BRPI0711582A2 - polipeptìdeos antifúngicos - Google Patents

Abstract

POLIPEPTìDEOS ANTIFúNGICOS. São providos métodos e composições para proteção de uma planta de um agente patogênico, especificamente um agente patogênico de fungo. As composições incluem seqüências de aminoácido, variantes e fragmentos das mesmas para polipeptídeos antipatogênicos que foram isolados de caldos de fermentação de fungos. Os ácidos nucléicos que codificam os polipeptí.deos antipatogênicos são também providos. é provido adicionalmente um método para indução de resistência do agente patogênico em uma planta usando as seqúências de nucleotídeo reveladas aqui. O método compreende introdução em uma planta de um cassete de expressão compreendendo um promotor operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo antipatogênico da invenção. São adicionalmente providas composições compreendendo um polipeptídeo antipatogênico ou um microorganismo transformado compreendendo um ácido nucléico da invenção em combinação com um veículo e métodos de uso dessas composições para proteger a planta de um agente patogênico. Também são reveladas plantas transformadas, células de plantas, sementes e microorganismos compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo antipatogênico da invenção.

Description

P0LIPEPTÍDE0S ANTIFUNGICOS

PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO

Essa invenção foi realizada com o suporte governamental de acordo com o contrato número DE-AC02- 05CH11231, concedido pelo United States Department of Energy. O governo detém determinados direitos com relação â invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere aos polipeptideos que apresentam atividade antipatogênica e às seqüências de ácido nucléico que codificam os mesmos. Os métodos da invenção empregam esses polipeptideos antipatogênicos e seqüências de ácido nucléico para controlar agentes patogênicos das plantas e aumentar a resistência patogênica nas plantas.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

As doenças das plantas se constituem, freqüentemente, em uma limitação séria na produtividade agrícola e, o portanto, vêm influenciando a história e desenvolvimento das práticas agrícolas. Vários agentes patogênicos são responsáveis pelas doenças das plantas, incluindo fungos, bactérias, vírus, e nematóides. Entre os agentes causadores das doenças infecciosas das plantas de colheita, contudo, os fungos constituem o grupo economicamente mais importante de agentes patogênicos das plantas e são responsáveis pelas perdas anuais enormes de alimentos, fibras e provisões comercializáveis.

A incidência de doenças das plantas vem sendo tradicionalmente controlada por práticas agrícolas que incluem rotação da colheita, o uso de substâncias químicas agrícolas e técnicas de reprodução convencionais. O emprego de substâncias químicas para controlar agentes patogênicos das plantas, contudo, aumenta os custos para os fazendeiros e causa efeitos prejudiciais no ecossistema. Os consumidores e reguladores governamentais de modo semelhante estão se tornando mais conscientes dos perigos ambientais associados à produção e uso de substâncias agrícolas sintéticas para combater os agentes patogênicos.

Em razão de tais questões, os reguladores baniram os limitaram o uso de algumas das substâncias químicas mais perigosas. A incidência das doenças de fungo vem sendo controlada em algum grau por colheitas de reprodução resistente. Os métodos de reprodução tradicionais, contudo, são consumidores de tempo e requerem esforço contínuo de modo a manter a resistência à doença conforme evoluem os agentes patogênicos. Vide, por exemplo, Grover e Gowthaman (2003) Curr. Sei. 84:330-340. Assim, existe uma necessidade significativa de novas alternativas para o controle dos agentes patogênicos das plantas que possuem um risco mais baixo de poluição e perigos ambientais que os característicos dos métodos à base de substâncias químicas agrícolas tradicionais e que são menos problemáticos que as técnicas de reprodução convencionais.

Muitas doenças das plantas, incluindo, porém não limitado à podridão do caule do milho e mofo da espiga, podem ser causadas por uma variedade de agentes patogênicos. A podridão do caule, por exemplo, é uma das doenças do milho mais destrutiva e amplamente difundida. A doença é causada por um complexo de fungos e bactérias que atacam e degradam os caules que se encontram próximo à maturidade da planta. A perda de rendimento significativa pode ocorrer como resultado da queda dos caules enfraquecidos, bem como morte prematura da planta. A podridão do caule do milho é tipicamente causada por mais de uma espécie de fungo, porém a podridão do caule por Gibberella, causado Gibberella zeae, podridão do caule por Fusarium, causado pelo Fusarium verticillioides, F. proliferatum, ou F. subglutinans e podridão do caule por Antracnose, causada por Colletotrichum graminicola são as mais freqüentemente reportadas (Smith e White (1988) ; Diseases of corn, pp. 701-766 em Corn and Corn Improvement, Agronomy Series #18 (3a ed.), Sprague, C.F., e Dudley, J. W., eds. Madison, WI) . Devido ao fato de que as doenças das plantas podem ser causadas por um complexo de agentes patogênicos, é necessária uma resistência de amplo espectro para mediar eficazmente o controle da doença. Assim, existe uma necessidade significativa de composições antifúngicas que possam marcar múltiplos agentes patogênicos que causam podridão de caule e mofo da espiga.

Recentemente, os cientistas agrícolas desenvolveram plantas de colheita com resistência melhorada aos agentes patogênicos por transformação genética das plantas para expressarem proteínas antipatogênicas. Por exemplo, as batatas e o tabaco geneticamente transformados para produzirem uma proteína de endocitinase antifúngicos mostraram resistência aumentada aos agentes patogênicos de fungos nativos ao solo e foliares. Vide Lorito e outros, (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. 95:7860-7865. Além disso, a cevada transgênica que é resistente ao fungo de ferrugem do caule também foi desenvolvida. Vide Horvath e outros, (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. 100:364-369. Um esforço contínuo para identificar os agentes antipatogênicos e para transformar geneticamente as plantas resistentes a doenças está em andamento.

Assim, a luz do impacto significativo dos agentes patogênicos das plantas, especificamente agentes patogênicos de fungos, no rendimento e qualidade das colheitas, novas composições e métodos para proteger as plantas dos agentes patogênicos são necessários. Os métodos e composições para controlar múltiplos agentes patogênicos de fungo são de interesse específico.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO

Composições e métodos para proteger uma planta de um agente patogênico são obtidos. As composições incluem seqüências de aminoácido e nucleotídeo para polipeptídeos antipatogênicos, especificamente antifúngicos. Os polipeptídeos da invenção revelam atividade antipatogênica contra agentes patogênicos de fungos nas plantas. Mais especificamente, as composições da invenção compreendem os polipeptídeos antipatogênicos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 1 e 3, além de seus variantes e fragmentos. Moléculas de ácido nucléico compreendendo seqüências de nucleotídeo que codificam os polipeptídeos antipatogênicos da invenção são adicionalmente obtidas. As composições podem também incluir cassetes de expressão compreendendo um promotor ligado operavelmente a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo antipatogênico da invenção. Plantas transformadas, células de planta, sementes e microorganismos compreendendo um cassete de expressão da invenção são adicionalmente obtidos. As composições da invenção são úteis nos métodos direcionados à indução de resistência ao agente patogênico, especificamente resistência ao fungo, nas plantas. Nas concretizações específicas, os métodos compreendem introdução na planta de pelo menos um cassete de expressão compreendendo um promotor ligado operave lmente a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo antipatogênico da invenção. Como um resultado, o polipeptídeo antipatogênico é expresso na planta e o agente patogênico é exposto à proteína no sítio de ataque do agente patogênico, pelo que, conduzindo à resistência aumentada contra o agente patogênico. Um promotor preferido de tecido pode ser usado para acionar a expressão de uma proteína antipatogênica nos tecidos de planta específicos que são especificamente vulnerais ao ataque dos agentes patogênicos, tais como, por exemplo, as raízes, folhas, caules, tecidos vasculares e sementes. Os promotores de indução do agente patogênico podem também ser empregados para acionar a expressão de uma proteína antipatogênica da invenção em ou próximo ao sítio da infecção por agente patogênico.

A presente invenção obtém, adicionalmente, composições e formulações antipatogênicas, além de métodos para seu emprego na proteção de uma planta de um agente patogênico, especificamente um agente patogênico de fungo. Em algumas concretizações, as composições compreendem um polipeptídeo antipatogênico ou um microorganismo transformado compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo antipatogênico da invenção, em combinação com um veículo. Os métodos de emprego dessas composições para proteger uma planta de um agente patogênico compreendem aplicação da composição antipatogênica ao ambiente de um agente patogênico de planta, por exemplo, por empoeiramento, difusão ou revestimento da semente. Os métodos e composições da invenção encontram uso na proteção das plantas dos agentes patogênicos, incluindo agentes patogênicos de fungo, nematóides e semelhantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra um alinhamento de seqüência das seqüências de aminoácido dos polipeptídeos LB-09812 (SEQ ID NO: 1) e LB-12922 (SEQ ID NO: 3) com os homólogos putativos estabelecidos nas SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 10 e 12. As descrições detalhadas desses homólogos putativos são fornecidas aqui a seguir.

A figura 2 mostra exemplos fotográficos do nivel de inibição associada a cada classificação numérica no ensaio de placa antifúngicos descrito no Exemplo 2.

A figura 3 provê os resultados dos ensaios de atividade antifúngicos realizados com o polipeptídeo estabelecido na SEQ ID N0:1, conforme descrito no Exemplo 3. A atividade antifúngicos contra Colletotrichum graminicola, Diplodia maydis, Fusarium graminearum e Fusarium verticillioides foi observada com ambos os polipeptídeos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção obtém composições e métodos direcionados à indução de resistência ao agente patogênico, especificamente resistência ao fungo nas plantas. As composições são seqüências de nucleotídeo e aminoácido para polipeptídeos antipatogênicos. Especificamente, a presente invenção obtém polipeptídeos antipatogênicos que apresentam as seqüências de aminoácido estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1 e 3 e variantes e fragmentos das mesmas, que foram isolados de extratos de caldo de fermentação de fungos de Penicillium glandicola e Penicillium citreonigrum e designados LB-09812 e LB-12922, respectivamente. A cepa do fungo LB-09812 foi isolada do solo de florestas com madeira apodrecida de Populus trenola L. em Kiev, Ucrânia. A cepa do fungo LB-12922 foi isolada de solo cultivado na região de Ternapol, na Ucrânia. As seqüências de aminoácido estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1 e 3 representam as formas de peptídeo maduras dos polipeptídeos de comprimento pleno, não processados, correspondentes conforme definido aqui a seguir. Um polipeptídeo antifúngicos possuindo a mesma seqüência de aminoácido de término N como SEQ ID NO :1 foi também purificado de um caldo de fermentação de fungo Penicillium glandicola que foi isolado de solo das florestas com madeira apodrecida de Tilia cordata L. em Kiev. São também obtidas moléculas de ácido nucléico isoladas, tais como, por exemplo, SEQ ID NOs: 2 e 4 e variantes e fragmentos das mesmas, compreendendo seqüências de nucleotídeo que codificam as seqüências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 1 e 3, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeo que são otimizadas para expressão nas plantas, especificamente no milho, e que codificam o polipeptídeo da SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO: 3 podem ser geradas usando métodos padrão conhecidos na técnica. Tais seqüências de nucleotídeo otimizadas na planta são adicionalmente englobadas pela presente invenção. As plantas, células de planta, sementes e microorganismos compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo antipatogênico da invenção são também reveladas aqui. São adicionalmente obtidas as composições antipatogênicas compreendendo um agente antipatogênico isolado, especificamente um polipeptídeo antifúngicos ou um microorganismo que expressa um polipeptídeo da invenção, em combinação com um veículo. As composições da invenção encontram emprego na geração de plantas resistentes aos agentes patogênicos e nas plantas de proteção contra agentes patogênicos, especificamente agentes patogênicos de fungos.

Os polipeptídeos revelados aqui como SEQ ID NOs: 1 e 3 revelam atividade antifúngicos contra agentes patogênicos de fungo das plantas, tais como, por exemplo, Colletotrichum graminicola, Diplodia maydis, Fusarium graminearum e Fusarium verticillioides. As espécies de origem dos polipeptídeos antifúngicos das SEQ ID NOs: 1 e 3 foram determinadas como sendo de fungos. Especificamente, a fonte de fungo do polipeptídeo da SEQ ID N0:1 é Penicillium glandicola. A fonte de fungo do polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO:3 é Penicillium citreonigrum.

Os homólogos putativos com similaridade de seqüência aos polipeptídeos antifúngicos das SEQ ID NO :1 e SEQ ID NO: 3 foram identificados de outras fontes de fungos. As pesquisas da base de dados revelaram que as SEQ ID NOs: 1 e 3 compartilham similaridade de seqüência com os produtos de tradução prescritos de uma seqüência de nucleotídeo isolada de uma coletânea de expressão de DNAc normalizada Aspergillus flavus (seqüência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:5; seqüência de nucleotídeo estabelecida na SEQ ID NO: 6 (Número de acesso C0133987)) e uma seqüência de nucleotídeo isolada de uma coletânea de DNAc de Aspergillus niger (seqüência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 7; seqüência de nucleotídeo estabelecida na SEQ ID NO: 8 (Número de acesso DR698208 (filamento complementar do DNAc DR698208) ; e seqüência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 9). Os polipeptídeos antifúngicos das SEQ ID NOs: 1 e 3 também compartilham homologia com uma proteína hipotética de função desconhecida, isolada do Aspergillus fumigatus (seqüência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 10 (derivada do Número de acesso EAL92121 (corrigido)); seqüência de nucleotídeo estabelecida na SEQ ID NO: 11 (Número de acesso AAHFO 1000002) . Um DNA genômico codificando um homólogo LB-09812/LB-12922 do Fusarium graminearum também foi isolado. 0 produto de tradução prescrito da seqüência genômica isolada do Fusarium graminearum também é revelado aqui (seqüência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:12; seqüência de nucleotídeo estabelecida na SEQ ID NO:13 (Número de acesso AACMO 1000196.1)) . Nenhum dos homólogos putativos das SEQ ID NOs: 1 e 3 descritos aqui é reportado na literatura como possuindo atividade antifúngicos. Um alinhamento dos polipeptídeos da invenção e esses análogos putativos são fornecidos na figura 1. As seqüências de aminoácido estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 10 e 12 e as seqüências de nucleotídeo estabelecidas na SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 11 e 13 podem também ser usadas nas composições antipatogênicas e nos métodos da invenção.

Os ácidos nucléicos e polipeptídeos da presente invenção encontram emprego nos métodos para indução de resistência ao agente patogênico em uma planta. Conseqüentemente, as composições e métodos revelados aqui são úteis na proteção das plantas contra agentes patogênicos de fungo, vírus, nematóides e semelhantes.

"Resistência ao agente patogênico" ou "resistência à doença" significa que a planta evita os sintomas da doença que se constituem no resultado das interações planta-agente patogênico. Isto é, os agentes patogênicos são impedidos de causar doenças nas plantas e sintomas de doença associados ou alternativamente, os sintomas da doença causados pelo agente patogênico são minimizados ou abrandados, tais como, por exemplo, a redução do estresse e perdas de rendimento associadas. Um versado na técnica apreciará que as composições e métodos revelados aqui podem ser usados com outras composições e métodos disponíveis na técnica na proteção das plantas do ataque de insetos e agentes patogênicos.

"Composições antipatogênicas" ou "polipeptídeos antipatogênicos" pretende significar que as composições da invenção possuem atividade antipatogênica e assim são capazes de supressão, controle e/ou extermínio do organismo patogênico invasivo. Um polipeptídeo antipatogênico da invenção reduzirão os sintomas da doença resultando do desafio do agente patogênico em pelo menos cerca de 5% a cerca de 50% em pelo menos cerca de 10% a cerca de 60% e pelo menos cerca de 30% a cerca de 70%, pelo menos cerca de 40% a cerca de 80% ou pelo menos cerca de 50% a cerca de 90% ou maior. Conseqüentemente, os métodos da invenção podem ser utilizados para proteger plantas da doença, especificamente aquelas doenças que são causadas por agentes patogênicos das plantas. Nas concretizações específicas, a atividade antipatogênica exibida pelos polipeptídeos da invenção é a atividade antifúngicos. Conforme empregado aqui, "atividade antifúngicos" se refere à capacidade de supressão, controle e/ou extermínio do agente patogênico de fungo invasivo. Da mesma forma, "resistência ao fungo" se refere à tolerância melhorada a um agente patogênico de fungo, quando comparado aquele de uma planta do tipo não tratada ou silvestre. A resistência pode variar de um leve aumento na tolerância aos efeitos do agente patogênico de fungo (por exemplo, inibição parcial) à resistência total, tal que, a· planta não é afetada pela presença do agente patogênico. Um nível aumentado de resistência contra um agente patogênico de fungo específico ou contra um espectro mais amplo de agentes patogênicos de fungo podem ambos constituir atividade antifúngicos ou resistência ao fungo aperfeiçoada.

Os ensaios que medem atividade antipatogênica são geralmente conhecidos na técnica, como o são os métodos para quantificar a resistência a doença nas plantas seguindo-se a infecção pelo agente patogênico. Vide, por exemplo, a Patente US número 5.614.395 que é incorporada aqui como referência. Tais técnicas incluem medição com o tempo, o diâmetro de lesão média, a biomassa do agente patogênico e a porcentagem total dos tecidos de planta diminuídos. Por exemplo, uma planta tanto expressando um polipeptídeo antipatogênico quanto possuindo uma composição antipatogênica aplicada à sua superfície mostra uma diminuição na necrose do tecido (isto é, diâmetro da lesão) ou uma diminuição na morte da planta seguindo-se o desafio do agente patogênico quando comparada a uma planta de controle que não foi exposta à composição antipatogênica. Alternativamente, a atividade antipatogênica pode ser medida por uma diminuição na biomassa do agente patogênico.

Por exemplo, uma planta expressando um polipeptídeo antipatogênico ou exposta a uma composição antipatogênica é desafiada com um agente patogênico de interesse. Com o tempo, as amostras de tecido dos tecidos inoculados com agente patogênico são obtidas e o RNA é extraído. A porcentagem de uma transcrição de RNA de agente patogênico específica em relação ao nível de uma transcrição específica da planta permite que o nível da biomassa do agente patogênico seja determinado. Vide, por exemplo, Thomma e outros, (1998) Plant Biology 95:15107-15111, incorporado aqui como referência.

Adicionalmente, os ensaios antipatogênicos in vitro, incluem, por exemplo, a adição de concentrações variadas da composição do agente patogênico aos discos de papel e colocação dos discos sobre suspensão contendo Agar do agente patogênico de interesse. Seguindo-se a incubação, zonas de inibição límpidas se desenvolvem ao redor dos discos que contêm uma concentração eficaz do polinucleotídeo antipatogênico (Liu e outros, (1994) Plant Biology 91:1888-1892, incorporado aqui como referência). Adicionalmente, a análise microespectrométrica pode ser empregada para medir as propriedades antipatogênicas in vitro de uma composição (Hu e outros, (1997) Plant Mol. Biol. 34:949-959 e Cammue e outros, (1992) J. Biol. Chem. 267: 2228-2233, ambos incorporados aqui como referência). Os ensaios que medem especificamente a atividade antifúngicos são também bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Duvick e outros, (1992) J. Biol. Chem. 267:18814-18820; Lacadena e outros, (1995) Arch. Biochem. Biophys. 324:273-281; Xu e outros, (1997) Plant Mol. Biol. 34: 949-959; Lee e outros, (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 263:646-651; Vila e outros, (2001) Mol. Plant Microbe Interact. 14:1327-1331; Moreno e outros, (2003) Phytpathol. 93 :1344-1353; Kaiserer e outros, (2003) Arch. Microbiol. 180:204-210 e Patente US número 6.015.941.

As composições reveladas aqui compreendem ácidos nucléicos isolados que codificam polipeptideos antipatogênicos, cassetes de expressão compreendendo as seqüência de nucleotídeo da invenção e polipeptideos antipatogênicos isolados. As composições antipatogênicas compreendendo um polipeptídeo da invenção, em combinação com um veículo são também providas. A invenção revela, adicionalmente, plantas e microorganismos transformados com ácidos nucléicos que codificam proteínas antipatogênicas. As composições encontram uso nos métodos para induzir resistência ao agente patogênico em uma planta e para proteção de uma planta do agente patogênico, especificamente agentes patogênicos de fungo.

Nos aspectos específicos, os métodos para indução de uma resistência ao agente patogênico em uma planta compreendem introdução em uma planta de pelo menos um cassete de expressão, sendo que o cassete de expressão compreende uma seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo antipatogênico da invenção ligado operavelmente a um promotor que aciona a expressão na planta. A planta expressa o polipeptídeo antipatogênico, pelo que, expondo o agente patogênico ao polipeptídeo no sítio de ataque do agente patogênico. Nas concretizações específicas, os polipeptídeos possuem atividade antifúngicos, e o agente patogênico é um fungo, tal como, por exemplo, Colletotrichum graminicola, Diplodia maydis, Fusarium graminearum ou Fusarium verticillioides. A expressão de um polipeptídeo antipatogênico da invenção pode ser alvejada para tecidos de planta específicos onde a resistência ao agente patogênico é especificamente importante, tal como, por exemplo, as folhas, raízes, caules ou tecidos vasculares. Tal expressão preferida do tecido pode ser realizada por promotores preferidos para raiz, preferidos para folha, preferidos para tecido vascular, preferidos para caules ou preferidos para sementes. Além disso, os polipeptídeos da invenção podem também ser alvejados pra locais subcelulares específicos dentro de uma célula de planta ou, alternativamente, secretados da célula, conforme descrito aqui a seguir.

Igualmente como a expressão de um polipeptídeo antipatogênico da invenção pode ser alvejada para tecidos específicos de planta ou tipos de células através do emprego de promotores apropriados, ela pode também ser alvejada para diferentes locais dentro da célula, através do emprego de informações de alvejamento ou "marcadores de alvejamento" . Diferente do promotor, que atua como o nível transcricional, tais informações de alvejamento fazem parte do produto de tradução inicial. Dependendo do modo de infecção do agente patogênico ou a função metabólica do tecido ou tipo de célula, a localização da proteína nos diferentes compartimentos da célula pode tornar isso mais eficaz contra um dado agente patogênico ou fazer com que isso interfira menos com as funções da célula. Por exemplo, pode-se produzir uma proteína precedida por um peptídeo de sinal, que dirige o produto de tradução para dentro do retículo endoplásmico, por inclusão na construção (isto é, cassete de expressão) de seqüência codificando um peptídeo de sinal, (tais seqüência podem também ser denominadas as "seqüência de sinal"). A seqüência de sinal empregada seria, por exemplo, uma associada ao gene codificando o polipeptídeo ou poderia ser tomada de outro gene. Existem muitos peptídeos de sinal descritos na literatura e eles são amplamente intercambiáveis (Raikhel and Chrispeels, "Protein sorting and vesicle traffic" em Buchanan e outros, eds, (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants (American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD), incorporado aqui como referência). A adição de um peptídeo de sinal resultará no produto de tradução entrando no retículo endoplásmico (no processo do qual o peptídeo de sinal é removido do polipeptídeo), porém a localização intracelular final da proteína depende de outros fatores que podem ser manipulados para resultar na localização mais apropriada para o agente patogênico e tipo de célula. A via padrão, isto é, a via tomada pelo polipeptídeo se nenhum outro marcador de alvejamento for incluído, resulta na secreção do polipeptídeo através da membrana celular (Raikhel e Chrispeels, supra) para o apoplasto. O apoplasto é a região fora do sistema de membrana do plasma e inclui paredes celulares, espaços intercelulares e os vasos de xilema que formam um sistema contínuo e permeável através do qual a água e solutos podem se mover. Isso será freqüentemente, uma localização apropriada. Nas concretizações específicas, uma seqüência de nucleotídeo codificando um peptídeo de sinal de alfa-amilase de cevada (BAA) é ligada na estrutura a um polinucleotideo da invenção. A seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo de sinal BAA e a seqüência de aminoácido para o peptídeo de sinal são estabelecidas na SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, respectivamente. Uma seqüência de nucleotídeo exemplar codificando o peptídeo de sinal BAA ligada a uma seqüência de nucleotídeo codificando SEQ ID NO:l e a seqüência de aminoácido para a BAA-SEQ ID NO:1 são obtidas nas SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17, respectivamente. Uma seqüência de nucleotídeo exemplar codificando o peptídeo de sinal BAA ligada a uma seqüência de nucleotídeo codificando SEQ ID NO: 3 e a seqüência de aminoácido para BAA-SEQ ID NO: 3 são adicionalmente obtidas nas SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO-.19, respectivamente.

Outros agentes patogênicos podem ser mais eficazmente combatidos por localização do peptídeo dentro da célula ao invés de fora da membrana celular. Isso pode ser realizado, por exemplo, por adição de uma seqüência codificando o sinal de retenção de retículo endoplásmico para a seqüência do gene. Os métodos e seqüência para realizar isso são descritos em Raikhel e Chrispeels, supra; por exemplo, adição das seqüência codificando os aminoácidos K, D, E e L naquela ordem ou suas variações descritas na literatura ao final da fração de codificação de proteína do polipeptídeo realizará isso. As seqüência de retenção de ER são bem conhecidas na arte e incluem, por exemplo, KDEL (SEQ ID NO: 2 0) , SEKDEL (SEQ ID N0:21), HDEL (SEQ ID NO:22), e HDEF (SEQ ID NO:23). Vide, por exemplo, Denecke e outros, (1992). EMBO J. 11:2345-2355; Wandelt e outros, (1992) Plant J. 2:181-192; Denecke e outros, (1993) J. Exp. Bot. 44:213-221; Vitale e outros, (1993) J. Exp. Bot. 44:1417- 1444; Gomord e outros, (1996) Plant Physiol. Biochem. 34:165-181; Lehmann e outros, (2001) Plant Physiol. 127 (2): 436-449.

Alternativamente, o emprego dos marcadores de alvejamento vacuolares tais como aqueles descritos por Raikhel and Chrispeels, supra, além do peptídeo de sinal resultará na localização do peptídeo em uma estrutura vacuolar. Conforme descrito em Raikhel e Chrispeels, supra, o marcador de alvejamento vacuolar pode ser colocado em diferentes posições na construção. 0 uso de um peptídeo de transição plastídeo codificando a seqüência ao invés de um peptídeo de sinal codificando a seqüência resultará na localização do polipeptídeo no plastídeo do tipo de célula escolhido (Raikhel e Chrispeels, supra). Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Von Heijne e outros, (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark e outros, (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa e outros, (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer e outros, (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; e Shah e outros, (1986) Science 233:478-481.

As seqüência de alvejamento de cloroplasto que codificam tais peptídeos de trânsito são também conhecidas na técnica e incluem a subunidade pequena de cloroplasto da ribulose- 1,5-bisfosfato carboxilase (Rubisco) (de Castro Silva Filho e outros, (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell e outros, (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5- (enolpiruvil)chiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS) (Archer e outros, (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22 (6) :789-810) ; triptofano sintase (Zhao e outros, (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081 -6087); plastocianina (Lawrence e outros, (1997) J. Biol. Chem. 272 (33) :20357-20363) ; corismato sintase (Schmidt e outros, (1993) J. Biol. Chem. 268 (36) : 27447-27457) ; e a proteína de ligação a/b de clorofila em colheita com luz (LHBP) (Lamppa e outros, (1988) J. Biol. Chem. 263 :14996-14999) . Um versado na técnica também preveria a geração de plantas transgênicas, nas quais os cloroplastos foram transformados para superexpressar um gene para um peptídeo antipatogênico. Vide, por exemplo, Daniell (1999) Nature Biotech 17:855- 856; e Patente US número 6.338.168.

