BRPI0715297B1 - vacina profilática contra tuberculose - Google Patents

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Abstract

vacina profilática contra tuberculose, a presente invenção está relacionada à utilização de um agente imunoterapêutico que contém fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta do complexo mycobacterium tuberculosis (mtb-c) para a preparação de uma droga para o tratamento profilático de tuberculose, na qual o citado agente pode ser obtido utilizando-se um método compreendido pelas etapas a seguir: cultivo da cepa virulenta de mtb-c durante um período igual a ou maior do que três semanas; e, subsequentemente, homogeneização da cultura celular na presença de um surfactante noniônico.

Description

VACINA PROFILÁTICA CONTRA TUBERCULOSE
Campo da técnica
Refere-se a presente patente à utilização de um agente imunoterapêutico baseado em fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta 5 do complexo Mycobacterium tuberculosis para a preparação de uma droga para o tratamento profilático de tuberculose.
Estado da técnica
A tuberculose é uma doença crônica infecciosa causada pelo complexo para bacilos de Mycobacterium tuberculosis (MTB-C), que atualmente 10 inclui as espécies M. tuberculosis, M. bovis, M. microti e M. africanum.
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, 8.000.000 novos casos de pessoas que manifestam a doença são registrados mundialmente todos os anos e aproximadamente 3.000.000 pessoas morrem. Considera-se que há mais de 2.000.000.000 pessoas infectadas em todo o mundo e que 90-100 milhões de novas 15 infecções são geradas todos os anos.
A vacina atual utilizada no tratamento preventivo contra a tuberculose é baseada em bactérias da cepa chamada BCG (Bacillus Calmette-Guerirí), uma variante atenuada de M. bovis.
Diversas vacinas contra a tuberculose baseadas em fragmentos de 20 parede celular de cepas virulentas e avirulentas de Mycobacterium estão descritas no estado da técnica. Também está descrito que o adjuvante utilizado na composição da vacina influencia significativamente a eficácia da mesma.
E. Ribi et al., Nature 1963, 198, páginas 1214 a 1215, descrevem os ensaios de imunização realizados com uma composição compreendida por 25 fragmentos de parede celular da cepa avirulenta de BCG e óleo mineral. Os citados fragmentos são obtidos por homogeneização de uma cultura da cepa no óleo mineral mencionado. A composição é mais eficaz do que a vacina convencional (BCG).
Todavia, está descrito no mesmo artigo que os fragmentos de parede 30 celular não induzem qualquer resposta imunológica quando são obtidos por
2/12 homogeneização em água e na ausência de óleo mineral.
D. P. Pal et al., Indian J. Med. Res. 1977, 65, páginas 340 a 345, descrevem uma vacina preparada com fragmentos de parede celular da cepa virulenta H37Rv e óleo mineral. Neste caso, os fragmentos de parede celular são obtidos por meio de homogeneização das células mortas em fase aquosa, e o óleo mineral é subsequentemente adicionado à composição. Também está descrito que os fragmentos de parede celular homogeneizado em fase aquosa não são imunogênicos e que a presença de óleo mineral é necessária para que a vacina seja eficaz.
G.K. Khuller et al., Folia Microbiol., 1992, 37, páginas 407 a 412, descrevem a eficácia protetora de diferentes frações da parede celular da cepa avirulenta H37Ra de M. tuberculosis formulada com adjuvante incompleto de Freund, que também inclui óleo mineral.
E. M. Agger et al., Scand. J. Immunol., 2002, 56, páginas 443 a 447, descrevem vacinas compreendidas por fragmentos de parede celular da cepa virulenta H37Rv, que são eficazes quando incluem o surfactante catiônico brometo de dimetildioctadecilamônio como adjuvante. Também está descrito que os ensaios conduzidos com os bacilos homogeneizados de M. tuberculosis que não contêm o adjuvante mencionado não geram níveis de resistência contra a tuberculose no modelo murino.
I.M. Orme Vaccine, 2006, 24, páginas 2 a 19, que é um artigo recente de análise de novas vacinas contra a tuberculose, descreve que a vacina BCG convencional é, essencialmente, ineficaz na proteção de pessoas adultas contra a tuberculose. É indicado, no mesmo artigo, que diversos candidatos para diferentes tipos de vacinas (vacinas de subunidades com proteínas, vacinas com DNA, vacinas combinadas com vírus, vacinas com cepas recombinantes) estão sendo analisados e são esperados novos desenvolvimentos.
