BRPI0716018A2

BRPI0716018A2 - plantas modificadas geneticamente que sintetizam amido que possui maior poder de intumescimento

Info

Publication number: BRPI0716018A2
Application number: BRPI0716018-6A
Authority: BR
Inventors: Claus Frohberg
Original assignee: Bayer Cropscience Ag
Priority date: 2006-08-09
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2013-07-30
Also published as: US8304606B2; AU2007283732A1; AR062301A1; EP2052077A1; AU2007283732B2; AR112458A2; EP2052077B1; JP2010500012A; CN101495622B; CA2659535C; US20100034953A1; CN101495622A; WO2008017518A1; PL2052077T3; CA2659535A1; EP1887079A1; JP5284261B2; BRPI0716018B1

Abstract

Patente de Invenção: "PLANTAS MODIFICADAS GENETICAMENTE QUE SINTETIZAM AMIDO QUE POSSUI MAIOR PODER DE INTUMESCIMENTO". A presente invenção refere-se a células vegetais a plantas modificadas geneticamente e a processos para a produção de células vegetais e de plantas modificadas geneticamente que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e uma maior atividade de proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase. As plantas deste tipo sintetizam amidos que possuem maior poder de intumescimento em água quante. A presente invenção refere-se similarmente a amidos que possuem maior poder de intumescimento em água quente e a processos para a produção dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLANTAS MODIFICADAS GENETICAMENTE QUE SINTETIZAM AMIDO QUE POS- SUI MAIOR PODER DE INTUMESCIMENTO".

A presente invenção refere-se a células vegetais e plantas modi- ficadas geneticamente e a processos para a produção de células vegetais e plantas modificadas geneticamente que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água di- quinase. As plantas deste tipo sintetizam amidos que possuem maior poder de intumescimento em água quente. A presente invenção refere-se similar- mente a amidos que possuem maior poder de intumescimento em água quente e a processos para a preparação dos mesmos.

Além de óleos, gorduras e proteínas, os polissacarídeos são os materiais brutos renováveis principais das plantas. O amido, que é uma das substâncias de reserva mais importante em plantas superiores, além da ce- lulose, possui uma função central nos polissacarídeos. Além disso, o amido é um constituinte essencial da nutrição de seres humanos e de animais em termos da fisiologia nutricional. As características estruturais do amido conti- do nos alimentos podem influenciar as propriedades funcionais (por exem- pio, poder de ligação com a água, poder de intumescimento), de fisiologia nutricional (por exemplo, capacidade de digestão, influência do alimento so- bre o índice glicêmico) ou que confere estrutura (por exemplo, resistência a cortes, textura, pegajosidade, capacidade de processamento) de todos os tipos de alimentos. As composições alimentícias, portanto, contêm frequen- temente um amido que possui certas características estruturais que determi- nam as propriedades desejadas do alimento em questão. As propriedades dos alimentos que contêm tecido vegetal que armazena amido (por exemplo, grãos, fruto, farinhas) também podem ser influenciadas pelo amido contido nos tecidos vegetais.

O polissacarídeo amido é um polímero de unidades estruturais

básicas quimicamente homogêneas, as moléculas de glicose. O que está envolvido aqui, entretanto, é uma mistura muito complexa de formas molecu- lares diferentes, que diferem em relação ao seu grau de polimerização, a ocorrência de ramificações das cadeias de glicose e aos seus comprimentos de cadeia e que podem, além disso, ser modificadas, por exemplo, fosforila- das. O amido, portanto, não é um material bruto. Em particular, a amilose, um polímero essencialmente não ramificado de moléculas de glicose ligadas de forma alfa-1,4-glicosídica, é distinguída da amilopectina, que é uma mis- tura complexa de cadeias de glicose ramificadas de forma diferente. As rami- ficações ocorrem aqui como um resultado da ocorrência de ligações alfa-1,6- glicosídicas adicionais. Em plantas típicas utilizadas para a produção indus- trial de amido ou como alimentos, tais como, por exemplo, milho, arroz, trigo ou batatas, o amido sintetizado consiste em aproximadamente 20% - 25% de amilose e até aproximadamente 70% - 75% de amilopectina.

As propriedades funcionais, de fisiologia nutricional ou que con- ferem estrutura do amido, tais como, por exemplo, a solubilidade, o compor- tamento de retrogradação, a capacidade de ligação com a água, as proprie- dades de formação de filmes, a viscosidade, as propriedades de gelatiniza- ção, a estabilidade ao congelamento-descongelamento, a estabilidade a áci- dos, a resistência do gel, o poder de intumescimento, a capacidade de di- gestão e o tamanho do grânulo de amido dos amidos são influenciadas, en- tre outras coisas, pelas características estruturais do amido tais como a pro- porção de amilose/amilopectina, o peso molecular dos polímeros de glicose, o padrão de distribuição de cadeias laterais, o conteúdo de íons, o conteúdo de lipídeos e de proteínas e/ou a morfologia dos grânulos de amido etc.

Através de processos baseados em cruzamentos, as caracterís- ticas estruturais selecionadas do amido e assim também propriedades fun- cionais, que conferem fisiologia nutricional ou estrutura do amido em células vegetais também podem ser alteradas. Entretanto, isto só é possível atual- mente para características estruturais selecionadas do amido (por exemplo, conteúdo de amilopectina/amilose, US 5.300.145). No momento, por exem- pio, não é possível influenciar o conteúdo de fosfato no amido vegetal ape- nas através de medidas de cruzamento.

Uma alternativa para os processos de cruzamento consiste na modificação selecionada de plantas que produzem amido através de méto- dos de engenharia genética. Um pré-requisito para isso, entretanto, é a iden- tificação e a caracterização das enzimas envolvidas na síntese de amido e/ou na modificação do amido e em sua análise funcional subsequente em

plantas transgênicas.

Várias enzimas que catalisam reações diferentes estão envolvi- das na síntese do amido em células vegetais. As amido sintases (EC2.4.1.21, ADP-glicose, 1,4-alfa-D-glucano 4-alfa-D-glucosiltransferase) catalisam uma reação de polimerização através de transferência de um radical glicosila de ADP-glicose para alfa-1,4-glucanos, o radical glicosila transferido sendo li- gado à alfa-1,4-glucano através da produção de uma ligação alfa-1,4. Em quase todas as plantas investigadas até agora, foi possível em cada caso demonstrar um número de isoformas de amido sintases. As amido sintases podem ser divididas em dois grupos diferentes: amido sintases ligadas a grânulos (GBSS) e amido sintases solúveis (também abreviadas como "SS" em relação à presente invenção). As amido sintases ligadas a grânulos cata- lisam a síntese de amilose, enquanto que as amido sintases solúveis estão envolvidas na síntese de amilopectina (Bali e Morell, 2003, Annu. Rev, Plant Biol. 54, 207-233; Teltow e outros, 2004, J. Expt. Bot. 55(406), 2131-2145). O grupo de amido sintases solúveis possui um número de isoformas que são denominadas na literatura técnica como SSI, SSII, SSIII, SSIV. A atribuição das amido sintases aos grupos individuais (SSI, SSII, SSIII, SSIV) é realiza- da através de homologias de seqüências das seqüências de proteínas das respectivas enzimas em questão (Bali e Morell, 2003, Annu. Rev, Plant Biol. 54, 207-233). Cada isoforma individual das amido sintases solúveis é atribu- ída a uma função específica na síntese do amido de acordo com a doutrina atual. Em plantas dicotiledôneas, até agora foi possível apenas demonstrar uma isoforma de proteínas SSII, enquanto que em muitas plantas monocoti- ledôneas (por exemplo, milho) foram demonstradas duas classes diferentes de proteínas SSII, que são representadas por SSIIa ou SSIIb. Em plantas monocotiledôneas, SSIIa é expressa preferencialmente no endosperma e SSIIb preferencialmente no tecido foliar (Teltow e outros, 2004, J. Expt. Bot. 55(406), 2131-2145). A função específica, em particular, das amido sintases solúveis individuais na síntese do amido, não está atualmente finalmente esclarecida (Bali e Morell, 2003, Annu. Rev, Plant Biol. 54, 207-233).

As propriedades funcionais, que conferem fisiologia nutricional ou estrutura do amido também são influenciadas pelo conteúdo de fosfato, um componente sem ser de carbono do amido. Uma distinção deve ser feita aqui entre o fosfato que é covalentemente ligado com a molécula de glicose do amido na forma de monoésteres (em relação à presente invenção deno- minado amido fosfato) e o fosfato na forma de fosfolipídeos associado com o

amido.

O conteúdo do amido fosfato varia dependendo do tipo de plan- ta. Por exemplo, certos mutantes de milho sintetizam um amido que possui um maior conteúdo de amido fosfato (milho ceroso a 0,002% e milho com alto teor de amilose a 0,013%), enquanto que os tipos convencionais de mi- Iho contêm apenas traços de amido fosfato. Similarmente, quantidades pe- quenas de amido fosfato são encontradas no trigo (0,001%) enquanto na aveia e no Sorgo não foi possível detectar qualquer amido fosfato. Menos amido fosfato foi similarmente encontrado em mutantes de arroz (arroz cero- so a 0,003%) que em tipos convencionais de arroz (0,013%). Quantidades significativas de amido fosfato foram encontradas em plantas que sintetizam amido armazenado em tubérculos ou raízes tal como, por exemplo, tapioca (0,008%), batata doce (0,011%), araruta (0,021%) ou batata (0,089%). Os valores percentuais para o conteúdo de amido fosfato citado no texto anteri- or em cada caso referem-se ao peso seco do amido e foram determinados por Jane e outros (1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832).

O amido fosfato pode estar presente na forma de monoésteres na posição C2, C3 ou C6 dos monômeros de glicose polimerizados (Takeda e Hizukuri, 1971, Starch/Stãrke 23, 267-272). A distribuição de fosfato do fosfato no amido sintetizado pelas plantas é distinguido em geral no fato de que aproximadamente 30% até 40% dos radicais de fosfato na posição C3 e aproximadamente 60% até 70% dos radicais de fosfato na posição C6 das moléculas de glicose estão covalentemente ligados (Blennow e outros, 2000, Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211-218). Blennow e outros (2000, Carbohydrate Polymers 41, 163-174) determinaram um conteúdo de amido fosfato que fica ligado na posição C6 das moléculas de glicose para vários amidos, tais como, por exemplo, amido da batata (entre 7,8 e 33,5 nmols por mg de amido, dependendo do cultivar), amido de várias espécies de Curcu- ma (entre 1,8 e 63 nmols por mg, dependendo do cultivar), amido da tapioca (2,5 nmols por mg de amido), amido do arroz (1,0 nmol por mg de amido), amido do feijão-da-china (3,5 nmols por mg de amido) e amido do sorgo (0,9 nmol por mg de amido). No amido da cevada e no amido de vários mutantes cerosos de milho, estes autores não foram capazes de detectar qualquer amido fosfato ligado na posição C6. Até agora, não foi possível fazer qual- quer conexão entre o genótipo de uma planta e o conteúdo de amido fosfato (Jane e outros, 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832). Portanto, não é possível no momento influenciar o conteúdo de amido fosfato em plantas

através de medidas de cruzamento.

Até agora, foram descritas duas proteínas que medeiam a intro- dução de ligações covalentes de radicais fosfato nas moléculas de glicose do amido. A primeira proteína possui a atividade enzimática de uma alfa- glucano-água diquinase (GWD, E.C.: 2.7.9.4) (Ritte e outros, 2002, PNAS 99, 7166-7171), é freqüentemente chamada de R1, em particular, na literatu- ra científica mais antiga e é ligada aos grânulos de amido do amido de re- serva nos tubérculos de batata (Lorberth e outros, 1998, Nature Biotechno- Iogy 16, 473-477). A segunda proteína descrita na literatura, que catalisa a introdução do amido fosfato no amido, possui a atividade enzimática de uma fosfoglucano-água diquinase (PWD, E.C.: 2.7.9.5) (Kõtting e outros, 2005, Plant Physiol. 137, 2424-252, Baunsgaard e outros, 2005, Plant Journal 41,

595-605).

Uma diferença significativa entre GWD e PWD consiste no fato de que GWD pode utilizar amido não fosforilado como um substrato, isto é, uma fosforilação de novo do amido não fosforilado pode ser catalisada pela GWD, enquanto que a PWD precisa de um amido já fosforilado como um substrato, isto é, introduz adicionalmente fosfato no amido já fosforilado (Kótting e outros, 2005, Plant Physiol. 137, 2424-252, Baunsgaard e outros, 2005, Plant Journal 41, 595-605). Uma diferença significativa adicional entre GWD e PWD consiste no fato de que a GWD introduz grupos fosfato exclu- sivamente na posição C6 das moléculas de glicose do amido, enquanto que a PWD fosforila exclusivamente a posição C3 das moléculas de glicose do amido fosforilado (Ritte e outros, 2006, FEBS Letters 580, 4872-4876).

Na reação catalisada por GWD ou por PWD, os materiais de partida alfa-1,4-glucano (para GWD) ou alfa-1,4-glucano fosforilada (para PWD), trifosfato de adenosina (ATP) e água são reagidos para fornecer os produtos fosfato de glucano (amido fosfato), monofosfato e monofosfato de adenosina (Kõtting e outros, 2005, Plant Physiol. 137, 2424-252, Ritte e ou- tros, 2002, PNAS 99, 7166-7171).

As plantas de trigo que possuem uma maior atividade de proteí- nas GWD devido à expressão de um gene que codifica GWD da batata são descritas na WO 02 34923. Em comparação com as plantas do tipo selva- gem em que não foi possível detectar qualquer amido fosfato, estas plantas sintetizam um amido que contém quantidades significativas de amido fosfato

na posição C6 das moléculas de glicose.

A WO 05 2359 descreve a superexpressão de uma GWD da ba-

tata em plantas de milho, otimizada em relação aos códons utilizados pelas plantas de milho. Através de 31P RMN, um conteúdo total de fosfato (ligado nas posições C6, C3 e C2 das moléculas de glicose) do amido de milho em questão de 0,0736% de fosfato com base na quantidade de glicose foi de- terminado. Se um peso molecular de 98 foi considerado como uma base pa- ra o fosfato, um conteúdo de fosfato total de aproximadamente 7,5 nmols de fosfato por mg de amido resulta no conteúdo de fosfato total determinado na WO 05 2359 de 0,0736% para o amido isolado das plantas de milho trans-

gênicas.

As plantas que possuem uma maior atividade de uma proteína PWD devido à superexpressão de um gene que codifica PWD de Arabidop- sis thaliana são descritas na WO 05 095617. Em comparação às plantas do tipo selvagem não-transformadas correspondentes, estas plantas possuem um maior conteúdo de amido fosfato.

Uma propriedade funcional importante, por exemplo, no proces- samento de amidos na indústria de alimentos, é o poder de intumescimento. Várias propriedades estruturais dos amidos, tais como a proporção de ami- lose/amilopectina, o comprimento das cadeias laterais, o peso molecular, o número de ramificações, possuem uma influência sobre o poder de intumes- cimento dos amidos em questão (Narayana e Moorthy, 2002, Starch/Stárke

54, 559-592).

Pode ser tirada uma informação da literatura científica de que, em adição à proporção de amilose/amilopectina, a distribuição de cadeias laterais da amilopectina e a distribuição de pesos moleculares dos polímeros de amido, também a quantidade de amido fosfato, possuem uma influência sobre as propriedades funcionais, em particular, sobre o poder de intumes- cimento do amido (Narayana e Moorthy, 2002, Starch/Stárke 54, 559-592). Deve ser enfatizado que em relação ao poder de intumescimen-

to do amido tem que ser feita uma distinção entre o poder de intumescimen- to em água fria (por exemplo, temperatura ambiente) e o poder de intumes- cimento em água morna ou quente. Os amidos nativos possuem um poder de intumescimento insignificante, se algum, em água fria, enquanto que os amidos modificados fisicamente (pré-gelatinizados, secos) já são capazes de sofrer intumescimento em água fria. Os processos de produção de amidos que sofrem intumescimento em água fria são descritos, por exemplo, na US 4.280.851. Em relação à presente invenção, o termo "poder de intumesci- mento" refere-se ao comportamento do amido em suspensões aquosas mornas/quentes. O poder de intumescimento é determinado de forma pa- dronizada através do aquecimento dos grânulos de amido na presença de um excesso de água, removendo a água não ligada após a centrifugação da suspensão e formando o quociente do peso do resíduo obtido e o peso da quantidade de amido pesada ali. Quando este processo é realizado, com o aquecimento da suspensão de amido as áreas cristalinas dos grânulos de amido são dissolvidas e as moléculas de água são intercaladas nos grânulos de amido, mas sem a estrutura dos próprios grânulos de amido ser destruída ali, isto é, ocorre somente um intumescimento dos grânulos de amido indivi- duais, causado pela absorção de moléculas de água.

Em comparação aos amidos de cereais, os amidos isolados de

tubérculos ou tecidos tuberosos possuem um poder de intumescimento em

água quente significativamente maior.

Para os amidos da batata isolados de inúmeras variedades, um

poder de intumescimento máximo de 74,15 g/g (variedade Kufri Jyoti) foi de- terminado a 85°C (Singh e outros, 2002, Journal of the Science of Food and Agriculture 82, 1376-1383) de acordo com o método de Leach e outros (1959, Cereal Chemistry 36, 534-544). Takizawa e outros (2004, Brazilian Archives of Biology e Technology 47 (6), 921-931) determinaram um poder de intumescimento de 100 g/g para o amido da batata (90°C, de acordo com o método de Leach e outros (1959, Cereal Chemistry 36, 534-544)). O amido do trigo, isolado de vários cultivares, possui um poder de intumescimento de 16,6 g/g até 26,0 g/g (temperatura: suspensão de AgNO3 a 0,1 % aquosa em ebulição) (Yamamori e Quynh, 2000, Theor Appl Genet 100, 23-28). O amido isolado de vários cultivares de cevada sem casca possui um poder de intu- mescimento de 16,5 g/g ou 19,3 g/g e o amido ceroso ou isento de amilose dos vários cultivares da dita cevada possui um poder de intumescimento de 36,0 g/g até 55,7 g/g (temperatura: AgNO3 a 0,1% aquoso a 70°C, Yasui e outros, 2002, Starch/Stárke 54, 179-184). Para o amido de milho, foi deter- minado um poder de intumescimento de 22,3 g/g e para os amidos de milho com alto teor de amilose um poder de intumescimento de 9,6 g/g (Hylon V), 6,1 g/g (Hylon VII) ou 3,9 g/g (LAPS = Amido Com Baixo Teor de Amilopecti- na (Low AmyIoPectin Starch)) (90°C, Shi e outros, 1998, J. Cereal Sei. 27, 289-299). Na US 6.290 9.907, um poder de intumescimento de 35,4 g/g foi indicado para o amido de milho ceroso. Para o amido isolado de vários culti- vares de arroz, foi determinado um poder de intumescimento de 26,0 g/g até 33,2 g/g (Sodhi e Singh, 2003, Food Chemistry 80, 99-108) de acordo com o método de Leach e outros (1959, Cereal Chemistry 36, 534-544). Chen e outros (2003, Starch/Stárke 55, 203-212) determinaram um poder de intu- mescimento de aproximadamente 25 g/g até aproximadamente 49 g/g (95°C, suspensão aquosa) para várias misturas de amidos cerosos do arroz com amidos de arroz com alto teor de amilose. Yasui e outros (2002, Star- ch/Stàrke 54, 179-184) determinaram um poder de intumescimento de 55,7 g/g (medido em água em ebulição em solução de nitrato de prata aquosa a

0,1 %) para um amido de arroz isento de amilose.

Através da preparação de derivados de amidos nativos, as pro- priedades funcionais dos amidos podem ser alteradas. Os amidos de trigo "reticulados", dependendo do grau de reticulação, possuem um poder de intumescimento de 6,8 g/g até 8,9 g/g, os amidos de trigo acetilados possu- em um poder de intumescimento de no máximo 10,3 g/g e ao mesmo tempo os amidos de trigo reticulados e acetilados possuem um poder de intumes- cimento de 9,4 g/g, enquanto os amidos não derivatizados correspondentes possuíam um poder de intumescimento de 8,8 g/g (medido a 90°C; Van

Hung e Morita, 2005, Starch/Stárke 57, 413-420). para os amidos de arroz cerosos acetilados, foi determinado um

poder de intumescimento de aproximadamente 30 g/g e para o amido de arroz ceroso reticulado um poder de intumescimento de aproximadamente g/g, enquanto que o amido de arroz ceroso não derivatizado correspon- dente tinha um poder de intumescimento de aproximadamente 41 g/g. O a- mido de arroz acetilado tinha um poder de intumescimento de aproximada- mente 20 g/g e o amido de arroz reticulado tinha um poder de intumescimen- to de aproximadamente 13 g/g, enquanto que o amido de arroz não derivati- zado correspondente tinha um poder de intumescimento de aproximadamen- te 14 g/g (medido a 90°C, Liu e outros, 1999, Starch/Stàrke 52, 249-252). A US 6.299.907 descreve amidos reticulados, a reação de reticulação sendo realizada após o pré-intumescimento dos amidos em questão em uma solu- ção de hidróxido/sulfato de sódio. Dependendo do grau de reticulação, para o amido de trigo foi determinado um poder de intumescimento de 6,8 g/g até 7,3 g/g (correspondendo ao amido de trigo não derivatizado 14,7 g/g), para o amido de trigo hidroxipropila um poder de intumescimento de 9,7 g/g (cor- respondendo ao amido de trigo não derivatizado 22,9 g/g), para o amido de milho reticulado um poder de intumescimento de 5,9 g/g (correspondendo ao amido de milho não derivatizado 16,7 g/g), para o amido de milho ceroso reticulado um poder de intumescimento de 8,3 g/g (correspondendo ao ami- do de milho ceroso não derivatizado 35,4 g/g) e para o amido de batata reti- culado um poder de intumescimento de 6,7 g/g (correspondendo ao amido da batata não derivatizado não foi especificado de forma acurada) (medido a 95°C). Isto resulta do fato de que o poder de intumescimento de amido não pode ser aumentado significativamente, se for de alguma forma possível, através dos métodos de derivatização costumeiros atualmente.

A presente invenção se baseia no objetivo de produzir amidos

modificados disponíveis que possuem propriedades funcionais alteradas e células vegetais e plantas que sintetizam um amido que possui propriedades funcionais alteradas e processos e meios para a produção das ditas plantas

e/ou células vegetais.

A presente invenção refere-se assim às células vegetais modifí-

cadas geneticamente e às plantas modificadas geneticamente que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, em comparação com as células vegetais do tipo selvagem ou as plantas do tipo selvagem não-modificadas geneticamen-

te correspondentes.

Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma célu- la vegetal ou a uma planta que é modificada geneticamente, à modificação genética que leva ao aumento na atividade de pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il e ao mesmo tempo ao aumento

na atividade de pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, em comparação com as células vegetais do tipo selvagem ou as plantas do tipo selvagem correspondentes que não são mo- dificadas geneticamente.

A modificação genética pode ser aqui qualquer modificação ge-

nética que leva a um aumento na atividade de pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il e (ao mesmo tempo) pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase nas células vegetais modificadas geneticamente ou nas plantas modificadas ge- neticamente, em comparação com as células vegetais do tipo selvagem ou as plantas do tipo selvagem correspondentes que não são modificadas ge- neticamente.

O termo "célula vegetal do tipo selvagem" significa, em relação à

presente invenção, que estas são células vegetais que serviram como um material de partida para a produção das células vegetais de acordo com a invenção, isto é, sua informação genética, além da modificação genética in- troduzida, corresponde a de uma célula vegetal de acordo com a invenção. Em relação à presente invenção, o termo "planta do tipo selva-

gem" significa que estas são plantas que serviram como um material de par- tida para a produção das plantas de acordo com a invenção, isto é, sua in- formação genética, além da modificação genética introduzida, corresponde à de uma planta de acordo com a invenção. O termo "correspondente" significa, em relação à presente in-

venção, que na comparação de um número de artigos, os artigos em ques- tão que estão sendo comparados com outros foram mantidos sob condições idênticas. Em relação à presente invenção, o termo "correspondente" em associação com uma célula vegetal do tipo selvagem ou uma planta do tipo selvagem significa que as células vegetais ou as plantas que estão sendo comparadas com outras foram cultivadas sob condições de cultura idênticas e que possuem uma idade idêntica (cultivo).

O termo "maior atividade de pelo menos uma proteína que pos- sui a atividade de uma amido sintase II" significa aqui, no contexto da pre- sente invenção, um aumento na expressão de genes endógenos que codifi- cam proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase Il e/ou um aumento na quantidade de proteínas que possuem a atividade de uma ami- do sintase Il nas células e/ou um aumento na atividade enzimática de proteí- nas que possuem a atividade de uma amido sintase Il nas células. O termo "maior atividade de uma proteína que possui a atividade

de uma glucano-água diquinase" significa aqui, no contexto da presente in- venção, um aumento na expressão de genes endógenos que codificam pro- teínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase e/ou um aumento na quantidade de proteínas que possuem a atividade de uma glu- cano-água diquinase nas células e/ou um aumento na atividade enzimática de proteínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase nas

células.

O aumento na expressão pode ser determinado, por exemplo, através da medida da quantidade de produtos da transcrição que codificam proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase Il ou que codifi- cam proteínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase. Isto pode ser realizado, por exemplo, através da análise de Northern blot ou através de RT-PCR. Um aumento na quantidade de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il aqui significa preferencialmente um aumento na quantidade de produtos da transcrição em comparação com células correspondentes que não são modi- ficadas geneticamente em pelo menos 100%, em particular, em pelo menos 125%, preferencialmente em pelo menos 150% e particular e preferencial- mente em pelo menos 200%. Um aumento na quantidade de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a atividade de uma ami- do sintase Il também significa que as plantas ou as células vegetais que não contêm quantidades detectáveis de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il contêm, após a modificação genética de acordo com a invenção, quantidades detectáveis de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a atividade

de uma amido sintase II. um aumento na quantidade de produtos da transcrição que codi-

ficam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase significa preferencialmente aqui um aumento na quantidade de produtos da transcrição em comparação com células correspondentes que não são modi- ficadas geneticamente em pelo menos 50%, em particular, em pelo menos 70%, preferencialmente em pelo menos 85% e particular e preferencialmen- te em pelo menos 100%.

Um aumento na quantidade de produtos da transcrição que codi- ficam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase também significa que as plantas ou as células vegetais que não contêm quantidades detectáveis de produtos da transcrição que codificam uma pro- teína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, após a modifi- cação genética de acordo com a invenção, contêm quantidades detectáveis de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a ativida- de de uma glucano-água diquinase.

O aumento na quantidade de proteína que possui a atividade de

uma amido sintase Il ou que possui a atividade de uma glucano-água diqui- nase que possui uma maior atividade destas proteínas nas células vegetais em questão como um resultado, pode ser determinado, por exemplo, através de métodos imunológicos tal como a análise de Western blot, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima) ou RIA (radioimunoensaio). Um aumento na quantidade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il significa preferencialmente aqui um aumento na quantidade da proteína em questão em comparação com as células correspondentes que não são modificadas geneticamente em pelo menos 100%, em particular, em pelo menos 125%, preferencialmente em pelo menos 150% e particular e prefe- rencialmente em pelo menos 200%. Um aumento na quantidade de proteí- nas que possuem a atividade de uma amido sintase Il significa também que plantas ou células vegetais que não contêm quantidades detectáveis de pro- teína que possui a atividade de uma amido sintase Il contêm, após a modifi- cação genética de acordo com a invenção, uma quantidade detectável de

proteína que possui a atividade de uma amido sintase II. um aumento na quantidade de uma proteína que possui a ativi-

dade de uma glucano-água diquinase significa preferencialmente aqui um aumento na quantidade da proteína em questão em comparação com as células correspondentes que não são modificadas geneticamente, em pelo menos 50%, em particular em pelo menos 70%, preferencialmente em pelo menos 85% e particular e preferencialmente em pelo menos 100%.

Um aumento na quantidade de proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase significa ainda que as plantas ou as células vegetais que não contêm quantidades detectáveis de proteínas que possu- em a atividade de uma glucano-água diquinase contêm, após a modificação genética de acordo com a invenção, uma quantidade detectável de proteína

que possui a atividade de uma glucano-água diquinase. Os métodos para a produção de anticorpos que reagem especi-

ficamente com uma certa proteína, isto é, que se ligam especificamente com a dita proteína, são conhecidos pelos versado na técnica (vide, por exemplo, Lottspeich e Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik [Bioanalytics], Spektrum akad. Velag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4). A produção de anticorpos deste tipo é oferecida como um serviço por contrato por algumas firmas (por exemplo, Eurogentec, Bélgica). Os anticorpos com os quais um aumento na quantidade de proteína que possui a atividade de uma glucano-água diqui- nase pode ser detectado através de métodos imunológicos são descritos em Lorberth e outros (1998, Nature Biotechnology 16, 473-477) e Ritte e outros (2000, Plant Journal 21, 387-391). Os anticorpos com os quais um aumento na quantidade de proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il pode ser determinado através de métodos imunológicos são descritos em Walter ("Untersuchungen der Expression und Funktion der Stárkesynthase Il (SS II) aus Weizen (Triticum aestivum)" [Investigations of the expression and function of amido sintase Il (SS II) from wheat (Triticum aestivum)], disserta- ção na faculdade de Biologia da University of Hamburg, ISBN 3-8265-8212- 8).

A quantidade de atividade de uma proteína que possui a ativida- de de uma glucano-água diquinase pode ser detectada, por exemplo, como descrito na literatura (Mikkelsen e outros, 2004, Biochemical Journal 377,

525-532; Ritte e outros, 2002, PNAS 99, 7166-7171).

A quantidade de atividade de uma proteína que possui a ativida- de de uma amido sintase Il pode ser determinada, por exemplo, como des- crito na literatura (Nishi e outros, 2001, Plant Physiology 127, 459-472). Um método preferido para a determinação da quantidade de atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il é descrito sob o i-

tem 9 dos métodos gerais. Preferencialmente, as células vegetais de acordo com a inven- ção ou as plantas de acordo com a invenção possuem uma atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, que é aumen- tada pelo menos 6 vezes, preferencialmente pelo menos 7 vezes, particular e preferencialmente pelo menos 8 vezes, especialmente preferencialmente pelo menos 9 vezes e muito especialmente preferencialmente pelo menos vezes, em comparação com células vegetais do tipo selvagem ou plantas do tipo selvagem correspondentes que não foram modificadas geneticamen- te.

As proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase Il

(ADP-glicose-1,4-alfa-D-glucano-4-alfa-D-glucosil transferase; EC 2.4.1.21) possuem uma seqüência de certos domínios em sua estrutura. No terminal N, possuem um peptídeo sinal para transporte nos plastídeos. Na direção do terminal N para a terminação C segue uma região N-terminal e um domínio catalítico. (Li e outros, 2003, Funct Integr Genomics 3, 76-85). Análises adi- cionais, baseadas nas comparações de seqüências de aminoácidos (http://hits.isb-s'h nh/cni-bin/PFSCAN) de várias proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase Il mostraram que estas proteínas possuem três domínios específicos. Na seqüência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6, os aminoácidos 322 até 351 representam o domínio 1, os a- minoácidos 423 até 462 representam o domínio 2 e nos aminoácidos 641 até 705 representam o domínio 3. O domínio 1 é codificado pelos nucleotídeos 1190 até 1279, o domínio 2 é codificado pelos nucleotídeos 1493 até 1612 e o domínio 3 é codificado pelos nucleotídeos 2147 até 2350 da seqüência de

ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 5.

