BRPI0715427A2 - mÉtodo para amplificaÇço de sequÊncia ou sinal de Ácidos nucleicos alvo, oligonucleotideo mofificado reversÍvel, mistura e conjunto de reaÇço de amplificaÇço de Ácido nucleico - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA AMPLIFICAÇçO DE SEQUÊNCIA OU SINAL DE ÁCIDOS NUCLEICOS ALVO, OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO PEVERSÍVEL, MISTURA E CONJUNTO DE REAÇçO DE AMPLIFICAÇçO DO ÁCIDO NUCLEICO. A presente invenção fornece um método para a amplificação de uma seqúência ou sinais alvo de ácidos nucleicos, onde uma mistura de reação de amplificação é usada contendo pelo menos um oligonucleotideo modificado reversivelmente rendo uma extremidade 3<39> de um grupo não hidroxila, que pode ser convertido em uma extremidade 3' de hidroxila após a exposição a um produto químico e/ou irradiação e/ou faixa de temperatura. A presente invenção também fornece um oligonucleotideo reversivelmentemodificado, como descrito acima, e uma mistura de reação de amplificação de ácidos nucleicos e um conjunto compreendendo tal oligonucleotídeo.

Description

MÉTODO PARA AMPLIFICAÇÃO DE SEQÜÊNCIA OU SINAL DE ÁCIDOS NUCLEICOS ALVO, OLIGONUCLEOTIDEO MODIFICADO REVERSÍVEL, MISTURA E CONJUNTO DE REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO DO ÁCIDO

NUCLEICO

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere geralmente ao campo da química do ácido nucleico. Mais especificamente, se refere a métodos de amplificar seqüências ou sinais de ácidos nucleicos e a métodos de reduzir a amplificação não específica.

FUNDAMENTOS

As tecnologias de amplificação do ácido nucleico são amplamente utilizadas na microbiologia clínica, classificação do sangue, segurança alimentar, diagnóstico de doenças genéticas e prognósticos, microbiologia ambiental, descoberta e validação da droga alvo, forense e outras pesquisas biomédicas. 0 vigor da amplificação do ácido nucleico, especificidade, sensibilidade, confiabilidade nos termos da exatidão e a precisão, e a disponibilidade são de importância particular.

A amplificação específica da seqüência do ácido nucleico permite a detecção sensível da presença de uma seqüência específica. A reação em cadeia da polimerase (PCR) e a reação em cadeia da ligase (RCL) são duas tecnologias termocíclicas de amplificação.

Ao contrário da PCR e RCL, a amplificação isotérmica refere-se a uma categoria de amplificação na qual a amplificação é realizada a uma temperatura substancialmente constante. A amplificação mediada por transcrição (TMA) , amplificação baseada na seqüência de ácido nucleico (NASBA) , amplificação por deslocamento de fita (SDA), amplificação em círculo rolante (RCA), amplificação isotérmica do único primer (SPIA™), e amplificação isotérmica do único primer exponencial (X-SPIA™) , replicação de seqüência auto- sustentável (3SR) e a amplificação isotérmica laço-negociada (LAMP) são exemplos de amplificação isotérmica. A seqüência do ácido nucleico pode igualmente ser detectada através do processo de amplificação do sinal, tal como o experimento cíclico e a ensaio 'invasor. 0 sinal detectável é gerado pela segmentação da nuclease do experimento hibridizado.

Porque todas as enzimas, independentes de sua

termoestabilidade, são ativas em uma escala de temperatura, tal propriedade poderia adversamente afetar a amplificação do ácido nucleico em termos de especificidade, sensibilidade e taxa sinal/ruído etc. Isto foi demonstrado claramente no processo da PCR. Uma polimerase de DNA termoestável é essencial para uma PCR. Embora a temperatura ótima da atividade catalítica de uma polimerase de DNA termoestável seja em torno de 60 a 75°C, também é ativa em baixas temperaturas. Ela retém a atividade significativa mesmo na temperatura ambiente. Sua atividade em baixa temperatura é uma causa da formação de dímero do primer, amplificação não específica e sensibilidade reduzida de detecção.

O desempenho da PCR do DNA é melhorado empregando tecnologias de início quente. "Início quente" refere-se a qualquer método de montagem de reações da PCR que mantêm um ou vários componentes da reação fisicamente ou funcionalmente separados do resto dos componentes em baixa temperatura e que permite o início das reações em uma temperatura elevada. Tecnologias de início quente da PCR são categorizadas nos seguintes grupos:

1. Barreira física para dividir todos os componentes essenciais pelo menos em dois compartimentos como descrito na Pat. U.S No. 5.411.876, 5.565.339; 5.413.924 e 5.643.764, todas sendo incorporadas neste por referência. A barreira é

removida pelo aquecimento a temperaturas elevadas.

2. Inibidores de enzima reversível para suprimir a atividade da enzima em baixa temperatura como descrito nas patentes US 5.338.671; 5.677.152; 5.773.258; 6.183.998; 5.693.502, 5.874.557, 5.763.173, 6.020.130, e 6.183.967, que

são incorporadas neste por referência. A ligação do inibidor pode ser covalente ou não-covalente. O início quente por estes métodos é homogêneo e é mais amplamente utilizado.

3. Separação de fase do co-fator como descrito na patente US 6.403.341, incorporada neste por referência. Mg2+ é precipitado em baixa temperatura e torna-se solúvel à medida que a temperatura aumenta.

A RT PCR em etapa única é um processo de amplificação do RNA alvo, combinando a transcrição reversa da molécula de RNA e amplificando complementarmente a molécula de DNA em um frasco. As moléculas de RNA alvo incluem o HIV, HCV, virus do Nilo Ocidental (WNV), virus da gripe humana, virus da gripe aviária, virus da Dengue, virus Ebola etc. Nos Estados Unidos, é obrigatório para testar a presença de HIV, HBV, HCV e WNV em doadores de sangue. 0 desempenho da RT-PCR em etapa única é critico para estes testes clínicos e de classificação de sangue. Infelizmente, nenhuma das tecnologias de inicio a quente existentes pode ser bem aplicada a este processo, porque:

1. A maior parte da transcriptase reversa, a enzima chave para a transcrição reversa, não pode ser um alvo para o

processo de início a quente porque não são termostáveis e perderão atividade após a incubação em alta temperatura.

2. A molécula de RNA, o tema do ensaio, não é estável e sofre degradação significativa a alta temperatura. A presença de íons metálicos bivalentes, como Mg2+ torna a degradação

muito severa. Nenhuma das tecnologias existentes pode ser aplicada sem danificar as moléculas de RNA alvo.

3. Longo tempo de incubação do processo de transcrição reversa, geralmente de 30 minutos ou mais, aumenta tremendamente a chance de ter reações colaterais que poderiam

reduzir drasticamente a detecção da sensibilidade. Isto mostra que os inibidores da enzima baseados em tecnologias de início a quente não iria melhorar o desempenho da RT PCR em etapa única.

Devido a importância prática da amplificação de ácidos nucleicos, há forte procura de uma nova tecnologia que possa melhorar o desempenho da reação de amplificação do ácido nucleico, especialmente uma RT PCR em etapa única. Nesta solicitação um novo inicio controlado da reação de amplificação de ácidos nucleicos é descrita. Todas as patentes, pedidos de patentes e publicações aqui mencionadas, tanto supra e infra, são incorporadas neste documento por referência.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os inventores pensam não existir uma tecnologia de inicio a quente envolvendo oligonucleotideos, e que como um componente essencial para a amplificação de ácidos nucleicos, o oligonucleotideo é um alvo ideal para tecnologias de inicio a quente ou controlado.

Δ presente invenção fornece um método para a amplificação de uma seqüência ou sinal alvo de ácidos nucleicos, onde uma mistura de reação de amplificação é usada a qual contém pelo menos um oligonucleotideo modificado reversível tendo extremidade 3' de um grupo não-hidroxila, que pode ser convertida em uma extremidade 3' de hidroxila após a exposição a um produto químico e/ou irradiação e/ou uma faixa de temperatura.

A presente invenção também fornece um método para a amplificação de uma seqüência ou sinal alvo de ácidos nucleicos, compreendendo as etapas de:

(a) contatar uma amostra suspeita de conter o ácido nucleico alvo com uma mistura de reação de amplificação

contendo, pelo menos, um oligonucleotideo modificado reversível, onde o oligonucleotideo modificado reversível não tem uma extremidade 3' não-hidroxila que pode ser convertida em uma extremidade 3' hidroxila após exposição a um produto químico e/ou irradiação e/ou faixa de temperatura;

(b) expor a mistura da etapa (a) ao produto químicos e/ou irradiação e/ou faixa de temperatura para um tempo suficiente para regenerar a extremidade 3' hidroxila 3; e

(c) realizar a reação de amplificação.

A presente invenção também fornece um método para a

amplificação de uma seqüência alvo ácido ribonucléico, o método compreendendo as etapas de:

(a) contatar uma amostra suspeita de conter o ácido ribonucléico alvo com uma mistura de reação de amplificação que contém, pelo menos, um primeiro oligonucleotideo modificado reversível, onde o primeiro oligonucleotideo modificado reversível não tem uma extremidade 3' não- hidroxila que pode ser convertida em uma extremidade 3' hidroxila após exposição a um primeiro produto químico e/ou irradiação e/ou primeira faixa de temperatura; (b) incubar a mistura da etapa (a) em condições que

permitam a transcrição reversa do ácido ribonucléico;

(c) expor a mistura da etapa (b) ao referido primeiro produto químico e/ou irradiação e/ou primeira faixa de temperatura por um tempo suficiente para regenerar a

extremidade 3' de hidroxila do primeiro oligonucleotideo modificado reversível; e

(d) realizar a reação de amplificação para produtos de extensão do primer.

