BRPI0710105A2

BRPI0710105A2 - Dispositivo e método para detecção de componentes biológicos marcados por fluorescência

Info

Publication number: BRPI0710105A2
Application number: BRPI0710105-8A
Authority: BR
Inventors: Stellan Lindberg
Original assignee: Hemocue Ab
Priority date: 2006-03-28
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2011-08-02
Also published as: MX2008012323A; SE531233C2; NO20084083L; EP2008082A1; JP2009527734A; WO2007111555A1; KR101055544B1; RU2390024C1; ZA200805865B; CN101410708A; CA2637592A1; US20090011518A1; EP2008082A4; SE0600687L; AU2007229975A1; AU2007229975B2; KR20080098657A; CN101410708B; RU2008138602A; JP4923065B2

Abstract

<B>DISPOSITIVO E MéTODO PARA DETECçãO DE COMPONENTES BIOLóGICOS MARCADOS POR FLUORESCêNCIA<D>A presente invenção refere-se a um dispositivo de obtenção de amostra para detecção de componentes biológicos em uma amostra de líquido compreendendo: uma cavidade de medição para receber uma amostra de líquido, no qual a cavidade de medição tem uma espessura fixa predeterminada, e um reagente, que é disposto em uma forma seca dentro da cavidade de medição. O reagente compreende uma molécula conjugada de fluoroforo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISPOSITIVOE MÉTODO PARA DETECÇÃO DE COMPONENTES BIOLÓGICOS MAR-CADOS POR FLUORESCÊNCIA".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um dispositivo de obtenção deamostra, um método e um sistema para detecção e enumeração volumétricade componentes biológicos marcados por fluorescência em uma amostra delíquido.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA Quando se analisa uma amostra biológica, tal como uma amos-tra de célula, é desejável poder identificar os diferentes componentes daamostra, por exemplo, os diferentes tipos de células presentes. Estes dife-rentes componentes mostram suas respectivas estruturas moleculares, taiscomo marcadores de superfície de célula, pelas quais os componentes po-dem ser diferenciados. Utilizando moléculas conjugadas de fluoroforo parase ligarem a estas estruturas moleculares os componentes biológicos podemser marcados de modo fluorescente. São conhecidas na técnica uns poucosprocessos para detectar e analisar componentes marcados de modo fluores-cente, principalmente células, predominantemente a citometria de fluxo etécnicas de microscopia de fluorescência.

Na citometria de fluxo, células-alvo por fluorescência em sus-pensão são passadas uma por uma por um canal de fluxo defronte a um fei-xe de laser e podem ser medidas as fluorescências de vários diferentescomprimentos de onda, assim como a dispersão de luz frontal e ortogonal.Deste modo, pode ser analisada a marcação de vários diferentes fluoroforos,como também o tamanho e a granulação das células. Métodos de citometriade fluxo são revelados, por exemplo, nas Patentes números U.S. 3.826.364,U.S. 4.248.412 e U.S. 5.047.321.

A microscopia de fluorescência é geralmente conduzida pelairradiação de uma amostra fluorescente a ser estudada, usualmente espa-lhada sobre uma lâmina de microscópio, com irradiação eletromagnética deum comprimento de onda específico mais curto, fazendo os fluoroforos naamostra absorver em dita irradiação e, subseqüentemente, emitir irradiaçãoeletromagnética de um comprimento de onda específico mais longo. A irra-diação emitida é detectada usando um microscópio equipado com um filtrocromático, ou um monocromador equivalente, que essencialmente permitepassar apenas a irradiação de comprimento de onda mais longo.

Nas Patentes U.S. 4.125.828 e U.S. 2006/0017001 são revela-dos microscópios de fluorescência e métodos para detectar uma amostrafluorescente que foi espalhada sobre uma lâmina de microscópio.

Na Patente U.S. 5.932.428 é revelado uma análise e uma mistu-ra de amostra para a enumeração de componentes de interesse coloridos demodo fluorescente de uma amostra de sangue por um instrumento de for-mação de imagem. Em um aspecto da patente U.S. 5.932.428, o sanguetotal é misturado com um anticorpo marcado de modo fluorescente comple-tamente seco e um detergente zwitteriônico, após o que a mistura de sangueé atraída para dentro de um tubo capilar de escaneamento. O tubo capilarcheio é escaneado utilizando-se um feixe laser que é estreitado na forma deuma cintura gaussiana que intersecta o tubo capilar. O laser então iluminauma região de coluna do tubo capilar igual ao diâmetro da cintura gaussiana,regula a profundidade do espaço do tubo capilar e excita qualquer matériafluorescente nesta região. A fluorescência desta região é detectada por umdetector de luz. O laser então ilumina outra região do tubo capilar e a fluo-rescência desta região é também detectada, etc. Deste modo, é escaneadoum volume pré-determinado da amostra por fluorescência.

Na Patente U.S. 2006/0024756 é revelado um dispositivo, méto-do e algoritmo para enumeração de células-alvo de modos fluorescente emagnético. De acordo com o método revelado, todas as células são marca-das de modo fluorescente, mas apenas as células-alvo são também marca-das magneticamente. A amostra de célula marcada é colocada em uma câ-mara, ou cubeta, entre dois magnetos em forma de cunha para mover seleti-vãmente as células-alvo magneticamente a uma superfície de observaçãoda cubeta. Um LED (Diodo Emissor de Luz) ilumina as células e uma câme-ra CCD (Dispositivo de Carregamento Acoplado) captura as imagens de luzfluorescente emitida pelas células-alvo. A marcação de célula pode ocorrerna cubeta ou câmara usada para análise, ou a amostra é transferida para talcubeta, ou câmara, depois de concedido tempo suficiente para permitir amarcação de célula. O volume da cubeta é conhecido e usado para determi-nar a concentração absoluta das células-alvo na amostra de sangue. No en-tanto, isto requer esperar até que todas as células-alvo tenham sido movidasmagneticamente para uma superfície de observação antes de poderem serdetectadas e contadas.

A Patente EP O 422 708 revela um dispositivo para uso em pro-cedimentos de testes químicos. O dispositivo compreende uma cavidadedefinida por duas paredes planas e paralelas, uma das quais retém anticor-pos imobilizados covalentemente e esta, ou a outra parede, retém anticorpossecos, mas não imobilizados covalentemente, marcados de modo fluores-cente. O objetivo é usar o dispositivo para análises intercaladas de um antí-geno que pode se ligar a ambos os anticorpos imobilizados e marcados.Uma amostra de líquido contendo o antígeno a ser analisado é sugada porforça de capilaridade para dentro do dispositivo, dissolvendo os anticorposmarcados. O antígeno é ligado pelos anticorpos imobilizados e também osanticorpos marcados ligam-se ao antígeno, através do que são concentradosanticorpos marcados de modo fluorescente na parede retendo anticorposimobilizados covalentemente. Esta parede é feita de vidro, ou outro materialtransmissor de luz, e tem a capacidade de conduzir luz como uma fibra óticaou guia de onda. A presença de antígeno na amostra de líquido é detectadamedindo a intensidade da luz na borda da parede, isto é, a luz guiada pelaparede que emana dos anticorpos fluorescentes presentes na dita parede.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

É um objetivo da invenção proporcionar uma análise simplespara detectar componentes biológicos marcados de modo fluorescente deuma amostra de líquido. De acordo com um aspecto da invenção, é um obje-tivo proporcionar uma análise simples para enumeração volumétrica decomponentes biológicos marcados de modo fluorescente de uma amostra delíquido. É um objetivo adicional da invenção proporcionar uma rápida análisesem a necessidade de aparelhos complicados ou extensas preparações deamostra.