Em relação à presente invenção, o termo "proteína que possui a

atividade de uma amido sintase II" deve ser entendido como significando uma proteína que catalisa uma reação de glicosilação em que moléculas de glicose do substrato ADP-glicose são transferidas para cadeias de glucano ligadas por alfa-1,4 com a formação de uma ligação de alfa-1,4 (ADP-glicose + {(1,4)-alfa-D-glucosil} (N) <=> ADP + {(1,4)-alfa-D-glucosil) (N+1)), em que a seqüência de aminoácidos da proteína que possui a atividade de uma pro- teína de uma amido sintase Il possui uma identidade de pelo menos 86%, preferencialmente pelo menos 93%, particular e preferencialmente pelo me- nos 95% com os aminoácidos 322 até 351 (domínio 1) da seqüência de ami- noácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6 e possui uma identidade de pelo menos 83%, preferencialmente pelo menos 86%, particular e preferencial- mente pelo menos 95% com os aminoácidos 423 até 462 (domínio 2) da se- qüência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6 e possui uma identi- dade de pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 82%, preferencial- mente 86%, particular e preferencialmente 98%, em particular preferencial- mente de pelo menos 95% com os aminoácidos 641 até 705 (domínio 3) da seqüência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6.

As seqüências de ácidos nucleicos e as seqüências de aminoá- cidos que correspondem às mesmas, que possuem a dita identidade com os domínios 1, 2 e 3 e codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, são conhecidas pelos versado na técnica e são publicadas, por exemplo, sob o No de Acesso AY133249 (Hordeum vulgaré), No de A- cesso AY133248 (Aegilops tauschii), Nos de Acesso XP467757, AAK64284 (Oryza sativa), AAK81729 (Oryza sativa), Nos de Acesso AAD13341, A- AS77569, No AAD13342 (Zea Mays), No de Acesso AAF13168 (Manihot eculenta), No de Acesso BAD18846 (Phaseolus vulgaris), No de Acesso CAA61241 (Solanum tuberosum), No de Acesso CAA61269 (Pisum sati- vum), No de Acesso AAC19119 (Ipomea batatas), No de Acesso AAF26156 (Arabidopsis thaliana), No de Acesso AA P41030 (Colocasia esculenta), No de Acesso AAS 88880 (Ostraeococcus tauri) ou No de Acesso AAC17970 (Chlamydomonas reinhardii). As seqüências de ácidos nucleicos e as se- qüências de aminoácidos mencionadas que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il podem ser acessadas através do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) e são expressamente incluídas na descrição do presente pedido de patente através da menção das referên- cias.

No contexto da presente invenção, o termo "proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase" deve ser entendido como signi- ficando uma proteína que transfere um resíduo de beta-fosfato de ATP para o amido. Os amidos isolados de folhas de um mutante sex1-3 de Arabidop- sis thaliana não possuem quantidades detectáveis de radicais fosfato ligados de forma covalente, mas são fosforilados por uma proteína que possui a ati- vidade de uma glucano-água diquinase. Isto é, o amido não fosforilado, por exemplo, isolado de folhas de um mutante sex1-3 de Arabidopsis thaliana, é utilizado como um substrato em uma reação de fosforilação catalisada por uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.

O radical beta-fosfato do ATP é transferido de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase para o amido e o radical gama-fosfato do ATP é transferido para a água. O AMP (monofosfato de a- denosina) resulta como um produto de reação adicional. Uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é, portanto, também de- nominada [alfa-1,4-glucano]-água diquinase ou uma amido-água diquinase (EC: 2.7.9.4; Ritte e outros, 2002, PNAS 99, 7166-7171). Na fosforilação do amido catalisado por uma proteína que possui a atividade de uma glucano- água diquinase, ligações de monoéster de fosfato adicionais resultam exclu- sivamente na posição C6 das moléculas de glicose (Ritte e outros, 2006, FEBS Letters 580, 4872-4876). Na catálise da reação de fosforilação de um amido por uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diqui- nase, uma proteína fosforilada em que o radical beta-fosfato do ATP é ligado covalentemente a um aminoácido da proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase resulta como um intermediário (Ritte e outros, 2002, PNAS 99, 7166-7171). O intermediário resulta através da autofosforilação da proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, isto é, a proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase por si só catalisa a reação que leva ao intermediário. As seqüências de aminoácidos que codificam as proteínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase contêm um domínio de fosfo-histidina. Os domínios de fosfo- histidina são descritos, por exemplo, em Tien-Shin Yu e outros (2001, Plant Cell 13, 1907-1918). Na autofosforilação de uma proteína que possui a ativi- dade de uma glucano-água diquinase, um radical de histidina no domínio de fosfo-histidina da seqüência de aminoácidos que codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é fosforilado (Mikkelsen e outros, 2004, Biochemical Journal 377, 525-532). Na seqüência de proteína de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase de Solanum tuberosum mostrada sob a SEQ ID NO 2, os aminoácidos 1064 até 1075 são os domínios de fosfo-histidina. Se o radical de histidina conservado (na seqüência de proteína do aminoácido 1069 mostrada, por exemplo, sob a SEQ ID NO 2) dos domínios de fosfo-histidina for substituído por um outro aminoácido, a autofosforilação e assim também a fosforilação de glucanos pela proteína que sofreu mutagênese não ocorrerão mais (Mikkelsen e ou- tros, 2004, Biochemical Journal 377, 525-532). Além disso, uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é distinguida pelo fato de que possui um domínio de ligação ao nucleotídeo C-terminal que é incluído na seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 1121 até 1464 mos- trada, por exemplo, sob a SEQ ID NO 2. Uma deleção do domínio de ligação ao nucleotídeo leva à inativação de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase (Mikkelsen e Blennow, 2005, Biochemical Journal 385, 355-361). No terminal N, as proteínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase contêm um domínio de ligação a carboidra- tos (CBM) que é incluído na seqüência de aminoácidos dos aminoácidos 78 até 362 mostrada sob a SEQ ID NO 2. Os domínios de ligação a carboidra- tos são distinguidos, inter alia, pelo fato de que sua seqüência de aminoáci- dos contém resíduos de triptofano conservados. Se estes resíduos de ami- noácidos conservados forem substituídos por outro aminoácido, os domínios de ligação a carboidratos perdem sua capacidade de se ligar às glucanos. Por exemplo, a substituição dos aminoácidos W139 ou W194 na seqüência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 2 leva a uma perda da função deste domínio de ligação a carboidrato. Se o domínio de ligação a carboidra- to de uma glucano-água diquinase for deletado (por exemplo, uma deleção dos aminoácidos 1 até 362, quando os aminoácidos 1 até 77 na seqüência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 2 constituem um peptídeo sinal plastídico), isto não leva, entretanto, à inativação da atividade da fosforilação da enzima (Mikkelsen e outros, 2006, Biochemistry 45, 4674-4682).

As seqüências de ácidos nucleicos e as seqüências de aminoá- cidos que correspondem a estas, que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, são descritas de espécies diferen- tes, tais como, por exemplo, batata (WO 97 11188, GenBank Acc.: AY027522, Y09533), trigo (WO OO 77229, US 6.462.256, GenBank Acc.: AAN93923, GenBank Acc.: AR236165), arroz (GenBank Acc.: AAR61445, GenBank Acc.: AR400814), milho (GenBank Aec.: AAR61444, GenBank Acc.: AR400813), soja (GenBank Ace.: AAR61446, GenBank Aec.: AR400815), Curcuma longa (SEQ ID NO 3), frutas cítricas (GenBank Acc.: AY094062), Arabidopsis (GenBank Acc.: AF312027) e a alga verde Ostreococcus tauri (GenBank Acc.: AY570720.1). As seqüências de ácidos nucleicos e as se- qüências de aminoácidos mencionadas que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase são publicadas, inter alia, pelo NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) e são expressamente incluí- das na descrição do presente pedido de patente através da menção das re- ferências.

Uma modalidade adicional da presente invenção refere-se a uma célula vegetal modificada geneticamente de acordo com a invenção ou a uma planta modificada geneticamente de acordo com a invenção, em que a modificação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha no genoma da célula vegetal ou no genoma da planta.

Nesta associação, o termo "modificação genética" significa a in- trodução de moléculas de ácidos nucleicos estranhas homólogas e/ou hete- rólogas no genoma de uma célula vegetal ou no genoma de uma planta, on- de a dita introdução destas moléculas leva ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e ao au- mento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II.

Através da introdução de uma molécula de ácido nucleico estra- nha, as células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de acordo com a invenção são alteradas em relação a sua informação genética. A pre- sença ou a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico estra- nha leva a uma alteração fenotípica. Alteração "fenotípica" significa prefe- rencialmente aqui uma alteração mensurável de uma ou mais funções das células. Por exemplo, as células vegetais modificadas geneticamente de a- cordo com a invenção e as plantas modificadas geneticamente de acordo com a invenção, por causa da presença ou no caso da expressão de molé- culas de ácidos nucleicos estranhas introduzidas, exibem um aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água di- quinase e um aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II.

O termo "molécula de ácido nucleico estranha" é entendido em relação à presente invenção como significando uma molécula do tipo que não ocorre naturalmente nas células vegetais do tipo selvagem correspon- dentes ou que não ocorre naturalmente nas células vegetais do tipo selva- gem no arranjo espacial real ou que fica localizada em um sítio do genoma da célula vegetal do tipo selvagem em que não ocorre naturalmente. Prefe- rencialmente, a molécula de ácido nucleico estranha é uma molécula recom- binante que consiste em vários elementos cuja combinação ou arranjo espa- ciai específico não ocorre naturalmente nas células vegetais.

Em princípio, uma molécula de ácido nucleico estranha pode ser qualquer molécula de ácido nucleico desejada que causa um aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água di- quinase e de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il na célula vegetal ou na planta.

O termo "molécula de ácido nucleico recombinante" deve ser entendido em relação à presente invenção como significando uma molécula de ácido nucleico que contém moléculas de ácidos nucleicos diferentes que não estão naturalmente presentes em uma combinação como está presente em uma molécula de ácido nucleico recombinante. Assim, as moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, por exemplo, em adição às moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e/ou uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, podem conter seqüências de ácidos nucleicos adicionais que não estão naturalmente presentes em combinação com as moléculas de ácidos nucleicos mencionadas. As seqüências de ácidos nucleicos adicio- nais mencionadas, que estão presentes em uma molécula de ácido nucleico recombinante em combinação com a molécula de ácido nucleico que codifi- ca uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase ou uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, podem ser aqui quaisquer seqüências desejadas. Estas podem ser, por exemplo, se- quências genônicas e/ou de ácidos nucleicos de plantas. Preferencialmente, as seqüências de ácidos nucleicos adicionais mencionadas são seqüência reguladoras (promotores, sinais de término, intensificadores), particular e preferencialmente seqüências reguladoras que são ativas em tecido vegetal, em particular, preferencialmente seqüências reguladoras específicas ao te- cido que são ativas em tecido vegetal. Os métodos para a produção de mo- léculas de ácidos nucleicos recombinantes são conhecidos pelos versado na técnica e compreendem métodos de engenharia genética, tal como, por e- xemplo, a associação de moléculas de ácidos nucleicos através da ligação, da recombinação genética ou da síntese de novo de moléculas de ácidos nucleicos (vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning, a Labo- ratory Manual, 3a edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel e outros, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5a edição (2002), ISBN: 0471250929).

O termo "genoma" deve ser entendido em relação à presente

invenção como significando a totalidade do material hereditário presente em uma célula vegetal. É sabido pelos versado na técnica que em adição ao núcleo da célula outros compartimentos (por exemplo, plastídeos, mitocôn- drias) também contêm material hereditário. Em uma modalidade adicional, as células vegetais de acordo

com a invenção e as plantas de acordo com a invenção são caracterizadas pelo fato de que pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codi- fica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase. Preferencialmente, as moléculas de ácidos nucleicos estranhas que codifi- cam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase são as moléculas de ácidos nucleicos já mencionadas e conhecidas pelos versado na técnica provenientes de várias espécies de plantas, particular e preferencialmente moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteí- na que possui a atividade de uma glucano-água diquinase da batata ou de Curcuma longa, em particular, preferencialmente uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase que possui a seqüência de amino- ácidos mostrada sob a SEQ ID NO 2 ou que é codificada pela seqüência de

ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO 1.

As seqüências mostradas sob a SEQ ID NO 3 e a SEQ ID NO 4 não foram publicadas até agora. As células vegetais ou as plantas, em parti- cular, células vegetais de arroz ou plantas de arroz, que contêm uma molé- cuia de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína que possui a ati- vidade de uma glucano água diquinase de Curcuma longa, são distinguidas pelo fato de que sintetizam um amido que possui um conteúdo de amido fos- fato maior que o das células vegetais ou das plantas que contêm uma molé- cula de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína que possui a ati- vidade de uma glucano-água diquinase de outra espécie (por exemplo, bata- ta).

A presente invenção refere-se ainda, portanto, a moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, escolhidas do grupo que consiste em a) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína

que possui a seqüência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 4;

b) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína cuja seqüência de aminoácidos contém pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 93%, preferencialmente pelo

menos 96% e em particular preferencialmente pelo menos 99% da seqüência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 4;

c) moléculas de ácidos nucleicos que compreendem a se- qüência de ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 3 ou uma seqüência complementar;

d) moléculas de ácidos nucleicos que possuem uma identida-

de com a seqüência de ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 3 de pelo menos 90%, preferencialmente de pelo menos 93%, preferencialmente de pelo menos 96% e em particular preferencialmente de pelo menos 99%,

e) moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam sob condi-

ções estringentes com pelo menos um filamento das molé- culas de ácidos nucleicos descritas sob a) ou c);

f) moléculas de ácidos nucleicos cuja seqüência de nucleotí- deos, por causa da degeneração do código genético, difere

da seqüência das moléculas de ácidos nucleicos menciona-

da sob a) ou c);

g) moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos, varia- ções alélicas e/ou derivados das moléculas de ácidos nucle- icos mencionadas sob a), b), c), d), e) ou f),

h) moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a), b), c), d),

e), f) ou g), que estão ligadas a elementos reguladores (promotores) que iniciam a transcrição nas células vegetais

ou

i) moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com h), em que

os promotores são promotores específicos ao tecido, parti-

cular e preferencialmente promotores que iniciam a trans- crição, especificamente nas células de endosperma vegetal.

Além disso, a presente invenção refere-se a plasmídeos, vetores e células vegetais ou plantas que contêm uma molécula de ácido nucleico

estranha de acordo com a invenção.

Em uma modalidade adicional, as células vegetais de acordo

com a invenção e as plantas de acordo com a invenção são caracterizadas pelo fato de que pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codi- fica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II. Preferen- cialmente, as moléculas de ácidos nucleicos estranhas que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il são as moléculas de ácidos nucleicos já mencionadas conhecidas pelos versado na técnica pro- venientes de várias espécies de plantas, particular e preferencialmente mo- léculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a ativi- dade de uma amido sintase Il do trigo, em particular, preferencialmente uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il que possui a se- quência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6 ou que é codificada pela seqüência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO 5.

Em uma modalidade adicional, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção são caracterizadas pelo fato de que uma primeira molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e uma segunda molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que

possui a atividade de uma amido sintase II.

As moléculas de ácidos nucleicos estranhas introduzidas para a

modificação genética nas células vegetais ou nas plantas podem ser uma molécula de ácido nucleico individual ou um número de moléculas de ácidos nucleicos. Estas podem, portanto, ser tanto moléculas de ácidos nucleicos que contêm seqüências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e seqüências de ácidos nucleicos que codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il quanto podem ser moléculas de ácidos nucleicos em que as se- qüências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a ativi- dade de uma glucano-água diquinase e as seqüências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il estão presentes em moléculas de ácidos nucleicos diferentes. As sequên- cias de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e as seqüências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il po- dem estar contidas simultaneamente, por exemplo, em um vetor, um plasmí- deo ou moléculas de ácidos nucleicos presentes na forma linear ou outros constituintes de dois vetores, plasmídeos ou moléculas de ácidos nucleicos

lineares em cada caso separadas das outras.

Se as seqüências de ácidos nucleicos que codificam uma prote-

ína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e as seqüências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il estiverem presentes em duas moléculas de ácidos nu- cleicos que estão separadas uma das outras, podem então ser introduzidas no genoma da célula vegetal ou da planta ao mesmo tempo ("co-transfor- mação") ou ainda em sucessão, isto é, uma após a outra cronologicamente ("supertransformação"). As moléculas de ácidos nucleicos separadas uma da outra podem também ser introduzidas em células vegetais ou plantas di- ferentes de uma espécie. Podem assim ser produzidas células vegetais ou plantas nas quais a atividade de pelo menos uma proteína que possui a ati- vidade de uma glucano-água diquinase ou de outra maneira pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il é aumentada. As plantas de acordo com a invenção podem então ser produzidas através do cruzamento subsequente das plantas, em que a atividade de uma proteí- na que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é aumentada, com aquelas em que a atividade de uma proteína que possui a atividade de

uma amido sintase Il é maior.

Além disso, para a introdução de uma molécula de ácido nuclei-

co estranha ao invés de uma célula vegetal do tipo selvagem ou de uma planta do tipo selvagem, é utilizada uma célula mutante ou um mutante que é distinguido pelo fato de que já possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase ou uma maior ativi- dade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II. Os mutantes podem ser tanto mutantes que ocorrem espontaneamente (natu- ralmente) quanto aqueles que foram produzidos através do uso seletivo de agentes mutagênicos (tais como, por exemplo, agentes químicos, radiação ionizante) ou processos de engenharia genética (por exemplo, marcação com ativação de T-DNA, marcação com ativação de transposon, ativação in

situ, mutagênese in vivo).

As células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de

acordo com a invenção podem, portanto, ser também produzidas através da introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha que leva ao aumen- to na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase em uma célula mutante ou um mutante que já possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II. As células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de acordo com a invenção também podem ser produzidas através da introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha que leva ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il em uma célula mutante ou um mutante que já possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase. As células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de

acordo com a invenção também podem ser produzidas através do cruza- mento de um mutante, em que a atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é menor, com uma planta que de- vido à introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sinta- se II. Similarmente, é possível produzir células vegetais de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a invenção através do cruzamento de um mutante, em que a atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il é maior, com uma planta que devido à introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.

As plantas de acordo com a invenção também podem ser produ- zidas através do cruzamento um mutante, em que a atividade de uma prote- ína que possui a atividade de uma amido sintase Il é maior, com um mutante em que a atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-

água diquinase é maior.

Um grande número de técnicas está disponível para a introdu- 10

ção de DNA em uma célula hospedeira vegetal. Estas técnicas incluem a transformação de células vegetais com T-DNA utilizando Agrobacterium tu- mefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agentes de transformação, a fusão de protoplastos, a injeção, a eletroporação de DNA1 a introdução do DNA através da abordagem de biolística e possibilidades adicionais.

O uso da transformação mediada por agrobactérias de células vegetais foi intensivamente investigado e descrito, inter alia, na patente EP 120516; Hoekema, (Em: The Binary Plant Vector System Offsetdruckkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Capítulo V; Fraley e outros, Crit. Rev. Plant Sei. 4, 1-46) e em An e outros (1985, EMBO J. 4, 277-287). Para a transformação da batata, vide, por exemplo, Rocha-Sosa e outros (1989,

EMBO J. 29-33).

A transformação de plantas monocotiledôneas através de veto- res baseada na transformação com Agrobacterium também foi descrita (1993, Chan e outros, Plant Mol. Biol. 22, 491-506; Hiei e outros, 1994, Plant J. 6, 271-282; Deng e outros, 1990, Science in China 33, 28-34; Wilmink e outros, 1992, PIantCeII Reports 11, 76-80; May e outros, 1995, Bio/Techno- logy 13, 486-492; Conner e Domisse, 1992, Int. J. Plant Sei. 153, 550-555; Ritchie e outros, 1993, Transgenic Res. 2, 252-265). Os métodos alternati- vos para a transformação de plantas monocotiledôneas são a transformação através da abordagem de biolística (Wan e Lemaux, 1994, Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil e outros, 1993, Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala e outros, 1994, Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer e outros, 1990, Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), a transformação de protoplastos, a eletroporação de células parcialmente permeabilizadas ou a incorporação do DNA através de fibras de vidro. A transformação do milho, em particular, é descrita repeti- damente na literatura (cf., por exemplo, W095/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm e outros, 1990, Biotechnology 8, 833-844; Gordon-Kamm e outros, 1990, Plant Cell 2, 603-618; Koziel e outros, 1993, Biotechnology 11, 194-200; Moroc e outros, 1990, Theor. Appl. Genet. 80, 721-726).

A transformação bem sucedida de outras espécies de cereais também já foi descrita, por exemplo, para a cevada (Wan e Lemaux, vide acima; Ritala e outros, vide acima; Krens e outros, 1982, Nature 296, 72-74) e para o trigo (Nehra e outros, 1994, Plant J. 5, 285-297; Becker e outros, 1994, Plant Journal 5, 299-307). Todos os métodos anteriores são adequa- dos no contexto da presente invenção.

As células vegetais e as plantas que são modificadas genetica- mente através da introdução de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e/ou de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il podem ser distinguidas das células vegetais do tipo selva- gem ou das plantas do tipo selvagem, inter alia, em virtude do fato de que possuem pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha que não o- corre naturalmente nas células vegetais do tipo selvagem ou nas plantas do tipo selvagem ou em virtude do fato de que uma molécula deste tipo está presente integrada em um sítio no genoma da célula vegetal de acordo com a invenção ou no genoma da planta de acordo com a invenção, em que não ocorre nas células vegetais do tipo selvagem ou nas plantas do tipo selva- gem, isto é, em um outro ambiente genômico. Além disso, tais células vege- tais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção podem ser distinguidas das células vegetais do tipo selvagem ou das plantas do tipo selvagem em virtude do fato de que contêm pelo menos uma cópia da molé- cula de ácido nucleico estranha integrada de forma estável em seu genoma, opcional e adicionalmente a cópias que ocorrem naturalmente de uma molé- cula deste tipo nas células vegetais do tipo selvagem ou nas plantas do tipo selvagem. Se a(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) estranha(s) introduzi- da(s) nas células vegetais de acordo com a invenção ou nas plantas de a- cordo com a invenção for(em) cópias adicionais de moléculas que já ocor- rem naturalmente nas células vegetais do tipo selvagem ou nas plantas do tipo selvagem, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção podem ser distinguidas das células vegetais do tipo selvagem ou das plantas do tipo selvagem, em particular, em virtude do fato de que esta(s) cópia(s) adicional(is) fica(m) localizada(s) em sítios no geno- ma em que não ocorreria(m) em células vegetais do tipo selvagem ou em plantas do tipo selvagem. Isto pode ser verificado, por exemplo, com o auxí- lio de uma análise de Southern blot.

Além disso, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção podem ser distinguidas das células vege- tais do tipo selvagem ou das plantas do tipo selvagem preferencialmente em pelo menos uma das características a seguir: se uma molécula de ácido nu- cleico estranha introduzida for heteróloga em relação à célula vegetal ou às plantas, as células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de a- cordo com a invenção contêm produtos da transcrição das moléculas de áci- dos nucleicos introduzidas. Estes podem ser detectados, por exemplo, atra- vés da análise de Northern blot ou através de RT-PCR (Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Inversa). Preferencialmente, as células ve- getais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção contêm uma proteína que é codificada por uma molécula de ácido nucleico introduzida. Esta pode ser detectada, por exemplo, através de métodos imu- nológicos, em particular, através de uma análise de Western blot.

Se uma molécula de ácido nucleico estranha introduzida for ho- móloga em relação à célula vegetal ou às plantas, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção podem ser distinguidas das células vegetais do tipo selvagem ou das plantas do tipo selvagem, por exemplo, por causa da expressão adicional das moléculas de ácidos nucleicos estranhas introduzidas. As células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção contêm preferencialmen- te os produtos da transcrição das moléculas de ácidos nucleicos estranhas. Estes podem ser detectados, por exemplo, através da análise de Northern blot ou com o auxílio da RT-PCR "quantitativa".

As plantas de acordo com a invenção podem, em princípio, ser plantas de qualquer espécie de planta desejada, isto é, tanto plantas mono- cotiledôneas quanto dicotiledôneas. Preferencialmente, são plantas úteis, isto é, plantas que são cultivadas por seres humanos com a finalidade de nutrição ou com finalidades técnicas, em particular, industruais.

Em uma modalidade adicional, a planta de acordo com a inven- ção é uma planta que armazena amido.

O termo "planta que armazena amido" em relação à presente in- venção signfica todas as plantas que possuem partes da planta que contêm um armazenamento de amido, tais como, por exemplo, milho, arroz, trigo, centeio, aveia, cevada, mandioca, batata, sagu, cará, feijão-da-china, ervi- lha, Sorgo, batata doce.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a plantas monocotiledôneas que armazenam amido de acordo com a inven- ção, em particular, preferencialmente plantas da família (sistemática) Poace- ae. Particular e preferencialmente, estas são plantas de arroz, milho ou trigo.

O termo "planta de trigo" em relação à presente invenção signifi- ca espécies de plantas do gênero Triticum ou plantas que são produzidas partindo de cruzamentos com plantas do gênero Triticum, particularmente espécies de plantas do gênero Triticum cultivadas com finalidades comerci- ais na agricultura ou plantas que são produzidas partindo de cruzamentos com plantas do gênero Triticum·, Triticum aestivum é preferida em particular.

O termo "planta de milho" em relação à presente invenção signi- fica espécies de plantas do gênero Zea, particularmente espécies de plantas do gênero Zea cultivadas com finalidades comerciais na agricultura, particu- lar e preferencialmente Zea mais.

O termo "plantas de arroz" em relação à presente invenção signi- fica espécies de plantas do gênero Oryza, particularmente espécies de plan- tas do gênero Oryza cultivadas com finalidades comerciais na agricultura, particular e preferencialmente Oryza sativa.

Em uma modalidade adicional, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção são células vegetais transgênicas ou plantas transgênicas.

As células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção sintetizam um amido modificado em comparação com o amido isolado de células vegetais do tipo selvagem ou de plantas do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamente.

Um objetivo adicional da presente invenção refere-se, portanto, às células vegetais de acordo com a invenção ou às plantas de acordo com a invenção que sintetizam um amido modificado em comparação com o ami- do isolado das células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes ou isolado das plantas do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes.

A invenção refere-se ainda a plantas modificadas geneticamente que contêm células vegetais de acordo com a invenção. Tais plantas podem ser produzidas partindo de células vegetais de acordo com a invenção atra- vés da regeneração.

a presente invenção refere-se ainda ao material de propagação

das plantas de acordo com a invenção, que compreende uma célula vegetal

de acordo com a invenção.

O termo "material de propagação" compreende aqui quaisquer

constituintes das plantas que são adequados para a produção de descen- dentes de uma maneira vegetativa ou sexual. Para a propagação vegetativa, por exemplo, cortes, culturas de calos, rizomas ou tubérculos são adequa- dos. Outro material de propagação compreende, por exemplo, fruto, semen- tes, mudas, protoplastos, culturas de células etc. Particular e preferencial- mente, o material de propagação é constituído de sementes contendo en-

dosperma (grãos).

Em uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se às

partes vegetais que podem ser colhidas das plantas de acordo com a inven- ção, tal como fruto, raízes de armazenamento, raízes, flores, brotos, ramos ou caules, preferencialmente sementes, grânulos ou tubérculos, estas partes que podem ser colhidas contendo células vegetais de acordo com a inven- ção.

O amido que é sintetizado partindo das células vegetais de a- cordo com a invenção ou das plantas de acordo com a invenção é distingui- do, em comparação com o amido isolado das células vegetais do tipo selva- gem correspondente que não são modificadas geneticamentes ou em com- paração com o amido isolado das plantas do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes, em particular, pelo fato de que possui um maior poder de intumescimento em água quente.

Além disso, a presente invenção refere-se ainda a um processo para a produção de uma planta modificada geneticamente, em que

a) uma célula vegetal é modificada geneticamente, a modifi- cação genética compreendendo as etapas i e ii a seguir em

qualquer seqüência desejada, individualmente ou simulta- neamente

i) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento

na atividade de uma proteína que possui a atividade

de uma amido sintase II, em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes,

ii) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento

na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes b) uma planta é regenerada partindo das células vegetais da

etapa a);

c) opcionalmente plantas adicionais são produzidas com o auxílio das plantas de acordo com a etapa b) em que as células vegetais são opcionalmente isoladas das plantas de acor- do com a etapa b) ou c) e as etapas a) até c) do processo são repetidas até que seja produzida uma planta que contenha uma molécula de ácido nuclei- co estranha que codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il e uma molécula de ácido nucleico estranha que codifica uma prote- ína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase. Em uma modalidade preferida, o processo de acordo com a in-

venção para a preparação de uma planta modificada geneticamente com- preende as etapas a seguir: a) uma célula vegetal é modificada geneticamente, a modifi- cação genética compreendendo as etapas i e ii a seguir em qualquer seqüência desejada ou quaisquer combinações desejadas das etapas i e ii a seguir sendo realizadas indi- vidualmente ou simultaneamente

i) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes

ii) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes

b) uma planta é regenerada partindo das células vegetais que compreendem a modificação genética de acordo com as etapas

O a) i

ii) a) ii

iii) a) i e a) ii,

c) em células vegetais de plantas de acordo com a etapa

i) b) i uma modificação genética de acordo com a etapa

a) ii,

ii) b) ii uma modificação genética de acordo com a etapa a) i,

introduzida e uma planta é regenerada

d) opcionalmente plantas adicionais são produzidas com o auxílio das plantas obtidas de acordo com uma das etapas b) iii ou c) i ou c) ii. Isto se aplica para as modificações genéticas introduzidas na cé- lula vegetal de acordo com a etapa a) que são, em princípio, qualquer tipo de modificação que leva ao aumento na atividade de uma proteína que pos- sui a atividade enzimática de uma amido sintase Il e/ou que leva ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glu-

cano-água diquinase.

A regeneração das plantas de acordo com a etapa B) e opcio- nalmente a etapa c) do processo de acordo com a invenção podem ser reali- zados de acordo com os métodos conhecidos pelos versado na técnica (descritos, por exemplo, em "Plant Cell Culture Protocols", 1999, edt. by R.

D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2).

A produção de plantas adicionais (dependendo dos processos

de acordo com a etapa c) ou com a etapa d)) do processo de acordo com a invenção pode ser realizada, por exemplo, através da propagação vegetativa (por exemplo, através de mudas, tubérculos ou através de cultura de calos e da regeneração de plantas inteiras) ou através da propagação sexual. A propagação sexual ocorre preferencialmente aqui de uma maneira controla- da, isto é, plantas selecionadas que possuem certas propriedades são cru- zadas com outra e propagadas. A escolha é preferencialmente realizada a- qui de tal maneira que as plantas adicionais (que são produzidas de acordo com processos de acordo com a etapa c) ou com a etapa d)) compreendem as modificações introduzidas nas etapas anteriores.

Nos processos de acordo com a invenção para a produção de plantas modificadas geneticamente, as modificações genéticas para a pro- dução das células vegetais modificadas geneticamente de acordo com a in- venção podem ser realizadas simultaneamente ou em etapas uma após a .outra. Não é importante aqui o fato de que, para modificações genéticas su- cessivas que levam a uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II, é utilizado o mesmo método que o para a modificação genética que leva a uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase.

