioativos adequados in- cluem agentes diagnósticos, farmacêuticos, fármacos, moléculas orgânicas sintéticas, proteínas, peptídeos, vitaminas, esteróides e material genético, incluindo nucleosídeos, nucleotídeos e polinucleotídeos.
O termo "contido (com) em" refere-se a um agente farmacêutico sendo envelopado dentro de uma membrana de fosfolipídio, tal que o agente farmacêutico é protegido a partir do ambiente externo. Este termo pode ser usado permutavelmente com "encapsulado."
Uma "deleção," conforme o termo é usado aqui, refere-se a uma mudança no aminoácido ou seqüência de nucleotídeo que resulta na ausên- cia de um ou mais resíduos de aminoácido, ou nucleotídeos.
O termo "derivado", conforme aqui usado, refere-se à modifica- ção química de uma seqüência de polipeptídeo, ou uma seqüência de poli- nucleotideo. As modificações químicas de uma seqüência de polinucleotídeo podem incluir, por exemplo, substituição de hidrogênio por um grupo alquila, acila, ou amino. Um polinucleotídeo derivado codifica um polipeptídeo que retém pelo menos uma função biológica da molécula natural. Um polipeptí- 5 deo derivado é um modificado, por exemplo, por glicosilação, ou qualquer outro processo que retém pelo menos uma função biológica do polipeptídeo do qual ele foi derivado.
O termo "proteína ou polipeptídeo fusogênico", conforme aqui usados, referem-se a uma proteína ou peptídeo que quando adicionado a duas membranas de bicamada separadas podem proporcionar sua fusão em uma membrana simples. A proteína fusogênica força a célula ou membranas modelo em contato próximo e as fazem se fundir.
As palavras "inserção" ou "adição", conforme aqui usadas, refe- rem-se a mudanças em um aminoácido ou seqüência de nucleotideo resul- tando na adição de um ou mais resíduos de aminoácido ou nucleotídeos, respectivamente, à seqüência encontrada na molécula que ocorre natural- mente.
Os termos "lipídio" e "fosfolipídio" são usados permutavelmente, e para se referirem a estruturas contendo lipídios, fosfolipídios, ou derivados 20 destes compreendendo uma variedade de arranjos estruturais diferentes cujos lipídios são conhecidos para adotar em solução aquosa. Estas estrutu- ras incluem, mas não estão limitadas a, vesículas de bicamada de lipídio, micelas, lipossomas, emulsões, vesículas, fitas ou folhas de lipídio. Os lipí- dios podem ser usados sozinhos ou em qualquer combinação que um ver- 25 sado na técnica apreciaria para proporcionar as características desejadas para uma aplicação particular. Em adição, os aspectos técnicos de construc- tos de lipídio e formação de lipossoma são bem conhecidos na técnica, e quaisquer dos métodos comumente praticados no campo podem ser usados para a presente invenção.
"Composição de lipídio" refere-se a uma composição que com-
preende um composto de lipídio, tipicamente em um meio aquoso. Composi- ções de lipídio exemplares incluem suspensões, emulsões e composições de vesícula. "Formulação de lipídio" refere-se a uma composição de lipídio que também compreende um agente bioativo.
"Lipossoma" refere-se a um grupamento geralmente esférico ou agregado de compostos anfipáticos, incluindo compostos de lipídio, tipica- 5 mente na forma de uma ou mais camadas concêntricas, por exemplo, bica- madas. Eles podem também ser referidos aqui como vesículas de lipídio.
O termo "lipídio de cadeia longa" refere-se a lipídios tendo um comprimento de cadeia de carbono de cerca de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24. Em uma concretização, o comprimento de cadeia é 10 selecionado de um comprimento de cadeia de 18, 19, ou 20. Exemplos de lipídios que podem ser usados com a presente invenção são disponíveis na website www.avantilipidios.com. Exemplos representativos de lipídios de cadeia longa que podem ser usados com a presente invenção incluem, mas não estão limitados aos seguintes lipídios:
14:0 PS l,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Só-
dio) (DMPS);16:0 PS l,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio) (DPPS);17:0 PS l,2-Diheptadecanoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio); 18:0 PS l,2-Distearoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio) (DSPS); 18:1 PS l,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de 20 Sódio) (DOPS); 18:2 PS l,2-Dilinoleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio); 20:4 PS l,2-Diarachidonoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Só- dio); 22:6 PS l,2-Didocosahexaenoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio); 16:0-18:1 PS l-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio) (POPS); 16:0-18:2 PS 1-Palmitoil-2-Linoleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo- 25 L-Serina] (Sal de Sódio); 16:0-22:6 PS l-Palmitoil-2-Docosahexaenoil-sn- Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio); 18:0-18:1 PS l-Stearoil-2-0Ieoil- sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio); 18:0-18:2 PS l-Stearoil-2- Linoleoil-sn-Glicero-3- [Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio); 18:0-20:4 PS I- Stearoil-2-Araquidonoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio); 18:0- 30 22:6 PS l-Stearoil-2- Docosahexaenoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio); 16:0 PC l,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina (DPPC); 17:0 PC
1,2- Diheptadecanoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 18:0 PC 1,2-Distearoil-sn- Glicero-3-Fosfocolina (DSPC); 16:1 PC (Cis) 1,2-Dipalmitoleoil-sn-Glicero-3- Fosfocolina; 16:1 Trans PC l,2-Dipalmitelaidoil-sn-Glicero-3- Fosfocolina; 18:1 PC Delta6 (cis) l,2-Dipetroselinoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 18:2 PC (cis) l,2-Dilinoleoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 18:3 PC (cis) l,2-Dilinolenoil-sn- 5 Glicero-3-Fosfocolina; 20:1 PC (cis) l,2-Dieicosenoil-sn-Glicero-3- Fosfocolina; 22:1 PC (cis) 1,2-Dierucoil- sn-Glicero-3-Fosfocolina; 22:0 PC
l,2-Dibehenoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 24:1 PC (cis) l,2-Dinervonoil-sn- Glicero-3-Fosfocolina; 16:0-18:0 PC l-Palmitoil-2-Stearoil-sn-Glicero-3- Fosfocolina; 16:0-18:1 PC l-Palmitoil-2-01eoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 16:0- 18:2 PC 1- Palmitoil-2-Linoleoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 18:0-18:1 PC 1- Stearoil-2-01eoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 18:0-18:2 PC l-Stearoil-2- Linoleoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 18:1-18:0 PC l-Oleoil-2-Stearoil-sn- Glicero-3-Fosfocolina; 18:1-16:0 PC l-01eoil-2-Palmitoil-sn-Glicero-3- Fosfocolina; 18:0-20:4 PC l-Stearoil-2-Araquidonil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 16:0-18:1 PG l-Palmitoil-2-01eoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(l-Glicerol)] (Sal de Sódio) (POPG); 18:1 PG l,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(l-Glicerol)] (Sal de Sódio) (DOPG); 18:1 PA 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal de Monos- sódio) (DOPA); 18:1 Pl 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfoinositol (Sal de Amô- nia); 16:0(D31)-18:1 Pl 1-Palmitoil(D3 l)-2-01eoil-sn-Glicero-3-Fosfoinositol (Sal de Amônia); 18:1 PE l,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina (DO- PE); 18:2 PE l,2-Dilinoleoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina.
As frases "ácido nucleico" ou "seqüência de ácido nucleico", conforme aqui usadas, referem-se a um nucleotideo, oligonucleotídeo, poli- nucleotídeo, ou qualquer fragmento destes. Um "ácido nucleico" refere-se a 25 uma haste de pelo menos duas combinações açúcar-fosfato base. (Um poli- nucleotídeo é distinguido de um oligonucleotídeo pela contenção de mais do que 120 unidades monoméricas). Os nucleotídeos são as unidades mono- méricas de polímeros de ácido nucleico. O termo inclui ácido dioxirribonucle- ico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA) na forma de um RNA mensageiro de 30 oligonucleotídeo, anti-sentido, DNA de plasmídeo, partes de um DNA de plasmídeo, ou material genético derivado de um vírus. Anti-sentido é um po- linucleotídeo que interfere com a função de DNA e/ou RNA. O termo ácido nucleico refere-se a uma haste de pelo menos duas combinações açúcar- fosfato base. Ácidos nucleicos naturais têm um suporte de fosfato, os ácidos nucleicos artificiais podem conter outros tipos de suportes, mas contêm as mesmas bases. Os nucleotídeos são as unidades monoméricas de políme- 5 ros de ácido nucleico. O termo inclui ácido dioxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). RNA pode ser na forma de um tRNA (RNA de transfe- rência), siRNA (ácido ribonucleico de curta interferência), snRNA (RNA nu- clear pequeno), rRNA (RNA ribossomal), mRNA (RNA mensageiro), RNA de antissenso, e ribozimas. O DNA pode ser na forma de DNA de plasmídeo, 10 DNA viral, DNA linear, ou DNA cromossomal, ou derivados destes grupos. Em adição, estas formas de DNA e RNA podem ser de trançado simples, duplo, triplo, ou quádruplo. O termo também inclui PNAs (ácidos nucleicos de peptídeo), siNA (ácido nucleico de curta interferência), fosforotioatos, e outras variantes do suporte de fosfato de ácidos nucleicos nativos.
Conforme aqui usado, o termo "agente farmacêutico baseado
em nucleotideo", ou "fármaco baseado em nucleotideo", referem-se a um agente farmacêutico ou fármaco compreendendo um nucleotideo, um oligo- nucleotídeo ou um ácido nucleico.
"Paciente" ou "indivíduo" ou "individual" refere-se a animais, in- cluindo mamíferos, preferivelmente seres humanos.
Conforme aqui usado, "agente farmacêutico", ou "agente ativo", ou "fármaco", referem-se a qualquer material químico ou biológico, compos- to, ou composição capazes de induzir um efeito terapêutico desejado quan- do corretamente administrados a um paciente. Alguns fármacos são vendi- 25 dos em uma forma inativa que é convertida in vivo em um metabólito com atividade farmacêutica. Para proposta da presente invenção, os termos "a- gente farmacêutico", "agente ativo", e "fármaco" envolvem ambos o fármaco inativo e o metabólito ativo.
A frase "dose ou quantidade farmaceuticamente ou terapeutica- mente efetiva" refere-se a um nível de dosagem suficiente para induzir um resultado biológico desejado. Este resultado pode ser a distribuição de um agente farmacêutico, alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença, ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico, e a quantida- de precisa do ativo depende da condição física do paciente, progressão da doença sendo tratada, etc.
Conforme aqui usado, o termo "análogo de peptídeo" refere-se a 5 um peptídeo que difere em seqüência de aminoácido a partir do peptídeo nativo somente pelas substituições conservativas de aminoácido, por exem- plo, substituição de Leu por Vai, ou Arg por Lys, etc., ou por uma ou mais substituições não-conservativas de aminoácido, anulações, ou inserções localizadas nas posições que não destroem a atividade biológica do peptí- 10 deo (neste caso, a propriedade fusogênica do peptídeo). Um análogo de peptídeo, conforme aqui usado, pode também incluir, como parte ou toda de sua seqüência, um ou mais análogos de aminoácido, moléculas que imitam a estrutura de aminoácidos, e/ou aminoácidos naturais encontrados nas mo- léculas outras do que peptídeo ou análogos de peptídeo.
Conforme aqui usado, o termo "proteínas e polipeptídeos deriva-
dos de prosaposin" inclui, mas não é limitado a, saposins A, B, C e D que ocorrem naturalmente. O termo frase inclui adicionalmente proteínas e pep- tídeos derivados de saposin e análogos de peptídeo tendo atividade biológi- ca similar ou substancialmente similar, tais como, por exemplo, interação de 20 membrana para organização das estruturas da membrana, ligação de lipídio e funções de transferência, apresentação de lipídio, reestruturação de mem- brana, ancoragem da membrana, etc. O saposin C e polipeptídeos derivados deste podem ser usados em uma concretização da invenção. O termo ainda inclui fragmentos, tais como fragmentos H1, H2, H3, H4 ou H5 aqui descritos 25 e/ou conhecidos na técnica e equivalentes biologicamente ativos também.
O termo "lipídio de cadeia curta" refere-se a lipídios tendo um comprimento de cadeia de carbono de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Em uma concretização, o comprimento de cadeia de carbono é 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma concretização, o comprimento de cadeia de carbono é 6, 7 ou 8. Exem- 30 pios de lipídios de cadeia curta negativos estão disponíveis na website www.avantilipidios.com. Exemplos de lipídios de cadeia curta que podem ser usados com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, os se- guintes: 06:0 PS (DHPS) l,2-Dihexanoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio); 08:0 PS l,2-Dioctanoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-L-Serina] (Sal de Sódio); 03:0 PC l,2-Dipropionoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 04:0 PC 1,2- Dibutiroil-sn- Glicero-3-Fosfocolina; 05:0 PC 1,2-Divaleroil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 06:0 5 PC (DHPC) l,2-Dihexanoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 07:0 PC l,2-Diheptanoil- sn-Glicero-3-Fosfocolina; 08:0 PC l,2-Dioctanoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 09:0 PC 1,2-Dinonanoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina; 06:0 PG l,2-Dihexanoil-sn- Glicero-3-[Fosfo-rac-(l-Glicerol)] (Sal de Sódio); 08:0 PG l,2-Dioctanoil-sn- Glicero-3- [Fosfo-rac-(l-Glicerol)] (Sal de Sódio); 06:0 PA 1,2-Dihexanoil-sn- 10 Glicero-3-Fosfato (Sal de Monossódio); 08:0 PA 1,2-Dioctanoil-sn-Glicero- 3- Fosfato (Sal de Monossódio); 06:0 PE l,2-Dihexanoil-sn-Glicero-3- Fosfoetanolamina; 08:0 PE l,2-Dioctanoil-sn-Glicero-3- Fosfoetanolamina.
