BRPI0716018B1 - Processo para a produção de uma planta modificada geneticamente, amido modificado, seu processo de produção, e seu uso, amido derivatizado e seu processo de produção, farinha e seu processo de produção, bem como usos de plantas que compreendem células vegetais geneticamente modificadas, de material de propagação da dita planta, e de células vegetais modificadas geneticamente - Google Patents
Processo para a produção de uma planta modificada geneticamente, amido modificado, seu processo de produção, e seu uso, amido derivatizado e seu processo de produção, farinha e seu processo de produção, bem como usos de plantas que compreendem células vegetais geneticamente modificadas, de material de propagação da dita planta, e de células vegetais modificadas geneticamente Download PDFInfo
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Abstract
patente de invenção: "plantas modificadas geneticamente que sintetizam amido que possui maior poder de intumescimento". a presente invenção refere-se a células vegetais a plantas modificadas geneticamente e a processos para a produção de células vegetais e de plantas modificadas geneticamente que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase ii e uma maior atividade de proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase. as plantas deste tipo sintetizam amidos que possuem maior poder de intumescimento em água quante. a presente invenção refere-se similarmente a amidos que possuem maior poder de intumescimento em água quente e a processos para a produção dos mesmos.
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(54) Título: PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA MODIFICADA GENETICAMENTE, AMIDO MODIFICADO, SEU PROCESSO DE PRODUÇÃO, E SEU USO, AMIDO DERIVATIZADO E SEU PROCESSO DE PRODUÇÃO, FARINHA E SEU PROCESSO DE PRODUÇÃO, BEM COMO USOS DE PLANTAS QUE COMPREENDEM CÉLULAS VEGETAIS GENETICAMENTE MODIFICADAS, DE MATERIAL DE PROPAGAÇÃO DA DITA PLANTA, E DE CÉLULAS VEGETAIS MODIFICADAS GENETICAMENTE (51) Int.CI.: C12N 5/10; C12N 15/29; A01H 5/00; C08B 30/04; A23L 1/0522; C12N 9/12; C12N 9/10 (30) Prioridade Unionista: 09/08/2006 EP 06 090134.5, 10/08/2006 US 60/836,817 (73) Titular(es): BAYER INTELLECTUAL PROPERTY GMBH (72) Inventor(es): CLAUS FROHBERG
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA MODIFICADA GENETICAMENTE, AMIDO MODIFICADO, SEU PROCESSO DE PRODUÇÃO, E SEU USO, AMIDO DERIVATIZADO E SEU PROCESSO DE PRODUÇÃO, FA5 RINHA E SEU PROCESSO DE PRODUÇÃO, BEM COMO USOS DE PLANTAS QUE COMPREENDEM CÉLULAS VEGETAIS GENETICAMENTE MODIFICADAS, DE MATERIAL DE PROPAGAÇÃO DA DITA PLANTA, E DE CÉLULAS VEGETAIS MODIFICADAS GENETICAMENTE.
A presente invenção refere-se a células vegetais e plantas modi10 ficadas geneticamente e a processos para a produção de células vegetais e plantas modificadas geneticamente que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase. As plantas deste tipo sintetizam amidos que possuem maior poder de intumescimento em água quente. A presente invenção refere-se similarmente a amidos que possuem maior poder de intumescimento em água quente e a processos para a preparação dos mesmos.
Além de óleos, gorduras e proteínas, os polissacarídeos são os materiais brutos renováveis principais das plantas. O amido, que é uma das substâncias de reserva mais importante em plantas superiores, além da celulose, possui uma função central nos polissacarídeos. Além disso, o amido é um constituinte essencial da nutrição de seres humanos e de animais em termos da fisiologia nutricional. As características estruturais do amido contido nos alimentos podem influenciar as propriedades funcionais (por exem25 plo, poder de ligação com a água, poder de intumescimento), de fisiologia nutricional (por exemplo, capacidade de digestão, influência do alimento sobre o índice glicêmico) ou que confere estrutura (por exemplo, resistência a cortes, textura, pegajosidade, capacidade de processamento) de todos os tipos de alimentos. As composições alimentícias, portanto, contêm frequen30 temente um amido que possui certas características estruturais que determinam as propriedades desejadas do alimento em questão. As propriedades dos alimentos que contêm tecido vegetal que armazena amido (por exemplo,
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1a grãos, fruto, farinhas) também podem ser influenciadas pelo amido contido nos tecidos vegetais.
O polissacarídeo amido é um polímero de unidades estruturais básicas quimicamente homogêneas, as moléculas de glicose. O que está envolvido aqui, entretanto, é uma mistura muito complexa de formas molecu-
Petição 870170029974, de 05/05/2017, pág. 11/62 lares diferentes, que diferem em relação ao seu grau de polimerização, à ocorrência de ramificações das cadeias de glicose e aos seus comprimentos de cadeia e que podem, além disso, ser modificadas, por exemplo, fosforiladas. O amido, portanto, não é um material bruto. Em particular, a amilose, um polímero essencíalmente nâo ramificado de moléculas de glicose ligadas de forma alfa-1,4-glicosídica, é distinguida da amilopectina, que é uma mistura complexa de cadeias de glicose ramificadas de forma diferente. As ramificações ocorrem aqui como um resultado da ocorrência de ligações alfa-1,6glicosídicas adicionais. Em plantas típicas utilizadas para a produção industrial de amido ou como alimentos, tais como, por exemplo, milho, arroz, trigo ou batatas, o amido sintetizado consiste em aproximadamente 20% - 25% de amilose e até aproximadamente 70% - 75% de amilopectina.
As propriedades funcionais, de fisiologia nutricional ou que conferem estrutura do amido, tais como, por exemplo, a solubilidade, o comportamento de retrogradação, a capacidade de ligação com a água, as propriedades de formação de filmes, a viscosidade, as propriedades de gelatinização, a estabilidade ao congelamento-descongelamento, a estabilidade a ácidos, a resistência do gel, o poder de intumescimento, a capacidade de digestão e o tamanho do grânulo de amido dos amidos são influenciadas, entre outras coisas, pelas características estruturais do amido tais como a proporção de amilose/amilopectina, o peso molecular dos polímeros de glicose, o padrão de distribuição de cadeias laterais, o conteúdo de íons, o conteúdo de lipídeos e de proteínas e/ou a morfologia dos grânulos de amido etc.
Através de processos baseados em cruzamentos, as características estruturais selecionadas do amido e assim também propriedades funcionais, que conferem fisiologia nutricional ou estrutura do amido em células vegetais também podem ser alteradas. Entretanto, isto só é possível atualmente para características estruturais selecionadas do amido (por exemplo, conteúdo de amilopectina/amilose, US 5.300.145). No momento, por exemplo, não é possível influenciar o conteúdo de fosfato no amido vegetal apenas através de medidas de cruzamento.
Uma alternativa para os processos de cruzamento consiste na modificação selecionada de plantas que produzem amido através de métodos de engenharia genética. Um pré-requisito para isso, entretanto, é a identificação e a caracterização das enzimas envolvidas na síntese de amido e/ou na modificação do amido e em sua análise funcional subsequente em plantas transgênicas.
Várias enzimas que catalisam reações diferentes estão envolvidas na síntese do amido em células vegetais. As amido sintases (EC2.4.1.21, ADP-glicose, 1,4-alfa-D-glucano 4-alfa-D-glucosiltransferase) catalisam uma reação de polimerização através de transferência de um radical glicosila de ADP-glicose para alfa-1,4-glucanos, o radical glicosila transferido sendo ligado à alfa-1,4-glucano através da produção de uma ligação alfa-1,4. Em quase todas as plantas investigadas até agora, foi possível em cada caso demonstrar um número de isoformas de amido sintases. As amido sintases podem ser divididas em dois grupos diferentes: amido sintases ligadas a grânulos (GBSS) e amido sintases solúveis (também abreviadas como SS em relação à presente invenção). As amido sintases ligadas a grânulos catalisam a síntese de amilose, enquanto que as amido sintases solúveis estão envolvidas na síntese de amilopectina (Bali e Morell, 2003, Annu. Rev, Plant Biol. 54, 207-233; Teltow e outros, 2004, J. Expt. Bot. 55(406), 2131-2145).
O grupo de amido sintases solúveis possui um número de isoformas que são denominadas na literatura técnica como SSI, SSII, SSIII, SSIV. A atribuição das amido sintases aos grupos individuais (SSI, SSII, SSIII, SSIV) é realizada através de homologias de sequências das sequências de proteínas das respectivas enzimas em questão (Bali e Morell, 2003, Annu. Rev, Plant Biol. 54, 207-233). Cada isoforma individual das amido sintases solúveis é atribuída a uma função específica na síntese do amido de acordo com a doutrina atual. Em plantas dicotiledôneas, até agora foi possível apenas demonstrar uma isoforma de proteínas SSII, enquanto que em muitas plantas monocotiledôneas (por exemplo, milho) foram demonstradas duas classes diferentes de proteínas SSII, que são representadas por SSIIa ou SSIIb. Em plantas monocotiledôneas, SSIIa é expressa preferencialmente no endosperma e SSIIb preferencialmente no tecido foliar (Teltow e outros, 2004, J. Expt. Bot.
55(406), 2131-2145). A função específica, em particular, das amido sintases solúveis individuais na síntese do amido, não está atualmente finalmente esclarecida (Bali e Morell, 2003, Annu. Rev, Plant Biol. 54, 207-233).
As propriedades funcionais, que conferem fisiologia nutricional ou estrutura do amido também são influenciadas pelo conteúdo de fosfato, um componente sem ser de carbono do amido. Uma distinção deve ser feita aqui entre o fosfato que é covalentemente ligado com a molécula de glicose do amido na forma de monoésteres (em relação à presente invenção denominado amido fosfato) e o fosfato na forma de fosfolipídeos associado com o amido.
O conteúdo do amido fosfato varia dependendo do tipo de planta. Por exemplo, certos mutantes de milho sintetizam um amido que possui um maior conteúdo de amido fosfato (milho ceroso a 0,002% e milho com alto teor de amilose a 0,013%), enquanto que os tipos convencionais de milho contêm apenas traços de amido fosfato. Similarmente, quantidades pequenas de amido fosfato são encontradas no trigo (0,001%) enquanto na aveia e no Sorgo não foi possível detectar qualquer amido fosfato. Menos amido fosfato foi similarmente encontrado em mutantes de arroz (arroz ceroso a 0,003%) que em tipos convencionais de arroz (0,013%). Quantidades significativas de amido fosfato foram encontradas em plantas que sintetizam amido armazenado em tubérculos ou raízes tal como, por exemplo, tapioca (0,008%), batata doce (0,011%), araruta (0,021%) ou batata (0,089%). Os valores percentuais para o conteúdo de amido fosfato citado no texto anterior em cada caso referem-se ao peso seco do amido e foram determinados por Jane e outros (1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832).
O amido fosfato pode estar presente na forma de monoésteres na posição C2, C3 ou C6 dos monômeros de glicose polimerizados (Takeda e Hizukuri, 1971, Starch/Stãrke 23, 267-272). A distribuição de fosfato do fosfato no amido sintetizado pelas plantas é distinguido em geral no fato de que aproximadamente 30% até 40% dos radicais de fosfato na posição C3 e aproximadamente 60% até 70% dos radicais de fosfato na posição C6 das moléculas de glicose estão covalentemente ligados (Blennow e outros, 2000,
Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211-218). Blennow e outros (2000, Carbohydrate Polymers 41, 163-174) determinaram um conteúdo de amido fosfato que fica ligado na posição C6 das moléculas de glicose para vários amidos, tais como, por exemplo, amido da batata (entre 7,8 e 33,5 nmols por mg de amido, dependendo do cultivar), amido de várias espécies de Curcuma (entre 1,8 e 63 nmols por mg, dependendo do cultivar), amido da tapioca (2,5 nmols por mg de amido), amido do arroz (1,0 nmol por mg de amido), amido do feijão-da-china (3,5 nmols por mg de amido) e amido do sorgo (0,9 nmol por mg de amido). No amido da cevada e no amido de vários mutantes cerosos de milho, estes autores não foram capazes de detectar qualquer amido fosfato ligado na posição C6. Até agora, não foi possível fazer qualquer conexão entre o genótipo de uma planta e o conteúdo de amido fosfato (Jane e outros, 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832). Portanto, não é possível no momento influenciar o conteúdo de amido fosfato em plantas através de medidas de cruzamento.
Até agora, foram descritas duas proteínas que medeiam a introdução de ligações covalentes de radicais fosfato nas moléculas de glicose do amido. A primeira proteína possui a atividade enzimática de uma alfaglucano-água diquinase (GWD, E.C.: 2.7.9.4) (Ritte e outros, 2002, PNAS 99, 7166-7171), é frequentemente chamada de R1, em particular, na literatura científica mais antiga e é ligada aos grânulos de amido do amido de reserva nos tubérculos de batata (Lorberth e outros, 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477). A segunda proteína descrita na literatura, que catalisa a introdução do amido fosfato no amido, possui a atividade enzimática de uma fosfoglucano-água diquinase (PWD, E.C.: 2.7.9.5) (Kõtting e outros, 2005, Plant Physiol. 137, 2424-252, Baunsgaard e outros, 2005, Plant Journal 41, 595-605).
Uma diferença significativa entre GWD e PWD consiste no fato de que GWD pode utilizar amido não fosforilado como um substrato, isto é, uma fosforilação de novo do amido não fosforilado pode ser catalisada pela GWD, enquanto que a PWD precisa de um amido já fosforilado como um substrato, isto é, introduz adicionalmente fosfato no amido já fosforilado (Kõtting e outros, 2005, Plant Physiol. 137, 2424-252, Baunsgaard e outros, 2005, Plant Journal 41, 595-605). Uma diferença significativa adicional entre GWD e PWD consiste no fato de que a GWD introduz grupos fosfato exclusivamente na posição C6 das moléculas de glicose do amido, enquanto que a PWD fosforila exclusivamente a posição C3 das moléculas de glicose do amido fosforiiado (Ritte e outros, 2006, FEBS Letters 580, 4872-4876).
Na reação catalisada por GWD ou por PWD, os materiais de partida alfa-1,4-glucano (para GWD) ou alfa-1,4-glucano fosforilada (para PWD), trifosfato de adenosina (ATP) e água são reagidos para fornecer os produtos fosfato de glucano (amido fosfato), monofosfato e monofosfato de adenosina (Kõtting e outros, 2005, Plant Physiol. 137, 2424-252, Ritte e outros, 2002, PNAS 99, 7166-7171).
As plantas de trigo que possuem uma maior atividade de proteínas GWD devido à expressão de um gene que codifica GWD da batata são descritas na WO 02 34923. Em comparação com as plantas do tipo selvagem em que não foi possível detectar qualquer amido fosfato, estas plantas sintetizam um amido que contém quantidades significativas de amido fosfato na posição C6 das moléculas de glicose.
A WO 05 2359 descreve a superexpressão de uma GWD da batata em plantas de milho, otimizada em relação aos códons utilizados pelas plantas de milho. Através de 31P RMN, um conteúdo total de fosfato (ligado nas posições C6, C3 e C2 das moléculas de glicose) do amido de milho em questão de 0,0736% de fosfato com base na quantidade de glicose foi determinado. Se um peso molecular de 98 foi considerado como uma base para o fosfato, um conteúdo de fosfato total de aproximadamente 7,5 nmols de fosfato por mg de amido resulta no conteúdo de fosfato total determinado na WO 05 2359 de 0,0736% para o amido isolado das plantas de milho transgênicas.
As plantas que possuem uma maior atividade de uma proteína PWD devido à superexpressão de um gene que codifica PWD de Arabidopsis thaliana são descritas na WO 05 095617. Em comparação às plantas do tipo selvagem não-transformadas correspondentes, estas plantas possuem um maior conteúdo de amido fosfato.
Uma propriedade funcional importante, por exemplo, no processamento de amidos na indústria de alimentos, é o poder de intumescimento. Várias propriedades estruturais dos amidos, tais como a proporção de ami5 lose/amilopectina, o comprimento das cadeias laterais, o peso molecular, o número de ramificações, possuem uma influência sobre o poder de intumescimento dos amidos em questão (Narayana e Moorthy, 2002, Starch/Stárke 54, 559-592).
Pode ser tirada uma informação da literatura científica de que, 10 em adição à proporção de amilose/amilopecíina, a distribuição de cadeias laterais da amilopectina e a distribuição de pesos moleculares dos polímeros de amido, também a quantidade de amido fosfato, possuem uma influência sobre as propriedades funcionais, em particular, sobre o poder de intumescimento do amido (Narayana e Moorthy, 2002, Starch/Stãrke 54, 559-592).
Deve ser enfatizado que em relação ao poder de intumescimento do amido tem que ser feita uma distinção entre o poder de intumescimento em água fria (por exemplo, temperatura ambiente) e o poder de intumescimento em água morna ou quente. Os amidos nativos possuem um poder de intumescimento insignificante, se algum, em água fria, enquanto que os amidos modificados fisicamente (pré-gelatinizados, secos) já são capazes de sofrer intumescimento em água fria. Os processos de produção de amidos que sofrem intumescimento em água fria são descritos, por exemplo, na US 4.280.851. Em relação à presente invenção, o termo poder de intumescimento refere-se ao comportamento do amido em suspensões aquosas mornas/quentes. O poder de intumescimento é determinado de forma padronizada através do aquecimento dos grânulos de amido na presença de um excesso de água, removendo a água não ligada após a centrifugação da suspensão e formando o quociente do peso do resíduo obtido e o peso da quantidade de amido pesada ali. Quando este processo é realizado, com o aquecimento da suspensão de amido as áreas cristalinas dos grânulos de amido são dissolvidas e as moléculas de água são intercaladas nos grânulos de amido, mas sem a estrutura dos próprios grânulos de amido ser destruída ali, isto é, ocorre somente um intumescimento dos grânulos de amido individuais, causado pela absorção de moléculas de água.
Em comparação aos amidos de cereais, os amidos isolados de tubérculos ou tecidos tuberosos possuem um poder de intumescimento em água quente significativamente maior.
Para os amidos da batata isolados de inúmeras variedades, um poder de intumescimento máximo de 74,15 g/g (variedade Kufri Jyoti) foi determinado a 85°C (Singh e outros, 2002, Journal of the Science of Food and Agriculture 82, 1376-1383) de acordo com o método de Leach e outros (1959, Cereal Chemistry 36, 534-544). Takizawa e outros (2004, Brazilian Archives of Biology e Technology 47 (6), 921-931) determinaram um poder de intumescimento de 100 g/g para o amido da batata (90°C, de acordo com o método de Leach e outros (1959, Cereal Chemistry 36, 534-544)). O amido do trigo, isolado de vários cultivares, possui um poder de intumescimento de 16,6 g/g até 26,0 g/g (temperatura: suspensão de AgNO3 a 0,1% aquosa em ebulição) (Yamamori e Quynh, 2000, Theor Appl Genet 100, 23-28). O amido isolado de vários cultivares de cevada sem casca possui um poder de intumescimento de 16,5 g/g ou 19,3 g/g e o amido ceroso ou isento de amilose dos vários cultivares da dita cevada possui um poder de intumescimento de 36,0 g/g até 55,7 g/g (temperatura: AgNO3 a 0,1% aquoso a 70°C, Yasui e outros, 2002, Starch/Stãrke 54, 179-184). Para o amido de milho, foi determinado um poder de intumescimento de 22,3 g/g e para os amidos de milho com alto teor de amilose um poder de intumescimento de 9,6 g/g (Hylon V),
6,1 g/g (Hylon VII) ou 3,9 g/g (LAPS = Amido Com Baixo Teor de Amilopectina (Low AmyloPectin Starch)) (90°C, Shi e outros, 1998, J. Cereal Sei. 27, 289-299). Na US 6.290 9.907, um poder de intumescimento de 35,4 g/g foi indicado para o amido de milho ceroso. Para o amido isolado de vários cultivares de arroz, foi determinado um poder de intumescimento de 26,0 g/g até 33,2 g/g (Sodhi e Singh, 2003, Food Chemistry 80, 99-108) de acordo com o método de Leach e outros (1959, Cereal Chemistry 36, 534-544). Chen e outros (2003, Starch/Stárke 55, 203-212) determinaram um poder de intumescimento de aproximadamente 25 g/g até aproximadamente 49 g/g (95°C, suspensão aquosa) para várias misturas de amidos cerosos do arroz com amidos de arroz com alto teor de amilose. Yasui e outros (2002, Starch/Stárke 54, 179-184) determinaram um poder de intumescimento de 55,7 g/g (medido em água em ebulição em solução de nitrato de prata aquosa a
0,1%) para um amido de arroz isento de amilose.