Em uma modalidade preferida do processo de acordo com a in- venção para a produção de uma planta modificada geneticamente, uma eta- pa b)-1 do processo vem a seguir da etapa b) em que são selecionadas plantas que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il de acordo com a etapa a) i e/ou que pos- suem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase de acordo com a etapa a) ii. As plantas seleciona- das são então utilizadas para as etapas adicionais do processo.

Preferencialmente, são selecionadas aqui plantas que contêm a modificação genética de acordo com a etapa a) i e que possuem um aumen- to na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sinta- se II, que é maior pelo menos 6 vezes, preferencialmente pelo menos 7 ve- zes, particular e preferencialmente pelo menos 8 vezes, em particular, prefe- rencialmente pelo menos 9 vezes e muito particular e preferencialmente pelo menos 10 vezes, em comparação com as plantas do tipo selvagem não-

modificadas geneticamente correspondentes.

Preferencialmente, são selecionadas aqui plantas que contêm a modificação genética de acordo com a etapa a) ii e que sintetizam um amido que possui um conteúdo de amido fosfato que é maior pelo menos 4 vezes, particular e preferencialmente pelo menos 5 vezes, em particular preferenci- almente pelo menos 6 vezes, em comparação com as plantas do tipo selva- gem não-modificadas geneticamente correspondentes.

Em uma modalidade adicional do processo de acordo com a in- venção para a produção de uma planta modificada geneticamente, a modifi- cação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de áci- do nucleico estranha no genoma da célula vegetal, na presença ou na ex- pressão da molécula de ácido nucleico/moléculas de ácidos nucleicos estra- nhas que levam a uma maior atividade de uma proteína que possui a ativi- dade enzimática de uma amido sintase Il e/ou a uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase

na célula.

Em uma modalidade adicional do processo de acordo com a in- venção para a produção de uma planta modificada geneticamente, a modifi- cação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de áci- do nucleico estranha no genoma da célula vegetal, a molécula de ácido nu- cleico/moléculas de ácidos nucleicos estranhas compreendendo uma se- qüência que codifica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase Il e/ou uma proteína que possui a atividade enzimática de

uma glucano-água diquinase.

Em uma modalidade adicional do processo de acordo com a in- venção para a produção de uma planta modificada geneticamente de acordo com a invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codi- fica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase de batata, trigo, arroz, milho, soja, frutas cítricas, Curcuma ou A- rabidopsis. Preferencialmente, pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase de Curcuma longa ou de batata, particular e prefe- rencialmente de batata e, em particular, preferencialmente uma proteína que possui a seqüência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6 ou que é codificada pela seqüência de ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 5. As referências para as seqüências de ácidos nucleicos que codificam as pro- teínas e que possuem a atividade enzimática de uma glucano-água diquina- se das plantas mencionadas já são indicadas adicionalmente anteriormente.

Em uma modalidade adicional do processo de acordo com a in- venção para a produção de uma planta modificada geneticamente de acordo com a invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codi- fica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase Il de cevada, Aegilops, arroz, milho, mandioca, feijão, batata, ervilha, batata doce, Arabidopsis, cará, Ostreococcus ou Chlamydomonas. Preferencial- mente, pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase Il do trigo. As referências para as seqüências de ácidos nucleicos que codificam as pro- teínas mencionadas que possuem a atividade enzimática de uma amido sin- tase Il das plantas mencionadas já são indicadas adicional e anteriormente.

Como já descrito anteriormente para as moléculas de ácidos nu. cleicos estranhas incorporadas em uma célula vegetal ou uma planta para modificação genética, a etapa a) do processo de acordo com a invenção pa- ra a produção de uma planta modificada geneticamente pode envolver uma molécula de ácido nucleico individual ou um número de moléculas de ácidos nucleicos. As moléculas de ácidos nucleicos estranhas que codificam uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase Il ou que codificam uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano- água diquinase podem assim estar presentes juntas em uma única molécula de ácido nucleico ou podem estar presentes em moléculas de ácidos nuclei- cos separadas. Se as moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma pro- teína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase Il e que codi- ficam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase estiverem presentes em moléculas de ácidos nucleicos separadas, estas moléculas de ácidos nucleicos podem ser introduzidas em uma célula vege-

tal simultaneamente ou em etapas sucessivas.

Além disso, para a introdução de uma molécula de ácido nuclei- co estranha durante a implementação dos processos de acordo com a in- venção, ao invés de uma célula vegetal do tipo selvagem ou uma planta do tipo selvagem, pode ser utilizada uma célula mutante ou um mutante que é distinguido pelo fato de que já possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase Il ou uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma gluca- no-água diquinase. As afirmações feitas adicional e anteriormente sobre o uso de mutantes para a produção de células vegetais ou de plantas de acor- do com a invenção devem ser utilizadas aqui de forma correspondente.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a processos de acordo com a invenção para a produção de uma planta modifi- cada geneticamente, em que a molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase Il é sele-

cionada do grupo que consiste em

a) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína

que possui a seqüência de aminoácidos sob a SEQ ID NO 6;

b) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, cuja se- qüência de aminoácidos possui pelo menos 70%, preferen- cialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, particular e preferencialmente pelo menos 95% e mais preferencialmente de pelo menos 98% da seqüência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6;

c) moléculas de ácidos nucleicos que compreendem a se- qüência de ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 5 ou uma seqüência complementar;

d) moléculas de ácidos nucleicos que possuem uma identida- de de pelo menos 70%, preferencialmente de pelo menos 80%, preferencialmente de pelo menos 90%, em particular preferencialmente de pelo menos 95% e mais preferenci- almente de pelo menos 98% em relação às seqüências de

ácidos nucleicos descritas sob c),

e) moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam sob con- dições estringentes com pelo menos um filamento das mo- léculas de ácidos nucleicos descritas sob a) ou c);

f) moléculas de ácidos nucleicos cuja seqüência de nucleotí- deos difere da seqüência das moléculas de ácidos nuclei- cos mencionadas sob a) ou c) por causa da degeneração

do código genético;

g) moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos, varia- ções alélicas e/ou derivados das moléculas de ácidos nu- cleicos mencionadas sob a), b), c), d), e) ou f),

h) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, em que as seqüências de ácidos nucleicos que codificam uma proteí- na que possui a atividade de uma amido sintase Il estão li- gadas a elementos reguladores (promotores) que iniciam a transcrição nas células vegetais ou i) moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com h), em que os promotores são promotores específicos ao tecido, parti- cular e preferencialmente promotores que iniciam a trans- crição, especificamente em células de endosperma de

plantas.

Em uma modalidade preferida adicional, a presente invenção refere- se a processos de acordo com a invenção para a produção de uma planta modificada geneticamente, em que a molécula de ácido nucleico que codifi-

ca uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água

diquinase é selecionada do grupo que consiste em

a) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a seqüência de aminoácidos mostrada sob a

SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 4;

b) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína

que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e cuja seqüência possui uma identidade de pelo menos 70%, preferencialmente de pelo menos 80%, preferencialmente de pelo menos 90%, em particular preferencialmente de

pelo menos 95% e most preferencialmente de pelo menos

98% em relação à seqüência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 4;

c) moléculas de ácidos nucleicos que compreendem a se- qüência de ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 1 ou

SEQ ID NO 3 ou uma seqüência complementar;

d) moléculas de ácidos nucleicos que possuem uma identida- de de pelo menos 70%, preferencialmente de pelo menos 80%, preferencialmente de pelo menos 90%, em particular preferencialmente de pelo menos 95% e mais preferenci-

almente de pelo menos 98% em relação às seqüências de

ácidos nucleicos descritas sob c),

e) moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam sob con- I 40

dições estringentes com pelo menos um filamento das mo- léculas de ácidos nucleicos descritas sob a) ou c);

f) moléculas de ácidos nucleicos cuja seqüência de nucleotí- deos difere da seqüência das moléculas de ácidos nuclei-

cos mencionadas sob a) ou c) por causa da degeneração

do código genético;

h) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína

que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, em que as seqüências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água di- quinase estão ligadas a elementos reguladores (promoto- ! 5 res) que iniciam a transcrição em células vegetais ou

i) moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com h), em que os promotores são promotores específicos ao tecido, parti- cular e preferencialmente promotores que iniciam a trans- crição, especificamente em células de endosperma de

plantas.

O termo "identidade" deve ser entendido em relação à presente

invenção como significando o número de aminoácidos/nucleotídeos idênticos (identidade) com outras proteínas/ácidos nucleicos, expresso em porcenta- gem. Preferencialmente, a identidade em relação a uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il é determinada através de comparações da seqüência de aminoácidos indicada sob a SEQ ID NO 6 e a identidade em relação a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il é determinada através de compa- rações da seqüência de ácido nucleico indicada sob a SEQ ID NO 5 e a i- dentidade em relação a uma proteína que possui a atividade de uma gluca- no-água diquinase é determinada através de comparações da seqüência de aminoácidos indicada sob a SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 4 ou a identidade em relação a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é determinada através de comparações da seqüência de ácido nucleico indicada sob a SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 3 com outras proteínas/ácidos nucleicos com o auxílio de programas de computador. Se as seqüências que estão sendo comparadas com outra tiverem comprimentos diferentes, a identidade deve ser determi- nada de forma que o número de aminoácidos/nucleotídeos que a seqüência mais curta possui em comum com a seqüência mais longa determine a pro- porção percentual da identidade. Preferencialmente, a identidade é determi- nada através do programa de computador CIustaIW que é conhecido e está disponível ao público (Thompson e outros, Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). O CIustaIW é disponibilizado publicamente por Julie Thompson (Thompson®EMBL.Heidelberg.DE) e Toby Gibson (Gibson@ EMBL.Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofs- trasse 1, D 69117 Heidelberg1 Alemanha. O CIustaIW pode ser similarmente baixado ("downloaded") de vários sites da Internet, inter alia, no IGBMC (Ins- titut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Β. P. 163, 67404 Illkirch Cedex, França; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) e no EBI (ftp://ftD.ebi. ac.uk/pub/software/) e em todos os sites de Internet "mirrored" do EBI (Euro- pean Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 10 1SD, Reino Unido).

Preferencialmente, o programa de computador CIustaIW da ver- são 1.8 é utilizado com a finalidade de determinar a identidade entre proteí- nas descritas no contexto da presente invenção e outras proteínas. Os pa- râmetros a seguir devem ser ajustados aqui: KTUPLE=I, T0PDIAG=5, WIND0W=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=G0NNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.

Preferencialmente, o programa de computador CIustaIW da ver- são 1.8 é utilizado com a finalidade de determinar a identidade entre, por exemplo, a seqüência de nucleotídeos das moléculas de ácidos nucleicos descritas no contexto da presente invenção e a seqüência de nucleotídeos de outras moléculas de ácidos nucleicos. Os parâmetros a seguir devem ser ajustados aqui: KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX.IUB, GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: unweighted (TRANSIÇÕES: não pesadas).

Identidade significa ainda que há equivalências funcionais e/ou estruturais entre as moléculas de ácidos nucleicos em questão ou as proteí- nas codificadas pelas mesmas. As moléculas de ácidos nucleicos que são homólogas às moléculas descritas anteriormente e que são derivadas destas moléculas são geralmente variações destas moléculas que são modificações que exercem a mesma função biológica. Podem ser aqui variações que o- correm naturalmente, por exemplo, seqüências de outras espécies ou muta- ções, em que estas mutações podem ter ocorrido naturalmente ou que foram introduzidas através de mutagênese seletiva. Ainda, as variações podem ser seqüências preparadas de forma sintética. No caso das variações alélicas, estas podem ser tanto variações que ocorrem naturalmente quanto varia- ções que são preparadas de forma sintética ou produzidas através de técni- cas do DNA recombinante. Uma forma especial de derivados é constituída, por exemplo, de moléculas de ácidos nucleicos que, por causa da degenera- ção do código genético, diferem das moléculas de ácidos nucleicos descritas no contexto da presente invenção. O termo "hibridização" no contexto da presente invenção signifi-

ca hibridização sob condições convencionais de hibridização, preferencial- mente sob condições estringentes, como descrito, por exemplo, em Sam- brook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1 NY. ISBN: 0879695773). Particular e preferencialmente, "hibridizar" significa a hibridi- zação sob as condições a seguir: tampão de hibridização:

2xSSC; solução IOxDenhardt (Ficoll 400+PEG+BSA; porporção 1:1:1); 0,1% de SDS; 5 mM de EDTA; 50 mM de Na2HP04; 250 μg/mL de DNA de esperma de arenque; 50 μg/mL de tRNA; ou 25 M de tampão fosfato de sódio pH 7,2; 1 mM de EDTA; 7% de SDS temperatura de hibridização: T=65 até 68°C

tampão de lavagem: 0,1xSSC; 0,1% de SDS temperatura de lavagem: T=65 até 68°C. As moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam com as mo- léculas mencionadas podem ser isoladas, por exemplo, de bibliotecas ge- nômicas ou de cDNA. A identificação e o isolamento de tais moléculas de ácidos nucleicos podem ser realizados aqui utilizando as moléculas de áci- dos nucleicos mencionadas ou partes destas moléculas ou os complementos inversos destas moléculas, por exemplo, através da hibridização de acordo com processos padronizados ou por amplificação através da PCR.

Como uma sonda de hibridização para o isolamento de uma se- qüência de ácido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il ou que possui a atividade de uma glucano-água di- quinase, é possível utilizar, por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos que contêm exatamente ou que contêm essencialmente a seqüência de nucleo- tídeos indicada sob a SEQ ID NO 5 (amido sintase II) ou sob a SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 3 (glucano-água diquinase) ou partes destas seqüências. Os fragmentos utilizados como uma sonda de hibridização podem ser fragmen- tos ou oligonucleotídeos sintéticos que foram produzidos com o auxílio de técnicas de síntese costumeiras e cuja seqüência concorda essencialmente com a de uma molécula de ácido nucleico descrita no contexto da presente invenção. Se os genes que se hibridizam com as seqüências de ácidos nu- cleicos descritas no contexto da presente invenção forem identificados e iso- lados, deve ser realizada uma determinação da seqüência e uma análise das propriedades das proteínas codificadas por esta seqüência com a finali- dade de determinar se são proteínas que possuem a atividade de uma ami- do sintase Il ou a atividade de uma glucano-água diquinase.

As moléculas que se hibridizam com as moléculas de ácidos nu- cleicos descritas no contexto da presente invenção, em particular, incluem fragmentos, derivados e variações alélicas das moléculas de ácidos nuclei- cos mencionadas. O termo "derivado" em relação à presente invenção signi- fica que as seqüências destas moléculas diferem das seqüências das molé- cuias de ácidos nucleicos descritas anteriormente em uma ou mais posições e possuem um grau alto de identidade em relação a estas seqüências. As diferenças em relação às moléculas de ácidos nucleicos descritas anterior- mente podem resultar aqui, por exemplo, da deleção, da adição, da substitu- ição, da inserção ou da recombinação.

Para a expressão de moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a invenção que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il e/ou uma proteína que possui a atividade de uma glucano- água diquinase, estas são preferencialmente ligadas a seqüências de DNA reguladoras que garantem a transcrição em células vegetais. Estas, em par- ticular, incluem promotores. Geralmente, quaisquer promotores ativos nas células vegetais são adequados para expressão.

O promotor pode ser escolhido aqui de forma que a expressão ocorra de forma constitutiva ou apenas em um certo tecido, em um certo momento no desenvolvimento da planta ou em um momento determinado por influências externas. Tanto em relação à planta quanto em relação à mo- lécula de ácido nucleico, o promotor pode ser homólogo ou heterólogo.

Os promotores adequados são, por exemplo, o promotor do RNA 35S do vírus mosaico da couve-flor e o promotor da ubiquitina do mi- lho, o promotor do gene da actina-1 do arroz (McEIroy e outros, 1990, Plant Cell 2(2), 163-171), o promotor de histona do milho (WO 99 34005) para ex- pressão constitutiva, o promotor B33 de Patatingen (Rocha-Sosa e outros, EMBO J. 8 (1989), 23-29) para expressão específica ao tubérculo nas bata- tas ou um promotor que garante a expressão apenas em tecidos fotossinteti- camente ativos, por exemplo, o promotor ST-LS1 (Stockhaus e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus e outros, EMBO J. 8 (1989) 2445-2451) ou para uma expressão específica ao endosperma o promotor HMG do trigo, o promotor USP, o promotor da faseolina, os promo- tores dos genes da zeína do milho (Pedersen e outros, Cell 29 (1982), 1015- 1026; Quatroccio e outros, Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93), um promotor da glutelina (Leisy e outros, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng e ou- tros, Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara e outros, FEBS Lett. 383 (1996), 213-218), um promotor da globulina (Nakase e outros, 1996, Gene 170(2), 223-226), um promotor da prolamina (Qu e Takaiwa, 2004, Plant Biotechno- Iogy Journal 2(2), 113-125) ou um promotor Shrunken-1 (Werr e outros, EM- BO J. 4 (1985), 1373-1380). Entretanto, também podem ser utilizados pro- motores que são ativados apenas em um momento determinado por influên- cias externas (vide, por exemplo, WO 9307279). Podem ser tembém de inte- resse os promotores de proteínas de choque térmico que permitem uma in- dução simples. Além disso, podem ser utilizados os promotores específicos à semente, tal como, por exemplo, o promotor USP de Vicia faba, que garan- te a expressão específica à semente em Vicia faba e outras plantas (Fiedler e outros, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Báumlein e outros, Mol. Gen.

Genet. 225 (1991), 459-467).

Além disso, pode estar presente uma seqüência de término (si- nal de poliadenilação) que serve para a adição de uma cauda poli-A no pro- duto da transcrição. É atribuída à cauda poli-A uma função na estabilização dos produtos da transcrição. Tais elementos são descritos na literatura (cf. Gielen e outros, EMBO J. 8 (1989), 23-29) e podem ser substituídos arbitra- riamente.

As seqüências intrônicas entre o promotor e a região codificado- ra também podem estar presentes. As seqüências intrônicas deste tipo po- dem levar à estabilidade de expressão e à maior expressão em plantas (Cal- Iis e outros, 1987 Genes Devei. 1, 1183-1200; Luehrsen e Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier e outros, 1997; Plant Journal. 12(4): 895-899; Rose e Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil e ou- tros, 1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; Xu e outros, 2003, Science in Chi- na Series C Vol. 46 Ns 6, 561-569). As seqüências intrônicas adequadas são, por exemplo, o primeiro íntron do gene sh1 do milho, o primeiro íntron do gene 1 da poli-ubiquitina do milho, o primeiro íntron do gene EPSPS do arroz, o primeiro íntron do gene da actina-1 do arroz (McEIroy e outros, 1990, Plant Cell 2(2), 163-171) ou um dos dois primeiros íntrons do gene

PAT1 de Arabidopsis.

Uma modalidade adicional da presente invenção refere-se a um processo para a produção de uma planta modificada geneticamente de a- cordo com a invenção, em que

a) uma célula vegetal é modificada geneticamente, a modifica- ção genética levando ao aumento na atividade de uma prote- ína que possui a atividade de uma amido sintase Il em com- paração com células vegetais do tipo selvagem correspon- dente que não são modificadas geneticamentes;

b) uma planta é regenerada partindo das células vegetais da etapa a);

c) opcionalmente plantas adicionais são produzidas com o au- xílio das plantas de acordo com a etapa b) e

d) as plantas obtidas de acordo com a etapa b) ou c) são cru- zadas com uma planta que possui um aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano- água diquinase, em comparação com células vegetais do ti- po selvagem correspondente que não são modificadas gene- ticamentes.

a) uma célula vegetal é modificada geneticamente, a modifi- cação genética levando ao aumento na atividade enzimáti- ca de uma proteína que possui a atividade de uma gluca- no-água diquinase em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes;

b) uma planta é regenerada partindo das células vegetais da etapa a);

c) opcionalmente plantas adicionais são produzidas com o auxílio da planta de acordo com a etapa b) e

d) as plantas obtidas de acordo com a etapa b) ou c) são cru- zadas com uma planta que possui um aumento na ativida- de enzimática de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, em comparação com células vege- tais do tipo selvagem correspondente que não são modifi- cadas geneticamentes.

Nos dois últimos processos mencionados para a produção de

uma planta modificada geneticamente, as plantas de acordo com a etapa a) podem ser modificadas geneticamente como já descrito anteriormente. A regeneração de plantas de acordo com a etapa b) e a produção de plantas adicionais de acordo com a etapa c) já foram similarmente mostradas adi- cionalmente acima.

Uma planta que é cruzada de acordo com a etapa d) das duas últimas modalidades mencionadas com plantas ou descendentes das plan- tas obtidas da etapa b) ou c) pode ser qualquer planta que possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il ou uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma gluca- no-água diquinase, em comparação com plantas do tipo selvagem corres- pondentes. O aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il ou de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase pode ser produzido através de qualquer modificação que leve a um aumento na atividade das proteínas em questão nas plantas correspondentes. Estas plantas podem ser mutantes ou plantas modificadas através de métodos de engenharia genética. Os mutantes podem ser mutan- tes que ocorrem espontaneamente (naturalmente) e também aqueles que foram produzidos através do uso seletivo de agentes mutagênicos (tais co- mo, por exemplo, agentes químicos, radiação ionizante) ou processos de engenharia genética (por exemplo, marcação com ativação de transposon, marcação com ativação de T-DNA, mutagênese in vivo). Preferencialmente, as plantas produzidas através dos processos de engenharia genética são mutantes produzidos através da mutagênese de inserção, particular e prefe- rencialmente plantas modificadas geneticamente que expressam uma molé- cula de ácido nucleico estranha, em particular, preferencialmente plantas modificadas geneticamente nas quais a molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il ou uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.

Preferencialmente, para o cruzamento nos dois últimos proces- sos mencionados de acordo com a invenção, são utilizadas plantas que pos- suem uma atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, que é aumentada em pelo menos 6 vezes, preferencialmente em pelo menos 7 vezes, particular e preferencialmente em pelo menos 8 vezes, em particular preferencialmente em pelo menos 9 vezes e muito particular e preferencialmente em pelo menos 10 vezes, em comparação com plantas do tipo selvagem não-modificadas geneticamente correspondentes.

Em relação a plantas que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, para o cru- zamento nos dois últimos processos mencionados de acordo com a inven- ção são preferencialmente utilizadas plantas que sintetizam um amido que possui um conteúdo de amido fosfato que é aumentado pelo menos 4 vezes, particular e preferencialmente pelo menos 5 vezes, em particular preferenci- almente pelo menos 6 vezes, em comparação com plantas do tipo selvagem

não-modificadas geneticamente correspondentes.

Em uma modalidade preferida, os processos de acordo com a invenção para a produção de uma planta modificada geneticamente são uti- lizados para a produção de plantas de acordo com a invenção ou de plantas que possuem propriedades de plantas de acordo com a invenção.

A presente invenção refere-se ainda às plantas que podem ser

obtidas através dos processos de acordo com a invenção. Foi descoberto de forma surpreendentemente que as células

vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase Il e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase sintetizam um amido modificado. Em particular, o fato de que o amido sintetizado pelas células vegetais de acordo com a invenção ou pelas plantas de acordo com a invenção possui um maior poder de intumescimento em água quente, era surpreendente. O maior poder de intumescimento em agua quente de amidos que podem ser isolados de celulas vegetais de acordo com a invengao e de plantas de a- cordo com a invengao confere propriedades aos amidos que os tornam mais adequados para certas aplicagdes que os amidos convencionais. Se ο amido for empregado, por exemplo, como um agente espessante, ο maior poder de intumescimento em agua quente do amido leva a claramente menos amido que deve ser empregado para atingir um poder de espessamento identico. Isto tem ο resultado de que, por exemplo, ο conteudo de calorias dos alimen-

tos espessados com amido e reduzido. Um objetivo adicional da presente invengao refere-se ao amido

modificado que possui um maior poder de intumescimento em agua quente.

Particular e preferencialmente, ο poder de intumescimento em agua quente

do amido modificado de acordo com a invengao e aumentado pelo menos no

fator de 2，em particular pelo menos no fator de 3 e muito particular e prefe-

rencialmente pelo menos no fator de 4，em comparagao com ο amido 丨solado

de celulas vegetais do tipo selvagem correspondente que nao sao modifica-

das geneticamentes ou isolado de plantas do tipo selvagem correspondente

que nao sao modificadas geneticamentes.

Os metodos para a determinate) do poder de intumescimento em agua quente sao conhecidos pelos versado na tecnica e descritos na Iiteratura (por exemplo, Leach e outros, 1959, Cereal Chemistry 36’ 534- 544). Um metodo que sera utilizado preferencialmente em relagao a presen- te invengao para a determinagao do poder de intumescimento em agua quente e descrito sob os metodos gerais, item 1 · Preferencialmente, a presente invengao refere-se ao amido mo-

dificado que possui um poder de intumescimento em agua quente de pelo menos 110 g/g, preferencialmente de pelo menos 115 g/g, particular e prefe- rencialmente de pelo menos 120 g/g e, em particular, preferencialmente de pelo menos 125 g/g. Preferencialmente, ο amido modificado possui um poder de intumescimento em agua quente de no maximo 350 g/g, particular e preferenci- almente de no maximo 300 g/g, em particular preferencialmente de no maximo 250 g/g e especialmente preferencialmente de no maximo 200 g/g. Um objetivo adicional da presente invengao refere-se ao amido modificado isolado de uma celula vegetal monocotiledonea ou de uma planta monocotiledonea, que possui um poder de intumescimento em agua quente de pelo menos 60 g/g, preferencialmente de pelo menos 75 g/g, particular e preferencialmente de pelo menos 90 g/g, em particular, preferencialmente de pelo menos 105 g/g e especialmente preferencialmente de pelo menos 120 g/g· Preferencialmente, ο amido modificado isolado de uma celula vegetal mono- cotiledonea ou uma planta monocotiledonea possui um poder de intumesci- mento em agua quente de no maximo 250 g/g, particular e preferencialmente de no maximo 200 g/g, em particular, preferencialmente de no maximo 175 g/g e especialmente preferencialmente de no maximo 150 g/g.

Um objetivo adicional da presente invengao refere-se ao amido modificado isolado de celulas vegetais de arroz ou de plantas de arroz, que possui um poder de intumescimento em agua quente de pelo menos 65 g g/g, preferencialmente de pelo menos 80 g/g, particular e preferencialmente de pelo menos 100 g/g, em particular, preferencialmente de pelo menos 115 g/g e especialmente preferencialmente de pelo menos 125 g/g. Preferenci- almente, ο amido modificado isolado de uma celula vegetal de arroz ou de uma planta de arroz possui um poder de intumescimento em agua quente de no maximo 250 g/g, particular e preferencialmente de no maximo 200 g/g, em particular, preferencialmente de no maximo 175 g/g e especialmente pre- ferencialmente de no maximo 150 g/g.

Um objetivo preferido adicional da presente inven?ao refere-se

ao amido modificado isolado de celulas vegetais de milho ou de plantas de miiho, que possui um poder de intumescimento em agua quente de pelo me- nos 40 g/g, preferencialmente de pelo menos 42 g/g, mais preferencialmente de pelo menos 45 g/g e mais preferencialmente de pelo menos 55 g/g.

Um objetivo preferido adicional da presente invengao refere-se ao amido modificado isolado de celulas vegetais de trigo ou de plantas de trigo, que possui um poder de intumescimento em agua quente de pelo me- nos 35 g/g, preferencialmente de pelo menos 50 g/g.

O amido sintetizado partindo de celulas vegetais modificadas geneticamente de acordo com a invengao ou de plantas modificadas geneti- camente de acordo com a invengao possui preferencialmente um maior con- teijdo de amido fosfato. O conteijdo de amido fosfato do amido isolado de celulas vegetais de acordo com a invengao ou de plantas de acordo com a invengao e distintivamente maior aqui que ο conteiido de amido fosfato que seria esperado apos ο cruzamento partindo da soma do conteiido de fosfato das plantas parentais em questao.

Um objetivo preferido da presente invengao refere-se, portanto, ao amido modificado de acordo com a invengao que possui um maior conte- lido de amido fosfato, em comparagao com ο amido isolado de celulas vege- tais do tipo selvagem correspondente que nao sao modificadas genetica- mentes ou de plantas do tipo selvagem correspondente que nao sao modifi- cadas geneticamentes. Preferencialmente, ο conteiido de amido fosfato do amido de acordo com a invengao e aumentado pelo menos 10 vezes, partl· cular e preferencialmente pelo menos 15 vezes, em particular, preferencial- mente pelo menos 20 vezes e muito particular e preferencialmente pelo me- nos 25 vezes, em comparagao com ο amido isolado de celulas vegetais do tipo selvagem correspondente que nao sao modificadas geneticamentes ou isolado de plantas do tipo selvagem correspondente que nao sao modifica- das geneticamentes.

Preferencialmente, ο amido modificado de acordo com a inven- gao possui pelo menos 10 vezes mais, particular e preferencialmente pelo menos 15 vezes mais, em particular, preferencialmente pelo menos 20 ve- zes mais e muito particular e preferencialmente pelo menos 25 vezes mais amido fosfato na posigao C6 das moleculas de glicose do amido que ο ami- do isolado das celulas vegetais do tipo selvagem corresporidentes ou isolado de plantas do tipo selvagem correspondentes.

A quantidade do amido fosfato Iigado na posigao C6 das molecu- las de glicose pode ser determinada utilizando os metodos conhecidos pelos versado na tecnica, tal como, por exemplo, de forma fotometrica atraves de um teste enzimatico acoplado ou atraves de 31P-RMN de acordo com ο me-

todo descrito em Kasemusuwan e Jane (1996, Cereal Chemistry 73，702- 707). Preferencialmente, em relagao a presente invengao a quantidade de amido fosfato Iigado na posigao C6 das moleculas de glicose e determinada utilizando ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 2.

Um objetivo preferido adicional da presente invengao refere-se ao amido modificado de acordo com a invengao, que foi isolado de uma ce- Iula vegetal monocotiledonea ou de uma planta monocotiledonea e possui um conteudo de amido fosfato Iigado na posigao C6 das moleculas de glico- se do amido de pelo menos 11 nmols por mg de amido, particular e prefe- rencialmente de pelo menos 12 nmols por mg de amido. Em particular, este amido modificado de acordo com a invengao e preferencialmente amido de milho, arroz ou trigo.

Em uma modalidade adicional da presente invengao, os amidos modificados de acordo com a invengao sao amidos nativos.

O termo "amido nativo" em relagao a presente invengao significa que ο amido e isolado de plantas de acordo com a invengao, de partes das plantas que podem ser colhidas de acordo com a invengao, de partes de armazenamento de amido de acordo com a invengao ou de material de pro- pagagao de plantas de acordo com a invengao de acordo com metodos co- nhecidos pelos versado na tecnica. A presente invengao refere-se ainda ao amido modificado de

acordo com a irwengao’ que pode ser obtido das celulas vegetais de acordo com a invengao ou das plantas de acordo com a invengao, do material de propagagao de acordo com a invengao ou de partes da planta que podem ser colhidas de acordo com a invengao ou que pode ser obtido de plantas que to ram produzidas utilizando um processo de acordo com a invengao pa- ra a produgao de uma planta modificada geneticamente.

A presente invengao refere-se ainda a celulas vegetais ou a plantas que sintetizam um amido modificado de acordo com a invengao.