Conforme aqui usado, o termo "ácido nucleico de interferência curto", "siNA", "RNA de interferência curto", "siRNA", "molécula de ácido nu- cleico de interferência curta", "molécula de oligonucleotídeo de interferência curta", ou "molécula de ácido nucleico de interferência curta quimicamente modificada", refere-se a qualquer molécula de ácido nucleico capaz de inibir ou regular inferiormente expressão de gene ou replicação viral, por exemplo, por mediação de RNA de interferência "RNAi", ou silenciamento de gene em uma maneira específica de seqüência. Dentro de concretizações exempla- res, o siNA é uma molécula de polinucleotídeo de trançado duplo compreen- dendo regiões de sentido auto-complementar e de antissenso, no qual a re- gião de antissenso compreende uma seqüência de nucleotideo que é com- plementar a uma seqüência de nucleotideo em uma molécula de ácido nu- cleico alvo para regulação inferior de expressão, ou uma porção desta, e a região de sentido compreende uma seqüência de nucleotideo corresponden- te a (isto é, que é substancialmente idêntica em seqüência a) seqüência de ácido nucleico alvo ou porção desta. "siNA" significa um ácido nucleico de interferência pequeno, por exemplo, um siRNA, que é um ácido nucleico de trançado duplo de comprimento curto (ou opcionalmente um precursor mais longo deste, e que não é inaceitavelmente tóxico em células alvos). O com- primento de siNAs úteis dentro da invenção será, em certas concretizações, otimizado a um comprimento de aproximadamente 21 a 23 bp de compri- mento. Contudo, não existe limitação particular no comprimento de siNAs úteis, incluindo siRNAs. Por exemplo, siNAs podem inicialmente serem a- 5 presentados para células em uma forma de precursor que é substancialmen- te diferente do que uma forma final ou processada do siNA que existirá e exerce atividade de silenciamento de gene sob distribuição, ou após distribu- ição, à célula-alvo. As formas de precursor de siNAs podem, por exemplo, incluírem elementos de seqüência de precursor que são processados, de- 10 gradados, alterados, ou clivados em ou em seguida ao tempo de distribuição para produzir um siNA que é ativo dentro da célula para mediar silenciamen- to de gene. Desse modo, em certas concretizações, siNAs úteis dentro da invenção terão um comprimento de precursor, por exemplo, de aproximada- mente 100-200 pares bases, 50-100 pares bases, ou menos do que cerca de 15 50 pares bases, que produzirão um siNA processado ativo dentro da célula- alvo. Em outras concretizações, um siNA útil ou precursor de siNA será a- proximadamente 10 a 49 bp, 15 a 35 bp, ou cerca de 21 a 30 bp de compri- mento.
Conforme aqui usado, o termo "espontaneamente formado" é 20 pretendido para envolver aquele significado conhecido na técnica, no qual a formação do lipossoma requer a aplicação de força mínima ou nenhuma forma mecânica à mistura de fosfolipídios, embora seja para ser compreen- dido que a aplicação de força mecânica, tal como via vórtice ou mistura, po- de ser aplicada para facilitar formação da composição de lipossoma.
Os termos "estável" ou "estabilizado", conforme aqui usado, sig-
nificam que as vesículas podem ser substancialmente resistentes à degra- dação, incluindo, por exemplo, perda de estrutura de vesícula ou gás encap- sulado ou precursor gasoso por um período de tempo útil. Tipicamente, as vesículas empregadas na presente invenção têm um tempo de armazena- 30 gem desejável, frequentemente retendo pelo menos cerca de 90% por volu- me de sua estrutura original por um período de pelo menos cerca de duas a três semanas sob condições ambientes normais. Na forma preferida, as ve- sículas são desejavelmente estáveis por um período de tempo de pelo me- nos cerca de 1 mês, mais preferivelmente pelo menos cerca de 2 meses, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 6 meses, ainda mais prefe- rivelmente cerca de dezoito meses, e ainda mais preferivelmente até cerca 5 de 3 anos. As vesículas aqui descritas, incluindo vesículas enchidas de gás e precursor gasoso, podem também serem estáveis mesmo sob condições adversas, tais como temperaturas e pressões que estão acima ou abaixo daquelas experimentadas sob condições ambientes normais.
"Vesícula" refere-se a uma entidade esférica que é geralmente caracterizada pela presença de uma ou mais paredes ou membranas que formam um ou mais vazios internos. As vesículas podem ser formuladas, por exemplo, de lipídios, incluindo os vários lipídios aqui descritos, materiais pro- teínáceos, materiais poliméricos, incluindo polímeros sintéticos e semi- sintéticos naturais, ou tensoativos. Vesículas preferidas são aquelas que compreendem paredes ou membranas formuladas de lipídios. Nestas vesí- culas preferidas, os lipídios podem estar na forma de uma monocamada ou bicamada, e os lipídios de mono- ou bicamada podem ser usados para for- mar uma ou mais mono- ou bicamadas. No caso de mais do que uma mono- ou bicamada, as mono- ou bicamadas podem ser concêntricas. Lipídios po- dem ser usados para formar uma vesícula unilamelar (compreendida de uma monocamada ou bicamada), uma vesícula oligolamelar (compreendida de cerca de duas ou cerca de três monocamadas ou bicamadas), ou uma vesí- cula multilamelar (compreendida de mais do que cerca de três monocama- das ou bicamadas). Similarmente, as vesículas preparadas de proteínas ou polímeros podem compreender uma ou mais paredes concêntricas ou mem- branas. As paredes ou membranas de vesículas preparadas de proteínas ou polímeros podem ser substancialmente sólidas (uniformes), ou elas podem ser porosas ou semi-porosas. As vesículas aqui descritas incluem tais enti- dades comumente referidas como, por exemplo, lipossomas, micelas, bo- lhas, microbolhas, microesferas, bolhas revestidas com lipídio, polímero, pro- teína e/ou surfactante, microbolhas e/ou microesferas, micro balões, aero- géis, vesículas ligadas a clatrato, e similares. O vazio interno das vesículas pode ser cheio com um líquido (incluindo, por exemplo, um líquido aquoso), um gás, um precursor gasoso, e/ou um sólido ou material soluto, incluindo, por exemplo, um Iigante e/ou agente bioativo alvo, conforme desejado. Descrição
5 O objetivo da presente descrição refere-se a, geralmente, vesí-
culas de fosfolipídios unilamelares, tais como lipossomas, que podem ser espontaneamente formadas após a combinação de uma solução aquosa com fosfolipídios selecionados. As vesículas são facilmente formadas, está- veis, não-vazáveis (isto é, não liberam seus conteúdos) e cobrem uma am- 10 pia faixa de tamanho. As proteínas derivadas de prosaposin, tal como Sapo- sin C, e/ou as regiões H1 e H2 de SapC podem ser incorporadas nas vesícu- las de fosfolipídio. As vesículas de fosfolipídio, ou lipossomas, aqui descri- tos, são úteis para tratamento de doença. Os lipídios contendo lipossomas e a proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo podem ser usados como 15 agentes terapêuticos na ausência de agentes farmacêuticos adicionais, tal como no tratamento de estados de doença, tal como câncer, ou podem adi- cionalmente serem usados para distribuir e administrar agentes farmaceuti- camente ativos, particularmente onde distribuição através de uma membrana biológica é vantajoso.
Em breve, os lipossomas da presente invenção geralmente
compreendem um ou mais lipídios aniônicos de cadeia longa e uma ou mais proteínas derivadas de prosaposin ou polipeptídeo, no qual a única combi- nação de lipídios permite a formação espontânea dos lipossomas.
Em uma concretização, os lipossomas são compreendidos de uma combinação de um ou mais lipídios de cadeia longa aniônicos, um ou mais fosfolipídios de cadeia curta, e uma ou mais proteínas derivadas de prosaposin ou polipeptídeos, ou análogos ou derivados destes.
Em uma ainda outra concretização, os lipossomas da presente invenção podem adicionalmente compreender um ou mais agentes farma- cêuticos para a distribuição daquele agente a um indivíduo em necessidade de tal tratamento.
Em geral, o método de produção de lipossomas aqui descrito compreende as etapas de provisão de um ou mais fosfolipídios secos e uma proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo, ou análogo ou derivado destes; adição de uma solução aquosa para formar uma mistura; permitir a mistura para formar lipossomas.
5 Em uma concretização alternativa, o método pode compreender
as etapas de provisão de um ou mais fosfolipídios secos, e uma proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo; adição de um solvente orgânico pa- ra formar uma primeira mistura; congelamento-secagem da primeira mistura; adição de uma solução aquosa à primeira mistura para formar uma segunda 10 mistura; permitir a segunda mistura formar lipossomas. O um ou mais fosfo- lipídios secos podem compreender pelo menos um fosfolipídio de cadeia longa aniônico e/ou pelo menos um fosfolipídio de cadeia curta. A proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo pode ser Saposin C ou um fragmen- to, tal como H1, H2, H3,H4 ou H5.
Em outra concretização da presente invenção, o pH da composi-
ção de proteína-lipídio é acídico. Em outra concretização da presente inven- ção, o pH da composição está entre cerca de 6,8 e 2. Em outra concretiza- ção da presente invenção, o pH da composição está entre cerca de 5,5 e 2. Em outra concretização, o pH está entre cerca de 5,5 e cerca de 3,5.
Em outra concretização, a composição de proteína e lipídio na
forma seca é tratada com um ácido. Em uma concretização, o ácido é um tampão ácido ou ácido orgânico. Em outra concretização, o ácido é adicio- nado a um nível suficiente para protonatar pelo menos uma porção da prote- ína, no qual a composição tem um pH de a partir de cerca de 5,5 e cerca de 25 2. Em outra concretização, o ácido é adicionado a um nível suficiente para protonatar substancialmente a proteína, no qual a composição tem um pH de a partir de cerca de 5,5 e cerca de 2.
Em uma concretização adicional, o pH do pó seco de composi- ção de proteína e lipídio que foi tratado com um ácido suficiente para proto- natar pelo menos uma porção da proteína é então substancialmente neutra- lizado. Em uma concretização, o pH é neutralizado com um tampão de pH neutro. Em uma concretização, o pH é neutralizado com um tampão de pH neutro suficientemente para controlar o tamanho do lipossoma resultante. Em outra concretização, o pH é neutralizado com um tampão de pH neutro suficientemente para controlar o tamanho do lipossoma resultante para pro- porcionar lipossomas tendo diâmetros médios de cerca de 200 nanômetros.
5 Em outra concretização, os lipossomas têm um diâmetro médio de entre 50 e 350 nanômetros. Em outra concretização, os lipossomas têm um diâmetro médio de entre 150 e 250 nanômetros. Em outra concretização, o tampão é adicionado à composição para proporcionar um pH de composição final de cerca de 5 a cerca de 14, preferivelmente de cerca de 7 a 14, mais preferi- 10 velmente de cerca de 7 a cerca de 12, mais preferivelmente de cerca de 7 a cerca de 10, e ainda mais preferivelmente de cerca de 8 a cerca de 10.
Os lipossomas e métodos associados da presente invenção são unicamente caracterizados em que os lipossomas podem ser espontanea- mente formados após a adição de uma solução aquosa, tal que a aplicação 15 de uma força mecânica não é requerida. Ainda, a população Iipossomal re- sultante tem um tempo de armazenagem prolongado na ordem de anos ou mais. Como tal, em algumas concretizações da presente invenção, um ver- sado na técnica pode prontamente proporcionar sistemas de distribuição baseados em Iipossomal ou tratamentos com investimento financeiro reduzi- 20 do em reagentes e equipamento, e reduz exposição à reagentes tóxicos e custos associados com disposição de tais reagentes.
Proteínas ou Polipeptídeos Fusoqênicos
Saposins, uma família de glicoproteínas estáveis a calor peque- nas (-80 aminoácidos), são essenciais para a atividade hidrolítica in vivo de 25 várias enzimas Iisossomais na trajetória catabólica de glicosfingolipídios (ver Grabowski, G.A., Gatt, S., e Horowitz, M. (1990) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25, 385-414; Furst, W., e Sandhoff, K., (1992) Biochim. Biophys. Acta 1126, 1-16; Kishimoto, Y., Kiraiwa, M., e O1Brien, J.S. (1992) J. Lipides. Res. 33, 1255-1267). Quatro membros da família de saposin A, B, C, e D, são 30 proteoliticamente hidrolizadas de uma proteína precursora simples, prosapo- sin (ver Fujibayashi, S., Kao, F.T., Hones, C, Morse, H., Law, M., e Wenger, D.A. (1985) Am.J. Hum. Genet. 37, 741-748; 0’Brien, J.S., Kretz, K.A., Dew- ji, N., Wenger, D.A., Esch, F., e Fluharty, A.L. (1988) Science 241, 1098- 1101; Rorman, E. G., e Grabowski, G.A. (1989) Genomics 5, 486-492; Na- kano, T., Sandhoff, K., Stumper, J., Christomanou, H., e Suzuki, K. (1989) J. Biochem. (Tokyo) 105, 152-154; Reiner, O., Dagan, O., e Horowitz, M.