Através da preparação de derivados de amidos nativos, as propriedades funcionais dos amidos podem ser alteradas. Os amidos de trigo reticulados”, dependendo do grau de reticulação, possuem um poder de intumescimento de 6,8 g/g até 8,9 g/g, os amidos de trigo acetilados possu10 em um poder de intumescimento de no máximo 10,3 g/g e ao mesmo tempo os amidos de trigo reticulados e acetilados possuem um poder de intumescimento de 9,4 g/g, enquanto os amidos não derivatizados correspondentes possuíam um poder de intumescimento de 8,8 g/g (medido a 90°C; Van Hung e Morita, 2005, Starch/Stãrke 57, 413-420).
Para os amidos de arroz cerosos acetilados, foi determinado um poder de intumescimento de aproximadamente 30 g/g e para o amido de arroz ceroso reticulado um poder de intumescimento de aproximadamente 15 g/g, enquanto que o amido de arroz ceroso não derivatizado correspondente tinha um poder de intumescimento de aproximadamente 41 g/g. O a20 mido de arroz acetilado tinha um poder de intumescimento de aproximadamente 20 g/g e o amido de arroz reticulado tinha um poder de intumescimento de aproximadamente 13 g/g, enquanto que o amido de arroz não derivatizado correspondente tinha um poder de intumescimento de aproximadamente 14 g/g (medido a 90°C, Liu e outros, 1999, Starch/Stãrke 52, 249-252). A
US 6.299.907 descreve amidos reticulados, a reação de reticulação sendo realizada após o pré-íntumescimento dos amidos em questão em uma solução de hidróxido/sulfato de sódio. Dependendo do grau de reticulação, para o amido de trigo foi determinado um poder de intumescimento de 6,8 g/g até 7,3 g/g (correspondendo ao amido de trigo não derivatizado 14,7 g/g), para o amido de trigo hidroxipropila um poder de intumescimento de 9,7 g/g (correspondendo ao amido de trigo não derivatizado 22,9 g/g), para o amido de milho reticulado um poder de intumescimento de 5,9 g/g (correspondendo ao amido de milho não derivatizado 16,7 g/g), para o amido de milho ceroso reticulado um poder de intumescimento de 8,3 g/g (correspondendo ao amido de milho ceroso não derivatizado 35,4 g/g) e para o amido de batata reticulado um poder de intumescimento de 6,7 g/g (correspondendo ao amido da batata não derivatizado não foi especificado de forma acurada) (medido a 95°C). Isto resulta do fato de que o poder de intumescimento de amido não pode ser aumentado significativamente, se for de alguma forma possível, através dos métodos de derivatização costumeiros atualmente.
A presente invenção se baseia no objetivo de produzir amidos modificados disponíveis que possuem propriedades funcionais alteradas e células vegetais e plantas que sintetizam um amido que possui propriedades funcionais alteradas e processos e meios para a produção das ditas plantas e/ou células vegetais.
A presente invenção refere-se assim às células vegetais modificadas geneticamente e às plantas modificadas geneticamente que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, em comparação com as células vegetais do tipo selvagem ou as plantas do tipo selvagem não-modificadas geneticamente correspondentes.
Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a uma célula vegetal ou a uma planta que é modificada geneticamente, à modificação genética que leva ao aumento na atividade de pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e ao mesmo tempo ao aumento na atividade de pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, em comparação com as células vegetais do tipo selvagem ou as plantas do tipo selvagem correspondentes que não são modificadas geneticamente.
A modificação genética pode ser aqui qualquer modificação genética que leva a um aumento na atividade de pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e (ao mesmo tempo) pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase nas células vegetais modificadas geneticamente ou nas plantas modificadas geneticamente, em comparação com as células vegetais do tipo selvagem ou as plantas do tipo selvagem correspondentes que não são modificadas geneticamente.
O termo célula vegetal do tipo selvagem significa, em relação à presente invenção, que estas são células vegetais que serviram como um material de partida para a produção das células vegetais de acordo com a invenção, isto é, sua informação genética, além da modificação genética introduzida, corresponde a de uma célula vegetal de acordo com a invenção.
Em relação à presente invenção, o termo planta do tipo selvagem significa que estas são plantas que serviram como um material de partida para a produção das plantas de acordo com a invenção, isto é, sua informação genética, além da modificação genética introduzida, corresponde à de uma planta de acordo com a invenção.
O termo correspondente significa, em relação à presente invenção, que na comparação de um número de artigos, os artigos em questão que estão sendo comparados com outros foram mantidos sob condições idênticas. Em relação à presente invenção, o termo correspondente em associação com uma célula vegetal do tipo selvagem ou uma planta do tipo selvagem significa que as células vegetais ou as plantas que estão sendo comparadas com outras foram cultivadas sob condições de cultura idênticas e que possuem uma idade idêntica (cultivo).
O termo maior atividade de pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II significa aqui, no contexto da presente invenção, um aumento na expressão de genes endógenos que codificam proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase II e/ou um aumento na quantidade de proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase II nas células e/ou um aumento na atividade enzimática de proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase II nas células.
O termo maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase significa aqui, no contexto da presente invenção, um aumento na expressão de genes endógenos que codificam pro12 teínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase e/ou um aumento na quantidade de proteínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase nas células e/ou um aumento na atividade enzimática de proteínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase nas células.
O aumento na expressão pode ser determinado, por exemplo, através da medida da quantidade de produtos da transcrição que codificam proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase II ou que codifi-, cam proteínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase. Isto pode ser realizado, por exemplo, através da análise de Northern blot ou através de RT-PCR. Um aumento na quantidade de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II aqui significa preferencialmente um aumento na quantidade de produtos da transcrição em comparação com células correspondentes que não são modificadas geneticamente em pelo menos 100%, em particular, em pelo menos 125%, preferencialmente em pelo menos 150% e particular e preferencialmente em pelo menos 200%. Um aumento na quantidade de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II também significa que as plantas ou as células vegetais que não contêm quantidades detectáveis de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II contêm, após a modificação genética de acordo com a invenção, quantidades detectáveis de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II.
Um aumento na quantidade de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase significa preferencialmente aqui um aumento na quantidade de produtos da transcrição em comparação com células correspondentes que não são modificadas geneticamente em pelo menos 50%, em particular, em pelo menos 70%, preferencialmente em pelo menos 85% e particular e preferencialmente em pelo menos 100%.
Um aumento na quantidade de produtos da transcrição que codi13 ficam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase também significa que as plantas ou as células vegetais que não contêm quantidades detectáveis de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, após a modificação genética de acordo com a invenção, contêm quantidades detectáveis de produtos da transcrição que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.
O aumento na quantidade de proteína que possui a atividade de uma amido sintase II ou que possui a atividade de uma glucano-água diquinase que possui uma maior atividade destas proteínas nas células vegetais em questão como um resultado, pode ser determinado, por exemplo, através de métodos imunológicos tal como a análise de Western blot, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima) ou RIA (radioimunoensaio). Um aumento na quantidade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II significa preferencialmente aqui um aumento na quantidade da proteína em questão em comparação com as células correspondentes que não são modificadas geneticamente em pelo menos 100%, em particular, em pelo menos 125%, preferencialmente em pelo menos 150% e particular e preferencialmente em pelo menos 200%. Um aumento na quantidade de proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase II significa também que plantas ou células vegetais que não contêm quantidades detectáveis de proteína que possui a atividade de uma amido sintase H contêm, após a modificação genética de acordo com a invenção, uma quantidade detectável de proteína que possui a atividade de uma amido sintase II.
Um aumento na quantidade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase significa preferencialmente aqui um aumento na quantidade da proteína em questão em comparação com as células correspondentes que não são modificadas geneticamente, em pelo menos 50%, em particular em pelo menos 70%, preferencialmente em pelo menos 85% e particular e preferencialmente em pelo menos 100%.
Um aumento na quantidade de proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase significa ainda que as plantas ou as células vegetais que não contêm quantidades detectáveis de proteínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase contêm, após a modificação genética de acordo com a invenção, uma quantidade detectável de proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.
Os métodos para a produção de anticorpos que reagem especificamente com uma certa proteína, isto é, que se ligam especificamente com a dita proteína, são conhecidos pelos versado na técnica (vide, por exemplo, Lottspeich e Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik [Bioanalytics], Spektrum akad. Velag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4). A produção de anticorpos deste tipo é oferecida como um serviço por contrato por algumas firmas (por exemplo, Eurogentec, Bélgica). Os anticorpos com os quais um aumento na quantidade de proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase pode ser detectado através de métodos imunológicos são descritos em Lorberth e outros (1998, Nature Biotechnology 16, 473-477) e Ritte e outros (2000, Plant Journal 21, 387-391). Os anticorpos com os quais um aumento na quantidade de proteína que possui a atividade de uma amido sintase II pode ser determinado através de métodos imunológicos são descritos em
Walter (Untersuchungen der Expression und Funktion der Stârkesynthase II (SS II) aus Weizen (Tríticum aestivum) [Investigations of the expression and function of amido sintase II (SS II) from wbeat (Triticum aestivum)], dissertação na faculdade de Biologia da University of Hamburg, ISBN 3-8265-82128).
A quantidade de atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase pode ser detectada, por exemplo, como descrito na literatura (Mikkelsen e outros, 2004, Biochemica, Journal 377, 525-532; Ritte e outros, 2002, PNAS 99, 7166-7171).
A quantidade de atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II pode ser determinada, por exemplo, como descrito na literatura (Nishi e outros, 2001, Plant Physiology 127, 459-472). Um método preferido para a determinação da quantidade de atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II é descrito sob o item 9 dos métodos gerais.
Preferencialmente, as células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de acordo com a invenção possuem uma atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, que é aumentada pelo menos 6 vezes, preferencialmente pelo menos 7 vezes, particular e preferencialmente pelo menos 8 vezes, especialmente preferencialmente pelo menos 9 vezes e muito especialmente preferencialmente pelo menos 10 vezes, em comparação com células vegetais do tipo selvagem ou plantas do tipo selvagem correspondentes que não foram modificadas geneticamente.
As proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase II (ADP-glicose-1,4-alfa-D-glucano-4-alfa-D-glucosil transferase; EC 2.4.1.21) possuem uma sequência de certos domínios em sua estrutura. No terminal N, possuem um peptídeo sinal para transporte nos plastídeos. Na direção do terminal N para a terminação C segue uma região N-terminal e um domínio catalítico. (Li e outros, 2003, Funct Integr Genomics 3, 76-85). Análises adicionais, baseadas nas comparações de sequências de aminoácidos (http.y/hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN) de várias proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase II mostraram que estas proteínas possuem três domínios específicos. Na sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6, os aminoácidos 322 até 351 representam o domínio 1, os aminoácidos 423 até 462 representam o domínio 2 e nos aminoácidos 641 até 705 representam o domínio 3. O domínio 1 é codificado pelos nucleotídeos 1190 até 1279, o domínio 2 é codificado pelos nucleotídeos 1493 até 1612 e o domínio 3 é codificado pelos nucleotídeos 2147 até 2350 da sequência de ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 5.
Em relação à presente invenção, o termo proteína que possui a atividade de uma amido sintase II deve ser entendido como significando uma proteína que catalisa uma reação de glicosilação em que moléculas de glicose do substrato ADP-glicose são transferidas para cadeias de glucano ligadas por alfa-1,4 com a formação de uma ligação de alfa-1,4 (ADP-glicose + {(1,4)-alfa-D-glucosil} (N) <=> ADP + {(1,4)-alfa-D-glucosil) (N+1)), em que a sequência de aminoácidos da proteína que possui a atividade de uma pro16 teína de uma amido sintase II possui uma identidade de pelo menos 86%, preferencialmente pelo menos 93%, particular e preferencialmente pelo menos 95% com os aminoácidos 322 até 351 (domínio 1) da sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6 e possui uma identidade de pelo menos 83%, preferencialmente pelo menos 86%, particular e preferencialmente pelo menos 95% com os aminoácidos 423 até 462 (domínio 2) da sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6 e possui uma identidade de pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 82%, preferencialmente 86%, particular e preferencialmente 98%, em particular preferencialmente de pelo menos 95% com os aminoácidos 641 até 705 (domínio 3) da sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6.
As sequências de ácidos nucleicos e as sequências de aminoácidos que correspondem às mesmas, que possuem a dita identidade com os domínios 1, 2 e 3 e codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, são conhecidas pelos versado na técnica e são publicadas, por exemplo, sob o No de Acesso AY133249 (Hordeum vulgaré), No de Acesso AY133248 (Aegilops tauschii), Nos de Acesso XP467757, AAK64284 (Oryza sativa), AAK81729 (Oryza sativa), Nos de Acesso AAD13341, AAS77569, No AAD13342 (Zea Mays), No de Acesso AAF13168 (Manihot eculenta), No de Acesso BAD18846 (Phaseolus vulgaris), No de Acesso CAA61241 (Solanum tuberosum), No de Acesso CAA61269 (Pisum sativum), No de Acesso AAC19119 (Ipomea batatas), No de Acesso AAF26156 (Arabidopsis thaliana), No de Acesso A A P41030 (Colocasia esculenta), No de Acesso AAS 88880 (Ostraeococcus tauri) ou No de Acesso AAC17970 (Chlamydomonas reinhardii). As sequências de ácidos nucleicos e as sequências de aminoácidos mencionadas que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II podem ser acessadas através do
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) e são expressamente incluídas na descrição do presente pedido de patente através da menção das referências.
No contexto da presente invenção, o termo proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase deve ser entendido como signi17 ficando uma proteína que transfere um resíduo de beta-fosfato de ATP para o amido. Os amidos isolados de folhas de um mutante sex1-3 de Arabidopsis thaliana não possuem quantidades detectáveis de radicais fosfato ligados de forma covalente, mas são fosforilados por uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase. Isto é, o amido não fosforilado, por exemplo, isolado de folhas de um mutante sex1-3de Arabidopsis thaliana, é utilizado como um substrato em uma reação de fosforilação catalisada por uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.
O radical beta-fosfato do ATP é transferido de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase para o amido e o radical gama-fosfato do ATP é transferido para a água. O AMP (monofosfato de adenosina) resulta como um produto de reação adicional. Uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é, portanto, também denominada [alfa-1,4-glucano]-água diquinase ou uma amido-água diquinase (EC: 2.7.9.4; Ritte e outros, 2002, PNAS 99, 7166-7171). Na fosforilação do amido catalisado por uma proteína que possui a atividade de uma glucanoágua diquinase, ligações de monoéster de fosfato adicionais resultam exclusivamente na posição C6 das moléculas de glicose (Ritte e outros, 2006, FEBS Letters 580, 4872-4876). Na catálise da reação de fosforilação de um amido por uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, uma proteína fosforilada em que o radical beta-fosfato do ATP é ligado covalentemente a um aminoácido da proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase resulta como um intermediário (Ritte e outros, 2002, PNAS 99, 7166-7171). O intermediário resulta através da autofosforilação da proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, isto é, a proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase por si só catalisa a reação que leva ao intermediário. As sequências de aminoácidos que codificam as proteínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase contêm um domínio de fosfo-histidina. Os domínios de fosfohistidina são descritos, por exemplo, em Tien-Shin Yu e outros (2001, Plant Cell 13, 1907-1918). Na autofosforilação de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, um radical de histidina no domínio de fosfo-histidina da sequência de aminoácidos que codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é fosforilado (Mikkelsen e outros, 2004, Biochemical Journal 377, 525-532). Na sequência de proteína de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase de Solanum tuberosum mostrada sob a SEQ ID NO 2, os aminoácidos 1064 até 1075 são os domínios de fosfo-histidina. Se o radical de histidina conservado (na sequência de proteína do aminoácido 1069 mostrada, por exemplo, sob a SEQ ID NO 2) dos domínios de fosfo-histidina for substituído por um outro aminoácido, a autofosforilação e assim também a fosforilação de glucanos pela proteína que sofreu mutagênese não ocorrerão mais (Mikkelsen e outros, 2004, Biochemical Journal 377, 525-532). Além disso, uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é distinguida pelo fato de que possui um domínio de ligação ao nucleotídeo C-terminal que é incluído na sequência de aminoácidos dos aminoácidos 1121 até 1464 mostrada, por exemplo, sob a SEQ ID NO 2. Uma deleção do domínio de ligação ao nucleotídeo leva à inativação de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase (Mikkelsen e Blennow, 2005, Biochemical
Journal 385, 355-361). No terminal N, as proteínas que possuem a atividade de uma glucano-água diquinase contêm um domínio de ligação a carboidratos (CBM) que é incluído na sequência de aminoácidos dos aminoácidos 78 até 362 mostrada sob a SEQ ID NO 2. Os domínios de ligação a carboidratos são distinguidos, inter alia, pelo fato de que sua sequência de aminoácidos contém resíduos de triptofano conservados. Se estes resíduos de aminoácidos conservados forem substituídos por outro aminoácido, os domínios de ligação a carboidratos perdem sua capacidade de se ligar às glucanos. Por exemplo, a substituição dos aminoácidos W139 ou W194 na sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 2 leva a uma perda da função deste domínio de ligação a carboidrato. Se o domínio de ligação a carboidrato de uma glucano-água diquinase for deletado (por exemplo, uma deleção dos aminoácidos 1 até 362, quando os aminoácidos 1 até 77 na sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 2 constituem um peptídeo sinal plastídico), isto não leva, entretanto, à inativação da atividade da fosforilação da enzima (Mikkelsen e outros, 2006, Biochemistry 45, 4674-4682).
As sequências de ácidos nucléicos e as sequências de aminoácidos que correspondem a estas, que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, são descritas de espécies diferentes, tais como, por exemplo, batata (WO 97 11188, GenBank Acc.: AY027522, Y09533), trigo (WO 00 77229, US 6.462.256, GenBank Acc.: AAN93923, GenBank Acc.: AR236165), arroz (GenBank Acc.: AAR61445, GenBank Acc.: AR400814), milho (GenBank Acc.: AAR61444, GenBank Acc.: AR400813), soja (GenBank Acc.: AAR61446, GenBank Acc.: AR400815), Curcuma longa (SEQ ID NO 3), frutas cítricas (GenBank Acc.: AY094062), Arabidopsis (GenBank Acc.: AF312027) e a alga verde Ostreococcus tauri (GenBank Acc.: AY570720.1). As sequências de ácidos nucléicos e as sequências de aminoácidos mencionadas que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase são publicadas, inter alia, pelo NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) e são expressamente incluídas na descrição do presente pedido de patente através da menção das referências.
Uma modalidade adicional da presente invenção refere-se a uma célula vegetal modificada geneticamente de acordo com a invenção ou a uma planta modificada geneticamente de acordo com a invenção, em que a modificação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucléico estranha no genoma da célula vegetal ou no genoma da planta.
Nesta associação, o termo modificação genética significa a introdução de moléculas de ácidos nucléicos estranhas homólogas e/ou heterólogas no genoma de uma célula vegetal ou no genoma de uma planta, onde a dita introdução destas moléculas leva ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II.
Através da introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha, as células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de acordo com a invenção são alteradas em relação a sua informação genética. A presença ou a expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucléico estranha leva a uma alteração fenotípica. Alteração fenotípica significa preferencialmente aqui uma alteração mensurável de uma ou mais funções das células. Por exemplo, as células vegetais modificadas geneticamente de acordo com a invenção e as plantas modificadas geneticamente de acordo com a invenção, por causa da presença ou no caso da expressão de moléculas de ácidos nucléicos estranhas introduzidas, exibem um aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e um aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II.