É, portanto, necessário ter uma vacina profilática para prevenir infecções causadas por M. tuberculosis que seja mais eficaz do que a vacina atual baseada na cepa atenuada de BCG.
3/12
Objeto da invenção
O objeto da presente invenção é a utilização de um agente imunoterapêutico compreendido por fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta de MTB-C para a preparação de uma droga para um tratamento profilático de infecções causadas por M. tuberculosis.
Descrição detalhada da invenção
A patente ES2231037-A1 apresenta um método para a preparação de um agente imunoterapêutico compreendido por fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB-C). Apresenta também composições que contêm o mesmo e a sua aplicação terapêutica para o tratamento combinado de tuberculose em associação com outras drogas.
Os autores da presente invenção descobriram o uso do citado agente imunoterapêutico para a preparação de uma droga para o tratamento profilático de tuberculose.
O objeto da presente invenção é, portanto, a utilização de um agente imunoterapêutico compreendido por fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB-C) para a preparação de uma droga para o tratamento profilático de tuberculose, na qual o citado agente é passível de ser conseguido por meio de um método compreendido pelas etapas a seguir:
- cultivo da cepa virulenta de MTB-C durante um período igual a ou maior do que três semanas e, subsequentemente,
- homogeneização da cultura celular na presença de um surfactante noniônico.
A cepa virulenta pode ser qualquer cepa virulenta de MTB-C. Uma das cepas mais utilizadas por pesquisadores neste campo é chamada de H37Rv que, por exemplo, pode ser adquirida livremente na National Collection of Type Cultures (NCTC), em Londres, na Inglaterra (número do depósito NC007416).
A cepa virulenta pode ser cultivada por inoculação no meio de cultura bem conhecido por um especialista na área, por exemplo, Middlebrook 7H10 ou
4/12
Agar 7H11, meio de Sauton ou meio de Proskauer-Beck.
A cultura da cepa virulenta é realizada durante um período igual a ou maior do que três semanas, preferivelmente compreendido entre 3 e 4 semanas. A temperatura da cultura é mantida, preferivelmente, entre 34° C e 38° C.
Assim que a cultura é finalizada, as células são isoladas utilizando-se técnicas como aquelas descritas, por exemplo, na patente ES2231037-A1.
A homogeneização das células vivas é realizada na presença de um surfactante noniônico e, preferivelmente, em um meio tampão com pH neutro, por exemplo, um pH compreendido entre 6 e 8, tal como aquele proporcionado por tampão PBS (solução salina tampão fosfato).
A homogeneização pode ser realizada por meio de sonificação de ultra-som, ou por meio do uso de pequenas pérolas de aproximadamente 1 mm de diâmetro, por exemplo, pérolas de sílica ou zircônia/sílica, juntamente com um homogeneizador mecânico. Um homogeneizador mecânico que pode ser utilizado, por exemplo, é o modelo BioSpec BeadBeater®.
As células MTB-C são rompidas por meio deste processo de homogeneização e pequenos fragmentos de parede celular são obtidos.
O tipo de surfactante noniônico utilizado no processo de homogeneização é preferivelmente selecionado a partir de um grupo composto por alquil fenol etoxilados, ésteres de sorbitan etoxilados e misturas dos mesmos.
Mais preferivelmente, o surfactante noniônico é selecionado a partir do grupo de octilfenol etoxilados. Mais preferivelmente, são utilizados os octilfenol etoxilados com um conteúdo de óxido de etileno compreendido entre 7 e 8 mols, cujos surfactantes podem ser encontrados no mercado sob o nome de Triton X114®.
O conteúdo de surfactante noniônico na etapa de homogeneização está preferivelmente compreendido entre 1% e 10% por peso em relação ao peso total do homogenado, mais preferivelmente entre 3% e 6% por peso.