A presente invengao refere-se ainda a um processo para a pro- dugao de um amido modificado, que compreende a etapa de extragao do amido de uma celula vegetal de acordo com a invengao ou de uma planta de

acordo com a invengao, do material de propagagao de acordo com a inven- ?ao de uma planta deste tipo e/ou de partes da planta que podem ser colhi- das de tal planta de acordo com a inven^ao, preferencialmente de partes que armazenam amido de tal planta de acordo com a invengao. Preferenci- almente, um processo deste tipo tambem compreende a etapa da colheita das plantas cultivadas ou de partes da planta e/ou do material de propaga- Qao destas plantas antes da extragao do amido e particular e preferencial· mente, alem disso, a etapa do cultivo das plantas de acordo com a invengao antes da colheita.

Os processos para a extragao do amido das plantas ou das par- tes que armazenam amido das plantas sao conhecidos pelos versados na tecnica. Alem disso, os processos para a extragao do amido de varias plan- tas que armazenam amido sao descritos, por exemplo, em Starch: Chemistry and Technology (ed.: Whistler, BeMiIIer e Paschall (1994)，2a edigao, Aca- demic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; vide, por exemplo, capi- tulo XII, page 412-468: Corn and Sorgo Starches: Production; por Watson; capituIo XIII, pagina 469-479: Tapioca, Arrowroot and Sago Starches: Pro- duction; por Corbishley e Miller; cap itu Io XIV’ pagina 479-490; Potato Starch: Production and Uses; por Mitch; cap itu Io XV, pagina 491 ate 506; Wheat Starch: Production, Modification and Uses; por Knight e Oson; e capitulo XVI, pagina 507 ate 528: Rice Starch: Production and Uses; por Rohmer e Klem; Corn Starch: Eckhoff e outros, Cereal Chem. 73 (1996), 54-57, a ex- tragao do amido de milho na escala industrial e geralmente conseguida atra- ves da "moagem Limida". Os dispositivos que sao comumente utilizados nos processos para a extragao de amido partindo de material vegetal sao sepa- radores, decantadores, hidrociclones, secadores em spray e secadores em Ieito fluidizado.

O termo "partes que armazenam amido" deve ser entendido em reIagao a presente invengao como significando as partes de uma planta em que ο amido, ao contrario do amido transitorio das folhas, e armazenado na forma de um deposito para a sobrevivencia perene de periodos de tempo mais longos. As partes das plantas preferidas que armazenam amido sao,

por exemplo, tuberculos, raizes de armazenamento e graos, os graos com- preendendo um endosperma sao particularmente preferidos, os graos com- preendendo um endosperma de plantas de milho, arroz ou trigo sao, em par- ticular, preferidos.

Em uma modalidade preferida, os processos de acordo com a invengao para a produgao de um amido modificado sao utilizados para a produgao de um amido de acordo com a invengao.

A presente invengao refere-se similarmente ao amido modifica- do, que pode ser obtido atraves de um processo de acordo com a invengao para a produgao de amido modificado. A presente invengao refere-se, alem disso, ao uso de celulas

vegetais de acordo com a invengao ou de plantas de acordo com a invengao para a produgao de um amido modificado.

E conhecido pelos versados na tecnica que as propriedades do amido podem ser alteradas, por exemplo, atraves da derivatizagao termica, quimica, enzimatica ou mecanica. Os amidos derivatizados sao particular- mente adequados para varias aplicagdes na area de alimentos e/ou sem ser de alimentos. Os amidos de acordo com a invengao sao melhor adequados como uma substancia de partida para a produgao de amidos derivatizados que os amidos convencionais, uma vez que possuem um conteijdo maior de grupos funcionais reativos, por exemplo, devido ao maior conteijdo de amido fosfato. Alem disso, as derivatizagoes podem ser realizadas a temperatures mais altas por causa do maior poder de intumescimento em agua quente dos amidos de acordo com a invengao, sem destruir significativamente a estrutu- ra do granulo de amido no curso das mesmas. A presente invengao refere-se, portanto, ainda a processos para

a produgao de um amido derivatizado, em que ο amido modificado de acor- do com a invengao e subsequentemente derivatizado.

O term。"amido derivatizado" deve ser entendido em reIagao a presente invenpao como significando um amido modificado de acordo com a invengao, cujas propriedades apos ο isolamento das celulas vegetais foram alteradas com ο auxilio de processos quimicos, enzimaticos, termicos ou

mecanicos. Em uma modalidade adicional da presente invengao, ο amido derivatizado de acordo com a invengao e ο amido tratado com calor e/ou com acido.

Em uma modalidade adicional, os amidos derivatizados sao ete- res de amido, em particular, eteres de alquil amido, eteres de O-alila, eteres de hidroxialquila, eteres de O-carboxilmetila, eteres de amido contendo ni- trogenio, eteres de amido contendo fosfato ou eteres de amido contendo e 门 xof re.

Em uma modalidade adicional, os amidos derivatizados sao a- midos reticulados.

Em uma modalidade adicional, os amidos derivatizados sao po- Iimeros com enxerto de amido.

Em uma modalidade adicional, os amidos derivatizados sao a- midos oxidados.

Em uma modalidade adicional, os amidos derivatizados sao es-

teres de amido, em particular, esteres de amido que foram introduzidos no amido utilizando acidos organicos. Os amidos derivatizados sao particular e preferencialmente amidos "fosfato", "nitrato", "sulfato", "xantato", "acetato" ou "citrato".

Os amidos derivatizados de acordo com a invengao sao ade-

quados para varios usos na indiistria farm ace utica e no campo de alimentos e/ou sem ser de alimentos. Os metodos para a produgao de amidos derivati- zados de acordo com a invengao sao conhecidos pelos versado na tecnica e sao descritos adequadamente na Iiteratura geral. Um sumario da produgao de amidos derivatizados e encontrado, por exemplo, em Orthoefer (em Corn, Chemistry and Technology, 1987, eds. Watson e Ramstad, capitulo 16，479- 499).

A presente invengao refere-se similarmente ao amido derivatiza- do que pode ser obtido atraves do processo de acordo com a invengao para a produgao de um amido derivatizado.

A presente invenpao refere-se ainda ao uso de amidos modifica-

dos de acordo com a invengao para a produgao de amido derivatizado. As partes que armazenam amido de plantas sao frequentemente processadas para produzir farinhas. Os exemplos de partes de plantas das quais as farinhas podem ser produzidas sao, por exemplo, tuberculos de plantas de batata e graos de plantas que produzem graos. Para a produgao de farinhas partindo de plantas de cereais, os graos contendo endosperma destas plantas sao moidos e peneirados. O amido e um constituinte principal do endosperma. Em outras plantas que nao contem endosperma, mas ou- tras partes que armazenam amido, tais como, por exemplo, tuberculos ou raizes, a farinha e frequentemente produzida atraves da fragmentagao, da secagem e da moagem subsequente dos orgaos de armazeriamento em questao. O amido do endosperma ou contido nas partes que armazenam amido das plantas constitui uma parte essencial da farinha que e produzida partindo das partes da planta em questao. As propriedades das farinhas sao, portanto, tambem influenciadas pelo amido presente na farinha em questao. As celuias vegetais de acordo com a invengao e as plantas de acordo com a invengao sintetizam um amido alterado em comparagao com as celuias ve- getais do tipo selvagem correspondente que nao sao modificadas genetica- mente ou as plantas do tipo selvagem correspondente que nao sao modifi- cadas geneticamentes. As farinhas produzidas partindo das celuias vegetais de acordo com a invengao, das plantas de acordo com a invengao, do mate- rial de propagagao de acordo com a invengao ou das partes que podem ser colhidas de acordo com a invengao possuem, portanto, propriedades altera- das. As propriedades das farinhas tambem podem ser influenciadas pela mistura do amido com farinhas ou pela mistura das farinhas que possuem propriedades diferentes.

Um objetivo adicional da presente invengao refere-se, portanto, a farinhas que compreendem um amido de acordo com a invengao.

Um objetivo adicional da presente invengao refere-se a farinhas que podem ser produzidas partindo de celuias vegetais de acordo com a invengao, de plantas de acordo com a invengao，de partes que armazenam amido de plantas de acordo com a invengao, de material de propagagao de

acordo com a invengao ou de partes de plantas que podem ser colhidas de acordo com a invengao. As partes que armazenam amido de plantas preferi- das de acordo com a invengao para a produgao de farinhas sao tuberculos, raizes de armazenamento e graos contendo um endosperma. Em relagao a presente invengao, os graos de plantas da familia (sistematica) Poaceae sao particularmente preferidos, graos de plantas de milho, arroz ou trigo sao, em particular, preferidos.

O termo "farinha" deve ser entendido em relagao a presente in-

I

vengao como significando um ρό obtido atraves da moagem de partes das plantas. Opcionalmente, as partes das plantas sao secas antes da moagem e da trituragao e/ou peneiradas apos a moagem.

As farinhas de acordo com a invengao sao distinguidas com ba- se no amido de acordo com a invengao presente nas mesmas, em virtude do fato de que possuem um conteiido alterado de fosfato e/ou um maior poder de intumescimento em agua quente. Isto e desejado, por exemplo, no pro- cessamento de farinhas na industria de alimentos para muitas aplicagdes, em particular, na produgao de produtos de panificagao.

Um objetivo preferido da presente invengao refere-se a farinhas produzidas partindo de graos de uma planta monocotiledonea, que possuem um poder de intumescimento em agua quente de pelo menos 28 g/g, prefe- rencialmente de pelo menos 33 g/g, particular e preferencialmente de pelo menos 38 g/g e, em particular, preferencialmente de pelo menos 43 g/g.

A determinagao do poder de intumescimento em agua quente de farinhas e realizada aqui de forma analoga ao metodo ja descrito para a de- terminagao do poder de intumescimento em agua quente de amido, com a diferenga de que as farinhas sao empregadas aqui ao inves do amido. Um metodo preferido para a determinagao do poder de intumescimento em agua quente de farinhas e descrito sob os metodos gerais, item 1.

Um objeto adicional da presente invengao e um process。para a produgao de farinhas, que compreende a etapa da moagem de celulas vege- tais de acordo com a invengao, de plantas de acordo com a invengao, de partes de plantas de acordo com a invengao, de partes que armazenam a- mido de plantas de acordo com a invengao, de material de propagagao de acordo com a invengao ou de material que pode ser colhido de acordo com a invengao.

As farinhas podem ser produzidas atraves da moagem das par- tes que armazenam amido de plantas de acordo com a invengao. E conhed- do pelos versados na tecnica como produzir farinhas. Preferencialmente, um processo para a produgao de farinhas inclui ainda a etapa da colheita das plantas cultivadas ou de partes da planta e/ou do material de propagagao ou das partes de armazenamento de amido destas plantas antes da moagem e particular e preferencialmente, alem disso, a etapa do cultivo de plantas de acordo com a invengao antes da colheita.

Em uma modalidade adicional da presente invengao, ο processo para a produgao de farinhas inclui um processamento de plantas de acordo com a invengao, de partes que armazenam amido de plantas de acordo com a invengao, de material de propagagao de acordo com a invengao ou de um material que pode ser colhido de acordo com a invengao antes da moagem.

O processamento aqui pode ser, por exemplo, um tratamento termico e/ou uma secagem. O tratamento termico seguido pela secagem do material tratado pelo calor e utilizado, por exemplo, na produgao de farinhas provenientes de raizes de armazenamento ou de tuberculos tais como, por exemplo, de tuberculos de batata antes que a moagem ocorra. A trituragao de plantas de acordo com a invengao, de partes que armazenam amido de plantas de acordo com a invengao, de material de propagagao de acordo com a invengao ou de material que pode ser coletado de acordo com a in- vengao antes da moagem pode ser similarmente ο processamento dentro do significado da presente invengao. A remogao do tecido vegetal, tal como, por exemplo, de residuos de cereais dos graos, antes da moagem, e tambem ο processamento antes da moagem dentro do significado da presente inven- gao.

Em uma modalidade adicional da presente invengao, ο processo para a produgao de farinhas inclui ο processamento dos graos para moagem apos a moagem.

Os graos para moagem podem ser aqui peneirados, por exem- plo, apos a moagem com a finalidade de, por exemplo, produzir varios tipos de farinhas.

Um objetivo adicional da presente invengao e ο uso de partes de plantas modificadas geneticamente de acordo com a invengao, de plantas de acordo com a invengao, de partes de plantas de acordo com a invengao, de partes que armazenam amido de plantas de acordo com a invengao, de ma- terial de propagagao de acordo com a invengao ou de material que pode ser coletado de acordo com a invengao para a produgao de farinhas. Descrigao das sequencias SEQ ID NO 1: sequencia de acido nucleico que codifica uma proteina que

possui a atividade de uma glucano-agua diquinase de So- Ianum tuberosum.

SEQ ID NO 2: sequencia de aminoacidos da proteina codificada pela SEQ ID NO 1 que possui a atividade de uma glucano-agua diquinase de Solanum tuberosum.

__________SEQ ID NQl3:sequencia de acido nucleico que codifica uma proteina que

possui a atividade de uma glucano-agua diquinase de Cur- cuma longa.

SEQ ID NO 4: sequencia de aminoacidos da proteina codificada pela SEQ ID NO 3 que possui a atividade de uma glucano-agua

diquinase de Curcuma longa. SEQ ID NO 5: sequencia de acido nucleico que codifica a proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il de Triticum aes- tivum.

SEQ ID NO 6: sequencia de aminoacidos da proteina codificada pela

SEQ ID NO 3 que possui a atividade de uma amido sintase Il de Triticum aestivum. Descricao das fiquras

A figura 1 mostra zimogramas para a determinagao da atividade de proteinas que possuem a atividade de uma amido sintase Il em compara- gao com ο tipo selvagem. Foram utilizados extratos de proteinas totais de

graos imaturos (15 dias apos ο inicio da florescencia) de plantas do tipo sel- vagem (WT) e daqueles de tres plantas modificadas geneticamente (oe-SSII- O.S.-5, oe-SSII-0.s.-12, oe-SSII-0.s.-19) produzidos independentemente um do outro partindo da transformagao utilizando ο vetor de expressao AH32- 191. Nas faixas WT e puro (nao diluido), quantidades equivalentes de prote- ina dos respectivos extratos sao aplicadas em cada caso. Os extratos de proteinas das plantas modificadas geneticamente foram diluidos sequenci- almente (1:2, 1:4, 1:6，1:8，1:10, 1:20 ou 1:100) e estas diluigoes foram simi- Iarmente separadas umas das outras de forma eletroforetica. Comparando a intensidade dos produtos especificos sintetizados por uma proteina que pos- sui a atividade de uma amido sintase Il presente nos zimogramas apos a coloragao com solugao de Lugol (marcada com uma seta) dos extratos de proteinas de plantas do tipo selvagem com a intensidade das bandas de ex- tratos de proteinas de plantas alteradas geneticamente em questao, pode ser determinado ο aumento na atividade de uma amido sintase Il comparada com a das plantas do tipo selvagem. Intensidades equivalentes significam aqui atividades equivalentes.

A figura 2 mostra ο autorradiograma de uma Analise de Northern Blot de sementes T1 imaturas das Iinhagens de arroz oe-SSII-0.s.-19, oe- SSII-0-S.-20, oe-SSII-0.s.-21, oe-SSII-0.s.-22, oe-SSII-0.s.-23 em compa- ragao com plantas do tipo selvagem (WT) que nao foram modificadas gene- ticamente. Para isso, ο RNA foi extraido de tres sementes em cada caso de Iinhagens produzidas independentemente da transformagao utilizando ο ve- tor de expressao AH32-191 e analisado de acordo com ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 8. A banda que se hibridizou utilizando uma sonda de acido nucleico marcada que codifica uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il do trig。e marcada por SSII.

A figura 3 mostra um zimograma de extratos de proteinas de sementes T1 imaturas das Iinhagens de arroz oe-SSII-0.s.-8, oe-SSII-O.s.- 19’ oe-SSII-0.s.-23 em comparagao com sementes de plantas do tipo selva- gem (WT) que nao foram modificadas geneticamente apos a coloragao com solugao de Lugol. Por linhagem, os extratos de proteinas de dois (oe-SSII-

O.S.-8) ou tres (oe-SSII-0.s.-19, oe-SSII-0.s.-23) graos diferentes foram analisados. A analise atraves de zimograma foi realizada aqui de acordo com ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 9. A banda no zimogra- ma que e especifica para uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il e marcada por SSII.

A figura 4 mostra um mapa do plasm ideo pJH77.

A figura 5 mostra um zimograma de extratos de proteinas de graos de milho imaturos de plantas do tipo selvagem (WT) e de uma Iinha- gem transgenica (TG) que possui uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il (SS2). E indicada a quantidade de proteina fornecida.

A figura 6 mostra um mapa do plasm ideo pHN3. Metodos gerais

Sao descritos abaixo os metodos que podem ser utilizados para a realizagao dos processos de acordo com a invengao. Estes metodos sao modalidades reais da presente invengao, mas nao restringem a presente invengao a estes metodos. E conhecido pelos versados na tecnica que po- de-se realizar a invengao de forma identica atraves da modificagao dos me- todos descritos e/ou atraves da substituigao de partes individuals dos meto- dos por partes alternativas dos metodos. Os conteudos de todas as publica- g5es citadas sao adicionalmente incluidos na descrigao do pedido de paten- te como referencia.

1. Determinacao do poder de intumescimento em aqua quente (SP)

100 mg de amostra (amido ou farinha) sao suspensos em 6 ml de agua e subsequentemente intumescidos a 92,5°C durante 20 minutos. Durante a incubagao da amostra a 92,5°C, a suspensao e misturada repeti- damente (durante os primeiros 2 minutos continuamente, apos 3，4, 5,10, 15 ou 25 minutos) atraves da rotagao cuidadosa dos recipientes das amostras em 360°. Ap6s a incubagao a 92，5°C durante um total de 30 minutos, a sus- pensao e resfriada em agua gelada durante aproximadamente 1 minuto an- tes da incubagao a 25°C durante 5 minutos e realizada. Apos a centrifuga- gao (temperatura ambiente, 10OOxg, 15 minutos), ο sobrenadante obtido e

cuidadosamente removido do sedimento gelatinoso e ο peso do sedimento e determinado. O poder de intumescimento em agua quente e calculado de acordo com a formula a seguir:

SP = (peso do sedimento gelatinoso)/(peso da amostra pesada em (farinha ou amido)) 2. Determinacao do conteiido de amido fosfato

a) Determinagao do conteiido de fosfato na posigao C6 das moleculas de glicose

No amido, as posigoes C2, C3 e C6 das unidades de glicose po- dem ser fosforiladas. Para a determinagao do conteiido de P na C6 do ami- do ou da farinha (modificada de acordo com Nielsen e outros, 1994，Plant Physiol. 105: 111-117), 50 mg de farinha de arroz/milho ou de amido de ar- roz/milho foram hidrolisados a 95° C em 500 μΙ_ de HCI a 0,7 M durante 4 h com agitagao continua. Subsequentemente, as bateladas foram centrifuga- das a 15’500xg durante 10 min e os sobrenadantes foram purificados partin- do da materia suspensa e da turvagao atraves de uma membrana de filtro (0,45 μηι). 20 μL do hidrolisado transliicido foram misturados com 180 μί_ de tampao imidazol (300 mM de imidazol, pH 7,4; 7,5 mM de MgCI2, 1 mM de EDTA e 0,4 mM de NADP) e as amostras foram medidas em 340 nm em um fotometro. Apos a determinagao da absorgao de base, uma reagao enzimati- ca foi iniciada atraves da adigao de 2 unidades cada de glicose 6-fosfato de- sidrogenase (de Leuconostoc mesenteroides, Boehringer Mannheim). A alte- ragao medida (DO) se baseia em uma reagao equimolar de glicose 6-fosfato e NADP para fornecer 6-fosfogluconato e NADPH, a formagao de NADPH sendo detectada no comprimento de onda mencionado anteriormente. A re- agao foi monitorada ate atingir um ponto final. O conteiido de glicose 6- fosfato no hidrolisado pode ser calculado partindo do resultado desta medi- da:

nmol de glicose 6-fosfato/mg FW = χ

DO χ volume medido (200 μΙ_) volume de hidrolisado (500 μΙ_)

Coeficiente de extingao χ volume de amostra medida <20 μΙ_) χ mg de amostra pesada (50 mg) Para nao serem obtidos resultados erroneos devido a hidrolise incompleta do amido no material pesado (farinha ou amido), ο grau de hidro- lise foi subsequentemente determinado. Para isto, 10 μί de hidrolisado fo- ram tirados dos respectivos hidrolisados medidos em reIagao a glicose 6- fosfato, neutralizados com 10 μί de NaOH a 0,7 M, Ievados a um volume final de 2 mL com agua e diluidos 1:100 com agua. 4 μΙ_ desta diluigao foram tratados com 196 μΙ_ de tampao de medida (100 mM de imidazol pH 6,9; 5 mM de MgCI2, 1 mM de ATP, 0,4 mM de NADP) e utilizados para a deterrrH- nagao fotometrica do conteCido de glicose. Apos a determinagao da absor- gao de base em 340 nm, a reagao foi monitorada no fotometro (340 nm) a- traves da adigao de 2 μΙ_ de mistura de enzimas (hexoquinase 1:10; glicose 6-fosfato desidrogenase de Ievedura 1:10; em tampao de medida) ate atingir ο ponto final. O principio de medida corresponde a primeira reagao. Partindo das medidas obtidas, a quantidade de glicose pode ser calculada para a respectiva amostra:

DO χ volume medido (200 μΙ_) χ volume de hidrolisado (500 μΙ_) χ volume total de diluigao (2 mL)

nmol de glicose/g FW = -

Coeficiente de extingao χ volume de amostra medida <20 μ1_) χ volume empregado para diluigao (10 μΙ_) χ mg de amostra pesada (50 mg)

A quantidade de glicose das amostras individuals detectadas corresponde aqui a proporgao de amido que esta disponivel para a determl· nagao de fosfato em C6. Para simplificagao, ο conteudo de glicose e conver- tido no conteCido de amido no calculo adicional.

ConteCido de glicose (mmol g FW) χ peso molecular de glicose no amido (162 g/mol) ConteDdo de amido (%)

χ fator de conversao (% = 100)--

Fator de conversao (mmol para mol = 1000)

Subsequentemente, ο resultado da medida de glicose 6-fosfato

esta relacionado com ο conteCido de amido da amostra correspondente com

a finalidade de expressar ο conteCido de glicose 6-fosfato por mg de amido hidrolisado:

nmol de glicose 6-fosfato/mg de amostra pesada χ 100

nmol de Glc 6-P/mg de amido =--

Conteiido de amido (mg de amido/100 mg de amostra pesada)

Sem ser com referenda a quantidade de glicose 6-fosfato no peso obtido da amostra (farinha ou amido), atraves dessa forma de calculo, a quantidade de glicose 6-fosfato e relatada apenas para a parte do amido que foi completamente hidrolisada em glicose.

b)_Determinacao do conteiido total de fosfato

A determinagao do conteiido total de fosfato foi realizada de a- cordo com ο metodo de Ames (Methods in Enzymology VIII, (1966)，115- 118).

Aproximadamente 50 mg de amido sao tratados com 30 μί_ de solugao de nitrato de magnesio etanolico e a mistura e incinerada em uma mufla a 500。C durante tres horas. O residuo e tratado com 300 μΙ_ de HCI a 0,5 M e incubado a 60°C durante 30 min. Subsequentemente, uma aliquota e completada ate 300 μΙ_ com HCI a 0,5 M1 adicionada a uma mistura de 100 μΙ_ de acido ascorbico com concentragao a 10% e 600 μΙ_ de milibdato de amonio a 0,42% em acido sulfCirico a 2 M e incubada a 45°C durante 20 min.

3. Transformagao de plantas de arroz

As plantas de arroz foram transformadas de acordo com ο metodo descrito por Hiei e outros (1994, Plant Journal 6(2), 271 -282).

4. Transformagao de plantas de trigo

As plantas de trigo foram transformadas de acordo com ο metock) descrito por Becker e outros (1994, Plant Journal 5, 299-307).

5. Transformagao de plantas de milho

Os embrioes imaturos de plantas de milho da Iinhagem A188

foram transformados de acordo com ο metodo descrito por Ishida e outros (1996, Nature Biotechnology 14, 745-750).

6. Processamento de graos de arroz e produgao de fa ri η has de arroz

Para a produgao de quantidades adequadas de material para investigagao, as plantas de arroz foram cultivadas em uma estufa e colhidas apos atingir a maturidade completa. Para a secagem adicional, os graos de arroz maduros foram armazenados a 37°C durante 3 a 7 dias.

Subsequentemente, os graos foram Iiberados das cascas atra- ves de um descascador (Laboratory Paddy sheller, Grainman, Miami, Flori- da, USA) e ο arroz marrom obtido foi processado atraves do polimento du- rante 1 minuto (Pearlest Rice Polisher, Kett, Villa Park, CA, USA) para pro- duzir arroz branco. Para as investigag5es da composigao dos graos e das propriedades do amido, os graos brancos foram moidos para produzir "fari- nha de arroz" atraves de um moinho de Iaboratorio (Cyclotec, Sample mill, Foss1 Dinamarca).

7. Extra?ao de amido de arroz de farinha de arroz

A extragao de amido de arroz de farinha de arroz foi realizada

seguindo ο metodo descrito em Wang e Wang (2004; Journal of Cereal Sci- ence 39: 291-296).

Aproximadamente 10 g de farinha de arroz foram incubados a temperatura ambiente com 40 mL de 0,05% (p/v) de NaOH durante 16 a 18 horas em um agitador. Subsequentemente, a suspensao foi transferida para uma misturadora Waring para completar a digestao e misturada vigorosa- mente durante 15 segundos em velocidade baixa e subsequentemente du- rante 45 segundos em velocidade alta. Para a separagao de constituintes maiores (por exemplo, parede celular), a suspensao foi passada sucessiva- mente atraves de peneiras possuindo uma Iargura de trama de 125 μιτι e 63 μΓΠ. Apos a centrifugagao a 1500 rpm durante 15 minutos (Microfuge 3.0R; Heraeus), ο sobrenadante foi vertido e a camada de proteina disposta sobre a superficie do precipitado foi removida utilizando uma espatula. O precipita- do resultante foi ressuspenso novamente em 0,05% (p/v) de NaOH e ο pro- cesso descrito acima foi repetido. Subsequentemente, ο precipitado foi res- suspenso em agua e ο pH da suspensao foi ajustado em 6,5 ate 7 utilizando

HCI. O amido de arroz obtido foi Iavado com agua um total de tres vezes, cada etapa de Iavagem compreendendo uma sedimentagao (centrifugagao a 1500 rpm, 15 min, temperatura ambiente), ο descarte do sobrenadante e a ressuspensao do precipitado em agua fresca. Antes da ultima etapa de Iava- gem, ο pH foi verificado novamente e opcionalmente ajustado em pH 7 utili- zando HCI. O precipitado da ultima etapa de Iavagem foi ressuspenso em acetona, sedimentado e ο sobrenadante foi descartado. Apos a ressuspen- sao do precipitado novamente em acetona, a suspensao foi vertida em uma placa de Petri e seca em uma capela a temperatura ambiente durante pelo menos 18 horas.

Em uma ultima etapa, ο amido de arroz obtido dessa maneira foi

convertido atraves da moagem em um almofariz em um ρό firio, que pode ser empregado diretamente para investigapoes adicionais. 8. Analise do nivel de expressao de uma proteina atraves de Nor-

thern blot

A expressao de um acido nucleico que codifica uma proteina foi

verificada atraves da analise de Northern blot. Para isto, tres graos de arroz imaturos foram colhidos (aproximadamente 15 dias apos a fluorescencia) para cada planta independerite obtida atraves da transformagao e congela- dos em nitrogenio liquido. Para a homogeneizagao, os graos de arroz conge- Iados em uma placa para microtituIagao de 96 pogos foram triturados utili- zando uma esfera de ago inoxidavel de 4,5 mm em um moinho Retsch (mo- delo MM300) durante 30 segundos a uma frequencia de 30 hertz. Subse- quentemente, ο RNA foi isolado atraves de um kit de extragao de RNA da Promega de acordo com as instrugoes do fabricante (SV 96 Total RNA Isola- tion System, order Ng Z3505, Promega1 Mannheim). A concentrapao do RNA nas amostras individuais foi determinada atraves da determinagao fotometri- ca da absorgao em 260 nm.

Por amostra, 2 μς de RNA em cada caso foram Ievados ate um volume uniforme e tratados com um volume identico de tampao de amostra de RNA (65% (v/v) de formamida, 8% de formaldeido, 13% (v/v) de tampao de gel (vide acima), 50 pg/mL de brometo de etidio). Apos ο aquecimento

(10 min, 65°C) e ο resfriamento imediato em gelo, ο RNA foi separado em um gel de agarose a 1,2% (p/v) (MOPS a 20 mM pH 8，acetato de Na a 0,5 mM, 1 mM de EDTA, 6% (v/v) de formaldeido) utilizando tampao de eluigao de RNA (MOPS a 20 mM pH 8,0, acetato de Na a 5 mM, 1 mM de EDTA) em uma intensidade de corrente constante de 50 a 80 mA durante aproximada- mente 2 horas.

Subsequentemente, ο RNA foi transferido para uma membrana Hybond-N atraves de um blot de difusao utilizando 10x SSC (NaCI a 1,5 M, citrato de Na 150 mM pH 7,0) e imobilizado na membrana atraves de irradia- gao de UV.

Para a hibridizagao do Northern blot para a detecgao da expres-

sao de uma molecula de acido nucleico que codifica uma proteina que pos- sui a atividade de uma amido sintase II, um fragmento Spel/BspHI de apro- ximadamente 1 kb do plasmideo AH32-191 (pb 4568-5686), que compreen- de a regiao a 5’ do cDNA, que codifica uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il do trigo, foi utilizado. A marcagao radioativa do fragmento de DNA foi realizada atraves do kit de marcagao de DNA iniciado aleatoriamente (Random primed DNA labelling kit) da Roche (order Ns 1004 760) utilizando 32P-alfa-dCTP de acordo com as instru?5es do fabricante.

A membrana de nylon que compreende ο RNA transferido foi incubada durante quatro horas a 60°C com agitagao suave em um banho de agua contendo tampao de hibridizagao (tampao fosfato de Na a 250 mM pH 7,2,，EDTA 1 mM de 6% (p/v) de SDS, 1 % (p/v) de BSA) antes do DNA marcado radioativamente ser adicionado no tampao de hibridizagao. Apos a incubagao durante 16 horas, ο tampao de hibridizagao foi removido e a membrana foi Iavada sucessivamente uma vez com 3xSSC e uma vez com 2xSSC (vide acima) a 60。C com agitagao suave em um banho de agua para a remogao de moleculas de DNA Iigadas de forma nao-especifica. Para a detecgao do RNA marcado, foi realizada uma autorradiografia da membrana de nylon sobre um filme de raios X a -70°C durante um ate tres dias.

9. Determinagao da atividade de uma proteina que possui a ativi-

dade de uma amido sintase Il atraves de gel de atividade (zimograma) A detecgao da atividade de proteinas que possuem a atividade de uma amido sintase em graos de arroz imaturos foi realizada atraves de geis de atividade (zimogramas), em que os extratos de proteinas sao sepa- rados em um gel de poliacrilamida sob condigoes nativas e subsequente- mente incubados com substratos apropriados. O produto de reagao resultan- te (alfa-glucano) foi corado no gel atraves da solugao de Lugol.