Estes objetivos são parcial ou totalmente alcançados por umdispositivo de obtenção de amostra, um método e um sistema de acordocom as reivindicações independentes. Modalidades preferenciais são evi-dentes nas reivindicações dependentes.

De acordo com um aspecto, a presente invenção assim relacio-na-se a um dispositivo de obtenção de amostra para a detecção de compo-nentes biológicos em uma amostra de líquido, o dito dispositivo de obtençãode amostra compreendendo uma cavidade de medição para receber umaamostra de líquido, onde a cavidade de medição tem uma espessura fixapredeterminada. O dispositivo de obtenção de amostra compreende um rea-gente, que é colocado em uma forma seca dentro da cavidade de medição,dito reagente compreendendo uma molécula conjugada de fluoroforo.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção relaciona-secom um método para a detecção de componentes biológicos marcados porfluoroforo em uma amostra de líquido. O método compreende misturar umreagente englobando uma molécula conjugada de fluoroforo com uma amos-tra de líquido de modo que a molécula conjugada de fluoroforo liga-se a umaestrutura molecular específica de um componente biológico na amostra delíquido; introduzir a amostra de líquido em uma cavidade de medição de umdispositivo de obtenção de amostra, a dita cavidade de medição tendo umaespessura fixa predeterminada; irradiar uma área da amostra na cavidade demedição com radiação eletromagnética de um comprimento de onda corres-pondendo a um comprimento de onda de excitação do fluoroforo; e detectarcomponentes biológicos marcados por fluoroforo em toda a espessura dacavidade de medição, a dita detecção compreendendo obter uma imagemdigital da área irradiada na cavidade de medição.

O dispositivo de obtenção de amostra proporciona a possibilida-de de se obter diretamente uma amostra de sangue total dentro da cavidadede medição e fornecê-la para análise. Não há a necessidade de preparaçãoda amostra. Na prática, uma amostra de sangue pode ser sugada para den-tro da cavidade de medição diretamente do dedo picado de um paciente.Fornecer o dispositivo de obtenção de amostra com um reagente permiteuma reação dentro do dispositivo de obtenção de amostra, o que torna aamostra pronta para análise. A reação é iniciada quando a amostra de san-gue entra em contato com o reagente. Deste modo, não há a necessidadede preparar manualmente a amostra, o que faz a análise especialmente a-dequada para ser realizada diretamente em uma sala de exames enquanto opaciente espera.

Uma vez que o reagente é fornecido em uma forma seca, o dis-positivo de obtenção de amostra pode ser transportado e armazenado porum longo período sem afetar a utilização do dispositivo de obtenção de a-mostra. Assim, o dispositivo de obtenção de amostra com o reagente podeser fabricado e preparado muito antes de se fazer a análise de uma amostrade sangue.

O dispositivo de obtenção de amostra da presente invenção po-de assim ser usado de modo fácil e repetido até mesmo por uma pessoanãotreinada, e não necessariamente em um ambiente de laboratório padro-nizado, uma vez que o dispositivo de obtenção de amostra pode formar umconjunto pronto para uso em que a entrada de amostra do dispositivo de ob-tenção de amostra necessita apenas ser levada a entrar em contato com aamostra de modo a obter a amostra de uma forma pronta para ser analisada.

Em adição, a espessura fixa da cavidade de medição fornece apossibilidade de determinar a contagem de componentes biológicos por uni-dade volumétrica da amostra de líquido. Uma vez que o método é arranjadopara detectar componentes biológicos marcados por fluoroforo em toda aespessura da cavidade de medição, é possível realizar a análise da amostrade líquido rapidamente. Não há a necessidade de esperar que os compo-nentes biológicos se acomodem dentro da cavidade de medição ou sejamatraídos para uma superfície de observação.

Os componentes biológicos da amostra de líquido podem ser,por exemplo, células eucarióticas, tais como células de mamíferos (por e-xemplo, leucócitos e plateletas); bactérias, vírus; e macromoléculas, tais co-mo DNA (Ácido Desoxirribonucléico).

A amostra de líquido pode ser, por exemplo, um fluido corpóreo,tal como sangue integral não diluído, urina ou líquido espinhal; ou uma cultu-ra de células, tal como uma cultura de células de mamífero ou uma culturabacteriana. A amostra de líquido pode ser um fluido biológico não diluídoainda não submetido a qualquer pré-tratamento. O pré-tratamento de umaamostra biológica, tal como diluição, centrifugação e dissolução, conduz auma precisão menor quando se relaciona células-alvo enumeradas ao volu-me analisado. Quanto mais o pré-tratamento progride, mais baixa a precisãoda enumeração. O método é ainda mais simplificado ao não se empregarqualquer tipo de pré-tratamento antes de colocar a amostra no dispositivo deobtenção de amostra pronto para uso.

É assim possível detectar a presença ou a quantidade de, porexemplo, um tipo específico de célula em uma amostra de sangue.

O dispositivo de obtenção de amostra pode compreender umcorpo tendo duas superfícies planas para definir dita cavidade de medição.As superfícies planas podem ser colocadas a uma distância predeterminadauma da outra para definir uma espessura de amostra para uma medição óti-ca. Isto significa que o dispositivo de obtenção de amostra proporciona umaespessura bem definida para a medição ótica, que pode ser usada para de-terminar com exatidão a contagem dos componentes biológicos marcadospor fluoroforo por unidade volumétrica da amostra de líquido. Um volume deuma amostra de líquido analisada será bem definido pela espessura da ca-vidade de medição e uma área da amostra sendo representada. Assim, ovolume bem definido pode ser usado para associar o número de componen-tes biológicos marcados por fluoroforo ao volume da amostra tal que é de-terminada a contagem volumétrica de componentes biológicos marcados porfluoroforo.

Preferivelmente, a cavidade de medição tem uma espessura uni-forme de 5—170 micrômetros. Uma espessura de pelo menos 50 micrôme-tros significa que a cavidade de medição não força uma amostra de líquido,tal como uma amostra de célula, a ser espalhada em uma camada única,permitindo a um volume maior de amostra de líquido ser analisado sobreuma pequena área de seção transversal. Assim, um volume suficientementegrande da amostra de líquido de modo a dar valores confiáveis da contagemde componentes biológicos marcados por fluoroforo pode ser analisado em-pregando uma imagem relativamente pequena da amostra de célula. A es-pessura é mais preferivelmente no mínimo de 100 micrômetros, o que permi-te uma área de seção transversal até menor ser analisada, ou analisado umvolume maior de amostra. Ademais, a espessura de pelo menos 50 micrô-metros, e mais preferivelmente 100 micrômetros, também simplifica a fabri-cação da cavidade de medição tendo uma espessura bem definida entreduas superfícies planas.

Para a maioria das amostras, por exemplo, uma amostra desangue disposta em uma cavidade tendo uma espessura de não mais que170 micrômetros, a contagem de componentes biológicos marcados por fluo-roforo, tal como células de uma amostra de sangue, é tão baixa que ocorre-rão apenas desvios menores em razão dos componentes serem dispostossobrepondo-se uns aos outros. No entanto, o efeito de tais desvios serãorelacionados à contagem dos componentes biológicos marcados por fluoro-foro e pode, então, pelo menos em certa extensão, ser manipulado por in-termédio de resultados corrigidos estatisticamente para grandes valores dacontagem de componentes biológicos marcados por fluoroforo. Esta corre-ção estatística pode ser baseada em calibrações do aparelho de medição.Os desvios serão até menores para uma cavidade de medição tendo umaespessura de não mais que 150 micrômetros, na qual pode ser usada umacalibragem mais simples. Esta espessura pode até não requerer qualquercalibração para componentes biológicos sobrepostos.