A massa homogeneizada que contém os fragmentos de parede celular é submetida a um tratamento convencional para separar e rejeitar as células não
5/12 fragmentadas e os componentes solubilizados. A centrifugação em diferentes velocidades e a lavagem com solução tampão como descrito na patente ES2231037-A1 pode ser utilizada, por exemplo. O sedimento que contém os fragmentos de parede celular é obtido após a realização dos mencionados processos de purificação. O citado sedimento é disperso em tampão PBS e submetido a um tratamento convencional para assegurar a inativação completa das células de MTBC que possam ter permanecido viáveis após o processo de fragmentação e purificação. O tratamento mencionado pode ser um processo químico, por exemplo, por meio do tratamento com formaldeído, ou um processo físico, por exemplo, por meio de tratamento de autoclave ou pasteurização.
A dispersão dos fragmentos de parede celular em tampão PBS obtido após o tratamento de inativação pode ser liofilizado para facilitar o armazenamento dos mesmos. Para este fim, a dispersão pode ser distribuída em frascos e liofilizada em uma temperatura entre -15° C e -25° C e com um vácuo entre 0,1 e 0,5 mbar.
Os frascos obtidos após o processo de liofilização contêm o agente imunoterapêutico compreendido pelos fragmentos de parede celular de MTB-C, e são armazenados, em geral, em temperaturas muito baixas, por exemplo -70° C.
Como indicado anteriormente, o objeto da presente invenção é a utilização do agente imunoterapêutico compreendido por fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta de MTB-C para a preparação de uma droga para o tratamento profilático de tuberculose, isto é, para a preparação de uma vacina profilática contra tuberculose.
A droga para o tratamento profilático da tuberculose está compreendida pelo agente imunoterapêutico baseado em fragmentos de parede celular e, opcionalmente, diluentes, adjuvantes e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A droga pode estar na forma de solução salina tampão fosfato, solução aquosa, emulsão ou na forma de lipossomas.
A droga está, preferivelmente, na forma de lipossomas.
Os lipossomas podem ser formados utilizando-se lipídios auxiliares convencionais e técnicas bem conhecidas por um especialista na área, tais como
6/12 aquelas descritas na patente ES2231037-A1.
Os lipossomas incluem, em geral, fosfolipídios, com uma carga líquida neutra e/ou negativa, e esteróis.
Os fosfolipídios utilizados podem ser, por exemplo: fosfatidilcolina, fosfatidilserina e fosfatidilinositol.
O componente principal dos lipossomas é geralmente a fosfatidilcolina, que pode ser sintetizada ou isolada a partir de fontes naturais. Um produto comercial frequentemente utilizado é lecitina derivada da soja, que é uma mistura complexa de fosfolipídios que incluem entre eles a fosfatidilcolina.
Os esteróis que são utilizados na preparação de lipossomas podem ser, entre outros, colesterol e sais biliares.
Os lipossomas são preferivelmente formados utilizando-se uma mistura de lecitina derivada de soja e colato de sódio.
Os lipossomas podem, opcionalmente, conter aditivos que melhoram a sua estabilidade, por exemplo: a vitamina E, que age como um antioxidante lipídico.
Os lipossomas obtidos possuem geralmente uma distribuição de tamanho no qual 99,9% são menores do que 1 mícron.
Os lipossomas podem ser submetidos à liofilização para se obter, dessa forma, o agente imunoterapêutico na forma de lipossomas liofílizados.
A droga pode ser administrada na forma de uma única dose ou de várias doses, por meio da repetição em determinados intervalos de tempo. Preferivelmente, duas doses são administradas separadas durante um período compreendido entre 2 a 5 semanas, de preferência entre 3 e 4 semanas.
A droga pode ser administrada em uma mucosa, por exemplo, ocular, intranasal, oral, gástrica, intestinal, vaginal, ou mucosa do trato urinário, ou parentalmente, por exemplo, de maneira subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou intraperitoneal. A administração parenteral é a preferida.
A dose adequada depende de diversos parâmetros, incluindo, entre eles, o método de administração e o sujeito a ser tratado, porém, preferivelmente, a
7/12 dose está compreendida entre 1 pg e 1000 pg, de preferência, entre 25 e 700, e mais preferivelmente ainda, entre 50 pg e 200 pg.
A droga compreendida por fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta de MTB-C pode ser administrada em combinação com outras vacinas profiláticas contra tuberculose, tais como aquelas mencionadas em S.H.E. Kaufmann, Nature Rev. Immunol. 2006, 6, 699-704 como, por exemplo, a vacina BCG, vacinas de subunidades ou vacinas recombinantes de BCG.