O termo molécula de ácido nucléico estranha é entendido em relação à presente invenção como significando uma molécula do tipo que não ocorre naturalmente nas células vegetais do tipo selvagem correspondentes ou que não ocorre naturalmente nas células vegetais do tipo selvagem no arranjo espacial real ou que fica localizada em um sítio do genoma da célula vegetal do tipo selvagem em que não ocorre naturalmente. Preferencialmente, a molécula de ácido nucléico estranha é uma molécula recombinante que consiste em vários elementos cuja combinação ou arranjo espacial específico não ocorre naturalmente nas células vegetais.
Em princípio, uma molécula de ácido nucléico estranha pode ser qualquer molécula de ácido nucléico desejada que causa um aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II na célula vegetal ou na planta.
O termo molécula de ácido nucléico recombinante deve ser entendido em relação à presente invenção como significando uma molécula de ácido nucléico que contém moléculas de ácidos nucléicos diferentes que não estão naturalmente presentes em uma combinação como está presente em uma molécula de ácido nucléico recombinante. Assim, as moléculas de ácidos nucléicos recombinantes, por exemplo, em adição às moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e/ou uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, podem conter sequências de ácidos nucléicos adicionais que não estão naturalmente presentes em combinação com as moléculas de ácidos nucléicos mencionadas. As sequências de ácidos nucléicos adicionais mencionadas, que estão presentes em uma molécula de ácido nucleico recombinante em combinação com a molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase ou uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, podem ser aqui quaisquer sequências desejadas. Estas podem ser, por exemplo, sequências genônicas e/ou de ácidos nucléicos de plantas. Preferencialmente, as sequências de ácidos nucléicos adicionais mencionadas são sequência reguladoras (promotores, sinais de término, intensificadores), particular e preferencialmente sequências reguladoras que são ativas em tecido vegetal, em particular, preferencialmente sequências reguladoras específicas ao tecido que são ativas em tecido vegetal. Os métodos para a produção de moléculas de ácidos nucléicos recombinantes são conhecidos pelos versado na técnica e compreendem métodos de engenharia genética, tal como, por exemplo, a associação de moléculas de ácidos nucléicos através da ligação, da recombinação genética ou da síntese de novo de moléculas de ácidos nucléicos (vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3a edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel e outros, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5a edição (2002), ISBN: 0471250929).
O termo genoma deve ser entendido em relação à presente invenção como significando a totalidade do material hereditário presente em uma célula vegetal. É sabido pelos versado na técnica que em adição ao núcleo da célula outros compartimentos (por exemplo, plastídeos, mitocôndrias) também contêm material hereditário.
Em uma modalidade adicional, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção são caracterizadas pelo fato de que pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codi22 fica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase. Preferencialmente, as moléculas de ácidos nucléicos estranhas que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase são as moléculas de ácidos nucléicos já mencionadas e conhecidas pelos versado na técnica provenientes de várias espécies de plantas, particular e preferencialmente moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase da batata ou de Curcuma longa, em particular, preferencialmente uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase que possui a sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 2 ou que é codificada pela sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO 1.
As sequências mostradas sob a SEQ ID NO 3 e a SEQ ID NO 4 não foram publicadas até agora. As células vegetais ou as plantas, em particular, células vegetais de arroz ou plantas de arroz, que contêm uma molécula de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano água diquinase de Curcuma longa, são distinguidas pelo fato de que sintetizam um amido que possui um conteúdo de amido fosfato maior que o das células vegetais ou das plantas que contêm uma molécula de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase de outra espécie (por exemplo, batata).
A presente invenção refere-se ainda, portanto, a moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, escolhidas do grupo que consiste em
a) moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteína que possui a sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 4;
b) moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteína cuja sequência de aminoácidos contém pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 93%, preferencialmente pelo menos 96% e em particular preferencialmente pelo menos 99% da sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID
NO 4;
c) moléculas de ácidos nucleicos que compreendem a sequência de ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 3 ou uma sequência complementar;
d) moléculas de ácidos nucleicos que possuem uma identidade com a sequência de ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 3 de pelo menos 90%, preferencialmente de pelo menos 93%, preferencialmente de pelo menos 96% e em particular preferencialmente de pelo menos 99%,
e) moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam sob condições estringentes com pelo menos um filamento das moléculas de ácidos nucleicos descritas sob a) ou c);
f) moléculas de ácidos nucleicos cuja sequência de nucleotídeos, por causa da degeneração do código genético, difere da sequência das moléculas de ácidos nucleicos mencionada sob a) ou c);
g) moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos, variações alélicas e/ou derivados das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas sob a), b), c), d), e) ou f),
h) moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a), b), c), d), e), f) ou g), que estão ligadas a elementos reguladores (promotores) que iniciam a transcrição nas células vegetais ou
i) moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com h), em que os promotores são promotores específicos ao tecido, particular e preferencialmente promotores que iniciam a transcrição, especificamente nas células de endosperma vegetal.
Além disso, a presente invenção refere-se a plasmídeos, vetores e células vegetais ou plantas que contêm uma molécula de ácido nucleico estranha de acordo com a invenção.
Em uma modalidade adicional, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção são caracterizadas pelo fato de que pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II. Preferencialmente, as moléculas de ácidos nucleicos estranhas que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II são as moléculas de ácidos nucleicos já mencionadas conhecidas pelos versado na técnica provenientes de várias espécies de plantas, particular e preferencialmente moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II do trigo, em particular, preferencialmente uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II que possui a sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6 ou que é codificada pela sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO 5.
Em uma modalidade adicional, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção são caracterizadas pelo fato de que uma primeira molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e uma segunda molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II.
As moléculas de ácidos nucleicos estranhas introduzidas para a modificação genética nas células vegetais ou nas plantas podem ser uma molécula de ácido nucleico individual ou um número de moléculas de ácidos nucleicos. Estas podem, portanto, ser tanto moléculas de ácidos nucleicos que contêm sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e sequências de ácidos nucleicos que codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II quanto podem ser moléculas de ácidos nucleicos em que as sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e as sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II estão presentes em moléculas de ácidos nucleicos diferentes. As sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e as sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II po25 dem estar contidas simultaneamente, por exemplo, em um vetor, um plasmídeo ou moléculas de ácidos nucleicos presentes na forma linear ou outros constituintes de dois vetores, plasmídeos ou moléculas de ácidos nucleicos lineares em cada caso separadas das outras.
Se as sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e as sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II estiverem presentes em duas moléculas de ácidos nucleicos que estão separadas uma das outras, podem então ser introduzidas no genoma da célula vegetal ou da planta ao mesmo tempo (“co-transformação) ou ainda em sucessão, isto é, uma após a outra cronologicamente (supertransformação). As moléculas de ácidos nucleicos separadas uma da outra podem também ser introduzidas em células vegetais ou plantas diferentes de uma espécie. Podem assim ser produzidas células vegetais ou plantas nas quais a atividade de pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase ou de outra maneira pelo menos uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II é aumentada. As plantas de acordo com a invenção podem então ser produzidas através do cruzamento subsequente das plantas, em que a atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é aumentada, com aquelas em que a atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II é maior.
Além disso, para a introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha ao invés de uma célula vegetal do tipo selvagem ou de uma planta do tipo selvagem, é utilizada uma célula mutante ou um mutante que é distinguido pelo fato de que já possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase ou uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II. Os mutantes podem ser tanto mutantes que ocorrem espontaneamente (naturalmente) quanto aqueles que foram produzidos através do uso seletivo de agentes mutagênicos (tais como, por exemplo, agentes químicos, radiação ionizante) ou processos de engenharia genética (por exemplo, marcação com ativação de T-DNA, marcação com ativação de transposon, ativação in situ, mutagênese in vivo).
As células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de acordo com a invenção podem, portanto, ser também produzidas através da introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha que leva ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase em uma célula mutante ou um mutante que já possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase li. As células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de acordo com a invenção também podem ser produzidas através da introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha que leva ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II em uma célula mutante ou um mutante que já possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.
As células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de acordo com a invenção também podem ser produzidas através do cruzamento de um mutante, em que a atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é menor, com uma planta que devido à introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II. Similarmente, é possível produzir células vegetais de acordo com a invenção ou plantas de acordo com a invenção através do cruzamento de um mutante, em que a atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II é maior, com uma planta que devido à introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.
As plantas de acordo com a invenção também podem ser produzidas através do cruzamento um mutante, em que a atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II é maior, com um mutante em que a atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucanoágua diquinase é maior.
Um grande número de técnicas está disponível para a introdu27 ção de DNA em uma célula hospedeira vegetal. Estas técnicas incluem a transformação de células vegetais com T-DNA utilizando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agentes de transformação, a fusão de protoplastos, a injeção, a eletroporação de DNA, a introdução do DNA através da abordagem de biolística e possibilidades adicionais.
O uso da transformação mediada por agrobactérias de células vegetais foi intensivamente investigado e descrito, inter alia, na patente EP 120516; Hoekema, (Em: The Binary Plant Vector System Offsetdruckkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Capítulo V; Fraley e outros, Crit. Rev. Plant Sei. 4, 1-46) e em An e outros (1985, EMBO J. 4, 277-287). Para a transformação da batata, vide, por exemplo, Rocha-Sosa e outros (1989, EMBO J. 29-33).
A transformação de plantas monocotiledôneas através de vetores baseada na transformação com Agrobacterium também foi descrita (1993, Chan e outros, Plant Mol. Biol. 22, 491-506; Hiei e outros, 1994, Plant
J. 6, 271-282; Deng e outros, 1990, Science in China 33, 28-34; Wilmink e outros, 1992, Plant Cell Reports 11, 76-80; May e outros, 1995, Bio/ Technology 13, 486-492; Conner e Domisse, 1992, Int. J. Plant Sei. 153, 550-555; Ritchie e outros, 1993, Transgenic Res. 2, 252-265). Os métodos alternativos para a transformação de plantas monocotiledôneas são a transformação através da abordagem de biolística (Wan e Lemaux, 1994, Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil e outros, 1993, Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala e outros, 1994, Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer e outros, 1990, Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), a transformação de protoplastos, a eletroporação de células parcialmente permeabilizadas ou a incorporação do DNA através de fibras de vidro. A transformação do milho, em particular, é descrita repetidamente na literatura (cf., por exemplo, WO95/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm e outros, 1990, Biotechnology 8, 833-844; Gordon-Kamm e outros, 1990, Plant Cell 2, 603-618; Koziel e outros, 1993, Biotechnology 11, 194-200; Moroc e outros, 1990, Theor. Appl. Genet. 80, 721-726).
A transformação bem sucedida de outras espécies de cereais também já foi descrita, por exemplo, para a cevada (Wan e Lemaux, vide acima; Ritala e outros, vide acima; Krens e outros, 1982, Nature 296, 72-74) e para o trigo (Nehra e outros, 1994, Plant J. 5, 285-297; Becker e outros, 1994, Plant Journal 5, 299-307). Todos os métodos anteriores são adequados no contexto da presente invenção.
As células vegetais e as plantas que são modificadas geneticamente através da introdução de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e/ou de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II podem ser distinguidas das células vegetais do tipo selvagem ou das plantas do tipo selvagem, inter alia, em virtude do fato de que possuem pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha que não ocorre naturalmente nas células vegetais do tipo selvagem ou nas plantas do tipo selvagem ou em virtude do fato de que uma molécula deste tipo está presente integrada em um sítio no genoma da célula vegetal de acordo com a invenção ou no genoma da planta de acordo com a invenção, em que não ocorre nas células vegetais do tipo selvagem ou nas plantas do tipo selvagem, isto é, em um outro ambiente genômico. Além disso, tais células vegetais de acordo com a invenção e plantas de acordo com a invenção podem ser distinguidas das células vegetais do tipo selvagem ou das plantas do tipo selvagem em virtude do fato de que contêm pelo menos uma cópia da molécula de ácido nucleico estranha integrada de forma estável em seu genoma, opcional e adicionalmente a cópias que ocorrem naturalmente de uma molécula deste tipo nas células vegetais do tipo selvagem ou nas plantas do tipo selvagem. Se a(s) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) estranha(s) introduzida(s) nas células vegetais de acordo com a invenção ou nas plantas de acordo com a invenção for(em) cópias adicionais de moléculas que já ocorrem naturalmente nas células vegetais do tipo selvagem ou nas plantas do tipo selvagem, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção podem ser distinguidas das células vegetais do tipo selvagem ou das plantas do tipo selvagem, em particular, em virtude do fato de que esta(s) cópia(s) adicional(is) fica(m) localizada(s) em sítios no genoma em que não ocorreria(m) em células vegetais do tipo selvagem ou em plantas do tipo selvagem. Isto pode ser verificado, por exemplo, com o auxílio de uma análise de Southern blot.
Além disso, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção podem ser distinguidas das células vegetais do tipo selvagem ou das plantas do tipo selvagem preferencialmente em pelo menos uma das características a seguir: se uma molécula de ácido nucleico estranha introduzida for heteróloga em relação à célula vegetal ou às plantas, as células vegetais de acordo com a invenção ou as plantas de acordo com a invenção contêm produtos da transcrição das moléculas de ácidos nucleicos introduzidas. Estes podem ser detectados, por exemplo, através da análise de Northern blot ou através de RT-PCR (Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Inversa). Preferencialmente, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção contêm uma proteína que é codificada por uma molécula de ácido nucleico introduzida. Esta pode ser detectada, por exemplo, através de métodos imunológicos, em particular, através de uma análise de Western blot.
Se uma molécula de ácido nucleico estranha introduzida for homóloga em relação à célula vegetal ou às plantas, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção podem ser distinguidas das células vegetais do tipo selvagem ou das plantas do tipo selvagem, por exemplo, por causa da expressão adicional das moléculas de ácidos nucleicos estranhas introduzidas. As células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção contêm preferencialmente os produtos da transcrição das moléculas de ácidos nucleicos estranhas. Estes podem ser detectados, por exemplo, através da análise de Northern blot ou com o auxílio da RT-PCR quantitativa.
As plantas de acordo com a invenção podem, em princípio, ser plantas de qualquer espécie de planta desejada, isto é, tanto plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas. Preferencialmente, são plantas úteis, isto é, plantas que são cultivadas por seres humanos com a finalidade de nutrição ou com finalidades técnicas, em particular, industruais.
Em uma modalidade adicional, a planta de acordo com a inven30 ção é uma planta que armazena amido.
O termo planta que armazena amido em relação à presente invenção signfica todas as plantas que possuem partes da planta que contêm um armazenamento de amido, tais como, por exemplo, milho, arroz, trigo, centeio, aveia, cevada, mandioca, batata, sagu, cará, feijão-da-china, ervilha, Sorgo, batata doce.
Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a plantas monocotiledôneas que armazenam amido de acordo com a invenção, em particular, preferencialmente plantas da família (sistemática) Poaceae. Particular e preferencialmente, estas são plantas de arroz, milho ou trigo.
O termo planta de trigo em relação à presente invenção significa espécies de plantas do gênero Triticum ou plantas que são produzidas partindo de cruzamentos com plantas do gênero Triticum, particularmente espécies de plantas do gênero Triticum cultivadas com finalidades comerciais na agricultura ou plantas que são produzidas partindo de cruzamentos com plantas do gênero Triticum·, Triticum aestivum é preferida em particular.
O termo planta de milho em relação à presente invenção significa espécies de plantas do gênero Zea, particularmente espécies de plantas do gênero Zea cultivadas com finalidades comerciais na agricultura, particular e preferencialmente Zea mais.
O termo plantas de arroz em relação à presente invenção significa espécies de plantas do gênero Oryza, particularmente espécies de plantas do gênero Oryza cultivadas com finalidades comerciais na agricultura, particular e preferencialmente Oryza sativa.
Em uma modalidade adicional, as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção são células vegetais transgênicas ou plantas transgênicas.
As células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção sintetizam um amido modificado em comparação com o amido isolado de células vegetais do tipo selvagem ou de plantas do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamente.
Um objetivo adicional da presente invenção refere-se, portanto, às células vegetais de acordo com a invenção ou às plantas de acordo com a invenção que sintetizam um amido modificado em comparação com o amido isolado das células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes ou isolado das plantas do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes.
A invenção refere-se ainda a plantas modificadas geneticamente que contêm células vegetais de acordo com a invenção. Tais plantas podem ser produzidas partindo de células vegetais de acordo com a invenção através da regeneração.
A presente invenção refere-se ainda ao material de propagação das plantas de acordo com a invenção, que compreende uma célula vegetal de acordo com a invenção.
O termo material de propagação compreende aqui quaisquer constituintes das plantas que são adequados para a produção de descendentes de uma maneira vegetativa ou sexual. Para a propagação vegetativa, por exemplo, cortes, culturas de calos, rizomas ou tubérculos são adequados. Outro material de propagação compreende, por exemplo, fruto, sementes, mudas, protoplastos, culturas de células etc. Particular e preferencialmente, o material de propagação é constituído de sementes contendo endosperma (grãos).
Em uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se às partes vegetais que podem ser colhidas das plantas de acordo com a invenção, tal como fruto, raízes de armazenamento, raízes, flores, brotos, ramos ou caules, preferencialmente sementes, grânulos ou tubérculos, estas partes que podem ser colhidas contendo células vegetais de acordo com a invenção.
O amido que é sintetizado partindo das células vegetais de acordo com a invenção ou das plantas de acordo com a invenção é distinguido, em comparação com o amido isolado das células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes ou em comparação com o amido isolado das plantas do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes, em particular, pelo fato de que possui um maior poder de intumescimento em água quente.
Além disso, a presente invenção refere-se ainda a um processo para a produção de uma planta modificada geneticamente, em que
a) uma célula vegetal é modificada geneticamente, a modificação genética compreendendo as etapas i e ii a seguir em qualquer sequência desejada, individualmente ou simultaneamente
i) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes, ii) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes
b) uma planta é regenerada partindo das células vegetais da etapa a);
c) opcionalmente plantas adicionais são produzidas com o auxílio das plantas de acordo com a etapa b) em que as células vegetais são opcionalmente isoladas das plantas de acordo com a etapa b) ou c) e as etapas a) até c) do processo são repetidas até que seja produzida uma planta que contenha uma molécula de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e uma molécula de ácido nucleico estranha que codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.
Em uma modalidade preferida, o processo de acordo com a invenção para a preparação de uma planta modificada geneticamente compreende as etapas a seguir:
a) uma célula vegetal é modificada geneticamente, a modificação genética compreendendo as etapas i e ii a seguir em qualquer sequência desejada ou quaisquer combinações desejadas das etapas i e ii a seguir sendo realizadas indi5 vidualmente ou simultaneamente
i) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes ii) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes
b) uma planta é regenerada partindo das células vegetais que compreendem a modificação genética de acordo com as etapas
i) a)i ii) a) ii iii) a) i e a) ii,
c) em células vegetais de plantas de acordo com a etapa
i) b) i uma modificação genética de acordo com a etapa
a) ii, ii) b) ii uma modificação genética de acordo com a etapa a) i, é introduzida e uma planta é regenerada
d) opcionalmente plantas adicionais são produzidas com o auxílio das plantas obtidas de acordo com uma das etapas b) iii ou c) i ou c) ii.
Isto se aplica para as modificações genéticas introduzidas na célula vegetal de acordo com a etapa a) que são, em princípio, qualquer tipo de modificação que leva ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II e/ou que leva ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase.
A regeneração das plantas de acordo com a etapa B) e opcionalmente a etapa c) do processo de acordo com a invenção podem ser realizados de acordo com os métodos conhecidos pelos versado na técnica (descritos, por exemplo, em Plant Cell Culture Protocols, 1999, edt. by R. D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2).