5 (1989) J.Mol.Neurosci. 1, 225-233). A seqüência completa de aminoácidos para saposins A, B, C e D foi reportada, bem como a organização genômica e seqüência de cDNA de prosaposin (ver Fujibayashi, S., Kao, F. T., Jones, C., Morse, H., Law, M., e Wenger, D. A. (1985) Am. J. Hum. Genet. 37, 741- 748; 0'Brien, J. S., Kretz, K. A., Dewji, N., Wenger, D. A., Esch, E, e Flu- 10 harty, A. L. (1988) Science 241, 1098-1101; Rorman, E. G., e Grabowski, G. A. (1989) Genomics 5, 486-492). Uma deficiência completa de prosaposin com mutação no códon de iniciação causa o armazenamento de substratos de glicosfingolipídio múltiplos assemelhando-se a uma deficiência de hidro- Iase Iisossomal combinada (ver Schnabel, D., Schroder, M., Furst, W., Klien, 15 A., Hurwitz, R., Zenk, T., Weber, J., Harzer, K., Paton, B.C., Poulos, A., Su- zuki, K., e Sandhoff, K. (1992) J. Biol. Chem. 267, 3312-3315).
Saposins são definidos como proteínas ativadoras de esfingoli- pídio ou coenzimas. Estruturalmente, saposins A, B, C, e D têm aproxima- damente 50-60% de similaridade incluindo seis resíduos de cisteína estrita- mente conservados (ver, Furst, W., e Sandhoff, K., (1992) Biochim. Biophys. Acta 1126, 1-16) que formam três fontes de intradomínio de dissulfeto cujas colocações são idênticas (ver Vaccaro, A.M., Salvioli, R., Barca, A., Tatti, M., Ciaffoni, F., Maras, B., Siciliano, R., Zappacosta, F., Amoresano, A., e Pucci, P. (1995) J. Biol. Chem. 270, 9953-9960). Todos os saposins contêm um local de glicosilação com colocação conservada na meia seqüência N- terminal, mas glicosilação não é essencial a suas atividades (ver Qi. X., e Grabowski, G.A. (1998) Biochemistry 37, 11544-11554; Vaccaro, A.M., Ciaf- foni, F., Tatti, M., Salvioli, R., Barca, A., Tognozzi, D., e Scerch, C. (1995) J. Biol. Chem. 270, 30576-30580). Em adição, saposin A tem um Segundo Io- cal de glicosilação no meio C-terminal.
Todos os saposins e proteínas similares a saposin e domínios contêm uma "dobra de saposin" quando em solução. Esta dobra é um moti- vo de grupo α-helicoidal múltiplo, caracterizado por uma estrutura de dissul- feto triconservada e vários polipeptídeos anfipáticos. Apesar esta estrutura de dobra de saposin compartilhada em solução, saposins e proteínas simila- res a saposin têm diversas funções biológicas in vivo na intensificação de 5 degradação de esfingolipídio Iisossomal (SL) e glicosfingolipídio (GSL) por hidrolases específicas. Devido a estas regras, os saposins ocupam uma po- sição central no controle de metabolismos de esfingolipídio Iisossomal e gli- cosfingolipídio.
Na ausência desta função, glucosilceramida se acumula no cé- rebro conduzindo a doença de Gaucher, (ver Pampols, T.; Pineda, M.; Giros, M. L.; Ferrer, I.; Cusi, V.; Chabas, A.; Sammarti, F. X.; Vanier, M. T.; Chris- tomanou, H. Acta NeuropatoL 1999, 97, 91-97). Outra doença resultante do acúmulo de glicosfingolipídios (GSL) é Ieucodistrofia metacromática, que pode também ser causada por deficiências de enzima Iisossomal e ativado- res de saposin, (ver Zhang, X.L.; Rafi, M. A.; DeGaIa, G.; Wenger, D. A. Proc Natl AcadSci USA 1990, 87, 1426-1430; Schnabel, D.; Schroder, M.; San- dhoff, K. FEBS Lett 1991, 284, 57-59). Bem como seu papel específico na ativação enzimática, SapC é também capaz de atividade neuritogênica, transporte inter-membrana de gangliosides e GSL, apresentação de antíge- no de lipídio e atividades de indução de fusão de membrana. Deve ser nota- do que a administração intravenosa de SapC ligado a PS ULV, tem também sido usada para demonstrar a capacidade de transportar fosfolipídio etique- tado fluorescente no sistema nervoso central. Parece, portanto, que o com- plexo combinado de SapC - PS pode prestar-se a um novo fármaco e siste- ma de distribuição de gene específico para o tratamento de doenças neuro- lógicas e de cérebro.
Proteínas e polipeptídeos fusogênicos adequados para uso nes- ta invenção incluem, mas não estão limitados a, proteínas da família sapo- sin, por exemplo, saposin C. Também incluídos estão homólogos de saposin 30 C, no qual o homólogo possui pelo menos 80% de homologia de seqüência, ou pelo menos 90% de homologia de seqüência, tal que o fragmento possui atividade biológica similar ou substancialmente similar. Devido a degenera- ção do código genético que codifica para saposin C, será prontamente com- preendido por um versado na técnica que 100% de homologia de seqüência não é essencial para operação da presente invenção.
Exemplos de peptídeos ou análogos de peptídeo incluem:
5 Ser-Asp-Val-Tyr-Cys-Glu-Val-Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys- Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ue-Leu-Asp-Ala-Phe-Asp-Lys- Met-Cys-Ser-Lys-Leu-Pro (SEQ. ID. No. 1);
Val-Tyr-Cys-Glu-Val-Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp- Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu-Asp-Ala-Phe-Asp-Lys-Met-Cys-Ser- Lys-Leu-Pro (SEQ. ID. No. 2),
e derivados, análogos, homólogos, fragmentos e misturas destes.
Também incluídos estão polipeptídeos da fórmula: h-u-Cys-Glu-h-Cys-Glu-h-h-h-Lys-Glu-h-u-Lys-h-h-Asp-Asn-Asn-Lys-u-Glu- Lys-Glu-h-h-Asp-h-h-Asp-Lys-h-Cys-u-Lys-h-h,
onde h = aminoácidos hidrofóbicos, incluindo, Vai, Leu, He, Met, Pro, Phe, e Ala; eu = aminoácidos polares não-carregados, incluindo, Thr, Ser, Tyr, Gly, Gin, e Asn.
Os domínios funcionais de SapC humano são mostrados na Fig. 1. As seis cisteinas (faceadas em negrito) e a seqüência de consenso de N- glicosilação (*) são indicadas. Os dois domínios helicoidais, H1 (YCEVCE- FLVKEVTKLID) e H2 (EKEILDAFDKMCSKLPK) são etiquetados consequen- temente. As abreviações MBD e FD significam ligação de membrana e do- mínio fusogênico, respectivamente. Um domínio fusogênico está localizado no meio amino-terminal da molécula de SapC, que inclui os peptídeos de H1 e H2. Os efeitos de SapC e seus dois peptídeos de domínio helicoidal, H1 e H2, na desestabilização e reestruturação de membrana de lipídios foram examinados com microscópio de força atômica (AFM). AFM indica que SapC pode desestabilizar e reestruturar a membrana acídica para formar "emplas- tros" mais espessos na superfície, eventualmente conduzindo à dissolução da bicamada. A desestabilização de membrana, como um resultado de SapC, também começa em defeitos, sugerindo que os defeitos de alta curva- tura promovem desestabilização de membrana. Em contraste, nem H1 nem Η2 sozinhos têm influência significante na estrutura da membrana. H2 tende a interagir com lipídios onde os defeitos da membrana estão presentes, e então se agregam em estruturas similares a haste. Enquanto os resultados de AFM mostram a influência de SapC e seus segmentos de H1 e H2 nas 5 membranas suportadas, a influência potencial destas proteínas na estabili- dade da vesícula e morfologia não foi demonstrada. Aqui, SANS é usado para caracterizar vesículas na ausência e presença de SapC, H1 e H2. Esta técnica revela ambos informação estrutural mesoscópica relacionada ao ta- manho, forma e polidispersividade da vesícula, e informação nanoscópica 10 relacionada a espessura da membrana.
Membrana de Fosfolipídio e Formação de Lipossomas
Lipossomas são vesículas microscópicas consistindo em bica- madas de lipídio concêntricas e, conforme aqui usado, referem-se a vesícu- las pequenas compostas de lipídios anfipáticos dispostos em bicamadas es- 15 féricas. Estruturalmente, a faixa de lipossomas em tamanho e forma de tu- bos longos a esferas, com dimensões de umas poucas centenas de angs- troms a frações de um milímetro. Indiferente da forma total, as bicamadas são geralmente organizadas como lamelas concêntricas fechadas, com uma camada aquosa separando cada lamela de sua vizinha. O tamanho da vesí- 20 cuia normalmente cai em uma faixa de entre cerca de 20 e cerca de 30.000 nm de diâmetro. A distribuição específica de lipossomas a um tecido-alvo, tal como uma proliferação de massa de célula, tecido neoplástico, tecido infla- matório, tecido inflamado, e tecido infectado, pode ser alcançada pela sele- ção de um tamanho de lipossoma apropriado para distribuir um agente tera- 25 pêutico para referido tecido-alvo. Por exemplo, lipossomas com um diâmetro médio de 180 nm não podem se acumular em um tumor sólido; lipossomas com um diâmetro médio de 140 nm se acumulam na periferia do mesmo tu- mor sólido, e lipossomas com um diâmetro médio de 110 nm se acumulam na periferia e porções centrais daquele tumor sólido.
Geralmente, os lipossomas são formados por sujeição de uma
mistura de lipídios a uma força mecânica. Por exemplo, uma ampla varieda- de de métodos são atualmente usados na preparação de composições de lipossoma, tais como, por exemplo, diálise de solvente, prensa Francesa, extrusão (com ou sem congelamento-descongelamento), evaporação de fa- se reversa, congelamento-descongelamento simples, sonicação, diálise de quelato, homogeneização, infusão de solvente, microemulsificação, forma- 5 ção espontânea, vaporização de solvente, diálise de solvente, técnica de célula de pressão Francesa, diálise de detergente controlada, e outros. Ver, por exemplo, Madden et al., Chemistry e Physics of Lipides, 1990. Os lipos- somas podem também serem formados por vários processos que envolvem sacudimento ou vórtice. Contudo, a capacidade de proporcionar um método 10 e composição pelos quais os lipossomas podem ser espontaneamente for- mados sem a necessidade de aplicação de uma forma mecânica é benéfica em que equipamento e etapas adicionais não são requeridos, reduzindo, desse modo, o tempo e custo associados com sua preparação. A presente invenção trata esta necessidade.
Vesículas unilamelares de formação espontânea (ULV), de baixa
polidispersidade podem ser encontradas no diagrama de fase de misturas de fosfolipídio ternárias contendo cadeias acil longas e curtas (ver, por exemplo, Nieh, M.).-P.; Harroun, T. A.; Raghunathan; V. A., Glinka; C. J.; J. Katsaras Biophys. J. 2004, 86, 2615-2629; Egelhaaf, S. U.; Schurtenberger, P. Phys. 20 Rev. Lett. 1999, 82, 2804-2807; Nieh, M.-P.; Raghunathan, V. A.; Kline, S. R.; Harroun, T. A.; Huang, C.-Y.; Pencer, J.; Katsaras, J. Langmuir 2005, 21, 6656-6661. As ULVs são formadas ou pelo aumento da temperatura (ver Lesieur, P.; Kiselev, M. A.; Barsukov, L. I.; Lombardo, D. J. Appi Cryst. 2000, 33, 623-627; Nieh, M.-P.; Harroun, T. A.; Raghunathan, V. A.; Glinka, 25 C. J.; Katsaras, J. Phys. Rev. Lett. 2003, 91, 158105), ou diluindo-se micelas discoidais de bicamadas (ver V. A., Glinka; C. J.; J. Katsaras Biophys. J. 2004, 86, 2615-2629), onde o lipídio de cadeia curta seqüestra no aro de alta curvatura do disco de bicamada, minimizando sua energia de borda. A tran- sição de micela de bicamada discoidal a ULV ocorre a uma temperatura cor- 30 respondente ao gel de lipídio de cadeia longa-cristalino líquido (temperatura de transição principal), implicando que níveis de miscibilidade aumentados entre os lipídios de cadeia longa e de cadeia curta conduzem a lipídio de cadeia curta para se difundir a partir da borda do disco, fazendo com que a tensão de linha aumente, e o módulo de rigidez aumente. Esta série de e- ventos dá ocorrência à formação de ULV monodispersa. (ver Fromherz, P. Chem. Phys. Lett. 1983, 94, 259-266). Estas ULVs são estáveis sobre perío- 5 dos prolongados de tempo, a saber, semanas (ver Nieh, M.-P.; Harroun, T. A.; Raghunathan, V. A.; Glinka, C. J.; Katsaras, J. Phys. Rev. Lett. 2003, 91, 158105), e desse modo, são consideradas serem boas candidatas como transportadores de fármacos.