A combinação de vacinas pode ser realizada simultaneamente ou pode ser feita em duas inoculações separadas ao longo do tempo. O período entre as inoculações pode ser até mesmo durante vários anos.
No caso de inoculações separadas ao longo do tempo, primeiro uma vacina profilática contra tuberculose é preferivelmente administrada e a droga compreendida pelos fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta de MTBC, que age como um agente re-estimulante da vacina inicialmente inoculada, é subsequentemente administrada.
Descobriu-se, de maneira surpreendente, que a administração da droga compreendida pelo agente imunoterapêutico baseado em fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta de MTB-C é capaz de induzir uma resposta geradora de interferon-γ do tipo Thl contra os antígenos específicos de M. tuberculosis. Os citados antígenos incluem Ag85B e Ag85A, que fazem parte do complexo Ag85, compostos por uma família de proteínas de baixo peso molecular que desempenham um papel decisivo na biossíntese da parede celular e são produzidas em quantidades consideráveis quando a cultivo bacteriano está na fase log.
Foi observado que a vacina BCG convencional não gera uma resposta imunoprotetora contra os antígenos do complexo Ag85, o que poderia representar uma menor capacidade de proteção.
Também foi descoberto que o número de bacilos viáveis presentes nos pulmões de ratos vacinados com o citado agente imunoterapêutico subsequentemente infectados com a cepa virulenta H37Rv é menor do que o número
8/12 de bacilos viáveis presentes no grupo de ratos de controle, e o citado número é comparável aquele dos ratos vacinados com a vacina BCG convencional.
Os exemplos abaixo são apresentados para proporcionar a um especialista na área uma explicação detalhada de exemplos de realização específicos dentro da presente invenção.
Exemplo 1 - Eficácia do agente imunoterapêutico como uma vacina profilática contra a infecção causada por M. tuberculosis
O agente imunoterapêutico utilizado neste exemplo foi preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 2 da patente ES2231037-A1.
A eficácia do agente imunoterapêutico baseado em fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta de MTB-C foi analisada em ratos fêmeas do tipo C57BL/6 com 6 a 8 semanas de vida e livres de patógenos específicos.
Os ratos foram divididos em três grupos de 12 animais cada e foram submetidos ao seguinte protocolo de vacinação:
1) Sem vacinação (grupo de controle),
2) Inoculados subcutaneamente com duas doses de 285 pg do agente imunoterapêutico obtido no Exemplo 2 da patente ES2231037-A1 na 3a e 6a semana do experimento.
3) Inoculados subcutaneamente com uma dose de colônia 2 χ 106 que forma unidades da cepa dinamarquesa de BCG (Statens Sérum Institute, na Dinamarca) na semana 0 do experimento.
A cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv Pasteur), que foi cultivada em meio de Proskauer-Beck até uma fase ‘mid-log’, foi utilizada para a infecção e armazenada em alíquotas de 1 ml em uma temperatura de -70° C até a sua utilização.
Os ratos foram infectados por aerossol com a citada cepa virulenta na 9a semana do experimento por meio da colocação dos mesmos em um aparelho para infecção por aerossol Middlebrook que proporcionou um inóculo de aproximadamente 10-50 bacilos viáveis nos pulmões dos ratos.
O número de bacilos viáveis nos pulmões foi determinado 3 semanas
9/12 após a infecção por aerossol dos animais (12a semana do experimento) incubandose diluições seriais de homogenado pulmonar em Middlebrook 7H11 Agar durante semanas a 37° C. O pulmão foi homogeneizado na presença de 1 ml de água destilada duas vezes.
Os resultados da Tabela I expressam o logaritmo da colônia que forma unidades (CFU) por ml que foram identificadas no pulmão:
Grupo de ratos Vacina LogioCFU/m 1
1 Nenhum (Grupo de controle) 6,42±0,24
2 Agente imunoterapêutico encapsulado no lipossoma 5,72±0,30
3 BCG 5,71±0,58
As diferenças entre o resultado do grupo de ratos que não foram vacinados e os resultados dos grupos vacinados são estatisticamente significativas.