Poderia também ser prevista a localização do polipeptídeo antipatogênico em outros compartimentos celulares por adição de informações apropriadas de alvejamento. (Raikhel e Chrispeelsi supra). Um site útil disponível na internet onde podem ser obtidas informações e referências com relação ao reconhecimento de várias seqüências alvo pode ser encontrado em: psort.nibb.ac.jp/mit. Outras referências com relação ao estado da técnica de alvejamento de proteína incluem Silva- Filho (2003) Curr. Opin. Plant Biol. 6:589-595; Nicchitta (2002) Curr. Opin. Cell Biol. 14:412-416; Bruce (2001) Biochim Biophys Acta 1541:2-21; Hadlington & Denecke (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 3: 461-468; Emanuelsson e outros, (2000) J. Mol. Biol. 300:1005-1016; Emanuelsson & von Heijne (2001) Biochim Biophys Acta 1541:114-119, incorporados aqui como referência. As composições da invenção encontram emprego nos métodos direcionados à proteção de uma planta de um agente patogênico. "Proteção de uma planta do agente patogênico" significa o extermínio do agente patogênico ou prevenção ou limitação da formação da doença em uma planta. Em algumas concretizações, uma composição antipatogênica compreendendo um polipeptídeo antipatogênico e um veículo é aplicada diretamente ao ambiente de um agente patogênico de planta, tal como, por exemplo, em uma planta ou no solo ou outro meio de crescimento circundando as raízes da planta, a fim de proteger a mesma do ataque do agente patogênico. Microorganismos transformados compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma proteína antipatogênica da invenção e métodos de emprego das mesmas para proteger uma planta de um agente patogênico são adicionalmente obtidos. Em algumas concretizações, o microorganismo transformado é aplicado diretamente a uma planta ou ao solo onde a planta se desenvolve.

Conforme empregado aqui, "ácido nucléico" inclui referência a um desoxiribonucleotídeo ou polímero ribonucleotídeo tanto em uma forma filamentada simples ou dupla e a menos que de outra forma limitado, engloba análogos conhecidos (por exemplo, ácidos nucléicos de peptídeo) possuindo a natureza essencial dos nucleotídeos naturais pelo que eles hibridizam em ácidos nucléicos de filamento simples em um modo semelhante ao dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados aqui intercambiave lmente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam aos polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduos de aminoácido se constituem em um análogo químico artificial de um aminoácido correspondente ocorrendo naturalmente, bem como aos polímeros de aminoácido ocorrendo naturalmente. Os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos tanto de um ácido nucléico revelado aqui quanto pelo emprego de técnicas padrão de biologia molecular. Por exemplo, uma proteína truncada da invenção pode ser produzida por expressão de um ácido nucléico recombinante da invenção em uma célula hospedeira apropriada ou alternativamente por uma combinação de procedimentos ex vivo, tais como, digestão e purificação.

Conforme empregado aqui, os termos "codificando" ou "codificado" quando empregados no contexto de um ácido nucléico especificado significam que o ácido nucléico compreende as informações necessárias para direcionar a tradução da seqüência de nucleotídeo em uma proteína especificada. As informações pelas quais uma proteína é codificada são especificadas pelo emprego de códons. Um ácido nucléico codificando uma proteína pode compreender seqüências não traduzidas (por exemplo, íntrons) dentro das regiões traduzidas do ácido nucléico ou pode não possuir tais seqüências não traduzidas intermediárias (por exemplo, como no DNAc).

A invenção engloba polinucleotídeo substancialmente purificado ou composições de proteína. Um polinucleotídeo "isolado" ou "purificado" ou proteína ou fração biologicamente ativa do mesmo é substancial ou essencialmente isenta de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou proteína conforme verificado em seu ambiente ocorrendo naturalmente.

Assim, um polinucleotídeo ou proteína isolada ou purificada é substancialmente isenta de outro material celular ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes ou substancialmente isenta de precursores químicos ou outras substâncias químicas quando sintetizada quimicamente.

Opcionalmente, um polinucleotídeo "isolado" é isento de seqüências (otimamente seqüências codificando proteína) que naturalmente flanqueiam o polinucleotídeo (isto é, seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) no DNA genômico do organismo, a partir das quais o polinucleotídeo se deriva. Por exemplo, nas várias concretizações, o polinucleotídeo isolado pode conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb da seqüência de nucleotídeo que naturalmente flanqueia o polinucleotídeo no DNA genômico da célula, a partir da qual o polinucleotídeo se deriva. Uma proteína que é substancialmente isenta de material celular inclui preparações de proteína apresentando menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1 % (em peso seco) da proteína de contaminação. Quando a proteína da invenção ou fração biologicamente ativa é recombinantemente produzida, o meio de cultura representa otimamente menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de precursores químicos ou substâncias químicas diferentes da proteína de interesse.

Fragmentos e variantes das seqüências de nucleotídeo e proteínas reveladas, codificados dessa forma são também englobados pela presente invenção. "Fragmento" significa uma fração da seqüência de nucleotídeo ou uma fração da seqüência de aminoácido e conseqüentemente a proteína codificada dessa forma. Os fragmentos de uma seqüência de nucleotídeo podem codificar fragmentos da proteína que mantêm a atividade biológica da proteína natura e, conseqüentemente, possuem atividade antipatogênica, mais especificamente atividade antifúngicos. Alternativamente, os fragmentos de uma seqüência de nucleotídeo que são úteis como sondas de hibridização geralmente não codificam proteínas de fragmento retendo atividade biológica. Assim, os fragmentos de uma seqüência de nucleotídeo podem variar de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos e até a seqüência de nucleotídeo de comprimento pleno codificando os polipeptídeos da invenção.

Um fragmento de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma fração biologicamente ativa de um polipeptídeo antifúngicos da invenção codificará pelo menos 15, 25, 30, 4 0 ou 50 aminoácidos contínuos ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo antifúngicos de comprimento pleno da invenção (por exemplo, 33 aminoácidos para SEQ ID N0:1). Os fragmentos de uma seqüência de nucleotídeo que são úteis como sondas de hibridização ou iniciadores da PCR geralmente não precisam codificar uma fração biologicamente ativa de uma proteína antipatogênica.

Conforme empregado aqui, "seqüência de comprimento pleno" com referência a um polinucleotídeo especificado significa possuir a seqüência de aminoácido total de uma seqüência nativa. "Seqüência nativa" significa uma seqüência endógena, isto é, uma seqüência não construída encontrada em um genoma do organismo. Assim, um fragmento de uma seqüência de nucleotídeo da invenção pode codificar uma fração biologicamente ativa de um polipeptideo antipatogênico ou pode ser um fragmento que pode ser empregado como uma sonda de hibridização ou iniciador da PCR usando os métodos revelados a seguir. Uma fração biologicamente ativa de um polipeptideo antipatogênico pode ser preparada por isolamento da fração de uma das seqüências de nucleotídeo da invenção, expressando a fração codificada da proteína antipatogênica (por exemplo, por expressão recombinante in vitro) e avaliação da atividade da fração codificada da proteína antif úngicos. As moléculas de ácido nucléico que são fragmentos de uma seqüência de nucleotídeo da invenção compreendem pelo menos 15, 20, 50, 75, 100 ou 150 nucleotídeos contínuos ou até o número de nucleotídeos presente em uma seqüência de nucleotídeo de comprimento pleno revelada aqui.

"Variantes" significa seqüências substancialmente semelhantes. Para os polinucleotídeos, uma variante compreende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios internos dentro do polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo. Conforme empregado aqui, um polinucleotídeo ou polipeptideo "nativo" compreende uma seqüência de nucleotídeo ocorrendo naturalmente ou seqüência de aminoácido, respectivamente. Um versado na técnica reconhecerá que variantes dos ácidos nucléicos da invenção serão construídas, tal que, o quadro abeto de leitura seja mantido. Para os polinucleotídeos, variantes conservadoras incluem aquelas seqüências que, em razão da degeneração do código genético, codificam a seqüência de aminoácido de um dos polipeptídeos antipatogênicos da invenção. Variantes alélicas ocorrendo naturalmente, tais como estas podem ser identificadas com o emprego de técnicas de biológica molecular bem conhecidas como, por exemplo, com reação da cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização conforme ressaltadas a seguir. Os polinucleotídeos variantes também incluem polinucleotídeo derivado sinteticamente, tais como aqueles gerados, por exemplo, por emprego de mutagênese direcionada para o sítio, porém que ainda codificam uma proteína antipatogênica da invenção. De modo geral, as variantes de um polinucleotídeo específico da invenção apresentarão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência em relação ao polinucleotídeo específico, conforme determinado pelos programas de alinhamento de seqüência e parâmetros descritos aqui em qualquer lugar.

As variantes de um polinucleotídeo específico da invenção (isto é, o polinucleotídeo de referência) podem também ser avaliadas em comparação ao percentual de identidade da seqüência entre o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. Assim, por exemplo, é revelado um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo com uma dada porcentagem de identidade de seqüência com relação ao polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3. A porcentagem de identidade da seqüência entre quaisquer dois polipeptídeos pode ser calculada empregando programas de alinhamento de seqüência e parâmetros descritos aqui em qualquer lugar. Quando qualquer dado par de polinucleotídeos da invenção é avaliado comparando-se a porcentagem de identidade da seqüência compartilhada pelos dois polipeptideos que eles codificam, a porcentagem de identidade da seqüência entre os dois polipeptideos codificados é de pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade da seqüência.

Proteína "variante" significa um derivado de proteína da proteína nativa por deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios internos na proteína nativa e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa. As proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a atividade biologicamente desejada da proteína nativa, isto é, atividade antipatogênica, especificamente antifúngicos conforme descrito aqui. Tais variantes podem resultar, por exemplo, de polimorfismo genético ou da manipulação humana. Variantes biologicamente ativas de uma proteína antipatogênica nativa da invenção terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com relação à seqüência de aminoácido para a proteína nativa, conforme determinado pelos programas de alinhamento de seqüências e parâmetros descritos aqui em qualquer posição. Uma variante biologicamente ativa de uma proteína da invenção pode diferir daquela proteína como tão pouco quanto 1-15 resíduos de aminoácido, tão pouco quanto 1-10, tais como, 6-10, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.

As proteínas da invenção podem ser alteradas de vários modos incluindo substituições, deleções, truncamentos e inserções de aminoácidos. Os métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes da seqüência de aminoácido e fragmentos das proteínas antipatogênicas podem ser preparados por mutações no DNA. Os métodos para mutagênese e alterações de polinucleotídeo são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488- 492; Kunkel e outros, (1987) Methods in Enzymol. 154:367-v 382; Patente US número 4.873.192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) e as referências citadas aqui. Diretrizes de como as substituições de aminoácido apropriadas não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff e outros, (1978) Atlas of Protein Seguence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado aqui como referência. Substituições conservadoras, tais como, troca de um aminoácido por outro possuindo propriedades semelhantes podem ser ótimas.

Assim, os genes e polinucleotídeos da invenção incluem ambas, as seqüências ocorrendo naturalmente, bem como as formas mutantes. Da mesma forma, as proteínas da invenção englobam proteínas ocorrendo naturalmente, bem como variações e formas modificadas das mesmas. Tais variantes continuarão a possuir a atividade antipatogênica desejada, especificamente atividade antifúngicos. Obviamente, as mutações que serão feitas no DNA codificando a variante não devem colocar a seqüência fora do quadro de leitura e otimamente não criarão regiões complementares que possam produzir estrutura de RNAm secundária. Vide a Patente EP número 0075444.

Na natureza, alguns polipeptídeos são produzidos como precursores complexos que, além dos marcadores de alvejamento, tais como os peptídeos de sinal discutidos aqui em algum local desse pedido, também contêm outros fragmentos de peptideos que são removidos (processados) em algum ponto durante a maturação da proteína, resultando em uma forma madura do polipeptídeo que é diferente do produto de tradução primário (com exceção da remoção do peptídeo de sinal) . "Proteína madura" se refere a um polipeptídeo processado pós translacionalmente; isto é, um do qual quaisquer pré ou pró-peptídeos presentes no produto de tradução primário foram removidos. "Proteína precursora", "pré-pró-peptídeo" ou "pré-pró-proteína" se refere ao produto primário da tradução de RNAm; isto é, com pré e pró-peptídeos ainda presentes. Os pré e pró-peptídeos podem incluir, porém não estão limitados aos sinais de localização intracelular. "Pré" nessa nomenclatura geralmente se refere ao peptídeo de sinal. A forma do produto de tradução apenas com o peptídeo de sinal removido, porém ainda sem processamento adicional é denominada um "pró-peptídeo" ou "pró-proteína" . Os fragmentos ou segmentos a serem removidos podem também ser referidos, propriamente, como "pró-peptídeos". Uma pró- proteína ou pró-peptídeo assim tem o peptídeo de sinal removido, porém apresenta os pró-peptídeos (aqui com referência aos segmentos de pró-peptídeo) e as frações que constituirão a proteína madura. O versado na técnica é capaz de determinar, dependendo das espécies nas quais as proteínas são expressas e da localização intracelular desejada, se os níveis de expressão mais altos podem ser obtidos por emprego de uma construção gênica codificando apenas a forma madura da proteína, a forma madura com um peptídeo de sinal ou a pró-proteína (isto é, uma forma incluindo pró-peptídeos) com um peptídeo de sinal. Para expressão ótima nas plantas ou fungos, as seqüências de pré e pró-peptídeo podem ser necessárias. Os segmentos de pró- peptídeo podem desempenhar um papel ajudando na dobra correta do peptídeo.

A seqüência genômica que codifica polipeptídeo LB- 09812 de comprimento pleno é obtida na SEQ ID NO:24. O polipeptídeo LB-09812 de comprimento pleno é estabelecido na SEQ ID NO: 25. Uma seqüência genômica que codifica polipeptídeo LB-12922 de comprimento pleno é obtida na SEQ ID NO:26. A seqüência de polipeptídeo LB-12922 de comprimento pleno prevista é estabelecida na SEQ ID NO:27. Detalhes experimentais com relação ao isolamento dos genes de LB-09812 e LB-12922 genes são obtidos no Exemplo 4 a seguir.

Não se espera que as deleções, inserções e substituições das seqüências de proteína englobadas aqui produzam alterações radicais nas características da proteína. Contudo, quando for difícil prever o efeito exato da substituição, deleção ou inserção com antecedência, o versado na técnica apreciará que o efeito será avaliado por ensaios de classificação de rotina. Isso é, a atividade pode ser avaliada por ensaios que medem a atividade antipatogênica, tal como os ensaios de placa antifúngicos. Vide, por exemplo, Duvick e outros, (1992) J. Biol. Chem. 267:18841-18820, incorporado aqui como referência.

Polinucleotídeos e proteínas variantes também englobam seqüências e proteínas derivadas de procedimento mutagênico e recombinogênico, tais como, embaralhamento do DNA. Com tal procedimento, uma ou mais seqüências de codificação de proteína antipatogênica diferentes podem ser manipuladas para criar uma nova proteína antipatogênica possuindo as propriedades desejadas. Dessa maneira, as bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas de uma população de polinucleotídeos de seqüência correlatos compreendendo regiões de seqüência que possuem identidade de seqüência substancial e podem ser recombinados homologamente in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando essa abordagem, os motives de seqüência codificando um domínio de interesse podem ser embaralhados entre o gene da proteína antipatogênica da invenção e outros genes da proteína antipatogênica conhecidos de modo a obter uma nova codificação gênica para uma proteína com uma propriedade de interesse aperfeiçoada, tal como, atividade antifúngicos aumentada. As estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri e outros, (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore e outros, (1997) J. Mol. Biol. 272:336- 347; Zhang e outros, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri e outros, (1998) Nature 391:288-291 e Patentes US números 5.605.793 e 5.837.458.

Os polinucleotídeos da invenção podem ser empregados para isolar seqüências correspondentes de outros organismos, especificamente outros microorganismos, mais especificamente outros fungos. Dessa maneira, os métodos tais como, PCR, hibridização e semelhantes podem ser usados para identificar tais seqüências, com base em sua homologia de seqüência com relação às seqüências estabelecidas aqui. As seqüências isoladas com base em sua identidade de seqüência com relação às seqüências totais estabelecidas aqui ou com relação às variantes e fragmentos da mesma são englobadas pela presente invenção. Tais seqüências incluem seqüências que são ortólogas às seqüências reveladas. "Ortólogos" se refere aos genes derivados de um gene ancestral comum e que são encontrados em espécies diferentes como resultado do processo de formação das espécies. Os genes encontrados em espécies diferentes são considerados ortólogos quando suas seqüências de nucleotídeo e/ou suas seqüências de proteína codificadas compartilham pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade da seqüência. As funções dos ortólogos são freqüentemente altamente conservadas entre as espécies. Assim, os polinucleotídeos isolados que codificam uma proteína antipatogênica, especificamente antifúngicos e que hibridizam sob condições estringentes com relação às seqüências reveladas aqui ou às variantes ou fragmentos dos mesmos são englobados pela presente invenção.

Em uma abordagem da PCR, os iniciadores de oligonucleotídeo podem ser designados para emprego nas reações da PCR de modo a ampliar as seqüências de DNA correspondentes do DNAc ou DNA genômico extraído de qualquer organismo de interesse. Os métodos para designação dos iniciadores da PCR e de clonagem na PCR são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e outros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Vide também, Innis e outros, eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis e Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Os métodos conhecidos da PCR incluem, porém não estão limitados aos métodos que utilizam iniciadores emparelhados, iniciadores aninhados, iniciadores específicos simples, iniciadores degenerados, iniciadores específicos para gene, iniciadores específicos para vetor, iniciadores parcialmente não combinados e semelhantes.

Nas técnicas de hibridização, todo ou parte de um polinucleotídeo conhecido é empregada com uma sonda que hibridiza seletivamente em outros polinucleotídeos correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNAc ou fragmentos de DNA genômico clonados (isto é, bibliotecas genômicas ou de DNAc) de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de DNAc, fragmentos de RNA ou outros oligonucleotídeos e podem ser rotuladas com um grupo detectável, tal como, 32P ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo, sondas para hibridização podem ser fabricadas por marcação de oligonucleotídeos sintéticos com base nos polinucleotídeos da invenção. Os métodos para preparação de sondas para hibridização e para construção de bibliotecas de DNAc e genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são revelados em Sambrook e outros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Por exemplo, um polinucleotídeo total revelado aqui ou uma ou mais frações do mesmo podem ser usadas como uma sonda capaz de hibridizar especificamente com relação aos polinucleotídeos correspondentes e RNAs mensageiro. Para obter hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem seqüências que são seqüências única entre as seqüências polinucleotídeo antipatogênicas e são otimamente pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento e mais otimamente pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Tais sondas podem ser usadas para ampliar correspondentemente os polinucleotídeos de um organismo escolhido por PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar seqüências de codificação adicionais de um organismo desejado ou um ensaio de diagnóstico para determinar a presença de seqüências de codificação em um organismo. Técnicas de hibridização incluem classificação de hibridização de bibliotecas de DNA em placa (tanto placas ou colônias; vide, por exemplo, Sambrook e outros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

A hibridização de tais seqüências pode ser realizada sob condições estringentes. "Condições estringentes" ou "condições de hibridização estringente" significam condições nas quais uma sonda hibridizará para sua seqüência alvo a um grau detectavelmente maior em relação a outras seqüências (por exemplo, pelo menos duas vezes em relação ao histórico). Condições estringentes são dependentes de seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. 0 controle da estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, seqüências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, as condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma incompatibilidade nas seqüências, de modo que os graus inferiores de similaridade são detectados (sondagem heteróloga) . Geralmente, uma sonda é inferior a cerca de 1.000 nucleotídeos de comprimento, otimamente menos de 500 nucleotídeos de comprimento.

Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M ion de Na, tipicamente uma concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 3 0°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 600C para sondas longas (por exemplo, superior a 50 nucleotídeos). As condições estringentes podem também ser obtidas com a adição de agentes desestablizadores, tais como, formamida. Condições de estringência exemplarmente baixas incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, IM NaCl, SDS a 1% (dodecil sulfato de sódio) a 370C e uma lavagem em IX a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M de citrato de trissódio) a 50 a 55°C. As condições de estringência moderada exemplares incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCl7 SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,5X a IX SSC a 55 a 60°C. Condições de estringência altas exemplares incluem hibridização em formamida a 50%, IM NaCl, SDS a 1% a 37°C e uma lavagem em 0,1X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, os tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% SDS. A duração da hibridização geralmente é inferior a cerca de 24 horas, geralmente cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será pelo menos de um período de tempo suficiente para alcançar o equilíbrio.

A especificidade é tipicamente a função das lavagens pós- hibridização, os fatores críticos sendo a resistência iônica e temperatura da solução de lavagem final. Para os híbridos de DNA-DNA, o ponto de fusão térmica (Tm) pode ser aproximado da equação do Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% de form) - 500/L; onde M ê molaridade dos cátions monovalentes, % GC é a porcentagem dos nucleotídeos de guanosina e citosina no DNAi % de form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido nos pares de base. O Tm é a temperatura (sob resistência iônica definida e pH) onde 50% de uma seqüência alvo complementar hibridizam com uma sonda perfeitamente combinada. Tm é reduzido para cerca de 1°C para cada 1% da incompatibilidade: assim, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com as seqüências de identidade desejadas. Por exemplo, se as seqüências com > 90% de identidade forem procuradas, o Tm pode ser diminuído para 10°C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas a cerca de 5°C menor em relação ao Tm da seqüência especifica e seu complemento em uma resistência iônica definida e pH. Contudo, condições gravemente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 1, 2, 3 ou 4°C menor em relação ao Tm; condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 6, 7, 8, 9 ou 10°C menor em relação ao Tm; condições de estringência baixas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 11, 12, 13, 14, 15 ou 2O°C menor em relação ao Tm. Empregando a equação, hibridização e composições de lavagem, e o Tm desejado, aqueles de conhecimento comum na técnica entenderão que as variações na estringência da hibridização e/ou soluções de lavagem são descritas inerentemente. Se o grau desejado de incompatibilidade resultar em um Tm inferior a 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida) é ótima para aumentar a concentração de SSC, de modo que uma temperatura maior pode ser empregada. Um guia extensivo para a hibridização do ácido nucléico é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte 1, Capítulo 2 (Elsevier, New York); e Ausubel e outros, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Vide Sambrook e outros, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Os termos que se seguem são empregados para descrever as relações de seqüência entre dois ou mais polinucleotídeos ou polipeptídeos: (a) "seqüência de referência", (b) "janela de comparação, (c) "identidade de seqüência e (d) "porcentagem de identidade de seqüência" .

(a) Conforme empregado aqui, "seqüência de referência" é uma seqüência definida empregada como uma base para comparação da seqüência. Uma seqüência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma seqüência especificada; por exemplo, como um segmento de um DNAc de comprimento pleno ou seqüência gênica ou o DNAc completo ou seqüência gênica.

(b) Conforme empregado aqui, "janela de comparação" faz referência a um segmento contínuo e especificado de uma seqüência de polinucleotídeo, sendo que a seqüência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos (gaps)) em comparação à seqüência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo dos dois polinucleotídeos. De modo geral, a janela de comparação possui pelo menos 20 nucleotídeos contínuos de comprimento e opcionalmente pode ter 30, 40, 50, 100 ou mais longa. Os versados na técnica entenderão que para evitar a similaridade alta com relação a ma seqüência de referência em razão da inclusão de intervalos na seqüência de polinucleotídeo, uma penalidade de intervalo é tipicamente introduzida e é subtraída do número de combinações.

Os métodos de alinhamento das seqüências para comparação são bem conhecidos na arte. Assim, a determinação da porcentagem de identidade da seqüência entre quaisquer duas seqüências pode ser realizada empregando um algoritmo matemático. Exemplos não limitantes de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Smith e outros, (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; o método de pesquisa para alinhamento local de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 872264, modificado com em Karlin e Altschul (1993) Proc. WatI. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.

As implementações de computador desses algoritmos matermáticos podem ser utilizadas para comparação das seqüências de modo a determinar a identidade da seqüência. Tais implementações incluem, porém não estão limitadas a: programa de AGRUPAMENTO (CLUSTAL) no PC//gene (disponível na Intelligenetics, Mountain View, Califórnia) ; o programa de ALINHAMENTO (ALIGN) (Versão 2.0) e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA na GCG Wisconsin Genetics Software Package, Versão 10 (disponível Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia, USA) . Os alinhamentos empregando esses programas podem ser realizados utilizando os parâmetros padrão. O programa de AGRUPAMENTO é bem descrito por Higgins e outros, (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins e outros, (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet e outros (1988) Nucleic Aeids Res. 16:10881-90; Huang e outros, (1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson e outros, (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. 0 programa de ALINHAMENTO se baseia no algoritmo de Myers e Miller (1988) supra. Uma tabela residual de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4 podem empregadas com o programa ALINHAMENTO quando se compara seqüências de aminoácido. Os programas BLAST de Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se baseiam no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) supra. As pesquisas do nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com um programa BLASTN, classificação = 100, comprimento da palavra = 12 para obter seqüências de nucleotídeo homólogas a uma seqüência de nucleotídeo codificando uma proteína da invenção. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, classificação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter uma seqüência de aminoácidos homóloga a uma proteína ou polipeptídeo da invenção. De modo a obter os alinhamentos com intervalos para fins de comparação, BLAST com intervalo (no BLAST 2.0) pode ser empregado conforme descrito em Altschul e outros, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI- BLAST (no BLAST 2.0) pode ser empregado para realizar uma busca repetida que detecta relações distantes entre moléculas. Vide Altschul e outros, (1997) supra. Quando utilizamos BLAST, BLAST com intervalo, PSI-BLAST, podem ser empregados os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para seqüências de nucleotídeo, BLASTX para proteínas) . Vide www.ncbi.nlm.nih.gov. O alinhamento pode ser realizado manualmente por inspeção.

A menos que de outra forma declarado, valores de identidade/similaridade de seqüência providos aqui se referem ao valor obtido empregando GAP Versão 10 que utiliza os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma seqüência de nucleotídeo empregando Peso GAP de 50 e Peso em Comprimento de 3, e a matriz de classificação nwsgapdna. cmp; % de identidade e % de similaridade para uma seqüência de aminoácido empregando Peso GAP de 8 e Peso em Comprimento de 2, e a matriz de classificação BLOSUM62; ou qualquer programa equivalente dos mesmos. "Programa equivalente" significa qualquer programa de comparação de seqüência que, para quaisquer duas seqüências em questão, gera um alinhamento possuindo combinações de nucleotídeo ou resíduo de aminoácido idênticas quando comparadas ao alinhamento correspondente gerado pelo GAP Versão 10.

O GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453 para obter o alinhamento de duas seqüências completas, o que maximiza o número de combinações e minimiza o número de intervalos. O GAP considera todos os alinhamentos possíveis e posições de intervalos e cria o alinhamento. com o número maior de bases combinadas e o menor número de intervalos. Isso permite a provisão de uma penalidade de criação de intervalo e uma penalidade de extensão de intervalo nas unidades das bases combinadas. GAP deve realizar um ganho do número de combinações de penalidades para criação de intervalo para cada intervalo que ele insere. Se a penalidade de extensão do intervalo superior a zero for escolhida, GAP deve, além disso, obter um ganho para cada intervalo inserido do comprimento do intervalo vezes a penalidade por extensão do intervalo. Os valores de penalidade para criação de intervalo padrão e valores de penalidade de extensão de intervalo na Versão 10 do Pacote de Software GCG Wisconsin Genetics para seqüências de proteína são de 8 e 2, respectivamente. Para as seqüências de nucleotídeo, a penalidade para criação de intervalo padrão é de 50, enquanto a penalidade para extensão de intervalo padrão é de 3. As penalidades para criação de intervalo e extensão de intervalo podem ser expressas como um inteiro selecionado do grupo de inteiros consistindo em 0 a 200. Assim, por exemplo, as penalidades para criação de intervalo e extensão de intervalo podem ser de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou maiores.

GAP apresenta um elemento da família dos melhores alinhamentos. Pode haver muitos elementos dessa família, porém nenhum outro elemento possui uma qualidade melhor. GAP revela quatro figuras de mérito para os alinhamentos: Qualidade, Taxa, Identidade e Similaridade. A Qualidade é a métrica maximizada, a fim de alinhar as seqüências. A taxa é a qualidade dividida pelo número de bases no segmento mais curto. A porcentagem de identidade é a porcentagem de símbolos que realmente combinam. A Porcentagem de similaridade é a porcentagem de símbolos que são semelhantes. Os símbolos que são cruzados dos intervalos são ignorados. Uma similaridade é classificada quando o valor de matriz de classificação para um par de símbolos é superior ou igual a 0,50, o limite de similaridade. A matriz de classificada usada ria Versão 10 do pacote de Software GCG Wisconsin Genetics é BLOSUM62 (vide Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).

(c) Conforme empregado aqui, "identidade de seqüência" ou "identidade" no contexto das duas seqüências de polinucleotídeos ou polipeptídeo faz referência aos resíduos nas duas seqüências que são os mesmos quando alinhadas para correspondência máxima em relação a uma janela de comparação especificada. Quando da porcentagem de identidade da seqüência ê empregada com referência às proteínas é reconhecido que as posições dos resíduos que não são idênticas freqüentemente diferem por substituições de aminoãcido conservador, onde os resíduos de aminoácido são substituídos por outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga de hidrofobicidade) e portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando as seqüências diferem das substituições conservadoras, a porcentagem de identidade da seqüência pode ser ajustada a montante para corrigir a natureza conservadora da substituição. As seqüências que diferem em tais substituições conservadoras são ditas como possuindo "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Os meios para realizar esse ajuste são bem conhecidos dos versados na técnica. Tipicamente, isso envolve a classificação de uma substituição conservadora como uma incompatibilidade parcial ao invés de plena, pelo que, aumentando a porcentagem de identidade da seqüência. Assim, por exemplo, quando um aminoácido idêntico recebe uma classificação de 1 e uma substituição não conservadora recebe uma classificação de zero, uma substituição conservadora recebe uma classificação entre zero e 1. A classificação das substituições conservadoras é calculada, por exemplo, como implementada no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia).

(d) Conforme empregado aqui, "porcentagem de identidade de seqüência" significa o valor determinado por comparação de duas seqüências alinhadas otimamente em relação a uma janela de comparação, sendo que a fração da seqüência de polinucleotídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos) em comparação à seqüência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. A porcentagem é calculada por determinação do número de posições nas quais a base de ácido nucléico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas seqüências para render o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 10 0 para render a porcentagem de identidade de seqüência.

O emprego do termo "polinucleotídeo" não pretende limitar a presente invenção aos polinucleotídeos compreendendo DNA. Os versados na técnica reconhecerão que os polinucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxiribonucleotídeos. Tais desoxiribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem as moléculas ocorrendo naturalmente e os análogos sintéticos. Os polinucleotídeos da invenção também englobam todas as formas de seqüências incluindo porém não limitado às formas de filamentos simples, formas de filamentos duplos e semelhantes.

Em algumas concretizações, cassetes de expressão compreendendo um promotor ligado operavelmente a uma seqüência de nucleotídeo heteróloga da invenção que codifica um polipeptídeo antipatogênico são adicionalmente obtidos. Os cassetes de expressão da invenção encontram uso na geração de plantas transformadas, células de plantas e microorganismos e na prática dos métodos para indução de resistência ao agente patogênico revelado aqui. O cassete de expressão incluirá as seqüências reguladoras 5' e 3' ligadas operavelmente a um polinucIeotIdeo da invenção. "Ligado(a)(s) operavelmente" significa uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operável entre um polinucleotídeo de interesse e uma seqüência reguladora (isto é, um promotor) é uma ligação funcional que permite a expressão do polinucleotídeo de interesse. Elementos operavelmente ligados podem ser contínuos ou não contínuos. Quando se refere à união de duas regiões de codificação da proteína, ligadas operavelmente pretende significar que as regiões de codificação estão no mesmo quadro de leitura. O cassete pode conter também, pelo menos um gene adicional a ser co- transformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode(m) ser obtido(s) em múltiplos cassetes de expressão. Tal cassete de expressão é obtido com vários sítios de restrição e/ou recombinação para inserção do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo antipatogênico como estando sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão adicionalmente pode conter genes marcadores selecionáveis.

O cassete de expressão incluirá, na direção 5'-3' da transcrição, uma região de iniciação de transcrição (isto é, um promotor), região de iniciação translacional, um polinucleotídeo da invenção, uma região de terminação translacional e, opcionalmente, uma região de terminação transcricional funcional no organismo hospedeiro. As regiões reguladoras (isto é, promotores, regiões reguladoras transcricionais e regiões de terminação translacional) e/ou polinucleotídeo da invenção podem ser nativas/análogas à célula hospedeira ou um ao outro. Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou o polinucleotídeo da invenção podem ser heterõlogos em relação à célula hospedeira ou um ao outro. Conforme usado aqui, "heteróloga (s)" com referência a uma seqüência é uma seqüência que se origina de uma espécie estranha, ou se da mesma espécie, é substancialmente modificada de sua forma nativa na composição e/ou local genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operavelmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente das espécies das quais o polinucleotídeo foi derivado ou, se das mesmas espécies/espécies análogas, uma ou ambas são substancialmente modificadas de sua forma original e/ou local genômico ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo ligado operavelmente.

A região de terminação incluída opcionalmente pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com o polinucleotídeo de interesse ligado operavelmente, pode ser nativa com a planta hospedeira ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga) ao promotor, o polinucleotídeo de interesse, o hospedeiro ou qualquer combinação dos mesmos. Regiões de terminação conveniente estão disponíveis do Ti-plasmídeo de A. tumefaciens, tal como, as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Vide, também, Guerineau e outros, (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon e outros, (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen e outros, (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe e outros, (1990) Gene 91:151-158; Bailas e outros, (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi e outros (1987) Nucleic Aeids Res. 15:9627-9639. Nas concretizações específicas, o terminador (PinII) do gene de inibidor II de protease de batata é empregado. Vide, por exemplo, Keil e outros, (1986) Nucl. Acids Res. 14:5641- 5650; e An e outros, (1989) Plant Cell 1:115-122, incorporado aqui como referência em sua totalidade.

Quando apropriado, os polinucleotldeos podem ser otimizados quando à expressão aumentada no organismo transformado. Por exemplo, os polinucleotldeos podem se sintetizados empregando códons preferidos de plantas para expressão aperfeiçoada. Vide, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão do emprego do códon transferido ao hospedeiro. Os métodos estão disponíveis na técnica para sintetização dos genes preferidos das plantas. Vide, por exemplo, Patente US números 5.380.831 e 5.436.391 e Murray e outros, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporado aqui como referência.

Modificações de seqüência adicionais são conhecidas as quais melhoram a expressão gênica em um hospedeiro celular. Essas incluem eliminação das seqüências codificando sinais de poliadenilação espúrios, sinais de sítio de Splice exon- íntron, repetições semelhantes à transposon e outras tais seqüências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais à expressão gênica. O teor de G-C da seqüência pode ser ajustado para níveis medidos para um dado hospedeiro celular, conforme calculado por referência aos genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a seqüência é modificada para evitar estruturas de RNA secundárias de grampo previstas.

Os cassetes de expressão podem conter, adicionalmente, seqüências líder 5'. Tais seqüências líder podem atuar para melhorar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (região de não codificação 5' de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein e outros, (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6126-6130); líderes de potivírus, por exemplo, líder de TEV (Vírus de corrosão do Tabaco) (Gallie e outros, (1995) Gene 165 (2) :233-238) , líder de MDMV (Vírus Mosaico do Milho Anão) e proteína de ligação de cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP) (Macejak e outros, (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido de RNAm da proteína de revestimento do vírus mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling e outros, (1987) Nature 325:622-625); líder do vírus mosaico do tabaco (TMV) (Gallie e outros, (1989) em Molecular Biology of RNA1 ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e líder de vírus de mancha clorótica do milho (MCMV) (Lommel e outros, (1991) Virology 81:3 82- 385) . Vide também, Della-Cioppa e outros, (1987) Plant Physiol. 84:965-968.

Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados, de modo a prover as seqüências de DNA na orientação apropriada e, conforme apropriado, no quadro de leitura apropriado. Para esse fim, os adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para obter os sítios de restrição convenientes, remoção do DNA supérfluo, remoção dos sítios de restrição ou semelhantes. Para essa finalidade, mutagênese in vitro, reparo do iniciador, restrição, recombinação, ressubstituições, por exemplo, transcrições e transversões podem estar envolvidos.

O cassete de expressão também pode compreender um gene marcador selecionável para a seleção das células transformadas. Os genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção das células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem genes codificando resistência antibiótica, tais como aqueles codificando neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes conferindo resistência aos compostos herbicidas, tais como, glufosinato de amônio, bromoxinila, imidazolinonas e 2,4- diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores selecionáveis adicionais incluem marcadores fenotípicos, tais como, J3- galactosidase e proteínas fluorescentes, tais como, proteína fluorescente verde (GFP) (Su e outros, (2004) Biotechnol Bioeng 85:610-9 e Fetter e outros, (2004) Plant Cell 16:215-28), proteína fluorescente ciano (CYP) (Bolte e outros, (2004) J. Cell Science 777:943-54 e Kato e outros, (2002) Plant Physiol 729:913-42), e proteína fluorescente amarela (PhiYFP™ da Evrogen, vide, Bolte e outros, (2 004) J Cell Science 777:943-54). For additional selectable markers, see generalIy, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson e outros, (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6314-6318; Yao e outros, (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419- 2422; Barkley e outros, (1980) em The Operon, pp. 177-220; Hu e outros, (1987) Cell 48:555-566; Brown e outros, (1987) Cell 49:603-612; Figge e outros (1988) Cell 52:713-722; Deuschle e outros, (198 9) Proc. Natl. Acad. Act USA 86:5400-5404; Fuerst e outros, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle e outros, (1990) Science 248:480- 483; Gossen (1993) Ph. D. Thesis, University of Heidelberg; Reines e outros, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow e outros, (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti e outros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Bairn e outros, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski e outros, (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb e outros, (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt e outros, (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen e outros, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva e outros, (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka e outros, (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlim); Gill e outros, (1988) Nature 334:721-724. Tais revelações são incorporadas aqui como referência.

A lista acima de genes marcadores selecionáveis não é limitante. Qualquer gene marcador selecionável pode ser empregado nessa invenção.

Vários promotores podem ser empregados na prática da invenção, incluindo o promotor nativo da seqüência de polinucleotídeo de interesse. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Uma ampla faixa de promotores de planta são discutidos na revisão recente de Potenza e outros, (2 004) In Vitro Cell Dev. Biol. - Plant 40:1-22, incorporado aqui como referência. Por exemplo, os ácidos nucléicos podem se combinados com promotores induzíveis de agente patogênico, preferidos para tecido, constitutivos, ou outros promotores para expressão nas plantas. Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, promotor de núcleo do promotor Rsyn7 e ou outros promotores constitutivos revelados no WO 99/4 3838 e Patente US número 6.072.050; o promotor de núcleo CaMV 35S (Odell e outros (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy e outros, (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen e outros, (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen e outros, (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last e outros (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Vdten e outros, (19M) EMBO J. 3 :2723-2730); promoter ALS (Patente US número 5.659.026) e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, as Patentes US números 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; and 6.177.611. Nas concretizações específicas, o promotor E35S-Ubi é empregado para expressão constitutiva forte.

De modo geral, será benéfico expressar o gene de um promotor induzível, especificamente de um promotor induzível do agente patogênico. Tais promotores incluem aquelas proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são incluídas seguindo-se infecção por um agente patogênico; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta 1,3-glicanase, quitinase, etc. Vide, por exemplo, Redolfi e outros, (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes e outros, (1992) Plant Cell 4:645-656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Vide também o WO 99/43819, incorporado aqui como referência.

São de interesse os promotores que resultam na expressão de uma proteína localmente em ou próxima ao sítio de infecção do agente patogênico. Vide, por exemplo, Marineau e outros, (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Mattel e outros, (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch e outros, (1986) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch e outros, (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; e Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Vide também, Chen e outros, (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang e outros, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner e outros, (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz e outros, (1989) Plant Cell 1:961-968; Patente US número 5.750.386 (induzlvel por nematóide); e as referências citadas aqui. São de interesse específico o promotor induzível para o gene PRMs de milho, sua expressão sendo induzida pelo agente patogênico Fusarium moniliforme (vide, por exemplo, Cordero e outros, (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200) e os promotores de milho induzíveis descritos nas Patente US número 6.429.362 (por exemplo, promotores Zm-PR1-81 e Zm- PR1-81), todos os quais são incorporados aqui como referência, em sua totalidade. Os promotores descritos na Patente US número 6.720.480, tais como, promotor Zm-BBII, podem também ser usados na prática da invenção.

Adicionalmente, como os agentes patogênicos encontram entrada nas plantas através de feridas ou lesão causada por inseto, um promotor induzível por ferida pode se usado nas construções da invenção. Tais promotores induzíveis por ferida incluem gene (pin II) inibidor de proteinase de batata (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan e outros, (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl e wun2, Patente US número 5.428.148; winl e win2 (Stanford e outros, (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl e outros, (1992) Science 225:1570-1573); WIPl (Rohmeier e outros, (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp e outros, (1993) FEBS Letters 323:73-76); gene MPI (Corderok e outros, (1994) Plant J. 6 (2) : 141-150) ; e semelhantes, incorporados aqui como referência.

Promotores regulados por substância química podem ser empregados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível por química, onde a aplicação da substância química induz a expressão gênica ou um promotor repressível por substância química, onde a aplicação da substância química reprime a expressão gênica. Os promotores induzíveis por substância química são conhecidos na técnica e incluem, porém não são limitados ao promotor de milho In2-2, que é ativado por herbicida benzenosulfonamida seguro, o promotor GST de milho, que é ativado por compostos eletrófilos hidrófobos que são empregados como herbicidas pré-emergentes e o promotor PR- Ia de tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores regulados por substância química de interesse incluem promotores sensíveis a esteróide (vide, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticõide em Schena e outros, (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425 e McNellis e outros, (1998) Plant J. 14 (2) :247-257) e promotores induzíveis por tetraciclina e repressíveis por tetraciclina (vide, por exemplo, Gatz e outros, (1991) Mol. Gen. Genet. 221:229-231, e Patentes US números 5.814.618 e 5.789.156), incorporados aqui como referência. Os promotores preferidos de tecido podem ser utilizados para marcar a expressão melhorada do polipeptídeo antipatogênico da invenção dentro de um tecido específico de planta. Por exemplo, um promotor preferido de tecido pode ser usado para expressar um polipeptídeo antifúngicos em um tecido de planta onde a resistência à doença é especificamente importante, tal como, por exemplo, as raízes ou folhas. Os promotores preferidos de tecido incluem Yamamoto e outros, (1997) Plant J. 12 (2) :255-265; Kawamata e outros, (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7) :792- 803; Hansen e outros, (1997) Mol. Gen Genet. 254(3) :337- 343; Russell e outros, (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart e outros, (1996) Plant Physiol. 112 (3) :1331-1341; Van Camp e outros, (1996) Plant Physiol. 112 (2) :525-535; Canevascini e outros, (1996) Plant Physiol. 112 (2) :513-524 ; Yamamoto e outros, (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773- 778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco e outros, (1993) Plant Mol Biol. 23 (6) : 1129-1138; Matsuoka e outros, (1993) Proc Natl. Acad. Sei. USA 90 (20) :9586-9590; e Guevara-Garcia e outros, (1993) Plant J. 4 (3):495-505. Tais promotores podem ser modificados, caso necessário, para expressão fraca.

Os promotores preferidos de tecido vascular são conhecidos na técnica e incluem aqueles promotores que dirigem seletivamente a expressão da proteína, por exemplo, no tecido de xilema e filoema. Os promotores preferidos de tecido vascular incluem, porém não estão limitados, ao promotor gênico de prunasina hidrolase Prunus serotina (vide, por exemplo, Publicação Internacional número WO 03/006651) e também aqueles encontrados no Pedido de Patente US número 10/109.4 88.

Os promotores preferidos de caule podem ser empregados para direcionar a expressão de um polipeptídeo antipatogênico da invenção. Promotores preferidos de caule exemplares incluem o promotor gênico MS8-15 de milho (vide, por exemplo, Patente US número 5.986.174 e Publicação Internacional Número WO 98/00533) e aqueles encontrados em Graham e outros, (1997) Plant Mol. Biol. 33(4): 729-735. Em determinadas concretizações da invenção, o promotor Zm-419 é empregado para expressão preferida de tecido no tecido de caule de milho. Vide, por exemplo, Pedido Provisório US número 60/729.772, intitulado "Promoter Active at High Leveis in Stalks, Stalk Nodes, Roots and Leaf Sheaths", depositado em 24 de outubro de 2005, que é incorporado aqui como referência em sua totalidade.

Os promotores preferidos de folha são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Yamamoto e outros, (1997) Plant J. 12 (2) :255-265; Kwon e outros, (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto e outros, (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) : 773-778; Gotor e outros, (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco e outros, (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6) :1129-1138; e Matsuoka e outros, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90(20) : 9586-9590.

Os promotores preferidos de raiz são conhecidos e podem ser selecionados de muitos disponíveis na literatura ou isolados de novo das várias espécies compatíveis. Vide, por exemplo Hire e outros, (1992) Plant Mol. Biol. 20 (2) : 207-218 (gene de glutamina sintetase específico para raiz de soja) ; Keller e Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10) :1051-1061 (elemento de controle específico para raiz no gene GRP 1.8 do feijão comum); Sanger e outros, (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promoter especifico de raiz o gene (MAS) de manopna sintase de Agrobacterium tumefaciens) ; e Miao e outros, (1991) Plant Cell 3(1) .-11-22 (clone de DNAc de comprimento pleno codificando glutamina sintetase citossólica (GS), que é expresso nas raízes e nódulos de raiz da soja) . Vide também, Bogusz e outros, (1990) Plant Cell 2(7):633-641 onde os dos promotores específicos de raiz isolados dos genes de hemoglobina do não legume de fixação de nitrogênio Parasponia andersonií e não legume de fixação de não nitrogênio correlato Trema tomentosa são descritos. Os promotores desses genes foram ligados a um gene repórter de β-glicuronidase e introduzidos em ambos o não legume Nicotiana tabacum e o legume Lotus corniculatus e em ambos a atividade promotora não específica da raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dos promotores dos genes de indução de raiz rolC e rolD altamente expressos de Agrobacterium rhizogenes (vide Plant Science (Limerick) 79 (1) : 69-76) . Eles concluíram que os determinantes de DNA preferidos de tecido e melhoradores são dissociados nesses promotores. Teeri e outros, (1989) empregou a fusão gênica para IacZ de modo a mostrar que a octopina sintase codificando o gene T-DNA de Agrobacterium é especificamente ativa na epiderme da ponta da raiz e que o gene TR2' é específico para raiz na planta intacta e estimulado por ferimento no tecido foliar, uma combinação especificamente desejável de características para uso com um gene inseticida ou larvacida (vide EMBO J. 8 (2) :343-350) . O gene TRl' fundido ao nptll (neomicina fosfotransferase III) mostrou características semelhantes. Os promotores adicionais preferidos de raiz incluem o promotor gênico VfENOD-GRP3 (Kuster e outros, (1995) Plant Mol. Biol. 29 (4) : 759-772) ; e promotor rolB (Capana e outros, (1994) Plant Mol. Biol. 25 (4):681-691. Vide, também Patentes US numerouS 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; e 5.023.179.

Os promotores " preferidos de semente" incluem ambos promotores "específicos de semente" (aqueles promotores que ativam durante o desenvolvimento da semente, tais como promotores das proteínas de armazenamento de semente) bem como promotores de "germinação de semente" (aqueles promotores ativos durante a germinação da semente) . Vide Thompson e outros, (1989) BioEssays 10:108, incorporado aqui como referência. Tais promotores preferidos de semente incluem, porém não estão limitados ao Ciml (mensagem induzida por citocinina); CZ19B1 (zeína de 19 kDa do milho); milps (mio-inositol-l-fosfato sintase) (vide WO 00/11177 e Patente US número 6.225.529; incorporados aqui como referência). Gama-zeína é um promotor específico de endosperma, Globulina 1 (Gib-I) sendo um representante do promotor específico para embrião. Para os dicotos, os promotores específicos para semente incluem, porém não estão limitados à β-fascolina de feijão, napin, ]3- conglicinina, lecitina de soja, cruciferina e semelhantes. Para os monocotos, os promotores específicos para semente incluem, porém não estão limitados a zeína de 15 kDa do milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, gama-zeína, cera, shrunken 1, shrunken 2, Globulina 1, etc. Vide também, o WO 00/12733, onde os promotores preferidos de semente dos genes endl e end2 são revelados, sendo incorporados aqui como referência.

Em determinadas concretizações, as seqüências de ácido nucléico da presente invenção podem ser empilhadas com qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeo de interesse, a fim de criar plantas com um fenótipo desejado. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser empilhados com outros genes antifúngicos e semelhantes. As combinações geradas podem também incluir múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse. Os polinucleotídeos da presente invenção podem também ser empilhados com qualquer outro gene ou combinação de genes para produzir plantas com uma variedade de combinações de traço desejadas incluindo, porém não limitado aos traços desejáveis para alimentação do animal, tais como, genes com alto teor de óleo (por exemplo, Patente US número 6.232.529); aminoácidos equilibrados (por exemplo, hordotioninas (Patentes US números 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; e 5.703.409); cevadacom alto teor de lisina (Williamson e outros, (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; e WO 98/20122) ; e proteínas com alto teor de metionina (Pedersen e outros, (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara e outros, (1988) Gene 71:359; e Musumura e outros, (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); capacidade de digestão aumentada (por exemplo, proteínas de armazenamento modificadas (Patente US número 6.858.778, depositado em 7 de novembro de 2001); e tioredoxinas (Patente US número 7.009.087, depositada em 3 de dezembro 2001)), suas revelações sendo incorporadas aqui como referência. Os polinucleotídeos da presente invenção podem também ser empilhados com traços desejáveis para resistência aos insetos, doenças ou herbicidas (por exemplo, proteínas toxinas ao Bacillus thuringiensis (Patentes US números 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881;

Geiser e outros (1986) Gene 48:109); Iectinas (Van Damme e outros, (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); genes de desintoxicação de fumonisina (Patente US número 5.792.931); avirulência e genes resistentes à doença (Jones e outros, (1994) Science 266:789; Martin e outros, (1993) Science 262:1432; Mindrinos e outros, (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintase (ALS) que conduzem à resistência herbicida, tais como, mutações de S4 e/ou Hra; inibidores de glutamina. sintase, tais como, fosfinotricina ou basta (por exemplo, gene bar) ; e resistência ao glifosato (genes EPSPS, genes GAT, tais como aqueles revelados na Publicação de Pedido de Patente US número US2 004/0082770, também W002/36782 e W003/092360) ) ; e traços desejáveis para processamento ou produtos de processo, tais como, genes com alto teor de óleo (por exemplo, Patente US número 6.232.529); óleos modificados (por exemplo, genes desaturase de ácido graxo (Patente US número 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (por exemplo, ADPG pirofosforilases (AGPase) , amido sintases (SS), enzimas de ramificação de amido (SBE) e enzimas de desramificação de amido (SDBE); e polímeros ou bioplásticos (por exemplo, Patente US número 5.602,321;beta-cetotiolase, poliidroxibutirato sintase e acetoacetil-CoA reductase (Schubert e outros, (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitam a expressão dos poliidroxialcanoatos (PHAs)), as revelações dos mesmos sendo incorporadas aqui como referência. Pode-se também combinar os polinucleotideos da presente invenção com polinucleotideos obtendo traços agrícolas como esterilidade masculina (por exemplo, vide Patente US número 5.583.210), resistência à disseminação de doenças, tempo de floração ou traços de tecnologia de transformação, tais como, regulação do ciclo celular ou alvejamento do gene (por exemplo, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), as revelações dos mesmos sendo incorporadas aqui como referência.

Essas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método incluindo, porém não limitado à reprodução cruzada das plantas por qualquer metodologia convencional ou TopCross® ou transformação genética. Se os traços forem empilhados por transformação genética das plantas, as seqüências de polinucleotídeo de interesse podem ser combinadas a qualquer tempo e qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica compreendendo um ou mais traços desejados pode ser empregada como o alvo para introduzir traços adicionais por transformação subseqüente. Os traços podem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo de co-transformação com os polinucleotideos de interesse obtidos por combinação dos cassetes de expressão. Por exemplo, se duas seqüencias forem introduzidas, as duas seqüências podem ser contidas nos cassetes de transformação separados (trans) ou contidas no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das seqüências pode ser direcionada pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em determinados casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que suprimirá a expressão do polinucleotídeo de interesse. Esse pode ser misturado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de traços na planta. É adicionalmente reconhecido que as seqüências de polinucleotídeo podem ser empilhadas em um local genômico desejado empregando um sistema de recombinação específico de sítio. Vide, por exemplo, W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, e W099/25853 todos sendo incorporados aqui como referência.

Os métodos da invenção envolvem introdução de um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. "Introdução" significa a apresentação do polinucleotídeo à planta. Em algumas concretizações, o polinucleotídeo será apresentado, de modo que a seqüência ganha acesso ao interior de uma célula da planta, incluindo sua inserção em potencial no genoma da planta. Os métodos da invenção não dependem de um método específico para introdução da seqüência em uma planta, apenas que o polinucleotídeo ganha acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para introdução dos polinucleotídeos nas plantas são conhecidos na técnica incluindo, porém não limitados aos métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transitória e métodos mediados por vírus. Os polipeptídeos podem também ser introduzidos na planta de modo que eles ganham acesso ao interior da célula da planta ou permanecem externos à célula, porém em contato próximo com a mesma.

"Transformação estável" significa que a construção de nucleotídeo introduzida na planta se integra ao genoma da planta e é capaz de ser herdada pela progênie da mesma. "Transformação transitória" ou "expressão transitória" significa que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra ao genoma da planta ou um polipeptídeo ê introduzido em uma planta.