Em uma modalidade do método de amplificação de uma seqüência alvo de ácido ribonucléico, a mistura de reação de amplificação ainda inclui pelo menos um segundo oligonucleotideo modificado reversível, onde o segundo oligonucleotideo modificado reversível tem uma extremidade 3' não-hidroxila que pode ser convertida em uma extremidade 3 ' de hidroxila após a exposição a um segundo produto químicos e/ou irradiação e/ou uma segunda faixa de temperatura, e em que o método ainda inclui uma etapa de exposição da mistura da etapa (a) com o segundo químicos e/ou irradiação e/ou segunda faixa de temperatura por um tempo suficiente para regenerar a extremidade 3' de hidroxila do segundo oligonucleotideo modificado reversível antes da etapa (b) .

A presente invenção também fornece um oligonucleotideo modificado reversível com uma extremidade 3' de grupo não- hidroxila, que pode ser convertida em uma extremidade 3' de hidroxila após a exposição a um produto químico e/ou irradiação e/ou faixa de temperatura. A presente invenção também fornece uma mistura de reação de amplificação de ácidos nucleicos e conjunto composto pelo oligonucleotideo modificado reversível da presente invenção.

Exemplos de extremidade 3' não-hidroxila do oligonucleotideo modificado reversível da presente invenção são, mas não se limitando a, um éster de ácido carboxílico, um grupo de éter incluindo silil éter e um grupo fotolítico.

Em uma modalidade preferida, o método da invenção é útil em um processo RT PCR em única etapa com um sistema de duas enzimas, no qual pelo menos uma transcriptase reversa e uma polimerase de DNA termostável são utilizadas, ou com um sistema de uma enzima, no qual apenas uma enzima é usada que funciona como uma transcriptase reversa ou uma polimerase de DNA.

Em outra modalidade preferida, pelo menos 25%, de

preferência pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 75%, e ainda mais preferível pelo menos 90% das extremidades 3' do grupo não-hidroxila do oligonucleotideo modificado reversível da invenção é convertida em uma extremidade 3' de hidroxila.

O oligonucleotideo baseado na amplificação de ácidos nucleicos de início controlado da presente invenção, além de ser uma alternativa à tecnologia de início a quente, pode melhorar o desempenho de diversas reações de amplificação de ácidos nucleicos, especialmente as reações RT-PCR.

BREVE DESCRIÇÃO DE DESENHOS

Figura la. Modificação do oligonucleotideo com um anidrido.

Na presença do catalisador DMAP em TEA, grupos hidroxila de oligonucleotideo, incluindo tanto grupos hidroxila 5'e 3', formam éster com anidrido maléico.

Figura 2. Hidrólise do éster maléico do oligonucleotideo.

A hidroxilamina é um produto químico altamente nucleofílico e pode efetivamente quebrar ligações de este carboxílico. Como um resultado tanto os grupos hidroxila 5' e 3' são regenerados e uma hidroxiamida é formada.

Figura 3. Modificação do oligonucleotideo com um trialquilsilil cloreto.

Grupos de hidroxila 5' e 3' de um oligonucleot ideo reagem com o terc-butildimetilsilil cloreto na presença de imidazol para formar o éter terc-butildimetilsilil.

Figura 4. Segmentação do silil éter por fluoreto.

0 silil éter é hidrolisado por fluoreto. Ambos os grupos hidroxila 5' e 3' são regenerados como resultado da hidrólise.

Figuras 5. Redução da formação do dimero do primer com oligonucleotideos modificados na PCR do DNA.

Figura 5a é curva de amplificação com oligonucleotideos (R) regulares inalterados e oligonucleotideo (M) modificados na presença do modelo (T+) ou na ausência do modelo, ou seja, nenhum modelo de controle (NTC). A PCR foi feita o inicio a frio regular da Taq polimerase. A amplificação foi monitorado com corante Sybr Green™, um fluoroforo de coloração especifica de ácido nucleico de filamento duplo. Sybr GreenTM detecta o DNA de filamento duplo de uma maneira não-seqüência especifica. Por conseguinte, os dois dimeros de primer amplificados e a seqüência alvo são detectados. Dimero do primer e a seqüência alvo são distinguidos por curvas de derretimento de produtos amplificados (Figura 5b) .

Figuras 6. Ineficácia da Taq Polimerase de DNA de inicio a quente na prevenção da formação do dimero de primer sob uma condição de reação RT-PCR em única etapa com oligonucleotideos regulares inalterados.

Sob a condição de RT PCR em única etapa, tanto a Taq Polimerase de DNA (regT) regular e Taq Polimerase de DNA (HST) de inicio a quente produziram dimero do primer só independentemente da presença de modelo (T+) ou ausência do modelo (controle sem modelo, NTC) . Curvas de ampliação e fusão são mostradas na Figura 6a e 6b, respectivamente.

Figura 7. Redução da formação de dimero de primer por oligonucleotideos modificado. Todas as reações de PCR foram feitas com Taq Polimerase de DNA regular na ausência do modelo. Por conseguinte, todos os produtos observados' aqui são dimeros de primers. É uma forma de medir quantos dimeros de primers são formados em condições diferentes. Quanto mais dimeros de primers são formados, mais cedo a curva de amplificação surge.

Oligonucleotideos regulares inalterados (R) produziram dimeros de primers. A presença da transcriptase reversa (RT+) conduziu a formação de mais dimeros de primers do que a ausência da transcriptase reversa (RT~) como refletido na diferença de ciclo ~4 no valor Ct. Em contraste, o dímero de primer é muito reduzido com oligonucleotideos modificados (M) . A presença da transcriptase reversa não levou a maior formação de dimeros de primers. Figura 8. Melhoria do desempenho RT PCR em única etapa

com oligonucleotideos modificados.

Com oligonucleotideos modificados (M) , o Ct do dimero de primer é atrasado em 11 ciclos, em comparação com os oligonucleotideos regulares (R) . Com oligonucleotideos regulares, a formação severa de dimero de primer não causou a amplificação da seqüência alvo mesmo na presença de 1250 cópias da seqüência alvo (Figura 8b). Em contraste aos oligonucleotideos modificados resultaram na amplificação limpa da seqüência alvo sem que o dimero de primer como revelado pela curva de fusão dos produtos amplificados.

Tabela 1. Número de espécies possíveis dos dimeros de primer vs o número de oligonucleotideos presentes em um sistema de amplificação.

A tabela é gerada com base nas seguintes hipóteses: 1. Cada alvo é amplificado com dois oligonucleotideos

diferentes;

2. Cada dímero de primer (PD) é formado com dois oligonucleotideos diferentes.

3. Qualquer um dos dois oligonucleotideos só poderia constituir um dímero de primer.

Número de espécies possíveis de dímero de primer (# PD) é calculado com a seguinte equação:

#PDs=N(2N-1)

N é o número de alvos a serem amplificados.

Quando N aumenta, o número de oligonucleotideos exigidos aumenta linearmente. Entretanto #PD sobe geometricamente. Por exemplo, existem dois oligonucleotideos em um sistema de amplificação em single-plex. Nesse sistema single-plex, existe apenas um alvo direcionado a amplificação e uma espécie de dimero de primer. A taxa #PD/N é 1. Em um sistema de amplificação decaplex, há vinte oligonucleotideos e 10 seqüências alvo. Agora #PD é aumentado para 190. A taxa #PD/N espécies torna-se 19.

O aumento geométrico do número de espécies do dimero de primer faz o PCR multiplex muito desafiador especialmente em um sistema RT-PCR em única etapa no qual a chance da formação de dimero de primer é fortemente aumentada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um método de amplificação de uma seqüência ou de sinais alvo de ácidos nucleicos, onde uma mistura de reação de amplificação é usada contendo pelo menos uma oligonucleotideo modificado reversível com uma extremidade 3' de grupo não-hidroxila que pode ser convertida em uma extremidade 3' de hidroxila após uma exposição a produtos químicos e/ou irradiação e/ou uma faixa de temperatura.

Conforme utilizado aqui, o termo "amplificação de ácidos nucleicos" refere-se à amplificação da seqüência do ácido nucleico (ex. RCR, RT-PCR) , ou a amplificação do sinal do ácido nucleico (ex. ensaio invasor). Normalmente um oligonucleotideo utilizados na

amplificação de ácidos nucleicos tem um grupo hidroxila 3' . O grupo hidroxila 3' é essencial para o oligonucleotideo: i. para ser estendido por uma polimerase de ácido nucleico; e ii. para ser ligado por uma ligase de ácido nucleico. Também impacta: i. susceptibilidade a 3' -» 5' atividade da nuclease que é chamada de atividade de revisão; e ii. formação de uma estrutura segmentável era uma ensaio invasor. Assim, a modificação do grupo hidroxila 3' do primer do oligonucleotideo iria inibir eficazmente a sua · função na reação de amplificação.

Critérios de escolha de um grupo de modificadores

adequados são:

1. Um processo que produz oligonucleotideo com modificação completa ou quase completa.

2. Oligonucleotideo modificado é estável em condição de armazenamento.

0 oligonucleotideos é normalmente armazenado em solução aquosa a 4°C ou -20°C. Reversão automática mensurável na condição não ocorre.

3. Produtos químicos utilizados para reverter a alteração e produtos oriundos a partir da clivagem não

interferem no processo de amplificação de ácidos nucleicos. Porque é preferível fazer o início controlado em um sistema homogêneo, sem etapa adicional de manipulação, é importante que o produto químico e/ou produtos clivados não inibirão a atividade significativa da enzima (polimerase, ligase, nuclease etc) nem a mudança da especificidade da reação.

4. Temperatura na qual a reversão é efetivamente realizada é compatível com a termoestabilidade da enzima para o sistema da reação. Por exemplo, seria melhor ter a reversão

realizada a uma temperatura superior a 60°C em um sistema de PCR. Para a amplificação de ácidos nucleicos por T MA, a reversão deve ser feita abaixo de 45°C.