Os graos de arroz imaturos individuais (aproximadamente 15 dias apos a fluorescencia) foram congelados em nitrogenio Iiquido e homo- geneizados em 150 a 200 μΙ_ de tampao de extrapao gelado (tris/HCI a 50 mM pH 7,6, EDTA a 2,5 mM, DTT a 2 mM, PMSF a 4 mM, 0,1% (p/v) de gli- cogenio, 10 % (v/v) de glicerol). Apos a centrifugagao (15 min, 13.000 g, 4°C), ο sobrenadante transliicido foi transferido para um recipie门te de reagao novo e uma aliquota do extrato foi utilizada para a determinagao do conteii- do de proteinas de acordo com Bradford (1976, Anal Biochem 72: 248-254). A separagao dos extratos de proteinas foi realizada atraves de

gel de poliacrilamida a 7,5% continuo (7,5% de acrilamida:bisacrilamida 37,5:1; tris/HCI a 25 mM pH 7,6, glicina a 192 mM, 0,1 % (p/v) de APS, 0,05 % (v/v) de TEMED) utilizando tampao de eluigao em concentragao de uma vez (tris/HCI25 mM, glicina a 192 mM). Para cada amostra, quantidades cor- respondendo a 15 μς de proteina foram aplicadas e a eletroforese foi reali- zada a 4°C durante 2 ate 2,5 horas. Subsequentemente, os geis foram incu- bados durante a noite a temperatura ambiente em 15 mL de tampao de in- cubagao (citrato de sodio pH a 0,5 mM 7,0, acetato de potassio a 25 mM, EDTA a 2 mM, DTT a 2 mM, 0,1% (p/v) de amilopectina, tricina/NaOH pH a 50 mM 8,5, ADP-glicose a 1 mM) com agitagao continua. A colora^ao do amido formado foi realizada atraves da solugao de Lugol.

Para determinar em quantas vezes a atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il e aumentada em compara- gao com plantas do tipo selvagem correspondente que nao sao modificadas geneticamentes, os extratos de proteinas das Iinhagens modificadas geneti- camente foram em cada caso diluidos sequencialmente e separados de for-

ma eletroforetica de acordo com ο metodo descrito anteriormente. As etapas adicionais foram realizadas como ja descrito anteriormente. Apos corar os zimogramas com a solugao de Lugol，foi realizada uma comparagao visual da intensidade dos produtos corados produzidos por uma proteina que pos- sui a atividade.de uma amido sintase Il (marcados por uma seta na figura 1) para as varias diluigioes dos extratos de proteinas das plantas modificadas geneticamente com os produtos dos extratos de proteinas do tipo selvagem nao diluidos em questao. Uma vez que a intensidade da coloragao dos pro- dutos se correlaciona diretamente com a atividade de uma proteina que pos- sui a atividade de uma amido sintase II, as bandas dos produtos que possu- em intensidades iguais possuem a mesma atividade. Se as bandas dos pro- dutos de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il no extrato de proteinas diluido possuirem a mesma intensidade que a banda dos produtos do extrato de proteinas nao diluido correspondente proveniente de plantas do tipo selvagem em questao, ο fato de diluigao correspondera ao grau de aumento na atividade nas plantas modificadas geneticamente em questao (para isto, comparar a figura 1).

10. Produgao de plantas atraves de embrioes de arroz (recuperagao de embrioes)

As sementes sao separadas da panicula e os residuos sao re- movidos. O endosperm a e separado do embriao utilizando um bisturi e e utilizado para as analises apropriadas. Para aumentar a capacidade de u- medecimento, ο embriao e tratado por curto periodo de tempo com 70% de etanol e subsequentemente incubado durante 20 minutos em uma solugao que compreende 10% de NaOCI e uma gota de detergente disponivel co- mercialmente para esterilizagao.

Subsequentemente, a solugao de esterilizagao e removida ο mais completamente quanto possivel e ο embriao e Iavado com agua des- mineralizada esterilizada uma vez durante um minuto e subsequentemente duas vezes durante 10 minutos em cada caso. As sementes sao colocadas em placas de Petri sobre meio solidificado utilizando agar compreendendo um quarto da concentragao de sais do meio MS (meio de Murashige-Skoog)

e 4 % de sacarose. Subsequentemente, as placas de Petri sao seladas com parafilme e incubadas a 23°C na escuridao. Apos a germinagao (aproxima- damente de 5 a 7 dias apos a exibigao dos embri5es), as placas de Petri sao transferidas para a luz. Se os hipocotilos das plantas cultivadas partindo da semente tiverem atingido um comprimento de aproximadamente 2 cm, as plantas serao transferidas para vasos de vidro compreendendo meio MS solidificado utilizando agar contendo 2% de sacarose. Apos a formagao ade- quada de raizes, as plantas podem ser plantadas no solo.

I

11. Processamento de graos de milho

Para a produgao de material suficiente, as plantas de milho fo- ram cultivadas sob condigoes de estufa. Espigas de milho totalmente madu- ras foram colhidas e armazenadas a 37°C durante 3 a 7 dias para secagem adiciorial antes que os graos fossem removidos das espigas.

12. Extragao de amido de milho

O amido de milho foi extraido de acordo com ο metodo de moa- gem Cimida descrito pela "Corn Refiners Association" (http://www.milho.org). a 50 g de graos de milho foram incubados em um excesso de acido sulfu- roso durante 3 dias a 50°C para Iiberar a matriz proteica. Depois disso, os graos foram Iavados com agua e secos durante um curto periodo de tempo. A moagem dos graos foi feita em um moinho de ultracentrifuga^ao (retsch, Alemanha, ZM100) com uma peneira que possui uma Iargura de trama de 2 mm. O material moido foi transferido para um bequer de vidro e incubado durante pelo menos 30 minutos em solugao de NaCI a 20% Ievando a sedl· mentagao dos granulos de amido e a uma flutuagao dos corpos Iipidicos na fase superior. A fase superior compreendendo os germens foi decantada e ο sediment。foi novamente suspenso na solugao remanescente. Depois disso, uma purificagao adicional dos granulos de amido foi conseguida atraves de varias etapas de peneiragao. Foi utilizada uma peneira de 500 μιτι (DIN 4188) seguida por uma peneira de 200 μιτι (DIN 4188) e uma peneira de 125 (ISO 3310-1), em que as peneiras foram Iavadas com 20% de NaCI (2 a 3 L) atraves do uso de um atomizador ate que as goticulas sob a peneira nao contivessem mais granulos de amido. O amido recebido foi sedimentado du-

rante a noite a temperatura ambiente e ο sobrenadante foi decantado de uma maneira que permaneceram aproximadamente 5 mm do sobrenadante sobre ο amido sedimentado. Depois disso, ο amido foi transferido para tubos de centrifuga e sedimentados novamente durante 10 minutos a 3500 rpm em uma Heraeus Variofuge. Apos a centrifugagao a camada de amido-proteina na superficie do sediment。(frequentemente sendo reconhecida como pos- suindo uma coloragao diferente) foi removida com uma espatula e foi descar- tada. O amido obtido foi novamente suspenso varias vezes com acetato de sodio a 0,2 M, pH 4,6, centrifugado (5 minutos, vide os outros parametros acima) e em cada momento a camada de amido-proteina na superficie do sedimento foi removida como descrito anteriormente. Depois disso, ο a- mido obtido foi digerido em uma solugao compreendendo acetato de sodio a 0,2 M, pH 4,6, 1% de bromelaina e 1% de pesina durante 1 hora sob rota- gao constante seguida por centrifugagao (3000 rpm, vide os outros parame- tros acima). A camada de amido-proteina na superficie do sedimento foi no- vamente removida como descrito anteriormente, ο sedimento obtido foi sus- penso em agua e centrifugado novamente antes que a camada de proteina na superficie do sedimento fosse removida como descrito anteriormente. Esta etapa de Iavagem foi no total repetida 5 vezes antes do amido obtido ser suspenso em 80% de etanol e centrifugado (3000 rpm, vide os outros parametros acima). Esta etapa foi repetida 4 vezes. Finalmente ο amido ob- tido foi Iavado uma vez em acetona para remover os lipideos. Depois disso, ο amido foi seco a temperatura ambiente. 13. Cultivo de plantas de milho

Material vegetal Zea mays, variedade A188 Condi?5es de cultivo na estufa:

solo: 80% de turf a branca

20% de turf a marrom 100 kg/m3 de areia para vidro 40 kg/m3 de argila estrutura: fina

pH 5,3-6,1

fertilizante basico: 2 kg/m3 12-12-17 (+2) e 100 g/m3 Radigen (Therafor Gm- bH, lsrlohn, Alemanha)

Vasos: recipientes de 10 Iitros

Densidade: maximo de 6 plantas/m2

Fertilizagao: 1 TAB Plantosan 4g (20-10-15+6) no estagio de 4 folhas 1 TAB Plantosan (vide acima) apos 3 semanas adicionais

Temperatura: dia 22°C a 25°C / noite 16°C Luz: 18 horas, 350 - 400 pEinstein/s/m

Umidade: 50% rel Exemplos

1. Preparagao do vetor de expressao de planta AH32-191, que com pre- ende uma sequencia codificadora para uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il

A sequencia codificadora completa da proteina que possui a ati- vidade de uma amido sintase Il do trigo (T.a.-SSII) foi cortada do plasmideo pCF31 (descrito na WO 97 45545 sob ο nome pTaSSI) atraves das endonu- cleases de restrigao Ech 36 H e Xho I e clonada no plasm ideo IR103-123 (descrito na WO 05 030941) clivado utilizando as endonucleases de restri- gao Eco RV e Xho I. O vetor de expressao obtido foi chamado de AH32-191. O vetor de expressao de planta IR103-123 serve para a expressao especifi- ca ao endosperma do gene alvo sob ο controle do promotor da globulina do arroz. O vetor de expressao de planta IR103-123 contem adicionalmente ο gene bar sob ο controle do promotor CaMV35S, que foi utilizado como um marcador de selegao para a transformagao de plantas.

2. Produgao de plantas de arroz que possuem uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il

As plantas de arroz (variedade M202) foram transformadas atra- ves de Agrobacterium compreendendo ο plasm ideo AH32-191, utilizando ο metodo descrito em Hiei e outros (1994，Plant Journal 6(2), 271-282). As plantas obtidas receberam ο nome oe-SSII-O.s.-X, em que X representa plantas independentes produzidas partindo da transformagao.

3. Produgao de plantas de arroz que possuem uma maior atividade de

uma proteina que possui a atividade de uma glucano-agua diquinase As plantas de arroz (variedade M202) foram transformadas atra- ves de Agrobacterium compreendendo ο plasmideo pML82 (descrito na WO 05 095619), utilizando ο metodo descrito em Hiei e outros (1994, Plant Jour- nal 6(2)’ 271-282). As plantas obtidas receberam ο nome oe-GWD-O.s.-X, em que X representa plantas independentes produzidas partindo da trans- formagao.

4. Analise das plantas de arroz que foram transformadas utilizando ο vetor de expressao AH32-191

As plantas de arroz produzidas partindo da transformagao com ο vetor de expressao AH32-191 (plantas TO) das Iinhagens que possuem ο nome oe-SSII-O.s.-X foram cultivadas no solo em uma estufa. O RNA foi isolado partindo de graos imaturos (sementes T1) de varias Iinhagens que possuem ο nome oe-SSII-O.s.-X e uma analise de Northern blot foi realizada de acordo com ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 8. Foi possi- vel identificar um niimero de Iinhagens que tinham uma maior expressao de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il do trigo em comparagao com plantas do tipo selvagem nao-modificadas geneticamente correspondentes (vide ο exemplo de representa^ao na figura 2).

Uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il em sementes T1 imaturas de varias Iinhagens oe-SSII- O.s.-X foi adicionalmente detectada atraves de zimograma (vide ο exemplo de representagao nas figuras 1 e 2). A analise atraves de zimograma foi rea- lizada de acordo com ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 9.

5. Analise das plantas de arroz que foram transformadas utilizando ο vetor de expressao pML82

As plantas de arroz produzidas partindo da transformagao com ο vetor de expressao pML82 (plantas TO) das Iinhagens que possuem ο nome oe-GWD-O.s.-X foram cultivadas em solo em uma estufa. A farinha foi produ- zida partindo de graos maduros individuals (sementes T1) de varias Iinhagens que possuem ο nome oe-GWD-O.s.-X. Para isso, os graos individuals foram finamente pulverizados e ο material mo (do foi subsequentemente triturado em

um moinho de esferas (Retsch, modelo MM300) durante 30 segundos a uma frequencia de 30 hertz. Subsequentemente, foi realizada uma determinagao do conteijdo de amido fosfato na posigao C6 de moleculas de glicose da fa- rinha de acordo com ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 2.

Os resuItados a seguir foram obtidos para as plantas seleciona-

das:

Nome da planta nmol de fosfato em C6 por mg de peso fresco das sementes oe-GWD-0.s.-2 1,68 oe-GWD-0.s.-4 1,70 oe-GWD-0.s.-9 1,47 WT 0,30

Tabela 1: Conteiido de fosfato Iigado na posigao C6 das mole- culas de glicose nas farinhas, produzidas partindo de sementes T1 individu- als de Iinhagens diferentes que possuem ο nome oe-GWD-O.s.-X em com- paragao com farinhas produzidas partindo de sementes de plantas do tipo selvagem correspondentes (WT) da variedade M202, que nao foram modifi- cadas geneticamente.

Como e evidente partindo da tabela 1, foi possivel utilizando ο vetor de expressao pML82 identificar Iinhagens independentes produzidas partindo da transformagao, que em comparagao com plantas do tipo selva- gem correspondentes que nao foram modificadas geneticamente tinham um maior conteijdo de fosfato Iigado na posigao C6 das moleculas de glicose nas farinhas. Uma vez que e conhecido que as celulas vegetais que possu- em uma maior expressao de uma proteina que possui a atividade de uma glucano-agua diquinase sintetizam um amido que possui um maior conteiido de amido fosfato em comparagao com plantas do tipo selvagem nao-modifl· cadas geneticamente correspondentes (vide, por exemplo, WO 02 34923), ο aumento no conteiido de fosfato nas Iinhagens que possuem ο nome oe- GWD-O.s.-X deve ser atribuido a uma maior atividade da proteina que pos- sui a atividade de uma glucano-agua diquinase. 6. Produgao de plantas que possuem uma maior atividade de uma protei- na que possui a atividade de uma amido sintase Il e uma maior atividade de

uma proteina que possui a atividade de uma glucano-agua diquinase sementes T1 em cada caso de plantas de varias Iinhagens que possuem ο nome oe-SSII-O.s.-X ou das Iinhagens oe-GWD-O.s.-X fo- ram novamente cultivadas em uma estufa e as plantas em questao foram borrifadas com uma solugao que compreende 0,5% de Basta® (Bayer CropScience). Aproximadamente um quarto das plantas tratadas das Iinha- gens oe-SSH-0.s.-19, oe-GWD-0.s.-2, oe-GWD-0.s.-4 e oe-GWD-0.s.-9 reagiu sensivelmente ao tratamento com Basta®, que permitiu que fosse concluido que nao continham ο gene bar mediando resistencia a Basta® e ο T-DNA dos veto res de expressao foi integrado em um sitio do genoma ou nos sitios no genoma que ficam tao fortemente Iigados que nao se segre- gam. As sementes T2 de plantas T1 destas Iinhagens que eram resistentes ao tratamento com Basta® foram novamente colocadas na estufa e um tra- tamento com Basta® foi realizado como descrito anteriormente. Subsequen- temente, ο mesmo tratamento com Basta® foi realizado com plantas T3 des- tas linhagens: era possivel aqui identificar varias plantas T3 das Iinhagens oe-GWD-0.s.-19, oe-GWD-0.s.-2, oe-GWD-0.s.-4 e oe-GWD-0.s.-9 em que todas as plantas eram resistentes a Basta®. Isto permitiu que fosse conclui- do que as plantas T2 das quais as sementes T3 em questao foram origina- das eram homozigotas em relagao ao T-DNA integrado. As sementes T2 de plantas homozigotas das linhagens oe-SSII-0.s.-19, oe-GWD-0.s.-2, oe- GWD-O.S.-4 e oe-GWD-0.s.-9 foram novamente colocadas e varias plantas da Iinhagem oe-SSII-0.s.-19 foram em cada caso pulverizadas com polen das linhagens oe-GWD-0.s.-2, oe-GWD-0.s.-4 e oe-GWD-0.s.-9. Os des- cendentes do cruzamento resultante disso foram denominados oe-SSII/ GWD-O.S.-1 (oe-SSI卜O.S.-19 X oe-GWD-0.s.-2), oe-SSII/GWD-0.s.-2 (oe- SSII-O.S.-19 X oe-GWD-0.s.-4) e oe-SSII/GWD-0.s.-3 (oe-SSII-0.s.-19 X oe-GWD-0.s.-9).

7. Analise de plantas que possuem uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il e uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma glucano-agua diquinase

Das linhagens oe-SSII/GWD-0.s.-1, oe-SSII/GWD-0.s.-2, oe-

SSII/GWD-O.S.-3 produzidas partindo dos cruzamento e de plantas parentais homozigotas (oe-SSII-0.s.-19, oe-GWD-0.s.-2, oe-GWD-0.s.-4 e oe-GWD- O.S.-9), sementes F1 individuals foram em cada caso colhidas e os embri5es foram separados e armazenados a temperatura ambiente. A farinha, obtida do endosperma remanescente das respectivas sementes F1 individuals, foi verificado utilizando ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 6 em reIagao ao conteijdo de fosfato Iigado na posigao C6 das moleculas de glico-

se. Foram obtidos os resultados a seguir.

Nome da planta N9 da semente F1 nmol de fosfato em C6 por mg de amido oe-SSII/GWD-0.s.-1 1 6,5 2 2,8 3 2,6 4 2,5 5 2,6 oe-SSII/GWD-0.s.-2 1 7,9 2 7,2 3 7,1 4 8,4 5 6,9 oe-SSII/GWD-0.s.-3 1 6,7 2 6,0 3 7,7 4 7,5 5 7,0 oe-SSI卜O.S.-19 (matema) 1 1,5 2 1,4 oe-GWD-0.s.-2 (paterna 1) 1 3,6 oe-GWD-0.s.-4 (paterna 2) 1 3,5 oe-GWD-0.s.-9 (paterna 3) 1 4,1 WT 1 0,5 2 0,5

Tabela 2: conteijdo de fosfato Iigado na posigao C6 das molecu- las de glicose em farinhas, produzidas partindo de sementes F1 individuals de Iinhagens que possuem ο nome oe-SSII/GWD-O.s.-X, em comparagao com farinhas produzidas partindo de sementes individuals de plantas do tipo selvagem correspondentes da variedade M202 (WT) que nao foram modifi- cadas geneticamente. O conteiido de fosfato Iigado na posigao C6 das mo- leculas de glicose nas farinhas produzidas partindo de sementes homozigo- tas individuals das Iinhagens parentais e similarmente mostrado.

Os em brides de sementes da Iinhagem oe-SSII/GWD-O.s.-X, cujas farinhas tinham um conteOdo de fosfato Iigado na posigao C6 das mo- Ieculas de glicose de pelo menos 6,0 nmols de C6 fosfato por mg de amido, foram germinados atraves do metodo descrito sob os metodos gerais, item e subsequentemente cultivados em uma estufa para a produgao de se- mentes F2. Para a identificagao dos descendentes que eram homozigotos em relagao a dois T-DNAs integrados, mediando uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il ou mediando uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma gluca- no-agua diquinase, ο processo descrito acima para as sementes F1 foi repe- tido com as sementes F2. Subsequentemente, em fila, os embri5es de se- mentes cujas farinhas tinham um conteudo de fosfato Iigado na posigao C6 das moleculas de glicose de pelo menos 6,0 nmols de C6 fosfato por mg de peso fresco da semente foram germinados e cultivados em uma estufa para a produgao de sementes F3. Os resultados a seguir foram obtidos para se- mentes F3 individuals, que se originam de uma planta F2 em cada caso:

Nome da planta Ns da semente F3 nmol de fosfato em C6 por mg de amido oe-SSII/GWD-0.s.-1 1 9,7 2 9,7 3 10,0 4 9,7 5 9,8 6 9,1 7 8,4 8 9,7 9 9,9 10 10,0 11 9,8 12 9,8 oe-SSII/GWD-0.s,2 1 10,4 2 9,8 3 10,9 4 10,1 5 11,2 6 10,0 7 11,0 8 9,7 9 10,4 10 10,5 11 11,9 12 10,6 oe-SSII/GWD-0.s.-3 1 12,5 2 11,5 3 11,3 4 11,4 5 11,0 6 11,6 7 11,5 8 11,5 9 12,1 10 10,0 11 11,5 12 10,6 oe-SSII-0.s.-19 (materna) 1 1,5 2 1,7 3 2,2 4 1,9 oe-GWD-0.s.-9 (paterna 3) 1 3,3 2 2,9 3 3,3 4 3,3 WT 1 0,5 2 0,9

Tabela 3: Conteiido de fosfato Iigado na posigao C6 das mole- culas de glicose em farinhas, produzidas partindo de sementes F3 individu- als de Iinhagens que possuem ο nome oe-SSII/GWD-O.s.-X; que foram pre- paradas atraves do cruzamento das Iinhagens parentais oe-SSII-0.s.-19 (materna) com plantas das Iinhagens oe-GWD-O.s.-X (paterna), em compa- ragao com farinhas produzidas partindo de sementes individuals de plantas do tipo selvagem correspondentes da variedade M202 (WT) que nao foram modificadas geneticamente. O conteiido de fosfato Iigado na posigao C6 das moleculas de glicose nas farinhas produzidas partindo de sementes homozi- gotas individuals das Iinhagens parentais individuals e similarmente mostra- do.

O fato de que ο conteOdo de fosfato Iigado na posigao C6 das moleculas de glicose em farinhas produzidas partindo de sementes F3 incH- viduais que em cada caso foram originadas de uma planta F2 das Iinhagens em questao era aproximadamente identico ao fato indicado de que as plan- tas F2 em questao sao homozigotas em reIagao aos dois T-DNAs integra-

dos. As sementes F3 de plantas F2 das Iinhagens oe-SSII/GWD-O.s.- 1, oe-SSII/GWD-0.s.-2, oe-SSII/GWD-0.s.-3, que eram homozigotas em rela?ao aos dois T-DNAs integrados mediando uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il ou mediando uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma glucano- agua diquinase, foram processadas para produzir fa ri η has de acordo com ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 6. O amido foi isolado de uma parte desta farinha de acordo com ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 7. Subsequentemente, ο conteudo de fosfato Iigado na posigao C6 das moleculas de glicose foi determinado em farinhas e amido. Foram obtidos os resuItados a seguir:

Nome da planta nmol de fosfato em C6 por mg de amido nmol de fosfato em C6 por mg de amido oe-SSII/GWD-0.s.-1 12,9 11,5 oe-SSII/GWD-0.s.-2 13,4 12,6 oe-SSII/GWD-0.s.-3 13,0 12,4 oe-SSII-0.s.-19 (materna) 1,5 1,2 oe-GWD-0.s.-2 (paterna 1) 3,9 3,3 oe-GWD-0.s.-4 (paterna 2) 3,9 3,5 oe-GWD-0.s.-9 (paterna 3) 3,9 3,5 WT 1,1 0,4

Tabela 4: conteiido de fosfato Iigado na posigao C6 das molecu- las de glicose em farinhas ou amido, produzidas partindo de sementes de plantas homozigotas de Iinhagens que possuem ο nome oe-SSII/GWD-O.s.- X; que foram produzidas atraves de cruzamento, em comparagao com fari- nhas ou amido produzido partindo de sementes das Iinhagens parentais oe- SSH-0.s.-19 (materna) e oe-GWD-O.s.-X (paterna) ou de plantas do tipo sel- vagem da variedade M202 (WT).

A determinagao do poder de intumescimento em agua quente de farinhas ou de amidos produzidos partindo de sementes F3 das Iinhagens oe-SSII/GWD-O.s.-X em relagao as integragoes de T-DNA de plantas homo- zigotas das Iinhagens oe-SSII-0.s.-19 e oe-GWD-O.s.-X e de plantas do tipo selvagem foi realizada de acordo com ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 1. Para as Iinhagens oe-SSII/GWD-O.s.-X, diferindo do metodo descrito sob os metodos gerais, item 1，ο dobro da quantidade de agua com base na quantidade de farinha ou de amido foi empregado aqui uma vez que utilizando a quantidade de agua indicada sob os metodos gerais, item 1 com estas Iinhagens nao podia ser distinguida uma separagao da substancia in- tumescida do sobrenadante aquoso. Foram obtidos os resultados a seguir:

Nome da planta Poder de intumesci- mento da farinha [g/g] Poder de intumesci- mento da farinha [g/g] oe-SSIIGWD-0.s.-1 42,8 95,2 oe-SSIIGWD-0.s.-2 41,1 128,3 oe-SSIIGWD-0.s,3 34’ 1 91,4 oe-SSII-O.s.-l9 (materna) 22,6 36,2 oe-GWD-0.s.-2 (paterna 1) 20,1 30,8 oe-GWD-0.s.-4 (paterna 2) 20,0 36,5 oe-GWD-0.s.-9 (paterna 3) 17,4 34,0 WT 16,3 27,7

Tabela 5: poder de intumescimento em agua quente de farinhas

ou de amido produzido partindo de sementes de plantas homozigotas de Iinhagens que possuem ο nome oe-SSII/GWD-O.s.-X; que foram produzidas atraves de cruzamento, em comparagao com farinhas ou amido produzido partindo de sementes das Iinhagens parentais oe-SSH-0.s.-19 (materna) e oe-GWD-O.s.-X (paterna) ou de plantas do tipo selvagem da variedade M202 (WT).

8. Preparagao do vetor de expressao de planta pJH77, que compreende uma sequencia codificadora para uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il

A sequencia codificadora completa da proteina que possui a ati-

vidade de uma amido sintase Il do trigo (T.a.-SSII) foi subclonada. O plasmi- deo obtido foi denominado pJH77 (vide a figura 4) e compreende os elemen-

tos funcionais a seguir: Posigoes de Nt Orientapao Origem 6600-6623 RB: T-DNA da borda direita de Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) 6624-6909 TL-DNA remanescente de pTiAch5, que flanqueia a borda direita (Gielen e outros, 1984) 6910-7285 no sentido anti-horario 3'nos: sequencia que compreende a regiao nao traduzida a 3，do gene da nopalina sintase do T- DNA do plasmideo pTiT37 (Depicker e outros, 1982) 7286-9685 no sentido anti-horario ss2aTa: sequencia codificadora da proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il do trigo (T.a.-SSII) de Triticum aestivum (trigo) (SEQ ID Ne5) 9686-10437 no sentido anti-horario intronl ubil Zm: primeiro Intron do gene da ubi- quitina-1 (ubil) de Zea mays (Christensen e ou- tros, 1992). 10438-11478 no sentido anti-horario PgIobuIinOs: sequencia que compreende a regi- ao promotora do gene da globulina-1 de Oryza sativa (arroz) (Hwang e outros (2002)) 11479-13261 no sentido horario Pactl Os: sequencia que compreende a regiao promotora do gene da actina-1 de Oryza sativa (arroz) (Mc Elroy e outros, 1990). 13262-13739 no sentido horario intronl actl Os: primeiro intron do gene da acti- na-1 de Oryza sativa (arroz) (Mc Elroy e outros, 1990). 13740-14291 no sentido horario bar. sequencia codificadora do gene da fosfinotri- cina acetiltransferase de Streptomyces hygrosco- picus (Thompson e outros (1987)) 14292-14561 no sentido horario 3'nos: sequencia que compreende a regiao nao traduzida a 3’ do gene da nopalina sintase do T- DNA do plasm ideo pTiT37 (Depicker e outros, 1982) 14562-296 TL-DNA remanescente de pTiAch5, que flanqueia a borda esquerda (Gielen e outros, 1984) (Gielen e outros, 1984) 297-320 LB: T-DNA da borda esquerda de Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) Tabela 6: elementos geneticos do plasmideo pJH77.

Christensen A. H., Sharrock R.A., Quail P.H. (1992). Maize polyubiquitin genes: structure, thermal pertubation of expression and transcript splicing and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Molecular Bio-

logy, 18, 675-689.__

DepickerA., Stachel S., Dhaese P., Zambryski P., Goodman H.M. (1982). Nopali- ne synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular and

Applied Genetics, 1, 561-573.__

Gielen J.; De Beuckeleer M.; Seurinck J.; Deboeck F.; De Greve H.; Lemmers M.; Van Montagu M.; Schell J. (1984). Isolation of an efficient actin promoter for use in

rice transformation. The EMBO journal, 3, 835-846_

Hwang Y.-S.，Yang D·’ McCuIIar C., Wu L., Chen L., Pham P., Nandi S., Huang N. (2002). Analysis of the rice-endosperm-specific globulin promoter in transformed rice cells. Plant Cell Rep 20，842-847.

Leroux B., Pelissier B., Lebrun M. (1996). Chimeric herbicide resistance gene. US Patent US5559024 (24 de setembro de 1996), RHONE POULENC AGROCHIMIE

JFRL_-

Mc Elroy D., Zhang W., Cao J., Wu R. (1990). Isolation of an efficient actin promo-

ter for use in rice transformation. The Plant Cell, 2, 163-171._______

Thompson CJ.’ Rao Movva N·, Tizard R., Crameri R·’ Davies J., Lauwereys M., Botterman J. (1987). Characterization of the herbicide resistance gene bar from

Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal, 6, 2519-2523._

Zambryski P. (1988). Basic processes underlying Agrobacterium-mediated DNA transfer to plant cells. Annual Review of Genetics, 22, 1-30.__

Tabela 7: referencias citadas na Tabela 6.

9. Produgao e identificagao de plantas de milho que possuem uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il As plantas de milho (variedade A188) foram transformadas com

ο plasm ideo pJH77 de acordo com ο metodo descrito sob os metodos ge- rais, item 5. As plantas obtidas receberam ο nome JH77-X, em que X repre- senta plantas independentes produzidas partindo da transformagao. As plan- tas que se originam da transformagao com ο plasm ideo JH77 (plantas TO) foram cultivadas na estufa e polinizadas com polen de plantas do tipo selva- gem (variedade A188).

A proteina foi extraida de graos nao-maduros isolados (ca. 15 dias apos a polinizagao) (graos T1) de plantas independentes obtidas apos a transformagao com ο plasm ideo pJH77 e da polinizagao cruzada com ο tipo selvagem assim como de plantas do tipo selvagem nao-transformadas (A188). Os respectivos extratos de proteinas de varias plantas foram anali- sados em zimogramas de acordo com ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 9. Para a quantificagao do aumento na atividade da proteina que possui a atividade de uma SS II, os extratos de proteinas provenientes de Iinhagens transgenicas foram sequencialmente diluidos. O resuItado de tal analise e exemplificado pela figura 5. Varias plantas exibiram um aumento de atividade da proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il de um fator entre 3 e 5 em comparagao com as plantas do tipo seIvagem (A188).

10. Preparagao do vetor de expressao de planta pHN3, que compreende a sequencia codificadora para uma proteina que possui a atividade de uma glucano-agua diquinase

O vetor pHN3 (Fig. 7) e derivado de pRPA-BL150-Αα2 (EP0337899).