Composições e Métodos para Formação Espontânea de Lipossomas Um método de formação de lipossomas envolve o uso de lipídios
de cadeia longa e de cadeia curta, no qual ambas espécies de lipídio são fosfolipídios zwiteriônicos di-saturados dopados com quantidades pequenas de um lipídio acídico de cadeia longa, tal como dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG). Na presente descrição, a morfologia de uma concretização de for- 15 mação espontaneamente de lipossomas, é descrita. Nesta concretização, a mistura de lipídios usada para formar espontaneamente lipossomas compre- ende dipalmitoil e dihexanoil fosfatidilcolina (DPPC e DHPC, respectivamen- te), e o lipídio acídico de cadeia longa dioleoil fosfatidilserina (DOPS), embo- ra seja prontamente compreendido a um versado na técnica que várias mo- 20 dificações e substituições podem ser feitas a esta combinação para chegar a outras concretizações adequadas dentro do escopo da invenção. A mistura adicionalmente inclui pelo menos uma proteína derivada de prosaposin, ou polipeptídeo ou variante ou análogo destes.
Os lipossomas espontaneamente formados podem ser produzi- 25 dos efetuando-se as seguintes etapas: 1) provisão de uma mistura de lipí- dios secos e uma proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo; 2) adição de uma solução aquosa à mistura; 3) permitir que a mistura forme liposso- mas, no qual os lipossomas são estáveis e não requerem a adição de força mecânica para alcançar sua formação. Em uma concretização, os lipídios 30 compreendem pelo menos um lipídio aniônico de cadeia longa. Em outra concretização, os lipídios compreendem pelo menos um lipídio aniônico de cadeia longa e pelo menos um lipídio de cadeia curta. A proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo pode ser selecionado a partir do grupo consis- tindo em Saposin C (SEQ ID No. 2), H1 (SEQ ID No.3), H2 (SEQ ID No.4), H3 (SEQ ID No.5), H4 (SEQ ID No.6), H5 (SEQ ID No.7), e misturas destes. Prosaposin é representado em SEQ ID No. 1. As proteínas derivadas de 5 prosaposin podem adicionalmente compreender análogos ou derivados de Saposin C, H1, H2, H3, H4, H5, e misturas destes.
A solução aquosa pode ser qualquer solução fisiologicamente compatível capaz de solubilizar os lipídios e proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo, tal que um lipossoma espontaneamente se forma. Exemplos 10 não-limitativos de soluções aquosas incluem, por exemplo, água, água deio- nizada, salina, e salina tamponada por fosfato (PBS). A concentração molar de proteína total e lipídio sob adição da solução aquosa é cerca de 300 uM, ou cerca de 400 uM, ou cerca de 500 uM, ou até 1000 uM. O pH da solução aquosa é cerca de 7,4, ou cerca de 7,0-7,6, ou cerca de 6,8 a cerca de 7,8.
Após adição da solução aquosa, a mistura de lipídio e proteína
espontaneamente forma lipossomas. Será compreendido a um versado na técnica, contudo, que a mistura pode ser turbilhonada ou misturada para a- celerar ou, de outro modo, facilitar a formação dos lipossomas.
Em uma concretização alternativa, o método pode compreender as etapas de provisão de um ou mais fosfolipídios secos e uma proteína de- rivada de prosaposin ou polipeptídeo; adição de um solvente orgânico para formar uma primeira mistura; congelamento-secagem da primeira mistura; adição de uma solução aquosa à primeira mistura para formar uma segunda mistura; permitir que a segunda mistura forme lipossomas. O um ou mais fosfolipídios secos podem compreender pelo menos um fosfolipídio aniônico de cadeia longa e/ou pelo menos um fosfolipídio de cadeia curta. A proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo pode ser Saposin C, ou um fragmen- to, tal como H1, H2, H3, H4 ou H5. Nesta concretização, o solvente orgânico pode ser qualquer solvente orgânico adequado, por exemplo, t-butanol (pre- ferido), isopropanol, 1-propanol, etanol, etil éter, metanol, ou DMSO. O sol- vente orgânico compreende cerca de 80-90%, ou cerca de 70-95%, ou cerca de 50-95%, da primeira mistura final antes de secagem por congelamento. A primeira mistura pode ser armazenada por meses ou anos antes da adição de uma solução aquosa usada para formar os lipossomas.
O uso de um lipídio negativamente carregado de cadeia longa, tal como DOPS, ao invés de lipídios zwiteriônicos somente, é acreditado o- timizar as interações entre Saposin C ou seus fragmentos, tais como os pep- tídeos H1 e H2, e o lipídio acídico se agrega, e é unicamente adequado para a formação espontânea de lipossomas, proporcionando um novo e útil meio para formação de lipossomas para tratamento de doença. Em concretiza- ções alternativas, o lipídio carregado negativamente de cadeia longa pode ser selecionado de dioleoil fosfatidilserina (DOPS), Dioleoilfosfatidil-glicerol (DOPG), 1,2-dioleoil-fosfatidiinositol (DOPI) e 1,2-dioleoilácido fosfatídico (DOPA), ou combinações destes. Os lipídios negativos de cadeia longa da presente invenção podem ser qualquer fosfolipídio de cadeia longa que tem cadeia de carbono de cerca de 14 a cerca de 24 carbonos de comprimento, ou de cerca de 18 a cerca de 20 carbonos de comprimento. Uma lista exaus- tiva de lipídios está disponível em www.avantilipidios.com. Um versado na técnica apreciará que lipídios podem ser usados na presente invenção. En- quanto qualquer combinação de lipídios de cadeia longa e de cadeia curta pode ser usada, algumas combinações produzem lipossomas mais estáveis. Por exemplo, enquanto não se pretendendo limitar a presente invenção, o seguinte pode guiar a seleção da composição da qual lipossomas são for- mados: onde cadeias longas de cerca de 20 a cerca de 24 carbonos de com- primento são usadas, lipídios de cadeia curta tendo comprimentos de cerca de 6 a cerca de 8 podem ser usados para estabilidade aperfeiçoada de Ii- possoma. Onde comprimentos de cadeia longa de cerca de 14 a cerca de 18 são usados, lipídios de cadeia curta tendo comprimentos de cerca de 6 a cerca de 7 podem ser usados para estabilidade aperfeiçoada de lipossoma. Enquanto estas combinações de lipídios produzem lipossomas mais está- veis, outras combinações podem ser bem sucedidamente usadas, e não são pretendidas para serem repudiadas.
O potencial para formação de ULV estável é adicionalmente ma- ximizado através da adição de lipídios de cadeia curta e de cadeia longa conforme descrito aqui. O lipídio de cadeia curta pode ser qualquer lipídio de cadeia curta adequado, conforme compreendido por um versado na técnica. Em uma concretização, por exemplo, o lipídio de cadeia curta é um lipídio de fosfatidilcolina de cadeia curta neutro, tal como dipalmitoil fosfatidilcolina 5 (DPPC). O lipídio de cadeia curta pode também ser um lipídio de fosfatidilse- rina de cadeia curta, tal como DHPS. Com a adição do lipídio de cadeia cur- ta, conforme aqui descrito, a população de lipossoma formada é geralmente monodispersa. Sem o lipídio de cadeia curta, a população é polidispersa, tendo diferença no tamanho e forma dos lipossomas resultantes. Como um 10 resultado de adição dos fosfolipídios de cadeia curta, é possível alcançar uma população monodispersa, melhorando a capacidade de controlar as farmacocinéticas e biodisponibilidade da preparação resultante.
Em uma concretização particular, a mistura de lipídio usada para sintetizar lipossomas de saposin-C compreende o lipídio negativamente car- 15 regado dioleoilfosfatidil-serina (DOPS), no qual uma pequena quantidade do lipídio de cadeia longa neutro dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e o lipídio de cadeia curta neutro díhexanoíl fosfatidicolina (DHPC) é adicionada. Nesta concretização particular, a proporção molar de [DOPS]:[DPPC] varia de 1:1 a 10:1 com ([DPPC]+[DOPS])/[DHPC] igual a cerca de 4. Em uma concretiza- 20 ção alternativa, DHPC é substituído ou combinado com DHPS.
Qualquer lipídio conhecido na técnica correspondendo em carga e comprimento pode ser usado. Amostras contendo esta composição de lipí- dios dopada com pequena quantidade de saposin C não desestabilizam, mas grandes agregados podem precipitar da solução para o sistema com 25 uma concentração mais alta de saposin C, indicando desestabilização da membrana. As amostras de DOPS/DPPC/DHPC são estáveis sobre um pe- ríodo de 24 meses, indicando que a adição dos lipídios de cadeia longa neu- tros e lipídios de cadeia curta aumenta a estabilidade dos agregados. Con- tudo, qualquer combinação de lipídios de cadeia longa e de cadeia curta po- 30 de ser usada de acordo com a invenção conforme aqui descrito. A Tabela 1 ilustra exemplos não-limitativos de lipídios de cadeia longa e de cadeia curta que podem ser usados na efetuação dos métodos da presente invenção. Tabela 1: Combinações de Fosfolipídios de Cadeia Longa e de Cadeia Curta
Fosfolipídio de Cadeia Longa Fosfolipídio de Cadeia Curta 18:1 PS 18:0 PC 06:0 PC (DHPC) 18:1 PS 06:0 PC (DHPC) 18:1 PS 18:0 PC 06:0 PS (DHPS) 18:1 PS 06:0 PS (DHPS) 18:2 PS 18:1 PG 06:0 PS (DHPS) 18:0-18:1 PS 18:1 PE 06:0 PC(DHPC) 16:0 PS 16:1 PC 05:0 PC 20:4 PS 20:1 PC 07:0 PC Adicionalmente, a presença ou ausência de hidrocarbonetos de
saturação na cadeia de lipídio efetua a estabilidade do lipossoma. Por e- xemplo, lipídios tendo comprimentos de cadeia de cerca de 18 ou mais são 5 usados, o fosfolipídio pode ser saturado ou insaturado, preferivelmente insa- turado. Para lipídios de cadeia longa mais curtos, tais como aqueles tendo cerca de 14 a cerca de 16 carbonos, o lipídio pode ser insaturado, mas o uso de lipídios saturados produz desempenho aperfeiçoado da presente inven- ção.
Exemplos não-limitativos de proporções de lipídio são conforme
segue. A proporção molar do fosfolipídio neutro selecionado para o fosfolipí- dio negativo selecionado na composição é cerca de 1 para 10 (cerca de 10% de fosfolipídios neutros), ou cerca de 1 para 5 (cerca de 20% de fosfolipídios neutros), ou cerca de 1 para 1 (50% de fosfolipídios neutros). A proporção 15 molar do fosfolipídio de cadeia longa selecionado para o lipídio de cadeia curta selecionado na composição é cerca de 4 para 1 (cerca de 20% de ca- deia curta), e pode ser cerca de 10 para 1 (10% de cadeia curta) a cerca de 3 para 1 (cerca de 33% de cadeia curta).
Um exemplo da proporção de cadeia longa para cadeia curta em uma concretização é conforme segue: [lipídio de cadeia longa neutro] + [lipí- dio de cadeia longa acídico])/[lipídio de cadeia curta neutro ou aniônico] é cerca de 4. Como outro exemplo, em uma concretização, a proporção molar de DOPS para DPPC na mistura varia de cerca de 10-8 a 1, ou cerca de 7-6 a 1, ou cerca de 5-3 a 1 ou cerca de 1-2 a 1, com ([DPPC]+[DOPS])/DHPC = cerca de 4. Em outras concretizações, [lipídio de cadeia longa neu- tro]+[lipídio de cadeia longa acídico])/[lipídio de cadeia curta neutro ou aniô- nico] pode ser cerca de 2 a cerca de 10, ou cerca de 3 a cerca de 8, ou cer- 5 ca de 4 a cerca de 7. Lipídios apropriados para uso na presente invenção podem ser selecionados de quaisquer lipídios conhecidos na técnica, ou conforme providos em www.avantilipidios.com.
Os lipossomas da presente invenção podem adicionalmente compreender um ou mais agente farmacêutico e/ou agente de formação de 10 imagem que foram presos no interior aquoso, ou entre bicamadas, ou por prendimento de moléculas hidrofóbicas dentro da bicamada. Várias técnicas podem ser empregadas para usar lipossomas para fármacos encapsulados alvos em tecidos hospedeiros selecionados, e fora de tecidos sensitivos. Es- tas técnicas incluem manipulação do tamanho dos lipossomas, sua carga de 15 superfície de rede, e sua rota de administração.
Os lipossomas da presente invenção podem também serem dis- tribuídos por uma via de distribuição passiva. Distribuição passiva de lipos- somas envolve o uso de várias rotas de administração, por exemplo, intra- venosa, subcutânea, intramuscular e tópica. Cada rota produz diferenças na localização dos lipossomas.