Em uma modalidade preferida, o oligonucleotideo modificado reversível da invenção tem um éster de ácido carboxílico 3'. Para regenerar o grupo hidroxila 3', um produto químico selecionado a partir, mas não se limitando a azida, imidazol, piridina, hidroxilamina, hidrazina, hidróxido de tetrabutilamônia, é utilizado.

Em outra modalidade preferida, o oligonucleotideo modificados reversivelmente da invenção tem um silil éter 3'. Para remover o grupo silil 3' e regenerar o grupo hidroxila 3', um produto químico contendo fluoreto é incluído no sistema de reação.

Em ' outra modalidade preferida, o oligonucleotideo modificado reversível da invenção tem um grupo éter 3' .

Em outra modalidade preferida, o oligonucleotideo

modificado reversível da invenção tem um grupo 3' modificado que pode sofrer clivagem fotolítica para gerar grupo hidroxila 3'. O grupo fotolítico é removido pela luz ou em combinação com um produto químico. Modificador do oligonucleotideo da presente invenção é

anexado ao oligonucleotideo por:

1. Modificação pós-síntese.

2. Sintetizador do oligonucleotideo usando um suporte de síntese tendo um modificador

3. Sintetizador de oligonucleotideo usando um suporte de

síntese tendo um nucleosídeo modificado

4. Sintetizador de oligonucleotideo usando um nucleosídeo de fosforamidita modificado. A direção da síntese é tanto 5' para 3' ou 3' para 5'. 5. Sintetizador de oligonucleotideo usando um reagente

Além da melhoria da amplificação qualitativa do ácido nucleico por reação de PCR de início a quente, a invenção descrita aqui é capaz de melhorar a amplificação de ácidos nucleicos por amplificação isotérmica qualitativa e quantitativamente.

Existem relatos de detecção quantitativa do ácido nucleico por diversas tecnologias de amplificação isotérmica incluindo S DA, TMA, NASBA, RCA (Walker, 1996; Spears, 1997; Nadeau, 1999; Leoa, 1998; Nilsson, 2002, todos os quais são incorporados aqui por referência). No entanto, a exatidão e precisão desses ensaios claramente precisam ser melhoradas. Uma causa da quantificação pobre é a falta de início controlado da reação de amplificação.

De acordo com a presente invenção, um oligonucleotideo utilizado na amplificação de ácidos nucleicos tem uma fração 3' diferente do grupo hidroxila. No entanto o grupo hidroxila 3' pode ser gerado pela exposição a produtos químicos e/ou irradiação e/ou faixa de temperatura. A regeneração do grupo hidroxila 3' permite a amplificação de ácidos nucleicos por:

i. Amplificação da seqüência alvo por polimerase de ácidos nucleicos.

Processos de amplificação da seqüência alvo mediados por polimerase incluem reação em cadeia de polimerase (PCR), amplificação de círculo rolante (RCA), amplificação por deslocamento de fita (SDA), amplificação isotérmica do único primer (SPIA™), amplificação isotérmica do único primer exponencial (X-SPIA™) , amplificação isotérmica laço- negociada (LAMP), amplificação baseada na seqüência de ácido nucleico (NASBA), amplificação mediada por transcrição (TMA), e replicação de seqüência auto-sustentável (3SR). O grupo hidroxila 3' é necessário para reação de

polimerização do ácido nucleico.

ii. Ligação mediada pela amplificação da seqüência alvo.

Nesta categoria, a ligação é uma etapa fundamental para

obter a seqüência alvo amplificada. As tecnologias incluem a reação em cadeia da ligase (LCR) , a LCR permitida como descrito na patente US 6511810; Iacuna-LCR (patente US 5,427,930), e ligação mediada por PCR.

Na ligação mediada por PCR, a ligação ocorre antes do processo de PCR. A ligação é para adicionar uma seqüência de primer alvo. Os oligonucleotideos tanto para a ligação da reação e PCR são assunto da presente invenção.

iii. Ensaio invasor

Ensaio invasor (patentes US 6348314, 6090543, 6001567, 5985557, 5846717 e 5837450, todas as quais são incorporadas por referência neste documento) , é uma análise de amplificação de sinal. O modelo alvo, um oligonucleotideo invasivo a montante e um oligonucleotideo a jusante que sobrepõe parcialmente o oligonucleotideo invasivo forma uma estrutura invasiva. As endonucleases flap clivam o oligonucleotideo a jusante para gerar a detecção de sinal. Verificou-se que a extremidade 3' do oligonucleotideo invasivo afeta muito a clivagem. Na verdade, a estrutura de clivagem formada com o oligonucleotideo invasivo tendo uma extremidade 3' não-hidroxila mostrou a clivagem drasticamente reduzida.

Suprimindo a formação de dimero de primer/reação não- especifica abaixo da temperatura de reação e controlando a inicio da reação, a presente invenção melhorará a sensibilidade e capacidade dos métodos de amplificação de ácidos nucleicos acima.

0 oligonucleotideo da presente invenção contém uma seqüência que é capaz de hibridização especifica para uma seqüência de ácido nucleico alvo desejada. Em uma modalidade, o oligonucleotideo contém uma seqüência complementar a somente uma seqüência de ácido nucleico alvo. Em outra modalidade, ele tem uma região não complementar à seqüência alvo. A seqüência não complementar está localizada na região 5' do oligonucleotideo.

Em outra modalidade, o oligonucleotideo da presente invenção tem uma estrutura secundária que muda, por exemplo, diminui ou desaparece após formação duplex que é resultado da amplificação.

0 oligonucleotideo pode ser constituído por cinco partes:

1 Bases;

ii. Grupo de açúcar

iii. Ligação entre nucleosideo

iv. Um grupo de geração de sinal para detecção

v. Outros grupos.

i. As bases incluem quaisquer bases naturais, sem qualquer limitação, adenina, N6-metil adenina, N6-isopentenil adenina, guanina, 7-metil guanina, querosina, wyosine, inosina, citosina, 3-metil citosina, 5-metil citosina, uracil, dihidrouracil, pseudouracil, 4-tiouracil e timina. Base análogas, que também podem ser utilizadas, incluem, sem limitação, 7-deaza-adenina, 7- deaza-guanina, 2-amino purina, 2,6-diamino purina (adenina e guanina), 2-e/ou 6-tio purina (adenina e guanina), 5-bromo uracil, 5-nitro indol, 5- propinil uracil, iso-citosina, iso-guanina 5-fenil-uracil, 2- N-metilguanina, 5-butinil-uracil, dimetiltiazol uracil, 5- propinil citosina, 5-fenil-citosina, 5-butinil-citosina, dimetiltiazol citosina, 9-(aminoetoxi)fenoxazina, 5-(N- aminohexil) carbamoil-uracil, 6-azatimina, N2-

imidazolilpropil-2-amino adenina, N2-imidazolilpropil-

guanina, bases modificadas conforme descrito na Pat. U.S. No. 6001611. As bases mais comumente utilizadas são adenina, guanina, citosina e timina.

ii. A estrutura principal do oligonucleotideo pode consistir tanto de um ligação de fosfodiester regular 5' para 3' ou várias modificações desta. Exemplos de modificações incluem ligação de peptideo como visto no ácido nucleico

peptidico (PNA) , fosforotioato, fosforoditioato, N3'-*05' fosforamidato, 03'-N5' fosforamidato, 3' fosforotiolato, 5' fosforotiolato, ligação invertida, metilfosfonato, ácido nucleico morfolínico, boranofosfonato, fosforo-N-

butilamidatos e metilenemetiliminas, espaçador-d, ligadores de carbono.

iii. O grupo de açúcar do oligonucleotideo utilizado na presente invenção é geralmente ribose e/ou 2-desoxiribose. Pode conter um ou vários outros tipos de frações de açúcar, por exemplo, 2-0-alquil ribose, 2-amino ribose, 2-fluoro

ribose, arabinose, 2-desoxi arabinose, 2-desoxi-2-fluoro arabinose, 1,5 -anidro hexitol, 2-0,4-C-metileno ribose como em ácidos nucleicos bloqueado (LNA) e estrutura principal de cicloexeno.

iv. De acordo com a presente invenção, o oligonucleotideo pode incluir uma fração de sinalização. A

fração pode ser qualquer uma que seja adequada para a detecção por métodos físicos, químicos, fotoquímicos, imunoquímicos e bioquímicos, incluindo, mas não se limitando a fluorescência, quimiluminescência, bioluminescência, eletroquimioluminescência, fosforescência, espectrometria resolvida no tempo, polarização de fluorescência, reação enzimática, radioatividade, colorimetria, espectrometria de massa, magnetismo, mobilidade electroforética,■ e cromatografia.

Em uma modalidade, a fração de sinalização inclui uma fração de indicação e uma fração de regulação separada por uma seqüência que pode formar um local de clivagem para uma nuclease ou uma ribozima. Um exemplo é a análise de Q-zyme de Takara/Clontech.

Em outra modalidade, a fração de sinalização inclui uma fração marcada e uma fração dissipadora que dissipa a fração marcada quando o oligonucleotideo está em estado de filamento único. Após a formação da estrutura de fita dupla, o sinal é gerado. Amplifluor™ e Scorpion™ são duas tecnologias representativas desta categoria. Essa interação entre a fração rotulada e a fração dissipadora pode ser entre quaisquer entidades adequadas, incluindo, sem limitação, pequenas moléculas, por exemplo, fluoróforos e seus dissipadores e grandes moléculas, por exemplo, moléculas de proteína (Boute, 2002). A interação também pode ser baseada em qualquer mecanismo adequado. Por exemplo, a fração marcada e a fração dissipadora podem interagir uma com a outra baseada na transferência de energia de ressonância, incluindo, sem limitação, transferência de energia de ressonância (FRET) , transferência de energia de ressonância de luminescência (LRET) , transferência de energia de ressonância de fosforescência (PRET) e transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET).