A estrutura do vetor contem os elementos geneticos a seguir:

Posigdes de Nt Orienta^ao Origem 6600-6623 RB: repetigao na borda direita do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) 6624-6909 TL-DNA de pTiAch5 (Gielen e outros, 1984) 6910-6934 attB2: variagao da sequencia de reconhecimen- to attB de Escherichia coli (Hartley e outros, 2000) 6935-7254 no sentido anti-horario 3'nos: sequencia que inclui a regiao nao tradu- zida a 3' do gene da nopalina sintase do T-DNA de pTiT37 (Depicker e outros, 1982) 7255-11984 no sentido anti-horario r1St: sequencia codificadora do gene r1 de So- Ianum tuberosum (Lorberth e outros, 1998) 11985-12504 no sentido anti-horario ubilZm(intron): primeiro intron do gene da ubi- quitina-1 de Zea mays (milho) (Christensen e outros, 1992) 12505-13537 no sentido anti-horario PubiZm: sequencia que inclui a regiao promoto- ra do gene da ubiquitina-1 de Zea mays (milho) como descrito por Christensen e outros, 1992 13538-13562 attB1: variagao da sequencia de reconhecimen- to attB de Escherichia coli (Hartley e outros, 2000) 13563-15337 no sentido horario Pactl Os: sequencia que inclui a regiao promo- tora do gene da actina 1 de Oryza sativa (McEI- roy e outros, 1990) 15338-15815 no sentido horario actlOs(intron): sequencia que inclui ο intron do gene da actina 1 de Oryza sativa (McEIroy e outros, 1990) 15816-16367 no sentido horario -f , bar: a sequencia codificadora do gene da fosfi- notricina acetiltransferase de Streptomyces hy- groscopicus como descrito por Thompson e ou- tros (1987). 16368-16638 no sentido horario 3'nos: sequencia que inclui a regiao nao tradu- zida a 3' do gene da nopalina sintase do T-DNA de pTiT37 (Depicker e outros, 1982) 16639-296 丁L-DNA de pTiAch5 (Gielen e outros, 1984) 297-320 LB: repetigao da borda esquerda do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988)

Tabela 8: Elementos geneticos do plasmideo pHN3.

Bolivar, F·, Rodriguez, Ri., Greene, PJ.，Betlach, M.C., Heyneker1 H.L., Boyer, H.W., Crosa1 J., Falkow, S. (1977).

Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose clo- ning system. Gene, 2, 95-113.

Christensen, A.H., Sharrock1R.A., Quail,P.H. (1992).

Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and trans- cript splicing and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporati- on.

Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689.

Depicker1 A., Stachel, S·, Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H.M. (1982). Nopa- Iine synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 561-573.

Gielen, J., De Beuckeleer, M., Seurinck, J., Deboeck, F., De Greve, H., Lemmers, M., Van Montagu, M., Schell, J. (1984). The complete nucleotide sequence of the TL-DNA of the Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiAch5. The EMBO Journal, 3, 835-846.

Hartley J., Temple G., Brasch M. (2000). DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research, 10, 1788-1795.

Lorberth R1 Ritte G, Willmitzer L, Kossmann J (1998). Inhibition of a amido-granule- bound protein leads to modified amido and repression of cold sweetening. Nature Biotechnology 16, 473-477.

Mc日roy’D.’ Zhang1W., Cao1J., Wu，R. (1990).

Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation.

Plant Cell 2 (2), 163-171._

Rhone Poulenc Agro EP0337899 B1 “

Thompson, C.J., Rao Movva, N” Tizard, R., Crameri, R., Davies, J., Lauwereys, M., Bottermann, J. (1987). Characterization of the herbicide resistance gene bar from

Streptomyces hygroscopicus. EMBO J., 6, 2519-2523._

Wohlleben W, Arnold W, Bissonnette L1 Pelletier A, Tanguay A, Roy PH, Gamboa GC, Barry GF, Aubert E, Davies J, (1989). On the evolution of Tn21-like multiresis- tance transposons: sequence analysis of the gene (aacC1) for gentamicin acetyl- transferase-3-l(AAC(3)-l), another member of the Tn21-based expression cassette.

Mol Gen Genet. 217(2-3), 202-208._

Zambryski P. (1988). Basic processes underlying Agrobacterium-mediated DNA transfer to plant cells. Ann. Rev. Genet. 22: 1-30. _

Tabela 9: referencias citadas na tabela 8. 11. Produgao e identificagao de plantas de milho que possuem uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma glucano-agua di- quinase

As plantas de Zea mays (variedade A188) foram transformadas com ο plasmideo pHN3 de acordo com ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 5. As plantas obtidas receberam ο nome HN3-X, em que X re- presenta plantas independentes produzidas partindo da transformagao.

As plantas que se originam da transformagao com ο plasm ideo pHN3 (plantas TO) foram cultivadas na estufa e polinizadas com polen de plantas do tipo selvagem (variedade A188). As plantas da geragao T1 resul- tante foram cultivadas na estufa e borrifadas no estagio de tres folhas com uma solugao contendo 0,5% de Basta®. Apenas os grupos de plantas T1 dos quais ca. 25% das 30 plantas cultivadas em cada caso morreram apos a as- persao com a solugao de Basta® foram acompanhadas adicionalmente, por- que estas plantas sao aquelas para as quais a integragao do T-DNA relacio- nado do plasm ideo pHN3 esta presente em um Cinico locus no genoma. O DNA genomico foi isolado do material foliar de ca. 75% das plantas que so- fa revive ram a aspersao com a solugao de Basta® e verificado em cada caso em reIagao ao niimero de copias presentes em cada caso atraves da tecno- Iogia Invader® (Pielberg e outros 2003，Genome Res.;13, 2171-2177). As plantas T1 dentro de um grupo de prole de uma planta TO que exibia um s卜 nal aproximadamente duas vezes mais forte que ο da prole restante da mesma planta TO em uma analise atraves da tecnologia Invader® sao homo- zigotas em relagao ao I0cus em que ο T-DNA do plasm ideo esta integrado. Se aproximadamente 30% da prole de uma planta TO que sobreviveram ao tratamento com a solugao de Basta® exibirem um sinal aproximadamente duas vezes mais forte na analise atraves da tecnologia Invader, em compa- ragao com ca. 70% restantes da prole da mesma planta TO, entao isto e uma indicagao adicional de que a integragao do T-DNA ocorre em um unico Io- cus.

O conteudo de amido fosfato foi determinado de acordo com ο

metodo descrito sob os metodos gerais, item 2a) no amido isolado de graos colhidos de plantas selecionados como descrito anteriormente. O amido, isolado da Iinhagem HN3-101 tinha um conteijdo de amido fosfato na posi- gao C6 de 4,6 nmols por mg amido.

12. Produgao e identificagao de plantas de milho que possuem uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il e uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma gluca- no-agua diquinase

Varias Iinhagens independentes (JH77-X) que exibem graus di- ferentes no aumento na atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il foram utilizadas para ο cruzamento com plantas da Ii- nhagem HN3-101, que era homozigota em relagao a integragao do T-DNA do plasmideo pHN3. As plantas denominadas HN3-101 foram utilizadas co- mo doadoras de polen (parceiro de cruzamento do sexo masculino) e as plantas das Iinhagens JH77-X foram utilizadas como ο parceiro de cruza- mento do sexo feminio. As plantas F1 que se originam destes cruzamentos foram cultivadas na estufa, ο DNA foi extraido das folhas. Varias plantas F1 que carregavam ambos os transgenes podiam ser selecionadas com ο auxi- Iio da PCR. Varias plantas F2 de cada uma destas plantas foram cultivadas na estufa e ο DNA genomico foi isolado do material foliar e verificado em cada caso em relagao ao nCimero de copias presentes para ambos os trans- genes atraves da tecnologia Invader® (Pielberg e outros 2003, Genome Res.;13, 2171-2177). As plantas F2 dentro de um grupo de prole de uma planta F1 que exibia um sinal aproximadamente duas vezes mais forte que ο da prole remanescente da mesma planta F1 em uma analise atraves da tec- nologia Invader® devem ser observadas como sendo homozigotas em rela- gao aos respectivos loci em que os T-DNAs de ambos os plasmideos estao

integrados. A tabela a seguir mostra a origem das plantas que foram sele-

cionadas como descrito anteriormente:

Parceiro de cruzamento do sexo masculino Parceiro de cruzamento do sexo feminino Nome designado da plan- ts F2 selecionada HN3-101 JH77-01903 Cruzamento-13 HN3-101 JH77-02101 Cruzamento-49

Tabela 10: origem das plantas que foram obtidas apos ο cruzamento de plantas das Iinhagens HN3-101 e JH77-X.

13. Analise do amido de plantas que possuem uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il e uma alfa-glucano- agua diquinase

As espigas maduras das plantas denominadas Cruzamento-13 e Cruzamento-49 foram colhidas, adicionalmente secas como descrito sob os metodos gerais, item 11. O amido foi extraido dos graos como descrito sob os metodos gerais, item 12. O conteiido de amido fosfato nestes amidos foi analisado de acordo com ο metodo descrito sob os metodos gerais, item 2a) e ο poder de intumescimento em agua quente foi analisado como descrito sob os metodos gerais, item 1. Foram obtidos os resultados a seguir:

Nome da planta nmol de fosfato em C6 por mg de amido Poder de intumescimento do amido [g/g] A188-105 0,34 28,2 A188-114 0,13 30,8 JH77-01903 0,16 22,0 JH77-02101 0,16 22,2 HN3-101 4,70 42,3 Cross-13 6,49 48,6 Cross-49 5,97 47,4

Tabela 11: conteiido de amido fosfato e poder de intumescimento de amido isolado de plantas que possuem uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma amido sintase Il (JH77-01903, JH77-02101), uma maior atividade de uma proteina que possui a atividade de uma alfa-glucano- agua diquinase (HN3-101) ou de plantas que possuem uma maior atividade de ambas as proteinas (Cruzamento-13, Cruzamento-49) em comparagao com as plantas do tipo selvagem (A188-105, A188-114). LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> Bayer CropScience AG

<120> PLANTAS modificadas geneticamente QUE SINTETIZAM UM AMIDO QUE POS SUI MAIOR PODER DE INTUMESCIMENTO

<130> BCS 06-5009 PCT

<150> EP06090134.5

<151> 2006-08-09

<150> US60/836,817

<151> 2006-08-10

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> X

<211> 4851

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> Peptideo de transito

<222> (1)..(77)

<220>

<221> CDS

<222> (105)..(4499)

<300>

<308> EMBL / Y09533

<309> 1998-07-30

<313> (1)..(4499)

<400> 1

catcttcatc gaatttctcg aagcttcttc gctaatttcc tggtttcttc actcaaaatc 60

gacgtttcta gctgaacttg agtgaattaa gccagtggga ggat atg agt aat tcc 116

Met Ser Asn Ser

tta ggg aat aac ttg ctg tac cag gga ttc cta acc tea aca gtg ttg 164

Leu Gly Asn Asn Leu Leu Tyr Gln Gly Phe Leu Thr Ser Thr Val Leu

10 15 20

gaa cat aaa agt aga ate agt cct cct tgt gtt gga ggc aat tct ttg 212

Glu His Lys Ser Arg lie Ser Pro Pro Cys Val Gly Gly Asn Ser Leu 30 35

ttt caa caa caa gtg ate tcg aaa tea cct tta tea act gag ttt cga 260

Phe Gln Gln Gln Val lie Ser Lys Ser Pro Leu Ser Thr Glu Phe Arg 40 45 50

ggt aac agg tta aag gtg cag aaa aag aaa ata cct atg gaa aag aag 308

Gly Asn Arg Leu Lys Val Gln Lys Lys Lys lie Pro Met Glu Lys Lys 55 60 65

cgt get ttt tct agt tct cct cat get gta ctt acc act gat acc tct 356

Arg Ala Phe Ser Ser Ser Pro His Ala Val Leu Thr Thr Asp Thr Ser

70 75 80 gtt Val

tct Ser

gtt Val

cct Pro

g υ O a 1 2

gG 2

gag Glu

ctt Leu

gta

Val

cag

Gln

ate lie 225

caa Gln

tea tat

Ser Tyr

788

ggc cca Gly Pro

cca gat ggg 548

Pro Asp Gly

aaa Lys

ttc

Phe

gy 5 9 13 gG 1

aaa Lys

gaa

Glu

aca

Thr

tgg Trp

tct Ser 140

ctt Leu

ccg Pro

aat Asn

ttg agg tgg gag agg aag gga aaa cag aat tac ccc cct gag aaa gag 836

Leu Arg Trp Glu Arg Lys Gly Lys Gln Asn Tyr Pro Pro Glu Lys Glu

230 235 240

aag gag gaa tat gag get get cga act gtg cta cag gag gaa ata get 884

Lys Glu Glu Tyr Glu Ala Ala Arg Thr Val Leu Gln Glu Glu lie Ala 245 250 255 260

cgt ggt get tcc ata cag gac att cga gca agg cta aca aaa act aat 932

Arg Gly Ala Ser lie Gln Asp Xle Arg Ala Arg Leu Thr Lys Thr Asn 265 270 275

gat aaa agt caa age aaa gaa gag cct ctt cat gta aca aag agt gat 980

Asp Lys Ser Gln Ser Lys Glu Glu Pro Leu His Val Thr Lys Ser Asp 280 285 290

ata cct gat gac ctt gcc caa gca caa get tac att agg tgg gag aaa 1028

lie Pro Asp Asp Leu Ala Gln Ala Gln Ala Tyr lie Arg Trp Glu Lys 295 300 305

gca gga aag ccg aac tat cct cca gaa aag caa att gaa gaa ctc gaa 1076

Ala Gly Lys Pro Asn Tyr Pro Pro Glu Lys Gln lie Glu Glu Leu Glu

310 315 320

gaa gca aga aga gaa ttg caa ctt gag ctt gag aaa ggc att acc ctt 1124

Glu Ala Arg Arg Glu Leu Gln Leu Glu Leu Glu Lys Gly lie Thr Leu 325 330 335 340

gat gag ttg egg aaa acg att aca aaa ggg gag ata aaa act aag gtg 1172

acc Thr

aaa Lys

150

g 1 t a 9 V

tac Tyr

aag Lys

aac Asn

aaa

Lys 155

gca Ala

ctt Leu

aga Arg

act Thr

cca Pro 160

ttt Phe

gtt

Val

aaa tct Lys Ser

596

ggc Gly 165

tct Ser

aac Asn

tcc Ser

ate

lie

ctg Leu 170

aga Arg

ctg Leu

gag Glu

ata

lie

a 9 5 g工7 CAl

gac Asp

act

Thr

get

Ala

ate gaa

lie Glu 180

644

get Ala

att

lie

gag Glu

ttt

Phe

ctc Leu

185

ata

lie

tac Tyr

gat Asp

gaa

Glu

gcc Ala 190

cac

His

gat Asp

aaa Lys

tgg Trp

ata aag

lie Lys 195

692

aat Asn

ggt Gly

ggt Gly 200

aat Asn

ttt

Phe

cgt Arg

gtc

Val

aaa Lys 205

ttg Leu

tea Ser

aga Arg

aaa Lys

guo all g G 2

ata cga lie Arg

740

tct Ser 85

gag Glu

cta Leu

gca Ala

gaa

Glu

aag

Lys 90

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agt

Ser

cta Leu

ggg

Gly

ggg

Gly 95

aat att Asn lie

gag Glu

cta cag

Leu Gln 100

404

gtt Val

gat Asp

gtt Val

agg Arg

cct Pro

105

CCC

Pro

act Thr

tea Ser

ggt Gly

gat Asp 110

gtg Val

tcc ttt Ser Phe

g 1 t a gV

t e t h tP

t P 5 a S 1 gA 1

452

caa

Gln

gta

Val

aca Thr

aat Asn 120

ggt Gly

agt Ser

gat

Asp

aaa Lys

ctg Leu 125

ttt Phe

ttg Leu

cac His

tgg Trp

ggg

Gly 130

gca gta

Ala Val

500

gat

Asp 215 ggg gag Gly Glu

cta Leu

ctg Leu'

gta ctg Val Leu 435

1412

cta aat aaa aag ate ttt Leu Asn Lys Lys lie Phe 425

gta gca

Val Ala

aag Lys

tcc Ser 440

tct Ser

ggg

Gly

aag Lys

aca

Thr

aaa Lys

445

gta

Val

cat His

cta Leu

get

Ala

aca Thr 450

gat ctg Asp Leu

1460

aat cag Asn Gln

cca

Pro 455

att

lie

act Thr

ctt Leu

cac

His

tgg Trp 460

gca

Ala

tta Leu

tcc Ser

aaa Lys

agt

Ser 465

cct Pro

gga gag

Gly Glu

1508

tgg atg Trp Met 470

gta

Val

cca Pro

cct Pro

tea Ser

age

Ser 475

ata

lie

ttg Leu

cct Pro

ggg

Gly 480

tea Ser

att

lie

att tta lie Leu

1556

gac aag

Asp Lys 485

get

Ala

gcc

Ala

gaa

Glu

aca Thr 490

cct Pro

ttt

Phe

tea Ser

gcc Ala

agt

Ser 495

tct Ser

gat Asp

ggt cta

Gly Leu 500

1604

act tct Thr Ser

aag Lys

gta

Val

caa

Gln 505

tct Ser

ttg Leu

gat Asp

ata

lie

a 1 O t a 1 gv 5

att lie

gaa

Glu

gat Asp

ggc

Gly

aat ttt

Asn Phe 515

1652

gY 9 1 gG

g1 t a gV

atg Met

cca Pro 520

ttt Phe

gtt Val

ctt Leu

ttg Leu

tct Ser 525

ggt Gly

gaa

Glu

aaa Lys

tgg Trp

att lie 530

aag aac Lys Asn

1700

caa ggg

Gln Gly

tcg

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gat Asp

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tat

Tyr

gtt Val

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ttc Phe

agt Ser

get Ala

gca Ala

tcc Ser 545

aaa Lys

tta gca Leu Ala

1748

ctc aag Leu Lys 550

get Ala

get

Ala

ggg

Gly

gat Asp

ggc Gly 555

agt

Ser

gga Gly

act Thr

gca Ala

aag

Lys 560

tct Ser

tta Leu

ctg gat Leu Asp

1796

aaa ata

Lys 工Ie 565

gca Ala

gat Asp

atg Met

gaa

Glu 570

agt Ser

gag Glu

get Ala

cag Gln

aag Lys 575

tea Ser

ttt Phe

atg Met

cac egg

His Arg 580

1844

ttt aat Phe Asn

att lie

gca Ala

get Ala 585

gac Asp

ttg Leu

ata lie

gaa

Glu

gat

Asp 590

gcc Ala

act Thr

agt Ser

get Ala

ggt gaa Gly Glu 595

1892

ctt ggt ttt get gga att ctt gta tgg atg agg ttc atg get aca agg

1940

90

Asp Glu Leu Arg Lys Thr lie Thr Lys Gly Glu lie Lys Thr Lys Val 345 350 355

gaa aag cac ctg aaa aga agt tct ttt gcc gtt gaa aga ate caa aga 1220

Glu Lys His Leu Lys Arg Ser Ser Phe Ala Val Glu Arg lie Gln Arg 360 365 370

aag aag aga gac ttt ggg cat ctt att aat aag tat act tcc agt cct 1268

Lys Lys Arg Asp Phe Gly His Leu lie Asn Lys Tyr Thr Ser Ser Pro 375 380 385

gca gta caa gta caa aag gtc ttg gaa gaa cca cca gcc tta tct aaa 1316

Ala Val Gln Val Gln Lys Val Leu Glu Glu Pro Pro Ala Leu Ser Lys 390 395 400

att aag ctg tat gcc aag gag aag gag gag cag att gat gat ccg ate 13 64

lie Lys Leu Tyr Ala Lys Glu Lys Glu Glu Gln lie Asp Asp Pro 工Ie 405 410 415 420 Met Arg Phe Met Ala Thr Arg 610

Leu Gly Phe

Ala

600

Gly lie Leu Val

caa Gln

ctg Leu

ata lie 615

tgg Trp

aac Asn

aaa Lys

aac Asn

tat Tyr 620

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Glu

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1988

aag Lys

t a O C 1 3 g A 6

cag

Gln

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Leu

aca

Thr 635

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cag

Gln

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Asn 640

get

Ala

ttc

Phe

acc Thr

agt Ser

2036

cac His 645

cct Pro

cag Gln

tac Tyr

cgt Arg

gaa

Glu 650

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ttg Leu

egg Arg

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att lie 655

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tea Ser

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gtt Val

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2084

cgt Arg

gga

Gly

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Glu

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gat

Asp

gta

Val

a y g 1 gG

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Gln

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670

att

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agg Arg

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Glu

att

lie 675

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2132

gtc

Val

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680

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gac Asp

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Met

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2180

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Gln

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cat

His

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Asp

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2228

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Gln

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2276

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tea Ser

775

ggt Gly

gca Ala

gat Asp

ctt Leu

g U O

a 1 8 g G 7

tct Ser

get Ala

att

工Ie

gca

Ala

aac

Asn 785

tgc

Cys

atg

Met

ggc Gly

2468

tac Tyr

aaa

Lys 790

act Thr

gag Glu

gga

Gly

gaa

Glu

ggc

Gly 795

ttt

Phe

atg Met

gtt Val

gga

Gly

gtc Val 800

cag Gln

ata lie

aat Asn

cct Pro

2516

a 1 5 t a O g V 8

tea Ser

ggc ttg

Gly Leu

cca Pro

tct Ser 810

ggc

Gly

ttt Phe

cag Gln

gac Asp

CtC

Leu 815

CtC

Leu

cat

His

ttt

Phe

gtc

Val

tta Leu 820

2564

gac

Asp

cat His

gtg gaa Val Glu

gat

Asp 825

aaa Lys

aat Asn

9 1 t a gV

gaa

Glu

act Thr

830

ctt Leu

gag Glu

aga Arg

ttg Leu 835

cta Leu

2612

gag Glu

get Ala

cgt gag Arg Glu 840

gag Glu

ctt Leu

agg Arg

ccc Pro

ttg Leu 845

ctt Leu

ctc Leu

aaa Lys

cca Pro

aac

Asn 850

aac Asn

cgt Arg

2660

cta aag gat ctg ctg ttt ttg gac ata gca ctt gat tct aca gtt aga

2708

P 5 r O T 6 gac aac cat tgg get tta ttt gca 2900

Asp Asn His Trp Ala Leu Phe Ala 925 930

ctt gca ctt gca age aag gca gag 2948

Leu Ala Leu Ala Ser Lys Ala Glu 945

get Ala

aaa

Lys

ctt Leu

get Ala

tea Ser

g 1 5 t a 3 gv 9

atg

Met 920

ctt Leu

tcc Ser

gac Asp

aat Asn

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ggt

Gly

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ggg

Gly

tgg Trp

tac Tyr

950

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tta Leu

ttg Leu

cag Gln 955

cca Pro

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gcc

Ala

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Glu

tat Tyr 960

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gga

Gly

tea Ser

ata lie

2996

ctt

Leu 965

ggg

Gly

gtg Val

gac Asp

caa

Gln

tgg Trp 970

get

Ala

ttg Leu

aac Asn

ata

lie

ttt Phe 975

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gaa

Glu

gaa Glu

att

lie

ata

lie 980

3044

cgt Arg

get Ala

gga

Gly

tea Ser

a a 5

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g A 9

get Ala

tea Ser

tta Leu

tcc Ser

tct Ser 990

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aat Asn

aga Arg

ctc Leu 995

gat Asp

3092

ccc Pro

gtg Val

ctt Leu

egg Arg 1000

aaa

Lys

act Thr

gca Ala

aat Asn

cta Leu

1005

gga

Gly

agt Ser

tgg Trp

cag Gln

att

lie 1010

ate lie

3137

agt Ser

cca Pro

gtt Val

gaa Glu 1015

gcc Ala

gtt Val

gga

Gly

tat

Tyr

gtt Val 1020

gtc

Val

gtt Val

9 1 t a gV

gat Asp

gag

Glu 1025

ttg Leu

3182

ctt Leu

tea Ser

gtt Val

cag Gln 1030

aat Asn

gaa

Glu

ate lie

tac Tyr

gag

Glu 1035

aag Lys

ccc Pro

acg Thr

ate

lie

tta Leu 1040

gta

Val

3227

gca

Ala

aaa

Lys

tct Ser

gtt Val 1045

aaa

Lys

gga

Gly

gag Glu

gaa

Glu 1050

att lie

cct Pro

gat Asp

ggt Gly

get

Ala 1055

gtt Val

3272

gcc Ala

ctg Leu

ata

lie

aca Thr 1060

cca Pro

gac

Asp

atg

Met

cca Pro

gat Asp 1065

gtt Val

ctt Leu

tea Ser

cat

His

gtt Val 1070

tct Ser

3317

gtt Val

cga Arg

get

Ala

aga Arg

1075

aat Asn

ggg

Gly

aag Lys

gtt Val

tgc

Cys 1080

ttt Phe

get Ala

aca Thr

tgc

Cys

ttt Phe 1085

gat Asp

3362

CCC

Pro

aat Asn

ata

lie

ttg Leu

1090

get Ala

gac Asp

ctc Leu

caa

Gln

gca Ala 1095

aag Lys

gaa Glu

gga

Gly

agg Arg

att

工Ie 1100

ttg Leu

3407

ctc tta aag cct aca cct tea gac ata ate tat agt gag gtg aat

3452

Leu Lys Asp Leu Leu Phe Leu Asp lie Ala Leu Asp Ser Thr Val Arg

855 860 865

aca Thr

gca Ala 870

gta

Val

gaa

Glu

agg Arg

gga Gly

tat

Tyr 875

gaa

Glu

gaa Glu

ttg Leu

aac Asn

aac Asn 880

get Ala

aat Asn

cct Pro

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2756

aaa

Lys 885

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lie

atg Met

tac

Tyr

ttc

Phe

ate

lie 890

tcc Ser

ctc Leu

gtt Val

ctt Leu

gaa

Glu 895

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ctc Leu

gca

Ala

ctc Leu

tct

Ser 900

2804

g 1 t a g V

gac Asp

gat Asp

aat Asn

gaa Glu 905

gat Asp

ctt Leu

gtt Val

tat Tyr

tgc Cys 910

ttg Leu

aag Lys

gga

Gly

tgg Trp

aat Asn 915

caa Gln

2852 Leu Leu Lys Pro Thr Pro Ser Asp lie lie Tyr Ser Glu Val Asn 1105 1110 1115

gag att gag ctc

Glu 工Ie Glu Leu 1120

caa agt tea agt aac ttg gta gaa get gaa act

Gln Ser Ser Ser Asn Leu Val Glu Ala Glu Thr 1125 1130

3497

tea gca aca ctt

Ser Ala Thr Leu 1135

aga ttg gtg aaa aag

Arg Leu Val Lys Lys 1140

caa ttt ggt ggt tgt tac

Gln Phe Gly Gly Cys Tyr 1145

3542

gca ata tea gca Ala lie Ser Ala 1150

gat gaa ttc aca agt gaa atg Asp Glu Phe Thr Ser Glu Met 1155

gtt gga get aaa Val Gly Ala Lys 1160

3587

tea cgt aat att

Ser Arg Asn lie 1165

gca tat ctg aaa gga aaa gtg cct tcc tcg gtg

Ala Tyr Leu Lys Gly Lys Val Pro Ser Ser Val 1170 1175

3632

gga att cct acg Gly lie Pro Thr 1180

tea gta get ctt cca Ser Val Ala Leu Pro 1185

ttt gga gtc ttt

Phe Gly Val Phe

gag aaa

Glu Lys 1190

3677

gta ctt tea gac

Val Leu Ser Asp 1195

gac ata aat cag gga gtg gca aaa gag ttg caa

Asp lie Asn Gln Gly Val Ala Lys Glu Leu Gln 1200 1205

3722

att ctg atg aaa

lie Leu Met Lys 1210

aaa cta tct gaa gga gac ttc age get ctt ggt

Lys Leu Ser Glu Gly Asp Phe Ser Ala Leu Gly 1215 1220

3767

gaa att cgc aca

Glu lie Arg Thr 1225

acg gtt tta gat ctt tea gca cca get caa ttg

Thr Val Leu Asp Leu Ser Ala Pro Ala Gln Leu 1230 1235

3812

gtc aaa gag ctg

Val Lys Glu Leu 1240

aag gag aag atg cag

Lys Glu Lys Met Gln 1245

ggt tct ggc atg

Gly Ser Gly Met

cct tgg Pro Trp 1250

3857

cct ggt gat gaa

Pro Gly Asp Glu 1255

ggt cca aag egg tgg gaa caa

Gly Pro Lys Arg Trp Glu Gln 1260

gca tgg atg gcc Ala Trp Met Ala 1265

3902

ata aaa aag gtg

工Ie Lys Lys Val 1270

tgg get tea aaa tgg aat gag aga gca tac ttc Trp Ala Ser Lys Trp Asn Glu Arg Ala Tyr Phe 1275 1280

3947

age aca agg aag Ser Thr Arg Lys 1285

gtg aaa ctg gat cat gac tat ctg tgc atg get Val Lys Leu Asp His Asp Tyr Leu Cys Met Ala 1290 1295

3992

gtc ctt gtt caa Val Leu Val Gln 1300

gaa ata ata aat get gat tat gca ttt gtc att

Glu lie lie Asn Ala Asp Tyr Ala Phe Val lie 1305 1310

4037

cac aca acc aac His Thr Thr Asn 1315

cca tct tcc gga gac gac tea gaa ata tat gcc

Pro Ser Ser Gly Asp Asp Ser Glu lie Tyr Ala 1320 1325

4082

gag gtg gtc agg Glu Val Val Arg 1330

ggc ctt ggg gaa aca

Gly Leu Gly Glu Thr 1335

ctt gtt gga get Leu Val Gly Ala

tat cca Tyr Pro 1340

4127

gga cgt get ttg agt ttt ate tgc aag aaa aag gat ctc aac tct

4172 Gly Arg Ala Leu Ser Phe lie Cys Lys Lys Lys Asp Leu Asn Ser 1345 1350 1355

cct caa

Pro Gln

g 1 t a g V

tta Leu 1360

t y g1 g G

tac Tyr

cca Pro

age Ser

aaa

Lys 1365

ccg ate ggc ctt Pro lie Gly Leu

ttc

Phe 1370

ata

lie

4217

aaa aga Lys Arg

tct Ser

ate

lie 1375

ate

lie

ttc

Phe

cga Arg

tct

Ser

gat

Asp 1380

tcc aat ggg gaa

Ser Asn Gly Glu

gat

Asp 1385

ttg Leu

4262

gaa ggt Glu Gly

tat

Tyr

gcc Ala 1390

t y 9 1 gG

get Ala

ggc Gly

CtC Leu

tac Tyr 1395

gac agt gta cca Asp Ser Val Pro

atg Met 1400

gat Asp

4307

gag gag Glu Glu

gaa

Glu

aaa

Lys 1405

gtt

Val

gta

Val

att

lie

gat Asp

tac Tyr 1410

tct tcc gac cca Ser Ser Asp Pro

ttg Leu 1415

ata lie

4352

act gat

Thr Asp

ggt Gly

aac

Asn 1420

ttc Phe

cgc Arg

cag

Gln

aca

Thr

ate

lie 1425

ctg tcc aac att Leu Ser Asn lie

get Ala 1430

cgt Arg

43 97

get gga Ala Gly

cat His

get

Ala 1435

ate

lie

gag Glu

cta Leu

tat

Tyr 1440

ggc tct cct caa

Gly Ser Pro Gln

gac Asp 1445

att

lie

4442

gag ggt Glu Gly

gta

Val

gtg Val 1450

agg Arg

gat Asp

gga

Gly

aag Lys

att

lie 1455

tat gtc gtt cag

Tyr Val Val Gln

aca Thr 1460

aga Arg

4487

cca cag atg tga ttatattctc gttgtatgtt gttcagagaa gaccacagat Pro Gln Met

4539

gtgatcatat acctgtatga gagaagtgag aattagctgg acacgcatta ttgggtggtt

tctcattgta ttatacgtga aagtaggaat gtatgatata tgtattgcat tc

tcagatctgt gaccacttac ctgatacctc

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tgcaatatga ggaataataa gaaaaacttt

gggagaaatg tgtaaacatt gtactatata

tatgcactga ataatatcgc agcatcaaag

ccatgaagtt 4599 gctattggag 4659 gtaaaagcta 4719 tagtatatac 4779 aagaaatcct 4839 4851