Além disso, a espessura da cavidade de medição é suficiente-mente pequena para permitir que o aparelho de medição obtenha uma ima-gem digital de modo que a profundidade total da cavidade de medição possaser analisada simultaneamente. Se for utilizado um sistema de aumento noaparelho de medição, não será simples obter uma profundidade maior decampo. Em conseqüência, a espessura da cavidade de medição deve prefe-rivelmente não exceder 150 micrômetros, de modo que a espessura totalseja analisada simultaneamente em uma imagem digital. A profundidade decampo pode ser disposta para lidar com uma espessura da cavidade de me-dição de 170 micrômetros.

A imagem digital pode ser obtida com uma profundidade decampo no mínimo correspondente à espessura da cavidade de medição. Istosignifica que é obtido um foco suficiente da espessura da amostra total demodo que a espessura total da cavidade de medição pode ser simultanea-mente analisada na imagem digital da amostra. Assim, não há necessidadede esperar, por exemplo, as células se acomodarem na cavidade de medi-ção, em razão de que o tempo para fazer uma análise é reduzido. Escolhen-do não focalizar muito nitidamente sobre uma parte específica da amostra, éobtido um foco suficiente para a espessura total da amostra para permitir aidentificação do número de componentes biológicos marcados por fluoroforona amostra. Isto implica que um componente fluorescente pode estar umtanto embaçado e ainda ser considerado estando no foco da profundidadede campo.

A espessura fixa da cavidade de medição permite a análise deum volume bem definido da amostra. Em particular, uma área da cavidadede medição é adaptada para ser representada de modo a proporcionar aanálise de um volume bem definido da amostra, através do que pode serobtida a enumeração volumétrica de um componente biológico na amostra.A área sendo representada junto com a espessura da cavidade de mediçãoproporciona um volume bem definido da amostra. Através da contagem donúmero de componentes biológicos marcados dentro deste volume estático,pode ser facilmente obtida a contagem volumétrica dos componentes bioló-gicos na amostra. A contagem volumétrica pode ser obtida pela análise deuma imagem digital do volume. Assim, uma enumeração volumétrica podeser obtida sem a necessidade de passar uma amostra em frente a um anali-sador, como é realizado de acordo o princípio da citometria de fluxo.

O dispositivo de obtenção de amostra pode ser provido com umreagente que foi aplicado na superfície solvido em um líquido volátil que foievaporado para deixar o reagente em uma forma seca.

Deve ser entendido que o reagente é solvido vantajosamente emum líquido volátil antes de ser inserido na cavidade de medição. Isto significaque o líquido deve ser evaporado de um modo eficiente do espaço estreitoda cavidade de medição durante a fabricação e preparação do dispositivo deobtenção de amostra.

O reagente preferivelmente deve ser solvido em um solventeorgânico, e mais preferivelmente solvido em metanol. Tais solventes sãovoláteis e podem ser usados apropriadamente para secar o reagente sobre asuperfície da cavidade de medição.

O reagente, incluindo todos os seus componentes, da presenteinvenção é preferivelmente dissolvível e/ou capaz de ser suspenso na amos-tra de líquido a ser analisada, e é preferivelmente projetado para permane-cer em solução/suspensão através de toda a análise. Desde que, como aci-ma determinado, o método é preparado para detectar componentes biológi-cos marcados por fluoroforo na espessura total da cavidade de medição enão há necessidade de atrair ou imobilizar os componentes biológicos deinteresse em uma superfície de observação, não há necessidade de imobili-zar, ou de qualquer outra forma evitar dissolução/suspensão do reagente oude qualquer componente do reagente. Pelo contrário, utilizar um reagentedissolvível/capaz de ser suspenso, preferivelmente um reagente facilmentedissolvível/capaz de ser suspenso, facilita a mistura do reagente com a a-mostra de líquido e acelera quaisquer reações entre o reagente e a amostrade líquido incluindo o componente biológico a ser medido.

O reagente da presente invenção compreende uma moléculaconjugada de fluoroforo. Um fluoroforo, ou fluorocromo, é definido aqui comoparte de uma molécula que causa a molécula ser fluorescente. Uma molécu-la é fluorescente se ela emite radiação eletromagnética de um comprimentode onda específico como uma resposta ao ser submetida à radiação decomprimento de onda diferente.

Fluoroforos, ou fluorocromos, usados geralmente incluem, porexemplo, isotiocianato fluoresceína(FITC), ficoeritrina (PE), proteína de cio-rofila peridinina (PerCP), aloficocianina (APC) e cianina-5.5 (Cy 5.5).

A molécula conjugada de fluoroforo é preferivelmente dispostapara se ligar a uma estrutura molecular específica de um componente bioló-gico. Exemplos de tais moléculas incluem, mas não são limitadas a eles,ligantes, receptores, antígenos, anticorpos e fragmentos de anticorpos. Sãoexemplos de fragmentos de anticorpos, por exemplo, fragmentos de antíge-nos de aglutinação (Fab) e cadeia simples de fragmento variável (scFv). An-ticorpos e fragmentos de anticorpos são preferidos porque são obtidos demodo relativamente fácil com afinidade em comparação com todas as estru-turas moleculares, e são conhecidos muitos esquemas para conjugá-los comdiferentes tipos de fluoroforos.

A estrutura molecular pode ser qualquer estrutura molecular es-pecífica de um componente biológico, por exemplo, um marcador de superfí-cie de célula, tal como CD4 (cluster de diferenciação 4) ou CD8 (cluster dediferenciação 8) ou uma estrutura intracelular, tal como DNA. Um marcadorde superfície de célula é definido aqui como qualquer característica molecu-lar da membrana de plasma de uma célula que é acessível da parte externada célula, tal como um antígeno ou epítopo. Isto significa que quaisquer tiposde células podem ser detectados para qualquer propósito, tal como detectare enumerar células CD4+ com o objetivo de monitorar uma infecção de HIV.

A quantidade de moléculas conjugadas de fluoroforo é preferi-velmente selecionada de modo a haver uma quantidade suficiente para seligar aos componentes biológicos. De forma a assegurar que essencialmentetodas as moléculas biológicas objetivadas estejam adequadamente marca-das pelas moléculas conjugadas de fluoroforo dentro de um tempo razoável,as moléculas conjugadas de fluoroforo necessitam estar presentes em ex-cesso. No entanto, moléculas conjugadas de fluoroforo livres ainda ocorre-rão na amostra da mistura e é desejável que esta concentração livre sejamantida suficientemente baixa para manter baixa a fluorescência de fundoquando a amostra é analisada. Assim, as moléculas conjugadas de fluorofo-ro não devem estar presentes em excesso. A relação entre moléculas conju-gadas de fluoroforo ligadas e não ligadas depende da afinidade entre as mo-léculas conjugadas de fluoroforo e o componente biológico, e do tempo alo-cado para misturar as moléculas conjugadas de fluoroforo com o componen-te biológico.