Entre as diversas frações marcadas e frações dissipadoras, sondas de FRET têm sido amplamente utilizadas na detecção de moléculas alvo amplificadas. A sonda mais comum de FRET tem duas frações interativas. Uma é o grupo doador de fluorescência e a outra é um grupo aceitador fluorescente. Embora o grupo aceitador possa ser fluorescente, é preferível ter um grupo não-fluorescente como o aceitador. 0 grupo doador pode ser colocado tanto na extremidade 5', no meio, ou na extremidade 3'. Assim como pode o grupo aceitador. É preferível colocar o grupo doador na extremidade 5'. A clivagem da sonda por uma estrutura especifica de nuclease quando a sonda hibridiza para um ácido nucleico alvo irá separar o grupo de doadores do grupo aceitador e liberará a dissipação da fluorescência do doador pelo aceitantor.

A fração de sinalização da sonda da presente invenção também pode ter mais de duas frações interativas. Por exemplo, patente US 5952180 descreve um método para fazer uma oligonucleotideo prorrogável com um espectro de emissão de fluorescência distinguivel. O único espectro de emissão de fluorescência é gerado pela transferência de energia de fluorescência combinatória tag. Outro exemplo diz respeito a um teste de deslocamento de comprimento de onda com três grupos interativos, conforme descrito na patente US 6037130.

Ainda em outra modalidade, o próprio oligonucleotideo pode ser uma fração reguladora que interage com uma fração indicadora. Por exemplo, Nurmi relatou a síntese de uma sonda quelatizada de térbio fluorescente isoladamente marcado e seu uso na detecção de produtos de PCR (Nurmi, 2000) .

O oligonucleotideo também pode fazer parte de um gerador de sinal binário ou trinário. Por exemplo, a sonda da presente invenção pode ser um oligonucleotideo binário preparado de acordo com os métodos descritos na Pat. U.S N°. 6432642. Outra sonda binária contém dois oligonucleotideos complementares é descrita em Li et al. (Li, 2002). A sonda da presente invenção também pode ser uma molécula tripartida preparada pelos métodos descritos para fazer uma sinalização molecular tripartida. (Nutiu, 2002) . Uma diferença seria que o oligonucleotideo participa tanto da amplificação e quanto da reação de detecção.

ν. 0 oligonucleotideo da presente invenção também pode conter grupos em posições selecionadas. Os grupos incluem, mas não se limitam a, aglutinante de ranhura mínimaminor groove subcapa, pireno, colesterol, acridina, biotina, modificador de mobilidade de eletroforese capilar, amina, carboxila, fosfato, tiol para facilitar a ligação do alvo, conjugação com a superfície ou outras moléculas ou detecção por eletroforese capilar.

A modificação de grupos hidroxila em um oligonucleotideo é uma prática comum para proteger o grupo hidroxila, para marcar o oligonucleotideo, para adicionar grupos funcionais especiais, para alterar várias propriedades, como a resistência da nuclease, afinidade de ligação etc. Por exemplo, o anidrido acético na presença de N-metilimidazola e tetrahidrofurano (TF) é utilizado para fazer nivelamento em síntese de oligonucleotideo automática.

Para a presente invenção, grupos modificados adequados têm de cumprir os seguintes critérios:

1. Capacidade para se regenerar o grupo hidroxila 3'.

É preferível que 10% a 100% dos oligonucleotideos modificados regenere seu grupo hidroxila 3'. É mais preferível que pelo menos 50% dos oligonucleotideos modificados regenere seu grupo hidroxila 3'. É ainda mais preferido que pelo menos 75% dos oligonucleotideos modificados regenere seu grupo hidroxil 3' . Mais preferido ainda é que, pelo menos, 90% dos oligonucleotideo modificados regenere seu grupo hidroxila 3'. A regeneração pode ocorrer antes que a amplificação de ácidos nucleicos comece ou acontecer gradualmente à medida que o processo de amplificação avança.

2. Um processo de modificação robusto produz oligonucleotideos com modificação completa ou quase completa. A presença de oligonucleotideo inalterado em um sistema de amplificação de ácidos nucleicos poderia prejudicar os benefícios desta invenção. A percentagem do oligonucleotideo inalterado produzindo tal impacto negativo depende de um determinado sistema de amplificação.

3. O oligonucleotideo modificado deve ser estável em condições de armazenagem, sem reversão automática mensurável . A solução de armazenamento tem de ser compatível com o sistema de reação de amplificação de ácidos nucleicos. Deve também ter estabilidade suficiente em uma mistura de reação na qual todos os componentes da reação estão presentes. Isto é especialmente importante para a ativação química assistida. É preferível que a temperatura- elevada possa acelerar muito o processo de ativação.

4 . A condição de reação reversa é compatível com o processo de amplificação de ácidos nucleicos. A ativação do oligonucleotideo modificado 3' é feita preferencialmente no mesmo sistema de reação como o sistema de amplificação de ácidos nucleicos. Portanto os produtos químicos utilizados para a ativação, produtos da ativação, temperatura, pH, força iônica, solventes, comprimento de onda e intensidade de luz em um processo de foto-ativação devem ser todos compatíveis com o processo de amplificação de ácidos nucleicos.

Um oligonucleotideo da presente invenção tem um grupo 3' constituído por um grupo não-hidroxila. Os grupos preferidos são:

1. Um grupo de éster carboxílico.

2. Um éter incluindo um grupo de éter silil.

3. Um grupo fotolítico.

0 modificador de oligonucleotideo da presente invenção é fixado ao oligonucleotideo por:

1. Modificação pós-síntese.

2. Sintetizador de oligonucleotideo usando um suporte de síntese tendo um modificador.

3. Sintetizador de oligonucleotideo usando um suporte de síntese tendo um nucleisideo modificado.

4. Sintetizador de oligonucleotideo usando um nucleosídeo fosforamidita modificado. A direção de síntese é tanto 5' para 3' ou 3' para 5'.

5. Sintetizador de oligonucleotideo usando um reagente.

Prefere-se a síntese por um sintetizador de

oligonucleotideo do que a modificação pós-síntese.

Quando a modificação pós síntese é usada para anexar grupo modificador a extremidade 3', um grupo hidroxila livre 5' é muito provável que seja alterado também. Em uma modalidade preferida, um oligonucleotideo da presente invenção tem um grupo 3' constituído por um grupo de éster de ácido carboxílico. 0 éster é selecionado, mas não se limitando a, éster de formiato, éster de benzoilformato, éster de haloacetato, éster de metoxiacetato, éster trifenilmetoxiacetato, éster de fenoxiacetato, éster de maleato e seus derivados, éster de succinato e seus derivados, 4-oxopentaoato Ester e éster de pivaloate, éster de crotonato, 4-metoxicrotonato éster e 3-fenilpropionato.

Para regenerar o grupo hidroxila 3', um produto químico é utilizado. 0 produto químico é de, mas não se limitando a, azida, imidazol, piridina, hidroxilamina, hidrazina, hidróxido de tetrabutilamônia.

Quando a acilação do oligonucleotideo é feita após a síntese, a acilação do grupo hidroxila 3' com anidrido exige solvente básico, como trietilamina (TEA), outros solventes básicos são piridina, anilina, dietilamina, trimetilamina e catalisador de pirrolidona A, tais como dimetilaminopiridina (DMAP) , fluoreto, 1-metilimidazol, 4-pirrolinopiridina, 2- hidroxipiridina, é preferível para estar presente na reação.

Em uma modalidade preferida, o oligonucleotideo da invenção tem um éster de ácido maléico 3'. A hidroxilamina é utilizada para regenerar o grupo hidroxila 3'.

Em outra modalidade, o oligonucleotideo da invenção tem um grupo éter silil 3'.

0 silil éter é proveniente de um grupo composto de trimetilsilil éter, trietilsilil éter, triisopropilsilil éter, dimetilisopropilsilil éter, dietilisopropilsilil éter, dimetiltexilsilil éter, t-butildimetilsilil éter, t- butildifenilsilil éter, tribenzilsilil éter, tri-p-xilsilil éter, trifenilsilil éter, difenilmetilsilil éter, e t- butilmetoxifenilsilil éter.

Um grupo -OH pode ser convertido para silil éter tratando-o com um cloreto de trialquilsilil na presença de uma base de amina terciária, como imidazol, piridina e trietilamina. Silil éteres não são afetados pela maioria dos oxidantes e agentes redutores, e são estáveis a maioria dos ácidos e ■ bases não aquosos. 0 grupo t-Butildimetilsilil é estável em solução aquosa na faixa de pH de 2 a 12, o que o torna um dos grupos de modificação de hidroxila mais amplamente utilizados.

A estabilidade do silil éter foi bem estudada. 0 trimetilsilil é o mais prontamente sililado. No entanto, é também o mais lábil à hidrólise. A substituição de um dos grupos metil do grupo trimetilsilil pelo t-butil origina um grupo t-butildimetilsilil, que é cerca de IO4 vezes mais estável do que o grupo TMS.

Os grupos de silil éter são mais comumente removidos por tratamento com ion de fluoreto. Os fluoretos são selecionados a partir do grupo químico constituído por tetrabutilamônia fluoreto, fluoreto de sódio, fluoreto de potássio, fluoreto de lítio, ácido fluorídrico.

Em outra modalidade preferida, o oligonucleotideo da invenção tem grupo éter 3' . Um grupo éter preferido é tetrahidrofuranil éter.

Um grupo éter é alil éter. 0 alil éter é hidrolisado por um catalisador de paládio ou ródio.

Outro grupo éter é p-metoxifenil ou p-metoxibenzil ou 3, 4-dimetoxibenzil éter ou (4-metoxifenoxi) metil éter. 0 éter é clivado por nitrato cérico de amônia.