Protocolos de transformação, bem como protocolos para introdução de seqüências de polipeptideos ou polinucleotídeos em plantas muitas vezes variam dependendo do tipo da planta ou célula de planta, isto é, monocoto ou dicoto, alvejados para transformação. Métodos apropriados para introdução dos polipeptideos e polinucleotídeos nas células de plantas incluem microinjeção (Crossway e outros, (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs e outros, (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium (Patentes US números 5.563.055 e 5.981.840), transferência direta de gene (Paszkowski e outros, (1984) EMBO J. 3:2717-2722) e aceleração de partícula de balística (vide, por exemplo, Sanford e outros, Patentes US números 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244 e 5.932.782; Tomes e outros, (1995) em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlim) ; McCabe e outros, (1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação de Lecl (WO 00/28058). Vide também Weissinger e outros, (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford e outros, (1987) Partieulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou e outros, (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe e outros, (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175- 182 (soja); Singh e outros, (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta e outros, (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein e outros, (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309 (milho); Klein e outros, (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); Patentes US números 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein e outros, (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Fromm e outros, (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren e outros, (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Patente US número 5.736.369 (cereais); Bytebier e outros, (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae) ; De Wet e outros, (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman e outros, (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler e outros, (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e Kaeppler e outros, (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por pêlos); D1Halluin e outros, (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li e outros, (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda e outros, (1996) Nature Bioteehnology 14:745-750 (milho através de Agrobaeterium tumefaeiens) ; todos os quais são incorporados aqui como referência.

Nas concretizações específicas, as seqüências antipatogênicas da invenção podem ser providas a uma planta empregando uma variedade de métodos de transformação transitórios. Tais métodos de transformação transitórios incluem, porém não estão limitados à introdução da proteína antipatogênica ou variantes e fragmentos das mesmas diretamente em uma planta ou introdução da transcrição da proteína antipatogênica na planta. Tais métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombardeamento da partícula. Vide, por exemplo, Crossway e outros, (1986) Mol. Gen. Genet. 202:179-185; Nomura e outros, (1986) Plant Sei. 44:53-58; Repleve outros, (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. 91:2176-2180 e Hush e outros, (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784 todos os quais são incorporados aqui como referência. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser transformado transitoriamente na planta empregando técnicas conhecidas na arte. Tais técnicas incluem sistema de vetor virótico e a precipitação do polinucleotídeo em um modo que impede liberação subseqüente do DNA. Assim, a transcrição do DNA de ligação de partícula pode ocorrer, porém a freqüência com a qual é liberado para se integrar ao genoma é muito reduzida. Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilenoimina (PEI; Sigma #P3143).

Em outras concretizações, o polinucleotídeo da invenção pode ser introduzido nas plantas por contato das mesmas com um vírus ou ácidos nucléicos viróticos. De modo geral, tais métodos envolvem a incorporação de uma construção de nucleotídeo da invenção dentro de um DNA virótico ou molécula de RNA. É reconhecido que o polipeptídeo antipatogênico da invenção pode ser inicialmente sintetizado como parte de uma poliproteína virótica, que mais tarde pode ser processada por proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína recombinante desejada. Adicionalmente, é reconhecido que os promotores da invenção também englobam promotores utilizados para transcrição por RNA polimerases viróticas. Os métodos de introdução dos polinucleotídeos nas plantas e expressando uma proteína codificada, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viróticos, são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patentes US números 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 e Porta e outros, (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221; incorporadas aqui como referência.

São conhecidos na arte os métodos para marcar a inserção de um polinucleotídeo em um local especifico no genoma da planta. Em uma concretização, a inserção do polinucleotídeo em uma localização genômica desejada é obtida empregando um sistema de recombinação específico de sítio. Vide, por exemplo, W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855 e W099/25853 todos os quais são incorporados aqui como referência. Em resumo, o polinucleotídeo da invenção pode estar contido no cassete de transferência flanqueado pelos dois sítios de recombinação não recombinogênicos. O cassete de transferência é introduzido na planta que já tenha incorporado estavelmente dentro de seu genoma um sítio alvo que é flanqueado por dois sítios de recombinação não recombinogênicos, que correspondem aos sítios do cassete de expressão. Uma recombinase apropriada é provida e o cassete de expressão é integrado ao sítio alvo. O polinucleotídeo de interesse é dessa forma integrado em uma posição cromossômica específica ao genoma da planta.

As células que foram transformadas podem se desenvolver nas plantas de acordo com modos convencionais. Vide, por exemplo, McCormick e outros (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem então se desenvolver e tanto ser polinizadas com a mesma cepa transformada ou cepas diferentes e a progênie resultante possuindo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser desenvolvidas para garantir que a expressão da característica genotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e então as sementes colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido obtida. Desse modo, a presente invenção provê semente transformada (também referida como "semente transgênica") possuindo uma construção de nucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporado estavelmente em seu genoma.

A linhagem da reprodução se inicia com a reticulação de dois genótipos, tal como uma linhagem de elite de interesse e outra linhagem de progênie de elite possuindo uma ou mais características desejáveis (isto é, possuindo um polinucleotídeo estavelmente transformado da invenção, possuindo uma atividade modulada e/ou nível do polipeptídeo da invenção, etc.) que complementa a linhagem de elite de interesse. Se os dois elementos de origem não obtiverem todas as características desejadas, outras fontes podem ser incluídas na população de reprodução. No método de pedigree, as plantas superiores são uniformizadas e selecionadas em gerações filiadas sucessivas. Nas gerações filiadas sucessivas, a condição heterozigota fornece caminho para as linhagens homogêneas como resultado da autopolinização e seleção. Tipicamente, no método de pedigree de reprodução, cinco ou mais gerações filiadas sucessivas de uniformização e seleção são praticadas: Fl -> F2: F2 -> F3, F3 -> F4, F4 -> F5, etc. Após uma quantidade suficiente de reprodução, a geração de filiadas sucessivas servirá para aumentar a semente da reprodução desenvolvida. Nas concretizações específicas, a linhagem de reprodução compreendem alelos de homozigoto em cerca de 95% ou mais de seus locais.

Além de serem usados para criar uma conversão de retrocruzamento, o retrocruzamento pode também ser usado em combinação com a reprodução de pedigree para modificar a linhagem de elite de interesse e um híbrido que é fabricado empregando uma linhagem de elite modificada. Conforme discutido anteriormente, o retrocruzamento pode ser empregado para transferir um ou mais traços especificamente desejáveis de uma linhagem, o elemento de origem doador, para uma progênie denominada o elemento de origem recorrente, que possui várias características agronômicas boas totais ainda que falte aquele traço ou traços desejáveis. Contudo, o mesmo procedimento pode ser usado para mover a progênie na direção do genótipo do elemento de origem recorrente, porém ao mesmo temo reter muitos componentes do elemento de origem não recorrente por parada do retrocruzamento em um estágio anterior e precedendo a uniformização e seleção. Por exemplo, é criado um Fl, tal como um híbrido comercial. Esse híbrido comercial pode ser retrocruzado em uma de suas linhagens de origem para criar BC1 ou BC2. As progênies são uniformizadas e selecionadas de modo que progênies desenvolvidas recentemente apresentem muitos dos atributos do elemento de origem recorrente e ainda vários atributos desejáveis do elemento de origem não recorrente. Essa abordagem nivela o valor e resistências do elemento de origem recorrente para emprego em novos híbridos e reprodução.

Portanto, uma concretização dessa invenção é um método para fabricação de ma conversão de retrocruzamento da linhagem de progênie do milho de interesse compreendendo as etapas de cruzamento de uma planta de linhagem de progênie do milho de interesse com uma planta doadora compreendendo um gene mutante ou transgene conferindo um traço desejado (isto é, resistência ao agente patogênico aumentada) , seleção de uma planta da progênie de Fl compreendendo o gene mutante ou transgene conferindo o traço desejado e retrocruzamento da progênie Fl selecionada, planta a planta da linhagem de progênie do milho de interesse. Esse método pode compreender, adicionalmente, a etapa de obtenção de um perfil de marcador molecular da linhagem de progênie do milho de interesse e emprego do perfil de marcador molecular para selecionar uma progênie de planta com o traço desejado e o perfil marcador molecular da linhagem de progênie de interesse. Da mesma maneira, esse método pode ser empregado para produzir uma semente de híbrido Fl por adição de uma etapa final de cruzamento da conversão de traço desejada da linhagem de progênie do milho de interesse com uma planta de milho diferente para obter a semente de milho híbrida de Fl compreendendo um gene mutante ou transgene conferindo o traço desejado.

A seleção recorrente é um método empregado em um programa de reprodução de planta para aperfeiçoar uma população de plantas. 0 método emprega polinização cruzada de plantas individuais entre si para formar a progênie. A progênie se desenvolve e a progênie superior é selecionada por qualquer número de métodos de seleção, que inclui planta individual, progênie meio-sib, progênie total-sib, progênie uniformizada e cruzamento superior. A progênie selecionada é polinizada por cruzamento de modo a formar progênie para outra população. Essa população é plantada e novamente as plantas superiores são selecionadas quanto à polinização cruzada entre si. A seleção recorrente é um processo cíclico e, portanto pode ser repetida quantas vezes forem desejadas. 0 objetivo da seleção recorrente é aperfeiçoar os traços de uma população. A população aperfeiçoada pode então ser empregada como uma fonte de material de reprodução para obter as linhagens de progênie a serem usadas nos híbridos ou empregadas como elementos de origem para um cultivo sintético. Um cultivo sintético é a progênie resultante formada pelo intercruzamento de várias progênies selecionadas.

A seleção em massa é uma técnica útil quando empregada em conjunto com uma seleção melhorada do marcador molecular. Na seleção da massa, a sementes dos indivíduos são selecionadas com base no fenõtipo e/ou genótipo. Essas sementes selecionadas são então agrupadas em volume e empregadas para formação da nova geração. A seleção em volume requer o desenvolvimento de uma população de plantas em um gráfico em volume, permitindo que as plantas sofram autopolinização, colheita da semente em volume e então empregando uma amostra da semente colhida em volume para plantar a próxima geração. Ao invés da autopolinização, a polinização direcionada seria empregada como parte do programa de reprodução.

A reprodução por mutação é um dos muitos métodos que seriam empregados para introduzir novos traços em uma linhagem de elite. As mutações que ocorrem espontaneamente ou são artificialmente induzidas podem ser fontes úteis de variação para um reprodutor de plantas. O objetivo da mutagênese artificial é aumentar a taxa de mutação para uma característica desejada. As taxas de mutação podem ser aumentadas por muitos meios diferentes incluindo temperatura, armazenamento da semente por longo prazo, condições de cultura do tecido, radiação; tal como, raios- X, raios gama (ou exemplo, cobalto 60 ou césio 137) , nêutrons, (produto de cissiparidade nuclear por urânio 235 em um reator atômico), radiação beta (emitida dos radioisótopos, tais como, fósforo 32 ou carbono 14) ou radiação ultravioleta (preferivelmente de 2.500 a 2.900 nm) ou mutagenos químicos (tais como, análogos de base (5-bromo uracila), compostos correlatos (8-etóxi cafeína), antibióticos (estreptonigrina), agentes alquilantes (mostradas de enxofre, mostardas nitrogenadas, epóxidos, etilenoaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxiamina, ácido nitroso ou acridinas. Uma vez que um traço desejado é observado através da mutagênese, o traço pode então ser incorporado ao idioplasma existente por técnicas de reprodução tradicionais, tais como, retrocruzamento. Detalhes da reprodução por mutação podem ser encontrados em "Principies of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company, New York, a revelação do qual é incorporada aqui como referência. Além disso, as mutações criadas em outras linhagens podem ser usadas para produzir uma conversão de retrocruzamento das linhagens de elite que compreendem tais mutações.

Conforme empregado aqui, o termo planta inclui células de planta, protoplastos de planta, culturas de tecido celular de planta das quais o milho pode ser regenerado, caules de planta, blocos de planta e células de planta que estão intactas nas plantas ou partes das plantas, tais como, embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramos, frutos, cernes, espigas, sabugos, cascas, caules, raízes, pontas de raiz, anteras e semelhantes. 0 grão significa a semente madura obtida por criadores comerciais para fins diferentes do desenvolvimento ou reprodução das espécies. A progênie, as variantes e os mutantes das plantas regeneradas estão também incluídos no escopo da invenção, contanto que essas partes compreendam os polinucleotídeos introduzidos.

A presente invenção pode ser empregada para induzir resistência ao agente patogênico ou proteção ao ataque do agente patogênico em quaisquer espécies de planta, incluindo, porém, não limitado aos monocotos e dicotos. Exemplos de espécies de plantas de interesse incluem, porém não estão limitados ao milho (Zea mays) , Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B.juncea), especificamente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), painço (por exemplo, painço tipo pérola (Pennisetum glaucum), painço tipo proso (Panicum miliaceum), painço tipo rabo de raposa (Setaria italica), painço tipo fino (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), açafrão (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solarium tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium harbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatas), cassava (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), cítricos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis) , banana (Musa spp.), abacate (Persea americana) , figo (Ficus casica), guava (Psidium guajava) , manga (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), mamão papaia (Carica papaya) , caju (Anacardium occidentale) , macadamia (Macadamia integrifolia) , amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris) , cana de açúcar (Saeeharum spp.), aveia, cevada, vegetais, plantas ornamentais e coníferas.

Os vegetais incluem tomates (Lyeopersieon eseulentum), alface (por exemplo, Lactuea sativa), favas (Phaseolus vulgaris) , feijão lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.), e membros do gênero Cueumis, tais como, pepino (C sativus) , melão cantaloupe (C eantalupensis) e melão musgo (C meld). Plantas ornamentais incluem azaléia (Rhododendron spp.), hidrângea (Maerophylla hydrangea) , hibisco (Hibiseus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narciso (Nareissus spp.), petúnias (Petunia hybrida) , cravos (Dianthus earyophyllus), poinsétia (Euphorbia puleherrima) e crisântemos.

As coníferas que podem ser empregadas na prática da presente invenção incluem, por exemplo, pinheiros, tais como, espécie de pinheiro teda (Pinus taeda), pinheiro (Pinus elliotii) , pinheiro tipo ponderosa (Pinus ponderosa) , pinheiro tipo lodgepol (Pinus eontorta), e pinheiro tipo Monterey (Pinus radiata); abeto tipo Douglas (Pseudotsuga menziesii) ; cicuta Western (Tsuga eanadensis); abeto vermelho Sitka (Pieea glauca); sequóia (Sequoia sempervirens); abetos, tais como, abeto prata (Abies amabilis) e abeto bálsamo (Abies balsamea); além de cedros, tais como, cedro vermelho Western (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis) . Nas concretizações específicas, as plantas da presente invenção são plantas de colheita (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, açafrão, amendoim, sorgo, trigo, painço, tabaco, etc.). Em outras concretizações, milho e soja são ótimos e em outras concretizações os milhos são ótimos.

Outras plantas de interesse incluem grãos que fornecem sementes de interesse, plantas de semente oleaginosa e plantas leguminosas. As sementes de interesse incluem sementes de grãos, tais como, milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. Plantas de sementes oleaginosas incluem algodão, soja, açafrão, girassol, Brassica, milho, alfafa, palma, coco, etc. As leguminosas incluem feijões e ervilhas. Os feijões incluem guar, alfarroba, feno-grego, soja, feijão de jardim, ervilha, munguba, tipo de vagem, favas, lentilhas, grão-de-bico, etc.

As composições antipatogênicas, especificamente composições antifúngicas são também englobadas pela presente invenção. As composições antipatogênicas podem compreender polipeptídeos antipatogênicos ou

microorganismos transformados compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo antipatogênico. As composições antipatogênicas da invenção podem ser aplicadas ao ambiente de um agente patogênico de planta, conforme descrito aqui a seguir, pelo que, protegendo a planta do ataque do agente patogênico. Além disso, uma composição antipatogênica pode ser formulada com um veículo aceitável, isto é, por exemplo, uma suspensão, uma solução, uma emulsão, um pó, um grânulo dispersável, um pó umectável, um concentrado emulsionável, um aerossol, um grânulo impregnado, um coadjuvante, uma pasta que pode ser revestida e também encapsulamentos, por exemplo, de substâncias poliméricas.

Um gene codificando um polipeptídeo antipatogênico, especificamente antifúngicos da invenção pode ser introduzido em qualquer micróbio hospedeiro apropriado, de acordo com os métodos padrão na técnica. Por exemplo, os micróbios hospedeiros que são conhecidos por ocupar a "fitoesfera" (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplano) de uma ou mais colheitas de interesse podem ser selecionados. Esses microorganismos são selecionados de modo a serem capazes de competir seletivamente no ambiente específico com os microorganismos do tipo selvagem e proverem manutenção e expressão estável do gene expressando a proteína antifúngicos.

Tais microorganismos incluem bactérias, algas e fungos. São de interesse específico os microorganismos, tais como, bactérias, por exemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonasf Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobac ter ium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobaeter, Azotobaeter, Leuconostoc e Alealigenes, fungos, especificamente leveduras, por exemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula e Aureobasidium. De interesse específico são espécies bacterianas de fitoesfera, tais como, Pseudomonas syringae, Pseudomonas f luorescens, Serratia mareeseens, Acetobacter xylinum, Agrobactérias, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli e Azotobacter vinelandii e espécies de levedura de fitoesfera, tais como, Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saecharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae e Aureobasidium pollulans. São de interesse específico os microorganismos pigmentados.

Outros procariotes ilustrativos, ambos gram-negativo e gram-positivo incluem Enter obacteriaeeae, tais como, Eseheriehia, Erwinia, Shigella, Salmonella e Proteus; Baeillaeeae; Rhizobiaeeae, tais como Rhizobium; Spirillaeeae, tais como photobaeterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobaeillaeeae; Pseudomonadaceael tais como Pseudomonas e Aeetobaeter; Azotobaeteraceae e Nitrobaeteraeeae. Entre os eucariotes estão os fungos, tais como Phyeomycetes e Ascomyeetes, que incluem leveduras, tais como, Saceharomyces e Schizosaeeharomyces; e levedura Basidiomyeetes, tais como, Rhodotorula, Aureobas idium, Sporobolomyces e semelhantes.

Organismos hospedeiros microbianos de interesse específico incluem leveduras, tais como, Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyees spp., e Sporobolomyces spp., organismos filoplano, tais como Pseudomonas spp., Erwinia spp. e Flavobaeterium spp., e outros organismos incluindo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluoreseens, Saccharomyees cerevisiae, Baeillus thuringiensis, Eseheriehia eoli, Baeillus subtilis e semelhantes.

Genes codificando as proteínas antifúngicas da invenção podem ser introduzidos nos microorganismos que se multiplicam nas plantas (epifitos) para liberar proteínas antifungxcas para pragas alvo em potencial. Epifitos, por exemplo, podem ser bactérias gram positivas ou gram negativas.

As bactérias de colonização de raiz, por exemplo, podem ser isoladas da planta de interesse por métodos conhecidos na arte. Especificamente a cepa Bacillus cereus que coloniza as raízes pode ser isolada das raízes de uma planta (vide, por exemplo, Handelsman e outros, (1991) Appl. Environ. Microbiol. 56:713-718). Genes codificando os polipeptídeos antifúngicos da invenção podem ser introduzidos no Bacillus cereus que coloniza a raiz por métodos padrão conhecidos na técnica.

Os genes codificando proteínas antifúngicas podem ser introduzidos, por exemplo, no Bacillus de colonização de raiz por meio de eletrotransformação. Especificamente, os genes codificando as proteínas antifúngicas podem ser clonados em um vetor bidirecional, por exemplo, pHT3101 (Lerecius e outros, (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211- 218. O vetor bidirecional pHT3101 contendo a seqüência de codificação para o gene da proteína antifúngicos específico pode ser, por exemplo, transformado dentro do Baeillus de colonização da raiz por meio de eletroporação (Lerecius e outros, (1989) FEMS Mierobiol. Letts. 60:211-218).

Os métodos são providos para proteção de uma planta de um agente patogênico compreendendo aplicação de uma quantidade eficaz de uma proteína antipatogênica ou composição da invenção ao ambiente do agente patogênico. "Quantidade eficaz" significa uma quantidade de uma proteína ou composição suficiente para controlar o agente patogênico. As proteínas antipatogênicas e composições podem ser aplicadas ao ambiente do agente patogênico por meio de métodos conhecidos dos versados na técnica comum.

As composições antifúngicas da invenção podem ser obtidas por adição de um agente ativo em superfície, um veículo inerte, um preservante, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente de encapsulamento, um ligante, um emulsificante, um corante, um protetor contra UV, um tampão, um agente de fluxo ou fertilizantes, doadores de micronutrientes ou outras preparações que influenciam o crescimento da planta. Uma ou mais substâncias químicas agrícolas, incluindo, porém não limitadas aos herbicidas, inseticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas, acaricidas, reguladores do crescimento da planta, coadjuvantes de colheita e fertilizantes podem ser combinados com veículos, agentes tensoativos e adjuvantes rotineiramente empregados na técnica de formulação ou outros componentes para facilitar o manuseio do produto e aplicação aos agentes patogênicos alvo específicos. Os veículos e adjuvantes apropriados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias rotineiramente empregadas na tecnologia de formulação, por exemplo, substâncias naturais ou minerais regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, aglutinantes, ligantes ou fertilizantes. Os ingredientes ativos da presente invenção são normalmente aplicados na forma das composições e podem ser aplicados à área da colheita, à planta ou semente a ser tratada. Por exemplo, as composições da presente invenção podem ser aplicadas aos grãos na preparação ou durante o armazenamento em celeiros de grãos ou silo, etc. As composições da presente invenção podem ser aplicadas simultânea ou sucessivamente a outros compostos. Os métodos de aplicação de um ingrediente ativo da presente invenção ou uma composição química agrícola da presente invenção que contém pelo menos uma das proteínas antipatogênicas, mais especificamente proteínas

antifúngicas da presente invenção incluem, porém não estão limitados à aplicação foliar, revestimento de semente e aplicação ao solo. 0 número de aplicações e taxa de aplicação dependem da intensidade de infestação pela praga ou agente patogênico correspondente.

Os agentes ativos em superfície apropriados incluem, porém não estão limitados aos compostos aniônicos, tais como, um carboxilato, por exemplo, de um metal; carboxilato de um ácido graxo de cadeia longa; e N-acilsarcosinato; mono e diésteres de ácido fosfórico com etoxilatos de álcool graxo ou sais de tais ésteres; sulfatos de álcool graxo, tais como, dodecil sulfato de sódio, octadecil sulfato de sódio ou cetil sulfato de sódio; sulfatos de álcool graxo etoxilados; sulfatos de alquilfenol etoxilados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; alquil aril sulfonatos, tais como, alquil-benzeno sulfonatos ou alquilnaftaleno sulfonatos inferiores, por exemplo, butil-naftaleno sulfonatos, sais de condensados de naftaleno-aldeído fórmico sulfonado; sais de condensados de fenol-aldeído fórmico sulfonado; sulfonatos mais complexos, tais como os sulfonatos de amida, por exemplo, o produto de condensação sulfonada de ácido oléico e N-metil taurina ou os sulfusuccinatos de dialquila, por exemplo, sulfonato de sódio ou succinato de dioctila. Agentes não iônicos incluem produtos de condensação de ésteres de ácido graxo, alcoóis graxos, amidas de ácido graxo ou fenóis alquil ou alquenil graxo substituídos com óxido de etileno, ésteres graxos de éteres de álcool poliídrico, por exemplo, esteres do ácido graxo de sorbitano, produtos de condensação de tais ésteres com óxido de eileno, por exemplo, ésteres de ácido graxo polioxietileno sorbitano, copolímeros de bloco de oxido de etileno e óxido de propileno, glicóis acetilênicos, tais como, 2, 4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol ou glicóis acetilênicos etoxilados. Exemplos de um agente ativo em superfície catiônico incluem, por exemplo, uma mono, di ou poliamina alifática, tal como, um acetato, naftenato ou oleato; ou amina contendo oxigênio, tal como, um óxido de amida de polioxietileno alquilamina; uma amina ligada à amida preparada pela condensação de um ácido carboxílico com uma di ou poliamina; ou um sal de amônio quaternário.

Exemplos de materiais inertes incluem, porém não estão limitados aos minerais inorgânicos, tais como, caulim, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos ou materiais botânicos, tais como, cortiça, sabugos de milho em pó, cascas de amendoim, cascas de arroz e cascas de nozes.

As composições antipatogênicas da presente invenção podem estar em uma forma apropriada para aplicação direta ou como um concentrado da composição primária que requer diluição com uma quantidade apropriada de água ou outro diluente antes da aplicação. A concentração do polipeptídeo antipatogênico variará dependendo da natureza da formulação específica, especialmente se esta for um concentrado ou for usada diretamente. A composição contém 1 a 98% de um veículo inerte sólido ou líquido e 0 a 50% opcionalmente 0,1 a 50% em peso de um agente tensoativo. Essas composições serão administradas na taxa apresentada no rótulo do produto comercial, opcionalmente cerca de 4,53 g a 2.268 g por acre, 4,73 mL a 4.732 mL por acre quando na forma líquida.

Em uma concretização adicional, as composições, bem como os microorganismos transformados e proteínas antipatogênicas da invenção podem ser tratados antes da formulação para prolongar a atividade antipatogênica, especificamente antifúngicos quando aplicados ao ambiente de um agente patogênico alvo, à medida que o pré-tratamento não for prejudicial à atividade. Tal tratamento pode ser por meio químico e/ou físico, à medida que o tratamento não prejudique as propriedades da(s) composição (ões). Exemplos de reagentes químicos incluem, porém não estão limitados aos agentes de halogenação; aldeídos, tais como, aldeído fórmico e glutaraldeído; antiinfecciosos, tais como, cloreto de zefirano; alcoóis, tais como, isopropanol e etanol e fixadores histológicos, tais como, fixador de Bouin e fixador de Helly (vide, por exemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman e Co.).

As composições antipatogênicas da invenção podem ser aplicadas ao ambiente de um agente patogênico da planta, por exemplo, por aspersão, atomização, empoeiramento, espalhamento, revestimento ou derramamento, introdução ao solo ou sobre o mesmo, introdução à água de irrigação, por tratamento da semente ou aplicação geral ou empoeiramento na época em que o agente patogênico começar a aparecer ou antes do aparecimento dos agentes patogênicos como uma medida de proteção. Por exemplo, a proteína antipatogênica e/ou microorganismos transformados da invenção podem ser misturados com grãos de modo a proteger os grãos durante o armazenamento. De modo geral é importante a obtenção de um bom controle dos agentes patogênicos nos estágios precoces do desenvolvimento da planta, uma vez que essa é a época quando a planta pode ser mais gravemente danificada. As composições da invenção podem conter, convenientemente, um inseticida se isso for necessário. Em uma concretização da invenção, a composição é aplicada diretamente ao solo, na época do plantio, na forma granular de uma composição de um veículo e células mortas de uma cepa de Bacillus ou microorganismo transformado da invenção. Outra concretização é uma forma granular de uma composição compreendendo uma substância química agrícola, tal como, por exemplo, um herbicida, um inseticida, um fertilizante, um veículo inerte e células mortas de uma cepa de Bacillus ou microorganismo transformado da invenção.