A produção de plantas adicionais (dependendo dos processos de acordo com a etapa c) ou com a etapa d)) do processo de acordo com a invenção pode ser realizada, por exemplo, através da propagação vegetativa (por exemplo, através de mudas, tubérculos ou através de cultura de calos e da regeneração de plantas inteiras) ou através da propagação sexual. A propagação sexual ocorre preferencialmente aqui de uma maneira controlada, isto é, plantas selecionadas que possuem certas propriedades são cruzadas com outra e propagadas. A escolha é preferencialmente realizada a20 qui de tal maneira que as plantas adicionais (que são produzidas de acordo com processos de acordo com a etapa c) ou com a etapa d)) compreendem as modificações introduzidas nas etapas anteriores.
Nos processos de acordo com a invenção para a produção de plantas modificadas geneticamente, as modificações genéticas para a pro25 dução das células vegetais modificadas geneticamente de acordo com a invenção podem ser realizadas simultaneamente ou em etapas uma após a . outra. Não é importante aqui o fato de que, para modificações genéticas sucessivas que levam a uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II, é utilizado o mesmo método que o para a modificação genética que leva a uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase.
Em uma modalidade preferida do processo de acordo com a in35 venção para a produção de uma planta modificada geneticamente, uma etapa b)-1 do processo vem a seguir da etapa b) em que são selecionadas plantas que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II de acordo com a etapa a) i e/ou que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase de acordo com a etapa a) ii. As plantas selecionadas são então utilizadas para as etapas adicionais do processo.
Preferencialmente, são selecionadas aqui plantas que contêm a modificação genética de acordo com a etapa a) i e que possuem um aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, que é maior pelo menos 6 vezes, preferencialmente pelo menos 7 vezes, particular e preferencialmente pelo menos 8 vezes, em particular, preferencialmente pelo menos 9 vezes e muito particular e preferencialmente pelo menos 10 vezes, em comparação com as plantas do tipo selvagem nãomodificadas geneticamente correspondentes.
Preferencialmente, são selecionadas aqui plantas que contêm a modificação genética de acordo com a etapa a) ii e que sintetizam um amido que possuí um conteúdo de amido fosfato que é maior pelo menos 4 vezes, particular e preferencialmente pelo menos 5 vezes, em particular preferencialmente pelo menos 6 vezes, em comparação com as plantas do tipo selvagem não-modificadas geneticamente correspondentes.
Em uma modalidade adicional do processo de acordo com a invenção para a produção de uma planta modificada geneticamente, a modificação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucléico estranha no genoma da célula vegetal, na presença ou na expressão da molécula de ácido nucleico/moléculas de ácidos nucléicos estranhas que levam a uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II e/ou a uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase na célula.
Em uma modalidade adicional do processo de acordo com a invenção para a produção de uma planta modificada geneticamente, a modifi36 cação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha no genoma da célula vegetal, a molécula de ácido nucleico/moléculas de ácidos nucleicos estranhas compreendendo uma sequência que codifica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II e/ou uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase.
Em uma modalidade adicional do processo de acordo com a invenção para a produção de uma planta modificada geneticamente de acordo com a invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase de batata, trigo, arroz, milho, soja, frutas cítricas, Curcuma ou Arabidopsis. Preferencialmente, pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase de Curcuma longa ou de batata, particular e preferencialmente de batata e, em particular, preferencialmente uma proteína que possui a sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6 ou que é codificada pela sequência de ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 5. As referências para as sequências de ácidos nucleicos que codificam as proteínas e que possuem a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase das plantas mencionadas já são indicadas adicionalmente anteriormente.
Em uma modalidade adicional do processo de acordo com a invenção para a produção de uma planta modificada geneticamente de acordo com a invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II de cevada, Aegilops, arroz, milho, mandioca, feijão, batata, ervilha, batata doce, Arabidopsis, cará, Ostreococcus ou Chlamydomonas. Preferencialmente, pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II do trigo. As referências para as sequências de ácidos nucleicos que codificam as proteínas mencionadas que possuem a atividade enzimática de uma amido sintase II das plantas mencionadas já são indicadas adicional e anteriormente.
Como já descrito anteriormente para as moléculas de ácidos nui cleicos estranhas incorporadas em uma célula vegetal ou uma planta para modificação genética, a etapa a) do processo de acordo com a invenção para a produção de uma planta modificada geneticamente pode envolver uma molécula de ácido nucléico individual ou um número de moléculas de ácidos nucléicos. As moléculas de ácidos nucléicos estranhas que codificam uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II ou que codificam uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucanoágua diquinase podem assim estar presentes juntas em uma única molécula de ácido nucléico ou podem estar presentes em moléculas de ácidos nucleicos separadas. Se as moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II e que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase estiverem presentes em moléculas de ácidos nucléicos separadas, estas moléculas de ácidos nucléicos podem ser introduzidas em uma célula vegetal simultaneamente ou em etapas sucessivas.
Além disso, para a introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha durante a implementação dos processos de acordo com a invenção, ao invés de uma célula vegetal do tipo selvagem ou uma planta do tipo selvagem, pode ser utilizada uma célula mutante ou um mutante que é distinguido pelo fato de que já possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II ou uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase. As afirmações feitas adicional e anteriormente sobre o uso de mutantes para a produção de células vegetais ou de plantas de acordo com a invenção devem ser utilizadas aqui de forma correspondente.
Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a processos de acordo com a invenção para a produção de uma planta modificada geneticamente, em que a molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II é selecionada do grupo que consiste em
a) moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteína que possui a sequência de aminoácidos sob a SEQ ID NO
6;
b) moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, cuja sequência de aminoácidos possui pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, particular e preferencialmente pelo menos 95% e mais preferencialmente de pelo menos 98% da sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 6;
c) moléculas de ácidos nucléicos que compreendem a sequência de ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 5 ou uma sequência complementar;
d) moléculas de ácidos nucléicos que possuem uma identidade de pelo menos 70%, preferencialmente de pelo menos 80%, preferencialmente de pelo menos 90%, em particular preferencialmente de pelo menos 95% e mais preferencialmente de pelo menos 98% em relação às sequências de ácidos nucléicos descritas sob c),
e) moléculas de ácidos nucléicos que se hibridizam sob condições estringentes com pelo menos um filamento das moléculas de ácidos nucléicos descritas sob a) ou c);
f) moléculas de ácidos nucléicos cuja sequência de nucleotídeos difere da sequência das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas sob a) ou c) por causa da degeneração do código genético;
g) moléculas de ácidos nucléicos que são fragmentos, variações alélicas e/ou derivados das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas sob a), b), c), d), e) ou f),
h) moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, em que as sequências de ácidos nucléicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II estão ligadas a elementos reguladores (promotores) que iniciam a transcrição nas células vegetais ou
i) moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com h), em que os promotores são promotores específicos ao tecido, particular e preferencialmente promotores que iniciam a transcrição, especificamente em células de endosperma de plantas.
Em uma modalidade preferida adicional, a presente invenção referese a processos de acordo com a invenção para a produção de uma planta modificada geneticamente, em que a molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase é selecionada do grupo que consiste em
a) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 4;
b) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase e cuja sequência possui uma identidade de pelo menos 70%, preferencialmente de pelo menos 80%, preferencialmente de pelo menos 90%, em particular preferencialmente de pelo menos 95% e most preferencialmente de pelo menos 98% em relação à sequência de aminoácidos mostrada sob a SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 4;
c) moléculas de ácidos nucleicos que compreendem a sequência de ácido nucleico mostrada sob a SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 3 ou uma sequência complementar;
d) moléculas de ácidos nucleicos que possuem uma identidade de pelo menos 70%, preferencialmente de pelo menos 80%, preferencialmente de pelo menos 90%, em particular preferencialmente de pelo menos 95% e mais preferencialmente de pelo menos 98% em relação às sequências de ácidos nucleicos descritas sob c),
e) moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam sob con40 dições estringentes com pelo menos um filamento das moléculas de ácidos nucleicos descritas sob a) ou c);
f) moléculas de ácidos nucleicos cuja sequência de nucleotídeos difere da sequência das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas sob a) ou c) por causa da degeneração do código genético;
g) moléculas de ácidos nucleicos que são fragmentos, variações alélicas e/ou derivados das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas sob a), b), c), d), e) ou f),
h) moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, em que as sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase estão ligadas a elementos reguladores (promotores) que iniciam a transcrição em células vegetais ou
i) moléculas de ácidos nucleicos, de acordo com h), em que os promotores são promotores específicos ao tecido, particular e preferencialmente promotores que iniciam a transcrição, especificamente em células de endosperma de plantas.
O termo identidade deve ser entendido em relação à presente invenção como significando o número de aminoácidos/nucleotídeos idênticos (identidade) com outras proteínas/ácidos nucleicos, expresso em porcentagem. Preferencialmente, a identidade em relação a uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II é determinada através de comparações da sequência de aminoácidos indicada sob a SEQ ID NO 6 e a identidade em relação a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II é determinada através de comparações da sequência de ácido nucleico indicada sob a SEQ ID NO 5 e a ídentidade em relação a uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é determinada através de comparações da sequência de aminoácidos indicada sob a SEQ ID NO 2 ou SEQ ID NO 4 ou a identidade em relação a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase é determinada através de comparações da sequência de ácido nucleico indicada sob a SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 3 com outras proteínas/ácidos nucleicos com o auxílio de programas de computador. Se as sequências que estão sendo comparadas com outra tiverem comprimentos diferentes, a identidade deve ser determinada de forma que o número de aminoácidos/nucleotídeos que a sequência mais curta possui em comum com a sequência mais longa determine a proporção percentual da identidade. Preferencialmente, a identidade é determinada através do programa de computador ClustalW que é conhecido e está disponível ao público (Thompson e outros, Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). O ClustalW é disponibilizado publicamente por Julie Thompson (Thompson® EMBL.Heidelberg.DE) e Toby Gibson (Gibson@ EMBL.Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Alemanha. O ClustalW pode ser similarmente baixado (“downloaded) de vários sites da Internet, interalia, no IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, B. P. 163, 67404 lllkirch Cedex, França; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) e no EBI (ftp://ftp.ebi. ac.uk/pub/software/) e em todos os sites de Internet mirrored do EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB 10 1SD, Reino Unido).
Preferencialmente, o programa de computador ClustalW da versão 1.8 é utilizado com a finalidade de determinar a identidade entre proteínas descritas no contexto da presente invenção e outras proteínas. Os parâmetros a seguir devem ser ajustados aqui: KTUPLE=1, TOPDIAG=5, WIND0W=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.
Preferencialmente, o programa de computador ClustalW da versão 1.8 é utilizado com a finalidade de determinar a identidade entre, por exemplo, a sequência de nucleotídeos das moléculas de ácidos nucleicos descritas no contexto da presente invenção e a sequência de nucleotídeos de outras moléculas de ácidos nucleicos. Os parâmetros a seguir devem ser ajustados aqui: KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIXJUB, GAPOPEN=tO, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: unweighted (TRANSIÇÕES: não pesadas).
Identidade significa ainda que há equivalências funcionais e/ou estruturais entre as moléculas de ácidos nucléicos em questão ou as proteínas codificadas pelas mesmas. As moléculas de ácidos nucléicos que são homólogas às moléculas descritas anteriormente e que são derivadas destas moléculas são geralmente variações destas moléculas que são modificações que exercem a mesma função biológica. Podem ser aqui variações que ocorrem naturalmente, por exemplo, sequências de outras espécies ou mutações, em que estas mutações podem ter ocorrido naturalmente ou que foram introduzidas através de mutagênese seletiva. Ainda, as variações podem ser sequências preparadas de forma sintética. No caso das variações alélicas, estas podem ser tanto variações que ocorrem naturalmente quanto variações que são preparadas de forma sintética ou produzidas através de técnicas do DNA recombinante. Uma forma especial de derivados é constituída, por exemplo, de moléculas de ácidos nucléicos que, por causa da degeneração do código genético, diferem das moléculas de ácidos nucléicos descritas no contexto da presente invenção.
O termo hibridização no contexto da presente invenção significa hibridização sob condições convencionais de hibridização, preferencialmente sob condições estringentes, como descrito, por exemplo, em Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773). Particular e preferencialmente, hibridizar significa a hibridização sob as condições a seguir:
tampão de hibridização:
2xSSC; solução 10xDenhardt (Ficoll 400+PEG+BSA; porporção 1:1:1); 0,1 % de SDS; 5 mM de EDTA; 50 mM de Na2HPO4; 250 pg/mL de DNA de esperma de arenque; 50 pg/mL de tRNA; ou 25 M de tampão fosfato de sódio pH 7,2; 1 mM de EDTA; 7% de SDS temperatura de hibridização:
T=65 até 68°C tampão de lavagem: 0,1xSSC; 0,1% de SDS temperatura de lavagem: T=65 até 68°C.
As moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam com as moléculas mencionadas podem ser isoladas, por exemplo, de bibliotecas genômicas ou de cDNA. A identificação e o isolamento de tais moléculas de ácidos nucleicos podem ser realizados aqui utilizando as moléculas de ácidos nucleicos mencionadas ou partes destas moléculas ou os complementos inversos destas moléculas, por exemplo, através da hibridização de acordo com processos padronizados ou por amplificação através da PCR.
Como uma sonda de hibridização para o isolamento de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II ou que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, é possível utilizar, por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos que contêm exatamente ou que contêm essencialmente a sequência de nucleotídeos indicada sob a SEQ ID NO 5 (amido sintase II) ou sob a SEQ ,D NO 1 ou SEQ ID NO 3 (glucano-água diquinase) ou partes destas sequências. Os fragmentos utilizados como uma sonda de hibridização podem ser fragmentos ou oligonucleotídeos sintéticos que foram produzidos com o auxílio de técnicas de síntese costumeiras e cuja sequência concorda essencialmente com a de uma molécula de ácido nucleico descrita no contexto da presente invenção. Se os genes que se hibridizam com as sequências de ácidos nucleicos descritas no contexto da presente invenção forem identificados e isolados, deve ser realizada uma determinação da sequência e uma análise das propriedades das proteínas codificadas por esta sequência com a finalidade de determinar se são proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase II ou a atividade de uma glucano-água diquinase.
As moléculas que se hibridizam com as moléculas de ácidos nucleicos descritas no contexto da presente invenção, em particular, incluem fragmentos, derivados e variações alélicas das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas. O termo derivado em relação à presente invenção significa que as sequências destas moléculas diferem das sequências das molé44 cuias de ácidos nucléicos descritas anteriormente em uma ou mais posições e possuem um grau alto de identidade em relação a estas sequências. As diferenças em relação às moléculas de ácidos nucléicos descritas anteriormente podem resultar aqui, por exemplo, da deleção, da adição, da substituição, da inserção ou da recombinação.
Para a expressão de moléculas de ácidos nucléicos de acordo com a invenção que codificam uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e/ou uma proteína que possui a atividade de uma glucanoágua diquinase, estas são preferencialmente ligadas a sequências de DNA reguladoras que garantem a transcrição em células vegetais. Estas, em particular, incluem promotores. Geralmente, quaisquer promotores ativos nas células vegetais são adequados para expressão.
O promotor pode ser escolhido aqui de forma que a expressão ocorra de forma constitutiva ou apenas em um certo tecido, em um certo momento no desenvolvimento da planta ou em um momento determinado por influências externas. Tanto em relação à planta quanto em relação à molécula de ácido nucleico, o promotor pode ser homólogo ou heterólogo.
Os promotores adequados são, por exemplo, o promotor do RNA 35S do vírus mosaico da couve-flor e o promotor da ubiquitina do milho, o promotor do gene da actina-1 do arroz (McElroy e outros, 1990, Plant Cell 2(2), 163-171), o promotor de histona do milho (WO 99 34005) para expressão constitutiva, o promotor B33 de Patatingen (Rocha-Sosa e outros, EMBO J. 8 (1989), 23-29) para expressão específica ao tubérculo nas batatas ou um promotor que garante a expressão apenas em tecidos fotossinteticamente ativos, por exemplo, o promotor ST-LS1 (Stockhaus e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus e outros, EMBO J. 8 (1989) 2445-2451) ou para uma expressão específica ao endosperma o promotor HMG do trigo, o promotor USP, o promotor da faseolina, os promotores dos genes da zeína do milho (Pedersen e outros, Cell 29 (1982), 10151026; Quatroccio e outros, Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93), um promotor da glutelina (Leisy e outros, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng e outros, Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara e outros, FEBS Lett. 383 (1996),
213-218), um promotor da globulina (Nakase e outros, 1996, Gene 170(2), 223-226), um promotor da prolamina (Qu e Takaiwa, 2004, Plant Biotechnology Journal 2(2), 113-125) ou um promotor Shrunken-1 (Werr e outros, EMBO J. 4 (1985), 1373-1380). Entretanto, também podem ser utilizados promotores que são ativados apenas em um momento determinado por influências externas (vide, por exemplo, WO 9307279). Podem ser tembém de interesse os promotores de proteínas de choque térmico que permitem uma indução simples. Além disso, podem ser utilizados os promotores específicos à semente, tal como, por exemplo, o promotor USP de Vicia faba, que garante a expressão específica à semente em Vicia faba e outras plantas (Fiedler e outros, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bãumíein e outros, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467).
Além disso, pode estar presente uma sequência de término (sinal de poliadenilação) que serve para a adição de uma cauda poli-A no produto da transcrição. É atribuída à cauda poli-A uma função na estabilização dos produtos da transcrição. Tais elementos são descritos na literatura (cf. Gielen e outros, EMBO J. 8 (1989), 23-29) e podem ser substituídos arbitrariamente.
As sequências intrônicas entre o promotor e a região codificadora também podem estar presentes. As sequências intrônicas deste tipo podem levar à estabilidade de expressão e à maior expressão em plantas (Callis e outros, 1987 Genes Devei. 1, 1183-1200; Luehrsen e Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier e outros, 1997; Plant Journal. 12(4): 895-899; Rose e Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil e outros, 1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; Xu e outros, 2003, Science in China Series C Vol. 46 Ns 6, 561-569). As sequências intrônicas adequadas são, por exemplo, o primeiro íntron do gene sh1 do milho, o primeiro íntron do gene 1 da poli-ubiquitina do milho, o primeiro íntron do gene EPSPS do arroz, o primeiro íntron do gene da actína-1 do arroz (McElroy e outros, 1990, Plant Cell 2(2), 163-171) ou um dos dois primeiros íntrons do gene PAT1 de Arabidopsis.
Uma modalidade adicional da presente invenção refere-se a um processo para a produção de uma planta modificada geneticamente de acordo com a invenção, em que
a) uma célula vegetal é modificada geneticamente, a modificação genética levando ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes;
b) uma planta é regenerada partindo das células vegetais da etapa a);
c) opcionalmente plantas adicionais são produzidas com o auxílio das plantas de acordo com a etapa b) e
d) as plantas obtidas de acordo com a etapa b) ou c) são cruzadas com uma planta que possui um aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucanoágua diquinase, em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes.
Uma modalidade adicional da presente invenção refere-se a um processo para a produção de uma planta modificada geneticamente de acordo com a invenção, em que
a) uma célula vegetal é modificada geneticamente, a modificação genética levando ao aumento na atividade enzimática de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes;
b) uma planta é regenerada partindo das células vegetais da etapa a);
c) opcionalmente plantas adicionais são produzidas com o auxílio da planta de acordo com a etapa b) e
d) as plantas obtidas de acordo com a etapa b) ou c) são cruzadas com uma planta que possui um aumento na ativida47 de enzimática de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes.
Nos dois últimos processos mencionados para a produção de uma planta modificada geneticamente, as plantas de acordo com a etapa a) podem ser modificadas geneticamente como já descrito anteriormente. A regeneração de plantas de acordo com a etapa b) e a produção de plantas adicionais de acordo com a etapa c) já foram similarmente mostradas adicionalmente acima.