Pode ser observado que no pulmão do grupo de ratos vacinados com o agente imunoterapêutico encapsulado no lipossoma um número menor de bacilos viáveis é detectado do que no pulmão dos ratos não vacinados, e um número substancialmente idêntico a ele dos ratos vacinados com a vacina BCG convencional.
Consequentemente, a vacinação com o agente imunoterapêutico baseado em fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta de MTB-C alcança a proteção contra infecções causadas por M. tuberculosis.
Exemplo 2 - Eficácia do agente imunoterapêutico como um gerador de uma resposta Thl específica contra infecção causada por M. tuberculosis
O agente imunoterapêutico utilizado neste exemplo foi preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 2 da patente ES2231037-A1.
A eficácia do agente imunoterapêutico baseado em fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta de MTB-C foi analisada em ratos fêmeas do tipo C57BL/6 com 6 a 8 semanas de vida e livres de patógenos específicos em um
10/12 experimento ex vivo.
Os ratos foram divididos em grupos de 4 animais cada e foram submetidos ao seguinte programa de inoculação:
1) Subcutaneamente inoculados com solução salina na 3a e 6a semana do experimento (grupo de controle),
2) Subcutaneamente inoculados com duas doses de 285 pg do agente imunoterapêutico obtido no Exemplo 2 da patente ES2231037-A1 na 3a e 6a semanas do experimento.
3) Subcutaneamente inoculados com uma dose de colônia 2 x 106 que forma unidades da cepa dinamarquesa de BCG (Statens Serum Institute, na Dinamarca) na semana 0 do experimento, e com a solução salina na 3a e 6a semanas do experimento.
4) Subcutaneamente inoculados com colônia 2 x 106 que forma unidades do cepa virulenta de Mycobacterium tuberculosis (H37Rv Pasteur) na 3a semana do experimento, e com a solução salina na 6a semana do experimento.
Os ratos foram sacrificados na 7a semana, e os seus baços foram extraídos e submergidos em tubos contendo 5 ml de L-glutamina-RPMI (Gibco). Os tubos foram mantidos em gelo até o final do experimento. Os baços foram mecanicamente desintegrados e a suspensão foi filtrada através de uma trama de nylon de 70 pm de diâmetro. Em seguida, foram centrifugados por 10 minutos a 300 g. Os grânulos foram reconstituídos com 15 ml de uma solução composta por Tris e cloreto de amônia em água duas vezes destilada para realizar a lise nas células. Depois de 8 minutos, eles foram lavados com 20 ml de L-glutamina-RPMI e centrifugados por 10 minutos a 300 g.
Os grânulos obtidos foram recolocados em suspensão com 5 ml de Lglutamina-RPMI, e a suspensão foi filtrada através de uma trama de nylon de 70 pm de diâmetro. As células foram contadas com a câmera Neubauer.
As células dos baços dos ratos foram semeadas em pratos em uma proporção de 1 x 105 células/poço e foram cultivadas com 200 pl do meio de cultura completo (CCM) composto por L-glutamina-RPMI suplementado com soro
11/12 de feto de bezerro desativado, penicilina, estreptomicina, piruvato de sódio e 2mercaptoetanol, ou com 200 μΐ de meio de cultura completo (CCM) suplementado com antígenos de M. tuberculosis: 10 pg/ml do antígeno PPD (Statens Serum Instituí, da Dinamarca) e 5 pg/ml de ESAT-6, Ag85A e Ag85B (Lionex 5 Diagnostics and Therapeutics GmbH, da República Federal da Alemanha).
As células foram incubadas a 37° C em uma atmosfera com 5% CO2. Depois de 96 horas, os pratos foram centrifugados por 10 minutos a 300 g e o supematante de cada um deles foi coletado.
Os supematantes foram congelados após permanecer no citado estado por no mínimo 24 horas, o conteúdo de interferon-γ foi analisado aplicando-se a técnica de ELISA duplo sanduíche e utilizando-se um anticorpo monoclonal específico para interferon-γ murino (Diaclone).
A tabela II apresenta a concentração média de interferon-γ expressa como logio pg/ml que foi induzida em cada um dos grupos de ratos contra os 15 antígenos de M. tuberculosis:
Grupo Inóculo Antígenos
Controle PPD ESAT-6 Ag85B Ag85A
1 Controle 0 0 0 0 0
2 Agente imunoterapêutico encapsulado no lipossoma 0 2,57 0 2,69(1) 2,53(1)
3 BCG 0 2,01(3) 0 0 0
4 H37Rv 0 3,06(3) 2,86(2)(3) 2,76(3) 2,50(3)
(1) Diferenças estatisticamente significativas entre o Grupo 2 e o
Grupo 3.