Os éteres sensíveis ao catalisador à hidrólise mediada pelo catalisador de ácido de Lewis também podem ser utilizados. Os éteres incluem metoxietoximetil (MEM) éter, metoximetil (MOM), guaiacolmetil (GUM) éter,

tetraiydropiranil éter, tetrahidrotiofuranil éter.

Os catalisadores de ácido de Lewis adequados para este fim são selecionados a partir de ZnX2, MgX2, AGX, CuX2, MnX2, SnX2, FeX, Cox, PdX2, HgX2, FeX3, AiX3, LiBF4, TiCl4, etc. X é um átomo de halogênio. 0 3' siloximetil éter ou 2-(trimetilsilil)etoxylmetyl

éter pode ser removido pelo fluoreto do grupo químico selecionado constituído por fluoreto de tetrabutilamônia, fluoreto de sódio, fluoreto potássio, fluoreto de lítio, ácido fluorídrico.

3'2-(Trimetilsilil)detoximetil éter é hidrolizado pelo LiBF4 e/ou fluoreto para regenerar o grupo hidroxila.

3' Metil éter é hidrolisado com um ou mais produtos químicos a partir de um grupo composto de BBr3, SiCl4, NaI e AlX3.

Em outra modalidade preferida, o oligonucleotideo da invenção tem um grupo 3' modificado grupo que pode sofrer clivagem fotolítica para regenerar grupo hidroxia 3'. 0 grupo modificado 3' é selecionado do grupo químico contendo p- metoxibenzil éter, ésteres de nitrato, e o-nitrobenzil carbonato.

Além da clivagem fotolítica, um produto químico também pode ser adicionado no sistema da reação para reduzir a exigência de intensidade e/ou tempo de irradiação. Por exemplo, enquanto o p-metoxibenzil éter é clivado por luz ultravioleta (>280nm), o nitrato cérico de amônio pode ser adicionado no sistema de reação para acelerar a reação de hidrólise.

A cinética e a termodinâmica do processo de remoção do modificador podem ser afetadas pelo grupo de modificação, a propriedade do produto químico para a ativação, a concentração da substância química, temperatura, outros componentes em um sistema de reação, tais como pH, força iônica, etc. Se irradiação é usada para regenerar grupo hidroxila 3', a sua intensidade e comprimento de onda também pode afetar a velocidade e a integralidade do processo de ativação.

Aplicação da presente invenção em vários processos de amplificação de ácidos nucleicos

Para entender melhor como a presente invenção pode ser usada em vários processos de amplificação de ácidos nucleicos, a presente invenção é ilustrada com relação a alguns dos métodos atualmente disponíveis de amplificação de ácidos nucleicos e enzimas envolvidas.

Aplicação da presente invenção no ensaio invasor

0 ensaio invasor é um método de amplificação do sinal e é descrito nas patentes US 6348314; 6090543; 6001567;

5985557; 5846717, e 5837450, todas elas são incorporadas neste documento por referência.

Em invasor ensaio, o oligonucleotideo invasivo a montante e o oligonucleotideo de sonda de geração de sinal a jusante hibridizam com a molécula alvo, e formar uma estrutura de clivagem. A clivagem da sonda hibridizada pela endonuclease flap gera sinal detectável. Como outras enzimas termostáveis, a endonuclease flap é ativa em uma ampla faixa de temperatura. Esta é capaz de clivar muitas estruturas além das estruturas de clivagem desejadas. Os oligonucleotideos presentes em um sistema de reação poderiam formar uma variedade de estruturas intra-moleculares e inter- moleculares. A maioria delas é estável apenas em baixas temperaturas. A clivagem destas estruturas resulta tanto em fundo elevado ou baixo sinal detectável. Reduzir ou mesmo eliminar estas clivagens indesejáveis pode melhorar a qualidade do ensaio de detecção.

O uso de oligonucleotideos com extremidade 3' modificada, conforme descrito aqui, é uma boa forma de reduzir a clivagem dependente do não-modelo. Foi relatado que o grupo 3' do oligonucleotideo invasivo a montante afeta grandemente a clivagem (Kaiser, 1999) . Todas as substituições do grupo hidroxila 3' incluindo 3' desoxi, 3' fosfato e 3' d- espaçador resultou em inibição dramática. Em alguns casos, as substituições renderam quase a inibição completa. É claramente demonstrada a importância do grupo hidroxila 3' no evento de clivagem. A presente invenção fornece um método para utilizar um oligonucleotideo com uma extremidade 3' modificada reversivelmente para controlar o inicio do ensaio invasor, a fim de melhorar a sua capacidade de quantificação. 0 ensaio invasor também é capaz de detectar molécula de

RNA sem transcrição reversa. A molécula de RNA é sensível ao calor, especialmente na presença de íons metálicos bivalentes, como Mg2+, que é essencial para a ação da nuclease. Quando o RNA alvo é detectado, a condição de inicio a quente é preferida para ser branda. A presente invenção oferece inúmeros modificadores com diversas condições de ativação. Uma condição branda de ativação pode ser facilmente identificada. Um exemplo de ativação branda é a irradiação que é suave o suficiente para não machucar as moléculas de RNA alvo. Neste aspecto, a presente invenção tem uma vantagem clara sobre a modificação química baseada em tecnologias de inicio a quente de enzima.

Aplicação da presente invenção em reação em cadeia de polimerase

Tem sido bem documentado que o início a quente pode melhorar a amplificação de PCR dramaticamente. Muitos métodos de início a quente vêm sendo desenvolvidos para melhorar amplificação da PCR. Eles podem ser classificados nos seguintes grupos:

i. Criação de uma barreira física separando os componentes necessários para o lado reação a baixa

temperatura.

As patentes US 5411876, 5565339, 5413924 e 5643764 divulgam técnicas para criar uma barreira que desapareça à medida que a temperatura se eleve. No entanto, é inconveniente. Misturando todos os componentes em tal sistema heterogêneo é também muito desafiador.

ii. Precipitação de Magnésio (patente US 6403341)

0 magnésio é um elemento fundamental para a atividade da polimerase do DNA. Segundo a invenção, o magnésio é precipitado em baixas temperaturas e não pode participar da reação de polimerização do DNA. A uma temperatura adequada, a solubilidade do magnésio é aumentada. Conseqüentemente, o magnésio é libertado a partir do precipitado e ativa a polimerase do DNA. Este é um sistema de início a quente heterogêneo e enfrenta problemas semelhantes, como referido no "i". A dispensa do precipitado de magnésio é difícil de fazer.

iii. Ligação reversível não covalente de uma molécula inibidora para a' polimerase do DNA.

Essa molécula inibidora pode ser tanto um anticorpo (Patente US 5338671) ou um oligonucleotideo (Patentes US 5693502, 5874557, 5763173, 6020130 e 6183967). A estabilidade do inibidor/complexo de polimerase de DNA é dependente da temperatura. Quando a temperatura chega a certo ponto, o inibidor sai da polimerase de DNA, que então se torna ativa. Tal como um inibidor não-covalente, a completa inibição é difícil de ser alcançada. Eles também interferem na amplificação até certo grau, especialmente com o inibidor de oligonucleotideo.

iv. Modificação química da polimerase de DNA (Patentes US 5677152, 5773258 e 6183998)

Como inibidores não-covalentes, estes são um sistema de início a quente homogêneo. O anidrido e aldeído de ácidos dicarboxílicos são usados em tais modificações, respectivamente. Modificadores são removidos da polimerase de DNA com incubação prolongada a altas temperaturas. A atividade da polimerase de DNA é restaurada com a retirada de modificadores. Eles são muito rigorosos em termos da conclusão da supressão da atividade enzimática. No entanto, o processo de ativação é muito duro para a enzima. Na verdade, o próprio processo de ativação desnatura parte significativa das moléculas de enzima também.

A presente invenção é também um sistema de modificação química. Em vez de utilizar a enzima PCR modificada quimicamente, o oligonucleotideo 3' modificado é utilizado. Quando o DNA alvo a ser amplificado pela PCR,

oligonucleotideos modificados reversivelmente quimicamente fornecem início a quente com elevado rigor como a enzima quimicamente modificada. Sem serem ativados, os oligonucleotídeos modificados 3' não podem ser estendidos pela polimerase de DNA em baixa temperatura. Por isso, nenhum dímero de primer ou reação lateral poderia ocorrer em baixa temperatura. Diversas formas de ativação, que vão desde a ativação química assistida ã ativação mediada pela irradiação,' tornarão possível ter uma condição' de ativação leve.

Quando o RNA alvo é para ser amplificado, o modelo de

RNA tem de ser convertido para DNA primeiro através de um processo de transcrição reversa. Se a transcrição reversa for feita em um tubo separado e uma alíquota do produto da transcrição reversa for usada para amplificação da PCR, processo da PCR é essencialmente o mesmo como o com modelo de DNA como afirmado acima.

RT-PCR em única etapa é um processo no qual tanto a transcrição reversa e a PCR são realizadas no mesmo tubo seqüencialmente. Como discutido na sessão "FUNDAMENTO", nenhuma PCR de início a quente existente é eficaz para um RT- PCR em única etapa. Com a presente invenção, RT-PCR em única etapa pode ser significantemente melhorada.

Para um RT-PCR em única etapa single-plex, haverá apenas um oligonucleotideo transportando um grupo hidroxila 3' normal se a presente invenção for aplicada. Esta é para a transcrição reversa. Sabe-se que o dímero de primer não pode surgir a partir de um único primer.

Para um processo RT-PCR em única etapa triplex, tal como o produto da Roche para o exame de sangue de doadores no qual a presença do HIV, HBV e HCV é monitorada, há seis primers. 0 HIV e HCV são alvos de RNA e o VHB é alvo de DNA. Existem 15 tipos de dímeros de primers que poderiam ser formados com tecnologias convencionais (Tabela 1). De acordo com a presente invenção, 4 dos oligonucleotideos tem um grupo 3' modificado. Assim, haverá apenas uma espécie de dímero de primer que poderia ser gerado. A vantagem da atual tecnologia é evidente e significativa.