Uma planta que é cruzada de acordo com a etapa d) das duas últimas modalidades mencionadas com plantas ou descendentes das plantas obtidas da etapa b) ou c) pode ser qualquer planta que possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II ou uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, em comparação com plantas do tipo selvagem correspondentes. O aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II ou de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase pode ser produzido através de qualquer modificação que leve a um aumento na atividade das proteínas em questão nas plantas correspondentes. Estas plantas podem ser mutantes ou plantas modificadas através de métodos de engenharia genética. Os mutantes podem ser mutantes que ocorrem espontaneamente (naturalmente) e também aqueles que foram produzidos através do uso seletivo de agentes mutagênicos (tais como, por exemplo, agentes químicos, radiação ionizante) ou processos de engenharia genética (por exemplo, marcação com ativação de transposon, marcação com ativação de T-DNA, mutagênese in vivo). Preferencialmente, as plantas produzidas através dos processos de engenharia genética são mutantes produzidos através da mutagênese de inserção, particular e preferencialmente plantas modificadas geneticamente que expressam uma molécula de ácido nucleico estranha, em particular, preferencialmente plantas modificadas geneticamente nas quais a molécula de ácido nucleico estranha codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II ou uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.
Preferencialmente, para o cruzamento nos dois últimos processos mencionados de acordo com a invenção, são utilizadas plantas que possuem uma atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, que é aumentada em pelo menos 6 vezes, preferencialmente em pelo menos 7 vezes, particular e preferencialmente em pelo menos 8 vezes, em particular preferencialmente em pelo menos 9 vezes e muito particular e preferencialmente em pelo menos 10 vezes, em comparação com plantas do tipo selvagem não-modificadas geneticamente correspondentes.
Em relação a plantas que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, para o cruzamento nos dois últimos processos mencionados de acordo com a invenção são preferencialmente utilizadas plantas que sintetizam um amido que possui um conteúdo de amido fosfato que é aumentado pelo menos 4 vezes, particular e preferencialmente pelo menos 5 vezes, em particular preferencialmente pelo menos 6 vezes, em comparação com plantas do tipo selvagem não-modificadas geneticamente correspondentes.
Em uma modalidade preferida, os processos de acordo com a invenção para a produção de uma planta modificada geneticamente são utilizados para a produção de plantas de acordo com a invenção ou de plantas que possuem propriedades de plantas de acordo com a invenção.
A presente invenção refere-se ainda às plantas que podem ser obtidas através dos processos de acordo com a invenção.
Foi descoberto de forma surpreendentemente que as células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase sintetizam um amido modificado. Em particular, o fato de que o amido sintetizado pelas células vegetais de acordo com a invenção ou pelas plantas de acordo com a invenção possui um maior poder de intumescimento em água quente, era surpreendente. O maior poder de intumescimento em água quente de amidos que podem ser isolados de células vegetais de acordo com a invenção e de plantas de acordo com a invenção confere propriedades aos amidos que os tornam mais adequados para certas aplicações que os amidos convencionais. Se o amido for empregado, por exemplo, como um agente espessante, o maior poder de intumescimento em água quente do amido leva a claramente menos amido que deve ser empregado para atingir um poder de espessamento idêntico. Isto tem o resultado de que, por exemplo, o conteúdo de calorias dos alimentos espessados com amido é reduzido.
Um objetivo adicional da presente invenção refere-se ao amido modificado que possui um maior poder de intumescimento em água quente. Particular e preferencialmente, o poder de intumescimento em água quente do amido modificado de acordo com a invenção é aumentado pelo menos no fator de 2, em particular pelo menos no fator de 3 e muito particular e preferencialmente pelo menos no fator de 4, em comparação com o amido isolado de células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes ou isolado de plantas do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes.
Os métodos para a determinação .do poder de intumescimento em água quente são conhecidos pelos versado na técnica e descritos na literatura (por exemplo, Leach e outros, 1959, Cereal Chemistry 36, 534544). Um método que será utilizado preferencialmente em relação à presente invenção para a determinação do poder de intumescimento em água quente é descrito sob os métodos gerais, item 1.
Preferencialmente, a presente invenção refere-se ao amido modificado que possui um poder de intumescimento em água quente de pelo menos 110 g/g, preferencialmente de pelo menos 115 g/g, particular e preferencíalmente de pelo menos 120 g/g e, em particular, preferencialmente de pelo menos 125 g/g. Preferencialmente, o amido modificado possui um poder de intumescimento em água quente de no máximo 350 g/g, particular e preferencialmente de no máximo 300 g/g, em particular preferencialmente de no máximo 250 g/g e especiaimente preferencialmente de no máximo 200 g/g.
Um objetivo adicional da presente invenção refere-se ao amido modificado isolado de uma célula vegetal monocotiledônea ou de uma planta monocotiledônea, que possui um poder de intumescimento em água quente de pelo menos 60 g/g, preferencialmente de pelo menos 75 g/g, particular e preferencialmente de pelo menos 90 g/g, em particular, preferencialmente de pelo menos 105 g/g e especialmente preferencialmente de pelo menos 120 g/g. Preferencialmente, o amido modificado isolado de uma célula vegetal monocotiledônea ou uma planta monocotiledônea possui um poder de intumescimento em água quente de no máximo 250 g/g, particular e preferencialmente de no máximo 200 g/g, em particular, preferencialmente de no máximo 175 g/g e especialmente preferencialmente de no máximo 150 g/g.
Um objetivo adicional da presente invenção refere-se ao amido modificado isolado de células vegetais de arroz ou de plantas de arroz, que possui um poder de intumescimento em água quente de pelo menos 65 g g/g, preferencialmente de pelo menos 80 g/g, particular e preferencialmente de pelo menos 100 g/g, em particular, preferencialmente de pelo menos 115 g/g e especialmente preferencialmente de pelo menos 125 g/g. Preferencialmente, o amido modificado isolado de uma célula vegetal de arroz ou de uma planta de arroz possui um poder de intumescimento em água quente de no máximo 250 g/g, particular e preferencialmente de no máximo 200 g/g, em particular, preferencialmente de no máximo 175 g/g e especialmente preferencialmente de no máximo 150 g/g.
Um objetivo preferido adicional da presente invenção refere-se ao amido modificado isolado de células vegetais de milho ou de plantas de milho, que possui um poder de intumescimento em água quente de pelo menos 40 g/g, preferencialmente de pelo menos 42 g/g, mais preferencialmente de pelo menos 45 g/g e mais preferencialmente de pelo menos 55 g/g.
Um objetivo preferido adicional da presente invenção refere-se ao amido modificado isolado de células vegetais de trigo ou de plantas de trigo, que possui um poder de intumescimento em água quente de pelo menos 35 g/g, preferencialmente de pelo menos 50 g/g.
O amido sintetizado partindo de células vegetais modificadas geneticamente de acordo com a invenção ou de plantas modificadas geneticamente de acordo com a invenção possui preferencialmente um maior conteúdo de amido fosfato. O conteúdo de amido fosfato do amido isolado de células vegetais de acordo com a invenção ou de plantas de acordo com a invenção é distintivamente maior aqui que o conteúdo de amido fosfato que seria esperado após o cruzamento partindo da soma do conteúdo de fosfato das plantas parentais em questão.
Um objetivo preferido da presente invenção refere-se, portanto, ao amido modificado de acordo com a invenção que possui um maior conteúdo de amido fosfato, em comparação com o amido isolado de células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes ou de plantas do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes. Preferencialmente, o conteúdo de amido fosfato do amido de acordo com a invenção é aumentado pelo menos 10 vezes, particular e preferencialmente pelo menos 15 vezes, em particular, preferencialmente pelo menos 20 vezes e muito particular e preferencialmente pelo menos 25 vezes, em comparação com o amido isolado de células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes ou isolado de plantas do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes.
Preferencialmente, o amido modificado de acordo com a invenção possui pelo menos 10 vezes mais, particular e preferencialmente pelo menos 15 vezes mais, em particular, preferencialmente pelo menos 20 vezes mais e muito particular e preferencialmente pelo menos 25 vezes mais amido fosfato na posição C6 das moléculas de glicose do amido que o amido isolado das células vegetais do tipo selvagem correspondentes ou isolado de plantas do tipo selvagem correspondentes.
A quantidade do amido fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose pode ser determinada utilizando os métodos conhecidos pelos versado na técnica, tal como, por exemplo, de forma fotométrica através de um teste enzimático acoplado ou através de 31P-RMN de acordo com o método descrito em Kasemusuwan e Jane (1996, Cereal Chemistry 73, 70252
707). Preferencialmente, em relação à presente invenção a quantidade de amido fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose é determinada utilizando o método descrito sob os métodos gerais, item 2.
Um objetivo preferido adicional da presente invenção refere-se ao amido modificado de acordo com a invenção, que foi isolado de uma célula vegetal monocotiledônea ou de uma planta monocotiledônea e possui um conteúdo de amido fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose do amido de pelo menos 11 nmols por mg de amido, particular e preferencialmente de pelo menos 12 nmols por mg de amido. Em particular, este amido modificado de acordo com a invenção é preferencialmente amido de milho, arroz ou trigo.
Em uma modalidade adicional da presente invenção, os amidos modificados de acordo com a invenção são amidos nativos.
O termo amido nativo em relação à presente invenção significa que o amido é isolado de plantas de acordo com a invenção, de partes das plantas que podem ser colhidas de acordo com a invenção, de partes de armazenamento de amido de acordo com a invenção ou de material de propagação de plantas de acordo com a invenção de acordo com métodos conhecidos pelos versado na técnica.
A presente invenção refere-se ainda ao amido modificado de acordo com a invenção, que pode ser obtido das células vegetais de acordo com a invenção ou das plantas de acordo com a invenção, do material de propagação de acordo com a invenção ou de partes da planta que podem ser colhidas de acordo com a invenção ou que pode ser obtido de plantas que foram produzidas utilizando um processo de acordo com a invenção para a produção de uma planta modificada geneticamente.
A presente invenção refere-se ainda a células vegetais ou a plantas que sintetizam um amido modificado de acordo com a invenção.
A presente invenção refere-se ainda a um processo para a produção de um amido modificado, que compreende a etapa de extração do amido de uma célula vegetal de acordo com a invenção ou de uma planta de acordo com a invenção, do material de propagação de acordo com a inven53 ção de uma planta deste tipo e/ou de partes da planta que podem ser colhidas de tal planta de acordo com a invenção, preferencialmente de partes que armazenam amido de tal planta de acordo com a invenção. Preferencialmente, um processo deste tipo também compreende a etapa da colheita das plantas cultivadas ou de partes da planta e/ou do material de propagação destas plantas antes da extração do amido e particular e preferencialmente, além disso, a etapa do cultivo das plantas de acordo com a invenção antes da colheita.
Os processos para a extração do amido das plantas ou das par10 tes que armazenam amido das plantas são conhecidos pelos versados na técnica. Além disso, os processos para a extração do amido de várias plantas que armazenam amido são descritos, por exemplo, em Starch: Chemistry and Technology (ed.: Whistler, BeMiller e Paschall (1994), 2a edição, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; vide, por exemplo, capí15 tulo XII, page 412-468: Com and Sorgo Starches: Production; por Watson; capítulo XIII, página 469-479: Tapioca, Arrowroot and Sago Starches: Production; por Corbishley e Miller; capítulo XIV, página 479-490; Potato Starch: Production and Uses; por Mitch; capítulo XV, página 491 até 506; Wheat Starch: Production, Modification and Uses; por Knight e Oson; e capítulo
XVI, página 507 até 528: Rice Starch: Production and Uses; por Rohmer e Klem; Corn Starch: Eckhoff e outros, Cereal Chem. 73 (1996), 54-57, a extração do amido de milho na escala industrial é geralmente conseguida através da moagem úmida. Os dispositivos que são comumente utilizados nos processos para a extração de amido partindo de material vegetal são sepa25 radores, decantadores, hidrociclones, secadores em spray e secadores em leito fluidizado.
O termo partes que armazenam amido deve ser entendido em relação à presente invenção como significando as partes de uma planta em que o amido, ao contrário do amido transitório das folhas, é armazenado na forma de um depósito para a sobrevivência perene de períodos de tempo mais longos. As partes das plantas preferidas que armazenam amido são, por exemplo, tubérculos, raízes de armazenamento e grãos, os grãos com54 preendendo um endosperma são particularmente preferidos, os grãos compreendendo um endosperma de plantas de milho, arroz ou trigo são, em particular, preferidos.
Em uma modalidade preferida, os processos de acordo com a invenção para a produção de um amido modificado são utilizados para a produção de um amido de acordo com a invenção.
A presente invenção refere-se similarmente ao amido modificado, que pode ser obtido através de um processo de acordo com a invenção para a produção de amido modificado.
A presente invenção refere-se, além disso, ao uso de células vegetais de acordo com a invenção ou de plantas de acordo com a invenção para a produção de um amido modificado.
É conhecido pelos versados na técnica que as propriedades do amido podem ser alteradas, por exemplo, através da derivatização térmica, química, enzimática ou mecânica. Os amidos derivatizados são particularmente adequados para várias aplicações na área de alimentos e/ou sem ser de alimentos. Os amidos de acordo com a invenção são melhor adequados como uma substância de partida para a produção de amidos derivatizados que os amidos convencionais, uma vez que possuem um conteúdo maior de grupos funcionais reativos, por exemplo, devido ao maior conteúdo de amido fosfato. Além disso, as derivatizações podem ser realizadas a temperaturas mais altas por causa do maior poder de intumescimento em água quente dos amidos de acordo com a invenção, sem destruir significativamente a estrutura do grânulo de amido no curso das mesmas.
A presente invenção refere-se, portanto, ainda a processos para a produção de um amido derivatizado, em que o amido modificado de acordo com a invenção é subsequentemente derivatizado.
O termo amido derivatizado deve ser entendido em relação à presente invenção como significando um amido modificado de acordo com a invenção, cujas propriedades após o isolamento das células vegetais foram alteradas com o auxílio de processos químicos, enzimáticos, térmicos ou mecânicos.
Em uma modalidade adicional da presente invenção, o amido derivatizado de acordo com a invenção é o amido tratado com calor e/ou com ácido.
Em uma modalidade adicional, os amidos derivatizados são éteres de amido, em particular, éteres de alquil amido, éteres de O-alila, éteres de hidroxialquila, éteres de O-carboxilmetila, éteres de amido contendo nitrogênio, éteres de amido contendo fosfato ou éteres de amido contendo enxofre.
Em uma modalidade adicional, os amidos derivatizados são amidos reticulados.
Em uma modalidade adicional, os amidos derivatizados são polímeros com enxerto de amido.
Em uma modalidade adicional, os amidos derivatizados são amidos oxidados.
Em uma modalidade adicional, os amidos derivatizados são ésteres de amido, em particular, ésteres de amido que foram introduzidos no amido utilizando ácidos orgânicos. Os amidos derivatizados são particular e preferencialmente amidos fosfato, nitrato, sulfato, xantato, acetato ou citrato.
Os amidos derivatizados de acordo com a invenção são adequados para vários usos na indústria farmacêutica e no campo de alimentos e/ou sem ser de alimentos. Os métodos para a produção de amidos derivatizados de acordo com a invenção são conhecidos pelos versado na técnica e são descritos adequadamente na literatura geral. Um sumário da produção de amidos derivatizados é encontrado, por exemplo, em Orthoefer (em Corn, Chemistry and Technology, 1987, eds. Watson e Ramstad, capítulo 16, 479499).
A presente invenção refere-se similarmente ao amido derivatizado que pode ser obtido através do processo de acordo com a invenção para a produção de um amido derivatizado.
A presente invenção refere-se ainda ao uso de amidos modificados de acordo com a invenção para a produção de amido derivatizado.
As partes que armazenam amido de plantas são frequentemente processadas para produzir farinhas. Os exemplos de partes de plantas das quais as farinhas podem ser produzidas são, por exemplo, tubérculos de plantas de batata e grãos de plantas que produzem grãos. Para a produção de farinhas partindo de plantas de cereais, os grãos contendo endosperma destas plantas são moídos e peneirados. O amido é um constituinte principal do endosperma. Em outras plantas que não contêm endosperma, mas outras partes que armazenam amido, tais como, por exemplo, tubérculos ou raízes, a farinha é frequentemente produzida através da fragmentação, da secagem e da moagem subsequente dos órgãos de armazenamento em questão. O amido do endosperma ou contido nas partes que armazenam amido das plantas constitui uma parte essencial da farinha que é produzida partindo das partes da planta em questão. As propriedades das farinhas são, portanto, também influenciadas pelo amido presente na farinha em questão. As células vegetais de acordo com a invenção e as plantas de acordo com a invenção sintetizam um amido alterado em comparação com as células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamente ou as plantas do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes. As farinhas produzidas partindo das células vegetais de acordo com a invenção, das plantas de acordo com a invenção, do material de propagação de acordo com a invenção ou das partes que podem ser colhidas de acordo com a invenção possuem, portanto, propriedades alteradas. As propriedades das farinhas também podem ser influenciadas pela mistura do amido com farinhas ou pela mistura das farinhas que possuem propriedades diferentes.
Um objetivo adicional da presente invenção refere-se, portanto, a farinhas que compreendem um amido de acordo com a invenção.
Um objetivo adicional da presente invenção refere-se a farinhas que podem ser produzidas partindo de células vegetais de acordo com a invenção, de plantas de acordo com a invenção, de partes que armazenam amido de plantas de acordo com a invenção, de material de propagação de acordo com a invenção ou de partes de plantas que podem ser colhidas de acordo com a invenção. As partes que armazenam amido de plantas preferidas de acordo com a invenção para a produção de farinhas são tubérculos, raízes de armazenamento e grãos contendo um endosperma. Em relação à presente invenção, os grãos de plantas da família (sistemática) Poaceae são particularmente preferidos, grãos de plantas de milho, arroz ou trigo são, em particular, preferidos.
O termo farinha deve ser entendido em relação à presente invenção como significando um pó obtido através da moagem de partes das plantas. Opcionalmente, as partes das plantas são secas antes da moagem e da trituração e/ou peneiradas após a moagem.
As farinhas de acordo com a invenção são distinguidas com base no amido de acordo com a invenção presente nas mesmas, em virtude do fato de que possuem um conteúdo alterado de fosfato e/ou um maior poder de intumescimento em água quente. Isto é desejado, por exemplo, no processamento de farinhas na indústria de alimentos para muitas aplicações, em particular, na produção de produtos de panificação.
Um objetivo preferido da presente invenção refere-se a farinhas produzidas partindo de grãos de uma planta monocotiledônea, que possuem um poder de intumescimento em água quente de pelo menos 28 g/g, preferencialmente de pelo menos 33 g/g, particular e preferencialmente de pelo menos 38 g/g e, em particular, preferencialmente de pelo menos 43 g/g.
A determinação do poder de intumescimento em água quente de farinhas é realizada aqui de forma análoga ao método já descrito para a determinação do poder de intumescimento em água quente de amido, com a diferença de que as farinhas são empregadas aqui ao invés do amido. Um método preferido para a determinação do poder de intumescimento em água quente de farinhas é descrito sob os métodos gerais, item 1.
Um objeto adicional da presente invenção é um processo para a produção de farinhas, que compreende a etapa da moagem de células vegetais de acordo com a invenção, de plantas de acordo com a invenção, de partes de plantas de acordo com a invenção, de partes que armazenam amido de plantas de acordo com a invenção, de material de propagação de acordo com a invenção ou de material que pode ser colhido de acordo com a invenção.
As farinhas podem ser produzidas através da moagem das partes que armazenam amido de plantas de acordo com a invenção. É conhecido pelos versados na técnica como produzir farinhas. Preferencialmente, um processo para a produção de farinhas inclui ainda a etapa da colheita das plantas cultivadas ou de partes da planta e/ou do material de propagação ou das partes de armazenamento de amido destas plantas antes da moagem e particular e preferencialmente, além disso, a etapa do cultivo de plantas de acordo com a invenção antes da colheita.
Em uma modalidade adicional da presente invenção, o processo para a produção de farinhas inclui um processamento de plantas de acordo com a invenção, de partes que armazenam amido de plantas de acordo com a invenção, de material de propagação de acordo com a invenção ou de um material que pode ser colhido de acordo com a invenção antes da moagem.