<210> 2

<211> 1464

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400>

2

Met Ser Asn Ser Leu Gly Asn Asn Leu Leu Tyr Gln Gly Phe Leu Thr 10 15

Ser Thr Val Leu Glu His Lys Ser Arg lie Ser Pro Pro Cys Val Gly 25 30

Gly Asn Ser Leu Phe Gln Gln Gln Val lie Ser Lys Ser Pro Leu Ser 40 45 Glu Lys Ala Gly Lys Pro Asn Tyr Pro Pro Glu Lys Gln lie 310 315 320

Thr Glu Phe Arg Gly Asn Arg Leu Lys Val Gln Lys Lys Lys lie Pro

50

55 60

Met Glu Lys Lys Arg Ala Phe Ser Ser Ser Pro His Ala Val Leu Thr

65

70 75 80

Thr Asp Thr Ser Ser Glu Leu Ala Glu Lys Phe Ser Leu Gly Gly Asn 85 90 95

lie Glu Leu Gln Val Asp Val Arg Pro Pro Thr Ser Gly Asp Val Ser 100 105 110

Phe Val Asp Phe Gln Val Thr Asn Gly Ser Asp Lys Leu Phe Leu His

115

120 125

Trp Gly Ala Val Lys Phe Gly Lys Glu Thr Trp Ser Leu Pro Asn Asp

130

135 140

Arg Pro Asp Gly Thr Lys Val Tyr Lys Asn Lys Ala Leu Arg Thr Pro

145

150 155 160

Phe Val Lys Ser Gly Ser Asn Ser lie Leu Arg Leu Glu lie Arg Asp

165 170 175

Thr Ala lie Glu Ala lie Glu Phe Leu lie Tyr Asp Glu Ala His Asp

180 185 190

Lys Trp 工Ie Lys Asn Asn Gly Gly Asn Phe Arg Val Lys Leu Ser Arg

195

200 205

Lys Glu lie Arg Gly Pro Asp Val Ser Val Pro Glu Glu Leu Val Gln

210

215 220

lie Gln Ser Tyr Leu Arg Trp Glu Arg Lys Gly Lys Gln Asn Tyr Pro

225

230 235 240

Pro Glu Lys Glu Lys Glu Glu Tyr Glu Ala Ala Arg Thr Val Leu Gln

245 250 255

Glu Glu lie Ala Arg Gly Ala Ser lie Gln Asp lie Arg Ala Arg Leu 260 265 270

Thr Lys Thr Asn Asp Lys Ser Gln Ser Lys Glu Glu Pro Leu His Val

275

280 285

Thr Lys Ser Asp lie Pro Asp Asp Leu Ala Gln Ala Gln Ala Tyr lie

290

295 300 Phe Asn lie Ala Ala Asp Leu lie Glu Asp 585 590

Ala Thr

Phe Met His

Glu Glu Leu Glu Glu Ala Arg Arg Glu Leu Gln Leu Glu Leu Glu Lys

325

330 335

Gly lie Thr Leu Asp Glu Leu Arg Lys Thr lie Thr Lys Gly Glu lie

340

345 350

Lys Thr Lys Val Glu Lys His Leu Lys Arg Ser Ser Phe Ala Val Glu

355

360

365

Arg lie Gln Arg Lys Lys Arg Asp Phe Gly His Leu lie Asn Lys Tyr

370 375

380

Thr Ser Ser Pro Ala Val Gln Val Gln Lys Val Leu Glu Glu Pro Pro

385 390

395

400

Ala Leu Ser Lys 工Ie Lys Leu Tyr Ala Lys Glu Lys Glu Glu Gln lie

405

410

415

Asp Asp Pro lie Leu Asn Lys Lys lie Phe Lys Val Asp Asp Gly Glu

420

425

430

Leu Leu Val Leu Val Ala Lys Ser Ser Gly Lys Thr Lys Val His Leu

435

440

445

Ala Thr Asp Leu Asn Gln Pro lie Thr Leu His Trp Ala Leu Ser Lys

450 455

460

Ser Pro Gly Glu Trp Met Val Pro Pro Ser Ser lie Leu Pro Pro Gly

465 470

475

480

Ser lie lie Leu Asp Lys Ala Ala Glu Thr Pro Phe Ser Ala Ser Ser

485 490

495

Ser Asp Gly Leu Thr Ser Lys Val Gln Ser Leu Asp lie Val lie Glu 500 505 510

Asp Gly Asn Phe Val Gly Met Pro Phe Val Leu Leu Ser Gly Glu Lys 515 520 525

Trp lie Lys Asn Gln Gly Ser Asp Phe Tyr Val Gly Phe Ser Ala Ala 530 535 540

Ser Lys Leu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Asp Gly Ser Gly Thr Ala Lys 545 550 555 560

Ser Leu Leu Asp Lys lie Ala Asp Met Glu Ser Glu Ala Gln Lys Ser

565 570

575 Leu Leu

Phe Leu Asp 860

工Ie Ala Leu Asp

Leu Gly Val

Pro Asn Asn Arg Leu 850

Lys Asn Val Glu Thr Leu Leu 830

His Phe Val Leu Asp 820

Lys Thr Leu Asn

Glu Asn Gly lie Thr Lys Glu 730 735

Glu Arg Leu Leu Glu Ala Arg Glu Glu 835 840

Leu Arg Pro

Leu Leu Leu Lys 845

Arg Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Ala lie His Ser Glu Pro Asn Phe Arg

740 745

750

Gly Asp Gln Lys Gly Gly Leu Leu Arg Asp Leu Gly His Tyr Met Arg 755 760 765

Thr Leu Lys Ala Val His Ser Gly Ala Asp Leu Glu Ser Ala lie Ala 770 775 780

Asn Cys Met Gly Tyr Lys Thr Glu Gly Glu Gly Phe Met Val Gly Val

785 790

795

800

Gln lie Asn Pro Val Ser Gly Leu Pro Ser Gly Phe Gln Asp Leu Leu

805

810

815

Ser Ala Gly Glu Leu Gly Phe Ala Gly lie Leu Val Trp Met Arg Phe

595

600

605

Met Ala Thr Arg Gln Leu 工Ie Trp Asn Lys Asn Tyr Asn Val Lys Pro

610

615

620

Arg Glu lie Ser Lys Ala Gln Asp Arg Leu Thr Asp Leu Leu Gln Asn

625

630

635

640

Ala Phe Thr Ser His Pro Gln Tyr Arg Glu lie Leu Arg Met lie Met

645 650

655

Ser Thr Val Gly Arg Gly Gly Glu Gly Asp Val Gly Gln Arg 工 Ie Arg 660 665 670

Asp Glu lie Leu Val lie Gln Arg Asn Asn Asp Cys Lys Gly Gly Met 675 680 685

Met Gln Glu Trp His Gln Lys Leu His Asn Asn Thr Ser Pro Asp Asp 690 695 700

Val Val 工Ie Cys Gln Ala Leu lie Asp Tyr lie Lys Ser Asp Phe Asp 705 710 715 720

His Val Glu Asp Ser Thr Val Arg Thr Ala Val Glu Arg Gly Tyr Glu Glu Leu Asn Asn 865 870 875 880

Ala Asn Pro Glu Lys Ile Met Tyr Phe Ile Ser Leu Val Leu Glu Asn 885 890 895

Leu Ala Leu Ser Val Asp Asp Asn Glu Asp Leu Val Tyr Cys Leu Lys 900 905 910

Gly Trp Asn Gln Ala Leu Ser Met Ser Asn Gly Gly Asp Asn His Trp 915 920 925

Ala Leu Phe Ala Lys Ala Val Leu Asp Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ala 930 935 940

Ser Lys Ala Glu Trp Tyr His His Leu Leu Gln Pro Ser Ala Glu Tyr 945 950 955 960

Leu Gly Ser Ile Leu Gly Val Asp Gln Trp Ala Leu Asn Ile Phe Thr 965 970 975

Glu Glu Ile Ile Arg Ala Gly Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu Leu 980 985 990

Asn Arg Leu Asp Pro Val Leu Arg Lys Thr Ala Asn Leu Gly Ser Trp 995 1000 1005

Gln Ile Ile Ser Pro Val Glu Ala Val Gly Tyr Val Val Val Val 1010 1015 1020

Asp Glu Leu Leu Ser Val Gln Asn Glu Ile Tyr Glu Lys Pro Thr 1025 1030 1035

Ile Leu Val Ala Lys Ser Val Lys Gly Glu Glu Glu Ile Pro Asp 1040 1045 1050

Gly Ala Val Ala Leu Ile Thr Pro Asp Met Pro Asp Val Leu Ser 1055 1060 1065

His Val Ser Val Arg Ala Arg Asn Gly Lys Val Cys Phe Ala Thr 1070 1075 1080

Cys Phe Asp Pro Asn Ile Leu Ala Asp Leu Gln Ala Lys Glu Gly 1085 1090 1095

Arg Ile Leu Leu Leu Lys Pro Thr Pro Ser Asp Ile Ile Tyr Ser 1100 1105 1110

Glu Val Asn Glu Ile Glu Leu Gln Ser Ser Ser Asn Leu Val Glu 1115 1120 1125 Ala Glu Thr Ser Ala Thr Leu Arg Leu Val Lys Lys Gln Phe Gly 1130 1135 1140

Gly Cys Tyr Ala Ile Ser Ala Asp Glu Phe Thr Ser Glu Met Val 1145 1150 1155

Gly Ala Lys Ser Arg Asn Ile Ala Tyr Leu Lys Gly Lys Val Pro 1160 1165 1170

Ser Ser Val Gly Ile Pro Thr Ser Val Ala Leu Pro Phe Gly Val 1175 1180 1185

Phe Glu Lys Val Leu Ser Asp Asp Ile Asn Gln Gly Val Ala Lys 1190 1195 1200

Glu Leu Gln Ile Leu Met Lys Lys Leu Ser Glu Gly Asp Phe Ser 1205 1210 1215

Ala Leu Gly Glu Ile Arg Thr Thr Val Leu Asp Leu Ser Ala Pro 1220 1225 1230

Ala Gln Leu Val Lys Glu Leu Lys Glu Lys Met Gln Gly Ser Gly 1235 1240 1245

Met Pro Trp Pro Gly Asp Glu Gly Pro Lys Arg Trp Glu Gln Ala 1250 1255 1260

Trp Met Ala Ile Lys Lys Val Trp Ala Ser Lys Trp Asn Glu Arg 1265 1270 1275

Ala Tyr Phe Ser Thr Arg Lys Val Lys Leu Asp His Asp Tyr Leu 1280 1285 1290

Cys Met Ala Val Leu Val Gln Glu Ile Ile Asn Ala Asp Tyr Ala 1295 1300 1305

Phe Val Ile His Thr Thr Asn Pro Ser Ser Gly Asp Asp Ser Glu 1310 1315 1320

Ile Tyr Ala Glu Val Val Arg Gly Leu Gly Glu Thr Leu Val Gly 1325 1330 1335

Ala Tyr Pro Gly Arg Ala Leu Ser Phe Ile Cys Lys Lys Lys Asp 1340 1345 1350

Leu Asn Ser Pro Gln Val Leu Gly Tyr Pro Ser Lys Pro Ile Gly 1355 1360 1365

Leu Phe Ile Lys Arg Ser Ile Ile Phe Arg Ser Asp Ser Asn Gly 1370 1375 1380 Glu Asp Leu Glu Gly Tyr Ala Gly Ala Gly Leu Tyr Asp Ser Val 1385 1390 1395

Pro Met Asp Glu Glu Glu Lys Val Val Ile Asp Tyr Ser Ser Asp 1400 1405 1410

Pro Leu Ile Thr Asp Gly Asn Phe Arg Gln Thr Ile Leu Ser Asn 1415 1420 1425

Ile Ala Arg Ala Gly His Ala Ile Glu Glu Leu Tyr Gly Ser Pro 1430 1435 1440

Gln Asp Ile Glu Gly Val Val Arg Asp Gly Lys Ile Tyr Val Val 1445 1450 1455

Gln Thr Arg Pro Gln Met 1460

<210> 3

<211> 4443

<212> DNA

<213> Curcuma longa

<220>

<221> CDS <222> (1)..(4443)

<400> 3

atg aac aat tgt gtt gga cat acc tta cct cag caa gct ctg ttt cgg 48

Met Asn Asn Cys Val Gly His Thr Leu Pro Gln Gln Ala Leu Phe Arg 10 15

cct tct gtt gta gaa cgc cat aat aca gct tgc caa cgt tct tct gga 96

Pro Ser Val Val Glu Arg His Asn Thr Ala Cys Gln Arg Ser Ser Gly 25 30

aac att ttg tgc act gtt cca tca gca tca aag gca gaa gat gtg cca 144

Asn Ile Leu Cys Thr Val Pro Ser Ala Ser Lys Ala Glu Asp Val Pro 40 45

tct ctt aaa cct ttc ctt tca agt aga ttc ctg ggg aag act ccc tat 192

Ser Leu Lys Pro Phe Leu Ser Ser Arg Phe Leu Gly Lys Thr Pro Tyr 50 55 60

gca gga aaa gga aac cca tta aag aaa aat tta aga aca gtt acc atg 240

Ala Gly Lys Gly Asn Pro Leu Lys Lys Asn Leu Arg Thr Val Thr Met 65 70 75 80

age cct caa gct tta ttg gca gca gat cct gct tca gag ctt gct aga 288

Ser Pro Gln Ala Leu Leu Ala Ala Asp Pro Ala Ser Glu Leu Ala Arg 85 90 95

aaa ttc aag ctg gac acc aat tcc gaa ttg gag gtt act att tgt aag 336

Lys Phe Lys Leu Asp Thr Asn Ser Glu Leu Glu Val Thr Ile Cys Lys 100 105 110

ccc aca tct gag tct cct atg caa att gat ttt caa gta acc aat gtc 384

Pro Thr Ser Glu Ser Pro Met Gln Ile Asp Phe Gln Val Thr Asn Val 115 120 125 agt ggt tcc ttg gtg ctt cat tgg ggt gta att ctc caa aca aga aga 432

Ser Gly Ser Leu Val Leu His Trp Gly Val Ile Leu Gln Thr Arg Arg 130 135 140

gaa tgg tct ctt cct tct cat tat cct gaa gga aca aaa gta tac aaa 480

Glu Trp Ser Leu Pro Ser His Tyr Pro Glu Gly Thr Lys Val Tyr Lys 145 150 155 160

aat caa gct ctc aga act cct ttt act aaa gtt ggc tcg act tgt tca 528

Asn Gln Ala Leu Arg Thr Pro Phe Thr Lys Val Gly Ser Thr Cys Ser 165 170 175

ctg aga tta gag att gat gat cct gaa ata gaa ata gtt gag ttt ctt 576

Leu Arg Leu Glu Ile Asp Asp Pro Glu Ile Glu Ile Val Glu Phe Leu 180 185 190

ata ctg gat gag gca gaa aac aaa tgg tac aaa cat aat ggc cag aat 624

Ile Leu Asp Glu Ala Glu Asn Lys Trp Tyr Lys His Asn Gly Gln Asn 195 200 205

ttt caa gtt cat ttg ttg aaa caa ggc tat caa aat caa cat gtt tca 672

Phe Gln Val His Leu Leu Lys Gln Gly Tyr Gln Asn Gln His Val Ser 210 215 220

gtc tct gga aat cca aat ate att gta cct gaa gac ctt gtg cag att 720

Val Ser Gly Asn Pro Asn Ile Ile Val Pro Glu Asp Leu Val Gln Ile 225 230 235 240

caa gcc ttt ctt agg tgg gaa aga aag ggt agg cag aca tat aca cct 768

Gln Ala Phe Leu Arg Trp Glu Arg Lys Gly Arg Gln Thr Tyr Thr Pro 245 250 255

gat caa gaa aag gag gag tat gaa gca gct aga atg gag ctg ata gaa 816

Asp Gln Glu Lys Glu Glu Tyr Glu Ala Ala Arg Met Glu Leu Ile Glu 260 265 270

gaa ata agt aga ggt atg cct gta gag gag ctt cga tcc aag ttg aca 864

Glu Ile Ser Arg Gly Met Pro Val Glu Glu Leu Arg Ser Lys Leu Thr 275 280 285

gag aaa cca gaa gtc aaa tct gga agt aga gaa gag aaa acc cac aga 912

Glu Lys Pro Glu Val Lys Ser Gly Ser Arg Glu Glu Lys Thr His Arg 290 295 300

gta caa agt cac aaa ggt ggg ate tca gat gat ctt gtg caa ata caa 960

Val Gln Ser His Lys Gly Gly Ile Ser Asp Asp Leu Val Gln Ile Gln 305 310 315 320

gca ttc ate cga tgg gag aaa gct ggg aaa cca aac tac cct cca gag 1008

Ala Phe Ile Arg Trp Glu Lys Ala Gly Lys Pro Asn Tyr Pro Pro Glu 325 330 335

aag caa ctt atg gag ttt gag gaa gca agg aaa gag ctg cag ctt gag 1056

Lys Gln Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala Arg Lys Glu Leu Gln Leu Glu 340 345 350

ttt gat aaa ggt act tct ctg gct gaa cta cgg gaa aag ate atg aag 1104

Phe Asp Lys Gly Thr Ser Leu Ala Glu Leu Arg Glu Lys Ile Met Lys 355 360 365

ggg gat ata tca act aaa gtt ttg aag caa ctg aag gtt gaa aag tat 1152

Gly Asp Ile Ser Thr Lys Val Leu Lys Gln Leu Lys Val Glu Lys Tyr 370 375 380

ttc age aac aaa aga att cag cgg aag gaa agg gac ate atg gaa att 1200 Phe Ser 385

ttg aat Leu Asn

gtc act Val Thr

cag gat Gln Asp

aag aat Lys Asn 450

tat ttg Tyr Leu 465

tca agg Ser Arg

cca ggt Pro Gly

ggt tta Gly Leu

ggg ggt Gly Gly 530

tgg ata Trp Ile 545

agt att Ser Ile

ctt gac Leu Asp

cac agg His Arg

ggc cat Gly His 610

atg aga Met Arg 625

att agt

Asn Lys

aaa aaa Lys Lys

cct cct Pro Pro 420

ggt gaa Gly Glu 435

ctt ctg Leu Leu

gct aca Ala Thr

aaa tca Lys Ser

tca gta Ser Val 500

atg gta Met Val 515

gat tat Asp Tyr

aag aat Lys Asn

agg aag Arg Lys

aag att Lys Ile 580

ttt agt Phe Ser 595

cta ggg Leu Gly

caa ctc Gln Leu

aaa gct

Arg Ile 390

gtt gca Val Ala 405

aca gtg Thr Val

tca gtt Ser Val

gta cta Val Leu

gat caa Asp Gln 470

aga gag Arg Glu 485

ttg cta Leu Leu

gat cag Asp Gln

gct gga Ala Gly

agt ggt Ser Gly 550

gct cct Ala Pro 565

gct gac Ala Asp

att gca Ile Ala

ctt gtt Leu Val

att tgg Ile Trp 630

cag gat

Gln Arg

gaa act Glu Thr

cta gaa Leu Glu

ctg cat Leu His 440

gta acc Val Thr 455

agt gaa Ser Glu

tgg atg Trp Met

gaa gag Glu Glu

tat tat Tyr Tyr 520

att ccc Ile Pro 535

ttg gac Leu Asp

ggt gat Gly Asp

ctg gag Leu Glu

gca gat Ala Asp 600

ggc att Gly Ile 615

aat aaa Asn Lys

agg ctc

Lys Glu

cta gat Leu Asp 410

ctc ttg Leu Leu 425

cag aaa Gln Lys

aaa cct Lys Pro

cca ctt Pro Leu

gta ccc Val Pro 490

tct tgt Ser Cys 505

cag gcc Gln Ala

ttc gtt Phe Val

ttt tac Phe Tyr

gga age Gly Ser 570

acc gag Thr Glu 585

ctc act Leu Thr

ctt gtt Leu Val

aac tac Asn Tyr

aca gat

Arg Asp 395

gaa aaa Glu Lys

gct aag Ala Lys

ate tat Ile Tyr

ttt gaa Phe Glu 460

att tta Ile Leu 475

cct aca Pro Thr

gaa acc Glu Thr

att caa Ile Gln

ctt cgt Leu Arg 540

att gag Ile Glu 555

ggc att Gly Ile

gct caa Ala Gln

gag caa Glu Gln

tgg atg Trp Met 620

aat gtc Asn Val 635

ctt ctt

Ile Met

tct tct Ser Ser

tct ata Ser Ile 430

aag ctg Lys Leu 445

agg aca Arg Thr

cac tgg His Trp

agt tct Ser Ser

cct ttt Pro Phe 510

ata gag Ile Glu 525

tca gac Ser Asp

ttg gac Leu Asp

gca aaa Ala Lys

aaa tct Lys Ser 590

gct aga Ala Arg 605

aga ttc Arg Phe

aag cca Lys Pro

cag gac

Glu Ile 400

caa ata Gln Ile 415

cat gag His Glu

gat aat Asp Asn

aaa gtt Lys Val

gga tta Gly Leu 480

att cct Ile Pro 495

act aag Thr Lys

att gat Ile Asp

gat aaa Asp Lys

gat aga Asp Arg 560

tca ttg Ser Leu 575

ttt atg Phe Met

ggc tct Gly Ser

atg gca Met Ala

cgt gag Arg Glu 640

ata tat

1248

1296

1344

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824

1872

1920

1968 Ile Ser Lys Ala Gln Asp Arg Leu Thr Asp Leu Leu Gln Asp Ile Tyr 645 650 655

aaa gac ttc ccc cag tat aga gag ate ttg agg atg ate atg gct act Lys Asp Phe Pro Gln Tyr Arg Glu Ile Leu Arg Met Ile Met Ala Thr 660 665 670

2016

gtt ggt agg ggc ggt gaa ggt gat gtt ggt cag cgt ate cga gat gaa 2 064

Val Gly Arg Gly Gly Glu Gly Asp Val Gly Gln Arg Ile Arg Asp Glu 675 680 685

ata tta gtt ata cag aga aac aat gac tgc aag gga gga atg atg gag 2112

Ile Leu Val Ile Gln Arg Asn Asn Asp Cys Lys Gly Gly Met Met Glu 690 695 700

gaa tgg cat cag aag cta cat aac aac act age cca gat gat gtt gtg 2160

Glu Trp His Gln Lys Leu His Asn Asn Thr Ser Pro Asp Asp Val Val 705 710 715 720

ata tgc cag gea ctt att gat tat gtt aaa agt gat ttt gac ate agt 2208

Ile Cys Gln Ala Leu Ile Asp Tyr Val Lys Ser Asp Phe Asp Ile Ser 725 730 735

gtg tac tgg gac agt ttg aat aaa aat gga ata acc aag gaa cgt ttg 2256

Val Tyr Trp Asp Ser Leu Asn Lys Asn Gly Ile Thr Lys Glu Arg Leu 740 745 750

ttg age tat gat cgt gct att cat tet gaa cca agt ttc agg aga gat 2304

Leu Ser Tyr Asp Arg Ala Ile His Ser Glu Pro Ser Phe Arg Arg Asp 755 760 765

cag aaa gaa ggt ctt tta cgt gat cta gga aac tac atg agg acg ttg 2352

Gln Lys Glu Gly Leu Leu Arg Asp Leu Gly Asn Tyr Met Arg Thr Leu 770 775 780

aag gea gtt cac tet ggt gea gat ctc gag tet gcc att gct acg tgt 2400

Lys Ala Val His Ser Gly Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Ala Thr Cys 785 790 795 800

atg ggt tac aaa tet gag cgt caa ggc ttt atg gtt ggc gtt caa ata 2448

Met Gly Tyr Lys Ser Glu Arg Gln Gly Phe Met Val Gly Val Gln Ile 805 810 815

aac ccg ata ggg gga ttg cca tet gga ttc cct ggt cta atg aaa ttc 2496

Asn Pro Ile Gly Gly Leu Pro Ser Gly Phe Pro Gly Leu Met Lys Phe 820 825 830

att cta aaa cat gtt gaa gat aaa aat gtg gag cct ttg ata gag ggg 2 544

Ile Leu Lys His Val Glu Asp Lys Asn Val Glu Pro Leu Ile Glu Gly 835 840 845

ttg ctg gag gea cga gtg gaa ctt aga cca ttg ctt ctt age tet cat 2592

Leu Leu Glu Ala Arg Val Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Ser Ser His 850 855 860

gaa cgg ctg aag gat ctt att ttt ttg gat ate gcc ctt gat tet act 2640

Glu Arg Leu Lys Asp Leu Ile Phe Leu Asp Ile Ala Leu Asp Ser Thr 865 870 875 880

gtc agg aca gct gtt gag aga gga tat gag gaa ttg agt aat gcg gag 2688

Val Arg Thr Ala Val Glu Arg Gly Tyr Glu Glu Leu Ser Asn Ala Glu 885 890 895

cca gag aaa ctt att tac ctt att atg ctg ctg ctt gag aat ctt gea 2736 Pro Glu Lys Leu Ile Tyr Leu Ile Met Leu Leu Leu Glu Asn Leu Ala 900 905 910

ttg tct aca gat gat aat gag gac ctc ata tat tgc ttg aag gga tgg Leu Ser Thr Asp Asp Asn Glu Asp Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Gly Trp 915 920 925

2784

aaa cat tcg atg gag atg tgt aag caa aaa gat gat caa tgg gca cta Lys His Ser Met Glu Met Cys Lys Gln Lys Asp Asp Gln Trp Ala Leu 930 935 940

2832

ttt gct aag tca ttt ctt gac aga acc cgt ctg gct cta tca age aag Phe Ala Lys Ser Phe Leu Asp Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ser Ser Lys 945 950 955 960

2880

gca gaa tac tac cat caa att ttg caa cct tca gct gaa tac ctt gga Ala Glu Tyr Tyr His Gln Ile Leu Gln Pro Ser Ala Glu Tyr Leu Gly 965 970 975

2928

tca ttg ctt gat gtt gat gca ggg gcg gta age ata ttc aca gaa gaa Ser Leu Leu Asp Val Asp Ala Gly Ala Val Ser Ile Phe Thr Glu Glu 980 985 990

2976

ate ata cgt gct gga tca gca gct Ile Ile Arg Ala Gly Ser Ala Ala 995 1000

tct tta tct gca ctt ctt cag cga Ser Leu Ser Ala Leu Leu Gln Arg 1005

3024

ctt gac cct ctt ctt cgg aaa gtt gca cat ttg gga age tgg cag Leu Asp Pro Leu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Gly Ser Trp Gln 1010 1015 1020

3069

gtc ata age cct gtt gaa gtt gct gga tat gtt gaa att gta gaa Val Ile Ser Pro Val Glu Val Ala Gly Tyr Val Glu Ile Val Glu 1025 1030 1035

3114

gaa ttg ctt gct gtc cag aat aaa tca tat aca caa tca aca att Glu Leu Leu Ala Val Gln Asn Lys Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Ile 1040 1045 1050

3159

ttg gtt gca aaa cat gta agg Leu Val Ala Lys His Val Arg 1055 1060

gga gaa gag gaa ata cca gat ggc Gly Glu Glu Glu Ile Pro Asp Gly 1065

3204

aca gtt gct gtt tta aca cct gat atg cca gat gtt cta tct cat Thr Val Ala Val Leu Thr Pro Asp Met Pro Asp Val Leu Ser His 1070 1075 1080

3249

gtc tct gtg cga gct aga aat age aag gta tgt ttt gct acc tgc Val Ser Val Arg Ala Arg Asn Ser Lys Val Cys Phe Ala Thr Cys 1085 1090 1095

3294

ttt gat gac aat ate ctg gat Phe Asp Asp Asn Ile Leu Asp 1100 1105

gag ttt cgg aga aat Glu Phe Arg Arg Asn 1110

gca gga aag Ala Gly Lys

3339

ctt ttt cat cta aag ccc aca tca gat gat att gta tat agt aaa Leu Phe His Leu Lys Pro Thr Ser Asp Asp Ile Val Tyr Ser Lys 1115 1120 1125

3384

ata gaa aaa act gaa cct gaa Ile Glu Lys Thr Glu Pro Glu 1130 1135

gat gtg ggt cca gtt Asp Val Gly Pro Val 1140

caa gct gga Gln Ala Gly

3429

gat gag caa tca ctg cca tct gtg aca ttg gtt agg aag cac ttc

3474 Asp Glu Gln Ser Leu Pro Ser Val Thr Leu Val Arg Lys His Phe 1145 1150 1155

age ggc aag tac acc ata tca Ser Gly Lys Tyr Thr Ile Ser 1160 1165

gct gaa gaa ttt acc Ala Glu Glu Phe Thr 1170

aat gaa atg Asn Glu Met

3519

gtt ggt gct aaa tca cgg aat ate tca ttt cta aaa gga aag gtt Val Gly Ala Lys Ser Arg Asn Ile Ser Phe Leu Lys Gly Lys Val 1175 1180 1185

3564

cct tca tgg gtg ggc att ccc aca tca gtc gct cta cca ttt gga Pro Ser Trp Val Gly Ile Pro Thr Ser Val Ala Leu Pro Phe Gly 1190 1195 1200

3609

gtt ttt gaa gaa gtt ctg tca aat gac ata aac aag gaa att gcc Val Phe Glu Glu Val Leu Ser Asn Asp Ile Asn Lys Glu Ile Ala 1205 1210 1215

3654

age cag ctg cag tta ctg aaa gag aag ttg gct ate gga gaa ttc Ser Gln Leu Gln Leu Leu Lys Glu Lys Leu Ala Ile Gly Glu Phe 1220 1225 1230

3699

aat gea ctt ctc gac ata aga aag atg ate ttg cag cta gea tet Asn Ala Leu Leu Asp Ile Arg Lys Met Ile Leu Gln Leu Ala Ser 1235 1240 1245

3744

cca att gag ttg gta caa gag Pro Ile Glu Leu Val Gln Glu 1250 1255

cta aag gga aaa atg cag gea tca Leu Lys Gly Lys Met Gln Ala Ser 1260

3789

gga atg cca tgg cct ggt gat gag ggt gaa gat cgg tgg gaa ctt Gly Met Pro Trp Pro Gly Asp Glu Gly Glu Asp Arg Trp Glu Leu 1265 1270 1275

3834

gct tgg atg gea ata aaa aga gtt tgg gct tca aag tgg aat gag Ala Trp Met Ala Ile Lys Arg Val Trp Ala Ser Lys Trp Asn Glu 1280 1285 1290