As composições da invenção encontram uso na proteção das plantas, sementes e produtos de planta de vários modos. Por exemplo, as composições podem ser empregadas em um método que envolve colocação de uma quantidade eficaz da composição antipatogênica, mais especificamente antifúngicos, no ambiente do agente patogênico por um procedimento selecionado do grupo consistindo em aspersão, empoeiramento, difusão ou revestimento da semente.

Antes da propagação da planta, material (fruto, tubérculo, bulbo, grãos, semente), porém especialmente a semente, é vendida como um produto comercial e é rotineiramente tratada com um revestimento protetor compreendendo herbicidas, inseticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscicidas ou misturas de várias dessas preparações, caso desejado, em conjunto com veículos adicionais, agentes tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação rotineiramente empregados na técnica da formulação para prover proteção contra danos causados por bactérias, fungos ou pragas. De modo a tratar a semente, o revestimento protetor pode ser aplicado às sementes tanto por impregnação dos tubérculos ou grãos com uma formulação líquida quanto por revestimento das mesmas com uma formulação úmida ou seca combinada. Além disso, nos casos especiais, outros métodos de aplicação as plantas são possíveis, por exemplo, tratamento direcionado aos botões ou ao fruto.

A semente da planta da invenção compreendendo uma molécula de DNA consistindo em uma seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo antipatogênico da invenção pode ser tratada com revestimento de proteção da semente compreendendo um composto de tratamento da semente, tal como, por exemplo, captano, carboxina, tiram, metalaxila, pirimifos-metil e outros que são geralmente usados no tratamento da semente. Alternativamente, a semente da invenção compreende um revestimento de proteção da semente compreendendo uma composição antipatogênica, mais especificamente antifúngicos da invenção que é empregada sozinha ou em combinação com um ou mais revestimentos de proteção da semente rotineiramente usados para o tratamento da semente.

Os polipeptídeos antifúngicos da invenção podem ser usados para qualquer aplicação incluindo revestimento das superfícies de modo a marcar os micróbios. Dessa maneira, os micróbios alvo incluem agentes patogênicos humanos ou microorganismos. As superfícies podem também ser revestidas com os polipeptídeos antifúngicos da invenção incluindo tapetes e instalações médicas esterilizadas. Os polipeptídeos ligados ao polímero da invenção podem ser empregados para revestir as superfícies. Os métodos para incorporação das composições com propriedades antimicrobianas aos polímeros são conhecidos na técnica. Vide a Patente US número 5.847.047 incorporada aqui como referência.

As concretizações da presente invenção podem ser eficazes contra uma variedade de agentes patogênicos de plantas, especificamente agentes patogênicos de fungos, tais como, por exemplo, Colletotrichum graminicola, Diplodia maydis, Fusarium graminearum e Fusarium verticillioides. Os agentes patogênicos da invenção incluem, porém não estão limitados aos vírus ou viróides, bactérias, insetos, nematóides, fungos e semelhantes. Os vírus incluem quaisquer vírus de planta, por exemplo, vírus mosaico do tabaco ou pepino, vírus em forma de manchas, vírus de necrose, vírus mosaico do milho anão, etc. Os agentes patogênicos de fungo incluem, porém não estão limitados ao Colletotrichum graminicola, Diplodia maydis, Fusarium graminearum e Fusarium verticillioides. Agentes patogênicos específicos para a maior parte das colheitas incluem: Soja: Phakopsora pachyrhizi, Phytophthora megasperma fsp. glycinea, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotichum truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta soj icola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris p.v. phaseoli, Microsphaera diffusa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, vírus mosaico da soja, Glomerella glycines, vírus em forma de mancha do tabaco, vírus raiado do tabaco, Phakopsora pachyrhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, vírus de murcha e mancha do tomate, Heterodera glycines Fusarium solani; Canola: Albugo Candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoetonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassieicola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata; Alfalfa: Clavibacter michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium oxysporum, Verticillium albo-atrum, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae, Colletotrichum trifolii, Leptosphaerulina briosiana, Uromyces striatus, Sclerotinia trifoliorum, Stagonospora meliloti, Stemphylium botryosum, Leptotrichila medicaginis; Trigo: Pseudomonas syringae p.v. atrofaeiens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recôndita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana, vírus amarelo da cevada anã, vírus mosaico de capim, vírus mosaico do trigo inerente ao solo, vírus mosaico raiado do trigo, vírus raiado do trigo, vírus estriado do trigo americano, Claviceps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum, vírus das plantas superiores, vírus estriado do trigo europeu; Girassol: Plasmopara halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster Yellows, Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum pv. carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora criptogea, Albugo tragopogonis; Milho: Colletotrichum graminicola, Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, F. verticillioides, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis O, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puecinia polysora, Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganense subsp. nebraskense, Trichoderma viride, vírus mosaico do milho anão AeB, vírus mosaico raiado do trigo, vírus clorótico do milho anão, Clavieeps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi pv. zea, Erwinia carotovora, Corn stunt spiroplasma, Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Sphaeelotheca reiliana, Physopella zeae, Cephalosporium maydis, Cephalosporium aeremonium, vírus clorótico de murcha do milho, vírus das plantas superiores, vírus mosaico do milho, vírus raiado fino do milho, vírus estriado do milho, vírus de listra do milho, vírus de aspereza do milho anão; Sorgo: Exserohilum turcicum, C. sublineolum, Cereospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas eampestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrophomina phaseolina, Perconia circinata, Fusarium moniliforme, Alternaria alternata, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas albopreeipitans), Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghieola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, mosaico H da cana de açúcar, vírus mosaico milho anão AeB, Clavieeps sorghi, Rhizoctonia solani, Aeremonium strietum, Selerophthona maerospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminieola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminieola, etc.

Os nematóides incluem nematóides parasíticos, tais como, nematóides de nó de raiz, cisto e lesão, incluindo Heterodera spp., Meloidogyne spp., e Globodera spp.; especificamente membros dos nematóides de cisto, incluindo, porém não limitados ao Heterodera glyeines (nematóide de cisto de soja); Heterodera sehaehtii (nematóide de cisto de beterraba); Heterodera avenae (nematóide de cisto de cereal); Globodera rostoehiensis e Globodera pailida (nematóides de cisto de batata). Os nematóides de lesão incluem Pratylenehus spp.

O artigo "um, uma" é usado aqui para se referir a um ou mais de um (isto é a pelo menos um) dos objetos gramaticais do artigo. Por exemplo, "um elemento" sinigica um ou mais elementos.

Unidades, prefixos e símbolos podem ser indicados em sua forma aceita do Sistema Internacional (SI). A menos que de outra forma indicado, os ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5' para 3'; as seqüências de aminoácido são escritas da esquerda para a direita na orientação do amino para carbóxi, respectivamente. As faixas numéricas incluem os números definidos naquelas faixas. Os aminoácidos podem ser referidos aqui por seus símbolos de três letras conhecidos ou por símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, da mesma forma, podem ser referidos por seus códigos de uma letra geralmente aceitos. Os termos definidos acima são mais completamente definidos com referência ao relatório descritivo como um todo.

Os exemplos que se seguem são providos como ilustração e não como limitação.

EXPERIMENTO

Os métodos de desenvolvimento das culturas de fungos são bem conhecidos na técnica. Para subcultura das culturas de fungo reveladas aqui, pode ser empregado qualquer caldo geralmente apropriado para desenvolvimento dos fungos, incluindo, por exemplo, caldo de dextrose de batata a seguir (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks MD) , caldo Sabouraud (BBL #210986, Voigt Global Distribution LLC, Kansas City, MO) e semelhantes.

Exemplo 1: Isolamento do Polipeptídeo antifúngicos LB- 09812 (SEQ ID N0:1)

Uma amostra do solo foi coletada de peças apodrecidas de madeira da árvore Populus tremula L. , na região de Kiev. O isolado de fungo de interesse, indicado aqui como IMV 01051 e que produziu o polipeptídeo antifúngicos da SEQ ID NO: 1, foi isolado empregando ágar de dextrose de batata. A cepa foi mais tarde identificada como Penicillium glandicola (Oudemans) Seifert e Samson. A cultura pura do organismo foi mantida a temperatura ambiente em ágar em extrato de malte inclinado por subcultivo da mesma em intervalos regulares. O isolado IMV 01051 foi transferido para o Berkeley Lab, onde as culturas cresceram em PDA e preservado por colocação de 10 tampões de ágar por cepa amostrada com pontas plásticas estéreis P1000 em tubos de criogênio de 2 mL contendo 0,7 mL de glicerol estéril a 45% (peso/volume). Os tubos de criogênio então foram colocados em um bloco de madeira e congelados por toda a noite em um freezer a -20°C em uma taxa de congelamento aproximada de 1°C/minuto. 0 material agora congelado foi transferido para um freezer a -84°C para manutenção por longo prazo.

A identificação das espécies foi confirmada por seqüenciamento dos domínios D1/D2 do gene codificando a subunidade maior RNAr. A extração do DNA genômico total foi realizada com kit FastDNA empregando FasPrep e o protocolo SpinColumn da BIO 101 Systems (Q-BIOgene, Vista, CA). A ampliação da PCR foi realizada em Platinum Blue® PCR SuperMix (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os iniciadores dos domínios de fungo genéricos D1/D2 (nucleotídeos 63-642) empregados para a ampliação da PCR e seqüenciamento foram publicados anteriormente por Kurtzman and Robnett (1998) Antonie Van Leeuwenhoek 73(4):331-71; e Kurtzman e Robnett (2003) FEMS Yeast Res. 3(4):417-32, ambos incorporados aqui como referência em sua totalidade. O seqüenciamento do DNA foi realizado na University of Califórnia na Berkeley DNA Sequencing Facility.

A seqüência bruta foi editada com a EditView Versão 1.0.1.1 (ABI, Foster City, CA) e alinhada empregando as subrotinas de alinhamento de múltiplas seqüências online (BCM Search Launcher (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi- align/multi-align.html) e MultAlin

(prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)) . A

seqüência alinhada para os domínios D1/D2 foi adicionalmente analisada para consenso usando subrotinas online pelo Ribosomal Database Project

(rdp.cme.msu.edu/html/) e Boxshade

(ch.emnet.org/software/BOX_form.html; um prefixo "www" deve ser empregado) e finalmente BLASTed contra a base de dados NCBI (ncbi.nlm.nih.gov/BLAST; um prefixo "www" deve ser empregado) para determinação das espécies.

Um conjunto projetado contendo condições de desenvolvimento específicas, isto é, teor do nutriente, temperatura, pH, tempo de incubação, aeração, etc. foi aplicado ao fungo isolado para promover a produção de metabólitos secundários e novos produtos naturais. As moléculas pequenas de interesse foram secretadas pela cepa de fungo acima quando ela foi desenvolvida em frascos Erlenmeyer de 250 mL enchidos com 50 mL de um meio. A cepa IMV 01051 foi desenvolvida em um meio contendo maltose (12,75 g/L), extrato de malte (15 g/L), dextrina (2,75 g/L), glicerol (2,36 g/L), fosfato de potássio dibásico (1 g/L), cloreto de amônio (1 g/L) e bacto-peptona (0,75 g/L). 0 pH do meio foi ajustado com ácido clorídrico para um valor final de 4,8. A cepa foi incubada a 16 0C em um incubador agitador orbital a 180 rpm por 144 horas. A biomassa e o sobrenadante da fermentação microbiana resultante foram então separados por centrifugação a 10,322 x g, 15°C por 20 minutos. 0 sobrenadante isento de célula, marcado como LB-09812, foi ensaiado para determinar a presença da atividade antifúngicos instável em calor. Após confirmação de que a atividade antifúngicos instável em calor estava presente no sobrenadante LB-09812, o sobrenadante isento de célula de uma escala grande, 500 mL de cultura foram obtidos e submetidos à extração de fase sólida, conforme descrito a seguir.

Cartuchos de extração Oasis HLB (6 gram, 35 mL) (Waters Corporation, Milf ord, MA) foram empregados para extração de fase sólida (SPE). Especificamente, o cartucho SPE foi umidificado com um volume de cartucho de metanol e então condicionado com aproximadamente 40 mL do Solvente A (acetonitrila a 2%, TFA a 0,1%) . Aproximadamente 90 mL de filtrado de cultura bruto foram tratados com 5X solvente A a uma concentração final de IX e centrifugados por 2 0 minutos em 3.000 χ g. 0 sobrenadante foi carregado em um cartucho SPE e o cartucho SPE foi lavado com aproximadamente 4 0 mL de solvente A. O cartucho SPE foi eluído com aproximadamente 40 mL de acetonitrila a 90%, TFA a 0,1%. A amostra eluída foi parcialmente seca em um evaporador centrifugo (Speed Vac), congelada com nitrogênio líquido e liofilizada à secura.

O extrato seco foi ressuspenso em salmoura tamponada com fosfato (PBS) (filtrado de cultura de partida 0,5 mL:20 mL) e o extrato ressuspenso foi enriquecido com proteínas usando uma coluna de fuso Sephadex GlO (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suécia). Colunas de cromatografia Bio-Spin descartáveis (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA) foram enchidas com aproximadamente 0,75 mL de volume do leito com Sephadex GlO que foi pré-equilibrado em salmoura tamponada com fosfato (PBS) e centrifugadas por 1 minuto a 1.000 χ g. Foram adicionados 200 pL de extrato de SPE em PBS a cada coluna Bio-Spin pré-rotacionada e as colunas Bio-Spin carregadas foram centrifugadas por 5 minutos a 1.000 χ g para eluir as proteínas.

Os extratos antifúngicos tratados com GlO foram fracionados por HPLC com uma coluna Júpiter de 5 μ C5 3OOA de 150 mm χ 4,6 mm (Phenomenex, Torrance, CA). As condições de partida da HPLC eram acetonitrila a 5%, ácido heptafluorbutírico a 0,04% (HFBA), 0,4 mL/minuto. Após injeção de 200 pL de extrato de antifúngicos tratado G10, a taxa de fluxo foi elevada para 0,8 mL/minuto por 1 minuto. Após um acréscimo de 1 minuto, um gradiente exponencialmente curvado de 94 minutos (curva gradiente 7 Waters, Waters Corporation, Milford, MA) foi iniciado para acetonitrila a 86%, 0,04% HFBA. As frações de HPLC foram divididas em 4 placas de ensaio de fundo límpido de 96 poços de 1A área. As placas contendo extratos fracionados foram então secas em um evaporador centrífugo. Os extratos fracionados e secos foram então classificados quanto à atividade antifúngicos contra FVE, CGR, FGR e DMA usando uma placa de ensaio antifúngicos, conforme descrito no Exemplo 3. FVE, FGR e DMA foram testados em 4.000 esporos/mL em caldo de dextrose de batata 1A X (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD). CGR foi testado em 4.000 esporos/mL em % X Czapek-Dox (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks MD) + 18 0 mL/L de suco V8. As culturas se desenvolveram a 27°C por 24 horas. Os ensaios foram classificados por visualização do crescimento dos fungos com um microscópio invertido. Foi verificado que as frações de HPLC de aproximadamente 65,5 a 67 minutos tinham atividade antifúngicos contra FVE, CGR, FGR e DMA.

Fracionamentos de HPLC adicionais foram realizados para avolumar a fração antifúngicos. Essa fração antifúngicos avolumada foi adicionalmente purificada empregando HPLC com orifício em micra com uma coluna Zorbax 3,5 μ C8 3OOA de 150 mm χ 1,0 mm (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) . As condições de partida eram acetonitrila a 9,5%, ácido fórmico a 0,1%, ácido trifluoracético (TFA) a 0,025%, 50 pL/minuto. Dois minutos após a injeção da amostra, um gradiente linear de 25 minutos foi iniciado para acetonitrila a 32%, ácido fórmico a 0,1%, TFA a 0,025%. Frações com base na máxima de 214 nm foram coletadas usando coletor de micro-fração Agilent, secas em um evaporador centrífugo e ensaiadas quanto à atividade antifúngicos conforme descrito acima. Uma máxima eluindo há aproximadamente 27 minutos foi obtida apresentando atividade contra FGR. Os espectros de massa ESI foram obtidos em um espectrômetro de massa Agilent MSD TOF. A máxima apresentou o perfil de íon de um peptídeo e uma massa de 3802 Da.

A redução e alquilação foram necessárias para seqüenciamento eficiente N-terminal. Aproximadamente 10 pg de proteína seca foram ressuspensos em 18 pL de bicarbonato de amônio a 0,1M, uréia a 8M, pH 8,3. Essa solução foi transferida para um frasco auto-amos trador de HPLC de volume limitado. Foi adicionado 1 pL de DTT 200 mM e a solução foi incubada a 500C por 1 hora. Subseqüentemente, foi adicionado 1 μL de iodoacetamida 500 mM e a solução foi incubada a 37°C por 30 minutos no escuro. A alquilação de iodoacetamida foi então saturada por adição de 2 pL de ácido trifluoracético a 25%. A proteína alquilada foi então purificada por HPLC de orifício em micra em uma coluna Zorbax de 3,5 μ C8 300A 150 mm χ 1,0 mm (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) . As condições de partida eram acetonitrila a 7,7%, ácido fórmico a 0,1%, (TFA) a 0,025%. Após 15 minutos, um gradiente linear de 7 0 minutos foi realizado para alcançar acetonitrila a 70,7%, ácido fórmico a 0,1%, TFA a 0, 025%. A taxa de fluxo da coluna era de 50 pL/minuto. Frações com base em máxima de 214 nm foram coletadas usando um coletor de microfração Agilen.

Seqüenciamento N-terminal

O seqüenciamento N-terminal inicial rendeu a seqüência que se segue:

ALHNSCSHPRCFNHAHCLTYS (SEQ ID NO: 28). A elucidação adicional da seqüência de término N requereu seqüenciamento dos fragmentos digeridos ArgC.

Digestão de ArgC

ArgC (classificação de excisão, Clostridium histolyticum Calbiochem cat. #324711) foi preparado por adição de água para obter 100 ng/pL. ~2 pg de LB09812 alquilado foram suspensos em 16 pL de 100 mM Tris-HCl/10 mM CaCl2, pH 7,6. 2 pL mM de DTT/5 mM EDTA foram então adicionados seguido por 2 pL de ArgC que havia sido diluído 1:4 com 100 mM Tris-HCl/10 mM CaCl2, pH 7,6. A solução foi incubada a 370C por 18 horas. Finalmente, a solução foi diluída com 20 pL de acetonitrila a 5%, ácido fórmico a 0,1%, TFA a 0,025% e injetada na coluna 1,0 χ 150 mm Zorbax 3 00SB C8 de 3,5 μπι. As condições de partida eram acetonitrila a 6,8%, ácido fórmico a 0,1%, ácido trif luoracético (TFA) a 0,025%, 50 pL/minuto. Quatro minutos após a injeção da amostra, um gradiente linear de 66 minutos foi iniciado para acetonitrila a 26,6%, ácido fórmico a 0,1%, TFA a 0,025%. Frações com base na máxima de 214 nm foram coletadas usando um coletor de micro-fração Agilent. As massas para os fragmentos isolados foram determinadas por ato de raiar aproximadamente 10% do fluxo de HPLC em um espectrômetro de massa Agilent MSD TOF integrado e equipado com uma fonte ESI. Sete máximas foram coletadas e enviadas para seqüenciamento N-terminal. A máxima V de ArgC que eluiu em 33 minutos, rendeu seqüência útil.

Resultados do Seqüenciamento N-terminal

Máxima V de ArgC: CFNHAHCLTYSHCHVXCS (SEQ ID NO: 29) A seqüência de aminoácido completa para polipeptídeo antifúngicos LB-09812 foi determinada por emprego de PCR Genome Walker que permitiu a identificação da seqüência de nucleotídeo estabelecida na SEQ ID NO:24, correspondendo à seqüência genômica de comprimento pleno para a proteína LB- 09812. A proteína LB-09812 não processada, de comprimento pleno é estabelecida na SEQ ID NO: 25. Os resultados do seqüenciamento de gene em conjunto com aqueles do seqüenciamento N-terminal de LB-09812 puderam prever um peptídeo maduro (estabelecido na SEQ ID NO.-l) possuindo uma massa idêntica aquela da LB-09812 purificada com HPLC.

Detalhes adicionais dos Experimentos Genome Walker são fornecidos aqui a seguir.

Exemplo 2: Isolamento do Polipeptídeo antifúngicos LB- 12922 (SEQ ID NO:3)

Uma amostra do solo agrícola cultivado na região de Ternapol, Ucrânia, foi isolada cerca de doze anos após o acidente nuclear de Chernobyl. 0 isolado de fungo de interesse, indicado aqui como LB-12922, que produziu o peptídeo antifúngicos da SEQ ID NO: 3, foi isolado empregando ágar de dextrose de batata. A cepa foi mais tarde identificada como Penicillium citreonigrum Dierekx. A cultura pura do organismo foi mantida a temperatura ambiente no ágar em extrato de malte inclinado por subcultivo da mesma em intervalos regulares. O isolado LB- 12922 foi transferido para o Berkeley Lab, onde as culturas cresceram em PDA e preservado por colocação de 10 tampões de ágar por cepa amostrada com pontas plásticas estéreis PlOOO em tubos de criogênio de 2 mL contendo 0,7 mL de glicerol estéril a 45% (peso/volume) . Os tubos de criogênio então foram colocados em um bloco de madeira e congelados por toda a noite em um freezer a -200C em uma taxa de congelamento aproximada de IoC/minuto. 0 material agora congelado foi transferido para um freezer a -840C para manutenção por longo prazo.

A identificação das espécies foi confirmada por seqüenciamento dos domínios D1/D2 do gene codificando a subunidade maior RNAr. A análise do éster metílico do ácido graxo de célula integral (FAME) foi realizada seguindo-se as recomendações do fabricante (MIDI, Newark, DE) . A cultura pura da cepa foi desenvolvida no meio líquido Sabouraud em um agitador orbital (180 rpm) a 300C por 3-5 dias. A biomassa foi colhida por centrifugação e cerca de 50 mg das células foram extraídos. 0 rendimento do éster metílico do ácido graxo foi determinado em um cromatógrafo de gás da Angilent Technologies (Paio Alto, CA) Modelo 6890. Os cromatogramas foram analisados usando a Versão 4.5 do Sherlock® Microbial Identification System (MIDI, Newark, DE) . A similaridade entre os cromatogramas foi estabelecida pela subrotina dendrograma. A base de dados de fungos disponível não pode resolve a identificação da cepa ao nível do gênero ou espécie.

O seqüenciamento dos domínios D1/D2 dos genes de codificação de RNA ribossômico de subunidade grande envolveu o desenvolvimento da cepa no meio líquido Sabouraud, extração do DNA genômico total e ampliação das seqüências alvo por PCR. A extração do DNA genômico total foi realizada com kit FastDNA empregando FasPrep e o protocolo SpinColumn da BIO 101 Systems (Q-BIOgene, Vista, CA) . A ampliação da PCR foi realizada em Platinum Blue® PCR SuperMix (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Os iniciadores dos domínios de fungo genéricos D1/D2 (nucleotídeos 63-642) empregados para a ampliação da PCR e seqüenciamento foram publicados anteriormente por Kurtzman e Robnett (1998) Antonie Van Leeuwenhoek 73 (4):331-71; e Kurtzman e Robnett (2003) FEMS Yeast Res. 3(4):417-32, ambos incorporados aqui como referência em sua totalidade. 0 seqüenciamento do DNA foi realizado na University of Califórnia na Berkeley DNA Sequencing Facility.

A seqüência bruta foi editada com a EditView Versão 1.0.1.1 (ABI, Foster City, CA) e alinhada empregando as subrotinas de alinhamento de múltiplas seqüências online (BCM Search Launcher (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi- align/multi-align.html) e MultAlin (prodes . toulouse . inra. f r/multalin/multalin. html) ) . A seqüência alinhada para os domínios D1/D2 foi adicionalmente analisada para consenso usando subrotinas online pelo Ribosomal Database Project (rdp.cme.msu.edu/html/) e Boxshade (ch.emnet.org/software/BOX_form.html; um prefixo "www" deve ser empregado) e finalmente BLASTed contra a base de dados NCBI (ncbi.nlm.nih.gov/BLAST; um prefixo "www" deve ser empregado) para determinação das espécies.

Um conjunto projetado contendo condições de desenvolvimento específicas, isto é, teor do nutriente, temperatura, pH, tempo de incubação, aeração, etc. foi aplicado ao fungo isolado para promover a produção de metabólitos secundários e novos produtos naturais. As moléculas pequenas de interesse foram secretadas pela cepa de fungo acima quando ela foi desenvolvida em frascos Erlenmeyer de 250 mL enchidos com 50 mL de um meio. A cepa IMV 00738 foi desenvolvida em um meio contendo glicose (75 g/L), ácido tartárico (4 g/L), tartrato de amônio (4 g/L), fosfato de amônio (0,6 g/L), carbonato de potássio (1 g/L), cloreto de amônio (0,6 g/L), carbonato de magnésio (0,4 g/L), sulfato de amônio (0,25 g/L), sulfato de zinco (700 pg/L) e sulfato de ferro (700 pg/L). O pH do meio foi ajustado com ácido clorídrico para um valor final de 4,8. A cepa foi incubada a 16 0C em um incubador agitador orbital a 180 rpm por 144 horas. A biomassa e o sobrenadante da fermentação microbiana resultante foram então separados por centrifugação a 10,322 χ g, 15°C por 20 minutos. 0 sobrenadante isento de célula, marcado como LB-12922, foi ensaiado para determinar a presença da atividade antifúngicos instável em calor. Após confirmação de que a atividade antifúngicos instável em calor estava presente no sobrenadante LB-12922, o sobrenadante isento de célula de uma escala grande, 500 mL de cultura foram obtidos e submetidos à extração de fase sólida, conforme descrito a seguir.

Cartuchos de extração Oasis HLB (6 gram, 35 mL) (Waters Corporation, Milford, MA) foram empregados para extração de fase sólida (SPE) . Especificamente, o cartucho SPE foi umidificado com um volume de cartucho de metanol e então condicionado com aproximadamente 4 0 mL do Solvente A (acetonitrila a 2%, TFA a 0,1%). Aproximadamente 90 mL de filtrado de cultura bruto foram tratados com 5X solvente A a uma concentração final de IX e centrifugados por 2 0 minutos em 3.000 x g. O sobrenadante foi carregado em um cartucho SPE e o cartucho SPE foi lavado com aproximadamente 40 mL de solvente A. O cartucho SPE foi eluído com aproximadamente 40 mL de acetonitrila a 90%, TFA a 0,1%. A amostra eluida foi parcialmente seca em um evaporador centrífugo (Speed Vac), congelada com nitrogênio líquido e liofilizada à secura.

O extrato seco foi ressuspenso em salmoura tamponada com fosfato (PBS) (filtrado de cultura de partida 0,5 mL:20 mL) e o extrato ressuspenso foi enriquecido com proteínas usando uma coluna de fuso Sephadex G10 (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suécia). Colunas de cromatografia Bio-Spin descartáveis (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA) foram enchidas com aproximadamente 0,75 mL de volume do leito com Sephadex G10 que foi pré-equilibrado em salmoura tamponada com fosfato (PBS) e centrifugadas por 1 minuto a 1.000 x g. Foram adicionados 200 pL de extrato de SPE em PBS a cada coluna Bio-Spin pré-rotacionada e as colunas Bio-Spin carregadas foram centrifugadas por 5 minutos a 1.000 χ g para eluir as proteínas.