Os lipossomas da presente invenção são também ideais para distribuição de agentes tarapêuticos ou de formação de imagem através da barreira sangue-cérebro. A presente invenção refere-se a um método pelo qual lipossomas contendo agentes terapêuticos podem ser usados para dis- 25 tribuir estes agentes ao SNC no qual o agente está contido dentro de um lipossoma compreendido dos lipídios acima referenciados e saposin C, pro- saposin, ou uma variante de saposin. O lipossoma contendo um agente te- rapêutico pode ser administrado via injeção IV, injeção IM, distribuição transnasal, ou qualquer outro método de distribuição de fármaco transvascu- 30 lar, usando geralmente métodos aceitos na técnica.
Sem pretender estar limitado pela teoria, um mecanismo possí- vel de como fusão de membrana mediada por saposin ocorre é através de mudanças conformacionais da proteína. Das proteínas derivadas de pro- saposin, saposin A e saposin C mostram o grau mais alto de identida- de/similaridade de aminoácido. Computacionalmente, ambas proteínas são prognosticadas se dobrarem em motivos de grupo helicoidal anfipáticos. Em 5 geral, a dobra de saposin é uma estrutura secundária super comum com cinco α-espiras anfipáticas dobradas em um domínio globular simples, e é comum em ambas proteínas. Em uma concretização, o dobramento é ao longo de uma espiral centralmente localizada no amino-terminal, contra qual espirais 2 e 3 são acondicionadas de um lado, e espirais 4 e 5 a partir do 10 outro lado. Esta dobra pode proporcionar uma interface para interação da membrana.
Um mecanismo para fusão de membrana mediada por saposin com membranas de fosfolipídio aniônico é pensado ser um processo de du- as etapas. Na primeira etapa, interações eletrostáticas entre os aminoácidos 15 positivamente carregados (forma básica), Iysina (Lys) e arginina (Arg) dos saposins, e a membrana de fosfolipídio negativamente carregada resulta em uma associação entre estas duas espécies (ver Figura 1). Na segunda eta- pa, interações hidrofóbicas intramoleculares entre as espirais de duas prote- ínas saposin adjacentes trazem as duas membranas em proximidade bas- 20 tante para que a fusão das membranas ocorra (ver Figura 2).
Desse modo, de acordo com a presente invenção, a associação de saposins, e, em particular, saposin C, com um lipídio, geralmente requer uma faixa de pH de cerca de 5,5 ou menos, visto que a associação inicial de saposin C com a membrana ocorre através de uma interação eletrostática 25 dos resíduos de aminoácido básicos positivamente carregados de saposin C com a membrana aniônica. Desse modo, é altamente desejável que os ami- noácidos básicos existam em suas formas protonatadas de modo a alcançar um alto número de interações eletrostáticas. Isto pode ser efetuado, por e- xemplo, pela adição de uma solução ácida à proteína derivada de prosapo- 30 sin ou polipeptídeo antes da combinação da proteína ou polipeptídeo com a mistura de lipídio.
Alternativamente, proteínas de fusão relacionadas e peptídeos derivados a partir da família de saposin de proteínas podem não ter esta li- mitação de faixa de pH mais baixa e, desse modo, a faixa de pH de outras proteínas de fusão de membrana e peptídeos podem variar de pH fisiológico (pH de cerca de 7) a faixas de pH mais baixas.
5 Análise Estrutural de Lipossomas DOPS/DPPC/DHPC
DOPS (um lipídio de cadeia longa carregado negativamente), DPPC (um lipídio de cadeia longa neutro) e DHPC (um lipídio de cadeia cur- ta neutro) em forma de pó (disponível de Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) e é usado sem purificação adicional. Para medições de DLS1 a proporção 10 molar de [DOPS]:[DPPC] varia de 1:1 a 10:1, com ([DPPC]+[DOPS])/[DHPC] = 4 para todas as amostras. Misturas de lipídio seco são dissolvidas em H20 ultra-pura filtrada (Millipore EASYpure UV) a uma concentração de lipídio total de 10% em peso e misturadas por ciclo de turbulência e temperatura, entre 4 e 50°C.
Para preparação de proteína contendo lipossomas, SapC foi so-
bre expresso em células de E. coli usando o sistema pET de indução de IPTG, e proteínas His-etiquetada foram eluídas de colunas de níquel. Após diálise, as proteínas foram adicionalmente purificadas por cromatografia H- PLC conforme segue: A coluna de fase reversa C4 foi equilibrada com 0,1% 20 de ácido trifluoracético (TFA) por 10 minutos, em seguida as proteínas foram eluídas em um gradiente linear (0-100%) de 0,1% de TFA em acetonitrila por 60 minutos. O pico maior de proteína foi coletado e liofilizado, enquanto as concentrações de proteína foram determinadas conforme descrito anterior- mente. Os peptídeos H1 (YCEVCEFLVKEVTKLID) e H2 (EKEILDAF 25 DKMCSKLPK) foram sintetizados por SynPep Corp. (Califórnia, USA) e dis- solvidos em D20 a uma concentração de 1,5 mg/mL. 0,1% em peso de so- lução de lipídio com [DOPS]/[DPPC] = 10 e ([DPPC]+[DOPS])/DHPC = 4 foi, em seguida, adicionado às duas soluções de peptídeo (1,5 mg/mL) a uma proporção de volume de 12:1, e a solução de SapC com uma proporção de 30 volume de 1:1, produzindo uma concentração de peptídeo final (ou SapC) de 62,5 μΜ, (proporção molar de [lipídio]/[peptídeo] = 22/1), uma concentração mais alta do que o SapC requerido para induzir desestabilização de mem- brana. Uma amostra contendo somente 6,25 μΜ de SapC ([lipídio]/[SapC] = 220/1) foi também preparada para proposta de comparação.
No desenvolvimento de complexos de SapC-ULV, o efeito da composição no sistema DOPS/DPPC/DHPC ULV foi caracterizado, um sis- 5 tema adequado para o estudo de SapC - interações de membrana. Em par- ticular, as morfologias do agregado desta mistura de lipídio foram determi- nadas via difusão de Iuz dinâmica (DLS), microscopia de elétron de trans- missão (TEM) e medições de SANS. SANS foi, em seguida, usado para ca- racterizar a influência de H1, H2 e SapC nestas ULVs.
Para agregados na ausência de peptídeos, os resultados de
DLS e TEM confirmam a presença de uma população bimodal de ULV com diâmetros da ordem de ~ 200 e > 500 nm, consistente com ajustes em da- dos de SANS usando uma combinação de fatores de forma para vesículas elipsoidais achatadas nos pólos, e invólucros elipsoidais triaxiais. Os dados 15 de SANS revelam que SapC promove agregação de ULV em altas concen- trações (62,5 μΜ), enquanto em concentrações mais baixas (6,25 μΜ ), a estrutura da ULV é não perturbada. Ambos H1 e H2 induzem pequena dimi- nuição na espessura da membrana. Enquanto o peptídeo de H1 não parece modificar o tamanho da ULV, ou sua distribuição de tamanho, H2 altera o 20 equilíbrio entre os dois agregados de ULV presentes. Qualitativamente, es- tes resultados são consistentes com as descobertas anteriores de AFM.
Para determinar a estrutura e estabilidade dos lipossomas resul- tantes, os 10% em peso de soluções homogeneizadas são primeiro progres- sivamente diluídos em 5, 2, 1, 0,5 e 0,1% em peso de amostras. Antes das 25 medições de DLS, os 0,1% em peso de amostras de lipídio em estoque são diluídos 5, 50 e 200 vezes, e são analisados usando-se dimensionador de partícula N4+ (Coulter, Miami, FL). Usando-se este método, foi determinado que a diluição do sistema não tinha efeito no tamanho das partículas. Para experimentos de SANS, o protocolo de preparação de amostra foi aplicado a 30 [DOPS]/[DPPC] = 10 amostras, exceto D20 (99,9%, Chalk River Laboratori- es, Chalk River, ON), ao invés de H20, foi usado para obter-se uma amostra com uma concentração total de lipídio de 0,5% em peso. Os 0,5% em peso de amostra foi então adicionalmente diluído em 0,1 e 0,05% em peso de misturas usando-se um tampão ácido composto de volumes iguais de aceta- to de sódio 0,1 N (NaAc) e ácido acético 0,1 N (HAc). A solução resultante tinha um valor de pH de 4,78+0,02 em D20, e era estável sobre uma dilui- 5 ção 12 vezes com D20.
Experimentos de SANS foram efetuados no instrumento 30m NG7 SANS localizado no National Institute of Standards e Technology (NIST) Center for Neutron Research (NCNR, Gaithersburg, Mariland, USA). Nêutrons (λ) de comprimento de onda de 8,09 Á, uma lente de focalização 10 de nêutron e uma distância longa de amostra para detector (SDD = 15,3 m) foram usados para alcançar os vetores de difusão mais baixa [q =4/A.sen(0/2), onde Θ é o ângulo de difusão]. Dois outros SDD (5 e 1 m) fo- ram também usados, cobrindo uma faixa q combinada de 0,002 a 0,35 A1 para todos os três SDD. Os dados brutos 2-D foram corrigidos para sensibi- 15 Iidade de detector, conhecimento, difusão de célula vazia e transmissão de amostra. Os dados corrigidos foram então circularmente calculados a média, ao redor do centro de feixe, produzindo os dados habituais 1-D. Estes dados foram então postos em escala de intensidade absoluta usando-se o fluxo de feixe incidente conhecido. O platô incoerente foi determinado pelo cálculo da 20 média da intensidade de pontos de dados altos 10-20, e então subtraídos dos dados reduzidos.
O tamanho da ULV foi determinado por espectroscopia de corre- lação de fóton23'24 usando-se um analisador de tamanho de partícula de sub- mícron N4+ (Coulter, Miami, FL). Vesículas grandes foram encontradas para 25 serem polidispersas com diâmetros entre 20 - 800 nm. Os dados foram ad- quiridos a um ângulo de 90°, e analisados usando-se um processo de distri- buição de tamanho (SDP) com uma função de auto-correlação. Uma análise ANOVA foi usada para determinar significância estatística, e barras de erro denotam o desvio padrão.
Imagens TEM foram tomadas com um Hitachi TEM (H-7600,
H1TACH1, Japan) operado a uma voltagem de aceleração de 80 kV. Uma gota de cada amostra foi colocada em uma grade de níquel revestida com um filme formvar de suporte (malha 200, uma faixa de espessura de 30 a 75 nm, Electron Microscopy Sciences, PA). A grade foi colocada em um papel de filtro à temperatura ambiente por 2 horas antes de análise de TEM. A ex- periência foi otimizada em alta ampliação, enquanto a área de interesse foi 5 localizada a baixa ampliação (50 - 1,000 X). Uma vesícula simples pode ser vista até ampliação de 50.000 X. Micrográficos TEM foram tomados usando- se uma câmera digital dupla AMT CCD (2K x 2K, 16 bit) com software de aquisição de imagem apropriado.
Devido ao SapC somente funcionar na presença de lipídios insa- turados carregados negativamente (isto é, DOPS) em condições ácidas, 23 o presente sistema é composto principalmente de DOPS e quantidades meno- res de DPPC e DHPC. Os resultados de DLS das várias amostras de pro- porção molar de [DOPS]/[DPPC] (Tabela 1) indicam que somente [DOPS]/[DPPC] = 10 amostras exibem uma distribuição de tamanho bimo- dal, enquanto as amostras remanescentes contêm pelo menos três popula- ções. Por esta razão, somente o [DOPS]/[DPPC] = 10 amostras foi usado para investigar adicionalmente os efeitos de SapC, H1 e H2 na estrutura destas ULVs. Os dados de DLS também mostram que as estruturas das amostras de DOPS/DPPC/DHPC são estáveis sobre um período de 12 me- ses (Tabela 2). Isto é evidência que a adição de DPPC e DHPC aumenta dramaticamente, comparado a DOPS sonicados, a estabilidade destes agre- gados, e oferecem a possibilidade que eles podem ser usados nas aplica- ções práticas.
Nota-se que os tamanhos aparentes, ou raios hidrodinâmicos de 25 ULV, conforme calculados de resultados de DLS, estão baseados na suposi- ção que as ULVs são esféricas. Conforme discutido em detalhes na literatu- ra,29 para vesículas estendidas ou achatadas nos pólos, uma determinação precisa da proporção axial da vesícula requer medição de ambos os raios hidrodinâmicos da vesícula e raio de rotação, por DLS e difusão de Iuz está- 30 tica (SLS), respectivamente. Para vesículas elipsoidais, o raio hidrodinâmico aparente conduzirá a uma subestimação ou superestimação pequena (<10%) de uma massa de ULV ou área superficial, para vesículas achatadas nos pólos ou estendidas, respectivamente.
Tabela 2: Raios hidrodinâmicos (nm) de dados de DLS de agregados de DOPS/DPPC/DHPC em solução, onde ([DOPS]+[DPPC])/DHPC = 4. O pa- rêntese indica a percentagem de população de cada agregado.