Ao empregar a presente invenção, um RT-PCR em única etapa pode ser melhorado através da utilização de modificações duplas. Uma modificação é necessária para oligonucleotideos para a transcrição reversa e a outra é para oligonucleotideos participantes da amplificação de PCR. As duas modificações têm duas condições de ativação diferentes para inicio da transcrição reversa e processos de PCR podem ser controlados separadamente. Esta abordagem será especialmente útil para RT-PCR em única etapa multiplex. Primer(s) de RT será ativado e disponibilizado para reação de RT quando a transcrição reversa está prestes a começar. Entretanto, o resto dos primers permanecerá inativado até o inicio da PCR. Isto irá eliminar a formação de dimero de primer/ reação não-especifica ocorrida antes do inicio da RT. A etapa de ativação pode ser feita de várias maneiras. Por exemplo, uma modificação é removida por irradiação e a outra é por ativação química assistida. Outro exemplo é que ambas as modificações têm susceptibilidade diferencial, quer ao mesmo produto químico/irradiação. A temperatura é outro fator chave que afeta a geração de grupo hidroxila 3' .

Aplicação da presente invenção em reações em cadeia de ligase (LCR)

Como a PCR, a LCR é um método de amplificação de alvo exponencial envolvendo uma termociclagem. A detecção de baixa sensibilidade associada à LCR é largamente atribuída à atividade residual de uma ligase termostável a uma temperatura inferior a sua temperatura de reação. Na LCR, a amplificação direcionada pelo não-modelo é indistinguível da amplificação direcionada pelo modelo.

Porque o grupo hidroxila 3' é essencial para a reação de ligação, a LCR de início a quente com oligonucleotideos 3' modificados utilizando a invenção descrita aqui pode reduzir ou mesmo eliminar as ligações direcionadas pelos não-modelo em baixas temperaturas.

A patente US 6511810 descreve um método de utilização de uma endonuclease flap termoestável para permitir a reação de ligação. Quando uma sonda FRET é incluída no sistema, esta pode ser usada para fazer uma quantificação em tempo real das moléculas alvo. Enquanto a invenção significativamente melhora a detecção de LCR, a amplificação direcionada por não-modelo não é eliminada. 0 método descrito aqui pode ainda reduzir o fundo. A presente invenção é adequada para a realização de inicio a quente nesse processo.

Aplicação da presente invenção na amplificação por circulo rolante (RCA), amplificação por deslocamento de fita (SDA), amplificação isotérmica do único primer (SPIA+) , amplificação isotérmica do único primer exponencial (X- SPIA+) , amplificação laço-mediada (LAMP)

Estas técnicas são descritas nas Patentes US. 5854033, 6183960, 6210884, 6344329, 5270184, 5916779, 6251639 e 6410278, respectivamente. Um elemento comum a todos os processos de amplificação isotérmica acima é a utilização de uma polimerase de DNA com uma forte atividade de deslocamento de fita. A polimerase de DNA mais amplamente utilizada nestas tecnologias é grande fragmento da polimerase de DNA Bst.

Embora grande fragmento da polimerase de DNA Bst seja ativo a uma temperatura até 65°C, não é termoestável. Portanto a modificação química da enzima não é uma forma viável para fazer o início a quente. Na verdade, um sistema de início a quente está ainda para ser desenvolvido para estas tecnologias. A condição de ativação diversa associada com a presente invenção torna possível encontrar uma condição compatível com cada tecnologia de amplificação particular.

A aplicação da presente invenção para estes ensaios pode eliminar todas as reações laterais ocorridas antes do início da amplificação. Oligonucleotideos convencionais são substituídos pelos oligonucleotídeos da presente invenção. Idealmente o grupo hidroxila 3' é regenerado quando a reação de amplificação está prestes a começar. A aplicação da presente invenção a esses processos, não

só pode melhorar a sensibilidade da amplificação, mas também a quantificação do alvo. A quantificação do alvo melhorada é alcançada através do início controlado da amplificação.

Uso da presente invenção em associação com NASBA, TMA e

3 5 3 SR

Eles são usados principalmente para amplificar o RNA alvo a uma temperatura constante. A amplificação compreende as seguintes etapas:

i. Transcrição reversa para fazer DNA complementar (cDNA).

Um RNA/DNA heteroduplex é formado como resultado da transcrição reversa. 0 oligonucleotideo utilizado na transcrição reversa tem uma seqüência de ligação alvo na região 3' e uma região promotora de polimerase de RNA na região 5'. A seqüência promotora de fita única não é transcricionalmente funcional até que ela se torne de fita dupla.

ii. A degradação da RNase H do RNA da fita de RNA/DNA heteroduplex.

A atividade da RNase H é fornecida tanto pela transcriptase reversa ou uma RNase H separada.

iii. Síntese do DNA de fita dupla.

Um segundo oligonucleotideo hibridiza o cDNA de fita única e é estendido pela transcriptase reversa para gerar um DNA/DNA duplex. Agora a região promotora para a polimerase de RNA correspondente é de fita dupla e funcional.

iv. Síntese do RNA de fita única pela transcrição in vitro.

Com um promotor funcional e uma polimerase de RNA, cada DNA/DNA duplex gera centenas de moléculas de RNA. Ele completa um ciclo de amplificação. Como resultado, cada molécula modelo de RNA é amplificada centenas de vezes.

V. Repete-se as etapas i a iv.

Isto irá amplificar o ácido nucleico alvo exponencialmente.

A sensibilidade destes ensaios em geral não é tão boa como a PCR. A sua capacidade de quantificação não é tão boa como a PCR também. A aplicação de início controlado nestes ensaios pode melhorar esses dois aspectos importantes. O início controlado irá efetivamente reduzir ou mesmo eliminar a reação lateral. Isto irá melhorar a sensibilidade do ensaio. A utilização da presente invenção nesses processos também irá melhorar a sua capacidade de quantificação do alvo. Sem um sistema de inicio controlado, a reação de amplificação começa rapidamente logo após a mistura de todos os componentes. Diferentes tempos de inicio de amplificação entre as amostras e padrões, em combinação com a cinética rápida da amplificação, torna a quantificação exata e precisa extremamente difícil. 0 início controlado irá fazer com que todas as amplificações comecem ao mesmo tempo. A quantificação pode ser significativamente melhorada.

O oligonucleotídeo da presente invenção é utilizado na amplificação de ácidos nucleicos para substituir seus oligonucleotideos convencionais homólogos que tem um grupo hidroxila 3'. A seqüência de oligonucleotídeo é a mesma. Pessoas versadas na técnica entenderão que magnitude do

benefício da presente invenção depende da tecnologia de amplificação de ácidos nucleicos, seqüência do oligonucleotídeo, sistema de reação, condição de incubação etc.

Pessoas versadas na técnica são capazes de fazer ajustes

quando o oligonucleotídeo da presente invenção substitui o oligonucleotídeo convencional. Dependendo do grupo modificador específico e produto químico utilizado para regenerar o grupo hidroxila 3' , pode ser necessário ajustar a concentração do oligonucleotídeo, sistema de tampão e condição de incubação para alcançar a condição de reação ótima.

A presente invenção pode ser usada em combinação com outras tecnologias que possam reduzir a formação do dímero de primer/reação não-específica. Tecnologias de início a quente, como discutidas anteriormente, são exemplos de tais tecnologias. A proteína de ligação do DNA de fita única também pode ser incluída no sistema de reação para reduzir ainda mais a formação do dímero de primer e aumento da especificidade de detecção.

O oligonucleotídeo da presente invenção é compatível com a utilização de bases especiais e grupos de açúcar nos primeiros três nucleotideos para reduzir ainda mais a formação do dímero de' primer e reação não-especifica. Essas duas técnicas são descritas na Patente US. 6001611 e 6794142, respectivamente, ambas incorporadas neste documento por referência.

A presente invenção também diz respeito aos conjuntos utilizados para executar a amplificação de ácidos nucleicos. Embora a configuração de cada kit possa variar, pelo menos um oligonucleotideo da presente invenção é necessária para realizar a amplificação.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são apresentados para proporcionar àqueles versados na técnica uma completa divulgação e descrição de como fazer e usar a presente invenção, e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção nem eles destinam-se a representar que as experiências a seguir são todas ou os únicos experimentos realizados. Foram feitos esforços para garantir a precisão no que diz respeito aos números utilizados (ex. quantidades, temperatura, etc), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser contabilizados.

Exemplo 1. Modificação do oligonucleotideo com anidrido maléico

O mecanismo da reação é ilustrado na Figura 1. Seqüências de três oligonucleotideos utilizados para detectar o virus da Hepatite B são listados na Tabela 2.

Tabela 2. Seqüência de oligonucleotídeos

Oligonucleotideo Seqüência Primer encaminhado: CCG TCT GTG CCT TCT CAT CTG Primer Reverso 11 GGT TTC CAT GTA ACG TGC AG Primer Reverso 2 GGT CTC CAT GCG ACG TGC AG

Oligonucleotideos liofilizados são dissolvidos em IxTE (1 OmM TrisHCl, pH8.0, 0,1 mm de EDTA) a ΙΟΟμΜ. 4- (dimetilamina)-piridina(DMAP)(Aldrich) uma solução é preparada em trietilamina(TEA)(Aldrich) em 3mg/ml. 4M anidrido maléico(Aldrich) é preparada em Ν,N'-dimetil- formamida.(DMF)(Sigma).

Etapa 1. mistura de 16μ1 de oligonucleotideo com 320 μΐ de solução de DMAP em um tubo microcentrifugo de 2.Oml.