Os extratos antifúngicos tratados com GlO foram fracionados por HPLC com uma coluna Júpiter de 5 μ C5 300A de 150 mm χ 4,6 mm (Phenomenex, Torrance, CA). As condições de partida da HPLC eram acetonitrila a 5%, ácido heptafluorbutírico a 0,04% (HFBA), 0,4 mL/minuto. Após injeção de 200 µL de extrato de antifúngicos tratado G10, a taxa de fluxo foi elevada para 0,8 mL/minuto por 1 minuto. Após um acréscimo de 1 minuto, um gradiente exponencialmente curvado de 94 minutos (curva gradiente 7 Waters, Waters Corporation, Milford, MA) foi iniciado para acetonitrila a 86%, 0,04% HFBA. As frações de HPLC foram divididas em 4 placas de ensaio de fundo límpido de 96 poços de M área. As placas contendo extratos fracionados foram então secas em um evaporador centrífugo. Os extratos fracionados e secos foram então classificados quanto à atividade antifúngicos contra FVE, CGR, FGR e DMA usando uma placa de ensaio antifúngicos, conforme descrito no Exemplo 3. FVE, FGR e DMA foram testados em 4.000 esporos/mL em caldo de dextrose de batata 1A X (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD). CGR foi testado em 4.000 esporos/mL em % X Czapek-Dox (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks MD) + 180 mL/L de suco V8. As culturas se desenvolveram a 27 0C por 24 horas. Os ensaios foram classificados por visualização do crescimento dos fungos com um microscópio invertido. Foi verificado que as frações de HPLC de aproximadamente 64,5 a 66 minutos tinham atividade antifúngicos contra FVEi CGR, FGR e DMA. A atividade antifúngicos contra FVE foi observada para frações de 63 a 72,5 minutos. Fracionamentos de HPLC adicionais foram realizados para avolumar a fração antifúngicos de 63 para 72,5 minutos. Essa fração antifúngicos avolumada foi adicionalmente purificada empregando HPLC com orifício em micra com uma coluna Zorbax 3,5 μ C8 300A de 150 mm χ 1,0 mm (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) . As condições de partida eram acetonitrila a 7,7%, ácido fórmico a 0,05%, ácido trif luoracético (TFA) a 0,025%, 50 pL/minuto. Seguindo-se a injeção da amostra, um gradiente linear de 4 0 minutos foi iniciado para acetonitrila a 25,7%, ácido fórmico a 0,05%, TFA a 0,025%. Subseqüentemente, um gradiente de 20 minutos foi iniciado para acetonitrila a 43,7%, ácido fórmico a 0,05%, TFA a 0,025%. Frações com base na máxima de 214 nm foram coletadas usando coletor de micro-fração Agilent, secas em um evaporador centrífugo e ensaiadas quanto à atividade antifúngicos conforme descrito acima. Uma máxima eluindo há aproximadamente 41 minutos foi obtida apresentando atividade contra FVE. Os espectros de massa ESI foram obtidos em um espectrômetro de massa Agilent MSD TOF. A máxima apresentou o perfil do íon de um peptídeo e uma massa de 445 Da.

A redução e alquilação foram necessárias para seqüenciamento eficiente N-terminal. Aproximadamente 10 pg de proteína seca foram ressuspensos em 18 pL de bicarbonato de amônio a 0,1M, uréia a 8M, pH 8,3. Essa solução foi transferida para um frasco auto-amostrador de HPLC de volume limitado. Foi adicionado 1 pL de DTT 200 mM e a solução foi incubada a 500C por 1 hora. Subseqüentemente, foi adicionado 1 pL de iodoacetamida 500 mM e a solução foi incubada a 370C por 30 minutos no escuro. A alquilação de iodoacetamida foi então saturada por adição de 2 pL de ácido trifluoracético a 25%. A proteína alquilada foi então purificada por HPLC de orifício em micra em uma coluna Zorbax de 3,5 μ C8 300A 150 mm χ 1,0 mm (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) . As condições de partida eram acetonitrila a 7,7%, ácido fórmico a 0,1%, TFA a 0,025%. Após 15 minutos, um gradiente linear de 70 minutos foi realizado para alcançar acetonitrila a 70,7%, ácido fórmico a 0,1%, TFA a 0,025%. A taxa de fluxo da coluna era de 50 pL/minuto. Frações com base em máxima de 214 nm foram coletadas usando um coletor de microfração Agilen. LB-12922 alquilado eluiu em cerca de 41 minutos.

Seqüenciamento N-terminal

O seqüenciamento N-terminal inicial rendeu a seqüência que se segue:

LSCYPSCMQNYCSHPRXFLXAT (SEQ ID NO:30) .

A seqüência de aminoácido completa para polipeptídeo antifúngicos LB-12922 foi determinada por emprego de PCR Genome Walker que permitiu a identificação da seqüência de nucleotídeo estabelecida na SEQ ID NO:26, correspondendo à seqüência genômica de comprimento pleno para a proteína antifúngicos LB-12922. A proteína LB-12922 não processada, de comprimento pleno é estabelecida na SEQ ID NO:27. Os resultados do seqüenciamento de gene em conjunto com aqueles do seqüenciamento N-terminal de LB-12922 puderam prever um peptídeo maduro (estabelecido na SEQ ID NO:3) possuindo uma massa idêntica aquela da LB-12922 purificada com HPLC. Detalhes adicionais dos Experimentos Genome Walker são fornecidos aqui a seguir.

Exemplo 3: Atividade antifúngicos dos Polipeptídeos LB-09812 (SEQ ID NO:l)

A atividade antifúngicos do polipeptídeo da SEQ ID NOÇ 1 contra agentes patogênicos de fungo Fusarium verticillioides (FVE) , Colletotrichum graminicola (CGR) , Fusarium graminearum (FGR) e Diplodia maydis (DMA) foi avaliada empregando um ensaio de placa padrão.

Especificamente, um vetor de transformação de E.coli compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO :1 fundido a uma proteína de ligação de maltose marcada His através do sítio de clivagem de fator XA foi gerado e empregado para expressar a proteína de fusão no E.coli. A proteína de fusão foi então purificada por afinidade (Ni-NTA) e a preparação da proteína foi submetida a uma clivagem de Fator ΧΑ. O peptídeo LB-09812 desejado (SEQ ID NO:l) foi então purificado por HPLC e a pureza e massa do peptídeo verificadas por LCMS. 0 peptídeo purificado foi quantificado e empregado nos ensaios padrão para medir a atividade antifúngicos, conforme descrito a seguir.

Preparação das culturas para produção de esporos: Culturas de FVE foram preparadas usando placas de ágar V8. Culturas de FGR, CGR e DMA foram preparadas usando ágar de aveia % x. Receitas dos meios são obtidas a seguir.

Especificamente, tubos contendo estoques de fungo de sílica-gel a -200C foram rapidamente flambados e aproximadamente 5 cristais foram aspergidos na superfície do ágar. Duas a três placas de cada isolado de fungo foram preparadas. As culturas recentemente colocadas em placas foram armazenadas em uma caixa de plástico para impedir que as culturas secassem. Culturas de FVE foram desenvolvidas no escuro, à temperatura ambiente. As culturas de CGR foram desenvolvidas em luz ambiente e a temperatura ambiente. As culturas de FGR e DMA foram desenvolvidas em uma câmara de desenvolvimento iluminada a 27°C. As novas culturas foram preparadas em semanas intercaladas para manter um fornecimento consistente de esporos.

Preparação do Esporo:

Os esporos foram preparados de culturas com 2-4 semanas de FVE, FGR, CGR e DMA. Para FGR, FVE e DMA, uma porção da placa de cultura foi enxaguada com uma pequena quantidade de meio de ensaio. A solução de enxágüe permaneceu nas placas de DMA por um tempo suficiente para permitir que a pienidia rompesse. O meio de ensaio foi então transferido para um tubo estéril. As amostras foram vortexadas e os esporos foram quantificados usando um hemacitômetro.

Para CGR, um laço estéril foi gentilmente arrastado através das áreas laranja da placa de cultura. O laço foi então inserido em um volume pequeno de meios de ensaio e os meios foram misturados com o laço para suspender os esporos. As amostras foram vortexadas e os esporos foram quantificados usando um hemacitômetro.

Os esporos foram diluídos à concentração desejada com meio de ensaio (4.000 esporos por mL para FGR, FVE e CGR e 6.000 esporos por mL para DMA) e mantidos em gelo antes do começo do ensaio de atividade antifúngicos.

Detalhes de Preparação da Placa de Ensaio:

Placas de fundo plano de 96 poços de cultura de não tecido padrão tratadas ou placas não tratadas de M área (Costar) foram usadas nos ensaios de placa antifúngicos. O meio de ensaio era caldo de dextrose de batata 1A χ para FVE, FGR e DMA e 1/4 x Czapec-Dox V8 foi empregado para CGR.

Os polipeptídeos antifúngicos em várias concentrações foram adicionados às placas em 50 pL/poço para uma placa de ensaio padrão ou 25 pL/poço para uma placa de meia área. Um volume igual de meios com esporos de fungos em 2 vezes as concentrações acima foi então adicionado para iniciar o ensaio. Alternativamente, amostras de chumbo fracionadas em HPLC foram ensaiadas por adição de meios com esporos de fungo (como acima) em placas de ensaio nas quais as amostras de HPLC haviam secado (Savant Speed-vac). As placas foram vedadas com uma membrana permeável a gás ("Breathe-Easy" , número Cat. BEM-1, Diversified Biotech, Boston, MA) e o ensaio desenvolveu no escuro a 28 0C por 24 a 48 horas.

Após o período de incubação as placas foram colocadas em um microscópio invertido e cada poço foi examinado e classificado em uma escala de 0-4, de acordo com os seguintes parâmetros: 0 = nenhuma inibição do crescimento de fungos quando comparado ao controle negativo, 0,5 = ligeira inibição (o desenvolvimento total é inferior ao controle negativo, porém o desenvolvimento de esporos individuais é aparente, embora não completamente confluente) , 2 = inibição moderada (o desenvolvimento de 1 esporo pode ser facilmente identificado e é significativamente menos abundante que o controle negativo; o desenvolvimento de cada esporo tende a parecer esférico), 3 = inibição forte (os esporos germinaram, porém o desenvolvimento é limitado a algumas ramificações de hifas curtas), 4 = inibição completa (os esporos não germinaram. Vide, por exemplo, Duvick e outros, (1992) j. Biol. Chem. 267: 18814-18820) . Uma planilha contendo exemplos representativos de cada nível de atividade antifúngicos é provida na figura 2.

Resultados

A figura 3 apresenta os resultados dos ensaios de atividade antifúngicos com o polipeptídeo estabelecido na SEQ ID NO:1. Esse polipeptídeo exibiu a atividade antifúngicos contra FVE, FGR, CGR e DMA.

Receitas dos Meios:

Caldo 1 x Czapek-Dox V8:

Para cada litro, suspenda 35 g de Caldo Difco Czapek- Dox (#233810) em dH20 e adicione de 180 mL de suco V8 que foi clarificado por centrifugação (3.000 χ g no total). Eleve o volume final para 1 litro e autoclave a 1210C por 20 minutos. Os meios são esterilizados em filtro para remover quaisquer fragmentos remanescentes.

Caldo 1 x dextrose de batata

Para cada litro, suspenda 24 g de Caldo de Dextrose de Batata Difco (#0549-17-9) em dH20 e eleve o volume final para 1 litro e autoclave a 121°C por 20 minutos. Os meios são esterilizados em filtro para remover quaisquer fragmentos remanescentes.

Agar V8

Para cada litro, dissolva 180 mL de suco V8 e 3 g de carbonato de cálcio em 820 mL de água de ionizada e então adicione 17 g de Bacto-agar em dH20 em um recipiente de 4 litros. Dez gotas de antiespumante a 5% podem ser opcionalmente adicionadas por litro preparado. Cubra e autoclave a 121°C por 20 minutos. Derrame o conteúdo das placas em capela estéril.

Ágar de Aveia

Para cada litro suspenda 36,4 g de Ágar de aveia Difco (#0552-17-3) e 4,25 g de ágar em dH20 em um recipiente de 4 litros cubra e autoclave a 121°C por 20 minutos. Derrame o conteúdo das placas em capela estéril.

Tabela 1; Detalhes das Condições do Caldo para as Cepas de FVE, FGR, CGR e DMA para Emprego nos Ensaios de Atividade antifúngicos In Vitro

<table>table see original document page 106</column></row><table> <table>table see original document page 107</column></row><table>

Exemplo 4: Isolamento dos genes LB-09812 e LB-12922 de comprimento pleno a partir do DNA genômico

Experimentos do Genome Walker foram realizados para isolar os genes LB-09812 e LB-12922 do DNA genômico de Penicillium glandicola e Penicillium citreonigrum, respectivamente.

Isolamento dos genes LB-09812 e LB-12922 O procedimento para isolamento do gene é descrito no Manual do Usuário para o kit Genome Walker vendido pela Becton Dickinson BioSciences (anteriormente Clontech Laboratories, Inc.; Palo Alto, CA) . O DNA genômico das linhagens de fungos LB-09812 e LB-12922 foi isolado no Lawrence Berkeley National Laboratory empregando o kit FastDNA(R) SPIN (QbioGene, Inc., Carlsbad, CA) e o método balístico de interrupção de célula de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi então empregado exatamente conforme descrito no Manual do Usuário do Genome Walker (Clontech PT3042-1, Versão PR033 00). Em resumo, o DNA foi digerido separadamente com enzimas de restrição Dral, EcoRV, PvuII e Stul, todos cortadores de extremidade cega. O DNA foi extraído com fenol, então clorofórmio e então precipitado com etanol. Os adaptadores do Genome Walker foram ligados nas extremidades do DNA restrito. O DNA resultante é referido como DL1-4, respectivamente. Para isolamento do gene LB-09812, vários iniciadores de sobreposição, degenerados foram projetados para as regiões sublinhadas e em itálico na seqüência de peptideo disponível, ALHNSCSHPRCFMfAHCLTYS (SEQ id no: 28). Esses iniciadores foram empregados nas reações de iniciação realizadas em cada amostra de DNA (DL 1-4) com os iniciadores do Genome Walker apropriados em uma ou duas rodadas de PCR. A PCR foi realizada em um ciclador térmico modelo PTC-100 com HotBonnet da MJ Research (Watertown, Maine) . 0 primeiro fragmento do gene LB-09812 foi clonado empregando apenas uma rodada da PCR usando o iniciador AP2 da BD BioSciences (5 1 -ACTATAGGGCACGCGTGGT-31; SEQ id no:31) e gspR2 (Bi-Rtgrttraarcayctnggrtg-S1; seq id no:32). as reações da PCR foram realizadas empregando o kit da PCR BD Advantage(™' HF2 em reações de 25 pL, com as concentrações finais do iniciador em 2 mM. Os parâmetros de ciclagem foram: 5 ciclos de 920C por 3 0 segundos, então 680C por 3 minutos, seguido por 28 ciclos de 920C por 20 segundos e 55°C por 3 minutos e finalmente 5 minutos a 65°C. Cerca de 20 pL de cada região foram operados em um gel de agarose a 1,0% e as faixas foram excisadas e purificadas com o kit de extração de gel QIAquick da Qiagen, Inc. (Valencia, Calif.) e clonado no vetor pCR-Blunt (Invitrogen, San Diego, Calif). Os clones foram seqüenciados para verificação. O fragmento resultante, parte da SEQ ID NO: 2 do gene LB-09812 foi clonado desse modo empregando os iniciadores AP2 e gspR2. O fragmento gênico e a proteína codificada dessa forma são estabelecidos a seguir e nas SEQ ID NOs: 33 e 34: TACCCGGACGGGCTTCTTCACCCCGAGAACGGTGGCTACTACCTGAAGGATGGGG ATGAAGTCGTCGTTGGCATTGCCAGCGACGATCTTTGCAAGGAGCTGGACGGTGC ATTCGCTAGCGTCGATGCAAAAATTGCCGAAGAAGCTGAAAGCGCTGGACCCGA AGATAATATTTCTGATGCTGAAAATGTCAAGAGAGATGTACTTGCCCTACATAAC TCATGCAGCCACCCTCGCTGCTTCAATCAC (SEQ ID NO:33)

YPDGLLHPENGGYYLKDGDEVWGIASDDLCKELDGAFASVDAKIAEEAESAGPED NISDAENVKRDVLALHNSCSHPRCFNH (SEQ ID NO:34)

A região em negrito corresponde aos dois terços N- terminal da seqüência de peptídeo conhecida na época em que os experimentos do Genome Walker foram realizados. 0 término carbóxi foi obtido com reações da PCR realizadas conforme descrito acima, porém com o iniciador da BD BioSciences APi (B--Gtaatacgactcactatagggc-S'; seq id NO:35) e gspF4 (5'-TTYAAYCAYGCNCAYTGYTTRAC-31; SEQ ID NO:36). 0 fragmento resultante é estabelecido a seguir e na SEQ ID NO:37.

TTCAACCACGCTCACTGCYTGACCTACTCGCACTGCCATGTATGCTCTTCCCGCAA GCGT

TGTCTTTAGAGTATCCTGCAATTTTGATAGTGGGAATGTTGGAGAGATTTACGAA GGCTT

ACAGAGATGTGGTTGGATAGTGAAAGTGGGGGAGGTAGTCTGGGGGTATAGCGG CCTCTG

GTTAGTTTCAATTAAGATGCGAATTTTGGCCTGATTCTTGCCTTGCTTTATTTAGA TTCA

ACAGAAAATTAAGATACCTGAAATACCATTACAGAGCCTATATAAAGCTAGCGT AGGGGG

GAAATCATCAGTTATTAAGAGGAGTCTCGGCGAACGAGATACTCAGGTTGACGA GCAATC

CTCTGGTCAAAATTCCATCTGGAAAGATGTGTACCGTACCGTCAATAATTGGGTC GATGA

GTAGTGCCCTAATTTAACGCCTGTACACGGTGAACTCCATGA (SEQ ID NO: 37)

Traduzido no quadro 1, esse fragmento codifica o polipeptídeo que se segue (SEQ ID NO:38):

FNHAHCLTYSHCHVCSSRKRCL*SILQF**WECWRDLRRLTEMWLDSESGGGSLGV *RPL

VSFN*DANFGLILALLYLDSTEN*DT*NTITEPI*S*RRGEIISY*EESRRTRYSG*RAI LWSKFHLERCVPYRQ*LGR*WP*FNACTR*TP* (SEQ ID NO:38)

A seqüência de compósito gerada desses dois fragmentos de DNA genômicos codifica a seqüência de aminoácido LB- 09812 madura, SEQ ID NO:l.

A fim de obter uma seqüência de pré-proteína putativa, isto é, uma seqüência codificando uma metionina no término N previsto da proteína não processada, duas rodadas da PCR foram realizadas usando o DNA da Genome Walkers DL-2 como gabarito. Os reagentes e condições de ciclagem para ambas as rodadas da PCR foram conforme descrito acima, usando essas combinações do iniciador:

Rodada 1: iniciador da BD BioSciences API (5'- GTAATACGACTCACTATAGGGC - 3 1 ; SEQ ID NO: 35) e PHN99817 (5'- CGACGCTAGCGAATGCACCGTC-31; SEQ ID NO:39).

Rodada 2: iniciador da BD BioSciences AP 2 (51- ACTATAGGGCACGCGTGGT-3 ' ; SEQ ID NO: 31)) e PHN99816 (51- TCATCCCCATCCTTCAGGTAGTAGC-3 * ; SEQ ID NO:40).

Conforme descrito no Manual do Usuário da Genome Walker, o DNA da primeira rodada da PCR foi diluído 50 vezes e serviu como um gabarito para a segunda rodada da PCR. Para clonar o gene LB-09812 como uma molécula simples, a PCR foi realizada empregando o DNA genômico LB-09812 como gabarito, com o iniciador à frente PHNlOl 10 (5'- TATACCAAACGAAGAAGGATAGT-3' : SEQ ID NO: 41) e iniciador inverso PHPl0108 (51-ATCTAAATAAAGCAAGGCAAG-3'; SEQ ID NO:42). As faixas foram purificadas conforme descrito acima e clonadas no vetor pCR-Blunt para verificação da seqüência, resultando na SEQ ID NO:24.

Para isolamento do gene LB-12922, vários iniciadores de sobreposição degenerados foram projetados para as regiões sublinhadas e regiões em itálico na seqüência de peptídeo disponível LSCYPSCMQNYCSHPRX.FLXAT (SEQ ID NO: 30).

As bibliotecas do Genome Walker e da PCR foram realizadas conforme descrito para a clonagem de LB-09812. A primeira região genômica do LB-12922 clonada foi o produto das reações da PCR realizadas em duas rodadas. A primeira rodada da PCR foi iniciada com o iniciador da BD BioSciences API (SEQ ID NO: 35) e gspPIBFl (5'- TGYATGCARAAYTAYTGY-3 1 ; SEQ ID NO: 50). As reações da primeira rodada foram diluídas 50 vezes e usadas como gabarito para a segunda rodada da PCR, iniciada com o iniciador da BD BioSciences AP2 (SEQ ID NO: 31) e gspPlBF3 (5'-TAYTGYAGYCAYCCNCG-3'; SEQ ID NO:51)). As faixas foram purificadas conforme descrito acima e clonadas no vetor pCR-Blunt para verificação da seqüência. A seqüência de fragmento resultante é estabelecida a seguir e na SEQ ID NO:43:

TACTGYAGCCATCCCCGTTGCTTCCTCCACGCTACTTGTTTGTCCTACTCTCATTG CCATGTGTGCGGTACCCGGAAGGTCTGTCTCTAA (SE ID NO: 43) , que codifica a metade do término C do peptídeo LB-12992, YCSHPRCFLHATCLSYSHCHVCGTRKVCL* (SEQ ID NO: 44) . Os resíduos nessa seqüência de fragmentos que eram conhecidos antes dos experimentos do Genome Walker estão em negrito. Essa seqüência de fragmento, quando adicionada aos resíduos N- terminal determinados pelo seqüenciamento do peptídeo, resultou na seqüência para peptídeo maduro LB-12922 (SEQ ID NO:3).

Para clonar os fragmentos genômicos 5' adicionais do gene LB-12992, outro conjunto de reações do Genome Walker foi realizado conforme descrito acima. Os iniciadores específicos do gene eram gspPlBR6 (5'-YCKNGGRTGNGARCARTA- 3'; SEQ ID NO: 45) e gspPlBRl (seqüência 5'- RCARTARTTYTGCATRCA-3 ' ; SEQ ID NO: 46) para a primeira e a segunda rodadas da PCRi respectivamente. Essas reações resultaram na seqüência de nucleotídeo estabelecida a seguir e na SEQ ID NO: 47, uma parte maior da qual sendo a SEQ ID NO:26:

ATGACTAAGACATCCATAGAGACCTTAATTACCCCTCACGACATCGACATGCAAT ACATT

TTTACCTCCCTCGTTCAATTTCTGTGCTTCATGAACGTCATGGCTGAAGGTCTAAC CCGG

TACCAAACCTCACCCCCGACTGATGTCGTGATTCTCCACGATAGACAATCCCTGA ACGAT

TACGTGAAGATCAATCCAAACGGTCTGCTCCATGCCGAGAATGGAGGCTACTACC TGAAA

GACATGGAAGACGTAGTCGTTGCTATCGCTAGTGATGACCTGTGCAATGAGCTGG ATGGT

GCCTGGGCTAGCGCTGAGGCTGCTGCTGATGCGCTTGACGCGGCTGAATCTAATT CTGGA

TCTGGCTCTTTGAGCGGCGCGAATGTTACGAAGAGAAACGAAGACCTTTCTTGTT ATCCC

AGCTGTATGCAGAATTAT (SEQ ID NO:47).

Para clonar a seqüência genômica codificando a proteína LB-12992 não processada, putativa como uma molécula simples, assim confirmando sua seqüência, os iniciadores PHN100279 (51-ATGTCCTCCTCCCAAGTTTCCTTC-3'; SEQ ID NO: 48) e PHNl 00 615 (5'- AGTGGGTGGATATTTGTCTCAGAAA-3 '; SEQ ID NO: 49) foram usados com o DNA genômico LB-12992 como gabarito em uma rodada simples da PCR empregando as condições do tipo Genome Walker. 0 fragmento resultante foi purificado com gel, clonado e seqüenciado complemente, produzindo a SEQ ID NO:26.

A seqüência genômica para LB-09812 é estabelecida na SEQ ID NO:24 e codifica o polipeptídeo não processado, de comprimento pleo previsto, estabelecido na SEQ ID NO:25. 0 polipeptídeo LB-09812 de comprimento pleno possui um peptídeo de sinal previsto e região de prõ-peptídeo. A seqüência de sinal putativa é apresentada em negrito com o sítio de clivagem previsto designado como um . A região de pró-peptídeo prevista se encontra ressaltada e em itálico. O peptídeo maduro previsto se encontra sublinhado.

MKSISTSLVLVLCFLTTMMIEG^LTRLHPENGGYYLKDGD flALHNSCSHPRCFNHAHCLTYSHCHVCSSRKRCL (SEQ ID NO:25).

Uma seqüência genômica codificando a seqüência de polipeptídeo LB-12922 de comprimento pleno prevista foi isolada de modo semelhante, conforme descrito acima. A seqüência é estabelecida na SEQ ID NO:26 e codifica o polipeptídeo não processado, de comprimento pleno, previsto estabelecido na SEQ ID NO: 27. 0 polipeptídeo LB-12 922 de comprimento pleno possui um peptídeo de sinal e região de pró-peptídeo previstos. 0 polipeptídeo LB-12922 de comprimento pleno possui um peptídeo de sinal e região de pró-peptídeo previstos. A seqüência de sinal putativa é apresentada em negrito com o sítio de clivagem previsto designado como um "'". 0 sítio de clivagem não é previsto com exatidão. A região de pró-peptideo prevista se encontra ressaltada e em itálico. O peptideo maduro previsto se encontra sublinhado.

MTKTSIETLITPHDIDMQYIFTSLVQFLCFMINVMA EGIiTJRFQTSPPTDWXli

HDRQSLNDYVKINPNGLLHENGGYYLKDMEDVWAIASDDLCNFLDGAWASAFAAADAL

DAAESNSGSGSLSGAWTVTíCJWEriLSCYPSCMQNYCSHPRCFLHATCLSYSHCHVCGTR

KVCL (SEQ ID NO:27).

Exemplo 5: Transformação e regeneração de plantas de milho transgênicas

Embriões de milho imaturos de plantas doadoras de estufa são bombardeados com um plasmídeo contendo uma seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo antipatogênico estabelecido na SEQ ID NO :1 ligado operavelmente a um promotor que aciona a expressão em uma célula de planta de milho e um marcador selecionável (por exemplo, o gene marcador selecionável PAT (Wohlleben e outros, (1988) Gene 70:25-37), que confere resistência ao herbicida Bialaphos). Alternativamente, o gene marcador selecionável é provido em um plasmídeo separado. A transformação é realizada com se segue. As receitas dos meios são fornecidas a seguir.