O dispositivo de obtenção de amostra pode ainda compreender uma entrada de amostra comunicando a cavidade de medição com o exteri-or do dispositivo de obtenção de amostra, a dita entrada sendo disposta paraobter uma amostra de líquido. A entrada de amostra pode ser disposta paraatrair uma amostra de líquido por força de capilaridade e a cavidade de me-dição pode ainda atrair líquido da entrada para dentro da cavidade de medi- ção. Como resultado, a amostra de líquido pode facilmente ser obtida dentroda cavidade de medição simplesmente movendo a entrada de amostra paracontato com o líquido. Assim, as forças capilares da entrada de amostra e dacavidade de medição atrairão uma quantidade bem definida de líquido paradentro da cavidade de medição. Alternativamente, a amostra de líquido pode ser sugada ou atraída para dentro da cavidade de medição por intermédioda aplicação de uma força de bombeamento externo para o dispositivo deobtenção de amostra. De acordo com outra alternativa, a amostra de líquidopode ser levada para dentro de uma pipeta e então introduzida dentro dacavidade de medição por intermédio da pipeta. O dispositivo de obtenção de amostra pode ser descartável, istoé, preparado para ser usado apenas uma vez. O dispositivo de obtenção deamostra proporciona um conjunto para realizar uma contagem de compo-nentes biológicos marcados por fluoroforo, uma vez que o dispositivo de ob-tenção de amostra é capaz de receber uma amostra de líquido e reter todos os reagentes necessários de modo a apresentar a amostra para contagem.Isto é particularmente permitido uma vez que o dispositivo de obtenção deamostra é adaptado para uso apenas uma vez e pode ser formado sem con-sideração das possibilidades de limpar o dispositivo de obtenção de amostrae reaplicar um reagente. Além disso, o dispositivo de obtenção de amostra pode ser moldado em um material plástico e, devido a isso, fabricado a baixocusto. Assim, pode ser compensador quanto ao custo usar um dispositivo deobtenção de amostra descartável.De acordo com uma modalidade do método para detecção decomponentes biológicos marcados por fluoroforo em uma amostra de líqui-do, o dispositivo de obtenção de amostra compreende um reagente, que édisposto em forma seca dentro da cavidade de medição, no qual o reagentecompreende uma molécula conjugada de fluoroforo. Então, a mistura é obti-da introduzindo a amostra de líquido dentro da cavidade de medição parafazer contato com o reagente. Isto significa que não há necessidade de pre-paração de amostra. Pode ser iniciada uma reação quando a amostra desangue entra em contato com o reagente. Assim, não há necessidade depreparar manualmente o reagente, o que torna a análise especialmente a-dequada para ser executada diretamente em uma sala de exames enquantoo paciente espera.

No entanto, de acordo com uma modalidade alternativa, a mistu-ra do reagente com a amostra de líquido pode ser realizada antes da amos-tra de líquido ser introduzida dentro da cavidade de medição. De acordo comoutra alternativa, a mistura pode ser realizada em pelo menos duas etapas,em que a primeira etapa é executada antes de a amostra ser introduzidadentro da cavidade de medição e a segunda etapa é executada na cavidadede medição. Isto significa que a preparação da amostra é pelo menos parci-almente feita fora do dispositivo de obtenção de amostra. No entanto, é ain-da mantida a vantagem de usar um dispositivo de obtenção de amostra ten-do uma cavidade de medição com uma espessura fixa. Assim, o métodoproporciona uma possibilidade de determinar a contagem de componentesbiológicos por unidade volumétrica da amostra de líquido. Ademais, não há anecessidade de esperar que os componentes biológicos de interesse aco-modem-se dentro da cavidade de medição ou sejam atraídos para uma su-perfície de observação.

Para a irradiação da amostra ser estudada, é preferível usaruma fonte de radiação colocada para não permitir a radiação de comprimen-tos de onda que correspondam, ou estejam perto, dos comprimentos de on-da que são emitidos pelo fluoroforo na amostra, porque isto poderá interferircom a detecção da radiação emitida. De modo a obter esta radiação decomprimento de onda limitado, preferivelmente é usada uma fonte de radia-ção junto com um filtro cromático. Alternativamente, pode ser usado um la-ser que irradie com um comprimento de onda específico que é absorvidopelo fluoroforo. Pode também ser usado um prisma ou uma tela (grade) demodo a dirigir apenas determinados comprimentos de onda de radiação deuma fonte de radiação para a amostra. A fonte de radiação é, preferivelmen-te, um diodo emissor de luz (LED), mas qualquer fonte de radiação pode serusada, tal como um laser ou um bulbo de luz normal. Um LED é preferidoporque é relativamente barato e confiável.

A detecção dos componentes biológicos marcados por fluoroforocompreende, preferivelmente, obter uma imagem digital da amostra irradiadana cavidade de medição, na qual os componentes biológicos exibindo o fluo-roforo são diferenciados como pontos fluorescentes emitindo radiação ele-tromagnética de um comprimento de onda correspondente a um comprimen-to de onda de emissão do fluoroforo. A imagem digital é convenientementeobtida através do uso de uma câmera CCD incorporada a um microscópiode fluorescência, o microscópio preferivelmente sendo adaptado de modoconveniente através do uso de um filtro cromático, para essencialmente a-penas permitir que alcance a câmera o comprimento de onda da radiaçãoeletromagnética emitida pelo fluoroforo.

A detecção dos componentes biológicos marcados por fluoroforocompreende ainda, preferivelmente, analisar a imagem digital para identificarcomponentes biológicos exibindo o fluoroforo e determinar o número decomponentes biológicos exibindo o fluoroforo na amostra. Isto significa que adetecção e/ou contagem dos componentes biológicos pode ser facilmenteobtida por análise de imagem baseada em computador. Deste modo, podemser obtidos resultados confiáveis e capazes de serem reproduzidos.

A amostra de líquido preferivelmente é introduzida dentro da ca-vidade de medição de medição do dispositivo de obtenção de amostra atra-vés de uma entrada de amostra capilar, por intermédio de força de capilari-dade.

A imagem digital pode ser obtida usando um poder de ampliaçãode 3-50x, mais preferivelmente 3-1 Ox. Dentro destas faixas de poder de am-pliação, a maioria dos componentes biológicos tais como células de mamífe-ros, objetivo do presente método, é suficientemente ampliada de modo a serdetectada, enquanto a profundidade de campo pode ser ajustada para cobrira espessura da amostra. Um baixo poder de ampliação significa que podeser obtida uma grande profundidade de campo. No entanto, se é utilizadoum baixo poder de ampliação, os componentes biológicos podem ser difíceisde serem detectados. Um poder de ampliação mais baixo pode ser usadopara aumentar o número de pixels na imagem obtida, isto é, pelo aperfeiço-amento da resolução da imagem digital. Desta forma, tem sido possível usarum poder de ampliação de 3-4x, embora ainda permitindo aos componentesbiológicos, tais como células de mamíferos, serem detectadas.

A análise pode compreender a identificação de áreas de alta e-missão de radiação eletromagnética, de um comprimento de onda específicocorrespondendo à emissão de comprimento de onda do fluoroforo com oqual o componente biológico é marcado, na imagem digital. A análise podeainda compreender identificar pontos de luz na imagem digital resultantes daradiação eletromagnética específica emitida. Uma vez que as moléculasconjugadas de fluoroforo podem ser acumuladas em torno dos componentesbiológicos alvo, a emissão da fluorescência específica pode ter picos empontos separados. Estes pontos formarão pontos de luz na imagem digitalque podem ser detectados como correspondentes a um componente biológi-co-alvo.

A análise pode ainda compreender a ampliação eletrônica daimagem digital obtida. Enquanto a amostra está sendo ampliada para se ob-ter uma imagem digital aumentada da amostra, a própria imagem digital ob-tida pode ser aumentada eletronicamente para simplificar a distinção entreobjetos que são representados muito perto um do outro na imagem digitalampliada.

Se duas ou mais moléculas conjugadas de fluoroforo; conjuga-das a fluoroforos diferentes respectivamente, emitindo radiação eletromag-nética de diferentes comprimentos de onda respectivamente, e arranjadaspara se ligarem a estruturas moleculares diferentes respectivamente; estãocompreendidas no reagente, pode ser obtida uma imagem de cada compri-mento de onda de radiação.