O processamento aqui pode ser, por exemplo, um tratamento térmico e/ou uma secagem. O tratamento térmico seguido pela secagem do material tratado pelo calor é utilizado, por exemplo, na produção de farinhas provenientes de raízes de armazenamento ou de tubérculos tais como, por exemplo, de tubérculos de batata antes que a moagem ocorra. A trituração de plantas de acordo com a invenção, de partes que armazenam amido de plantas de acordo com a invenção, de material de propagação de acordo com a invenção ou de material que pode ser coletado de acordo com a invenção antes da moagem pode ser similarmente o processamento dentro do significado da presente invenção. A remoção do tecido vegetal, tal como, por exemplo, de resíduos de cereais dos grãos, antes da moagem, é também o processamento antes da moagem dentro do significado da presente invenção.
Em uma modalidade adicional da presente invenção, o processo para a produção de farinhas inclui o processamento dos grãos para moagem após a moagem.
Os grãos para moagem podem ser aqui peneirados, por exem59 pio, após a moagem com a finalidade de, por exemplo, produzir vários tipos de farinhas.
Um objetivo adicional da presente invenção é o uso de partes de plantas modificadas geneticamente de acordo com a invenção, de plantas de 5 acordo com a invenção, de partes de plantas de acordo com a invenção, de partes que armazenam amido de plantas de acordo com a invenção, de material de propagação de acordo com a invenção ou de material que pode ser coletado de acordo com a invenção para a produção de farinhas.
Descrição das sequências
SEQIDNO1:
SEQ ID NO 2:
sequencia de acido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase de Solanum tuberosum.
sequência de aminoácidos da proteína codificada pela SEQ ID NO 1 que possui a atividade de uma glucano-água diquinase de Solanum tuberosum.
sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase de Curcuma longa.
sequência de aminoácidos da proteína codificada pela SEQ ID NO 3 que possui a atividade de uma glucano-água diquinase de Curcuma longa.
sequência de ácido nucleico que codifica a proteína que possui a atividade de uma amido sintase II de Tríticum aestivum.
sequência de aminoácidos da proteína codificada pela SEQ ID NO 3 que possui a atividade de uma amido sintase II de Tríticum aestivum.
SEQ ID NO 4:
SEQ ID NO 5:
SEQ ID NO 6:
Descrição das figuras
A figura 1 mostra zimogramas para a determinação da atividade 30 de proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase II em comparação com o tipo selvagem. Foram utilizados extratos de proteínas totais de grãos imaturos (15 dias após o início da florescência) de plantas do tipo sel60 vagem (WT) e daqueles de três plantas modificadas geneticamente (oe-SSIlO.S.-5, oe-SSII-O.s.-12, oe-SSII-O.s.-19) produzidos independentemente um do outro partindo da transformação utilizando o vetor de expressão AH32191. Nas faixas WT e puro (não diluído), quantidades equivalentes de proteína dos respectivos extratos são aplicadas em cada caso. Os extratos de proteínas das plantas modificadas geneticamente foram diluídos sequencialmente (1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20 ou 1:100) e estas diluições foram similarmente separadas umas das outras de forma eletroforética. Comparando a intensidade dos produtos específicos sintetizados por uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II presente nos zimogramas após a coloração com solução de Lugol (marcada com uma seta) dos extratos de proteínas de plantas do tipo selvagem com a intensidade das bandas de extratos de proteínas de plantas alteradas geneticamente em questão, pode ser determinado o aumento na atividade de uma amido sintase II comparada com a das plantas do tipo selvagem. Intensidades equivalentes significam aqui atividades equivalentes.
A figura 2 mostra o autorradiograma de uma Análise de Northern Blot de sementes T1 imaturas das linhagens de arroz oe-SSII-O.s.-19, oeSSII-O.S.-20, oe-SSII-O.s.-21, oe-SSII-O.s.-22, oe-SSII-O.s.-23 em comparação com plantas do tipo selvagem (WT) que não foram modificadas geneticamente. Para isso, o RNA foi extraído de três sementes em cada caso de linhagens produzidas independentemente da transformação utilizando o vetor de expressão AH32-191 e analisado de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 8. A banda que se hibridizou utilizando uma sonda de ácido nucleico marcada que codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II do trigo é marcada por SSII.
A figura 3 mostra um zimograma de extratos de proteínas de sementes T1 imaturas das linhagens de arroz oe-SSII-O.s.-8, oe-SSIl-O.s.19, oe-SSII-O.s.-23 em comparação com sementes de plantas do tipo selvagem (WT) que não foram modificadas geneticamente após a coloração com solução de Lugol. Por linhagem, os extratos de proteínas de dois (oe-SSIlO.s.-δ) ou três (oe-SSII-O.s.-19, oe-SSII-O.s.-23) grãos diferentes foram analisados. A análise através de zimograma foi realizada aqui de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 9. A banda no zimograma que é específica para uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II é marcada por SSII.
A figura 4 mostra um mapa do plasmídeo pJH77.
A figura 5 mostra um zimograma de extratos de proteínas de grãos de milho imaturos de plantas do tipo selvagem (WT) e de uma linhagem transgênica (TG) que possui uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II (SS2). É indicada a quantidade de proteína fornecida.
A figura 6 mostra um mapa do plasmídeo pHN3.
Métodos gerais
São descritos abaixo os métodos que podem ser utilizados para a realização dos processos de acordo com a invenção. Estes métodos são modalidades reais da presente invenção, mas não restringem a presente invenção a estes métodos. É conhecido pelos versados na técnica que pode-se realizar a invenção de forma idêntica através da modificação dos métodos descritos e/ou através da substituição de partes individuais dos métodos por partes alternativas dos métodos. Os conteúdos de todas as publicações citadas são adicionalmente incluídos na descrição do pedido de patente como referência.
1. Determinação do poder de intumescimento em água quente (SP)
100 mg de amostra (amido ou farinha) são suspensos em 6 ml de água e subsequentemente intumescidos a 92,5°C durante 20 minutos. Durante a incubação da amostra a 92,5°C, a suspensão é misturada repetidamente (durante os primeiros 2 minutos continuamente, após 3, 4, 5,10, 15 ou 25 minutos) através da rotação cuidadosa dos recipientes das amostras em 360°. Após a incubação a 92,5°C durante um total de 30 minutos, a suspensão é resfriada em água gelada durante aproximadamente 1 minuto antes da incubação a 25°C durante 5 minutos é realizada. Após a centrifugação (temperatura ambiente, 1000xg, 15 minutos), o sobrenadante obtido é cuidadosamente removido do sedimento gelatinoso e o peso do sedimento é determinado. O poder de intumescimento em água quente é calculado de acordo com a fórmula a seguir:
SP = (peso do sedimento gelatinoso)/(peso da amostra pesada em (farinha ou amido))
2. Determinação do conteúdo de amido fosfato
a) Determinação do conteúdo de fosfato na posição C6 das moléculas de glicose
No amido, as posições C2, C3 e C6 das unidades de glicose podem ser fosforiladas. Para a determinação do conteúdo de P na C6 do amido ou da farinha (modificada de acordo com Nielsen e outros, 1994, Plant Physiol. 105: 111-117), 50 mg de farinha de arroz/milho ou de amido de arroz/milho foram hidrolisados a 95° C em 500 μΙ_ de HCI a 0,7 M durante 4 h com agitação contínua. Subsequentemente, as bateladas foram centrifugadas a 15,500xg durante 10 min e os sobrenadantes foram purificados partindo da matéria suspensa e da turvação através de uma membrana de filtro (0,45 qm). 20 μΙ_ do hidrolisado translúcido foram misturados com 180 μί. de tampão imidazol (300 mM de imidazol, pH 7,4; 7,5 mM de MgCb, 1 mM de EDTA e 0,4 mM de NADP) e as amostras foram medidas em 340 nm em um fotômetro. Após a determinação da absorção de base, uma reação enzimátíca foi iniciada através da adição de 2 unidades cada de glicose 6-fosfato desidrogenase (de Leuconostoc mesenteroides, Boehringer Mannheim). A alteração medida (DO) se baseia em uma reação equimolar de glicose 6-fosfato e NADP para fornecer 6-fosfogluconato e NADPH, a formação de NADPH sendo detectada no comprimento de onda mencionado anteriormente. A reação foi monitorada até atingir um ponto final. O conteúdo de glicose 6fosfato no hidrolisado pode ser calculado partindo do resultado desta medida:
nmol de glicose 6-fosfato/mg FW = x
DO x volume medido (200 μΙ_) volume de hidrolisado (500 μΙ_)
Coeficiente de extinção x volume de amostra medida (20 μΙ_) x mg de amostra pesada (50 mg)
Para não serem obtidos resultados errôneos devido à hidrólise incompleta do amido no material pesado (farinha ou amido), o grau de hidrólise foi subsequentemente determinado. Para isto, 10 gL de hidrolisado foram tirados dos respectivos hidrolisados medidos em relação a glicose 65 fosfato, neutralizados com 10 gL de NaOH a 0,7 M, levados a um volume final de 2 mL com água e diluídos 1:100 com água. 4 gL desta diluição foram tratados com 196 gL de tampão de medida (100 mM de imidazol pH 6,9; 5 mM de MgCI2, 1 mM de ATP, 0,4 mM de NADP) e utilizados para a determinação fotométrica do conteúdo de glicose. Após a determinação da absor10 ção de base em 340 nm, a reação foi monitorada no fotômetro (340 nm) através da adição de 2 gL de mistura de enzimas (hexoquinase 1:10; glicose 6-fosfato desidrogenase de levedura 1:10; em tampão de medida) até atingir o ponto final. O princípio de medida corresponde à primeira reação. Partindo das medidas obtidas, a quantidade de glicose pode ser calculada para a respectiva amostra:
DO x volume medido (200 gL) x volume de hidrolisado (500 gL) x volume total de diluição (2 mL) nmol de glicose/g FW = Coeficiente de extinção x volume de amostra medida (20 gL) x volume empregado para diluição (10 gL) x mg de amostra pesada (50 mg)
A quantidade de glicose das amostras individuais detectadas corresponde aqui à proporção de amido que está disponível para a determinação de fosfato em C6. Para simplificação, o conteúdo de glicose é convertido no conteúdo de amido no cálculo adicional.
Conteúdo de glicose (mmol g FW) x peso molecular de glicose no amido (162 g/mol) Conteúdo de amido (%) x fator de conversão (% =100)= Fator de conversão (mmol para mol = 1000)
Subsequentemente, o resultado da medida de glicose 6-fosfato está relacionado com o conteúdo de amido da amostra correspondente com a finalidade de expressar o conteúdo de glicose 6-fosfato por mg de amido hidrolisado:
nmol de glicose 6-fosfato/mg de amostra pesada x 100 nmol de Glc 6-P/mg de amido =Conteúdo de amido (mg de amido/100 mg de amostra pesada)
Sem ser com referência à quantidade de glicose 6-fosfato no peso obtido da amostra (farinha ou amido), através dessa forma de cálculo, a quantidade de glicose 6-fosfato é relatada apenas para a parte do amido que foi completamente hidrolisada em glicose.
b)_Determinação do conteúdo total de fosfato
A determinação do conteúdo total de fosfato foi realizada de acordo com o método de Ames (Methods in Enzymology VIII, (1966), 115118).
Aproximadamente 50 mg de amido são tratados com 30 μΙ_ de solução de nitrato de magnésio etanólico e a mistura é incinerada em uma mufla a 500°C durante três horas. O resíduo é tratado com 300 μΙ_ de HCl a 0,5 M e incubado a 60°C durante 30 min. Subsequentemente, uma alíquota é completada até 300 μΙ_ com HCl a 0,5 M, adicionada a uma mistura de 100 μΙ_ de ácido ascórbico com concentração a 10% e 600 pL de milibdato de amônio a 0,42% em ácido sulfúrico a 2 M e incubada a 45°C durante 20 min.
3. Transformação de plantas de arroz
As plantas de arroz foram transformadas de acordo com o método descrito por Hiei e outros (1994, Plant Journal 6(2), 271-282).
4. Transformação de plantas de trigo
As plantas de trigo foram transformadas de acordo com o método descrito por Becker e outros (1994, Plant Journal 5, 299-307).
5. Transformação de plantas de milho
Os embriões imaturos de plantas de milho da linhagem A188 foram transformados de acordo com o método descrito por Ishida e outros (1996, Nature Biotechnology 14, 745-750).
6. Processamento de grãos de arroz e produção de farinhas de arroz
Para a produção de quantidades adequadas de material para investigação, as plantas de arroz foram cultivadas em uma estufa e colhidas após atingir a maturidade completa. Para a secagem adicional, os grãos de arroz maduros foram armazenados a 37°C durante 3 a 7 dias.
Subsequentemente, os grãos foram liberados das cascas através de um descascador (Laboratory Paddy sheller, Grainman, Miami, Florida, USA) e o arroz marrom obtido foi processado através do polimento durante 1 minuto (Pearlest Rice Polisher, Kett, Villa Park, CA, USA) para produzir arroz branco. Para as investigações da composição dos grãos e das propriedades do amido, os grãos brancos foram moídos para produzir farinha de arroz através de um moinho de laboratório (Cyclotec, Sample mill, Foss, Dinamarca).
7. Extração de amido de arroz de farinha de arroz
A extração de amido de arroz de farinha de arroz foi realizada seguindo o método descrito em Wang e Wang (2004; Journal of Cereal Science 39: 291-296).
Aproximadamente 10 g de farinha de arroz foram incubados à temperatura ambiente com 40 mL de 0,05% (p/v) de NaOH durante 16 a 18 horas em um agitador. Subsequentemente, a suspensão foi transferida para uma misturadora Waring para completar a digestão e misturada vigorosamente durante 15 segundos em velocidade baixa e subsequentemente durante 45 segundos em velocidade alta. Para a separação de constituintes maiores (por exemplo, parede celular), a suspensão foi passada sucessivamente através de peneiras possuindo uma largura de trama de 125 pm e 63 pm. Após a centrifugação a 1500 rpm durante 15 minutos (Microfuge 3.OR; Heraeus), o sobrenadante foi vertido e a camada de proteína disposta sobre a superfície do precipitado foi removida utilizando uma espátula. O precipitado resultante foi ressuspenso novamente em 0,05% (p/v) de NaOH e o processo descrito acima foi repetido. Subsequentemente, o precipitado foi ressuspenso em água e o pH da suspensão foi ajustado em 6,5 até 7 utilizando HCI. O amido de arroz obtido foi lavado com água um total de três vezes, cada etapa de lavagem compreendendo uma sedimentação (centrifugação a 1500 rpm, 15 min, temperatura ambiente), o descarte do sobrenadante e a ressuspensão do precipitado em água fresca. Antes da última etapa de lavagem, o pH foi verificado novamente e opcionalmente ajustado em pH 7 utilizando HCI. O precipitado da última etapa de lavagem foi ressuspenso em acetona, sedimentado e o sobrenadante foi descartado. Após a ressuspensão do precipitado novamente em acetona, a suspensão foi vertida em uma placa de Petri e seca em uma capela à temperatura ambiente durante pelo menos 18 horas.
Em uma última etapa, o amido de arroz obtido dessa maneira foi convertido através da moagem em um almofariz em um pó fino, que pode ser empregado diretamente para investigações adicionais.
8. Análise do nível de expressão de uma proteína através de Northern blot
A expressão de um ácido nucleico que codifica uma proteína foi verificada através da análise de Northern blot. Para isto, três grãos de arroz imaturos foram colhidos (aproximadamente 15 dias após a fluorescência) para cada planta independente obtida através da transformação e congelados em nitrogênio líquido. Para a homogeneização, os grãos de arroz congelados em uma placa para microtitulação de 96 poços foram triturados utilizando uma esfera de aço inoxidável de 4,5 mm em um moinho Retsch (modelo MM300) durante 30 segundos a uma frequência de 30 hertz. Subsequentemente, o RNA foi isolado através de um kit de extração de RNA da Promega de acordo com as instruções do fabricante (SV 96 Total RNA Isolation System, order Ng Z3505, Promega, Mannheim). A concentração do RNA nas amostras individuais foi determinada através da determinação fotométrica da absorção em 260 nm.
Por amostra, 2 pg de RNA em cada caso foram levados até um volume uniforme e tratados com um volume idêntico de tampão de amostra de RNA (65% (v/v) de formamida, 8% de formaldeído, 13% (v/v) de tampão de gel (vide acima), 50 pg/mL de brometo de etídio). Após o aquecimento (10 min, 65°C) e o resfriamento imediato em gelo, o RNA foi separado em um gel de agarose a 1,2% (p/v) (MOPS a 20 mM pH 8, acetato de Na a 0,5 mM, 1 mM de EDTA, 6% (v/v) de formaldeído) utilizando tampão de eluição de RNA (MOPS a 20 mM pH 8,0, acetato de Na a 5 mM, 1 mM de EDTA) em uma intensidade de corrente constante de 50 a 80 mA durante aproximadamente 2 horas.
Subsequentemente, o RNA foi transferido para uma membrana Hybond-N através de um blot de difusão utilizando 10x SSC (NaCl a 1,5 M, citrato de Na 150 mM pH 7,0) e imobilizado na membrana através de irradiação de UV.
Para a hibridização do Northern blot para a detecção da expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, um fragmento Spel/BspHI de aproximadamente 1 kb do plasmídeo AH32-191 (pb 4568-5686), que compreende a região a 5’ do cDNA, que codifica uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II do trigo, foi utilizado. A marcação radioativa do fragmento de DNA foi realizada através do kit de marcação de DNA iniciado aleatoriamente (Random primed DNA labelling kit) da Roche (order Ns 1004 760) utilizando 32P-alfa-dCTP de acordo com as instruções do fabricante.
A membrana de nylon que compreende o RNA transferido foi incubada durante quatro horas a 60°C com agitação suave em um banho de água contendo tampão de hibridização (tampão fosfato de Na a 250 mM pH 7,2, , EDTA 1 mM de 6% (p/v) de SDS, 1 % (p/v) de BSA) antes do DNA marcado radioativamente ser adicionado no tampão de hibridização. Após a incubação durante 16 horas, o tampão de hibridização foi removido e a membrana foi lavada sucessivamente uma vez com 3xSSC e uma vez com 2xSSC (vide acima) a 60°C com agitação suave em um banho de água para a remoção de moléculas de DNA ligadas de forma não-específica.
Para a detecção do RNA marcado, foi realizada uma autorradiografia da membrana de nylon sobre um filme de raios X a -70°C durante um até três dias.
9. Determinação da atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II através de gel de atividade (zimograma)
A detecção da atividade de proteínas que possuem a atividade de uma amido sintase em grãos de arroz imaturos foi realizada através de géis de atividade (zimogramas), em que os extratos de proteínas são separados em um gel de poliacrilamida sob condições nativas e subsequentemente incubados com substratos apropriados. O produto de reação resultante (alfa-glucano) foi corado no gel através da solução de Lugol.
Os grãos de arroz imaturos individuais (aproximadamente 15 dias após a fluorescência) foram congelados em nitrogênio líquido e homogeneizados em 150 a 200 μι. de tampão de extração gelado (tris/HCI a 50 mM pH 7,6, EDTA a 2,5 mM, DTT a 2 mM, PMSF a 4 mM, 0,1% (p/v) de glicogênio, 10 % (v/v) de glicerol). Após a centrifugação (15 min, 13.000 g, 4°C), o sobrenadante translúcido foi transferido para um recipiente de reação novo e uma alíquota do extrato foi utilizada para a determinação do conteúdo de proteínas de acordo com Bradford (1976, Anal Biochem 72: 248-254).