Proporção de Duração Rh, nm (%)/1-100 100-200 400-800 DOPS/DPPC (Dias) 1 1 40(79) 145(12) 441(9) 1 40 42(76) 173(7) 705(17) 1 29(78) 157(11) 570(11) 40 Nenhum 147(51) 689(49) 1 Nenhum 138(70) 582(30) 40 Nenhum 178(56) 746(44) 240 Nenhum 161(49) 452(51) 365 Nenhum 159(51) 471(49) 5 A Figura 2 mostra dados de SANS do 0,1% em peso de mistura
de lipídio ([DOPS]/[DPPC] = 10) e as misturas de lipídio dopada com H1 e H2 em tampão de D20 acetato. Níveis inferiores de SapC (6,25 μΜ) não parecem perturbar o tamanho de ULV ou sua estrutura de membrana (o mesmo como misturas não-dopadas). No caso de níveis altos de SapC (62,5 10 μΜ), o sistema de lipídio dopado com SapC forma grandes agregados que precipitam da solução (não acessível para SANS), uma observação consis- tente com estudos prévios indicando que SapC desestabiliza as membra- nas.23 Portanto, foi somente focalizado nos efeitos de H1 e H2 na estrutura das vesículas. Os dados de SANS de 0,1% de misturas de 15 DOPS/DPPC/DHPC (triângulos), dopadas com Hl (quadrados) e dopadas com H2 (círculos) são mostrados na Figura 2. As linhas sólidas representam melhores ajustes aos dados. Os dois picos amplos, indicados por setas, são o resultado de comprimentos de correlação presentes no sistema. As linhas pontilhadas e tracejadas são, respectivamente, os resultados dos modelos 20 de invólucro triaxiais elipsoidais e achatados nos pólos usados para assentar os 0,1% de sistema não-dopado. As curvas de difusão das amostras não dopadas com SapC mostradas na Fig. 2 compartilham uma característica comum em que elas contêm dois picos amplos centrados ao longo de q ~ 0,01 e 0,03 Â'1, indicativos da presença de dois comprimentos de correlação no sistema. Para melhor compreender as origens destes picos, 0,05% em peso de mistura de lipídio pura foi também examinado. Os dados de SANS 5 dos 0,05% em peso de amostra podem ser escalados para sobrepor os 0,1% em peso de dados de amostra indicando que os dois picos amplos são inerentes às morfologias do agregado, e não o resultado de interações inter- partículas.
Para q > 0,06 Â"1, as diferenças na intensidade entre os três con- juntos de dados (Fig. 2) são indistinguíveis. A análise de um gráfico de Gui- nier modificado30 (também conhecido como gráfico de Kratky-Porod) aplica- da a todas as três amostras, onde ln(l-q2) tem um relacionamento linear com q2 na faixa entre 5xl0'3 e 2,5xl0'2 A1, indica a existência de uma estrutura lamelar. A Figure 3 mostra o gráfico de Guinier modificado para os 0,1% em peso de mistura de DOPS/DPPC/DHPC (círculos), sistema dopado com Hl (triângulos), e sistemas dopados com H2 (quadrados). As linhas represen- tam os melhores ajustes para os dados. A espessura da bicamada é então derivada da raiz quadrada da inclinação multiplicando-se pela raiz de 12. Os resultados de melhor ajuste mostram que a mistura não-dopada forma a bi- camada mais espessa (37,7 ± 0,7) A, enquanto as bicamadas dopadas com H1 e H2 são levemente mais delgadas (35,8 ± 0,8 e 36,2 ± 0,6 Á, respecti- vamente).
Para q < 0,06 A"1, a curva de difusão do sistema dopado com Hl, comparada ao sistema dopado com H2, é similar àquela de misturas de lipí- dio não-dopadas, implicando que nenhuma mudança significante está ocor- rendo na morfologia do agregado após dopagem das membranas com pep- tídeo H1. Esta observação é também consistente com um relatório prévio de AFM, onde H1 foi verificado não ter efeito nas bicamadas de l-palmitoil-2- oleoil fosfatidilserina (POPS). No caso de dados de SANS de amostra dopa- da com H2, diferenças qualitativas daquela da mistura de lipídio pura são observadas na inclinação dos dados da região de baixo q (q < 0,003 A'1), e a largura e intensidades dos dois picos. As imagens TEM de todas as três amostras foram obtidas, e par-
tículas com duas populações de morfologias foram observadas. A Figure 4 mostra imagens TEM representativas de uma mistura de DOPS/DPPC/DHPC (A e B), e misturas dopadas com Hl (C e D), e dopadas 5 com H2 (E e F). As vesículas tri-axiais elipsoidais, isto é, A, C e E, são todas de tamanho similar (área de seção transversal projetada de 150 - 200 nm x 600 - 800 nm), como são as vesículas achatadas nos pólos com raios proje- tados ao redor de 100 -150 nm. Estas dimensões são consistentes com os resultados de melhor ajuste dos dados de SANS, de acordo com o modelo 10 matemático para uma vesícula unilamelar triancial elipsoidal conforme se- gue:
presentado como um invólucro elipsoidal (Fig. 4) com comprimentos de nú- cleo diferentes ao longo dos três eixos principais, anúcieo, bnúcieo e cnúcieo (anú- 15 cieo ^ bnúcieo ^ cnúcieo)· Os comprimentos de invólucro ao longo dos eixos, ainvó-
Iucroi binvólucro © Cjnvólucro. SãO defínidOS COmO (anúcleo Oi (bnúcieo "*"/)© (Cnúcleo
I), respectivamente, onde I é a espessura da bicamada. Nota-se que esta aproximação não assume uma espessura de bicamada constante sobre a ULV total ao longo da direção normal da bicamada. O fator de forma para 20 um invólucro triancial elipsoidal calculado pela média sobre todas as possí- veis orientações, Ptriax(q), pode, desse modo, ser expresso como
(i representa invólucro ou núcleo), e Vtotai e Vnúcieo são os volumes total e de núcleo do elipsóide, respectivamente. Pd2o e piipjdio denotam as densidades de comprimento de difusão de D20 e lipídio.
O modelo para uma vesícula unilamelar triancial elipsoidal é re-
4·,,, (<?) = Ápn,o ~ Pm: \
onde j\ é a função de Bessel esférica de primeira ordem, j,(x) = {[senx/x2] - [cosx/x]}, Uj é definido como Para vesículas achatadas nos pólos elipsoidais, o fator de forma Pachatada nos póios(q) pode ser obtido por deixando-se cnúdeo = bnúcieo- Desse modo, Ui torna-se
J - 2 f *V 1 í «V '1S
</Jai' cos — j t h~ si»
Além disso, a função de Schultz, f(a), é empregada para descre- ver a distribuição do eixo mais curto (isto é, anúcieo) conforme mostrado abai- xo
/(<»)=
(«}Γ 1 :
W I-P
I'"*1)-',
'' expí--1- ÍA-3)
onde <a> é a média de a. p é polidispersidade definida como σ/<a>, onde σ é o desvio padrão de a. Um valor razoável para p está na faixa de O-I.45 A função Gama, ^ (l/p2), é usada para normalizar a integral da função de Β- ΙΟ chultz. A Eq. A-3 é posta dentro da integração interna da Eq. A-I para ser
PM,(q) - } J /(«,„,) · . I. x. q Y da,^dx (A-4)
*
A intensidade de difusão total para vesículas de não interação (achatadas nos pólos e tri-axiais elipsóides) pode então ser escrita como
I(Cj) ” (Φϋρ ~ μJ M ^ (A-5)
onde Φϋρ e OaChatada nos pólos são as frações de volume do lipídio total e invólu- cro achatado nos pólos em solução, respectivamente. O procedimento de ajuste é escrito no código de programação de IGOR, que é revisado a partir do pacote de análise de dados desenvolvido pelo grupo NIST SANS.
O modelo proposto para uma vesícula unilamelar, triancial elip- soidal de bicamada é mostrado na Figura 5. As regiões hidrofílicas (grupos principais) e hidrofóbicas (caudas de hidrocarboneto) são mostradas. No caso de vesículas achatadas nos pólos, b se iguala a c.
Uma morfologia tem uma projeção circular 2-D com um raio ~ 150 - 200 nm, enquanto a outra morfologia tem uma projeção elipsoidal a- Iongada com os eixos longo e curto de dimensões entre 600 e 800 nm, e 100 e 200 nm, respectivamente. Este resultado é consistente com os dados de DLS; contudo, a distribuição bimodal pode ser, ou uma mistura de vesículas esféricas e elipsoidais, ou aquela de vesículas achatadas nos pólos e tri- axiais, dependendo da espessura das partículas ao longo do eixo perpendi- cular à projeção. Desde que a primeira uma (mistura de vesículas esféricas e elipsoidais) não se ajusta a esses dados de SANS, foi formulado modelo que inclui os invólucros vesiculares achatados nos pólos e tri-axiais para a- juste do resultado de SANS. (Ver modelo matemático para uma vesícula uni- lamelar triancial de bicamada, acima). A morfologia achatada nos pólos tem dois eixos maiores de comprimento iguais e um eixo menor polidisperso (mostrados nas Figs. 4B, D, F), enquanto a morfologia triancial elipsóide tem três eixos de comprimento desiguais (Figs. 4A, C, E). Este modelo requer oito parâmetros de ajuste, a saber, três eixos para o invólucro triancial elip- soidal, dois eixos para o invólucro achatado nos pólos, polidispersidade do eixo mais curto para a morfologia achatada nos pólos, a espessura de bica- mada, e a proporção de população de triaxial-para-achatada nos pólos. Con- tudo, os resultados das medições de TEM e DLS, bem como a análise de Kratky-Porod, permite-nos restringir a espessura da bicamada e os compri- mentos dos dois eixos maiores no caso do invólucro achatado nos pólos, e os dois eixos mais longos para o invólucro tri axial elipsoidal. Isto deixa os comprimentos do eixo mais curto, a polidispersidade do eixo mais curto do invólucro achatado nos pólos e a proporção de população de triaxial-para- achatada nos pólos como parâmetros de ajuste livres. O resultado de melhor ajuste mostra que as elipsóides achatadas nos pólos e tri-axiais têm uma espessura de bicamada de 40 ± 5 Â, levemente maior do que o resultado obtido a partir do gráfico de Guinier modificado. O eixo mais curto da elipsói- de triancial e eixo menor das morfologias achatadas nos pólos são 250 ± 20 Á e 100 ± 10 Â, respectivamente. Estas características dão ocorrência aos picos amplos (~ 0,01 e -0,03 A'1) nos dados de SANS. Além disso, os dados de melhor ajuste para os comprimentos do eixo maior da elipsóide achatada nos pólos (~ 150 nm) e os dois eixos mais longos das morfologias de elip- sóide (- 200 e 500 nm) são consistentes com o resultado de TEM mostrado na Fig. 4. A percentagem de população de elipsóides achatadas nos pólos é verificada ser ~ 40 ± 10% no caso da mistura dopada com H2, enquanto é ~ 60 ± 10% para as misturas dopadas e não dopadas com H1. O fato que uma intensidade mais alta do primeiro pico (-0,01 Â'1) é observada no sistema dopado com H2, indicativo de população mais alta de vesículas tri-axiais e- lipsoidais, é consistente com o resultado de melhor ajuste. Parece, portanto, 5 que o peptídeo de H2 favorece a formação de vesículas tri-axiais elipsoidais. Em resumo, todas as três técnicas apontam para a presença de duas morfo- logias, a saber, elipsóides tri-axiais e achatadas nos pólos.
As misturas de DPPC/DHPC/DOPS usadas para formar siste- mas de ULV usando-se fragmentos de SapC e SapC (H1 e H2) surpreen- 10 dentemente mostraram comportamento inesperado da mistura de lipídio. Baseado nesses resultados experimentais anteriores,3 nessas expectativas iniciais foram encontrar condições apropriadas para a formação de ULV es- férica monodispersa. Contudo, conforme foi notado acima, verificou-se que, enquanto DPPC/DHPC/DOPS forma ULV, as distribuições de tamanho das 15 misturas examinadas por DLS eram multimodais. No caso de ULV bimodal- mente distribuída, foi verificado que cada população tem uma forma esférica e uma distribuição de tamanho estreita. Esta observação nos conduz a es- pecular que o mecanismo para presente formação de ULV é diferente da- quele que ocorre em misturas de DMPC/DHPC/DMPG.
Em estudos prévios, foi verificado que a formação de ULV de
baixa polidispersidade requer aquecimento do sistema a partir de morfologia de micela de bicamada de baixa temperatura (bicelas). O tamanho da ULV foi verificado ser dependente do tamanho das bicelas, e foi mais similarmen- te modulado por fatores tais como, a energia de tensão de linha de aro, a 25 rigidez de encurvamento de bicamada, e a taxa de coalescência de bicela. Além disso, a transição DMPC/DHPC/DMPG bicela -> ULV foi proximamente associada com a transição gel -> cristalino líquido de DMPC, que ocorre a ~ 23°C. Se a DPPC/DHPC/DOPS era para exibir um comportamento similar, é provável que a morfologia bicelar seria encontrada perto ou abaixo de -11 °C, 30 a temperatura onde cadeias de ácido graxo de DOPS' suportam uma transi- ção de fusão. Desde que a diluição das misturas de DMPC/DHPC/DMPG, em altas temperaturas, conduz à formação de ULV com uma distribuição de ο
tamanho ampla, foi concluído que o mecanismo de formação de ULV aqui é diferente daquele anteriormente investigado.