Estas imagens podem então ser superpostas, nas quais a análi-se pode mostrar alguns componentes biológicos apresentando uma estrutu-ra molecular, alguns outros mostrando outras e alguns mostrando ambas. Oraciocínio é similar, usando-se mais de duas moléculas conjugadas de fluo-roforo.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção relaciona-secom um sistema de enumeração volumétrica de componentes biológicosmarcados por fluoroforo em uma amostra de líquido, dito sistema compreen-dendo um dispositivo de obtenção de amostra como acima definido; e umaparelho de medição compreendendo um suporte de dispositivo de obtençãode amostra disposto para receber o dispositivo de obtenção de amostra quecontém uma amostra de líquido na cavidade de medição, uma fonte de luzposicionada para irradiar a amostra de líquido com radiação eletromagnéticade um comprimento de onda pré-determinado, um sistema de formação deimagem compreendendo meios de obtenção de imagem digital para obteruma imagem digital da amostra irradiada na cavidade de medição de medi-ção, no qual componentes biológicos marcados por fluoroforo são diferenci-ados na imagem digital por representação de imagens de comprimento deonda seletiva, e um analisador de imagem disposto para analisar a imagemdigital obtida para identificar componentes biológicos conjugados de fluorofo-ro e determinar o número de componentes biológicos conjugados de fluoro-foro na amostra de líquido.

O aparelho de medição pode utilizar as propriedades do disposi-tivo de obtenção de amostra como acima descrito para fazer a análise deuma amostra de líquido que foi obtida diretamente na cavidade de medição.O aparelho de medição pode representar um volume determinado de amos-tra para fazer uma enumeração volumétrica dos componentes biológicos naamostra.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSA presente invenção será agora descrita em detalhes adicionaispor intermédio de exemplos tendo como referência os desenhos anexados.

A figura 1 é uma vista esquemática de um dispositivo de obten-ção de amostra de acordo com uma modalidade da invenção.

A figura 2 é uma vista esquemática de um dispositivo de obten-ção de amostra de acordo com outra modalidade da invenção.

A figura 3 é uma vista esquemática de um sistema de mediçãode acordo com uma modalidade da invenção.

A figura 4 é um fluxograma de um método de acordo com umamodalidade da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE UMA MODALIDADE PREFERENCIAL

Com referência agora à figura 1, será descrito um dispositivo deobtenção de amostra 10, de acordo com uma modalidade da invenção. Odispositivo de obtenção de amostra é descartável e deve ser jogado fora de-pois de ter sido utilizado para análise. Isto significa que o dispositivo de ob-tenção de amostra 10 não requer manuseio complicado. O dispositivo deobtenção de amostra 10 é moldado em um material plástico, fabricado pormoldagem de injeção. Isto torna a fabricação do dispositivo de obtenção deamostra 10 simples e barata, na qual o custo do dispositivo de obtenção deamostra 10 é mantido baixo.

O dispositivo de obtenção de amostra 10 compreende um corpo12, que possui uma base 14, que pode ser tocado por um operador semcausar qualquer interferência nos resultados da análise. A base 14 tem pro-jeções 16 que se encaixam em um suporte no aparelho de análise. As proje-ções 16 são dispostas de modo que o dispositivo de obtenção de amostra 10seja posicionado corretamente no aparelho de análise.

O dispositivo de obtenção de amostra 10 compreende aindauma entrada de amostra 18. A entrada de amostra 18 é definida entre pare-des opostas dentro do dispositivo de obtenção de amostra 10, as paredessendo dispostas tão juntas uma da outra que uma força de capilaridade écriada na entrada de amostra 18. A entrada de amostra 18 comunica-se coma parte externa do dispositivo de obtenção de amostra 10 para permitir aosangue ser atraído para dentro do dispositivo de obtenção de amostra 10. Odispositivo de obtenção de amostra 10 compreende ainda uma câmara paracontagem de componentes biológicos marcados por fluoroforo, tais comocélulas, no formato de uma cavidade de medição 20 disposta entre paredesopostas dentro do dispositivo de obtenção de amostra 10. A cavidade demedição 20 é disposta em comunicação com a entrada de amostra 18. Asparedes definindo a cavidade de medição 20 são dispostas juntas, mais pró-ximas que as paredes da entrada de amostra 18, de modo que uma força decapilaridade pode atrair sangue da entrada de amostra 18 para dentro dacavidade de medição 20.

As paredes da cavidade de medição 20 são dispostas a umadistância uma da outra de 140 micrômetros. A distância é uniforme em todaa cavidade de medição 20. A espessura da cavidade de medição 20 define ovolume de sangue sendo examinado. Uma vez que o resultado da análisedeve ser comparado ao volume da amostra de sangue sendo examinada, aespessura da cavidade de medição 20 precisa ser muito precisa, isto é, sãopermitidas apenas variações muito pequenas na espessura dentro da cavi-dade de medição 20 e entre as cavidades de medição 20 de diferentes dis-positivos de obtenção de amostra 10. A espessura permite a um volume deamostra relativamente grande ser analisado em uma pequena área da cavi-dade. A espessura teoricamente permite que células sejam arrumadas emcima uma da outra dentro da cavidade de medição 20. No entanto, a quanti-dade de células dentro de uma amostra, como uma amostra de sangue, étão baixa que a probabilidade de isto ocorrer é muito pequena.

O dispositivo de obtenção de amostra 10 é adaptado para medircontagens de células-alvo por fluoroforo acima de 0,5 χ 109 células/litro desangue. Em contagens mais baixas de células, o volume de amostra serádemasiado pequeno para permitir estatisticamente quantidades significativasde células para serem contadas. Ademais, quando a contagem de células-alvo por fluoroforo excede a 12 χ 109 células/litro de sangue, o efeito de célu-las dispostas sobrepondo-se uma à outra começará a ser significativo nacontagem de células medidas. Nesta contagem de células-alvo por fluorofo-ro, as células-alvo cobrirão aproximadamente 8% da seção transversal daamostra sendo irradiada quando a espessura da cavidade de medição é de140 micrômetros. Assim, este efeito precisa ser levado em consideração pa-ra se obter contagens corretas das células-alvo por fluoroforo. Conseqüen-temente, pode ser usada uma correção estatística de valores da contagemde células-alvo acima de 12 χ 109 células/litro de sangue. Esta correção es-tatística será aumentada para contagens aumentadas de células-alvo porfluoroforo, uma vez que o efeito de células-alvo sobrepostas será maior paracontagens maiores de células. A correção estatística pode ser determinadapor intermédio da calibração de um aparelho de medição. Como uma alter-nativa, a correção estatística pode ser determinada em um nível geral para aconfiguração de aparelhos de medição a serem usados em conexão com odispositivo de obtenção de amostra 10. Deve ser observado que o dispositi-vo de obtenção de amostra 10 pode ser usado para analisar contagens decélulas-alvo por fluoroforo maiores que 50 χ 109 células-alvo/litro de sangue.

De acordo com uma modalidade alternativa, a detecção de com-ponentes biológicos marcados por fluoroforo é usada para determinar se umcomponente biológico específico está presente na amostra. Nesta modalida-de, não há a necessidade de realizar uma contagem volumétrica e, assim,pode ser detectada a presença de um componente biológico mesmo paraquantidades muito pequenas do componente na amostra.

A superfície de uma parede da cavidade de medição 20 é nomínimo parcialmente revestida com um reagente 22. O reagente 22 pode sersecado por congelamento, secado por calor, ou secado por vácuo e aplicadoà superfície da cavidade de medição 20. Quando uma amostra é colocadadentro da cavidade de medição 20, a amostra fará contato com o reagenteseco 22 e inicia uma reação de ligação entre o reagente 22 os componentesda amostra.

O reagente 22 é aplicado inserindo o reagente 22 dentro da ca-vidade de medição 20 usando uma pipeta ou distribuidor. O reagente 22 ésolvido em metanol quando inserido dentro da cavidade de medição 20. Osolvente com o reagente 22 enche a cavidade de medição 20. Em seguida, érealizada uma secagem, de modo a que o solvente seja evaporado e o rea-gente 22 seja fixado à superfície da cavidade de medição 20.