A separação dos extratos de proteínas foi realizada através de gel de poliacrilamida a 7,5% contínuo (7,5% de acrilamida:bisacrilamida 37,5:1; tris/HCI a 25 mM pH 7,6, glicina a 192 mM, 0,1 % (p/v) de APS, 0,05 % (v/v) de TEMED) utilizando tampão de eluição em concentração de uma vez (tris/HCI25 mM, glicina a 192 mM). Para cada amostra, quantidades correspondendo a 15 qg de proteína foram aplicadas e a eletroforese foi realizada a 4°C durante 2 até 2,5 horas. Subsequentemente, os géis foram incubados durante a noite à temperatura ambiente em 15 mL de tampão de incubação (citrato de sódio pH a 0,5 mM 7,0, acetato de potássio a 25 mM, EDTA a 2 mM, DTT a 2 mM, 0,1% (p/v) de amilopectina, tricina/NaOH pH a 50 mM 8,5, ADP-glicose a 1 mM) com agitação contínua. A coloração do amido formado foi realizada através da solução de Lugol.
Para determinar em quantas vezes a atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II é aumentada em comparação com plantas do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamentes, os extratos de proteínas das linhagens modificadas geneticamente foram em cada caso diluídos sequencialmente e separados de forma eletroforética de acordo com o método descrito anteriormente. As etapas adicionais foram realizadas como já descrito anteriormente. Após corar os zimogramas com a solução de Lugol, foi realizada uma comparação visual da intensidade dos produtos corados produzidos por uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II (marcados por uma seta na figura 1) para as várias diluições dos extratos de proteínas das plantas modificadas geneticamente com os produtos dos extratos de proteínas do tipo selvagem não diluídos em questão. Uma vez que a intensidade da coloração dos produtos se correlaciona diretamente com a atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II, as bandas dos produtos que possuem intensidades iguais possuem a mesma atividade. Se as bandas dos produtos de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II no extrato de proteínas diluído possuírem a mesma intensidade que a banda dos produtos do extrato de proteínas não diluído correspondente proveniente de plantas do tipo selvagem em questão, o fato de diluição corresponderá ao grau de aumento na atividade nas plantas modificadas geneticamente em questão (para isto, comparar a figura 1).
10. Produção de plantas através de embriões de arroz (recuperação de embriões)
As sementes são separadas da panícula e os resíduos são removidos. O endosperma é separado do embrião utilizando um bisturi e é utilizado para as análises apropriadas. Para aumentar a capacidade de umedecimento, o embrião é tratado por curto período de tempo com 70% de etanol e subsequentemente incubado durante 20 minutos em uma solução que compreende 10% de NaOCI e uma gota de detergente disponível comercialmente para esterilização.
Subsequentemente, a solução de esterilização é removida o mais completamente quanto possível e o embrião é lavado com água desmineralizada esterilizada uma vez durante um minuto e subsequentemente duas vezes durante 10 minutos em cada caso. As sementes são colocadas em placas de Petri sobre meio solidificado utilizando agar compreendendo um quarto da concentração de sais do meio MS (meio de Murashige-Skoog) e 4 % de sacarose. Subsequentemente, as placas de Petri são seladas com parafilme e incubadas a 23°C na escuridão. Após a germinação (aproximadamente de 5 a 7 dias após a exibição dos embriões), as placas de Petri são transferidas para a luz. Se os hipocótilos das plantas cultivadas partindo da semente tiverem atingido um comprimento de aproximadamente 2 cm, as plantas serão transferidas para vasos de vidro compreendendo meio MS solidificado utilizando agar contendo 2% de sacarose. Após a formação adequada de raízes, as plantas podem ser plantadas no solo.
11. Processamento de grãos de milho
Para a produção de material suficiente, as plantas de milho foram cultivadas sob condições de estufa. Espigas de milho totalmente maduras foram colhidas e armazenadas a 37°C durante 3 a 7 dias para secagem adicional antes que os grãos fossem removidos das espigas.
12. Extração de amido de milho
O amido de milho foi extraído de acordo com o método de moagem úmida descrito pela Com Refiners Association (http://www.milho.org). 10 a 50 g de grãos de milho foram incubados em um excesso de ácido sulfuroso durante 3 dias a 50°C para liberar a matriz proteica. Depois disso, os grãos foram lavados com água e secos durante um curto período de tempo. A moagem dos grãos foi feita em um moinho de ultracentrifugação (retsch, Alemanha, ZM100) com uma peneira que possui uma largura de trama de 2 mm. O material moído foi transferido para um béquer de vidro e incubado durante pelo menos 30 minutos em solução de NaCI a 20% levando à sedimentação dos grânulos de amido e a uma flutuação dos corpos lipídicos na fase superior. A fase superior compreendendo os germens foi decantada e o sedimento foi novamente suspenso na solução remanescente. Depois disso, uma purificação adicional dos grânulos de amido foi conseguida através de várias etapas de peneiração. Foi utilizada uma peneira de 500 pm (DIN 4188) seguida por uma peneira de 200 pm (DIN 4188) e uma peneira de 125 (ISO 3310-1), em que as peneiras foram lavadas com 20% de NaCI (2 a 3 L) através do uso de um atomizador até que as gotículas sob a peneira não contivessem mais grânulos de amido. O amido recebido foi sedimentado durante a noite à temperatura ambiente e o sobrenadante foi decantado de uma maneira que permaneceram aproximadamente 5 mm do sobrenadante sobre o amido sedimentado. Depois disso, o amido foi transferido para tubos de centrífuga e sedimentados novamente durante 10 minutos a 3500 rpm em uma Heraeus Variofuge. Após a centrifugação a camada de amido-proteína na superfície do sedimento (frequentemente sendo reconhecida como possuindo uma coloração diferente) foi removida com uma espátula e foi descartada. O amido obtido foi novamente suspenso várias vezes com acetato de sódio a 0,2 M, pH 4,6, centrifugado (5 minutos, vide os outros parâmetros acima) e em cada momento a camada de amido-proteína na superfície do sedimento foi removida como descrito anteriormente. Depois disso, o amido obtido foi digerido em uma solução compreendendo acetato de sódio a 0,2 M, pH 4,6, 1% de bromelaina e 1% de pesina durante 1 hora sob rotação constante seguida por centrifugação (3000 rpm, vide os outros parâmetros acima). A camada de amido-proteína na superfície do sedimento foi novamente removida como descrito anteriormente, o sedimento obtido foi suspenso em água e centrifugado novamente antes que a camada de proteína na superfície do sedimento fosse removida como descrito anteriormente. Esta etapa de lavagem foi no total repetida 5 vezes antes do amido obtido ser suspenso em 80% de etanol e centrifugado (3000 rpm, vide os outros parâmetros acima). Esta etapa foi repetida 4 vezes. Finalmente o amido obtido foi lavado uma vez em acetona para remover os lipídeos. Depois disso, o amido foi seco à temperatura ambiente.
13. Cultivo de plantas de milho
Material vegetal Zea mays, variedade A188
Condições de cultivo na estufa:
solo: 80% de turfa branca
20% de turfa marrom 100 kg/m3 de areia para vidro 40 kg/m3 de argila estrutura: fina pH 5,3-6,1 fertilizante básico: 2 kg/m3 12-12-17 (+2) e 100 g/m3 Radigen (Therafor Gm72 bH, Isrlohn, Alemanha)
Vasos: recipientes de 10 litros
Densidade: máximo de 6 plantas/m2
Fertilização: 1 TAB Plantosan 4g (20-10-15+6) no estágio de 4 folhas
TAB Plantosan (vide acima) após 3 semanas adicionais
Temperatura: dia 22°C a 25°C / noite 16°C
Luz: 18 horas, 350 - 400 pEinstein/s/m
Umidade: 50% rei
Exemplos
1. Preparação do vetor de expressão de planta AH32-191, que compreende uma sequência codificadora para uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II
A sequência codificadora completa da proteína que possui a atividade de uma amido sintase II do trigo (T.a.-SSIl) foi cortada do plasmídeo pCF31 (descrito na WO 97 45545 sob o nome pTaSSI) através das endonucleases de restrição Ec/136íl e Xho I e clonada no plasmídeo IR103-123 (descrito na WO 05 030941) clivado utilizando as endonucleases de restrição Eco RV e Xho I. O vetor de expressão obtido foi chamado de AH32-191. O vetor de expressão de planta IR103-123 serve para a expressão específica ao endosperma do gene alvo sob o controle do promotor da globulina do arroz. O vetor de expressão de planta IR103-123 contém adicionalmente o gene bar sob o controle do promotor CaMV35S, que foi utilizado como um marcador de seleção para a transformação de plantas.
2. Produção de plantas de arroz que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II
As plantas de arroz (variedade M202) foram transformadas através de Agrobacterium compreendendo o plasmídeo AH32-191, utilizando o método descrito em Hiei e outros (1994, Plant Journal 6(2), 271-282). As plantas obtidas receberam o nome oe-SSIl-O.s.-X, em que X representa plantas independentes produzidas partindo da transformação.
3. Produção de plantas de arroz que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase
As plantas de arroz (variedade M202) foram transformadas através de Agrobacterium compreendendo o plasmídeo pML82 (descrito na WO 05 095619), utilizando o método descrito em Hiei e outros (1994, Plant Journal 6(2), 271-282). As plantas obtidas receberam o nome oe-GWD-O.s.-X, em que X representa plantas independentes produzidas partindo da transformação.
4. Análise das plantas de arroz que foram transformadas utilizando o vetor de expressão AH32-191
As plantas de arroz produzidas partindo da transformação com o vetor de expressão AH32-191 (plantas T0) das linhagens que possuem o nome oe-SSIl-O.s.-X foram cultivadas no solo em uma estufa. O RNA foi isolado partindo de grãos imaturos (sementes T1) de várias linhagens que possuem o nome oe-SSIl-O.s.-X e uma análise de Northern blot foi realizada de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 8. Foi possível identificar um número de linhagens que tinham uma maior expressão de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II do trigo em comparação com plantas do tipo selvagem não-modificadas geneticamente correspondentes (vide o exemplo de representação na figura 2).
Uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase il em sementes T1 imaturas de várias linhagens oe-SSIlO.s.-X foi adicionalmente detectada através de zimograma (vide o exemplo de representação nas figuras 1 e 2). A análise através de zimograma foi realizada de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 9.
5. Análise das plantas de arroz que foram transformadas utilizando o vetor de expressão pML82
As plantas de arroz produzidas partindo da transformação com o vetor de expressão pML82 (plantas T0) das linhagens que possuem o nome oe-GWD-O.s.-X foram cultivadas em solo em uma estufa. A farinha foi produzida partindo de grãos maduros individuais (sementes T1) de várias linhagens que possuem o nome oe-GWD-O.s.-X. Para isso, os grãos individuais foram finamente pulverizados e o material moído foi subsequentemente triturado em um moinho de esferas (Retsch, modelo MM300) durante 30 segundos a uma frequência de 30 hertz. Subsequentemente, foi realizada uma determinação do conteúdo de amido fosfato na posição C6 de moléculas de glicose da farinha de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 2.
Os resultados a seguir foram obtidos para as plantas selecionadas:
| Nome da planta | nmol de fosfato em C6 por mg de peso fresco das sementes |
| oe-GWD-O.s.-2 | 1,68 |
| oe-GWD-O.s.-4 | 1,70 |
| oe-GWD-O.s.-9 | 1,47 |
| WT | 0,30 |
Tabela 1: Conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose nas farinhas, produzidas partindo de sementes T1 individuais de linhagens diferentes que possuem o nome oe-GWD-O.s.-X em comparação com farinhas produzidas partindo de sementes de plantas do tipo selvagem correspondentes (WT) da variedade M202, que não foram modificadas geneticamente.
Como é evidente partindo da tabela 1, foi possível utilizando o vetor de expressão pML82 identificar linhagens independentes produzidas partindo da transformação, que em comparação com plantas do tipo selvagem correspondentes que não foram modificadas geneticamente tinham um maior conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose nas farinhas. Uma vez que é conhecido que as células vegetais que possuem uma maior expressão de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase sintetizam um amido que possui um maior conteúdo de amido fosfato em comparação com plantas do tipo selvagem não-modificadas geneticamente correspondentes (vide, por exemplo, WO 02 34923), o aumento no conteúdo de fosfato nas linhagens que possuem o nome oeGWD-O.s.-X deve ser atribuído a uma maior atividade da proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.
6. Produção de plantas que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase sementes T1 em cada caso de plantas de várias linhagens que possuem o nome oe-SSIi-O.s.-X ou das linhagens oe-GWD-O.s.-X foram novamente cultivadas em uma estufa e as plantas em questão foram borrifadas com uma solução que compreende 0,5% de Basta® (Bayer CropScience). Aproximadamente um quarto das plantas tratadas das linhagens oe-SSII-O.s.-19, oe-GWD-O.s.-2, oe-GWD-O.s.-4 e oe-GWD-O.s.-9 reagiu sensivelmente ao tratamento com Basta®, que permitiu que fosse concluído que não continham o gene bar mediando resistência a Basta® e o T-DNA dos vetores de expressão foi integrado em um sítio do genoma ou nos sítios no genoma que ficam tão fortemente ligados que não se segregam. As sementes T2 de plantas T1 destas linhagens que eram resistentes ao tratamento com Basta® foram novamente colocadas na estufa e um tratamento com Basta® foi realizado como descrito anteriormente. Subsequentemente, o mesmo tratamento com Basta® foi realizado com plantas T3 destas linhagens: era possível aqui identificar várias plantas T3 das linhagens oe-GWD-O.s.-19, oe-GWD-O.s.-2, oe-GWD-O.s.-4 e oe-GWD-O.s.-9 em que todas as plantas eram resistentes a Basta®. Isto permitiu que fosse concluído que as plantas T2 das quais as sementes T3 em questão foram originadas eram homozigotas em relação ao T-DNA integrado. As sementes T2 de plantas homozigotas das linhagens oe-SSII-O.s.-19, oe-GWD-O.s.-2, oeGWD-O.S.-4 e oe-GWD-O.s.-9 foram novamente colocadas e várias plantas da linhagem oe-SSII-O.s.-19 foram em cada caso pulverizadas com pólen das linhagens oe-GWD-O.s.-2, oe-GWD-0.s.-4 e oe-GWD-O.s.-9. Os descendentes do cruzamento resultante disso foram denominados oe-SSIl/ GWD-O.S.-1 (oe-SSII-O.s.-19 X oe-GWD-0.s.-2), oe-SSII/GWD-O.s.-2 (oeSSII-O.S.-19 X oe-GWD-O.s.-4) e oe-SSII/GWD-O.s.-3 (oe-SSII-O.s.-19 X oe-GWD-O.s.-9).
7. Análise de plantas que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase
Das linhagens oe-SSII/GWD-O.s.-1, oe-SSII/GWD-O.s.-2, oeSSII/GWD-O.S.-3 produzidas partindo dos cruzamento e de plantas parentais homozigotas (oe-SSIl-O.s.-19, oe-GWD-0.s.-2, oe-GWD-O.s.-4 e oe-GWDO.S.-9), sementes F1 individuais foram em cada caso colhidas e os embriões foram separados e armazenados à temperatura ambiente. A farinha, obtida do endosperma remanescente das respectivas sementes F1 individuais, foi verificado utilizando o método descrito sob os métodos gerais, item 6 em relação ao conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose. Foram obtidos os resultados a seguir.
| Nome da planta | N9 da semente F1 | nmol de fosfato em C6 por mg de amido |
| oe-SSII/GWD-O.s.-1 | 1 | 6,5 |
| 2 | 2,8 | |
| 3 | 2,6 | |
| 4 | 2,5 | |
| 5 | 2,6 | |
| oe-SSII/GWD-O.s.-2 | 1 | 7,9 |
| 2 | 7,2 | |
| 3 | 7,1 | |
| 4 | 8,4 | |
| 5 | 6,9 | |
| oe-SSII/GWD-O.s.-3 | 1 | 6,7 |
| 2 | 6,0 | |
| 3 | 7,7 | |
| 4 | 7,5 | |
| 5 | 7,0 | |
| oe-SSII-O.s.-19 (materna) | 1 | 1,5 |
| 2 | 1,4 | |
| oe-GWD-O.s.-2 (paterna 1) | 1 | 3,6 |
| oe-GWD-O.s.-4 (paterna 2) | 1 | 3,5 |
| oe-GWD-O.s.-9 (paterna 3) | 1 | 4,1 |
| WT | 1 | 0,5 |
| 2 | 0,5 |
Tabela 2: conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose em farinhas, produzidas partindo de sementes F1 individuais de linhagens que possuem o nome oe-SSIl/GWD-O.s.-X, em comparação com farinhas produzidas partindo de sementes individuais de plantas do tipo selvagem correspondentes da variedade M202 (WT) que não foram modificadas geneticamente. O conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose nas farinhas produzidas partindo de sementes homozigo15 tas individuais das linhagens parentais é similarmente mostrado.
Os embriões de sementes da linhagem oe-SSIl/GWD-O.s.-X, cujas farinhas tinham um conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose de pelo menos 6,0 nmols de C6 fosfato por mg de amido, foram germinados através do método descrito sob os métodos gerais, item 10 e subsequentemente cultivados em uma estufa para a produção de se5 mentes F2. Para a identificação dos descendentes que eram homozigotos em relação a dois T-DNAs integrados, mediando uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II ou mediando uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase, o processo descrito acima para as sementes F1 foi repe10 tido com as sementes F2. Subsequentemente, em fila, os embriões de sementes cujas farinhas tinham um conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose de pelo menos 6,0 nmols de C6 fosfato por mg de peso fresco da semente foram germinados e cultivados em uma estufa para a produção de sementes F3. Os resultados a seguir foram obtidos para se15 mentes F3 individuais, que se originam de uma planta F2 em cada caso:
| Nome da planta | N9 da semente F3 | nmol de fosfato em C6 por mg de amido |
| oe-SSII/GWD-O.s.-1 | 1 | 9,7 |
| 2 | 9,7 | |
| 3 | 10,0 | |
| 4 | 9,7 | |
| 5 | 9,8 | |
| 6 | 9,1 | |
| 7 | 8,4 | |
| 8 | 9,7 | |
| 9 | 9,9 | |
| 10 | 10,0 | |
| 11 | 9,8 | |
| 12 | 9,8 | |
| oe-SSII/GWD-O.s.-2 | 1 | 10,4 |
| 2 | 9,8 | |
| 3 | 10,9 | |
| 4 | 10,1 | |
| 5 | 11,2 | |
| 6 | 10,0 | |
| 7 | 11,0 | |
| 8 | 9,7 | |
| 9 | 10,4 | |
| 10 | 10,5 | |
| 11 | 11,9 | |
| 12 | 10,6 |
| oe-SSII/GWD-O.s.-3 | 1 | 12,5 |
| 2 | 11,5 | |
| 3 | 11,3 | |
| 4 | 11,4 | |
| 5 | 11,0 | |
| 6 | 11,6 | |
| 7 | 11,5 | |
| 8 | 11,5 | |
| 9 | 12,1 | |
| 10 | 10,0 | |
| 11 | 11,5 | |
| 12 | 10,6 | |
| oe-SSII-O.s.-19 (materna) | 1 | 1,5 |
| 2 | 1,7 | |
| 3 | 2,2 | |
| 4 | 1,9 | |
| oe-GWD-O.s.-9 (paterna 3) | 1 | 3,3 |
| 2 | 2,9 | |
| 3 | 3,3 | |
| 4 | 3,3 | |
| WT | 1 | 0,5 |
| 2 | 0,9 |
Tabela 3: Conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose em farinhas, produzidas partindo de sementes F3 individuais de linhagens que possuem o nome oe-SSIl/GWD-O.s.-X; que foram preparadas através do cruzamento das linhagens parentais oe-SSII-O.s.-19 (materna) com plantas das linhagens oe-GWD-O.s.-X (paterna), em comparação com farinhas produzidas partindo de sementes individuais de plantas do tipo selvagem correspondentes da variedade M202 (WT) que não foram modificadas geneticamente. O conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose nas farinhas produzidas partindo de sementes homozi10 gotas individuais das linhagens parentais individuais é similarmente mostrado.
O fato de que o conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose em farinhas produzidas partindo de sementes F3 individuais que em cada caso foram originadas de uma planta F2 das linhagens em questão era aproximadamente idêntico ao fato indicado de que as plantas F2 em questão são homozigotas em relação aos dois T-DNAs integrados.