Preparação do tecido alvo

As espigas são descascadas e a superfície esterilizada com alvejante Clorox a 30% mais Micro detergente a 0,5% por 20 minutos, e enxaguadas duas vezes com água estéril. Os embriões imaturos são excisados e o eixo geométrico do embrião colocado para baixo (o lado do escutelo para cima), 25 embriões por pela, no meio 56OY por 4 horas e então alinhados dentro da zona alvo de 2,5 cm na preparação para bombardeamento. Preparação do DNA

É obtido um vetor de plasmídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptídeo antipatogênico estabelecido na SEQ ID NO :1 ligado operavelmente a um promotor que aciona a expressão em uma célula de milho. Esse DNA de plasmídeo mais o DNA do plasmídeo contendo um marcador selecionável (por exemplo, PAT) é precipitado em esferas de tungstênio de 1,1 pm usando um procedimento de precipitação com CaCl2 como se segue:

100 pL de partículas de tungstênio preparadas em água

10 pL (1 pg) de DNA no tampão Tris EDTA (1 pg de DNA total)

100 pL de 2,5 M CaCl2

10 pL de 0,IM espermidina

Cada reagente é adicionado seqüencialmente à suspensão de partícula de tungstênio, enquanto é mantido no vortexador de múltiplos tubos. A mistura final é brevemente sonicada e deixada incubar sob vortexação constante por 10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos são centrifugados rapidamente, o líquido é removido, lavado com 500 mL de etanol a 100% e centrifugados por 30 segundos. Novamente, o líquido é removido e 105 pL de etanol a 100% são adicionados á microesfera de partícula de tungstênio final. Para o bombardeamento com pistola de partículas, as partículas de tungstênio/DNA são rapidamente sonicadas e 10 pL manchados no centro de cada macroveículo e deixados secar por cerca de 2 minutos antes do bombardeamento.

Tratamento com pistola de partículas

As placas contendo amostra são bombardeadas no nível número 4 na pistola de partículas #HE34-1 ou #HE34-2. Todas as amostras receberam um tiro simples em 650 PSI, com um total de dez alíquotas retiradas de cada tubo de partículas/DNA preparados.

Tratamento subseqüente

Seguindo-se o bombardeamento, os embriões são mantidos no meio 560Y por 2 dias, então transferidos para o meio de seleção 560R contendo 3 mg/L de Bialaphos e subcultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10 semanas de seleção, os clones de calos resistentes a seleção são transferidos para o meio 288J para iniciar a regeneração da planta. Seguindo-se a maturação somática do embrião (2-4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para o meio para germinação e transferidos para a sala de cultura iluminada. Aproximadamente 7-10 dias mais tarde, as plantinhas em desenvolvimento são transferidas para o meio isento de hormônio 272V nos tubos onde permanecem por 7-10 dias até as plantinhas estarem bem desenvolvidas. As plantas são então transferidas para os inserções em recipientes planos (equivalentes a um vaso de 6,35 cm) contendo solo de vaso e se desenvolveram por 1 semana em uma câmara de desenvolvimento, subseqüentemente se desenvolvendo por mais 1-2 semanas na estufa, então transferidas para 600 vasos clássicos (6,05 litros) onde se desenvolveram até a maturidade. As plantas foram monitoradas e classificadas quanto à resistência ao fungo.

Bombardeamento e meios de cultura

O meio de bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416) , 1,0 mL/L de Mistura de Vitaminas da Eriksson (1000X SIGMA-1511) , 0,5 mg/L de HCl de tiamina, 120,0 g/L de sacarose, 1,0 mg/L de 2,4-D e 2,88 g/L de L-prolina (trazida ao volume com D-I H2O seguindo-se o ajuste para pH 5,8 com KOH) ; 2,0 g/L de Gelrite (adicionada após trazer ao volume com D-I H2O); e 8,5 mg/L de nitrato de prata (adicionado após esterilização do meio e resfriamento para temperatura ambiente). O meio de seleção (560R) compreende 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416) , 1,0 mL/L de Mistura de Vitaminas da Eriksson (1000X SIGMA-1511) , 0,5 mg/L de HCl de tiamina, 30,0 g/L de sacarose e 2,0 mg/L de 2,4-D (trazido ao volume com D-I H2O seguindo-se o ajuste para pH 5,8 com KOH) ; 3,0 g/L de Gelrite (adicionada após trazer ao volume com D-I H2O) ; e 0,85 mg/L de nitrato de prata e 3,0 mg de bialafos adicionados após esterilização do meio e resfriamento para temperatura ambiente.

O meio de regeneração da planta (288J) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução de estoque de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L de HCl de tiamina, 0,10 g/L de HCl de piridoxina e 0,40 g/L de glicina trazida ao volume com D-I H2O polido) (Murashige e Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 0,5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarose, e 1,0 mL/L de ácido abscísico (trazido ao volume com D-I H2O polido após ajuste d pH para 5,6); 3,0 g/L de Gelrite (adicionada após trazer ao volume com D-I H2O); e 1,0 mg/L de ácido indolacético e 3,0 mg/L de bialafos (adicionado após esterilização do meio e resfriamento para 60°C) . O meio isento de hormônio (272V) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução de estoque de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L de HCl de tiamina, 0,10 g/L de HCl de piridoxina e 0,40 g/L de glicina trazida ao volume com D-1 H2O polido) 0,1 mg/L de mio-inositol e 40,0 g/L de sacarose, (trazida ao volume com D-1 H2O polido após ajuste d pH para 5,6) e 6,0 g/L de bacto-ágar (adicionado após trazer ao volume com D-1 H2O polido), esterilizado e resfriado para 60°C.

Exemplo 6: Transformação do milho mediada por Agrobacterium e regeneração das plantas transgênicas

Para transformação do milho mediada com Agrobacterium empregando uma seqüência de nucleotídeo codificando o polipeptideo da SEQ ID N0:1, foi usado o método Zhao (Patente US número 5.981.840 e Publicação de Patente PCT W098/32326; o conteúdo das mesmas sendo incorporado aqui como referência) . Em resumo, os embriões imaturos são isolados do milho e os contatados com uma suspensão do Agrobacterium, onde as bactérias são capazes de transferir a construção do polinucleotídeo para pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção) . Nessa etapa, os embriões imaturos são imersos em uma suspensão de Agrobacterium para início da inoculação. Os embriões são co-cultivados por um período de tempo com o Agrobacterium (etapa 2: a etapa de co-cultivo) . Os embriões imaturos são cultivados no meio sólido, seguindo-se a etapa de infecção. Após esse período de co-cultivo é realizada uma etapa de "repouso" opcional. Nessa etapa de repouso, os embriões são incubados na presença de pelo menos um antibiótico conhecido por inibir o desenvolvimento do Agrobacterium sem a adição de um agente seletivo para transformadores de planta (etapa 3: etapa de repouso). Os embriões imaturos são cultivados no meio sólido com antibiótico, porém sem um agente de seleção, para eliminação do Agrobacterium e par uma fase de repouso para as células infectadas. Em seguida, os embriões inoculados são cultivados no meio contendo um agente seletivo e os calos transformados em desenvolvimento são recuperados (etapa 4: a etapa de seleção). Os embriões imaturos são cultivados no meio sólido com um agente seletivo resultando no desenvolvimento seletivo das células transformadas. O calo é então regenerado nas plantas (etapa 5: a etapa de regeneração) e os calos desenvolvidos no meio seletivo são cultivados no meio sólido para regenerar as plantas.

Exemplo 7: Transformação das culturas de embrião de soja somáticas e regeneração das plantas de soja

As soluções de estoque e os meios que se seguem são usados para transformação e regeneração das plantas de soja:

Soluções de Estoque

Estoque constituído de sulfato 100 x: 37,0 g de MgSO4. IK2O1 1,69 g de MnSO4-H2O, 0,86 g de ZnSO4.7H20, 0,0025 g de CuSO4. 5H20.

Estoque constituído de haletos 100 x: 20,0 g de CaCl2.2H20, 0,083 g de Kl, 0, 0025 g de CoCl2.6H20.

Estoque constituído de P.B. Mo 100 x: 18,5 g KH2P04, 0,62 g H2BO3, 0,025 g Na2MoO4. 2H20

Estoque constituído de 2,4-D: 10 mg/mL

Estoque constituído de vitamina B5 100 x: 10,0 g de mio-inositol, 0,10 g de ácido nicotínico, 0,10 g de piridoxina HCl, 1 g de tiamina.

Meios (por litro)

SB196: 10 mL de cada uma das soluções de estoque acima, 1 mL de estoque de vitamina B5, 0,463 g (NH4)2SO4, 2,83 g KNO3, 1 mL de estoque 2,4-D, 1 g de asparagina, 10 g de sacarose, pH 5,7.

SB103: 1 pk. De mistura de sais Murashige & Skoog, 1 mL de estoque de vitamina B5, 750 mg de hexaidrato de MgCl2, 60 g de maltose, 2 g de gelrita, pH 5,7.

SB166: SB103 suplementado com 5 g por litro de carvão ativado.

SB71-4: sais B5 de Gamborg (Gibco-BRL, catálogo número 21153-028), 1 mL de estoque de vitamina B5, 30 g de sacarose, 5 g de Agar TC, pH 5,7.

As culturas em suspensão de embriões de soja são mantidas em 35 mL de meio líquido (SB196) em um misturador giratório (150 rpm) a 28°C com luzes fluorescentes fornecendo um ciclo de 16 horas de luz/8 horas de escuro. As culturas são subcultivadas a cada 2 semanas por inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 mL de meios líquidos frescos.

As culturas em suspensão de embriões de soja são transformadas pelo método de bombardeamento de partículas com pistola (vide Klein e outros, (1987) Nature 327:70-73) empregando um instrumento DuPont Biolistic PDS 1000/He.

Nos procedimentos de bombardeamento de partículas com pistola é possível o emprego de: 1) DNA de plasmídeo total purificado ou 2) fragmentos de DNA contendo apenas o(s) cassete (s) de expressão de DNA de interesse. Para cada oito transformações de bombardeamento, são preparados 30 µL de suspensão contendo 1 a 900 picogramas (pg) de fragmento de DNA por par de bases do fragmento de DNA. O plasmídeo de DNA recombinante ou fragmento usado para expressar o gene antifúngicos se encontra em um plasmídeo ou fragmento de DNA recombinante separado do gene marcador selecionável. Ambos, os plasmídeos de DNA recombinantes ou fragmentos são co-precipitados em partículas de ouro como se segue. Os DNAs em suspensão são adicionados a 50 pL de uma suspensão de partículas de ouro a 20-60 mg/L, 0,6 pm e então combinados com 50 pL de CaCl2 (2,5 M) e 20 pL de espermidina (0,1 Μ) . A mistura é vortexada por pulso cinco vezes, rotacionada em uma microcentrífuga por 10 segundos e o sobrenadante removido. As partículas revestidas com DNA são então lavadas suma vez com 150 pL de etanol a 100%, vortexadas por pulso e rotacionadas em uma microcentrífuga novamente e ressuspensas em 85 pL de etanol anidro. Cinco pL de partículas de ouro revestidas com DNA são então carregadas em cada disco de macroveículo.

Aproximadamente 150 a 250 mg de uma cultura de suspensão de duas semanas são colocados em uma placa de petri vazia de 60 mm x 15 mm e o líquido residual é removido do tecido empregando uma pipeta. 0 tecido é colocado a 8,90 cm para fora da tela de retenção e cada placa de tecido é bombardeada uma vez. A pressão de ruptura da membrana é ajustada em 4.4 82 kPa e a câmara é evacuada para -71 cm de Hg. Dezoito placas são bombardeadas e, seguindo-se o bombardeamento, o tecido de cada placa é dividido entre dois frascos, colocado novamente nos meios líquidos e cultivado como descrito acima.

Sete dias após o bombardeamento, o meio líquido é trocado com meio SBl96 fresco, suplementado com 50 mg/mL de higromicina ou 100 ng/mL de clorossulfurona, dependendo do gene marcador selecionável empregado na transformação. O meio seletivo é refrescado semanalmente ou de duas em duas semanas. Sete semanas após o bombardeamento, o tecido verde, transformado é observado se desenvolvendo de grupos embriogênicos necróticos, transformados. O tecido verde isolado é removido e inoculado nos frascos individuais para gerar novas culturas em suspensão, embriogênicas, transformadas, propagadas por clones. Assim, cada nova linhagem é tratada como um evento de transformação independente. Essas suspensões podem então ser mantidas como suspensões de embriões agrupados em um estágio de desenvolvimento imaturo através de subcultura ou podem ser regeneradas dentro das plantas integrais por maturação e germinação dos embriões somáticos individuais.

Os grupamentos embriogênicos transformados são removidos da cultura líquida e colocados em meio Agar sólido (SB166) não contendo hormônios ou antibióticos por uma semana. Os embriões são cultivados a 26°C com luzes fluorescentes e incandescentes em uma programação de 16 horas de luz: 8 horas de escuro. Após uma semana, as culturas são então transferidas para meio SB103 e mantidas nas mesmas condições de desenvolvimento por mais 3 semanas. Antes da transferência da cultura líquida para o meio sólido, o tecido das linhagens selecionadas é ensaiado por PCR ou análise Southern quanto à presença do gene antifúngicos.

Os embriões somáticos se tornam apropriados à germinação após 4 semanas e são então removidos do meio de maturação e secos em placas de petri vazias por 1 a 5 dias. Os embriões secos são então plantados no meio SB71-4 onde eles se desenvolvem para germinarem sob as mesmas condições de luz e germinação descritas acima. Os embriões germinados são transferidos para solo estéril e se desenvolvem até a maturidade.

Todas as publicações e pedidos dé patente mencionados no relatório descritivo indicam o nível dos versados na técnica a qual essa invenção se refere. Todas publicações e pedidos de patente são incorporados aqui como referência, como se cada publicação ou pedido de patente individual tivesse sido específica e individualmente citado como sendo incorporado aqui como referência.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplos para fins de clareza e entendimento, fica claro que determinadas modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações apensas. Listagem de Seqüência

<110> Altier, Dan

Crane, Virgínia Ellanskaya, I.A. Gi11iam, Jacob Hunter-Cevera, Jennie Presnail, James Schepers, Eric Simmons, Carl Tamas Torok Yalpani, Nasser

<120> POLIPEPTÍDEOS ANTIFÚNGICOS

<130> 035718/326498

<150> 60/800,804 <151> 16/05/2006

<160> 51

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 33 <212> PRT

<213> Penicillium glandicola <22 0 >

<221> PEPTÍDEO <222 > (1) . . . (33)

<223> Peptídeo LB-09812 maduro previsto

<400> 1

Ala Leu His Asn Ser Cys Ser His Pro Arg Cys Phe Asn His Ala His

15 10 15

Cys Leu Thr Tyr Ser His Cys His Val Cys Ser Ser Arg Lys Arg Cys 20 25 30

Leu

<210> 2 <211> 102 <212> DNA

<213> Penicillium glandicola

<220>

<221> misc_caracterísctica <222> (0)...(0)

<223> Seqüência nucleotídica que codifica o peptídeo LB-09812 maduro previsto apresentado na SEQ de ID n° 1 <221> CDS

<222> (1) . . . (102)

<400> 2

gcc cta cat aac tca tgc age cac cct cgc tgc ttc aat cac gcc cat 48

Ala Leu His Asn Ser Cys Ser His Pro Arg Cys Phe Asn His Ala His 1 5 10 15

tgc ctg acc tac tcg cac tgc cat gta tgc tet tcc cgc aag cgt tgt 96 Cys Leu Thr Tyr Ser His Cys His Val Cys Ser Ser Arg Lys Arg Cys 20 25 30

ctt tag 102

Leu *

<210> 3 <211> 39 <212> PRT

<213> Penicillium citreonigrum <220>

<221> PEPTÍDEO <222> (1)...(39)

<223> Peptídeo LB-12922 maduro previsto <400> 3

Leu Ser Cys Tyr Pro Ser Cys Met Gln Asn Tyr Cys Ser His Pro Arg

1 5 10 15

Cys Phe Leu His Ala Thr Cys Leu Ser Tyr Ser His Cys His Val Cys

20 25 30

Gly Thr Arg Lys Val Cys Leu 35

<210> 4 <211> 120 <212> DNA

<213> Penicillium citreonigrum <220>

<221> misc_caracterísctica <222> (0) . . . (0)

<223> Seqüência nucleotídica que codifica o peptídeo LB-12922 maduro apresentado na SEQ de ID n" 3

<221> CDS

<222 > (1) . . . (120)

<400> 4

ctt tet tgt tat ccc age tgt atg cag aat tac tgc agt cat ccc cgt 48

Leu Ser Cys Tyr Pro Ser Cys Met Gln Asn Tyr Cys Ser His Pro Arg 1 5 10 15 tgc ttc etc cac gct act tgt ttg tcc tac tet cat tgc cat gtg tgc 96 Cys Phe Leu His Ala Thr Cys Leu Ser Tyr Ser His Cys His Val Cys 20 25 30

ggt acc cgg aag gtc tgt ctc taa 120

Gly Thr Arg Lys Val Cys Leu * 35

<210> 5 <211> 125 <212> PRT

<213> Aspergillus flavus

<400> 5 Met Ala Ala Ala Tyr Ser Met Gly Thr Leu Asp Asp Arg Asn Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Tyr Leu Leu 20 Asp His Asp Gly Lys 25 Ile Leu Ala Val Ala 30 Ala Asp Gly Leu Cys 35 Glu Glu Leu Asp Asn 40 Ser Val Ala Ser Ala 45 Arg Arg Val Tyr Glu 50 Gln Arg Ser Arg Phe 55 Asp Leu Tyr Ser Gly 60 Glu Val Gln Glu Val Thr Leu Gln Ser His Asp Ala Gln Leu Arg Arg Ser Gly Glu Asn 65 70 75 80 Ser Cys Ser His Pro 85 Arg Cys Tyr Thr His 90 Ala Leu Cys Glu Thr 95 Tyr Ser Asp Cys Phe 100 Val Cys Ser Ser Ser 105 His His Trp Cys Thr 110 Asp Val Gly Val Leu 115 Ser Trp Met Gly Leu 120 Ala Arg Leu Cys Tyr 125

<210> 6 <211> 378 <212> DNA

<213> Aspergillus flavus <400> 6

atggcagccg catactcaat ggggacactg gatgatcgaa acggcgggta ttacctccta 60 gaccacgatg gtaaaattct agccgtggca gcagatggcc tatgcgaaga gctcgacaat 120

tcggtggcat cggcaagaag agtctacgag caacgttcac gcttcgattt atatagcgga 180

gaggtccagg aggttaccct tcagagccat gatgcacagt tacggagaag tggggagaac 240

tcttgttcgc accctcgttg ttatacgcat gcgctgtgtg aaacttatag tgattgcttt 300

gtgtgctctt ctagtcatca ttggtgcact gatgttgggg ttttgtcttg gatggggctt 360

gctcgcttat gctattaa 378

<210> 7 <211> 106 <212> PRT

<213> Aspergillus niger <400> 7

Met Ala Asp Pro Tyr Pro Met Gly Thr Leu Asp Asp Arg Asn Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Tyr Leu Leu 20 Asp His Asp Ala Thr 25 Val Leu Ala Ile Ala 30 Ser Asp Ser Leu Cys 35 Glu Glu Leu Asp Ser 40 Ser Met Glu Ser Ala 45 Lys Arg Phe His Ser Asn Asp Pro Ile Phe Asp Asn Glu Ala Glu Asp Val Ala Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Glu Ala Ala Asn Pro Gly Leu Ser Asn His Cys Thr His 65 70 75 80 Pro Arg Cys His Thr 85 His Ala Leu Cys Arg 90 Thr Tyr Ser Asp Trp 95 Tyr Val Cys Leu Phe 100 Ser Phe His Trp Cys 105 Phe

<210> 8 <211> 321 <212> DNA

<213> Aspergillus niger

<220>

<221> CDS

<222> (1) . . . (321)

<400> 8

atg gca gac cca tat cct atg gga acc ttg gac gat agg aat ggg gga 4 8

Met Ala Asp Pro Tyr Pro Met Gly Thr Leu Asp Asp Arg Asn Gly Gly 1 5 10 15

tac tat ctg cta gac cat gat gct aca gtg tta gct att gca tca gat 96 Tyr Tyr Leu Leu Asp His Asp Ala Thr Val Leu Ala Ile Ala Ser Asp 20 25 30

tct ctc tgc gaa gaa ctg gac tcc tca atg gaa tcg gca aaa agg ttc 144

Ser Leu Cys Glu Glu Leu Asp Ser Ser Met Glu Ser Ala Lys Arg Phe

35 40 45

cat age aat gac cca att ttt gat aat gaa gcc gag gat gtt gca cct 192

His Ser Asn Asp Pro Ile Phe Asp Asn Glu Ala Glu Asp Val Ala Pro

50 55 60

ggg aag ggt gaa gca gcc aat cct ggc cta tca aat cat tgc act cac 240

Gly Lys Gly Glu Ala Ala Asn Pro Gly Leu Ser Asn His Cys Thr His

65 70 75 80

cca cgc tgt cat aca cat gct ctt tgt cgg acc tac age gat tgg tac 288

Pro Arg Cys His Thr His Ala Leu Cys Arg Thr Tyr Ser Asp Trp Tyr 85 90 95

gtg tgt ttg ttc agt ttc cat tgg tgt ttt tga 321

Val Cys Leu Phe Ser Phe His Trp Cys Phe * 100 105

<210> 9 <211> 109 <212> PRT

<213> Aspergillus niger <400> 9

Met Ala Asp Gln Tyr Pro Met Gly Thr Leu Asp Asp Arg Asn Gly Gly 1 5 10 15 Tyr Tyr Leu Leu 20 Asp His Asp Ala Thr 25 Val Leu Ala Ile Ala 30 Ser Asp Ser Leu Cys 35 Glu Gly Leu Asp Ser 40 Ser Met Glu Ser Ala 45 Lys Arg Phe His Ser 50 Asn Asp Pro Ile Ser 55 Asp Asn Glu Ala Glu 60 Asp Val Ala Pro Gly Lys Ala Glu Gly Ser Asn Pro Gly Leu Ser Asn His Cys Thr His 65 70 75 80 Pro Arg Cys His Thr 85 His Ala Leu Cys Arg 90 Thr Tyr Ser Asp Cys 95 Tyr Val Cys Ser Ser 100 Ser Phe His Trp Cys 105 Ser Glu Tyr Ile

<210> 10 <211> 141 <212> PRT

<213> Aspergillus fumigatus <400> 10

Met Arg Ile Asn Val Phe Thr Ile Leu Ser Leu Leu Phe Ala Ser Asn 1 5 10 15 Leu Ala Met Ala 20 Thr Thr Arg Tyr Thr 25 Glu Pro Ile Pro Glu 30 Gly Ile Pro Val Leu 35 Glu Thr Arg Gln Gln 40 Leu Asn Asp Met Ala 45 Asp Gln Tyr Pro Thr 50 Gly Thr Leu Asp Asp 55 Arg Asn Gly Gly Tyr 60 Tyr Leu Leu Asp His Asp Gly Ala Val Leu Ala Val Thr Ser Asp Ala Leu Cys Glu Glu 65 70 75 80 Leu Asp Ala Ser Met 85 Glu Gln Ala Arg Arg 90 Phe His Ala Gly Asn 95 Leu Asp Asp Glu Ala 100 Asp Val Val Pro Arg 105 Gly Asp Asn Ala Ala 110 Ala Ser Cys Ser His 115 Pro Arg Cys His Thr 120 His Ala Leu Cys Arg 125 Thr Tyr Ser Asp Cys 130 Tyr Val Cys Ser Ser 135 Ser Lys His Trp Cys 140 Phe <210> 11 <211> 426 <212> DNA

<213> Aspergillus fumigatus <220>

<221> misc_caracterísctica <222 > (O) ... (0)

<223> Seqüência correta baseada em cDNA XM_749066.1

<221> CDS

<222 > (1) ... (426)

<400 > 11

atg aga ate aac gtc ttt acc ate ctg tcc ctt ctc ttc gcc age aat 48 Met Arg Ile Asn Val Phe Thr Ile Leu Ser Leu Leu Phe Ala Ser Asn

15 10 15

ctc gcc atg gct aca acc aga tac acc gag ccg ate ccc gag gga ate 96 Leu Ala Met Ala Thr Thr Arg Tyr Thr Glu Pro Ile Pro Glu Gly Ile 20 25 30

ccc gtc ctc gag acc cgc caa caa ctc aac gac atg gea gac caa tat 144

Pro Val Leu Glu Thr Arg Gln Gln Leu Asn Asp Met Ala Asp Gln Tyr 35 40 45

ccc acg ggg act ctg gac gat cga aac ggg ggc tac tac ctg ctc gac 192

Pro Thr Gly Thr Leu Asp Asp Arg Asn Gly Gly Tyr Tyr Leu Leu Asp 50 55 60

cac gac ggc gcc gtc ttg gcc gtt acg tet gat gcg cta tgc gag gaa 240

His Asp Gly Ala Val Leu Ala Val Thr Ser Asp Ala Leu Cys Glu Glu

65 70 75 80

ctg gac gcc tcg atg gaa caa gcg agg aga ttt cat gcc ggg aac ttg 288

Leu Asp Ala Ser Met Glu Gln Ala Arg Arg Phe His Ala Gly Asn Leu

85 90 95

gac gac gag gcc gat gtt gtt cct agg ggt gat aat gcg gct gcg agt 336

Asp Asp Glu Ala Asp Val Val Pro Arg Gly Asp Asn Ala Ala Ala Ser 100 105 110

tgc tet cac ccg cgc tgt cat acc cat gct ttg tgt cgc aca tat agt 384

Cys Ser His Pro Arg Cys His Thr His Ala Leu Cys Arg Thr Tyr Ser 115 120 125

gac tgc tat gtt tgt tcg tcg age aaa cat tgg tgt ttt tga 426

Asp Cys Tyr Val Cys Ser Ser Ser Lys His Trp Cys Phe * 130 135 140 <210> 12 <211> 103 <212> PRT

<213> Fusarium graminearum <400> 12

Met Ala Ala Lys Tyr Gln Asp Thr Ala Leu Glu Pro Lys Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Asn Val Ile Glu Val Asp Gly Lys Ile Val Leu Ala Thr Asp Asp Lys

20 25 30

Ile Thr Lys Glu Ile Asp Asp Leu Val Gln Gln Leu Glu Lys Asn Asp

35 40 45

Pro Glu Ala Lys Glu Glu Pro Lys Ile Ser Lys Arg Arg Asp Leu Asn

50 55 60

Val Leu Glu Pro Arg Arg Arg Cys Ser His Pro Gly Cys Tyr Phe His 65 70 75 80

Ser Thr Cys Leu Thr Tyr Thr Ala Cys His Val Cys Arg Leu Pro Pro

85 90 95

Ser Arg Arg Gly Leu Cys Ile 100

<210> 13

<211> 312

<212> DNA

<213> Fusarium graminearum

<220>

<221> misc_caracterísctica

<222> (0) ... (0)

<223> Fragmento de DNA genômico de AACM01000196 .1

<221> CDS

<222> (1) . . . (312)