Uma vez que o reagente deve ser secado sobre a superfície deum espaço estreito, o líquido terá uma superfície muito pequena em contatocom a atmosfera ambiente, pelo que a evaporação do líquido é processadacom mais dificuldade. Assim, é vantajoso usar um líquido volátil, tal comometanol, que permite ao líquido ser evaporado de uma maneira efetiva doespaço estreito da cavidade de medição.

De acordo com um método de fabricação alternativo, o dispositi-vo de obtenção de amostra 10 é formado pela fixação de duas peças uma àoutra, no qual uma peça forma a parede inferior da cavidade de medição 20e a outra peça forma a parede superior da cavidade de medição 20. Isto per-mite a um reagente 22 ser secado sobre uma superfície aberta antes dasduas peças serem fixadas uma à outra. Assim, o reagente 22 pode ser solvi-do em água, desde que o reagente não necessite ser volátil.

O reagente 22 pode compreender um ou mais anticorpos conju-gados de fluoroforo. Os anticorpos são adaptados para se ligarem a umaestrutura molecular específica característica do componente biológico objeto,tal como uma célula. A estrutura pode ser um marcador de superfície de cé-lula, tal como CD4 ou CD8. Quando uma amostra de sangue faz contatocom o reagente 22, os anticorpos atuarão para se ligarem à estrutura mole-cular específica das células-alvo de sangue, assim se acumulando nas célu-las. O reagente 22 deve, preferivelmente, conter quantidades suficientes deanticorpo para distintamente marcar porções das células-alvo, essencial-mente cobrindo todas as células. Isto significa que basicamente todas ascélulas-alvo são fluorescentes e podem assim ser facilmente detectadas emuma imagem digital da amostra. Ainda, haverá freqüentemente um exceden-te de anticorpos conjugados de fluoroforo, que serão misturados ao plasmasangüíneo. O excedente de anticorpos dará um nível de fluorescência defundo baixo, homogêneo, no plasma sangüíneo. Os anticorpos acumuladosnas células-alvo serão distinguíveis sobre o nível de fluorescência de fundo.

O reagente 22 pode ainda compreender outros constituintes, quepodem ser ativos, isto é, tomando parte na aglutinação química a, por exem-plo, células de uma amostra de sangue, ou não-ativos, isto é, não tomandoparte na aglutinação. Os constituintes ativos podem, por exemplo, ser pre-pardos para facilitar a aglutinação dos anticorpos às suas respectivas estru-turas moleculares marcadas. Os constituintes não-ativos podem, por exem-plo, ser arranjados para melhorar a fixação do reagente 22 à superfície deuma parede da cavidade de medição 20.

Dentro de poucos minutos, a amostra de sangue terá reagidocom o reagente 22, de modo que os anticorpos marcados por fluoroforo seligaram às células-alvo.

Com referência à figura 2, será descrita outra modalidade dodispositivo de obtenção de amostra. O dispositivo de obtenção de amostra110 compreende uma câmara 120 formando a cavidade de medição. O dis-positivo de obtenção de amostra 110 tem uma entrada 118 até a câmara 120para transportar sangue para o interior da câmara 120. A câmara 120 é co-nectada a uma bomba (não mostrada) através de um tubo de sucção 121. Abomba pode aplicar uma força de sucção na câmara 120 através do tubo desucção 121, de modo que a amostra é sugada para dentro da câmara 120através da entrada 118. O dispositivo de obtenção de amostra 110 pode serdesconectado da bomba antes que a medição seja realizada. Como a cavi-dade de medição 20 do dispositivo de obtenção de amostra 10 de acordocom a primeira modalidade, a câmara 120 tem uma espessura bem definidadeterminando a espessura da amostra a ser examinada. Em adição, um re-agente 122 é aplicado às paredes da câmara 120 para reagir com a amos-tra.

Com referência agora à figura 3, será descrito um sistema paradetecção e enumeração volumétrica de componentes biológicos marcadospor fluoroforo. O sistema 30 compreende um suporte de amostra 32 parareceber um dispositivo de obtenção de amostra 10 com uma amostra desangue. O suporte de amostra 32 é disposto para receber o dispositivo deobtenção de amostra 10 de modo que a cavidade de medição de medição20 do dispositivo de obtenção de amostra 10 seja corretamente posicionadadentro do sistema 30. O sistema 30 compreende uma fonte de luz 34 parailuminar a amostra dentro do dispositivo de obtenção de amostra 10. A fontede luz 34 pode ser um LED1 que em conjunção com um filtro cromático irra-dia luz 48 correspondendo a um comprimento de onda de excitação do fluo-roforo usado na amostra. O comprimento de onda deve ainda ser escolhidotal que a absorção dos compostos fluorescentes da amostra diferentes doscomponentes marcados por fluoroforo seja relativamente baixa. Ademais, asparedes do dispositivo de obtenção de amostra 10 devem ser principalmentetransparentes ao comprimento de onda. Depois de passar através do filtrocromático, a luz é dirigida à amostra através do uso de um espelho dicróico35. Os fluoroforos que estão acumulados em torno (ou dentro) dos compo-nentes biológicos marcados da amostra, tais como células, absorverão estaluz 48 de um comprimento de onda específico e emitirão luz 50 de um com-primento de onda específico mais longo. A esta luz emitida 50 de um com-primento de onda mais longo é permitido passar através do espelho dicróicoe alcançar um sistema de formação de imagem 36 de modo que os compo-nentes biológicos marcados por fluoroforo emergirão em uma imagem digitalda amostra como áreas ou pontos iluminados. Se uma imagem colorida éobtida, as células-alvo emergirão como pontos coloridos específicos. Se umaimagem em preto e branco é obtida, as células-alvo emergirão como pontosde luz contra um fundo mais escuro.

A fonte de luz 34 pode, alternativamente, ser uma luz incandes-cente em conjunção com um filtro cromático, ou um laser.

De modo alternativo, a luz 48 pode ser dirigida em ângulo dire-tamente para a amostra, sem o envolvimento de um espelho dicróico.

O sistema 30 ainda compreende um sistema de formação deimagem 36, que é disposto acima do suporte de amostra 32. Assim, o siste-ma de formação de imagem 36 é arranjado para receber radiação 50 que foiemitida pela amostra de sangue. O sistema de formação de imagem 36 podecompreender um sistema de ampliação ótico 38 e um meio de obtenção deimagem 40. Pode ser usado um filtro cromático de modo a evitar que a luznão emitida pelos fluoroforos da amostra alcance o meio de obtenção deimagem 40. O sistema de ampliação 38 pode ser disposto para proporcionarum poder de ampliação de 3-50x, mais preferivelmente 3-1 OOx, e o mais pre-ferivelmente 3-4x. Dentro destas faixas de poder de ampliação, é possíveldistinguir células-alvo. A imagem pode ser obtida com uma resolução melho-rada de modo a permitir ser usado um baixo poder de ampliação. Além dis-so, a profundidade de campo do sistema de ampliação 38 pode ainda serarranjado para pelo menos corresponder à espessura da cavidade de medi-ção 20.

O sistema de ampliação 38 pode compreender uma lente objeti-va, ou sistema de lentes 42, disposto próximo ao suporte de amostra 32, euma lente ocular, ou sistema de lentes 44, disposto a uma distância da lenteobjetiva 42. A lente objetiva 42 proporciona uma primeira ampliação da a-mostra, que é adiante ampliada pela lente ocular 44. A lente objetiva 42 po-de ser disposta entre o espelho dicróico 35 a o suporte de amostra 32. Osistema de ampliação 38 pode compreender lentes adicionais para obter aampliação e formação de imagem apropriadas da amostra. O sistema deampliação 38 é disposto tal que a amostra na cavidade de medição 20,quando colocada no suporte de amostra 32, será focalizada sobre um planode imagem do meio de obtenção de imagens 40.