(2) Diferenças estatisticamente significativas entre o Grupo 2 e o
Grupo 4.
12/12 (3) Diferenças estatisticamente significativas entre o Grupo 3 e o Grupo 4.
Os resultados da Tabela II mostram que as duas inoculações realizadas com o agente imunoterapêutico encapsulado no lipossoma baseado em fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta de M. tuberculosis são capazes de induzir a produção de interferon-γ contra antígenos específicos de M. tuberculosis. Isto significa que eles induzem uma resposta protetora do tipo Thl.
Em particular, a resposta induzida pelo grupo de ratos inoculados com o agente imunoterapêutico encapsulado com lipossoma contra os antígenos PPD, Ag85B e Ag85A não apresenta diferenças significativas com a resposta do grupo de ratos inoculados com a cepa virulenta H37Rv de M. tuberculosis. A citada resposta é melhor do que a resposta do grupo de ratos inoculados com a cepa BCG, que é a vacina convencional, já que induz somente uma resposta contra PPD e não contra Ag85B e Ag85A.
Somente o grupo de ratos inoculados com a cepa virulenta foi capaz de induzir uma resposta contra o antígeno ESAT-6.
Consequentemente, o agente imunoterapêutico baseado em fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta de M. tuberculosis é capaz de induzir uma resposta protetora do tipo Thl contra antígenos específicos de M. tuberculosis, o que é um indicador de que pode ser utilizado eficazmente para prevenir infecções causadas por M. tuberculosis.

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. ) Utilização de um agente imunoterapêutico compreendido por fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB-C) para a preparação de uma droga para o tratamento profilático de tuberculose, no qual o citado agente é caracterizado por ser passível de ser conseguido por meio de um método compreendido pelas etapas a seguir:
    - cultivo da cepa virulenta de MTB-C durante um período igual a ou maior do que três semanas e, subsequentemente,
    - homogeneização da cultura celular na presença de um surfactante noniônico.
  2. 2. ) Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o período de cultura estar compreendido entre 3 e 4 semanas.
  3. 3. ) Utilização, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada por o surfactante noniônico ser selecionado a partir do grupo compreendido por alquil fenol etoxilados, ésteres de sorbitan etoxilados e misturas dos mesmos.
  4. 4. ) Utilização, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o surfactante noniônico ser selecionado a partir do grupo de octilfenol etoxilados.
  5. 5. ) Utilização, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o surfactante noniônico ser selecionado a partir de octilfenol etoxilados com um conteúdo de óxido de etileno compreendido entre 7 e 8 mols.
  6. 6. ) Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por a homogeneização ser realizada em um meio tampão com pH neutro.
  7. 7. ) Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações I a 6, caracterizada por o método ser compreendido ainda pelas seguintes etapas:
    - separação das células não fragmentadas e os componentes solubilizados por meio de centrifugação,
    - submissão da fração de fragmentos de parede celular a um tratamento químico ou físico para desativar as eventuais células de cepa virulenta que possa conter, e
    - secagem do agente imunoterapêutico obtido por meio de liofilização.
  8. 8. ) Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por a droga estar na forma de lipossomas.
  9. 9. ) Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por a droga ser administrada na forma de uma única dose ou diversas doses.
  10. 10. ) Utilização, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a droga ser
    Petição 870180152892, de 19/11/2018, pág. 10/18
    2/2 administrada em duas doses.
  11. 11. ) Utilização, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por as doses serem administradas separadamente durante um período compreendido entre 2 e 5 semanas.
  12. 12. ) Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por a droga ser administrada em combinação com outras vacinas profiláticas contra tuberculose.
  13. 13. ) Utilização, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por as vacinas serem combinadas em duas inoculações separadas ao longo do tempo.
  14. 14. ) Utilização, de acordo com a reivindicação l3, caracterizada por a administração, em primeiro lugar, de uma vacina profilática contra tuberculose e, subsequentemente, pela administração da droga compreendida por fragmentos de parede celular de uma cepa virulenta de MTB-C.
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