<400> 13

atg gct gca aag tac cag gac aca gca ctt gaa cca aag tat ggc ggc 48

Met Ala Ala Lys Tyr Gln Asp Thr Ala Leu Glu Pro Lys Tyr Gly Gly

1 5 10 15

aat gtc att gaa gtc gat ggg aag att gtc ctt gca acg gat gat aaa 96

Asn Val Ile Glu Val Asp Gly Lys Ile Val Leu Ala Thr Asp Asp Lys

20 25 30

att acc aaa gag att gac gac ctt gtt caa cag ttg gag aag aat gat 144

Ile Thr Lys Glu Ile Asp Asp Leu Val Gln Gln Leu Glu Lys Asn Asp 35 40 45

cca gag gct aaa gaa gag ccc aag att tca aag aga cga gat ctc aat 192

Pro Glu Ala Lys Glu Glu Pro Lys Ile Ser Lys Arg Arg Asp Leu Asn

50 55 60 gtc ctt gag ccc cgc cgc cgg tgt age cac cca ggt tgc tat ttc cat 240

Val Leu Glu Pro Arg Arg Arg Cys Ser His Pro Gly Cys Tyr Phe His

65 70 75 80

tet acc tgc ttg acc tat act gct tgt cac gtc tgt aga cta cca ccc 288

Ser Thr Cys Leu Thr Tyr Thr Ala Cys His Val Cys Arg Leu Pro Pro

85 90 95

age agg cga ggg tta tgt ate tag 312

Ser Arg Arg Gly Leu Cys Ile * 100

<210> 14 <211> 72 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência nucleotídica que codifica o peptídeo sinalizador de alfa-amilase de Cevada

<400> 14

atggccaaca agcacctgtc cctctccctc ttcctcgtgc tcctcggcct ctccgcctcc 60 ctcgcctccg ga 72

<210> 15 <211> 24 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Peptídeo sinalizador de alfa-amilase de Cevada <400> 15

Met Ala Asn Lys His Leu Ser Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Leu Gly

1 5 10 15

Leu Ser Ala Ser Leu Ala Ser Gly 20

<210 > 16 <211> 174 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência nucleotídica que codifica Peptídeo sinalizador de alfa-amilase de Cevada unido à seqüência nucleotídica de SEQ de ID de n° 2

<221> misc caracterísctica <222 > (1) . . . (72)

<223> Seqüência nucleotídica que codifica Peptídeo sinalizador de alfa-amilase de Cevada

<221> misc_caracterísctica <222> (73) . . . (174)

<223> Seqüência nucleotídica que codifica o peptídeo LB-09812 maduro apresentado na SEQ de ID n° 1

<400> 16

atggccaaca agcacctgtc cctctccctc ttcctcgtgc tcctcggcct ctccgcctcc 60 ctcgcctccg gagccctaca taactcatgc agccaccctc gctgcttcaa tcacgcccat 120

tgcctgacct actcgcactg ccatgtatgc tcttcccgca agcgttgtct ttag 174

<210> 17 <211> 57 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Peptídeo sinalizador de alfa-amilase de Cevada unido à seqüência aminoácida de SEQ de ID de n° 1

<221> SINAL <222> (1)...(24)

<223> Peptídeo sinalizador de alfa-amilase de Cevada

<221> PEPTÍDEO <222> (25) . . . (57)

<223> Peptídeo LB-09812 maduro apresentado na SEQ de ID n° 1 <400> 17

Met Ala Asn Lys His Leu Ser Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ser Ala Ser 20 Leu Ala Ser Gly Ala 25 Leu His Asn Ser Cys 30 Ser His Pro Arg Cys 35 Phe Asn His Ala His 40 Cys Leu Thr Tyr Ser 45 His Cys His Val Cys Ser Ser Arg Lys Arg Cys Leu

50 55

<210> 18 <211> 192 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência nucleotídica que codifica o Peptídeo sinalizador de alfa-amilase de Cevada unido à seqüência aminoácida de SEQ de ID de n° 4

<221> misc_caracterísctica <222 > (1) ... (72) <223> Seqüência nucleotídica que codifica Peptídeo sinalizador de alfa-amilase de Cevada

<221> misc_caracterísctica <222> (73)...(192)

<223> Seqüência nucleotídica que codifica o peptídeo LB-12922 maduro apresentado na SEQ de ID n" 3

<400> 18

atggccaaca agcacctgtc cctctccctc ttcctcgtgc tcctcggcct ctccgcctcc ctcgcctccg gactttcttg ttatcccagc tgtatgcaga attactgcag tcatccccgt 120

tgcttcctcc acgctacttg tttgtcctac tctcattgcc atgtgtgcgg tacccggaag 180

gtctgtctct aa 192

<210> 19

<211> 63

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Peptídeo sinalizador de alfa-amilase de Cevada unido à seqüência aminoácida de SEQ de ID de n° 3

<221> SINAL <222> (1)...(24)

<223> Peptídeo sinalizador de alfa-amilase de Cevada

<221> PEPTÍDEO <222> (25)...(63)

<223> peptídeo LB-012922 maduro apresentado na SEQ de ID n° 3 <400> 19

Met Ala Asn Lys His Leu Ser Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Leu Gly

1 5 10 15

Leu Ser Ala Ser Leu Ala Ser Gly Leu Ser Cys Tyr Pro Ser Cys Met

20 25 30

Gln Asn Tyr Cys Ser His Pro Arg Cys Phe Leu His Ala Thr Cys Leu

35 40 45

Ser Tyr Ser His Cys His Val Cys Gly Thr Arg Lys Val Cys Leu 50 55 60

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência de Retenção de Retículo endoplasmático

<400> 20 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 21 <211> 6 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência de Retenção de Retículo endoplasmático <400> 21

Ser Glu Lys Asp Glu Leu 1 5

<210> 22 <211> 4 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência de Retenção de Retículo endoplasmático

<400> 22 His Asp Glu Leu 1

<210> 23 <211> 4 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência de Retenção de Retículo endoplasmático

<400> 23 His Asp Glu Phe 1

<210> 24 <211> 453 <212> DNA

<213> Penicillium glandicola <220>

<221> misc_caracterísctica <222> (0) . . . (0)

<223> Seqüência genômica que codifica o polipetídeo LB-09812 completo apresentado na SEQ de ID n1 25

<221> misc_caracterísctica <222 > (352) . . . (453)

<223> Seqüência nucleotídica que codifica o peptídeo LB-09812 maduro apresentado na SEQ de ID η° 1 <221> CDS <222> (1) . . . (453)

<400> 24

atg aaa tcc att tcc acc tcc ctt gtc ttg gtc ctg tgc ttc ttg acc 48 Met Lys Ser Ile Ser Thr Ser Leu Val Leu Val Leu Cys Phe Leu Thr 1 5 10 15

acc atg att gaa ggt ctc acc cgt tac caa acc aca ccc cca age gac 96 Thr Met Ile Glu Gly Leu Thr Arg Tyr Gln Thr Thr Pro Pro Ser Asp 20 25 30

gcc ate gtc tgc cat gac aga caa gct ctt aac gac ctg gcc aag gcc

144

Ala Ile Val Cys His Asp Arg Gln Ala Leu Asn Asp Leu Ala Lys Ala

35 40 45

tac ccg gac ggg ctt ctt cac ccc gag aac ggt ggc tac tac ctg aag 192

Tyr Pro Asp Gly Leu Leu His Pro Glu Asn Gly Gly Tyr Tyr Leu Lys 50 55 60

gat ggg gat gaa gtc gtc gtt ggc att gcc age gac gat ctt tgc aag 240

Asp Gly Asp Glu Val Val Val Gly Ile Ala Ser Asp Asp Leu Cys Lys

65 70 75 80

gag ctg gac ggt gea ttc gct age gtc gat gea aaa att gcc gaa gaa 288

Glu Leu Asp Gly Ala Phe Ala Ser Val Asp Ala Lys Ile Ala Glu Glu

85 90 95

gct gaa age gct gga ccc gaa gat aat att tet gat gct gaa aat gtc 336

Ala Glu Ser Ala Gly Pro Glu Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Asn Val 100 105 110

aag aga gat gta ctt gcc cta cat aac tca tgc age cac cct cgc tgc 384

Lys Arg Asp Val Leu Ala Leu His Asn Ser Cys Ser His Pro Arg Cys 115 120 125

ttc aat cac gcc cat tgc ctg acc tac tcg cac tgc cat gta tgc tet 432

Phe Asn His Ala His Cys Leu Thr Tyr Ser His Cys His Val Cys Ser 130 135 140

tcc cgc aag cgt tgt ctt tag 453

Ser Arg Lys Arg Cys Leu *

145 150

<210> 25 <211> 150 <212> PRT

<213> Penicillium glandicola <220>

<221> SINAL <222> (1)...(21)

<223> Peptídeo sinalizador previsto

<221> PROPEP

<222 > (22) . . . (118)

<223> Região pró-peptídeo prevista

<221> PEPTÍDEO <222 > (119) . . . (150)

<223> Peptídeo LB-09812 maduro apresentado na SEQ de ID n° 1 <400> 25

Met Lys Ser Ile Ser Thr Ser Leu Val Leu Val Leu Cys Phe Leu Thr 1 5 10 15 Thr Met Ile Glu Gly Leu Thr Arg Tyr Gln Thr Thr Pro Pro Ser Asp 20 25 30 Ala Ile Val Cys His Asp Arg Gln Ala Leu Asn Asp Leu Ala Lys Ala 35 40 45 Tyr Pro Asp Gly Leu Leu His Pro Glu Asn Gly Gly Tyr Tyr Leu Lys 50 55 60 Asp Gly Asp Glu Val Val Val Gly Ile Ala Ser Asp Asp Leu Cys Lys 65 70 75 80 Glu Leu Asp Gly Ala Phe Ala Ser Val Asp Ala Lys Ile Ala Glu Glu 85 90 95 Ala Glu Ser Ala Gly Pro Glu Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Asn Val 100 105 110 Lys Arg Asp Val Leu Ala Leu His Asn Ser Cys Ser His Pro Arg Cys 115 120 125 Phe Asn His Ala His Cys Leu Thr Tyr Ser His Cys His Val Cys Ser 130 135 140 Ser π Λ c Arg Lys Arg Cys Leu ί c r\

<210> 26 <211> 525 <212> DNA

<213> Penicillum citreonigrum <220>

<221> misc_caracterísctica <222> (0) . . . (0)

<223> Seqüência genômica que codifica o polipeptído LB-12922 completo apresentado na SEQ de ID n° 27

<221> misc_caracterísctica <222 > (406) . . . (525)

<223> Seqüência nucleotídica que codifica o peptídeo LB-12922 maduro apresentado na SEQ de ID n° 3

<221> CDS <222> (1) (525) <400> 26

atg act aag aca tcc ata gag acc tta att acc cct cac gac ate gac 48 Met Thr Lys Thr Ser Ile Glu Thr Leu Ile Thr Pro His Asp Ile Asp 1 5 10 15

atg caa tac att ttt acc tcc ctc gtt caa ttt ctg tgc ttc atg aac 96 Met Gln Tyr Ile Phe Thr Ser Leu Val Gln Phe Leu Cys Phe Met Asn 20 25 30

gtc atg gct gaa ggt cta acc cgg tac caa acc tca ccc ccg act gat

144

Val Met Ala Glu Gly Leu Thr Arg Tyr Gln Thr Ser Pro Pro Thr Asp

35 40 45

gtc gtg att ctc cac gat aga caa tcc ctg aac gat tac gtg aag ate 192

Val Val Ile Leu His Asp Arg Gln Ser Leu Asn Asp Tyr Val Lys Ile 50 55 60

aat cca aac ggt ctg ctc cat gcc gag aat gga ggc tac tac ctg aaa 240

Asn Pro Asn Gly Leu Leu His Ala Glu Asn Gly Gly Tyr Tyr Leu Lys

65 70 75 80

gac atg gaa gac gta gtc gtt gct ate gct agt gat gac ctg tgc aat 288

Asp Met Glu Asp Val Val Val Ala Ile Ala Ser Asp Asp Leu Cys Asn

85 90 95

gag ctg gat ggt gcc tgg gct age gct gag gct gct gct gat gcg ctt 336

Glu Leu Asp Gly Ala Trp Ala Ser Ala Glu Ala Ala Ala Asp Ala Leu 100 105 110

gac gcg gct gaa tet aat tet gga tet ggc tet ttg age ggc gcg aat 384

Asp Ala Ala Glu Ser Asn Ser Gly Ser Gly Ser Leu Ser Gly Ala Asn

115 120 125

gtt acg aag aga aac gaa gac ctt tet tgt tat ccc age tgt atg cag 432

Val Thr Lys Arg Asn Glu Asp Leu Ser Cys Tyr Pro Ser Cys Met Gln 130 135 140

aat tac tgc agt cat ccc cgt tgc ttc ctc cac gct act tgt ttg tcc 480

Asn Tyr Cys Ser His Pro Arg Cys Phe Leu His Ala Thr Cys Leu Ser

145 150 155 160

tac tet cat tgc cat gtg tgc ggt acc cgg aag gtc tgt ctc taa 525

Tyr Ser His Cys His Val Cys Gly Thr Arg Lys Val Cys Leu *

165 170 <210> 27 <211> 174 <212> PRT

<213> Penicillium citreonigrum <220>

<221> SINAL <222> (1) . . . (35)

<223> Peptídeo sinalizador previsto

<221> PRÓ-PEPTÍDEO <222> (36) . . . (136)

<223 > Região pró-peptídeo prevista

<221> PEPTÍDEO <222 > (137) . . . (174) <223> peptideo LB-12922

<400> 27

Met Thr Lys Thr Ser Ile

1 5

Met Gln Tyr Ile Phe Thr 20

Val Met Ala GIu Gly Leu 35

Val Val Ile Leu His Asp 50

Asn Pro Asn Gly Leu Leu 65 70

Asp Met Glu Asp Val Val

85

Glu Leu Asp Gly Ala Trp 100

Asp Ala Ala Glu Ser Asn 115

Val Thr Lys Arg Asn Glu 130

Asn Tyr Cys Ser His Pro 145 150

Tyr Ser His Cys His Val

165

<210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> fragmento N-terminal de Peptídeo LB-9812 gerado durante a seqüenciação N-terminal

<400> 28

Ala Leu His Asn Ser Cys Ser His Pro Arg Cys Phe Asn His Ala His

maduro apresentado na SEQ de ID n° 3

Glu Thr Leu Ile Thr Pro His Asp Ile Asp

10 15

Ser Leu Val Gln Phe Leu Cys Phe Met Asn 25 30

Thr Arg 40 Tyr Gln Thr Ser Pro 45 Pro Thr Asp Arg Gln Ser Leu Asn Asp Tyr Val Lys Ile 55 60 His Ala Glu Asn Gly 75 Gly Tyr Tyr Leu Lys 80 Val Ala Ile Ala 90 Ser Asp Asp Leu Cys 95 Asn Ala Ser Ala 105 Glu Ala Ala Ala Asp 110 Ala Leu Ser Gly Ser Gly Ser Leu Ser Gly Ala Asn 120 125 Asp Leu Ser Cys Tyr Pro Ser Cys Met Gln 135 140 Arg Cys Phe Leu His 155 Ala Thr Cys Leu Ser 160 Cys Gly Thr Arg Lys Val Cys Leu

170 1 5 10 15

Cys Leu Thr Tyr Ser 20

<210> 29 <211> 18 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> fragmento N-terminal de Peptídeo LB-9812 gerado durante a seqüenciação N-terminal

<400> 29

Cys Phe Asn His Ala His Cys Leu Thr Tyr Ser His Cys His Val Xaa

1 5 10 15

Cys Ser

<210> 30 <211> 22 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> fragmento N-terminal de Peptídeo LB-12922 peptídeo gerado durante a seqüenciação N-terminal

<221> VARIANTE <222 > 17, 20

<223> Xaa = qualquer aminoácido <400> 30

Leu Ser Cys Tyr Pro Ser Cys Met Gln Asn Tyr Cys Ser His Pro Arg

1 5 10 15

Xaa Phe Leu Xaa Ala Thr 20

<210> 31 <211> 19 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> iniciador de PCR AP2 <400> 31

actatagggc acgcgtggt

<210> 32 <211> 21 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> iniciador de PCR gspR2 <400> 32

rtgrttraar cayctnggrt g

<210> 33 <211> 249 <212> DNA

<213> Penicillium glandicola <220>

<221> misc_caracterísctica <222> (0) . . . (0)

<223> Fragmento de gen LB-9812 obtido durante experimentos GenomeWalker

<400> 33

tacccggacg ggcttcttca ccccgagaac ggtggctact acctgaagga tggggatgaa gtcgtcgttg gcattgccag cgacgatctt tgcaaggagc tggacggtgc attcgctagc 120

gtcgatgcaa aaattgccga agaagctgaa agcgctggac ccgaagataa tatttctgat 180

gctgaaaatg tcaagagaga tgtacttgcc ctacataact catgcagcca ccctcgctgc 240

ttcaatcac 249

<210> 34 <211> 83 <212> PRT

<213> Penicillium glandicola <220>

<221> PEPTÍDEO <222 > (1) . . . (83)

<223> Seqüência aminoácida codificada pela seqüência aminoácida

apresentada na SEQ de ID η ° 33 <400> 34 Tyr Pro Asp Gly Leu Leu His Pro Glu Asn Gly Gly Tyr Tyr Leu Lys 1 5 10 15 Asp Gly Asp Glu Val Val Val Gly Ile Ala Ser Asp Asp Leu Cys Lys 20 25 30 Glu Leu Asp Gly Ala Phe Ala Ser Val Asp Ala Lys Ile Ala Glu Glu 35 40 45 Ala Glu Ser Ala Gly Pro Glu Asp Asn Ile Ser Asp Ala Glu Asn Val 50 55 60 Lys Arg Asp Val Leu Ala Leu His Asn Ser Cys Ser His Pro Arg Cys

65 70 75 80

Phe Asn His

<210> 35 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador de PCR APl

<400> 35

gtaatacgac tcactatagg gc

<210> 36 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador de PCR gspF4 <400> 36

ttyaaycayg cncaytgytt rac

<210> 37 <211> 462 <212> DNA

<213> Pencillium glandicola <220>

<221> misc_caracterísctica <222> (O) .. . (O)

<223> Fragmento do gen LB-9812 obtido Experimentos GenomeWalker

22

23

durante

<400> 37

ttcaaccacg ctcactgcyt tgtctttaga gtatcctgca 120

acagagatgt ggttggatag 180

gttagtttca attaagatgc 240

acagaaaatt aagatacctg 300

gaaatcatca gttattaaga 360

ctctggtcaa aattccatct 420

gtagtgccct aatttaacgc 462

gacctactcg cactgccatg attttgatag tgggaatgtt

tgaaagtggg ggaggtagtc

gaattttggc ctgattcttg

aaataccatt acagagccta

ggagtctcgg cgaacgagat

ggaaagatgt gtaccgtacc

ctgtacacgg tgaactccat

tatgctcttc ccgcaagcgt 60 ggagagattt acgaaggctt

tgggggtata gcggcctctg

ccttgcttta tttagattca

tataaagcta gcgtaggggg

actcaggttg acgagcaatc

gtcaataatt gggtcgatga

ga

<210> 38

<211> 138

<212> PRT

<213> Penicillium glandicola

<220>

<221> PEPTÍDEO <222> (1) . . . (138)

<223> Seqüência aminoácida codificada pela seqüência nucleotídica apresentada na SEQ de ID n° 3 7

<400> 38 Phe Asn His Ala His Cys Leu Thr Tyr Ser His Cys His Val Cys Ser 1 5 10 15 Ser Arg Lys Arg 20 Cys Leu Ser Ile Leu 25 Gln Phe Trp Glu Cys 30 Trp Arg Asp Leu Arg 35 Arg Leu Thr Glu Met 40 Trp Leu Asp Ser Glu 45 Ser Gly Gly Gly Ser 50 Leu Gly Val Arg Pro 55 Leu Val Ser Phe Asn 60 Asp Ala Asn Phe Gly Leu Ile Leu Ala Leu Leu Tyr Leu Asp Ser Thr Glu Asn Asp Thr 65 70 75 80 Asn Thr Ile Thr Glu 85 Pro Ile Ser Arg Arg 90 Gly Glu Ile Ile Ser 95 Tyr Glu Glu Ser Arg 100 Arg Thr Arg Tyr Ser 105 Gly Arg Ala Ile Leu 110 Trp Ser Lys Phe His 115 Leu Glu Arg Cys Val 120 Pro Tyr Arg Gln Leu 125 Gly Arg Val Val Pro 130 Phe Asn Ala Cys Thr 135 Arg Thr Pro

<210> 39 <211> 22 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador de PCR PHN99817 <400> 39

cgacgctagc gaatgcaccg tc 22

<210> 40 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador de PCR PHN99816 <400> 40

tcatccccat ccttcaggta gtagc 25

<210> 41 <211> 23 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador de PCR PHN10110 <4OO> 41 tataccaaac gaagaaggat agt 23

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador de PCR ΡΗΡ10108

<400> 42

atctaaataa agcaaggcaa g 21

<210> 43 <211> 90 <212> DNA

<213> Penicillium citreonigrum

<220>

<221> misc_caracterísctica <222> (0) ... (0)

<223> Fragmento do gen LB-12922 obtido durante Experimentos GenomeWalker

<221> CDS <222> (1) . . . (30)

<400> 43

tac tgy age cat ccc cgt tgc ttc ctc cac gctacttgtt tgtcctactc 50

Tyr Cys Ser His Pro Arg Cys Phe Leu His 1 5 10

tcattgccat gtgtgcggta cccggaaggt ctgtctctaa 90

<210> 44 <211> 29 <212> PRT

<213> Penicillium citreonigrum

<220>

<221> PEPTÍDEO <222 > (1) . . . (29)

<223> Seqüência aminoácida codificada pela seqüência Nucleotídica apresentada na SEQ de ID n° 43

<400> 44

Tyr Cys Ser His Pro Arg Cys Phe

1 5

Ser His Cys His Val Cys Gly Thr 20

Leu His Ala Thr Cys Leu Ser Tyr

10 15

Arg Lys Val Cys Leu 25

<210> 45 <211> 18 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22O>

<223> Iniciador de PCR gspPlBR6 <400> 45

ycknggrtgn garcarta

<210> 46 <211> 18 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

18

<220>

<223> Iniciador de PCR gspPIBRI <400> 46

rcartartty tgcatrca 18

<210> 47 <211> 438 <212> DNA

<213> Penicillium citreonigrum <220>

<221> misc_caracterísctica <222 > (O) .. . (O)

<223> Fragmento do gen LB-12922 obtido durante Experimentos GenomeWalker

<400> 47

atgactaaga catccataga gaccttaatt acccctcacg acatcgacat gcaatacatt 6 0 tttacctccc tcgttcaatt tctgtgcttc atgaacgtca tggctgaagg tctaacccgg 120

taccaaacct cacccccgac tgatgtcgtg attctccacg atagacaatc cctgaacgat 180

tacgtgaaga tcaatccaaa cggtctgctc catgccgaga atggaggcta ctacctgaaa 240

gacatggaag acgtagtcgt tgctatcgct agtgatgacc tgtgcaatga gctggatggt 300

gcctgggcta gcgctgaggc tgctgctgat gcgcttgacg cggctgaatc taattctgga 360

tctggctctt tgagcggcgc gaatgttacg aagagaaacg aagacctttc ttgttatccc 420

agctgtatgc agaattat 438

<210> 48 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador de PCR PHN100279

<400> 48

atgtcctcct cccaagtttc cttc

24 <210> 49 <211> 25 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador de PCR ΡΗΝ100615

<400> 49

agtgggtgga tatttgtctc agaaa

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador de PCR gspPIBFl

<400> 50

tgyatgcara aytaytgy

<210> 51

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Iniciador de PCR gspPlBF3

<400> 51

taytgyagyc ayccncg

Claims (22)

1. Polipeptldeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: a) um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácido estabelecida na SEQ ID NO: 1 ou 3; b) um polipeptídeo possuindo pelo menos 90% de identidade de seqüência em relação à SEQ ID NO: 1 ou 3, onde o dito polipeptídeo possui uma atividade antipatogênica; e, c) um polipeptídeo possuindo pelo menos 15 aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 1 ou 3, onde o dito polipeptídeo possui uma atividade antipatogênica.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo possui uma atividade antifúngica.

3. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: a) um polinucleotídeo compreendendo a seqüência estabelecida na SEQ ID NO: 2 ou 4; b) um polinucleotídeo possuindo pelo menos cerca de -90% de identidade de seqüência em relação à SEQ ID NO: 2 ou 4; c) um polinucleotídeo codificando a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 ou 3; d) um polinucleotídeo codificando a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo possuindo pelo menos 90% de identidade de seqüência com relação à SEQ ID NO: 1 ou 3, onde o dito polipeptídeo possui uma atividade antipatogênica; e, e) um polinucleotídeo codificando a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo possuindo pelo menos 15 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 ou 3, onde o dito polipeptídeo possui uma atividade antipatogênica.

4. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a seqüência de nucleotídeo é otimizada por expressão em uma planta.

5. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo da reivindicação 3, operativamente ligado a um promotor que aciona a expressão em uma planta ou célula de planta.

6. Cassete de expressão, de acordo com a. reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende, adicionalmente, um polinucleotídeo ligado operativamente codificando um peptídeo de sinal.

7. Cassete de expressão, de acordo com a· reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codificando um peptídeo de sinal compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 14.

8. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de sinal compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 15.

9. Célula de planta transformada, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um cassete de expressão da reivindicação 5.

10. Célula de planta, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a célula de planta é de um monocoto.

11. Célula de planta, de acordo com a reivindicação -10, caracterizada pelo fato de que o monocoto é milho, trigo, arroz, cevada, sorgo ou centeio.

12. Célula de planta, de acordo com a reivindicação -9, caracterizada pelo fato de que a célula de planta é de um dicoto.

13. Célula de planta, de acordo com a reivindicação -12, caracterizada pelo fato de que o dicoto é soja, Brassica, girassol, algodão ou alfafa.

14. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um cassete de expressão da reivindicação 5.

15. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a planta revela resistência aumentada a um agente patogênico de fungos de planta.

16. Planta, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o agente de fungos de planta é selecionado do grupo consistindo em Colletotrichum graminicola, Diplodia maydis, Fusarium graminearum e Fusarium verticillioides.

17. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor preferido de tecido selecionado do grupo consistindo em um promotor preferido de folha, um promotor preferido de raiz, um promotor preferido de semente, um promotor preferido de talo e um promotor preferido de tecido vascular.

18. Planta, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor induzível por agente patogênico.

19. Semente transformada, caracterizada pelo fato de ser da planta da reivindicação 14.

20. Método para indução de resistência ao agente patogênico de planta em uma planta, o método caracterizado pelo fato de que compreende introdução em uma planta de pelo menos um cassete de expressão da reivindicação 5.

21. Composição antipatogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um veículo e pelo menos um polipeptídeo da reivindicação 1.

22. Método para proteção de uma planta de um agente patogênico de planta, caracterizado pelo fato de que compreende aplicação da composição da reivindicação 21 ao ambiente de um agente patogênico de planta.