O meio de obtenção de imagens 40 é disposto para obter umaimagem digital da amostra. O meio de obtenção de imagens 40 pode serqualquer tipo de câmera digital, tal como uma câmera CCD. O tamanho dopixel da câmara digital causa uma restrição no sistema de formação de ima-gem 36 tal que o círculo de confusão no plano de imagem pode não excedero tamanho do pixel dentro da profundidade de campo. No entanto, células-alvo podem ainda ser detectadas mesmo se elas estiverem um tanto emba-çadas e, em conseqüência, ao círculo de confusão pode ser permitido exce-der o tamanho do pixel enquanto está sendo considerado dentro da profun-didade de campo. A câmera digital 40 obterá uma imagem digital da amostraem uma cavidade de medição 20, na qual a espessura total da amostra estásuficientemente focalizada na imagem digital para a contagem das célulasde sangue marcadas. O sistema de formação de imagem 36 definirá umaárea da cavidade de medição 20, que será representada na imagem digital.A área sendo representada junto com a espessura da cavidade de medição20 define o volume da amostra sendo representada. O sistema de formaçãode imagem 36 é configurado para conter amostras de sangue representadasno dispositivo de obtenção de amostra 10. Não há necessidade de mudar aconfiguração do sistema de formação de imagem 36. Preferivelmente, o sis-tema de formação de imagem 36 é disposto dentro de um alojamento demodo que a configuração não seja acidentalmente modificada.

Alternativamente, o sistema 30 pode compreender mais de umsistema de formação de imagem 36, por meio do que a fluorescência emitidade diferentes comprimentos de onda pode ser dirigida aos sistemas de for-mação de imagem respectivos. Dirigir os diferentes comprimentos de ondapara sistemas de formação de imagem diferentes 36 pode ser obtido usan-do, por exemplo, um ou mais espelhos dicróicos ou grades.

Além disso, pode ser usada uma pluralidade de fontes de luz 34,por meio do que a amostra pode ser irradiada com luz de comprimentos deonda específicos diferentes, ao mesmo tempo ou seqüencialmente. Isto po-de ser obtido utilizando uma pluralidade de LEDs em conjunção com no mí-nimo um filtro cromático para cada um. Convenientemente, todos os filtroscromáticos usados dentro do sistema 30 podem ser dispostos sobre rodas,sobre as quais todos os filtros cromáticos mais geralmente usados podemser prepardos, de modo que o filtro específico necessário a uma específicadetecção pode ser facilmente indexado para uma posição ativa. Um filtroestá em uma posição ativa quando ele intersecta a luz do LED antes que elaalcance a amostra, se o filtro é usado para a luz de excitação, ou quando eleintersecta a luz de fluorescência da amostra antes que ela alcance o meio deobtenção de imagem 40, se o filtro é usado para a luz emitida.

O sistema 30 compreende ainda um analisador de imagem 46.O analisador de imagem 46 é conectado à câmera digital 40 para receberimagens digitais obtidas pela câmera digital 40. O analisador de imagem 46é disposto para identificar padrões na imagem digital que correspondam auma célula marcada para contar o número de células-alvo presentes na i-magem digital. Assim, o analisador de imagem 46 pode ser disposto paraidentificar pontos de luz contra um fundo mais escuro. O analisador de ima-gem 46 pode ser disposto para primeiro ampliar eletronicamente a imagemdigital antes de analisar a imagem digital. Isto significa que o analisador deimagem 46 pode ser capaz de, mais facilmente, distinguir células-alvo quesão representadas de modo mais perto uma da outra, mesmo se a amplia-ção eletrônica da imagem digital tornar a imagem digital um tanto embaçada.

O analisado de imagem 46 pode calcular o número de células desangue marcadas por volume de sangue dividindo o número de células desangue marcadas sendo identificadas na imagem digital pelo volume da a-mostra de sangue, que está bem definido como descrito acima. A contagemvolumétrica de células de sangue marcadas pode ser mostrada em uma telado aparelho 30.

O analisador de imagem 46 pode ser entendido como uma uni-dade de processamento que compreende códigos para executar a análisede imagem.

Referindo-se à figura 4, será descrito um método de componen-tes biológicos marcados por fluorescência. O método será descrito especifi-camente com referência a um método para detecção e enumeração volumé-trica de linfócitos T marcados. No entanto, será entendido por aqueles ver-sados na técnica que o método pode ser modificado para a detecção e enu-meração volumétrica de outros componentes biológicos. É necessário serusado um reagente adequado para marcar os componentes biológicos deinteresse, e a detecção e irradiação precisam ser adaptadas aos comprimen-tos de onda de excitação e emissão dos fluoroforos escolhidos, como seráreconhecido por aqueles versados na técnica.

O método para detecção e enumeração volumétrica dos linfóci-tos T compreende obter uma amostra de sangue em um dispositivo de ob-tenção de amostra, etapa 102, tendo uma espessura fixa de 140 mícrons.Uma amostra não diluída de sangue humano total é obtida no dispositivo deobtenção de amostra. A amostra pode ser obtida de vasos sangüíneos capi-lares ou veias. Uma amostra de sangue arterial pode ser atraída para dentroda cavidade de medição diretamente de um dedo picado de um paciente. Aamostra de sangue faz contato com o reagente 22 no dispositivo de obten-ção de amostra, iniciando uma reação de aglutinação. O reagente compre-ende um anticorpo anti-CD4 (cluster de diferença 4) marcado de Fitc (isotio-cianato fluorescente) e um anticorpo anti-CD8 (cluster de diferença 8) mar-cado de APC (célula apresentadora de antígeno). Dentro de poucos minutos,a amostra de sangue terá reagido com o reagente 22, de modo que os anti-corpos marcados por fluoroforos ligaram-se respectivamente aos marcado-res CD4 dos linfócitos auxiliares T e aos marcadores CD8 dos linfócitos ma·tadores T da amostra de sangue, e agora a amostra está pronta para seranalisada. O dispositivo de obtenção de amostra é colocado em um aparelhode análise, etapa 104. Uma análise pode ser iniciada apertando um botão doaparelho de análise. Alternativamente, a análise pode ser iniciada automati-camente pelo aparelho detectando a presença do dispositivo de obtenção deamostra.

A amostra é irradiada usando um LED em conjunção com umfiltro cromático disposto para permitir apenas luz de cerca de 450 nanôme-tros passar, etapa 106. A luz permitida é dirigida diretamente para a amos-tra, em um ângulo suave em relação à superfície de cima do dispositivo deobtenção de amostra. A luz do LED é absorvida pelos flouroforos Fitc mar-cando os linfócitos CD4+, em razão de que o Fitc emite luz em torno de 500nanômetros. Uma câmera CCD é usada para obter uma imagem da amostrafluorescente sem qualquer ampliação ótica, etapa 108. A câmera está emconjunção com um filtro cromático disposto para permitir passar dentro dacâmera apenas luz de um comprimento de onda de cerca de 500 nanôme-tros. Isto significa que a imagem digital conterá pontos de luz/áreas nas po-sições das células auxiliares T marcadas.

A amostra é então novamente, da mesma forma que acima, irra-diada com um LED, agora em conjunção com um filtro cromático permitindopassar através da amostra apenas luz em torno de 590 nanômetros, assimexcitando os fluoroforos de APC marcando as células matadoras T CD8+.Em analogia com a detecção das células-alvo de Fite, é usado um filtro cro-mático permitindo passar na câmera CCD apenas luz em torno de 640 na-nômetros, na qual é obtida uma segunda imagem digital, desta vez contendopontos de luz/áreas nas posições das células T matadoras marcadas pre-sentes na amostra.