As sementes F3 de plantas F2 das linhagens oe-SSIl/GWD-O.s.1, oe-SSII/GWD-O.s.-2, oe-SSII/GWD-O.s.-3, que eram homozigotas em relação aos dois T-DNAs integrados mediando uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II ou mediando uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucanoágua diquinase, foram processadas para produzir farinhas de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 6. O amido foi isolado de uma parte desta farinha de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 7. Subsequentemente, o conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose foi determinado em farinhas e amido. Foram obtidos os resultados a seguir:
| Nome da planta | nmol de fosfato em C6 por mg de amido | nmol de fosfato em C6 por mg de amido |
| oe-SSII/GWD-O.s.-1 | 12,9 | 11,5 |
| oe-SSII/GWD-O.s.-2 | 13,4 | 12,6 |
| oe-SSII/GWD-O.s.-3 | 13,0 | 12,4 |
| oe-SSII-O.s.-19 (materna) | 1,5 | 1,2 |
| oe-GWD-O.s.-2 (paterna 1) | 3,9 | 3,3 |
| oe-GWD-O.s.-4 (paterna 2) | 3,9 | 3,5 |
| oe-GWD-O.s.-9 (paterna 3) | 3,9 | 3,5 |
| WT | 1,1 | 0,4 |
Tabela 4: conteúdo de fosfato ligado na posição C6 das moléculas de glicose em farinhas ou amido, produzidas partindo de sementes de plantas homozigotas de linhagens que possuem o nome oe-SSIl/GWD-O.s.X; que foram produzidas através de cruzamento, em comparação com farinhas ou amido produzido partindo de sementes das linhagens parentais oeSSII-O.S.-19 (materna) e oe-GWD-O.s.-X (paterna) ou de plantas do tipo selvagem da variedade M202 (WT).
A determinação do poder de intumescimento em água quente de farinhas ou de amidos produzidos partindo de sementes F3 das linhagens oe-SSIl/GWD-O.s.-X em relação às integrações de T-DNA de plantas homozigotas das linhagens oe-SSII-O.s.-19 e oe-GWD-O.s.-X e de plantas do tipo selvagem foi realizada de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 1. Para as linhagens oe-SSIl/GWD-O.s.-X, diferindo do método descrito sob os métodos gerais, item 1, o dobro da quantidade de água com base na quantidade de farinha ou de amido foi empregado aqui uma vez que utilizando a quantidade de água indicada sob os métodos gerais, item 1 com estas linhagens não podia ser distinguida uma separação da substância intumescida do sobrenadante aquoso. Foram obtidos os resultados a seguir:
| Nome da planta | Poder de intumescimento da farinha [g/g] | Poder de intumescimento da farinha [g/g] |
| oe-SSIIGWD-O.s.-1 | 42,8 | 95,2 |
| oe-SSIIGWD-O.s.-2 | 41,1 | 128,3 |
| oe-SSIIGWD-Os.-3 | 34,1 | 91,4 |
| oe-SSII-O.s.-19 (materna) | 22,6 | 36,2 |
| oe-GWD-O.s.-2 (paterna 1) | 20,1 | 30,8 |
| oe-GWD-O.s.-4 (paterna 2) | 20,0 | 36,5 |
| oe-GWD-O.s.-9 (paterna 3) | 17,4 | 34,0 |
| WT | 16,3 | 27,7 |
Tabela 5: poder de intumescimento em água quente de farinhas ou de amido produzido partindo de sementes de plantas homozigotas de linhagens que possuem o nome oe-SSIl/GWD-O.s.-X; que foram produzidas através de cruzamento, em comparação com farinhas ou amido produzido partindo de sementes das linhagens parentais oe-SSII-O.s.-19 (materna) e oe-GWD-O.s.-X (paterna) ou de plantas do tipo selvagem da variedade M202 (WT).
8. Preparação do vetor de expressão de planta pJH77, que compreende uma sequência codificadora para uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II
A sequência codificadora completa da proteína que possui a atividade de uma amido sintase II do trigo (T.a.-SSIl) foi subclonada. O plasmídeo obtido foi denominado pJH77 (vide a figura 4) e compreende os elementos funcionais a seguir:
| Posições de Nt | Orientação | Origem |
| 6600-6623 | RB: T-DNA da borda direita de Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) | |
| 6624-6909 | TL-DNA remanescente de pTiAchõ, que flanqueia a borda direita (Gielen e outros, 1984) | |
| 6910-7285 | no sentido anti-horário | 3’nos: sequência que compreende a região não traduzida a 3’ do gene da nopalina sintase do TDNA do plasmídeo pTiT37 (Depicker e outros, 1982) |
| 7286-9685 | no sentido anti-horário | ss2aTa: sequência codificadora da proteína que possui a atividade de uma amido sintase II do trigo (T.a.-SSIl) de Triticum aestivum (trigo) (SEQ ID Ne5) |
| 9686-10437 | no sentido anti-horário | intronl ubi1 Zm: primeiro íntron do gene da ubiquitina-1 (ubi1) de Zea mays (Christensen e outros, 1992). |
| 10438-11478 | no sentido anti-horário | PglobulinOs; sequência que compreende a região promotora do gene da globulina-1 de Oryza sativa (arroz) (Hwang e outros (2002)) |
| 11479-13261 | no sentido horário | PactIOs: sequência que compreende a região promotora do gene da actina-1 de Oryza sativa (arroz) (Mc Elroy e outros, 1990). |
| 13262-13739 | no sentido horário | intronl act1 Os: primeiro íntron do gene da actina-1 de Oryza sativa (arroz) (Mc Elroy e outros, 1990). |
| 13740-14291 | no sentido horário | bar. sequência codificadora do gene da fosfinotricina acetiltransferase de Streptomyces hygroscopicus (Thompson e outros (1987)) |
| 14292-14561 | no sentido horário | 3*nos: sequência que compreende a região não traduzida a 3’ do gene da nopalina sintase do TDNA do plasmídeo pTiT37 (Depicker e outros, 1982) |
| 14562-296 | TL-DNA remanescente de pTiAchõ, que flanqueia a borda esquerda (Gielen e outros, 1984) (Gielen e outros, 1984) | |
| 297-320 | LB: T-DNA da borda esquerda de Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) |
Tabela 6: elementos genéticos do plasmídeo pJH77.
Christensen A. H., Sharrock R.A., Quail P.H. (1992). Maize polyubiquitin genes: structure, thermal pertubation of expression and transcript splicing and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Molecular Biology, 18, 675-689.__
Depicker A., Stachel S., Dhaese P., Zambryski P., Goodman H.M. (1982). Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 561-573.__
Gielen J.; De Beuckeleer M.; Seurinck J.; Deboeck F.; De Greve H.; Lemmers M.; Van Montagu M.; Schell J. (1984). Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. The EMBO journal, 3, 835-846_
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Mc Elroy D., Zhang W., Cao J., Wu R. (1990). Isolation of an efficient actin promoterfor use in rice transformation. The Plant Cell, 2, 163-171.______
Thompson C.J., Rao Movva N., Tizard R., Crameri R., Davies J., Lauwereys M., Botterman J. (1987). Characterization of the herbicide resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. The EMBO Journal, 6, 2519-2523._
Zambryski P. (1988). Basic processes underlying Agrobacterium-medialed DNA transfer to plant cells. Annual Review of Genetics, 22, 1-30.
Tabela 7: referências citadas na Tabela 6.
9. Produção e identificação de plantas de milho que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II
As plantas de milho (variedade A188) foram transformadas com o plasmídeo pJH77 de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 5. As plantas obtidas receberam o nome JH77-X, em que X representa plantas independentes produzidas partindo da transformação. As plantas que se originam da transformação com o plasmídeo JH77 (plantas T0) foram cultivadas na estufa e polinizadas com pólen de plantas do tipo selvagem (variedade A188).
A proteína foi extraída de grãos não-maduros isolados (ca. 15 dias após a polinização) (grãos T1) de plantas independentes obtidas após a transformação com o plasmídeo pJH77 e da polinização cruzada com o tipo selvagem assim como de plantas do tipo selvagem não-transformadas (A188). Os respectivos extratos de proteínas de várias plantas foram anali83 sados em zimogramas de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 9. Para a quantificação do aumento na atividade da proteína que possui a atividade de uma SS II, os extratos de proteínas provenientes de linhagens transgênicas foram sequencialmente diluídos. O resultado de tal análise é exemplificado pela figura 5. Várias plantas exibiram um aumento de atividade da proteína que possui a atividade de uma amido sintase II de um fator entre 3 e 5 em comparação com as plantas do tipo selvagem (A188).
10. Preparação do vetor de expressão de planta pHN3, que compreende a sequência codificadora para uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase
O vetor pHN3 (Fig. 7) é derivado de pRPA-BL150-Ao2 (EP0337899).
A estrutura do vetor contém os elementos genéticos a seguir:
| Posições de Nt | Orientação | Origem |
| 6600-6623 | RB: repetição na borda direita do T-DNA de Agrobacteríum fumefac/ens (Zambryski, 1988) | |
| 6624-6909 | TL-DNA de pTiAchõ (Gielen e outros, 1984) | |
| 6910-6934 | attB2: variação da sequência de reconhecimento attB de Escherichia coli (Hartley e outros, 2000) | |
| 6935-7254 | no sentido anti-horário | 3’nos: sequência que inclui a região não traduzida a 3’ do gene da nopalina sintase do T-DNA de pTiT37 (Depicker e outros, 1982) |
| 7255-11984 | no sentido anti-horário | r1St: sequência codificadora do gene r1 de Solanum tuberosum (Lorberth e outros, 1998) |
| 11985-12504 | no sentido anti-horário | ubilZm(intron): primeiro íntron do gene da ubiquitina-1 de Zea mays (milho) (Christensen e outros, 1992) |
| 12505-13537 | no sentido anti-horário | PubiZm: sequência que inclui a região promotora do gene da ubiquitina-1 de Zea mays (milho) como descrito por Christensen e outros, 1992 |
| 13538-13562 | attB1: variação da sequência de reconhecimento attB de Escherichia coli (Hartley e outros, 2000) | |
| 13563-15337 | no sentido horário | PactIOs: sequência que inclui a região promotora do gene da actina 1 de Oryza sativa (McElroy e outros, 1990) |
| 15338-15815 | no sentido horário | actlOs(intron): sequência que inclui o íntron do gene da actina 1 de Oryza sativa (McElroy e outros, 1990) |
| 15816-16367 | no sentido horário | bar: a sequência codificadora do gene da fosfinotricina acetiltransferase de Streptomyces hygroscopicus como descrito por Thompson e outros (1987). |
| 16368-16638 | no sentido horário | 3’nos: sequência que inclui a região não traduzida a 3' do gene da nopalina sintase do T-DNA de pTiT37 (Depicker e outros, 1982) |
| 16639-296 | TL-DNA de pTiAchõ (Gielen e outros, 1984) | |
| 297-320 | LB: repetição da borda esquerda do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens (Zambryski, 1988) |
Tabela 8: Elementos genéticos do plasmídeo pHN3.
Bolívar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., Boyer, H.W., Crosa, J., Falkow, S. (1977).
Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene, 2, 95-113.
Christensen, A.H., Sharrock.R.A., Quail,P.H. (1992).
Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation.
Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689.
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Thompson, C.J., Rao Movva, N., Tizard, R., Crameri, R., Davies, J., Lauwereys, M., Bottermann, J. (1987). Characterization of the herbicide resistance gene bar from Streptomyces hygroscopicus. EMBO J., 6, 2519-2523._
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Tabela 9: referências citadas na tabela 8.
11. Produção e identificação de plantas de milho que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase
As plantas de Zea mays (variedade A188) foram transformadas com o plasmídeo pHN3 de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 5. As plantas obtidas receberam o nome HN3-X, em que X representa plantas independentes produzidas partindo da transformação.
As plantas que se originam da transformação com o plasmídeo pHN3 (plantas TO) foram cultivadas na estufa e polinizadas com pólen de plantas do tipo selvagem (variedade A188). As plantas da geração T1 resultante foram cultivadas na estufa e borrifadas no estágio de três folhas com uma solução contendo 0,5% de Basta®. Apenas os grupos de plantas T1 dos quais ca. 25% das 30 plantas cultivadas em cada caso morreram após a aspersão com a solução de Basta® foram acompanhadas adicionalmente, porque estas plantas são aquelas para as quais a integração do T-DNA relacionado do plasmídeo pHN3 está presente em um único lócus no genoma. O DNA genômico foi isolado do material foliar de ca. 75% das plantas que sobreviveram à aspersão com a solução de Basta® e verificado em cada caso em relação ao número de cópias presentes em cada caso através da tecnologia Invader® (Pielberg e outros 2003, Genome Res.;13, 2171-2177). As plantas T1 dentro de um grupo de prole de uma planta T0 que exibia um sinal aproximadamente duas vezes mais forte que o da prole restante da mesma planta T0 em uma análise através da tecnologia Invader® são homozigotas em relação ao lócus em que o T-DNA do plasmídeo está integrado. Se aproximadamente 30% da prole de uma planta T0 que sobreviveram ao tratamento com a solução de Basta® exibirem um sinal aproximadamente duas vezes mais forte na análise através da tecnologia Invader, em comparação com ca. 70% restantes da prole da mesma planta T0, então isto é uma indicação adicional de que a integração do T-DNA ocorre em um único lócus.
O conteúdo de amido fosfato foi determinado de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 2a) no amido isolado de grãos colhidos de plantas selecionados como descrito anteriormente. O amido, isolado da linhagem HN3-101 tinha um conteúdo de amido fosfato na posição C6 de 4,6 nmols por mg amido.
12. Produção e identificação de plantas de milho que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase
Várias linhagens independentes (JH77-X) que exibem graus diferentes no aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II foram utilizadas para o cruzamento com plantas da linhagem HN3-101, que era homozigota em relação à integração do T-DNA do plasmídeo pHN3. As plantas denominadas HN3-101 foram utilizadas como doadoras de pólen (parceiro de cruzamento do sexo masculino) e as plantas das linhagens JH77-X foram utilizadas como o parceiro de cruzamento do sexo feminio. As plantas F1 que se originam destes cruzamentos foram cultivadas na estufa, o DNA foi extraído das folhas. Várias plantas F1 que carregavam ambos os transgenes podiam ser selecionadas com o auxílio da PCR. Várias plantas F2 de cada uma destas plantas foram cultivadas na estufa e o DNA genômico foi isolado do material foliar e verificado em cada caso em relação ao número de cópias presentes para ambos os transgenes através da tecnologia Invader® (Pielberg e outros 2003, Genome Res.;13, 2171-2177). As plantas F2 dentro de um grupo de prole de uma planta F1 que exibia um sinal aproximadamente duas vezes mais forte que o da prole remanescente da mesma planta F1 em uma análise através da tecnologia Invader® devem ser observadas como sendo homozigotas em relação aos respectivos loci em que os T-DNAs de ambos os plasmídeos estão integrados.
A tabela a seguir mostra a origem das plantas que foram selecionadas como descrito anteriormente:
| Parceiro de cruzamento do sexo masculino | Parceiro de cruzamento do sexo feminino | Nome designado da planta F2 selecionada |
| HN3-101 | JH77-01903 | Cruzamento-13 |
| HN3-101 | JH77-02101 | Cruzamento-49 |
Tabela 10: origem das plantas que foram obtidas após o cruzamento de plantas das linhagens HN3-101 e JH77-X.
13. Análise do amido de plantas que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II e uma alfa-glucanoágua diquinase
As espigas maduras das plantas denominadas Cruzamento-13 e Cruzamento-49 foram colhidas, adicionalmente secas como descrito sob os métodos gerais, item 11.0 amido foi extraído dos grãos como descrito sob os métodos gerais, item 12. O conteúdo de amido fosfato nestes amidos foi analisado de acordo com o método descrito sob os métodos gerais, item 2a) e o poder de intumescimento em água quente foi analisado como descrito sob os métodos gerais, item 1. Foram obtidos os resultados a seguir:
| Nome da planta | nmol de fosfato em C6 por mg de amido | Poder de intumescimento do amido [g/g] |
| A188-105 | 0,34 | 28,2 |
| A188-114 | 0,13 | 30,8 |
| JH77-01903 | 0,16 | 22,0 |
| JH77-02101 | 0,16 | 22,2 |
| HN3-101 | 4,70 | 42,3 |
| Cross-13 | 6,49 | 48,6 |
| Cross-49 | 5,97 | 47,4 |
Tabela 11: conteúdo de amido fosfato e poder de intumescimento de amido isolado de plantas que possuem uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma amido sintase II (JH77-01903, JH77-02101), uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma alfa-glucanoágua diquinase (HN3-101) ou de plantas que possuem uma maior atividade de ambas as proteínas (Cruzamento-13, Cruzamento-49) em comparação com as plantas do tipo selvagem (A188-105, A188-114).
Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES1. Processo para a produção de uma planta modificada geneticamente, caracterizado pelo fato de quea) uma célula vegetal é modificada geneticamente, a modificação genética compreendendo as etapas i e ii a seguir em qualquer sequência desejada, individualmente ou simultaneamentei) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma amido sintase II contida na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou codificada pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 5 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a mesma sequência de aminoácidos em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamente, ii) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, a modificação genética levando ao aumento na atividade de uma proteína que possui a atividade enzimática de uma glucano-água diquinase contida na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a mesma sequência de aminoácidos em comparação com células vegetais do tipo selvagem correspondente que não são modificadas geneticamenteb) uma planta é regenerada partindo das células vegetais da etapa a);c) opcionalmente plantas adicionais são produzidas com oPetição 870170064430, de 31/08/2017, pág. 5/10 auxílio das plantas de acordo com a etapa b), em que as células vegetais são opcionalmente isoladas das plantas de acordo com a etapa b) ou c) e as etapas a) até c) do processo são repetidas até ter sido produzida uma planta que possui uma maior atividade de uma proteína5 que possui a atividade de uma amido sintase II e uma maior atividade de uma proteína que possui a atividade de uma glucano-água diquinase.
- 2. Processo para a produção de um amido modificado, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa da extração do amido das células vegetais modificadas geneticamente, de planta, de material de10 propagação ou de plantas que podem ser obtidas através de um processo como definido na reivindicação 1.
- 3. Uso de plantas de compreendem células vegetais geneticamente modificadas, de material de propagação da dita planta ou de plantas que podem ser obtidas através de um processo como definido na reivindicação 1,15 caracterizado pelo fato de que é para a produção de amido.
- 4. Amido modificado, caracterizado pelo fato de que é obtido por um processo como definido na reivindicação 2 e que tem um teor de fosfato de amido ligado na posição C6 das moléculas de glicose do amido de pelo menos 11 nmol por mg de amido, em que o amido é um amido de milho com um poder20 de intumescimento em água quente de pelo menos 40 g/g a 92° C, ou um amido de arroz com um poder de intumescimento em água quente de pelo menos 65 g/g a 92°C.
- 5. Processo para a produção de um amido derivatizado, caracterizado pelo fato de que o amido modificado como definido na25 reivindicação 4 é subsequentemente derivatizado.
- 6. Amido derivatizado, caracterizado pelo fato de que pode ser obtido através de um processo como definido na reivindicação 5.
- 7. Uso do amido modificado como definido na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para a produção de amido derivatizado.30
- 8. Farinha, caracterizada pelo fato de que compreende um amido modificado, que pode ser obtido através de um processo como definido na reivindicação 2 ou que compreende um amido modificado como definido naPetição 870170064430, de 31/08/2017, pág. 6/10 reivindicação 4.
- 9. Processo para a produção de farinhas, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de moagem de plantas, de material de propagação ou de plantas que podem ser obtidas através de um processo como definido na5 reivindicação 1.
- 10. Uso de células vegetais modificadas geneticamente, de plantas, de material de propagação ou de plantas que podem ser obtidas através de um processo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a produção de farinhas.Petição 870170064430, de 31/08/2017, pág. 7/101/5Determinação da Atividade de SS2 na Linhagem transgênica oe-SSIIa-O.s.-12WT pur 1:2 1.4 1:6 1:8 1:101:20 WT
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