Etapa 2. adicionar 6 μΐ de anidrido maléico 4M à mistura de oligonucleotideo/DMAP

Etapa 3. vórtice a mais alta velocidade por 2 minutos, a temperatura ambiente

Etapa 4. adicionar 1026 μΐ de isopropanol e misturar bem

Etapa 5. incubar a -20°C por 2 horas

Etapa 6. centrifugar a 14000 rpm durante 20 minutos a

4 0 C

Etapa 7. remover o sobrenadante -> acrescentam 800 μΐ de isopropanol -» centrifugar a 14000 rpm durante 20 minutos a 4 ° C

Etapa 8. repetir a etapa 7, uma vez

Etapa 9. remover o sobrenadante -» secar o tubo em temperatura ambiente dissolver o oligonucleotideo na água.

Exemplo 2. Preparação da Taq DNA Polxmerase

O gene de Termus aquaticus (Taq) DNA Polimerase foi clonado através da PCR com seqüência de GeneBank (Acesso N0 . J04639). Purificação da Taq DNA Polimerase foi realizada com um procedimento descrito por Lawyer et al. (Lawyer et al., 1989, JBC 264(11):6427-37; Lawyer et al. 1989, PCR Meth . Appl.2 (4) :275-87) .

Exemplo 3. Modificação da Taq DNA Polimerase com Ácido Citracônico.

0 ácido citracônico (Aldrich) e Ν,N'-diciclohexil carbodiimida (DCC)(Aldrieh), e NHS(Aldrich) foram todos dissolvidos em DMF a 1M. 200 μΐ de DCC, 200 μΐ de NHS e 100 μΐ de ácido citracônico foram misturados em um tubo microcentrifugo de 1,5 ml. A mistura foi então incubada em temperatura ambiente por 1 hora. A mistura foi então centrifugada a 12.000 rpm por 20 minutos em temperatura ambiente. O sedimento foi descartado e o sobrenadante foi mantido para modificar a Taq DNA polimerase.

A Taq DNA polimerase purificada é ajustada para Img/ml em 2 OmM MOPS, pH 8.0 e IOOmM de KCl. Um volume de ácido citracônico ativado foi misturado com o volume 99 de Taq DNA polimerase. A mistura foi então incubada em temperatura ambiente durante 1 hora para resultar na inativação da Taq DNA polimerase.

Exemplo 4. Amplificação da PCR com oligonucleotideos modificados

Sybr Green liga-se preferencialmente ao DNA de fita

dupla com mais de 1000 vezes maior afinidade do que com o DNA de fita única. Este tem sido amplamente utilizado para monitorar a amplificação da PCR em tempo-real. Embora tal ligação não seja uma seqüência especifica, é possível dizer diferentes produtos amplificados fazendo a análise da curva de fusão porque cada produto amplificado tem uma determinada temperatura de fusão. 0 ensaio Sybr Green foi utilizado na invenção para acompanhar a formação do dímero de primer bem como a ampliação do alvo. O sistema PCR contém 50mM TrisHCl, pH8.4, 5mM KCl, 3mM

MgCl2, 0,01% Tween-2 0, 0, 005% de gelatina, IxSybr Green, 5OOnM 5-ROX, 7.5mM cloreto de hidroxilamina (Aldrich), 0,2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e TTP, IU de Taq DNA polimerase, 200nM cada do anidrido maléico alterado ou inalterado do primer de VHB. Volume da reação é 25μ1. 0 cópia do modelo de HBV (nenhum modelo de controle ou NTC) ou 500 cópias do HBV foram adicionadas ao sistema.

As reações foram realizadas em ABI Prizm 7000. A condição de termociclagem é a seguinte: 95°C, IOmin -» (95°C, 5sec 60 °C, 30sec) X 40 ciclos.

Para reverter a alteração, tanto a pré-incubação em temperatura elevada, ou seja, 95°C, IOmin, e presença de cloreto de hidroxilamina são importantes.

Os resultados são mostrados na Figura 5a. Comparado com os primers (NTC/R) inalterados regulares, a reação de NTC com primers modificados de anidrido maléico (NTC/M) mostrou amplificação atrasada em 'mais de 7 ciclos. Em outras palavras, a amplificação de NTC ou formação de dimero de primer foi atrasada em mais de 7 ciclos. É claramente demonstrado que os primers modificados são eficazes na redução da formação de dimero de primer.

Exemplo 5. Análise da curva de fusão dos produtos da PCR Na Figura 5a, o modelo HBV mais a reação com primers regular (T+/R) mostrou uma amplificação de quase 5 ciclos anteriores do que o modelo HBV mais a reação com primers modificados (T+/M) . Sem a reação lateral tal como a formação do dimero de primer, espera-se que ambos teriam cinética de amplificação semelhante porque ambos continham o mesmo número de modelo de HBV. Isto exige uma análise mais profunda dos produtos amplificados. Análise da curva de fusão foi conduzida. Os resultados

são mostrados na Figura 5b. 0 modelo de HBV mais a reação com primer regular (T+/R) tiveram dois produtos, um produto maior que é dimero de primer com temperatura de fusão de cerca de 77 °C, e um produto menor que é produto de amplificação direcionado pelo modelo com temperatura de fusão de cerca de 83 0C. Em contraste, o modelo do HBV mais a reação com primer modificado (T+/M) mostrou amplificação limpa. Existe apenas produto de amplificação direcionado pelo modelo presente.

Exemplo 6. PCR com Taq polimerase regular e Taq 2 5 polimerase quimicamente modificada na presença da transcriptase reversa

Entre as várias enzimas baseadas em tecnologias de PCR de inicio a quente, a modificação química reversível da PCR DNA polimerase é a mais rigorosa e eficaz. Foi demonstrado que efetivamente melhora a amplificação do modelo de DNA e permite a amplificação multiplex da PCR.

No entanto, em um sistema RT PCR em única etapa enfrenta dificuldades que são indicadas em "FUNDAMENTOS". Uma enzima quimicamente modificada foi testada para sua capacidade de reduzir a formação de dimero de primer na presença da transcriptase reversa. O sistema PCR contém 50mM TrisHCl, pH8.4, 5mM KCl, 3mM MgCl2, 7 . 5mM cloreto de hidroxilamina (Aldrich), 0,01% Tween- 20, 0,005% de gelatina, 500nM 5-ROX, IxSybr Green, 0,2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e TTP, 4U de SuperScript III (Invitrogen), 200nM cada de primer HBV inalterado, IU de Taq DNA polimerase regulares de inicio não-quente ou quimicamente modificada de inicio a quente. O volume da reação é 25μ1.0 cópia do modelo de HBV (sem controle de modelo ou NTC) ou 500 cópias de HBV foram adicionas ao sistema. As reações foram realizadas em ABI Prizm 7000. A

condição de termociclagem é a seguinte: 55°C, 15min 95°C, IOmin - (95 °C, 5sec - 60°C, 30sec) X 40 ciclos.

A amplificação é mostrada na Figura 6a. Embora a amplificação de NTC com Taq (NTCIhsT) quimicamente modificados tenha sido atrasada por cerca de 2 ciclos, em comparação com a Taq (NTC/regT) regular, a amplificação de NTC com Taq quimicamente modificados é muito severa. No modelo HBV mais reações, a amplificação tanto com o Taq regular e o quimicamente modificado atingiu o limiar mais cedo do que é habitual (ver Figura 5a para referência) . A análise da curva de fusão revelou que havia apenas dimero de primer em todos os quatro tipos de amplificação no experimento (Figura 6b). Isto demonstrou que: i. a transcriptase reversa pode mediar a formação de dimero de primer; ii. a enzima PCR quimicamente modificada é ineficaz na redução da formação do dimero de primer quando a transcriptase reversa está presente no sistema de reação. Exemplo 7. PCR com oligonucleotideos modificados. A fim de continuar ainda demonstrando tanto o papel da transcriptase reversa na promoção da formação do dimero de primer e da eficácia dos primers modificados reversivelmente na prevenção da formação de dimero de primer, o seguinte experimento foi realizado:

O sistema da PCR contém 50mM TrisHCl, pH8.4, 5mM KCl, 3mM MgCl2, 7.5mM de cloreto de hidroxilamina (Aldrich), 0,01% Tween-20, 0,005% de gelatina, 500nM 5-ROX, IxSybr Green, 0,2 mm de cada dATP, dCTP, dGTP e TTP, IU de Taq DNA Polimerase regular inalterada, OU ou 4U de SuperScript III (Invitrogen), 200nM cada de primers de HBV inalterados ou modificados. 0 volume da reação é 25μ1. Nenhum modelo de HBV foi adicionado ao sistema.

As reações foram realizadas em ABI Prizm 7000. Condição de termociclagem é a seguinte: 55°C, 15min -> 95°C, IOmin -> (95 °C, 5sec - 60°C, 30sec) X 40 ciclos.

Com primers regulares inalterados, a presença da transcriptase reversa em uma reação de NTC (RT+/R) resultou em significativamente mais dimero de primer (Figura 7) do que ausência da transcriptase reversa (RT~/R) , quase 4 ciclos anteriores.

Primers modificados reduziram a formação do dimero de primer drasticamente. Na ausência ou presença de 4U da transcriptase reversa, a formação do dimero de primer foi atrasada por 7 (RT~/R vs RT"/M) e 11 ciclos (RT+/R vs RT+/M) , respectivamente, quando são comparados com primers regulares. Mais importante foi mostrado que a presença de transcriptase reversa não impactou significativamente a formação do dimero de primer quando primers modificados foram usados (RT~/M vs RT+/M) .

Exemplo 8. Amplificação do alvo com primers modificados

Para mostrar ainda a eficácia dos primers modificados reversivelmente na melhoria da amplificação de PCR em configuração RT PCR em única etapa, o seguinte experimento foi realizado:

0 sistema de PCR contém 50mM TrisHCl, pH8.4, 5mM KCl, 3mM MgCl2, 7.5mM de cloreto de hidroxilamina (Aldrich), 0,01% Tween-20, 0,005% de gelatina, 500nM 5-ROX, IxSybr Green, 0,2 mm de cada dATP, dCTP, dGTP e TTP, IU de Taq DNA Polimerase regular inalterada, 4U de SuperScrpt III (Invitrogen), 200nM cada de primers de HBV inalterados ou modificados. 0 volume da reação é 25μ1. 0 cópia do modelo de HBV (sem controle de modelo ou NTC) ou 500 cópias de HBV foram adicionas ao sistema. As reações foram realizadas em ABI Prizm 7000. A condição de termociclagem é a seguinte: 55°C, 15min -> 95°C, IOmin - ( 95 0C, 5sec - 60°C, '30sec) X 40 ciclos.