3879

aga gea tat ttc age aca agg aaa gtc aag ttg gat cat gac tat Arg Ala Tyr Phe Ser Thr Arg Lys Val Lys Leu Asp His Asp Tyr 1295 1300 1305

3924

ttg tgc atg gct gtc ttg gtt caa gaa ate att agt gct gat tat Leu Cys Met Ala Val Leu Val Gln Glu Ile Ile Ser Ala Asp Tyr 1310 1315 1320

3969

gea ttt gtc ate cac act aca aac cca tca tet gga gac tca tet Ala Phe Val Ile His Thr Thr Asn Pro Ser Ser Gly Asp Ser Ser 1325 1330 1335

4014

gaa ata tat gcc gag gtg gtg Glu Ile Tyr Ala Glu Val Val 1340 1345

aaa gga ctc ggá gaa Lys Gly Leu Gly Glu 1350

act ctt gtt Thr Leu Val

4059

gga gcc tat cca ggc cgg gea ttg age ttc gtc tgt aat aag aac Gly Ala Tyr Pro Gly Arg Ala Leu Ser Phe Val Cys Asn Lys Asn 1355 1360 1365

4104

aat ctg aac tcg cca aag gta ctt ggt ttc cca age aag cct att Asn Leu Asn Ser Pro Lys Val Leu Gly Phe Pro Ser Lys Pro Ile 1370 1375 1380

4149

ggc ctc ttc ate aaa cga tca att ate ttc aga tet gat tet aat

4194 Gly Leu Phe Ile Lys Arg 1385

ggt gaa gat tta gaa ggt Gly Glu Asp Leu Glu Gly 1400

gtg ccc atg gat gag gaa Val Pro Met Asp Glu Glu 1415

gac ccg tta ate atg gat Asp Pro Leu Ile Met Asp 1430

age att gct cga gea ggt Ser Ile Ala Arg Ala Gly 1445

cca cag gac att gaa ggt Pro Gln Asp Ile Glu Gly 1460

gtc caa aca aga cca cag Val Gln Thr Arg Pro Gln 1475

Ser Ile Ile Phe Arg Ser 1390 1395

tat gea ggt gct ggt ctt Tyr Ala Gly Ala Gly Leu 1405 1410

gag aaa gtg gta ctc gac Glu Lys Val Val Leu Asp 1420 1425

aag aac ttc cgt aat tca Lys Asn Phe Arg Asn Ser 1435 1440

tat gcg ate gag gag ctc Tyr Ala Ile Glu Glu Leu 1450 1455

gtt gta aag gat ggt aaa Val Val Lys Asp Gly Lys 1465 1470

atg tga

Met

1480

Asp Ser Asn

tat gac agt 4239

Tyr Asp Ser

tat gta gct 4284

Tyr Val Ala

ctg ctc tcc 4329

Leu Leu Ser

tat ggc tet 4374

Tyr Gly Ser

ate ttc gtc 4419

Ile Phe Val

4443

<210> 4

<211> 1480

<212> PRT

<213> Curcuma longa

<400> 4

Met Asn Asn Cys Val Gly His Thr Leu Pro Gln Gln Ala Leu Phe Arg 10 15

Pro Ser Val Val Glu Arg His Asn Thr Ala Cys Gln Arg Ser Ser Gly 25 30

Asn Ile Leu Cys Thr Val Pro Ser Ala Ser Lys Ala Glu Asp Val Pro 40 45

Ser Leu Lys Pro Phe Leu Ser Ser Arg Phe Leu Gly Lys Thr Pro Tyr 50 55 60

Ala Gly Lys Gly Asn Pro Leu Lys Lys Asn Leu Arg Thr Val Thr Met 65 70 75 80

Ser Pro Gln Ala Leu Leu Ala Ala Asp Pro Ala Ser Glu Leu Ala Arg 85 90 95

Lys Phe Lys Leu Asp Thr Asn Ser Glu Leu Glu Val Thr Ile Cys Lys 100 105 110

Pro Thr Ser Glu Ser Pro Met Gln Ile Asp Phe Gln Val Thr Asn Val 115 120 125 Ser Gly Ser Leu Val Leu His Trp Gly Val Ile Leu Gln Thr Arg Arg 130 135 140

Glu Trp Ser Leu Pro Ser His Tyr Pro Glu Gly Thr Lys Val Tyr Lys 145 150 155 160

Asn Gln Ala Leu Arg Thr Pro Phe Thr Lys Val Gly Ser Thr Cys Ser 165 170 175

Leu Arg Leu Glu Ile Asp Asp Pro Glu Ile Glu Ile Val Glu Phe Leu 180 185 190

Ile Leu Asp Glu Ala Glu Asn Lys Trp Tyr Lys His Asn Gly Gln Asn 195 200 205

Phe Gln Val His Leu Leu Lys Gln Gly Tyr Gln Asn Gln His Val Ser 210 215 220

Val Ser Gly Asn Pro Asn Ile Ile Val Pro Glu Asp Leu Val Gln Ile 225 230 235 240

Gln Ala Phe Leu Arg Trp Glu Arg Lys Gly Arg Gln Thr Tyr Thr Pro 245 250 255

Asp Gln Glu Lys Glu Glu Tyr Glu Ala Ala Arg Met Glu Leu Ile Glu 260 265 270

Glu Ile Ser Arg Gly Met Pro Val Glu Glu Leu Arg Ser Lys Leu Thr 275 280 285

Glu Lys Pro Glu Val Lys Ser Gly Ser Arg Glu Glu Lys Thr His Arg 290 295 300

Val Gln Ser His Lys Gly Gly Ile Ser Asp Asp Leu Val Gln Ile Gln 305 310 315 320

Ala Phe Ile Arg Trp Glu Lys Ala Gly Lys Pro Asn Tyr Pro Pro Glu 325 330 335

Lys Gln Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala Arg Lys Glu Leu Gln Leu Glu 340 345 350

Phe Asp Lys Gly Thr Ser Leu Ala Glu Leu Arg Glu Lys Ile Met Lys 355 360 365

Gly Asp Ile Ser Thr Lys Val Leu Lys Gln Leu Lys Val Glu Lys Tyr 370 375 380

Phe Ser Asn Lys Arg Ile Gln Arg Lys Glu Arg Asp Ile Met Glu Ile

385 390 395 400 Leu Asn Lys Lys Val Ala Glu Thr Leu Asp Glu Lys Ser Ser Gln Ile 405 410 415

Val Thr Pro Pro Thr Val Leu Glu Leu Leu Ala Lys Ser Ile His Glu 420 425 430

Gln Asp Gly Glu Ser Val Leu His Gln Lys Ile Tyr Lys Leu Asp Asn 435 440 445

Lys Asn Leu Leu Val Leu Val Thr Lys Pro Phe Glu Arg Thr Lys Val 450 455 460

Tyr Leu Ala Thr Asp Gln Ser Glu Pro Leu Ile Leu His Trp Gly Leu 465 470 475 480

Ser Arg Lys Ser Arg Glu Trp Met Val Pro Pro Thr Ser Ser Ile Pro 485 490 495

Pro Gly Ser Val Leu Leu Glu Glu Ser Cys Glu Thr Pro Phe Thr Lys 500 505 510

Gly Leu Met Val Asp Gln Tyr Tyr Gln Ala Ile Gln Ile Glu Ile Asp 515 520 525

Gly Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Pro Phe Val Leu Arg Ser Asp Asp Lys 530 535 540

Trp Ile Lys Asn Ser Gly Leu Asp Phe Tyr Ile Glu Leu Asp Asp Arg 545 550 555 560

Ser Ile Arg Lys Ala Pro Gly Asp Gly Ser Gly Ile Ala Lys Ser Leu 565 570 575

Leu Asp Lys Ile Ala Asp Leu Glu Thr Glu Ala Gln Lys Ser Phe Met 580 585 590

His Arg Phe Ser Ile Ala Ala Asp Leu Thr Glu Gln Ala Arg Gly Ser 595 600 605

Gly His Leu Gly Leu Val Gly Ile Leu Val Trp Met Arg Phe Met Ala 610 615 620

Met Arg Gln Leu Ile Trp Asn Lys Asn Tyr Asn Val Lys Pro Arg Glu 625 630 635 640

Ile Ser Lys Ala Gln Asp Arg Leu Thr Asp Leu Leu Gln Asp Ile Tyr 645 650 655

Lys Asp Phe Pro Gln Tyr Arg Glu Ile Leu Arg Met Ile Met Ala Thr

660 665 670 Val Gly Arg Gly Gly Glu Gly Asp Val Gly Gln Arg Ile Arg Asp Glu 675 680 685

Ile Leu Val Ile Gln Arg Asn Asn Asp Cys Lys Gly Gly Met Met Glu 690 695 700

Glu Trp His Gln Lys Leu His Asn Asn Thr Ser Pro Asp Asp Val Val 705 710 715 720

Ile Cys Gln Ala Leu Ile Asp Tyr Val Lys Ser Asp Phe Asp Ile Ser 725 730 735

Val Tyr Trp Asp Ser Leu Asn Lys Asn Gly Ile Thr Lys Glu Arg Leu 740 745 750

Leu Ser Tyr Asp Arg Ala Ile His Ser Glu Pro Ser Phe Arg Arg Asp 755 760 765

Gln Lys Glu Gly Leu Leu Arg Asp Leu Gly Asn Tyr Met Arg Thr Leu 770 775 780

Lys Ala Val His Ser Gly Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Ala Thr Cys 785 790 795 800

Met Gly Tyr Lys Ser Glu Arg Gln Gly Phe Met Val Gly Val Gln Ile 805 810 815

Asn Pro Ile Gly Gly Leu Pro Ser Gly Phe Pro Gly Leu Met Lys Phe 820 825 830

Ile Leu Lys His Val Glu Asp Lys Asn Val Glu Pro Leu Ile Glu Gly 835 840 845

Leu Leu Glu Ala Arg Val Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Ser Ser His 850 855 860

Glu Arg Leu Lys Asp Leu Ile Phe Leu Asp Ile Ala Leu Asp Ser Thr 865 870 875 880

Val Arg Thr Ala Val Glu Arg Gly Tyr Glu Glu Leu Ser Asn Ala Glu 885 890 895

Pro Glu Lys Leu Ile Tyr Leu Ile Met Leu Leu Leu Glu Asn Leu Ala 900 905 910

Leu Ser Thr Asp Asp Asn Glu Asp Leu Ile Tyr Cys Leu Lys Gly Trp

915 920 925

Lys His Ser Met Glu Met Cys Lys Gln Lys Asp Asp Gln Trp Ala Leu

930 935 940 Phe Ala Lys Ser Phe Leu Asp Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ser Ser Lys 945 950 955 960

Ala Glu Tyr Tyr His Gln Ile Leu Gln Pro Ser Ala Glu Tyr Leu Gly 965 970 975

Ser Leu Leu Asp Val Asp Ala Gly Ala Val Ser Ile Phe Thr Glu Glu 980 985 990

Ile Ile Arg Ala Gly Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ala Leu Leu Gln Arg 995 1000 1005

Leu Asp Pro Leu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Gly Ser Trp Gln 1010 1015 1020

Val Ile Ser Pro Val Glu Val Ala Gly Tyr Val Glu Ile Val Glu 1025 1030 1035

Glu Leu Leu Ala Val Gln Asn Lys Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Ile 1040 1045 1050

Leu Val Ala Lys His Val Arg Gly Glu Glu Glu Ile Pro Asp Gly 1055 1060 1065

Thr Val Ala Val Leu Thr Pro Asp Met Pro Asp Val Leu Ser His 1070 1075 1080

Val Ser Val Arg Ala Arg Asn Ser Lys Val Cys Phe Ala Thr Cys 1085 1090 1095

Phe Asp Asp Asn Ile Leu Asp Glu Phe Arg Arg Asn Ala Gly Lys 1100 1105 1110

Leu Phe His Leu Lys Pro Thr Ser Asp Asp Ile Val Tyr Ser Lys 1115 1120 1125

Ile Glu Lys Thr Glu Pro Glu Asp Val Gly Pro Val Gln Ala Gly 1130 1135 1140

Asp Glu Gln Ser Leu Pro Ser Val Thr Leu Val Arg Lys His Phe 1145 1150 1155

Ser Gly Lys Tyr Thr Ile Ser Ala Glu Glu Phe Thr Asn Glu Met 1160 1165 1170

Val Gly Ala Lys Ser Arg Asn Ile Ser Phe Leu Lys Gly Lys Val 1175 1180 1185

Pro Ser Trp Val Gly Ile Pro Thr Ser Val Ala Leu Pro Phe Gly 1190 1195 1200 Val Phe Glu Glu Val Leu Ser Asn Asp Ile Asn Lys Glu Ile Ala 1205 1210 1215

Ser Gln Leu Gln Leu Leu Lys Glu Lys Leu Ala Ile Gly Glu Phe 1220 1225 1230

Asn Ala Leu Leu Asp Ile Arg Lys Met Ile Leu Gln Leu Ala Ser 1235 1240 1245

Pro Ile Glu Leu Val Gln Glu Leu Lys Gly Lys Met Gln Ala Ser 1250 1255 1260

Gly Met Pro Trp Pro Gly Asp Glu Gly Glu Asp Arg Trp Glu Leu 1265 1270 1275

Ala Trp Met Ala Ile Lys Arg Val Trp Ala Ser Lys Trp Asn Glu 1280 1285 1290

Arg Ala Tyr Phe Ser Thr Arg Lys Val Lys Leu Asp His Asp Tyr 1295 1300 1305

Leu Cys Met Ala Val Leu Val Gln Glu Ile Ile Ser Ala Asp Tyr 1310 1315 1320

Ala Phe Val Ile His Thr Thr Asn Pro Ser Ser Gly Asp Ser Ser 1325 1330 1335

Glu Ile Tyr Ala Glu Val Val Lys Gly Leu Gly Glu Thr Leu Val 1340 1345 1350

Gly Ala Tyr Pro Gly Arg Ala Leu Ser Phe Val Cys Asn Lys Asn 1355 1360 1365

Asn Leu Asn Ser Pro Lys Val Leu Gly Phe Pro Ser Lys Pro Ile 1370 1375 1380

Gly Leu Phe Ile Lys Arg Ser Ile Ile Phe Arg Ser Asp Ser Asn 1385 1390 1395

Gly Glu Asp Leu Glu Gly Tyr Ala Gly Ala Gly Leu Tyr Asp Ser 1400 1405 1410

Val Pro Met Asp Glu Glu Glu Lys Val Val Leu Asp Tyr Val Ala 1415 1420 1425

Asp Pro Leu Ile Met Asp Lys Asn Phe Arg Asn Ser Leu Leu Ser 1430 1435 1440

Ser Ile Ala Arg Ala Gly Tyr Ala Ile Glu Glu Leu Tyr Gly Ser 1445 1450 1455 Pro Gln Asp Ile Glu Gly Val Val Lys Asp Gly Lys Ile Phe Val 1460 1465 1470

Val Gln Thr Arg Pro Gln Met 1475 1480

<210> 5

<211> 3000

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> CDS

<222> (227)..(2623)

<400> 5

ctccaccgcg gtggcggccg ctctagaact agtggatccc ccgggctgca ggaattcggc 60

acgagcttcg gcctgacccc gttcgtttac ccccacacag agcacactcc agtccagtcc 120

agcccactgc caccgcgcta ctctccactc ccactgccac cacctccgcc tgcgccgcgc 180

tctgggcgga ccaacccgcg aaccgtacca tctcccgccc cgatcc atg tcg tcg 235

Met Ser Ser 1

gcg gtc gcg tcc gcc gca tcc ttc ctc gcg ctc gcg tca gcc tcc ccc 283

Ala Val Ala Ser Ala Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser Ala Ser Pro 10 15

ggg aga tca cgc agg cgg gcg agg gtg age gcg cag cca ccc cac gcc 331

Gly Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Gln Pro Pro His Ala 25 30 35

ggg gcc ggc agg ttg cac tgg ccg ccg tgg ccg ccg cag cgc acg gct 379

Gly Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro Pro Gln Arg Thr Ala 40 45 50

cgc gac gga gct gtg gcg gcg ctc gcc gcc ggg aag aag gac gcg ggg 427

Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Gly Lys Lys Asp Ala Gly 55 60 65

ate gac gac gcc gcc gcg tcc gtg agg cag ccc cgc gca ctc cgc ggt 475

Ile Asp Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Gln Pro Arg Ala Leu Arg Gly 70 75 80

ggc gcc gcc acc aag gtc gcg gag cga agg gat ccc gtc aag acg ctc 523

Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val Lys Thr Leu 85 90 95

gac cgc gac gcc gcg gaa ggc ggc ggg ccg tcc ccg ccg gca gcg agg 571

Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ala Ala Arg 100 105 110 115

cag gac gcc gcc cgt ccg ccg agt atg aac ggc atg ccg gtg aac ggc 619

Gln Asp Ala Ala Arg Pro Pro Ser Met Asn Gly Met Pro Val Asn Gly 120 125 130

gag aac aaa tet acc ggc ggc ggc ggc gcg act aaa gac age ggg ctg 667

Glu Asn Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp Ser Gly Leu 135 140 145 ccc acg ccc gca cgc gcg ccc cat ccg tcg acc cag aac aga gca ccg 715

Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Pro Ser Thr Gln Asn Arg Ala Pro 150 155 160

gtg aac ggt gaa aac aaa gct aac gtc gcc tcg ccg ccg acg age ata 7 63

Val Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn Val Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ile 165 170 175

gcc gag gcc gcg gct tcg gat tcc gca gct acc att tcc ate age gac 811

Ala Glu Ala Ala Ala Ser Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser Ile Ser Asp

180 185 190 195

aag gcg ccg gag tcc gtt gtc cca gct gag aag acg ccg ccg tcg tcc 859

Lys Ala Pro Glu Ser Val Val Pro Ala Glu Lys Thr Pro Pro Ser Ser 200 205 210

ggc tca aat ttc gag tcc tcg gcc tet gct ccc ggg tet gac act gtc 907

Gly Ser Asn Phe Glu Ser Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ser Asp Thr Val 215 220 225

age gac gtg gaa caa gaa ctg aag aag ggt gcg gtc gtt gtc gaa gaa 955

Ser Asp Val Glu Gln Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Val Val Glu Glu 230 235 240

gct cca aag cca aag gct ctt tcg ccg cct gca gcc ccc gct gta caa 1003

Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro Ala Val Gln 245 250 255

gaa gac ctt tgg gat ttc aag aaa tac att ggt ttc gag gag ccc gtg 1051

Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Glu Glu Pro Val

260 265 270 275

gag gcc aag gat gat ggc cgg gct gtc gca gat gat gcg ggc tcc ttt 1099

Glu Ala Lys Asp Asp Gly Arg Ala Val Ala Asp Asp Ala Gly Ser Phe 280 285 290

gaa cac cac cag aat cac gac tcc gga cct ttg gca ggg gag aat gtc 1147

Glu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly Glu Asn Val 295 300 305

atg aac gtg gtc gtc gtg gct gct gag tgt tet ccc tgg tgc aaa aca 1195

Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp Cys Lys Thr 310 315 320

ggt ggt ctg gga gat gtt gcg ggt gct ctg ccc aag gct ttg gca aag 1243

Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Lys 325 330 335

aga gga cat cgt gtt atg gtt gtg gta cca agg tat ggg gac tat gaa 1291

Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu

340 345 350 355

gaa gcc tac gat gtc gga gtc cga aaa tac tac aag gct gct gga cag 1339

Glu Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Gln 360 365 370

gat atg gaa gtg aat tat ttc cat gct tat ate gat gga gtt gat ttt 1387

Asp Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly Val Asp Phe 375 380 385

gtg ttc att gac gct cct ctc ttc cga cac cgt cag gaa gac att tat 1435

Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Glu Asp Ile Tyr 390 395 400

ggg ggc age aga cag gaa att atg aag cgc atg att ttg ttc tgc aag 1483 Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe Cys Lys

405 410 415

gcc gct gtt gag gtt cca tgg cac gtt cca tgc ggc ggt gtc cct tat 1531

Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly Val Pro Tyr

420 425 430 435

ggg gat gga aat ctg gtg ttt att gca aat gat tgg cac acg gca ctc 157 9

Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His Thr Ala Leu 440 445 450

ctg cct gtc tat ctg aaa gca tat tac agg gac cat ggt ttg atg cag 1627

Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly Leu Met Gln 455 460 465

tac act cgg tcc att atg gtg ata cat aac ate gct cac cag ggc cgt 1675

Tyr Thr Arg Ser Ile Met Val Ile His Asn Ile Ala His Gln Gly Arg 470 475 480

ggc cct gta gat gaa ttc ccg ttc acc gag ttg cct gag cac tac ctg 1723

Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu His Tyr Leu

485 490 495

gaa cac ttc aga ctg tac gac ccc gtg ggt ggt gaa cac gcc aac tac 1771

Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His Ala Asn Tyr

500 505 510 515

ttc gcc gcc ggc ctg aag atg gcg gac cag gtt gtc gtg gtg age ccc 1819

Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val Val Val Val Ser Pro 520 525 530

ggg tac ctg tgg gag ctg aag acg gtg gag ggc ggc tgg ggg ctt cac 1867

Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp Gly Leu His 535 540 545

gac ate ata cgg cag aac gac tgg aag acc cgc ggc ate gtc aac ggc 1915

Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile Val Asn Gly 550 555 560

ate gac aac atg gag tgg aac ccc gag gtg gac gcc cac ctc aag tcg 1963

Ile Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Ala His Leu Lys Ser

565 570 575

gac ggc tac acc aac ttc tcc ctg agg acg ctg gac tcc ggc aag cgg 2 011

Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Arg Thr Leu Asp Ser Gly Lys Arg

580 585 590 595

cag tgc aag gag gcc ctg cag cgc gag ctg ggc ctg cag gtc cgc gcc 2059

Gln Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln Val Arg Ala 600 605 610

gac gtg ccg ctg ctc ggc ttc ate ggc cgc ctg gac ggg cag aag ggc 2107

Asp Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly Gln Lys Gly 615 620 625

gtg gag ate ate gcg gac gcc atg ccc tgg ate gtg age cag gac gtg 2155

Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser Gln Asp Val 630 635 640

cag ctg gtg atg ctg ggc acc ggg cgc cac gac ctg gag age atg ctg 2203

Gln Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu Ser Met Leu

645 650 655

cag cac ttc gag cgg gag cac cac gac aag gtg cgc ggg tgg gtg ggg 2251 Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly Trp Val Gly 660 665 670 675

ttc tcc gtg cgc ctg gcg cac cgg ate acg gcg ggg gcg gac gcg ctc 2299

Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala Asp Ala Leu 680 685 690

etc atg ccc tcc cgg ttc gag ccg tgc ggg ctg aac cag ctc tac gcc 2347

Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala 695 700 705

atg gcc tac ggc acc gtc ccc gtc gtg cac gcc gtc ggc ggc ctc agg 2395

Met Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly Gly Leu Arg 710 715 720

gac acc gtg ccg ccg ttc gac ccc ttc aac cac tcc ggg ctc ggg tgg 2443

Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His Ser Gly Leu Gly Trp 725 730 735

acg ttc gac cgc gcc gag gcg cac aag ctg ate gag gcg ctc ggg cac 2491

Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala Leu Gly His 740 745 750 755

tgc ctc cgc acc tac cga gac ttc aag gag age tgg agg gcc ctc cag 2539

Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Phe Lys Glu Ser Trp Arg Ala Leu Gln 760 765 770

gag cgc ggc atg tcg cag gac ttc age tgg gag cac gcc gcc aag ctc 2587

Glu Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala Ala Lys Leu 775 780 785

tac gag gac gtc ctc gtc aag gcc aag tac cag tgg tgaacgctag 2633

Tyr Glu Asp Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp 790 795

ctgctagccg ctccagcccc gcatgcgtgc atgacaggat ggaactgcat tgcgcacgca 2 693

ggaaagtgcc atggagcgcc ggcatccgcg aagtacagtg acatgaggtg tgtgtggttg 2753

agacgctgat tccaatccgg cccgtagcag agtagagcgg aggtatatgg gaatcttaac 2813

ttggtattgt aatttgttat gttgtgtgca ttattacaat gttgttactt attcttgtta 2873

agtcggaggc caagggcgaa agetagetea catgtctgat ggatgcacgt gccatggttg 2933

gtttggtagc gcagtgcaaa cggcaagaat gggaagtgaa ttcctccctg cttgaaaaaa 2993

aaaaaaa 3000

<210> 6

<211> 799

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 6

Met Ser Ser Ala Val Ala Ser Ala Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala Ser 10 15

Ala Ser Pro Gly Arg Ser Arg Arg Arg Ala Arg Val Ser Ala Gln Pro 25 30 Pro His Ala Gly Ala Gly Arg Leu His Trp Pro Pro Trp Pro Pro Gln 40 45

Arg Thr Ala Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Leu Ala Ala Gly Lys Lys 50 55 60

Asp Ala Gly Ile Asp Asp Ala Ala Ala Ser Val Arg Gln Pro Arg Ala 65 70 75 80

Leu Arg Gly Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Glu Arg Arg Asp Pro Val 85 90 95

Lys Thr Leu Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro 100 105 110

Ala Ala Arg Gln Asp Ala Ala Arg Pro Pro Ser Met Asn Gly Met Pro 115 120 125

Val Asn Gly Glu Asn Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys Asp 130 135 140

Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Pro Ser Thr Gln Asn 145 150 155 160

Arg Ala Pro Val Asn Gly Glu Asn Lys Ala Asn Val Ala Ser Pro Pro 165 170 175

Thr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Ala Ser Asp Ser Ala Ala Thr Ile Ser 180 185 190

Ile Ser Asp Lys Ala Pro Glu Ser Val Val Pro Ala Glu Lys Thr Pro 195 200 205

Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Glu Ser Ser Ala Ser Ala Pro Gly Ser 210 215 220

Asp Thr Val Ser Asp Val Glu Gln Glu Leu Lys Lys Gly Ala Val Val 225 230 235 240

Val Glu Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Pro Pro Ala Ala Pro 245 250 255

Ala Val Gln Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys Tyr Ile Gly Phe Glu 260 265 270

Glu Pro Val Glu Ala Lys Asp Asp Gly Arg Ala Val Ala Asp Asp Ala 275 280 285

Gly Ser Phe Glu His His Gln Asn His Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly 290 295 300 Glu Asn Val Met Asn Val Val Val Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp 305 310 315 320

Cys Lys Thr Gly Gly Leu Gly Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala 325 330 335

Leu Ala Lys Arg Gly His Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly 340 345 350

Asp Tyr Glu Glu Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala 355 360 365

Ala Gly Gln Asp Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly 370 375 380

Val Asp Phe Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gln Glu 385 390 395 400

Asp Ile Tyr Gly Gly Ser Arg Gln Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu 405 410 415

Phe Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly 420 425 430

Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp His 435 440 445

Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp His Gly 450 455 460

Leu Met Gln Tyr Thr Arg Ser Ile Met Val Ile His Asn Ile Ala His 465 470 475 480

Gln Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr Glu Leu Pro Glu 485 490 495

His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro Val Gly Gly Glu His 500 505 510

Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met Ala Asp Gln Val Val Val 515 520 525

Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp 530 535 540

Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gln Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile 545 550 555 560

Val Asn Gly Ile Asp Asn Met Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Ala His 565 570 575 Leu Lys Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Phe Ser Leu Arg Thr Leu Asp Ser 580 585 590

Gly Lys Arg Gln Cys Lys Glu Ala Leu Gln Arg Glu Leu Gly Leu Gln 595 600 605

Val Arg Ala Asp Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly 610 615 620

Gln Lys Gly Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser 625 630 635 640

Gln Asp Val Gln Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu 645 650 655

Ser Met Leu Gln His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly 660 665 670

Trp Val Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly Ala 675 680 685

Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Asn Gln 690 695 700

Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Ala Val Gly 705 710 715 720

Gly Leu Arg Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe Asn His Ser Gly 725 730 735

Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His Lys Leu Ile Glu Ala 740 745 750

Leu Gly His Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp Phe Lys Glu Ser Trp Arg 755 760 765

Ala Leu Gln Glu Arg Gly Met Ser Gln Asp Phe Ser Trp Glu His Ala 770 775 780

Ala Lys Leu Tyr Glu Asp Val Leu Val Lys Ala Lys Tyr Gln Trp 785 790 795

Claims

1. Célula vegetal modificada geneticamente, que possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sinta- se Il e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase em comparação com células vegetais do tipo selva- gem não-modificadas geneticamente.

2. Célula vegetal modificada geneticamente de acordo com a reivindicação 1, em que a modificação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha no genoma da planta.

3. Célula vegetal modificada geneticamente de acordo com as reivindicações 1 e 2, que sintetiza um amido modificado em comparação com o amido isolado de células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes.

4. Célula vegetal modificada geneticamente de acordo com as reivindicações de 1 a 3 que sintetiza um amido que possui um maior poder de intumescimento em água quente.

5. Planta que compreende células vegetais modificadas geneti- camente como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.

6. Material de propagação de planta como definida na reivindica- ção 5, que compreende células vegetais modificadas geneticamente como definidas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.

7. Processo para a produção de uma planta modificada geneti- camente, em que a) uma célula vegetal é modificada geneticamente, a modifi- cação genética compreendendo as etapas i e ii a seguir em qualquer seqüência desejada, individualmente ou simulta- neamente i) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase Il em comparação com células vegetais do tipo selvagem corresponden- te que não são modificadas geneticamentes, ii) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase em com- paração com células vegetais do tipo selvagem cor- respondente que não são modificadas geneticamen- tes b) uma planta é regenerada partindo das células vegetais da etapa a); c) opcionalmente plantas adicionais são produzidas com o auxílio das plantas de acordo com a etapa b), em que as células vegetais são opcionalmente isoladas das plantas de acor- do com a etapa b) ou c) e as etapas a) até c) do processo são repetidas até ter sido produzida uma planta que possui uma maior atividade de uma prote- ína que possui a atividade de uma amido sintase Il e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.

8. Processo para a produção de um amido modificado, que compreende a etapa da extração do amido das células vegetais modificadas geneticamente como definidas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, de planta como definida na reivindicação 5, de material de propagação como definido na reivindicação 6 ou de plantas que podem ser obtidas atra- vés de um processo como definido na reivindicação 7.

9. Uso de plantas como definido na reivindicação 5, de material de propagação como definido na reivindicação 6 ou de plantas que podem ser obtidas através de um processo como definido na reivindicação 7 para a produção de amido.

10. Amido modificado que pode ser obtido através do processo como definido na reivindicação 8.

11. Amido modificado, que possui um poder de intumescimento em água quente de pelo menos 110 g/g.

12. Processo para a produção de um amido derivatizado, em que o amido modificado é subseqüentemente derivatizado como definido na reivindicação 10 ou 11.

13. Amido derivatizado que pode ser obtido através de um pro- cesso como definido na reivindicação 12.

14. Uso do amido modificado como definido na reivindicação 10 ou 11 para a produção de amido derivatizado.

15. Farinha que compreende um amido modificado, que pode ser obtido através de um processo como definido na reivindicação 8 ou que compreende um amido modificado como definido na reivindicação 10 ou 11.

16. Processo para a produção de farinhas, que compreende a etapa de moagem de plantas como definidos na reivindicação 5, de material de propagação como definido na reivindicação 6 ou de plantas que podem ser obtidas através de um processo como definido na reivindicação 7.

17. Uso de células vegetais modificadas geneticamente como definidas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, de plantas como definidas na reivindicação 5, de material de propagação como definido na reivindicação 6 ou de plantas que podem ser obtidas através de um proces- so como definido na reivindicação 7 para a produção de farinhas.