As imagens digitais obtidas são transferidas a um analisador deimagem, realizando uma análise de imagem por ampliação eletrônica, etapa110, de modo a contar o número de pontos de luz na imagem digital respec-tiva. O analisador de imagem é então capaz de determinar respectivamentea concentração de células auxiliares T e células matadoras T na amostra desangue. O analisador de imagem é também capaz de sobrepor as duas ima-gens de modo a determinar se há quaisquer células que, contrariando a ex-pectativa, mostram ambas as células CD4 e CD8.

Alternativamente, a amostra de líquido, sangue total neste caso,pode ser reagida, ou parcialmente reagida, com o reagente 22 (anticorpos)fora do dispositivo de obtenção de amostra 10, depois do que a amostra re-agida, ou parcialmente reagida, pode ser obtida no dispositivo de obtençãode amostra 10.

Em uma modalidade, o reagente 22 compreende um anticorposecundário marcado por fluoroforo, tendo uma afinidade para um anticorpoprimário, cujo anticorpo secundário está presente na cavidade de medição20 do dispositivo de obtenção de amostra 10 em forma seca. A amostra delíquido é assim primeiro, fora do dispositivo de obtenção de amostra 10, tra-tada com o anticorpo primário, que se liga a uma estrutura molecular prescri-ta específica dos componentes biológicos-alvo da amostra. A amostra, inclu-indo os anticorpos primários, é então colocada no dispositivo de obtenção deamostra 10 segurando o anticorpo secundário. Os anticorpos secundáriossão então misturados com a amostra e ligam-se aos anticorpos primários, osquais, por sua vez, são ligados aos componentes biológicos-alvo, por meiodo que os componentes biológicos-alvo são marcados com o fluoroforo. Estamodalidade significa que o anticorpo conjugado de fluoroforo seco pode serusado para marcar muitos tipos diferentes de componentes biológicos, umavez que estes componentes tenham sido pré-tratados com um anticorpoprimário tendo uma afinidade por eles. Assim, o pré-tratamento da amostrapermite ao dispositivo de obtenção de amostra 10 ser usado em muitas apli-cações diferentes, não havendo a necessidade de adaptar o dispositivo deobtenção de amostra 10 para uso na detecção de apenas um componentebiológico.

Deve ser enfatizado que as modalidades preferenciais descritasaqui não são de nenhuma maneira Iimitativas e que são possíveis muitasmodalidades alternativas dentro do objetivo de proteção definido pelas rei-vindicações anexadas.

Claims

1. Dispositivo de obtenção de amostra para detecção de compo-nentes biológicos em uma amostra de líquido, o dito dispositivo de obtençãode amostra compreendendo:uma cavidade de medição para receber uma amostra de líquido,dita cavidade de medição tendo uma espessura fixa predeterminada, eum reagente, que é disposto em forma seca dentro da cavidadede medição, o dito reagente compreendendo uma molécula conjugada defluoroforo.

2. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com a reivin-dicação 1, em que a molécula conjugada de fluoroforo é disposta para seligar a uma estrutura molecular específica de um componente biológico.

3. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com a reivin-dicação 1 ou 2, em que o dispositivo de obtenção de amostra compreendeum corpo tendo duas superfícies planas que definem dita cavidade de medi-ção.

4. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com a reivin-dicação 3, em que as superfícies planas são dispostas a uma distância pre-determinada uma da outra para determinar uma espessura de amostra parauma medição ótica.

5. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, em que a cavidade de medição temuma espessura uniforme de 50-170 micrômetros.

6. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com a reivin-dicação 5, em que a cavidade de medição tem uma espessura uniforme depelo menos 100 micrômetros.

7. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com a reivin-dicação 5 ou 5, em que a cavidade de medição tem uma espessura uniformede não mais que 150 micrômetros.

8. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, em que uma área da cavidade de me-dição é adaptada para ser representada de modo a proporcionar a análisede um volume bem definido da amostra, por meio do que pode ser obtida aenumeração volumétrica de um componente biológico na amostra.

9. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, compreendendo ainda uma entrada deamostra comunicando a cavidade de medição com o exterior do dispositivode obtenção de amostra, dita entrada sendo disposta para obter uma amos-tra de líquido.

10. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com a reivin-dicação 9, em que a entrada é disposta para obter uma amostra de líquidoatravés de força de capilaridade.

11. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, em que o reagente foi aplicado à su-perfície solvido em um líquido volátil que foi evaporado para deixar o reagen-te em uma forma seca.

12. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, em que a molécula conjugada de fluo-roforo é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo.

13. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes, em que o dispositivo de obtenção deamostra é descartável.

14. Dispositivo de obtenção de amostra, de acordo a reivindica-ção 1, em que o reagente é dissolvível e/ou capaz de ser posto em suspen-são na amostra de líquido.

15. Método para detecção de componentes biológicos marcadospor fIuoroforo em uma amostra de líquido, dito método compreendendo:misturar um reagente compreendendo uma molécula conjugadade fluoroforo com uma amostra de líquido tal que a molécula conjugada defluoroforo liga-se a uma estrutura molecular específica de um componentebiológico na amostra de líquido;introduzir a amostra de líquido dentro de uma cavidade de medi-ção de um dispositivo de obtenção de amostra, dita cavidade de mediçãotendo uma espessura fixa predeterminada;irradiar uma área da amostra na cavidade de medição com radi-ação eletromagnética de um comprimento de onda correspondente a umcomprimento de onda de excitação do fluoroforo; edetectar componentes biológicos marcados por fluoroforos emtoda a espessura da cavidade de medição, dita detecção compreendendoobter uma imagem digital da área irradiada na cavidade de medição.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que dito dis-positivo de obtenção de amostra compreende um reagente, que é dispostoem uma forma seca dentro da cavidade de medição, dito reagente compre-endendo uma molécula conjugada de fluoroforo, e no qual dita mistura é ob-tida pela introdução da amostra de líquido dentro da cavidade de mediçãopara fazer contato com o reagente.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em quecomponentes biológicos exibindo o fluoroforo são diferenciados na imagemdigital como pontos fluorescentes emitindo radiação eletromagnética de umcomprimento de onda correspondente a um comprimento de onda de emis-são do fluoroforo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que a ima-gem digital é obtida usando um poder de ampliação ótica de 3-50x, mais pre-ferivelmente 3-1 Ox.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, compreen-dendo ainda:analisar digitalmente a imagem digital para identificar componen-tes biológicos exibindo o fluoroforo e determinar o número de componentesbiológicos exibindo o fluoroforo na amostra.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que dita aná-lise compreende identificar áreas da imagem digital resultantes da radiaçãoeletromagnética emitida.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em quedita análise compreende identificar pontos na imagem digital resultantes dereadiação eletromagnética emitida.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19--21, em que dita análise compreende sobrepor duas ou mais imagens obti-das, cada imagem mostrando respectivos comprimentos de onda emitidosespecíficos.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19--22, em que dita análise compreende ampliar eletronicamente a imagem digi-tal obtida.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15--23, em que a amostra de líquido é introduzida dentro da cavidade de medi-ção do dispositivo de obtenção de amostra através de uma entrada de a-mostra capilar por intermédio de força de capilaridade.

25. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 15-24,em que a dita imagem digital é obtida com uma profundidade de campo nomínimo correspondendo à espessura da cavidade de medição.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15--25, em que um volume da amostra de líquido analisada é bem definido pelaespessura da cavidade de medição e uma área da amostra sendo represen-tada.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15--26, em que dita irradiação é realizada por uma fonte de luz compreendendoum diodo emissor de luz.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15--27, em que dito comprimento de onda correspondendo a um comprimentode onda de excitação é obtido através do uso de um diodo emissor de luzem combinação com um filtro cromático.