Conforme mostrado na Figura 8a, os primers modificados efetivamente reduziram a formação do dimero de primer por 11 ciclos (NTC/M vs NTC/R). A amplificação direcionada pelo modelo com primers modificados (T+/M) foi isenta de dimero de primer, como demonstrado na Figura 8b enquanto a amplificação com primers regulares só rendeu dimero de primer mesmo na presença de 500 cópias do modelo HBV (T+/R na Figura 8a e 8b) .

REFERÊNCIAS

DOCUMENTOS DE PATENTE US

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Outras publicações

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Claims (36)

1. Método para amplificação de seqüência ou sinal de ácidos nucleicos 'alvo, caracterizado pelo fato de que uma mistura de reação de amplificação é usada a qual contém pelo menos um oligonucleotideo modificado reversível não tendo uma extremidade 3' de grupo não-hidroxila a qual pode ser convertida em uma extremidade 3' de hidroxila sob exposição a um produto químico e/ou irradiação e/ou faixa de temperatura.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) contatar uma amostra suspeita de conter o ácido nucleico alvo com uma mistura de reação de amplificação contendo, pelo menos, um oligonucleotideo modificado reversível, onde o oligonucleotideo modificado reversível não tem uma extremidade 3' não-hidroxila que pode ser convertida em uma extremidade 3' hidroxila após exposição a um produto químico e/ou irradiação e/ou faixa de temperatura; (b) expor a mistura da etapa (a) ao produto químicos e/ou irradiação e/ou faixa de temperatura para um tempo suficiente para regenerar a extremidade 3' hidroxila 3; e (c) realizar a reação de amplificação.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é ácido ribonucléico, o método compreendendo as etapas de: (a) contatar uma amostra suspeita de conter o ácido ribonucléico alvo com uma mistura de reação de amplificação que contém, pelo menos, um primeiro oligonucleotideo modificado reversível, onde o primeiro oligonucleotideo modificado reversível não tem uma extremidade 3' não- hidroxila que pode ser convertida em uma extremidade 3' hidroxila após exposição a um primeiro produto químico e/ou irradiação e/ou primeira faixa de temperatura; (b) incubar a mistura da etapa (a) em condições que permitam a transcrição reversa do ácido ribonucléico; (c) expor a mistura da etapa (b) ao referido primeiro produto químico e/ou irradiação e/ou primeira faixa de temperatura por um tempo suficiente para regenerar a extremidade 3' de hidroxila do primeiro oligonucleotideo modificado reversível; e (d) realizar a reação de amplificação para produtos de extensão do primer.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação de amplificação ainda compreende pelo menos um segundo oligonucleotideo modificado reversível, no qual o segundo oligonucleotideo modificado reversível não tem uma extremidade 3' do grupo de hidroxila, que pode ser convertida em uma extremidade 3' de hidroxila após exposição a um segundo produto químico e/ou irradiação e/ou uma segunda faixa de temperatura, e na qual o método ainda inclui uma etapa de exposição da mistura da etapa (a) com o segundo produto químico e/ou irradiação e/ou segunda faixa de temperatura para um tempo suficiente para regenerar a extremidade 3' de hidroxila do segundo oligonucleotideo modificado reversível antes da etapa (b).

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de ser uma etapa única do processo RT-PCR com um sistema de duas enzimas, no qual pelo menos uma transcriptase reversa e polimerase de DNA termostável é utilizada, ou com um sistema de uma enzima, no qual apenas uma enzima é utilizada que funciona como uma transcriptase reversa e uma polimerase de DNA.

6. Método, de acordo com qualquer umas das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que pelo menos 25%, de preferência, pelo menos, 50%, mais preferivelmente pelo menos 75%, e ainda mais preferível pelo menos 90% das extremidades 3' do grupo não-hidroxila é convertida em uma extremidade 3' hidroxila.

7. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotideo modificado reversível tem um grupo de éster de ácido carboxílico na sua extremidade 3'.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o éster de ácido carboxílico é selecionado a partir do grupo constituído por éster formiato, benzoilformiato éster, haloacetato éster, metoxiacetato éster, trifenilmetoxiacetato éster, fenoxiacetato éster, maleato éster e seus derivados, succinato éster e seus derivados, 4-oxopentaoato éster, pivaloato éster, crotonato éster, 4-metoxicrotonato éster, e 3-fenilpropionato.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de regenerar o grupo 3' de hidroxila é usado um produto químico que é selecionado a partir do grupo constituído de azida, imidazol, piridina, hidroxilamina, hidrazina e hidróxido de tetrabutilamônia.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de regenerar o grupo 3' de hidroxila, um produto químico é utilizado em combinação com incubação em uma faixa de temperatura.

11. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o éster de ácido carboxílico é éster de ácido maléico e hidroxilamina ou hidrazina é utilizado para regenerar o grupo de hidroxila 3'.

12. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o éster de ácido carboxílico é éster de ácido maléico e hidroxilamina ou hidrazina é utilizado para regenerar o grupo de hidroxila 3' após incubação a uma faixa de temperatura.

13. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o oligonucleot ideo modificado reversível tem um grupo de silil éter, na sua extremidade 3'.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o silil éter é selecionado a partir do grupo constituído por trimetilsilil éter, trietilsilil éter, triisopropilsilil éter, dimetilisopropilsilil éter, dietilisopropilsilil éter, éter dimetiltexilsilil, t-butildimetilsilil éter, t- butildifenilsilil éter, éter tribenzilsilil, tri-p-xilsilil éter, trifenilsilil éter, difenilmetilsilil éter, e t- butilmetoxifenilsilil éter.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que um fluoreto é utilizado para regenerar o grupo de hidroxila.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o fluoreto é selecionado a partir do grupo constituído por fluoreto tetrabutilamonia, fluoreto de sódio, fluoreto de potássio, fluoreto de litio e ácido fluorídrico.

17. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o oligonucleot ideo modificado reversível tem um grupo de éter, na sua extremidade 3'.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o éter é tet rahidrof uranil éter.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o éter é alil éter, e um catalisador de paládio e ródio é utilizado para regenerar o grupo de hidroxila 3' .

20. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o éter é p-metoxifenil ou p- metoxibenzil ou 3,4-dimetoxybenzil éter ou (4-metoxifenoxi) metil éter e nitrato cérico de amônia é utilizado para regenerar o grupo de hidroxila 3'.

21. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o éter é selecionado a partir do grupo constituído por metoxietoximetil éter, metoximetil éter, guaiacolmetil éter, tetrahidropiranil éter, e tetrahidrotiofuranil éter e o catalisador de ácido de Lewis é utilizado para regenerar o grupo de hidroxil 3'.

22. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o éter é siloximetil éter ou 2-(trimetilsilil)etoxilmetil éter e o fluoreto é usado para regenerar o grupo de hidroxila 3' .

23. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que "o éter 2-(trimetilsilil) detoximetil éter, e LLBF4 e/ou fluoreto é utilizado para regenerar o grupo de hidroxila 3'.

24. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o éter é metil-éter e um ou mais produtos químicos selecionados a partir do grupo constituído de BBr3, SiCl4, NaI e and.AlX3 são usados para regenerar o grupo de hidroxila 3'.

25. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado peZLo fato de que o oligonucleot ideo modificado reversível tem um grupo modificado na sua extremidade 3' que pode sofrer clivagem fotolítica para regenerar o grupo de hydxoxyla.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o grupo modificado é selecionado a partir do grupo composto de p-metoxibenzil éter, ésteres de nitrato e o-nitrobenzil carbonato.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a irradiação, como tal, ou em combinação com um produto químico e/ou uma faixa de temperatura, é utilizada para regenerar o grupo de hidroxila 3 ' .

28. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 para uso no ensaio invasor, reação em cadeia de polimerase, reação de cadeia de ligase, amplificação de círculo rolante, amplificação de deslocamento de vertente, amplificação mediada por transcrição, seqüência de ácidos nucleicos baseada na amplificação, replicação de seqüência auto-sustentada, amplificação isotérmica do único primer, amplificação isotérmica do único primer exponencial ou amplificação mediada por circuito.

29. Oligonucleotideo modificado reversível, ter uma extremidade 3' de grupo não-hidroxila, que pode ser convertida em uma extremidade 3' de hidroxila após exposição a um produto químico e/ou irradiação e/ou uma faixa de temperatura.

30. Oligonucleotideo modificado reversivelmente, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de ter um grupo de éster de ácido carboxílico em sua extremidade 3'.

31. Oligonucleotideo modificado reversivelmente, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o ácido carboxílico é éster do ácido maléico.

32. Oligonucleotideo modificado reversivelmente, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de ter um grupo de éter em sua extremidade 3'.

33. Oligonucleotideo modificado reversivelmente, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de o éter é éter de silyl.

34. Oligonucleotideo modificado reversivelmente, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de ter um grupo modificado em sua extremidade 3' que pode se submeter à clivagem fotolítica para regenerar o grupo de hidroxila 3'.

35. Mistura de reação de amplificação do ácido nucleico, caracterizada pelo fato de compreender o oligonucleotideo modificado reversível de qualquer uma das reivindicações 29 a 34.

36. Conjunto de reação da amplificação do ácido nucleico, caracterizado pelo fato de compreender o oligonucleotideo modificado reversivelmente de qualquer uma das reivindicações 29 a 34.