A técnica anterior ensina que após diluição, e como um resulta- do de flutuações de membrana coletivas, pilhas de DOPS Iamelar não se 5 ligam a formação de ULV polidispersa, ensinando o uso de DOPS para for- mar populações de lipossomas bimodais. Desse modo, embora suspensões puras de DOPS possam também formar ULV, pode-se rejeitar isto como o mecanismo de formação ocorrendo aqui. Foi especulado que as ULVs não- esféricas observadas são estabilizadas por ter DHPC de cadeia curta neutra 10 povoando a região de curvatura alta da ULV, enquanto DPPC de cadeia lon- ga proporciona o requisito de rigidez necessário para bicamadas estáveis.
A presente descrição coloca a descoberta inesperada que, em- bora uma distribuição de tamanho de ULV bimodal seja observada, as poli- dispersidades das populações individuais são razoavelmente baixas. Pode 15 ser que estas duas populações representem equilíbrio, estados de energia mínima que podem mudar o material livremente, ou pode ser que as ULVs individuais sejam estruturas dinâmicas capazes de se desviar para trás e para frente entre estas duas morfologias. A noção que as morfologias se transformam livremente foi prognosticadas teoricamente, e pode também ser 20 análoga às observações experimentais prévias onde vesículas livres esten- didas se transformam em vesículas achatadas nos pólos, e vice-versa.29,35,36
A morfologia de ULV elipsoidal é também inesperada, mas pode ser uma conseqüência de heterogeneidades laterais de membrana. Foi re- centemente mostrado por SANS que misturas ternárias contendo lipídios 25 saturados e insaturados podem exibir segregação lateral. Além disso, verifi- cou-se que, como uma função de aumento de temperatura através da transi- ção gel -> cristalino líquido, uma transição complicada esférica-poligonal- elipsoidal se agiganta em ULV. 38 A forma aparentemente poligonal (Fig 4B) presumivelmente resultada da separação de fase lateral entre estas duas 30 fases, onde os lipídios de DOPS e DHPC estão na fase La, enquanto DPPC está em fase de gel. Em adição, devido a espécie de lipídio diferente possuir comprimentos de cadeia de hidrocarboneto diferentes, cada domínio pode contribuir para determinar o comprimento de cada um dos eixos de elipsóide. Ao melhor desse conhecimento, vesículas monodispersas tri-axiais elipsoi- dais de sistemas de fosfolipídio puros ou misturas de lipídio não foram ante- riormente reportados, embora existam exemplos de transformação de vesí- 5 cuias esféricas em vesículas achatadas nos pólos ou de forma irregular in- duzidas pela polimerização de actin. Foi especulado que o resultado pode ser devido a separação de fase lateral dentro da membrana.
Os melhores ajustes aos dados de q altos resultam em uma es- pessura de bicamada entre 38 e 40 Â. Desde que o modelo de invólucro e- 10 Iipsoidal assuma uma espessura de bicamada constante ao longo do eixo principal, e uma densidade de comprimento de difusão uniforme através da bicamada, o valor para a espessura de bicamada pode ser esperado ser le- vemente maior do que valores obtidos de modelos mais detalhados. O gráfi- co de Guinier modificado indica que, comparado a ULV dopada com H1 e 15 H2, ULV não-dopada, possui uma bicamada mais espessa. Isto demonstra que embora H1 e H2 tenha um efeito de adelgaçamento na bicamada, eles não desestabilizam a bicamada. Wang et al. reportou que H1 e H2 podem inibir fusão de membrana induzida por SapC, implicando que eles possivel- mente se ligam no mesmo local de DOPS como SapC, reduzindo, desse 20 modo, a interação de SapCs com a membrana. Seus resultados também mostraram que H1 é mais efetiva do que H2 na inibição de fusão de mem- brana. Isto é consistente com o fato que H1 tem um efeito maior no adelga- çamento da bicamada.
Um estudo de AFM anterior mostrou que H2 formou emplastros 25 na membrana, que eram inferidos para serem estruturas similares à haste povoando regiões de defeitos de bicamada. Os dados de SANS indicam uma alteração de população de morfologias de partícula de ULV achatada nos pólos a triancial após dopagem com H2, comparados a ULV não-dopada e dopada com Hl. Desde que o DHPC de cadeia curta seja conhecido por 30 criar defeitos na membrana, esta mistura de lipídio pode proporcionar um ambiente adequado para H2 para associar-se com, conduzindo à formação preferida de ULV tri axial elipsoidal. Através do uso de SANS, TEM e DLS, as várias morfologias as- sumidas pelas misturas de DOPS/DPPC/DHPC foram caracterizadas. Duas morfologias de baixa polidispersidade são observadas, a saber, ULV acha- tada nos pólos e triancial elipsoidal. Aqui, o mecanismo de formação de ULV parece diferir daquele reportado anteriormente, e demonstrou que ULV de baixa polidispersidade pode ser formada mesmo na ausência do lipídio de cadeia longa suportando uma transição de um gel -> cristalino líquido. O re- sultado de SANS mostra que H1 e H2 não desestabilizam a morfologia de bicamada, um resultado consistente com dados prévios de AFM, mas que H1 tem um efeito maior no adelgaçamento da bicamada. Além disso, a adi- ção do peptídeo de H2 aumenta a proporção de vesículas triaxiais-para- achatadas nos pólos elipsoidais, presumivelmente devido a uma mudança nas miscibilidades de vários componentes de lipídio. Por outro lado, a adição de SapC desestabiliza a membrana e resulta na precipitação, de solução, de agregados grandes.
O aumento da evidência sugere que vesículas Iipossomais são transportadores efetivos para uma variedade de terapêuticos. Contudo, a eficiência de um sistema particular no tratamento de doença e sua viabilida- de comercial são de grande importância. Na presente descrição, é demons- 20 trado que ULV contendo fosfotidilserina mostrou se formar espontaneamen- te, são altamente estáveis, e de baixa polidispersidade. O protocolo descrito é adequado para escala de produção industrial de ULV ligado a SapC, útil para o desenvolvimento de complexos de SapC-PS que podem, então, se- rem testados para transporte in vivo de agentes terapêuticos.
Os lipídios de cadeia longa da presente invenção podem ser
qualquer fosfolipídio de cadeia longa que tem uma cadeia de carbono de cerca de 14 a cerca de 24 carbonos de comprimento, ou cerca de 18 a cerca de 20 carbonos de comprimento. Uma lista exaustiva de lipídios está dispo- nível em www.avantilipidios.com. Um versado na técnica apreciará quais 30 lipídios podem ser usados na presente invenção. Enquanto qualquer combi- nação de lipídios de cadeia longa e de cadeia curta pode ser usada, algu- mas combinações produzem lipossomas mais estáveis. Por exemplo, en- quanto não se pretendendo limitar a presente invenção, o seguinte pode guiar a seleção da composição da qual os lipossomas são formados: onde cadeias longas de cerca de 20 a cerca de 24 carbonos de comprimento são usadas, lipídios de cadeia curta tendo comprimentos de cerca de 6 a cerca 5 de 8 podem ser usados para estabilidade aperfeiçoada de lipossoma. Onde comprimentos de cadeia longa de cerca de 14 a cerca de 18 são usados, lipídios de cadeia curta tendo comprimentos de cerca de 6 a cerca de 7 po- dem ser usados para estabilidade aperfeiçoada de lipossoma. Enquanto es- tas combinações de lipídios produzem lipossomas mais estáveis, outras 10 combinações podem ser usadas com sucesso, e não são pretendidas para serem repudiadas. A Tabela 2 ilustra exemplos de combinações de fosfolipí- dio que podem ser usadas para gerar lipossomas mais estáveis. Estes e- xemplos, contudo, não são significativos para implicar que outras combina- ções de fosfolipídios não podem ser usadas com a presente invenção.
15 TABELA 2: Exemplos Não-Limitativos de Combinações de Fosfolipídios de Cadeia Longa e de cadeia Curta.
Comprimento de Fosfolipídio de Comprimento de Fosfolipídio de Cadeia Longa Cadeia Curta (Número de Carbonos) (Número de Carbonos) 14 a 24 4 a 8 16 a 22 5 a 7 18 a 20 6 a 7 20 a 24 7 a 8 14a 18 4 a 6 Adicionalmente, a presença ou ausência de hidrocarbonetos de saturação na cadeia de lipídio efetua estabilidade do lipossoma. Por exem- plo, lipídios tendo comprimentos de cadeia de cerca de 18 ou maiores são 20 usados, o fosfolipídio pode ser saturado ou insaturado, preferivelmente insa- turado. Para lipídios de cadeia curta mais curtos, tais como aqueles tendo cerca de 14 a cerca de 16 carbonos, os lipídio podem ser insaturados, mas o uso de lipídios saturados produz desempenho aperfeiçoado da presente in- venção.
Agentes Adicionais É também contemplado para ser uma parte da presente inven- ção preparar microesferas usando-se composições de matéria em adição aos lipídios e polímeros biocompatíveis descritos acima, provido que as mi- croesferas assim preparadas encontram a estabilidade e outros critérios aqui 5 colocados.
Propileno glicol pode ser adicionado para remover turvação, faci- litando dispersão ou dissolução das partículas de lipídio. O propileno glicol pode também funcionar como um agente de espessamento que aperfeiçoa a formação da microesfera e estabilização pela aumento da tensão superficial 10 na membrana da microesfera ou pele. É possível que o propileno glicol adi- cionalmente funcione como uma camada adicional que reveste a membrana ou pele da microesfera, proporcionando, desse modo, estabilização adicio- nal. Como exemplos de tais compostos de estabilização básicos ou auxilia- res adicionais, existem tensoativos convencionais que podem ser usados, 15 por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.684.479 e 5.215.680.
Compostos de estabilização auxiliares e básicos adicionais in- cluem agentes, tais como óleo de amendoim, óleo de canola, óleo de oliva, óleo de açafroa, óleo de milho, ou qualquer outro óleo comumente conheci- do por ser ingerível que seja adequado para uso como um composto de es- 20 tabilização de acordo com os requerimentos e instruções colocados no pre- sente relatório descritivo.
Em adição, os compostos usados para produzir sistemas de mi- cela misturados podem ser adequados para uso como compostos de estabi- lização básicos ou auxiliares, e estes incluem, mas não estão limitados a: 25 (dodecil-)brometo de lauriltrimetilamônio, brometo de (hexadecil- )cetiltrimetilamônio, nio(tetradecil-)brometo de miristiltrimetilamô, cloreto de alquildimetilbenzilamônio (alquil=C12,C14,C16,), brometo/cloreto de ben- zildimetildodecilamônio, benzildimetil brometo/cloreto de hexadecilamônio, benzildimetil brometo/cloreto de tetradecilamônio, brometo/cloreto de cetil- 30 dimetiletilamônio, ou brometo/cloreto de cetilpiridínio.
Verificou-se que os lipossomas usados na presente invenção podem ser controlados de acordo com o tamanho, solubilidade e estabilida- de ao calor pela escolha de entre vários agentes de estabilização adicionais ou auxiliares aqui descritos. Estes agentes podem afetar estes parâmetros das microesferas não somente por sua interação física com os revestimen- tos de lipídio, mas também por sua capacidade de modificar a viscosidade e tensão superficial da superfície do lipossoma. Consequentemente, os Iipos- somas usados na presente invenção podem ser favoravelmente modificados e adicionalmente estabilizados, por exemplo, pela adição de uma ou mais de uma ampla variedade de (a) modificadores de viscosidade, incluindo, mas não limitados a, carboidratos e seus derivados fosforilatados e sulfonatados; e poliésteres, preferivelmente com faixas de peso molecular entre 400 e 100.000; di- e trihidróxi alcanos e seus polímeros, preferivelmente com fai- xas de peso molecular entre 200 e 50.000; (b) agentes de emulsificação e/ou solubilização podem também ser usados em conjunto com os lipídios para alcançar modificações desejadas e adicionalmente estabilização; tais agen- tes incluem, mas não estão limitados a, acácia, colesterol, dietanolamina, monoestearato de glicerila, álcoois lanolínicos, lecitin, mono- e diglicerídeos, monoetanolamina, ácido oleico, oleil álcool, poloxâmero (por exemplo, polo- xâmero 188, poloxâmero 184, e poloxâmero 181), estearato de polioxietileno 50, polioxil 35 óleo de rícino, polioxil 10 oleil éter, polioxil 20 cetoestearil éter, estearato de polioxila 40, polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 60, polissorbato 80, diacetato de propileno glicol, monoestearato de propileno glicol, sulfato de sódio lauril, estearato de sódio, monolaurato de sorbitan, mono-oleato de sorbitan, monopalmitato de sorbitano, sorbitan monoesteara- to, ácido esteárico, trolamina, e cera de emulsificação; (c) agentes de sus- pensão e/ou de aumento de viscosidade que podem ser usados com os lipí- dios incluem, mas não estão limitados a, acácia, ágar, ácido algínico, alumí- nio monoestearato, bentonita, magma, carbômero 934P, carboximetilcelulo- se, cálcio e sódio e sódio 12, carrageenaa, celulose, dextrana, gelatina, go- ma guar, goma de feijão de alfarrobeira, veegum, hidroxietil celulose, hidro- xipropil metilcelulose, magnésio-alumínio-silicato, metilcelulose, pectin, óxido de polietileno, povidona, alginato de propileno glicol, dióxido de silício, algi- nato de sódio, tragacanto, goma xantana, alfa-d-gluconolactona, glicerol e manitol; (d) agentes de suspensão sintéticos podem também serem utiliza- dos, tais como polietilenoglicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP)1 polivinilálco-
ol (PVA)1 polipropileno glicol , e polissorbato; e (e) agentes de elevação de tonicidade podem ser incluídos; tais agentes incluem, mas não estão Iimita- 5 dos a, sorbitol, propilenoglicol e glicerol.
Os diluentes que podem ser empregados para criar um ambiente aquoso incluem, mas não estão limitados a, água, ou deionizada ou conten- do qualquer número de sais dissolvidos, etc., que não interferirão com a cri- ação e manutenção das microesferas estabilizadas, ou seu uso como agen- tes de contraste de MRI; e salina normal e salina fisiológica.
Os polímeros biocompatíveis úteis como materiais de estabiliza- ção para preparação de vesículas preenchidas com gás e precursor gasoso podem ser de origem natural, semi-sintética (modificada natural) ou sintética. Conforme aqui usado, o termo polímero denota um composto compreendido 15 de duas ou mais unidades monoméricas de repetição, e preferivelmente 10 ou mais unidades monoméricas de repetição. A frase polímero semi-sintético (ou polímero modificado natural), conforme empregada aqui, denota um po- límero natural que foi quimicamente modificado de algum modo. Polímeros naturais exemplares adequados para uso na presente invenção incluem po- 20 lissacarídeos que ocorrem naturalmente. Tais polissacarídeos incluem, por exemplo, arabinanas, fructanas, fucanas, galactanas, galacturonanos, glu- canas, mananas, silanas (tais como, por exemplo, inulin), levan, fucoidan, carrageenaa, galatocarolose, ácido péctico, pectinas, incluindo amilose, pul- lulan, glicogênico, amilopectino, celulose, dextrana, dextrino, dextrose, poli- 25 dextrose, pustulan, chitin, agarose, keratan, condroitan, dermatan, ácido hia- lurônico, ácido algínico, goma xanthana, amido e vários outros homopolíme- ros naturais ou heteropolímeros, tais como aqueles contendo um ou mais dos seguintes aldoses, cetoses, ácidos ou aminas: eritrose, treose, ribose, arabinose, xilose, lixose, alose, altrose, lucose, manose, gulose, idose, ga- 30 Iactose1 talose, eritirulose, ribulose, xilulose, psicose, frutose, sorbose, taga- tose, manitol, sorbitol, lactose, sacarose, trehalose, maltose, celobiose, glici- na, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspárti- co, ácido glutâmico, lisina, arginina, histidina, ácido glucurônico, ácido glucô- nico, ácido glucárico, ácido galacturônico, ácido manurônico, glucosamina, galactosamina, e ácido neuramínico, e derivados destes que ocorrem natu- ralmente. Consequentemente, polímeros adequados incluem, por exemplo, proteínas, tais como albumina. Polímeros semi-sintéticos exemplares inclu- em carboximetilcelulose, hidroximetilcelulose, hidroxipropilmetil-celulose, metilcelulose, e metoxicelulose. Polímeros sintéticos exemplares adequados para uso na presente invenção incluem polietilenos (tais como, por exemplo, polietileno glicol, polioxitileno e tereftalato de polietileno), polipropilenos (tais como, por exemplo, polipropileno glicol), poliuretanos (tais como, por exem- plo, polivinil álcool (PVA)1 cloreto de polivinilo e polivinilpirrolidona), poliami- das incluindo náilon, poliestireno, ácidos polilácticos, hidrocarbonetos fluori- natados, carbonos fluorinatados (tais como, por exemplo, politetrafluoroetile- no), e polimetilmetacrilato, e derivados destes. Métodos para a preparação de vesículas que empregam polímeros como compostos de estabilização serão prontamente aparentes àqueles técnicos no assunto, uma vez que provido com a presente descrição, quando a presente descrição é acoplada com informação conhecida na técnica, tais como aquelas descritas e referi- das na Patente dos Estados Unidos No. 5.205.290, as revelações da qual sendo aqui incorporadas, desse modo, por referência, em sua totalidade.
Alternativamente, um ou mais agentes antibactericidas e/ou con- servantes podem ser incluídos na formulação das composições, tais como benzoato de sódio, sais de amônia quaternária, azida de sódio, metil para- beno, propil parabeno, ácido sórbico, ascorbilpalmitato, hidroxianisol butila- tado, hidroxitolueno butilatado, clorobutanol, ácido dehidroacético, etilenodi- amina, monotioglicerol, benzoato de potássio, metabissulfeto de potássio, sorbato de potássio, bissulfeto de sódio, dióxido de enxofre, e sais mercuri- ais orgânicos. Tal esterilização, que pode também ser alcançada por outros meios convencionais, tal como por irradiação, será necessária onde as vesí- cuias estabilizadas são usadas para formação de imagem sob circunstâncias invasivas, por exemplo, intravascularmente ou intraperitonealmente. Os mei- os apropriados de esterilização serão aparentes àqueles técnicos no assunto baseados na presente descrição.
Dissacarídeos
Em adição aos ingredientes adicionais precedentes, dissacarí- deos podem ser adicionados à mistura de lipídio seca antes ou em conjunto 5 com a adição da solução aquosa, podem ser adicionados para aperfeiçoar a estabilidade do lipossoma. Exemplos não-limitativos de dissacarídeos ade- quados incluem, mas não estão limitados a, trehalose, sacarose, maltose, lactose, melibiose, galactose, glicose, frutose, ou lactose. Em geral, o dissa- carídeo compreende cerca de 50 a cerca de 100 mg de açúcar por 10 mg de 10 proteína total, isto é, uma proporção de cerca de 1:10 de proteína para dis- sacarídeo.
Agentes Antimembrana
Em adição, outros lipídios conhecidos como agentes anticâncer (ou "antimembrana") podem ser usados com as composições e métodos 15 descritos. Por exemplo, Edelfosina (sn-ET-18-OCH3 ou l-O-Octadecil-2-O- metil-sn-glicero-3-fosforilcolina) Miltefosina (Hexadecilfosfocolina), ou outros fosfolipídios, tais como lisofosfatídeos, cardiolipin, ceramidas, esfingomielin, esfingosinas, cerebrosidas, colesterol, formas modificadas destes lipídios, e combinações de qualquer dos lipídios antes mencionados, podem ser adi- 20 cionados às composições aqui descritas. Composições exemplares podem compreender SapC (100 μΜ) + DOPS (280 μΜ) + Edelfosina (20 μΜ); ou SapC (100 μΜ) + DOPS (290 μΜ) + Edelfosina (10 μΜ). A quantidade de Edelfosina pode variar de cerca de 2 a cerca de 50 μΜ; a quantidade de DOPS pode variar de cerca de 250 μΜ a cerca de 298 μΜ, onde SapC é 25 aproximadamente 100 μΜ. Outra faixa exemplar inclui proporção molar de SapC:DOPS:Edelfosina de 1:3:0.2 a 1:10:0.7. Onde SapC é descrito, deve ser compreendido que outras proteínas derivadas de prosaposin polipeptí- deos conforme aqui descrito, podem ser substituídas ou usadas em combi- nação.
Embora esta invenção tenha sido descrita em conjunto com sua
concretização mais preferida, concretizações adicionais estão dentro do es- copo e espírito da invenção reivindicada. O dispositivo preferido desta inven- ção é pretendido meramente para ilustrar a invenção, e não limitar o escopo da invenção, a medida que ela é definida nas reivindicações que se seguem.

Claims (30)

1. Composição para formação de uma população de Iipossomas compreendendo a) pelo menos um fosfolipídio aniônico de cadeia longa; b) pelo menos um fosfolipídio de cadeia curta; c) e uma proteína derivada de prosaposin ou polipeptídeo; Iipossoma é espontaneamente formado sob adição de uma solução aquosa.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo menos um fosfolipídio aniônico é selecionado a partir do grupo consistindo em dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dioleoil- fosfatidilinositol (DOPI) e ácido dioleoilfosfatídico (DOPA).
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo menos um fosfolipídio de cadeia curta é selecionado a partir do grupo con- sistindo em fosfatidilserina, um fosfatidilcolina, um fosfatidilinositol, um ácido fosfatídico, e uma fosfatidiletanolamina.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a po- pulação de Iipossomas tem uma distribuição de tamanho de vesículas uni- Iamelares monomodal, bimodal ou trimodal.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a po- pulação de Iipossomas é compreendida de vesículas unilamelares achata- das nos pólos e elipsoidais tri-axiais.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a pro- teína derivada de prosaposin é uma ou mais selecionadas a partir do grupo consistindo em saposin C, H1, H2, H3, H4, H5, ou misturas destes.
7. Composição para formação de um Iipossoma compreendendo DOPS, DPPC1 DHPC e uma proteína derivada de prosaposin ou polipeptí- deo selecionados a partir do grupo consistindo em saposin C, H1, H2, H3, H4, H5, ou misturas destes.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 4, em que a pro- porção de DOPS para DPPC está dentro da faixa de cerca de 2 a cerca de 20.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o Ii- possoma é compreendido de dioleoilfosfatidilserina, dipalmitoil fosfatidilcolina e hexanoil fosfatidilcolina, em que as quantidades de lipídio de cadeia longa aniônico, lipídio de cadeia longa neutro e lipídio de cadeia curta são contro- ladas pela fórmula [lipídio de cadeia longa neutro] + [lipídio de cadeia longa aniônico ou neutro])/(lipídio de cadeia curta aniônico ou neutro) está dentro da faixa de cerca de 2 a cerca de 10.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções acima, compreendendo adicionalmente um agente farmaceuticamente ativo.
11. Método de produção de uma população Iipossomal compre- endendo as etapas de a. provisão de pelo menos um fosfolipídio aniônico, pelo menos um fosfolipídio de cadeia longa, e pelo menos uma proteína derivada de pro- saposin ou polipeptídeo; b. adição de uma solução aquosa; c. combinação do pelo menos um fosfolipídio aniônico, o pelo menos um fosfolipídio de cadeia longa, e a pelo menos uma proteína deriva- da de prosaposin ou polipepídeo, com a solução aquosa para formar espon- taneamente uma população de Iipossomas tendo uma distribuição de tama- nho de vesículas unilamelares monomodal, bimodal ou trimodal.
12. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o pelo menos um fosfolipídio aniônico é selecionado a partir do grupo consistindo em dioleoil fosfatidilserina (DOPS), Dioleoilfosfatidil-glicerol (DOPG), 1,2- dioleoil-fosfatidilinositol (DOPI) e 1,2-ácido dioleoilfosfatídico (DOPA).
13. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o pelo menos um fosfolipídio de cadeia curta é uma fosfatidilserina, ou um fosfati- dilcolina.
14. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o pelo menos um fosfolipídio de cadeia curta é selecionado a partir do grupo con- sistindo em DHPC, DHPS, ou misturas destes.
15. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que a popu- lação de Iipossoma é compreendida de vesículas unilamelares achatadas nos pólos e elipsoidais tri-axiais.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que a proteí- na derivada de prosaposin é uma ou mais selecionadas a partir do grupo consistindo em saposin C, H1, H2, H3, H4, H5, ou misturas destes.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que os Iipos- somas compreendem DOPS, DPPC, DHPC e Saposin C.
18. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que os Iipos- somas compreendem DOPS, DHPC e H1.
19. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que os Iipos- somas compreendem DOPS1 DPPC, DHPC e H2.
20. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que os Iipos- somas compreendem DOPS, DPPC, DHPC e H5.
21. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que os Iipos- somas compreendem DOPS, DPPC, DHPC1 Saposin C, H1 e H2.
22. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que os Iipos- somas compreendem DOPS, DPPC, DHPS e Saposin C.
23. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que os Iipos- somas compreendem DOPS, DPPC, DHPS e H1.
24. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que os Iipos- somas compreendem DOPS, DPPC, DHPS e H2.
25. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que os Iipos- somas compreendem DOPS, DPPC, DHPS e H5.
26. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que os Iipos- somas compreendem DOPS, DPPC, DHPS, Saposin C, H1 e H2.
27. Método, de acordo com uma das reivindicações acima, em que a proporção de DPOS para DPPC ou DHPS se iguala a cerca de 2 a cerca de 20.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, em que os Iipossomas são compreendidos de dioleoilfosfatidilserina, dipalmitoil fosfatidilcolina e hexanoil fosfatidilcolina, em que as quantidades de lipídio de cadeia longa aniônico, lipídio de cadeia longa neutro e lipídio de cadeia curta são controladas pela fórmula [lipídio de cadeia longa neutro] + [lipídio de cadeia longa aniônico])/[lipídio de cadeia curta] se igualam a cerca de 2 a cerca de 10.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que o lipídio de cadeia curta é aniônico ou neutro.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, em que o Iipossoma compreende adicionalmente um agente farma- ceuticamente ativo.
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